1

Tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và

nghiên cứu điều kiện tối ưu để

nhuộm tế bào phục vụ chẩn

đoán bệnh ung thư bạch cầu

Trần Văn Tính

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận án TS ngành: Hóa học hữu cơ; Mã số: 62 44 27 01

Người hướng dẫn: PGS.TSKH. Lưu Văn Bôi, GS.TS.

Nguyễn Anh Trí

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Nghiên cứu tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-

thế)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên liệu điều

chế cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu

người. Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thế-

cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm cơ chất

nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người. Xác định

cấu trúc của các hợp chất điều chế được bằng các

phương pháp vật lý và hóa lý hiện đại (Phổ IR, 1H-

NMR và MS) và nghiên cứu mối tương quan giữa

độ nhạy của phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc

phân tử cơ chất bằng phương pháp tính hóa lượng

tử. Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế-

cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat để nhuộm

esteraza đặc hiệu bạch cầu người và tìm kiếm cơ

chất mới có độ đặc hiệu và độ nhạy cao. Nghiên cứu

2

ảnh hưởng hiệu ứng electron các nhóm thế X, hiệu

ứng không gian của các gốc N-hiđrocacbon nhóm

amit thế và các gốc cacboxylat trong phân tử cơ chất

đến độ nhạy và độ đặc hiệu đối với phản ứng nhuộm

esteraza. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm

bằng phương pháp đơn hình và ứng dụng để chế tạo

bộ kít nhuộm esteraza dùng phân loại dòng tế bào

trong bệnh bạch cầu người từ cơ chất tổng hợp được.

Keywords: Hóa hữu cơ; Tổng hợp cơ chất; Chế tạo

kit; Nhuộm tế bào; Ung thư bạch cầu

Content

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay việc phân loại dòng tế bào ung thư máu theo

tiêu chuẩn của các nhà khoa học Pháp, Mỹ và Anh (gọi tắt

là tiêu chuẩn FAB) chủ yếu dựa trên kết quả của ba phương

pháp: đánh dấu, miễn dịch và nhuộm hóa học tế bào.

Nhuộm esteraza đặc hiệu là một trong những phương pháp

phổ biến để phân biệt ung thư bạch cầu dòng tuỷ với các

dòng tế bào khác trong bệnh máu ác tính. Naphtol AS-D

cloaxetat là một cơ chất được sử dụng rộng rãi để nhuộm

esteraza đặc hiệu do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đối với

tế bào bạch cầu dòng tuỷ so với các cơ chất khác. Ngoài ra

naphtol AS-D cloaxetat còn dùng để phân biệt nhiều loại

đối tượng khác như vi khuẩn từ sa khoáng biển, khuẩn cầu

tách từ huyết thanh nhiễm HIV… Tuy nhiên, có nhiều khó

khăn khi sử dụng naphtol AS-D cloaxetat để nhuộm tế bào.

Một là, cho đến nay việc tổng hợp nguyên liệu đầu vẫn

thực hiện theo phương pháp truyền thống nên hiệu suất

3

thấp; thứ hai, kết quả nhuộm chênh lệch so với phương

pháp di truyền và miễn dịch còn cao (~29%); thứ ba, là cơ

chất dễ phân hủy khi nhiệt độ >-200C, khó khăn trong vận

chuyển và bảo quản. Vì vậy, nghiên cứu sử dụng phương

pháp tiên tiến để tổng hợp cơ chất mới có hoạt tính cao và

giá thành rẻ hơn nhằm sản xuất kít nhuộm esteraza tế bào

bạch cầu ở Việt Nam, phục vụ việc khám và chữa bệnh cho

cộng đồng là đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh

tế - xã hội cấp thiết.

2. Mục đích nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là ứng dụng phương

pháp mới, hiệu quả cao để tổng hợp cơ chất; khảo sát một

cách có hệ thống mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính để

tìm kiếm cơ chất mới có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn;

tối ưu hóa các điều kiện nhuộm nhằm giảm sự chênh lệch

và chế tạo bộ kít nhuộm esteraza để phân loại tế bào phục

vụ việc khám và điều trị bệnh ung thư máu.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án

1- Nghiên cứu tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-

cacboxamit làm nguyên liệu điều chế cơ chất nhuộm

esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người.

2- Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thế-

cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm cơ chất

nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người.

3- Xác định cấu trúc của các hợp chất điều chế được bằng

các phương pháp vật lý và hóa lý hiện đại (Phổ IR, 1H-

NMR và MS) và nghiên cứu mối tương quan giữa độ

nhạy của phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc phân tử

cơ chất bằng phương pháp tính hóa lượng tử.

4

4- Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-

2-yl cacboxylat để nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu

người và tìm kiếm cơ chất mới có độ đặc hiệu và độ

nhạy cao.

5- Nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng electron các nhóm thế

X, hiệu ứng không gian của các gốc N-hiđrocacbon

nhóm amit thế và các gốc cacboxylat trong phân tử cơ

chất đến độ nhạy và độ đặc hiệu đối với phản ứng nhuộm

esteraza.

6- Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm bằng phương

pháp đơn hình và ứng dụng để chế tạo bộ kít nhuộm

esteraza dùng phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu

người từ cơ chất tổng hợp được.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

- Đã nghiên cứu tìm được điều kiện thích hợp để điều chế

các nguyên liệu đầu 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-

cacboxamit bằng phương pháp truyền thống và phương

pháp sử dụng kỹ thuật vi sóng.

- Đã nghiên cứu cải tiến quy trình phản ứng giữa 3-hiđroxi-

(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit với các caboxylic

cloanhiđrit và đã tổng hợp được các hợp chất 3-(N-thế-

cacbamoyl)naphtalen-2-yl-cacboxylat có hoạt tính với

esteraza đặc hiệu bạch cầu người.

- Đã nghiên cứu một cách có hệ thống và xác định được ảnh

hưởng của hiệu ứng electron các nhóm thế X, yếu tố không

gian của các gốc N-hiđrocacbon nhóm amit thế và của các

gốc cacboxylat lên hoạt tính nhuộm esteraza đặc hiệu bạch

cầu người.

- Đã khảo sát có hệ thống phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu

bạch cầu người bằng các hợp chất 3-(N-thế)naphtalen-2-yl-

cacboxylat và đã xác định được cơ chất mới có độ nhạy

cao hơn cơ chất naphtol AS-D cloaxetat của hãng Sigma

5

bán trên thị trường.

- Đã tiến hành nghiên cứu kế hoạch hóa thực nghiệm theo

phương pháp đơn hình và tìm được điều kiện tối ưu sản

xuất kít nhuộm esteraza để phân loại dòng tế bào bệnh

bạch cầu cấp.

5. Điểm mới của luận án

- Đã nghiên cứu sử dụng kỹ thuật mới hiệu quả cao là

phương pháp lò vi sóng để tổng hợp 16 3-hiđroxi-(N-

thế)naphtalen-2-cacboxamit, trong đó có 3 chất mới.

- Đã nghiên cứu cải tiến quy trình phản ứng giữa các 3-

hiđroxi- (N-thế)naphtalen-2-cacboxamit với cacboxylic

cloanhiđrit. Kết quả đã tổng hợp được 38 dẫn xuất 3-(N-

thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl-cacboxylat, trong đó có 36

chất mới.

- Trên cơ sở nghiên cứu ảnh hưởng của hiệu ứng electron,

hiệu ứng không gian và các gốc nhị diện của nhóm

cacboxyl lên độ đặc hiệu, độ nhạy của cơ chất đối với

phản ứng nhuộm esteraza, đã xác định được: Các nhóm

thế đẩy cho điểm nhuộm cao hơn các nhóm thế hút điện

tử, các nhóm thế hút điện tử ở vị trí octo- cho điểm nhuộm

cao hơn vị trí para-. Điểm nhuộm cao nhất thuộc về các

gốc N-hiđrocacbon amit thế và các nhóm cacboxylat kích

thước trung bình. Các góc nhị diện của nhóm cacboxyl có

ảnh hưởng quan trọng đối với độ chọn lọc của esteraza

trong phản ứng thủy phân gốc este và độ nhạy của cơ chất.

- Đã điều chế được naphtol AS-OL -clopropionat làm cơ chất

mới có độ đặc hiệu tương đương, nhưng độ nhạy cao hơn

6

1,188 lần so với naphtol AS-D cloaxetat của hãng Sigma

cung cấp với giá thành chỉ bằng 20%.

- Đã chế tạo thành công kít nhuộm esteraza đặc hiệu bạch

cầu người sử dụng cơ chất mới naphtol AS-OL -

clopropionat; kết quả kiểm định trên máu của người bình

thường ở Viện Huyết học-Truyền máu trung ương và tủy

bệnh nhân bị bệnh máu đã phân loại dòng tế bào cho thấy:

bộ kit chế tạo được có tính đặc hiệu tương đương với sản

phẩm của hãng Sigma, nhưng độ nhạy cao hơn 1,188 lần,

được khuyến cáo đưa vào sản xuất thay thế sản phẩm

nhập ngoại.

6. Bố cục của luận án

Luận án gồm 135 trang, trong đó có 21 hình vẽ, đồ thị,

41 bảng biểu, chưa kể 129 trang phụ lục và 115 tài liệu

tham khảo. Ngoài phần mở đầu và kết luận, luận án chia

làm ba chương; chương I – Tổng quan tài liệu, gồm 24

trang; chương II – Thực nghiệm, gồm 22 trang và chương

III – Kết quả và bàn luận, gồm 76 trang, Kết luận và kiến

nghị 2 trang.

Liên quan đến nội dung luận án đã đăng 1 bài trên Tạp

chí Thông tin y dược, 3 bài báo trên Tạp chí hóa học (Viện

KH&CN Việt Nam), 1 bài trên Tạp chí Khoa học (ĐHQG

Hà Nội) và đã đăng ký 1 bằng sáng chế (Cục sở hữu trí tuệ

Bộ KH&CN).

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hóa học các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-

cacboxamit

Đã tổng kết các kết quả đạt được trong việc điều

chế, nghiên cứu tính chất và ứng dụng của các hợp chất 3-

hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có cấu trúc như

sau:

7

2

3

1

4

6

5

7

8

NHR1

OH

O

9

10

R1 = xiclohexyl, 1-naphtyl, 1-antraxyl và X-C6H4-;

trong đó X = o- và p-ankyl, o- và p-Hal, o- và p-NO2...

