TranslationsstrategienHans-Georg Kräusslich, Abteilung Virologie

http://virology.hyg.uni-heidelberg.de

15.5.2007

Mechanismen eukaryontischer TranslationCap-abhängige InitiationIRES-Elemente und cap-unabhängige InitiationVirale Strategien zur Modulation der TranslationTranslationsinhibition als zellulärer Abwehrmechanismus,virale Verteidigungsmechanismen

Aufbau eukaryontischer mRNA

ORF AAAAAAUG stopcap5‘UTR 3‘UTR

5‘cap: Bindung von InitiationsfaktorenKurze 5‘UTR (50-100 nt)Monocistronisch: ein ORF3‘UTR, PolyA

Prokaryontische mRNA: polycistronisch

SDSDSD

Virale Translationsstrategien

Viren nutzen den kompletten Translationsapparat der Wirtszelle

ABER

Kodierungskapazität muss möglichst effizient genutzt werden

Funktionell polycistronische mRNA

Virale Translation soll bevorzugt werden

Host cell shutoff

Translation

InitiationCap abhängiggeschwindigkeitsbestimmend

Elongation

Termination

Gesteuert von Translationsfaktoren

Aufbau des Translations-InitiationsKomplexes

Initiator-tRNA

43S Präinitiations-Komplex

Initiations-Komplex

Ribosom 40S UE

© Flint et al. Principles of Virology

Ternärer Komplex

Cap-Bindung

Translations-Initiation

Komplex gleitet entlang derRNA auf der Suche nach einemStartcodon (‚Scanning‘)

GTP Hydrolyse löst Dissoziation des Komplexes aus

Helikase

© Flint et al. Principles of Virology

Üblicherweise wird1. AUG genutzt

Translationshemmend wirken...

Fehlen der cap-Struktur

Ausgeprägte RNA-Sekundärstruktur (bes. 5‘-Ende)

Lange 5‘ UTR

Schlechter Kontext des AUG (Kozak-Regel)Optimal: GCCACCAUGGnur 5% der euk. mRNA haben optimalen Kontext(Regulation)

Translations-Initiation bei Poliovirus

+Strang RNA, kein cap, 5‘ Ende verknüpft mit VPgLange 5‘ UTRAusgeprägte Sekundärstruktur am 5‘ Ende7 nicht genutzte AUG in der 5‘ UTR

Translationsinitiation am 5‘ Ende und scanning bis zum Initiator-AUG ist unwahrscheinlich

Effiziente Translation von Poliovirus RNA bei vollständiger Abschaltung der Translation zellulärer mRNAs

Mechanismus?

VPg741 nt

AUG AUG AUG AUG AUG AUG AUG AUG

Hypothese: 5‘ unabhängiges Binden ribosomaler Untereinheiten

an interne RNA-Strukturen

AAAAAAORF A ORF Bcap

5‘UTR von Protein B> nur Protein A wird translatiert

5‘UTR von Poliovirus> Proteine A und B werden translatiert

Testsystem zum Nachweis (Bicistronische mRNA):

AUG AUG AUG AUG AUG AUG AUG AUG

40S-Komplex

Internal Ribosomal Entry Site (IRES)

Inhibierung der Proteinsynthese in Poliovirus-infizierten Zellen

Mechanismus: Zerstörung von eIF-4GCap-unabhängige Initiation bei Poliovirus © Flint et al. Principles of Virology

In Poliovirus-infizierten Zellen wird die zelluläre, Cap-abhängige Translation vollständig abgeschaltetPoliovirus RNA wird weiterhin effizient translatiert

IRES-abhängige TranslationIRES-tragende RNA nutzen ebenfalls Translationsinitiations-faktoren:

Typ 1/2 IRES: eIF2, eIF1/3, eIF4A, eIF4B(Picorna) Kein eIF4E (kein Cap!)

eIF4G oder Spaltprodukt

Typ 3 IRES: eIF2, eIF3(HCV) Kein eIF4A/4B/4E/4G

Darüber hinaus gibt es spezifische IRES-Bindungsfaktoren,die vermutlich modulierend wirken (RNA-Chaperone):

La: Regulator von Pol IIIPTB: Poly-Y-Trakt BindungsproteinPCBP: Poly-C Bindungsprotein

