T.P Nº 8: Diseño de oligonucleótidos. Objetivo: Diseño de oligonucleótidos adecuados para la...
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T.P Nº 8: Diseño de oligonucleótidos
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Objetivo: Diseño de oligonucleótidos adecuados
para la amplificación mediante PCR de un
fragmento interno del gen rpoS en Ps. alcaligenes
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Estrés: ayuno en nutrientes, pH ácido, alta osmolaridad
RpoS o S
Genes que confieren resistencia al estrés, genes involucrados en re-arreglos morfológicos y genes que provocan cambios en el metabolismo celular
RpoS
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Procedimiento
1) En base de datos de secuencias proteicas buscar secuencias correspondientes a RpoS de Pseudomonas.
2) Elegir 4 de estas secuencias y armar con ellas un archivo en formato FASTA
3) Buscar las regiones de homología utilizando el ClustalW
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ClustalW
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Procedimiento
4) Elegir regiones de homología situadas a una distancia adecuada (50 aa = 150 nucleótidos)
5) Reconstruir la secuencia nucleotídica de los nucleótidos elegidos, teniendo en cuenta los diferentes codones para un mismo aminoácido y el uso de codones para P. alcaligenes
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Ejemplo
1) Secuencia aminoacídica elegida
PDA(A o E)WDG
2) Reconstrucción de secuencia nucleotídica
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A (Ala) R (Arg) N (Asn) D (Asp) C (Cys) Q (Gln) E (Glt)
GCAGCCGCGGCT
CGACGCCGGCGTAGAAGG
AACAAT
GACGAT
TGCTGT
CAACAG
GAAGAG
G (Gly) H (His) I (Ile) L (Leu) K (Lys) M (Met) F (Fen)
GGAGGCGGGGGT
CACCAT
ATAATCATT
CTACTCCTGCTTTTATTG
AAAAAG
ATG TTCTTT
P (Pro) S (Ser) T (Thr) W (Trp) Y (Tyr) V (Val)
CCACCCCCGCCT
TCATCCTCGTCTAGCAGT
ACAACCACGACT
TGG TACTAT
GTAGTCGTGGTT
Código genético
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Codon usage para P oleovorans
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AspGluGlyPheLeuSerTyrCysTrpLeuProHisGlnGATGAAGGTTTTCTTTCTTATTGTTGGCTTCCTCATCAA C G C CT CAGC C C T C C C G
A A A A A G G G G G
Elegir la region de 18 a 21 nucleotidos menos “degenerada”
Un total de 32 oligonucleotidos se generan para dar lugar al peptido . TATTGTTGGCTTCC TACTGTTGGCTTCC TATTGCTGGCTTCC TACTGCTGGCTTCC
etc.
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Nucleótidos complementarios
C – GA - TB – VD - HK – MN - NR – YS – SW –W
Nucleótidos degenerados:
B = C ó G ó TD = A ó G ó TH = A ó C ó TK = G ó TM = A ó CN = A ó C ó G ó TR = A ó GS = G ó CV = A ó C ó G W = A ó TY = C ó T
Nomenclatura para nucleótidos degenerados
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• Tamaño del oligonucleótido y del producto
• Temperatura de fusión (Tm)
• Especificidad
• Secuencias complementarias
• Contenido en G/C y cadenas de polipirimidinas (T, C) o polipurinas (A,
G)
• Secuencia 3’ terminal.
• Secuencia 5’ terminal y regiones centrales
Para diseñar primers
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• Tamaño del oligonucleótido
18 a 24 bases
Temperatura de fusión (Tm)
Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
Tamaño del
Oligonucleótido
Tm = 2 (A+T) + 4(G+C)
Tamaño del
Oligonucleótido
Tm = 2 (A+T) + 4(G+C)
4 12°C 22 66°C
6 18°C 24 72°C 8 24°C 26 78°C
10 30°C 28 84°C 12 36°C 30 90°C
14 42°C 32 96°C 16 48°C 34 102°C
18 54°C 36 108°C 20 60°C 38 114°C
Tann: 5- 8 °C más baja que la de fusión
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• Contenido en G/C
45% al 55% Ideal mezcla al azar un contenido en GC del 50% y ~ 20 bases (la Tm
estaría en el rango de 56°C – 62°C).
• Complementariedad
NO estructuras secundarias o
dímeros o doble cadena
• Secuencia 3’-terminal
CG Clamp • Secuencia 5’-terminal y
regiones centralesCG Clamp
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Resumén de Criterios “positivos” para el diseño de primers
Temperatura de fusión
(Tm)
TmForward = TmReverse Tm = 55-62ºCT hibridación ~ 5-8ºC menos que la
Tm
Tamaño del primer 12-30 b, óptimo 18 a 24 b
Distancia entre primers 10 b-10 kb
Contenido en G+C >= secuencia diana; ideal del 45% al 55%
“cepo GC” en 3’ termina en T; G o C en dos (máx.) de cinco últimas bases
“cepo GC” en 5’ incluir varias G o C en las últimas bases
Lugares de apareamiento de de primers
únicos
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Diseño de oligonucleótidos para Reacción en cadena de
la polimerasa (PCR)
Online
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http://molbiol-tools.ca/PCR.htm
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Diseño de oligonucleótidos para Reacción en cadena
de la polimerasa (PCR)
Uso del programa DNAMAN
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