1.1. Các phương pháp điều chế

Các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-

cacboxamit chủ yếu được điều chế bằng hai phương pháp

truyền thống, gồm:

a) Phương pháp trực tiếp một giai đoạn

OH

O

OH

+

NH2

PCl3/SOCl2

OH

O

NH

b) Phương pháp gián tiếp hai giai đoạn

COOH

OH

+ SOCl2 COCl

OH- SO2

COCl

OH+

NH2

X

CONH

OH

X

1)

2)

3-Hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit điều chế theo các

phương pháp truyền thống mất nhiều thời gian, tốn năng lượng và

hiệu suất thấp (20-70%).

1.2. Tính chất của 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-

cacboxamit

Đã khái quát tính chất vật lý, tính chất phổ và các

tính chất hóa học chủ yếu của 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-

2-cacboxamit.

1.3. Ứng dụng của 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-

A

8

cacboxamit

3-Hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit được ứng

dụng chủ yếu trong hai lĩnh vực.

a) Làm phẩm màu: được tổng hợp bằng phản ứng

ghép đôi với muối điazo.

NH

O

OH

XO

NH

X2

X3

N N

O

NH

OH

NN

X2

X3

NH

O

X

b) Làm cơ chất nhuộm hóa học tế bào.

Chương 2. THỰC NGHIỆM

2.1. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên

cứu.

2.2. Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng trong

luận án

- Phương pháp tổng hợp hữu cơ truyền thống;

- Phương pháp tổng hợp hữu cơ sử dụng lò vi sóng;

- Phương pháp Vật lý và Hóa lý xác định cấu trúc;

- Phương pháp kế hoạch hóa thực nghiệm và thống

kê xử lý số liệu;

- Phương pháp nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào và

phương pháp FAB phân loại dòng tế bào;

- Phương pháp tính toán Hóa lượng tử Gaussian

2003 khảo sát mối tương quan định lượng giữa hoạt tính và

cấu trúc.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

9

Mục tiêu đề ra của luận án được thực hiện bắt đầu từ

việc nghiên cứu phương pháp tổng hợp các chất 3-hiđroxi-

(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên liệu đầu để

điều chế các cơ chất 3-(N-thế)-naphtalen-2-yl-cacboxylat

dùng nhuộm tế bào bạch cầu.

3.1. Tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit

Các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-

cacboxamit có công thức chung như hình A trang 4, được

chia làm hai dãy:

1) Dãy 1: Naphtol AS-X.

R1 = X-C6H4; x; X = o- và p-ankyl, o- và p-Hal, o- và p-

NO2...

2) Dãy 2: R1 = xiclohexyl, phenyl, naphtyl, antraxyl,

được tổng hợp để nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng không

gian lên phản ứng nhuộm esteraza tế bào bạch cầu.

3.1.1. Tổng hợp các naphtol AS-X bằng phương pháp

truyền thống

Đun hồi lưu hỗn hợp axit 3-hiđroxi-2-naphtoic, dẫn

xuất anilin và PCl3, theo tỷ lệ mol khác nhau, trong điều

kiện không dung môi ở 120-1300C và có dung môi

clobenzen ở 1350C, thời gian đến 2h. Phản ứng xảy ra theo

sơ đồ sau:

COOH

OH

NH2

X

C

O

NH

OH

+PCl3, T0C X

Ia-l

h = 40-70%

10

X = o-CH3 (Ia), p-CH3 (Ib), o-Cl (Ic), p-Cl (Id), o-Br (Ie),

p-Br (If), o-NO2 (Ig), p-NO2 (Ih), o-OCH3 (Ii), p-OCH3

(Ij), o-COOCH3 (Ik), p-COOCH3 (Il)

Đã tìm được điều kiện thích hợp là: tỷ lệ mol axit 3-

hiđroxi-2-naphtoic : dẫn xuất anilin : PCl3 = 1 : 1 : 0,3;

dung môi clobenzen; nhiệt độ 1300C và thời gian 2h. Ở

những điều kiện đó hiệu suất naphtol AS-X đạt 40-70%.

3.1.2. Tổng hợp các naphtol AS-X sử dụng lò vi sóng

Đã nghiên cứu sử dụng lò vi sóng để tổng hợp naphtol

AS-X. Quá trình phản ứng mô tả trên sơ đồ sau:

COOH

OH

NH2

X

Clobenzen

C

O

NH

OH

I a-l

Microwave

PCl3,

+

Kết quả khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tác nhân, thời gian,

nhiệt độ, bản chất dung môi và chế độ làm việc của lò vi

sóng lên hiệu suất sản phẩm Ia-l cho thấy, điều kiện thích

hợp là: tỷ lệ mol axit 3-hiđroxi-2-naphtoic : dẫn xuất anilin

: PCl3 = 1 : 1 : 0,3; thời gian 20 phút, nhiệt độ 1300C; dung

môi clobenzen; công suất lò 200w. Trong những điều kiện

đó, hiệu suất naphtol AS-X Ia-l đạt 80 - 90%.

Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý và các dữ kiện

phổ được đưa ra trong bảng 3.4 và 3.5 (xem toàn văn luận

án).