Ein Primärtranskript mehrere TranslationsprodukteGenetische Ökonomie

AAAA

Polyprotein

Initiation an verschiedenen Startcodons:•Reinitiation

•leaky scanning•Internal ribosomal entry

•Ribosomal shunting

Prozessierung

Überlesen vonStopcodonsLeseraster-

Wechsel•splicing

•RibosomalFrameshifting•RNA editing

Genomorganisation von Poliovirus und Prozessierung des Polyproteins zu den viralen Proteinen

© Flint et al. Principles of Virology

Synthese aller Proteine als Polyprotein, Prozessierung durch 2 virale Proteasen2A: Trennung Struktur- und Nicht-Strukturproteine3C: Alle weiteren Prozessierungen

Genomorganisation und Polyprotein-Prozessierung von Flaviviren

© Flint et al. Principles of Virology

Synthese aller Proteine als Polyprotein, Prozessierung durch zelluläre und virale Proteasen:Prozessierung der Strukturproteine: Signal-PeptidaseProzessierung der Nicht-Strukturproteine: NS3

Re-Initiation

© Flint et al. Principles of Virology

Influenza B Virus:

z.B. CauliflowerMosaic Virus:

100%25%

21 AUG Codons

Ein ‚Reinitiationsfaktor‘ (TAV) von CaMV interagiert mit der Translationsmaschinerie der Zelle

Park et al., Cell 2001

Überlesen von Startcodons (leaky scanning)

AUG AUGcap UAC

MetScanning Translationsstart am 1.AUG

aug AUGcap UAC

Met

Translationsstart

Ungünstiger Sequenzkontext (‚Kozak-Regeln‘)-> AUG wird ‚überlesen‘

Leaky scanning

‚Überspringen‘ von Startcodons (ribosome shunting)

AUG AUGcap UAC

MetScanning Translationsstart am 1.AUG

AUG AUGcap UAC

Met

Translationsstart

Transport des Initiations-komplexes vom cap zum AUG nicht linear entlang der RNA

Ribosomales frameshifting

Pausieren des Ribosoms (bewirkt durch benachbarte Pseudoknoten-oder stem-loop-Strukturen) an einer ‚slippery sequence‘ oberhalb des stop-codons

das Ribosom ‚rutscht‘ bei der Translation in das –1 oder +1 Leseraster

Effizienz abhängig vom Sequenzkontext der ‚slippery site‘Variiert zwischen 2% und 20% Regulationsmöglichkeit

ORFORF (-1)

CUCAGCAGGGUUUGGAGU

pseudoknot

2% frameshifting

12% frameshiftingUUUUUUMutieren

Hefevirus L-A:

Sekundärstrukturen stromabwärts von frameshift Stellen

Struktur des Pseudoknoten amgag-pro Übergang von MMTV

Ribosomales frameshifting – Rous Sarkom Virus

‚slippery sequence‘

gag

pol

gag ORF

pol ORF AAA UUU AUA

ACA AAU UUA UAG

. AC G . .

© Flint et al. Principles of Virology

RNA editing

Veränderung der mRNA Sequenz durch:Einfügen zusätzlicher Nukleotide (während der Transkription)Veränderung einzelner Basen in situ (posttranskriptionell)

mRNA Sequenz korreliert nicht mit der kodierenden Sequenz im Genom

Führt zu:LeserasterwechselC-terminale Extension (stop > Aminosäure)Änderung der Aminosäuresequenz

Modell des co-transkriptionellen RNA editing: Paramyxoviren

Masern-virus

Mumps-virus RNA-Pol pausiert an einem Übergang

Cn-Un im template

Der Pol-mRNA-Komplex verrutscht um 1-2 Basen entlang des templates(‚Stottern‘; vgl. PolyA-Synthese)

Dadurch werden zusätzliche Basen indas Transkript eingefügt

Die Stabilität der entstehenden RNA-Duplexe bestimmt, um wieviele BasenDie RNA-Pol verrutscht:Masernvirus: -1 BaseMumsvirus: -2 Basen

© Flint et al. Molecular Virology

Posttranskriptionelles RNA editing: Hepatitis delta satellite virus

Replikations-Intermediat

dsRNA AdenosinDeaminase

Editing(50%)

I: Basenpaarung mit C(U > C)

Transkription

Kleines delta Antigen:Genomreplikation

Grosses delta Antigen:Inhibiert Genomreplikation

Assoziation der RNA mit HDV env

+19 AS

© Flint et al. Molecular Virology

Unterdrückung der Termination

RNA pseudoknot

stop

Mo-MLVSindbis Virus

Amber -> GlnSuppression in 4-10% der Transkripte

Reguliert die relativen Mengen Gag (Strukturproteine): Pol (Enzyme)

