UBA Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Química Biológica

Alumnos: Licciardo, LucasSoto, Sergio

JTP: Matkovic, Laura

INFORME – TRABAJO PRÁCTICO Nro. 3

CINÉTICA ENZIMÁTICAOBJETIVOS

1 - Conocer cómo se puede estudiar la cinética básica de una enzima y se calculan sus parámetros Michaelianos.

2 - Estudiar el efecto que ejerce un inhibidor sobre la cinética de una enzima.

METODOLOGÍA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA δ -AMINOLEVULÍNICO DEHIDRASA (ALA-D)

Materiales

• Fuente enzimática: Fración S proveniente de la centrifugación a alta velocidad (15.000 g) de un homogenato de hígado de cerdo.• Buffer de la incubación: buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8.• Sustrato: ALA en buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8.• Solución desproteinizadora: CuS04 ss (solución saturada).• Reactivo de Ehrlich (pipetear bajo campana): 2 g de p-dimetilaminobenzaldehído disueltos en 25ml de HCl (concentrado, 12 M) y 75 ml de ácido acético glacial.• β-Mercaptoetanol (proviene de un stock concentrado: 14,34 M) (pipetear bajo campana): 200 mM.

Procedimiento

Se procedió según el protocolo descripto en la guía de trabajos prácticos de cinética enzimática y según las indicaciones de los docentes para cada grupo. Para el análisis se realizó una espectrofotometría de absorción de la cantidad de producto (PBG) formado para distintas concentraciones de sustrato. Los tubos se prepararon según el protocolo indicado en la Tabla 1 manteniéndolos en frío, en dicha tabla también se detallan los resultados de absorbancia. Luego se los llevó a incubar a 37°C durante 20 minutos. La reacción se cortó con 0,1 mL de CuSO 4 (s.s.), se agitó vigorosamente y se centrifugó durante 15 minutos a 3000 r.p.m. El producto de la reacción (PBG) se determinó en el sobrenadante. Para ello, se trasvasó a otro tubo, se le agregó 1 ml de reactivo de Ehrlich y se agitó inmediatamente. Se midió la absorbancia a 555 nm entre los 8 y 15 minutos. Con estos datos, la cantidad de PBG en cada reacción pudo determinarse a partir de la Ley de Beer. (Ɛ = 113.6 ml/mg).

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tubos ALA (mM)

ALA 10 mM

(mL)

Ác. Levulínico

(mM)

Ác. Levulínico

5 mM (mL)

β –Me200 mM

(mL)

Enzima (mL)

Buffer (mL)

Abs (555nm)

B 0 0 0 0 0.1 0.15 0.75 0.022*1 0.05 0.005 0 0 0.1 0.15 0.745 0.1342 0.10 0.010 0 0 0.1 0.15 0.740 0.2353 0.25 0.025 0 0 0.1 0.15 0.725 0.3094 0.50 0.050 0 0 0.1 0.15 0.700 0.3845 0.75 0.075 0 0 0.1 0.15 0.675 0.4226 1.00 0.1 0 0 0.1 0.15 0.650 0.4157 3.00 0.3 0 0 0.1 0.15 0.450 0.05**Bi 0 0 0.5 0.05 0.1 0.15 0.700 0.021*1i 0.05 0.005 0.25 0.05 0.1 0.15 0.695 0.0962i 0.10 0.010 0.25 0.05 0.1 0.15 0.690 0.1283i 0.25 0.025 0.25 0.05 0.1 0.15 0.675 0.2124i 0.50 0.050 0.25 0.05 0.1 0.15 0.650 0.2685i 0.75 0.075 0.25 0.05 0.1 0.15 0.625 0.3096i 1.00 0.1 0.25 0.05 0.1 0.15 0.600 0.3137i 3.00 0.3 0.25 0.05 0.1 0.15 0.400 0.374

Tabla 1 Protocolo utilizado para analizar el efecto del ácido levulínico sobre la actividad de la ALA-D.

* La diferencia de absorbancia en el blanco se muestra comparada frente a la del H2O** El valor de absorbancia es anómalo debido a un error en el procedimiento, por lo que no se utiliza para realizar los análisis correspondientes.

Determinación de las velocidades iniciales

Sabemos según la Ley de Beer que la absorbancia se relaciona con la concentración de una muestra según:

A=α . b .C

Donde b es el paso de la cubeta (en este caso, 1 cm) y α es una constante de absortividad. Para conocer la masa de proteína en dicha cubeta debemos multiplicar el valor de concentración por el volumen utilizado, por lo tanto tenemos:

C= Aα ∙b

=mv→m= A ∙v

α ∙b

Para conocer el valor de velocidad necesitamos normalizar el valor a una cantidad de unidades enzimáticas por hora. Por lo tanto, necesitamos dividir por el peso molecular del PBG para normalizar por UE y multiplicar por 3 debido a que este valor de velocidad es por 20 minutos y queremos que sea cada 60 minutos.

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Vo= A ∙v ∙3 ∙PM(PBG)α ∙bDonde PM (PBG )=Peso Molecular PBG=¿226 gr/mol = 0,226 mg/nmolV = 1 mL

De esta manera, tenemos la velocidad normalizada por unidad enzimática, por tiempo y por volumen. Si reemplazamos los valores para cada valor de velocidad obtenemos la siguiente tabla.