Trên phổ IR của các naphtol AS-X Ia-l có các cực đại

hấp thụ đặc trưng cho dao động hoá trị các nhóm hiđroxyl-

νOH ở khoảng 3482 đến 3172 (liên kết hiđro) cm-1

; nhóm

11

NH amit-νNH ở khoảng 3335 cm-1

và nhóm cacbonyl amit-

νCONH ở khoảng 1693 - 1619 cm-1

.

Trên phổ 1H-NMR của các dẫn xuất naphtol AS-X có

cộng hưởng của các proton nhóm metyl-δCH3 ở 2,30-2,34;

nhóm metoxi-δOCH3 ở 2,77-2,92; nhóm metyl este-

δCOOCH3 ở 3,87-3,85; các gốc phenyl và naphtyl-δArH ở

6,97-8,68 và 7,30-8,72; nhóm NH amit-δNH ở 10,50-11,82

và nhóm hiđroxyl- δOH ở 11,04-12,11 ppm.

Trên phổ MS, hầu hết các pic ion phân tử đều có cường

độ nhỏ hơn 50% (hình 3.4), chứng tỏ naphtol AS-X không

bền, rất dễ bị phân hủy dưới tác dụng chùm tia electron.

3.1.3. Tổng hợp 3-hiđroxi-N-

(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxyl)-naphtalen-2-

cacboxamit

3.1.3.1. Tổng hợp bằng phương pháp trực tiếp sử dụng

SOCl2

Để khảo sát ảnh hưởng của tác nhân, đã tiến hành

phản ứng giữa axit 3-hiđroxi-2-naphtoic với SOCl2, tỷ lệ

mol 1 : 20 ở nhiệt độ phòng trong môi axetonitrin, tiếp theo

cho hỗn hợp tác dụng với dẫn xuất amin (từ 1-1,1 đương

lượng mol so với axit naphtoic). Quá trình phản ứng được

mô tả trên sơ đồ sau:

[CH3CN]

COOH

OH

1) SOCl2 , 2) R1NH2 CONHR1

OH

1

2

345

6

7

8

IIa-d

R1 = , , ,1'

2'3'

4'

5'6'

1'

2'

3'

4'

5'

6' 1'

2'

3'

4'5'

6'

7'

8' 1'

2'

3'4'5'6'

7'

8'

9' 10'

(IIa) (IIb) (IIc) (IId)

12

Sau khi cất loại dung môi, trung hòa bằng NaOH rồi kết

tủa naphtol AS bằng dung dịch HCl, hiệu suất 3-hiđroxi-N-

(xiclohexyl/-phenyl/naphtyl/antraxyl)naphtalen-2-

cacboxamit (IIa-d) đạt gần 20%.

Để cải thiện hiệu suất, đã thực hiện phản ứng theo thứ tự

khác, hòa tan axit 3-hiđroxi-2-naphtoic và amin trong

axetonitrin, sau đó nhỏ giọt SOCl2 và khuấy hỗn hợp phản

ứng trong thời gian khoảng 2h. Sau khi xử lý, thu được các

sản phẩm IIa-d với hiệu suất như trước.

3.1.3.2. Tổng hợp các hợp chất IIa-d bằng phương pháp

gián tiếp

Đã thực hiện phản ứng giữa axit 3-hiđroxi-2-naphtoic,

amin và SOCl2 theo hai giai đoạn riêng biệt.

Giai đoạn 1: cho axit 3-hiđroxi-2-naphtoic tác dụng với

SOCl2 trong ete dầu hỏa khoảng 4 h, sau đó cất loại dung

môi, đuổi SOCl2 dưới áp suất thấp, thu naphtoyl clorua.

Phản ứng xảy ra như sơ đồ:

- SO2, - [Pyridin.HCl]

COOH

OH

1) SOCl2 , 2) Pyridin COCl

OH

Giai đoạn 2: cho naphtoyl clorua tác dụng với các

amin theo tỷ lệ mol 1 : 1,2 trong dung môi dioxan. Phản

ứng xảy ra như sau:

+

COCl

OHR1NH2

CONHR1

OHR1NH2.HCl

1

2

345

6

7

8

IIa-d

Sau khi xử lý, hiệu suất 3-hiđroxi-N-

(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/-antraxyl)naphtalen-2-cacboxamit

13

(IIa-d) chỉ đạt tối đa 32%, thấp hơn mong đợi. Nguyên nhân

hiệu suất thấp có lẽ do một phần amin bị kết tủa dưới dạng

muối amoni hiđroclorua.

3.1.3.3. Tổng hợp IIa-d bằng phương pháp trực tiếp sử

dụng PCl3

Đun hồi lưu hỗn hợp axit 3-hiđroxi-2-naphtoic, amin và

thay SOCl2 bằng PCl3, theo tỷ lệ mol 1 : 1,1 : 0,3 trong

dung môi clobenzen trong 1-2 h. Phản ứng xảy ra theo sơ

đồ sau:

Sau khi xử lý, hiệu suất 3-hiđroxi-N-(xiclo-

hexyl/phenyl/naphtyl/-antraxyl)naphtalen-2-cacboxamit (IIa-

d) đạt đến 81%. Cần chú ý rằng, nếu đun trên 1300C, hiệu suất

sản phẩm bị giảm, có lẽ do phân hủy nhiệt.