(ca. 10%)

Opal stop

RNA PolHelikasePotease

capping

P123 + P4: -Strang SynthetaseP1+ P2 + P3 + P4: +Strang SynthetaseRelative Menge von Protease (P2) zu Polymerase (P4) reguliert die RNA Synthese

© Flint et al. Principles of Virology

Virale Translationsstrategien (mehrere Proteine von einer mRNA)

Polyproteinsynthese

Picornaviruses Flaviviruses Alphaviruses Retroviruses

Leaky scanning

Sendai virus P/C mRNA Influenza B RNA 6

Reinitiation

Influenza B RNA 7 CMV gp48 mRNA

Suppression derTermination

Alphavirus nsP4 Retrovirus Gag-Pol

Ribosomales frameshifting

Coronavirus orf1a-1b Retrovirus Gag-Pol

Internal ribosomal entry Picornavirus Flavivirus

AUG AUG

stop stop

IRES

Maximale Nutzung einer RNA Sequenz zur Translationverschiedener Proteine: Sendai-Virus P/C/V Gen

Leaky scanning: Proteine C‘, P, CZunehmende Effizienz der Startcodons von 5‘ nach 3‘(ACG; AUG, Kontext; AUG Kontext

Ribosome shunting: Proteine Y1, Y2Expression dieser Proteine variiert in verschiedenen ZellinienRegulation des ‚ribosome shunting‘ durch zelluläre Faktoren???

RNA editing: Protein V, WEinfügen eines nicht im template enthaltenen Guanosins

Leserasterwechsel V-Protein

Maximale Nutzung einer RNA Sequenz zur Translationverschiedener Proteine: Sendai-Virus P/C/V Gen

© Flint et al. Principles of Virology

Regulation der Translation

Host-cell shutoff

Interferon-induzierte zelluläre Abwehrstrategie

virale Verteidigungsmechanismen

Inhibierung der Proteinsynthese in Poliovirus-infizierten Zellen

Mechanismus: Zerstörung der eIF-4G Untereinheitcap-unabhängige Initiation bei Poliovirus

© Flint et al. Principles of Virology

Inaktivierung des zellulären eIF4F-Komplexes durch virale Faktoren

© Flint et al. Principles of Virology

Modelle für Initiationskomplexe an capoder IRES Elementen

Keine eIF4E-Bindung

© Flint et al. Principles of Virology

Hemmung der Wirts-Proteinsynthese durch Stören der eIF4G-PABP Interaktion

Aneinanderlagerung beider Enden der mRNAInteraktion von eIF4G und PABP stimuliert die Translation

Rotavirus:Virales NSP3 bindet an eIF4G und blockiert Interaktion eIF4G:PABP

Inhibition der Translation zellulärer mRNARotavirus mRNA: cap, aber kein polyANSP3 bindet an das 3´Ende der viralen mRNAund ersetzt PABP in der Stimulierung der Translation viraler mRNA

Inhibierung der Translationsinitiation alszellulärer Abwehrmechanismus

Protein kinase, RNA activated (Pkr)

Phosphorylierung vonPkr-Substratenu.a. eIF2α> Block der Initiation

Virale dsRNAaktiviert Pkr

Interferoninduziert dieSythese von Pkr(und RNaseL)

© Flint et al. Principles of Virology

Wirkung der eIF2a Phosphorylierung auf das katalytische Recycling in der Initiation

AktiviertePkr

peIF2α bindet irreversibel an eIF2BMenge an freiem eIF2B nimmt abKein eIF2*GTP recyclingTranslationsinititation wird inhibiert

Recycling von eIF2*GTP

eIF2*GTP bringt tRNAizum Initiationskomplex

© Flint et al. Principles of Virology

PKR

Virale Strategien zur Inhibierung der eIF2α-Phosphorylierung

PKR

+

PKR P

P

PP

eIF2αP

eIF2αdsRNA

PKR-bindendeProteineHHV8: vIRF-2Vaccinia K3LEBV SMHCV NS5a

eIF2α-Dephospho-rylierungHSV-1 γ34.5

Bindung an dsRNAHSV-1 Us11Vaccinia E3LReovirus σ3

PKR-bindende RNAAdeno VA RNAIEBV EBER RNAHIV TAR?

Aktivierung des zellulären PKR-Inhibitors I-P58IPK

Influenza

Verhindern der eIF2αPhosphorylierungHCMV