Tubos ViB 0,0001 0,0132 0,0253 0,0344 0,0425 0,0476 0,0467 0,003Bi 0,0001i 0,0092i 0,0133i 0,0224i 0,0295i 0,0346i 0,0347i 0,041

Tabla 2. Velocidades inciales para cada ensayo tanto con inhibidor como sin inhibidor.

En base a los valores de la tabla 2, y las concentraciones de sustrato en cada tubo se realizó el siguiente gráfico 1.

Gráfico 1. Velocidades iniciales vs. Concentración de ALA-D para los ensayos con y sin ácido levulínico

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En el gráfico 1 en el cual se puede observar cómo evoluciona la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción (obtenidas anteriormente de manera analítica) puede verse que las curvas tienen un comportamiento logarítmico consistente con una curva michaeliana. En las concentraciones más altas, cuando aumentamos [ALA-D], la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad máxima, que no sobrepasará en ningún caso, independientemente de la [ALA-D]. Comparando ambas curvas, con y sin ácido levulínico podemos ver que en los ensayos en los cuales se añadió dicho compuesto, las velocidades disminuyeron respecto a los tubos sin ácido levulínico. Por lo tanto, podemos confirmar que el ácido levulínico es un inhibidor competitivo.

Gráfico 2. Linealización de Lineaweaver-Burk, representando 1/Vi vs. 1/[ALA-D]

En el gráfico 2 se realizó una linealización de Lineweaver-Burk, en el cual se representan la inversa de la velocidad inicial versus la inversa de la concentración de ALA-D. Utilizando esta linealización y realizando un ajuste lineal a partir del método de cuadrados mínimos como puede verse en el gráfico 3, se puede obtener la constante de Michaelis (Km) y la velocidad máxima Vm para cada grupo de datos a partir de los parámetros de la pendiente y la ordenada al origen de dicha recta.

Gráfico 3. Linealización de Lineaweaver-Burk, representando 1/Vi vs. 1/[ALA-D] incluyendo ajuste lineal.

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Sin inhibidor

Con inhibidor

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Teniendo en cuenta que

Vo=Vm×[S ]Km+[S]

Entonces

1Vo

=Km+[ S]Vm [S]

= KmVm

∙ 1[S ]

+ 1Vm

∙ [S][S]

Por lo tanto, podemos considerar una relación lineal entre 1/Vo y el resto de los parámetros, considerando:

f ( x )=mx+b

Donde

f ( x )= 1Vo;m=Km

Vm; x= 1

[S ];b= 1

Vm

Por lo tanto, según los datos del ajuste lineal obtenemos los siguientes resultados

1/Vm Km/Vm Vm Km Keq (intersección con el eje x)

Con inhibidor 26,68 4,55 0,037 0,168 0,170

Sin inhibidor 16,92 2,86 0,059 0,169 0,169

Tabla 3. Parámetros cinéticos obtenidos a partir de las regresiones lineales de ambas rectas.

Como podemos observar en la tabla 3, el valor de Km experimental es muy similar en los ensayos sin inhibidor al valor de dicha constante en los ensayos con inhibidor, tanto en el cálculo realizado a partir de la pendiente (Km/Vm) como el cálculo realizado a partir de la intersección de la recta con el eje de las absisas (llamado K equivalente en la tabla 3). Por lo tanto, podemos afirmar en base a estos resultados que la constante de Michaelis es igual en ambos grupos de datos.

Km’ = KmDonde Km’ es la constante de michaelis de los ensayos con inhibidor. En cuanto a Vm, podemos ver que en los ensayos sin inhibidor el valor es de aproximadamente el doble del Vm de los ensayos con inhibidor. Por lo tanto

Vm’ < VmDonde Vm’ es la velocidad máxima de los ensayos con inhibidor.

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Teniendo en cuenta estos datos podemos decir que el ácido levulínico parece ser un inhibidor no competitivo puro. De todas maneras, estos resultados pueden ser poco confiables debido a que no se realizaron réplicas de los ensayos por falta de tiempo, por lo tanto pueden no ser exactos.

Determinación de Ki

Para un inhibidor no competitivo puro sabemos que:

V m'= Vm

1+[ I ]Ki

Por lo tanto,

Ki= V m' ∙[I ]Vm−Vm'

Reemplazando los valores a partir de los datos de las tablas 1 y 3 se tiene que

Ki= 0,059∙0,2500,037−0,059

=−0,67

CONCLUSIONES

Se determinaron las velocidades iniciales utilizando la Ley de Beer y los parámetros necesarios para determinar las unidades enzimáticas presentes en los ensayos.

Se pudieron graficar correctamente las curvas de velocidades iniciales versus concentración de sustrato obteniéndose curvas michaelianas, además de constatarse el efecto del inhibidor, el cual redujo proporcionalmente las velocidades iniciales alcanzadas en cada una de las concentraciones de sustrato.

Se linealizaron los datos aplicando el método de linealización de Lineweaver-Burk y a partir de los parámetros obtenidos de la regresión lineal se calcularon las constantes michaelianas de los ensayos con y sin inhibidor y las velocidades máximas alcanzadas para cada grupo de datos. Estas constantes nos indicaron que el inhibidor era compatible con un tipo de inhibición no competitivo puro.

Se determinó la constante de disociación del inhibidor considerando un modelo de inhibición no competitivo puro.

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