3.1.3.4. Tổng hợp IIa-d bằng phương pháp sử dụng lò vi

sóng

Quá trình tổng hợp được tiến hành tương tự như với

các dẫn xuất anilin thế mô tả ở mục 3.1.2. Phản ứng xảy ra

theo sơ đồ sau: COCl

OH

+ RNH2

PCl3/Clobenzen

120oC, 20ph

CONHR1

OH

Microwave

IIa-d

1

2

3

45

6

7

8

Kết quả tổng hợp được đưa ra trên bảng 3.7 cho

thấy, trừ trường hợp tác nhân là aniline, tạo sản phẩm IIb

có hiệu suất tương tự như naphtol AS-X, còn

COOH

OH

1) PCl3, 2) R1NH2 CONHR1

OH

1

2

345

6

7

8

Clobenzen, 1300C

IIa-d

14

xiclohexylamin, naphtylamin và antraxylamin đều cho hiệu

suất IIa, IIc và IId thấp. Điều này có thể giải thích là do

xiclohexylamin tạo muối amoni hiđroclorua bền, bị kết tủa và

mất khả năng tham gia phản ứng; hai amin còn lại có cấu trúc

cồng kềnh, gây cản trở cho sự tấn công nucleophin vào nhóm

cacbonyl.

Hiệu suất, một số hằng số vật lý và các dữ kiện phổ IR, 1H-NMR và MS được thể hiện ở bảng 3.7 và bảng 3.8 (xem

toàn văn luận án).

Như vậy, bằng phương pháp sử dụng lò vi sóng đã tổng

hợp được 16 hợp chất 3-hiđroxi-(N-(thế)naphtalen-2-

cacboxamit (IIa-d) với hiệu suất cao, trong đó có 3 hợp

chất mới.

Trên phổ IR xuất hiện cực đại hấp thụ đặc trưng cho dao

động hóa trị của nhóm hiđroxyl-νOH ở vùng 3440-3458;

nhóm NH amit-νNH ở 3245-3301 và nhóm cacbonyl amit-

νC=O ở 1623-1648 cm-1

.

15

Bảng trích kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, phổ IR và 1H-NMR của

các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit

2

3

1

4

6

5

7

8

OH

CONHRX

10

9

R=C6H4 (dãy ); C6H10/C6H4/C10H7/C14H9 (dãy )

Chất X

Hiêu

suât,

%

Tnc, 0C

IR (υ, cm-1

, KBr)

1H-NMR

(DMSO-d6;

δ, ppm; J,

Hz) Chất X

Hiêu

suât,

%

Tnc, 0C

IR (υ, cm-1

, KBr)

1H-NMR

(DMSO-d6; δ,

ppm; J, Hz)

OH NH CO

amit OH NH OH NH

CO

amit OH NH

Ia o-

CH3 80

194-

195

3400,

3051 3325 1615 11,81 10,54 Ij p-OCH3 82

236-

237

3423,

3053 3283

1638,

1620

11,47;

s

10,51;

s

Ib p- 80 227- 3406, 3294 1623 11,39 10,53 Ik o- 80 174- 3482 3374 1615 12,11; 11,50;

Ia-l IIa-l

16

CH3 229 3048 COOCH3 176 s s

Ic o-Cl 78 226-

228

3408,

3172

3408,

3172

1642,

1626 11,91 11,13 Il

p-

COOCH3 83

270-

272

3444,

3058 3248 1619

11,13;

s

10,82;

s

Id p-Cl 83 254-

256

3422,

3054 3291

1636,

1619 11,19 10,66

Chất R

Hiêu

suât,

%

Tnc, 0C

IR (υ, cm-1

, KBr)

1H-NMR

(DMSO-d6; δ,

ppm; J, Hz)

Ie o-Br 82 218-

221

3445,

3224 3224

1640,

1625 11,90 11,00 OH NH

CO

amit OH NH

If p-Br 89 267-

269

3442,

3054 3287 1618 11,84 10,88 IIa C6H11 47

160-

162 3441 1623 1604

12,10;

s

8,78;

d;

3J=8,5

Ig o-

NO2 73

193-

195

3420,

3059 3328 1661 12,00 11,72 IIb C6H5 81

246-

247 3440 3298 1636

11,33;

s

10,59;

s

17

Ih p-

NO2 83

256-

258 3074 3289 1627 11,04 11,02 IIc C10H7 67

214-

215 3458 3245 1648

11,93;

s

11,11;

s

Ii o-

OCH3 82

161-

162 3197 3197

1640,

1625 11,76 11,07 IId C14H9 58

242-

244 3445 3301 1642

12,01;

s

11,27;

s

18

Trên phổ 1H-NMR của các hợp chất IIa-d, cộng

hưởng của các proton nhóm hiđroxyl-δOH xuất hiện ở

11,33-12,0; nhóm HN amit-δNH ở 10,59-11,27; vòng

phenyl/naphtyl/antraxyl-δArH ở 7,25-8,11 ppm. Riêng hợp

chất IIa, các proton nhóm NH amit-δNH và vòng

xiclohexyl cộng hưởng ở vùng trường mạnh hơn, tương

ứng ở 8,77 và 1,16-3,84 ppm.

Phổ MS của các hợp chất IIa-d cũng có pic ion phân

tử cường độ 35-45%. Trên hình 3.7 là phổ MS của hợp chất

IId lần đầu tiên tổng hợp được, pic ion phân tử có cường

độ [M+H]+ (35%).

Hình 3.7. Phổ MS của hợp chất IId

3.2. Tổng hợp các 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-

clocacboxylat làm cơ chất nhuộm tế bào bạch cầu

Đã tiến hành điều chế các este 3-(N-thế-

cacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-clo-cacboxylat bằng phương pháp

tương tự mô tả trong tài liệu của Burtone [16] (xem luận án):

Hòa tan nguyên liệu đầu cacboxamit Ia-l hoặc IIa-d và

NH

O

OH

NH

O

OH

NH

O

O

OCl

CH3

NH

O

OHCH3

1) CH2ClCOCl, THF

2) NaOH

Ia IIIa

19

cloaxetyl clorua vào THF. Sau đó, khuấy và nhỏ giọt dung

dịch NaOH 5N vào phản ứng ở nhiệt độ khoảng 00C. Trên

sơ đồ sau là ví dụ phản ứng giữa naphtol AS-D với

cloaxetyl clorua:

Tuy nhiên, sau khi xử lý, xác định cấu trúc, sản phẩm

thu được không phải este naphtol AS-D cloaxetat (IIIa)

như dự kiến, mà là nguyên liệu đầu naphtol AS-D (Ia).

Điều này có thể giải thích là cloaxetyl clorua đã thủy phân

thành muối cloaxetat, trước khi kịp tác dung với naphtolat.

Vì vậy, phản ứng este hóa đã không thể xảy ra.

Để thu được các este 3-(N-thế-cacbamoyl)-naphtalen-2-yl-2-

clo-cacboxylat, đã cải tiến quy trình thí nghiệm, bằng cách

thực hiện phản ứng theo hai giai đoạn. Giai đoạn 1, cho

nguyên liệu đầu Ia-l hoặc IIa-d tác dụng với NaOH, điều

chỉnh pH = 8. Giai đoạn 2, cho clocacboxyl clorua tác dụng

với muối naphtolat tạo thành trong giai đoạn 1. Toàn bộ

quá trình phản ứng được mô tả trên sơ đồ sau:

IIIa-l ; IVa-l ; Va-g ; VIa-f

CONHR1

OH

CONHR1

ONa

2NaOH 5N

THF

1)

CONHR1

ONa2)

RCOCl

THF

5

6

7

8 12

3

4CONHR1

OCOR

Sau khi xử lý, xác định cấu trúc, sản phẩm thu được là các 3-

(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl-2-clocacboxylat.

Như vậy, bằng cách cải tiến quy trình thí nghiệm, đã

tổng hợp thành công 4 dãy, gồm 38 cơ chất 3-(N-thế-

cacbamoyl)naphtalen-2-yl- 2-clocacboxylat IIIa-l, IVa-l,

20

Va-g và VIa-f với hiệu suất đạt từ 49-62%. Bốn dãy cơ

chất đó là:

1) Naphtol AS-X cloaxetat: R = ClCH2, R1 = X-C6H4;

X = o-CH3 (IIIa), p-CH3 (IIIb), o-Cl (IIIc), p-Cl (IIId), o-

Br (IIIe), p-Br (IIIf), o-NO2 (IIIg), p-NO2 (IIIh), o-OCH3

(IIIi),

p-OCH3 (IIIj), o-COOCH3 (IIIk), p-COOCH3 (IIIl)

2) Naphtol AS-X α-clopropionat: R = CH3CHCl; R1 = X-

C6H4;

X = o-CH3 (IVa), p-CH3 (IVb), o-Cl (IVc), p-Cl (IVd),

o-Br (IVe), p-Br (IVf), o-NO2 (IVg), p-NO2 (IVh), o-

OCH3 (IVi),

p-OCH3 (IVj), o-COOCH3 (IVk), p-COOCH3 (IVl).

3)-3-

(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxylcacbamoyl)naphtalen-2-

yl- -cloaxetat và -clopropionat:

R=CH2Cl; R1=Xiclohexyl (Va), phenyl (Vb), naphtyl (Vc),

antraxyl (Vd).

R= CH3CHCl; R1 = Xiclohexyl (Ve), phenyl (Vf), naphtyl (Vg),

antraxyl (Vh).

4)-Naphtol AS-D và naphtol AS-OL butyrat, -clobutyrat, -

clophenylaxetat:

R1=o-toluidin; R=CH2Cl (VIa), CHClCH3 (VIb),

CHClCH2CH3 (VIc).

R1 = o-anisidyl; R = CH2Cl (VId), CHClCH3 (VIe),

CHClC6H5 (VIf).

21

Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý và các dữ

kiện phổ của các cơ chất mô tả trong bảng 3.9 đến 3.16

(xem toàn văn luận án).

22

Bảng trích kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, phổ IR và 1H-NMR của các naphtol AS-X cacboxylat

3

2

4

1

7

8

6

5

OCOCHClR

CONH1'

5'

2'

6'

X

10

3'

4'

912 R=H (dãy IIIa-l), CH3 (dãy IVa-l)

X Chất

Hiêu

suât,

%

Tnc,

0C

IR (υ, cm-1

, KBr)

1H-NMR;

(δ, ppm; J,

Hz) Chất

Hiêu

suât,

%

Tnc,

0C

IR (υ, cm-1

, KBr) 1H-NMR (δ,

ppm; J, Hz)

NH CO

este

CO

amit NH

H-

12 NH

CO

este

CO

amit NH H-12

o-CH3 IIIa 55 173-

175 3323 1770 1658 10,45 4,66 IVa 52

131-

134 3368 1765 1657 10,03

5,0;

q; 3J=7,0

p-CH3 IIIb 52 160-

162 3276 1773 1654 10,45 4,65 IVb 54

167-

169 3246 1770 1658 10,46

5,0;

q; 3J=7,0

23

o-Cl IIIc 51 128-

130 3232 1769 1650 10,68 4,65 IVc 52

132-

134 3343 1776 1684 10,22

5,0;

q; 3J=7,0

p-Cl IIId 54 187-

189 3297 1777 1656 10,64 4,65 IVd 54

168-

170 3364 1760 1681 10,68

5,0;

q; 3J=7,0

o-Br IIIe 49 143-

145 3226 1779 1644 10,22 4,68 IVe 53

120-

123 3226 1779 1627 10,21

5,02;

q; 3J=7,0

p-Br IIIf 48 188-

190 3281 1769 1621 10,70 4,65 IVf 53

160-

162 3384 1774 1667 10,68

5,01;

q; 3J=7,0

o-NO2 IIIg 60 156-

158 3403 1782 1692 10,98 4,65 IVg 60

141-

143 3399 1770 1702 10,97 4,99;

q;

24

3J=7,0

p-NO2 IIIh 54 179-

181 3384 1774 1667 11,16 4,67 IVh 54

157-

159 3354 1759 1688 11,16

5,01;

q; 3J=7,0

o-OCH3 IIIi 53 132-

134 3315 1767 1656 9,55 4,68 IVi 55

123-

125 3325 1761 1657 9,51

5,01;

q; 3J=7,0

p-OCH3 IIIj 53 175-

177 3278 1773 1648 10,40 4,65 IVj 51

139-

141 3337 1764 1651 10,39

5,0;

q; 3J=7,0

o-

COOCH3 IIIk 51

186-

188 3327 1764 1718 11,35 4,69 IVk 42

121-

122 3286 1766 1664 11,35

5,01;

d; 3J=7,0

p- IIIl 50 186- 3311 1776 1715 10,92 4,66 IVl 50 172- 3327 1764 1718 10,90 5,02;

25

COOCH3 188 174 t; 3J=7,0

26

Bảng trích kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý, phổ IR và 1H-NMR 3-(N-thế cacbamoyl)naphtalen-2-

cacboxylat

OCOR

CONHR 1

Ch

ất R1

Hi

ệu

su

ất,

%

Tn

c,

oC

IR (υ, cm-1,

KBr)

1H-NMR

(δ, ppm; J,

Hz)

Ch

ất R

Hi

ệu

suấ

t,

%

Tnc,

oC

IR (υ, cm-1,

KBr)

1H-NMR

(δ, ppm;

J, Hz)

NH

CO

est

e

CO

ami

t

NH H-12 NH

C

O

est

e

CO

ami

t

NH H-

12

Va C6H

11 53

16

0-

16

330

1

177

5

163

9

8,34

; 4,64

VI

a

(CH2

)2

62 137,

3-

323

4

17

64

164

3

9,9

8

2,5

5;

Dãy Va-d: R = CH2Cl; Dãy Ve-h: R = CH3CHCl

Dãy VIa-c: R1 = o-CH3C6H5; Dãy VId-f: R1 = o-CH3OC6H5

27

1 d;

3J=8

,0

CH3 139 t;

3J

=7

Vb C6H

5 52

18

6-

18

8

330

8

177

3

164

7

10,5

3 4,64

VI

b

CHC

l

CH2

CH3

58 130-

131

336

4

17

62

167

6

10,

06

4,3

9;

q;

3J

=7

,5

Vc C10

H7 61

20

4-

20

6

334

7

175

3

164

5

10,6

4 4,66

VI

c

CHC

l

C6H5

53

147,

1-

148

331

1

17

61

165

1 10

6,2

1

28

Vd C14

H9 52

26

5-

26

6,5

324

8

176

9

166

3

10,7

4

4,96;

q;

3J=7,

0

VI

d

(CH2

)2

CH3

56 94-

95

339

5

17

65

166

3

9,4

7

2,6

0

Ve C6H

11 63

14

6-

14

8

333

5

176

5

160

0

8,36

;

d;

3J=8

,0

5,00;

q;

3J=7,

0

VI

e

CHC

l

CH2

CH3

51 149-

151

339

4

17

65

166

3

9,4

4

4,9

9;

t;

3J

=8

Vf C6H

5 55

18

9-

19

334

6

176

4

165

7

10,5

5

5,00;

q;

3J=7,

VIf

CHC

l

C6H5

59 133-

134

339

7

17

76

166

8

9,5

0

6,2

1

29

1 0

Vg C10

H7 63

17

4-

17

6

323

9

175

3

164

7

10,6

0

5,00;

q;

3J=7,

0

Vh C14

H9 46

18

6-

18

8

324

4

175

9

164

3

10,7

4

4,96;

q;

3J=7,

0

30

Trên phổ IR của các cơ chất tổng hợp được đã

không còn cực đại hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị

của liên kết OH ở vùng 3482-3434 cm-1

. Thay vào đó là

dao động hóa trị của nhóm C=O este ở vùng 1715-1780

cm-1

với cường độ mạnh, chứng tỏ phản ứng este hóa đã

hoàn thành.

Trên phổ 1H-NMR không thấy có pic cộng hưởng

của proton nhóm hiđroxyl δOH ở khoảng 11,02-12,10 ppm,

nhưng lại xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của các proton

nhóm δCH3 ở 2,28; nhóm δClCH2-CO ở 4,66; nhóm δNH

amit ở 10,04 và các nhân phenyl và naphtyl δArH ở 7,16-

8,42 ppm.

Các cơ chất tổng hợp được rất không bền ở điều

kiện bình thường, do đó đã tiến hành ghi phổ ESI-MS. Kết

quả cho thấy pic ion phân tử của chúng phản ảnh đúng với

khối lượng dự kiến.

3.3. Nghiên cứu nhuộm tế bào bạch cầu

Đã nghiên cứu nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch

cầu dùng cơ chất tổng hợp được bằng quy trình chuẩn số 91

do hãng Sigma cung cấp. Quá trình nhuộm được tiến hành

theo hai bước.

Bước 1: Cơ chất bị thủy phân bởi esteraza đặc hiệu

có trong bạch cầu, tạo lập lại 3-(N-thế)naphtalen-2-

cacboxamit Ia-l hoặc IIa-d:

31

CONHR1

OCOR

Esteraza / H2O

Ia-l ; IIa-d

CONHR1

OH

IVa-l ; Va-g ; VIa-fIIIa-l ;

Bước 2: cacboxamit Ia-l hoặc IIa-d sẽ ghép đôi với

muối điazo có sẵn trong tiêu bản nhuộm, tạo nên phẩm azo

có màu đặc trưng:

C

O

N

OCH3

OCH3H

N N Cl

CONHR1

OH

CONHR1

OHN

N

N

OCH3

O

O

HH3C

+

Kết quả nhuộm được đánh giá bằng phương pháp

phân độ và tính điểm theo quy trình 91 của hãng Sigma:

Độ 0: Không có hạt bắt màu thuốc nhuộm.

Độ 1: Ít hạt trên nguyên sinh chất, hạt mịn nhỏ, chiếm

≤ 1/3 bào tương của tế bào.

Độ 2: Số hạt bắt màu trên nguyên sinh chất, hạt trung

bình, chiếm > 1/3 đến < ¾

bào tương của tế bào.

Độ 3: Số hạt bắt màu trên nguyên sinh chất, hạt to,

chiếm hết bào tương của tế bào.

Độ 4: Nhiều hạt phủ kín nguyên sinh chất và nhân, hạt

to.Điểm nhuộm được tính theo công thức:

32

∑Y (điểm) = Y0 x 0 + Y1 x 1 + Y2 x 2 + Y3 x 3 +

Y4 x 4

Hoạt tính cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu

người được đánh giá theo hai tiêu chí, một là độ đặc hiệu,

hai là độ nhạy.

Độ đặc hiệu của cơ chất là khả năng phản ánh đúng

thực trạng tế bào-có esteraza phải dương tính, không có,

phải âm tính.

Độ nhạy của cơ chất là giới hạn phát hiện esteraza

trong tế bào bạch cầu, giới hạn phát hiện càng nhỏ thì độ

nhạy càng cao. Cơ chất có độ nhạy càng cao thì điểm

nhuộm càng cao.

3.3.1. Tối ưu hoá phản ứng nhuộm esteraza tế bào bạch

cầu

Đã tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm

esteraza đặc hiệu sử dụng cơ chất napthol AS-D cloaxetat

của hãng Sigma-Aldrich theo phương pháp đơn hình. Thiết

kế quy hoạch hóa thực nghiệm gồm 6 biến là nhiệt độ

nhuộm (X1), hàm lượng DMF (X2), DMSO (X3), cơ chất

(X4), muối điazo (X5) và pH (X6). Chọn thời gian cố định

10 phút, hệ dung môi gồm 3 cấu tử DMSO, DMF và nước.

Lựa chọn mức gốc thực nghiệm thể hiện ở bảng 3.17.

Bảng 3.17: Lựa chọn mức gốc thực nghiệm (1,5ml)

Nhân tố X1,

T0C

X2, µl X3,

µl

X4,

mg

X5,

mg X6, pH

Mức 37,0 4,50 4,50 0,45 0,45 7,30

33

gốc

i 2,0 0,750 0,75 0,15 0,15 0,30

Sau khi thực hiện các thí nghiệm tại các đỉnh đơn hình,

đã thu được thông số tối ưu cho các thành phần dung dịch

cơ chất nhuộm tế bào với thể tích 1,5 ml, như sau:

+ Naphtol AS-D cloaxetat:

0,480 mg.

+ Muối diazo: Fast blue BB

0,459 mg.

+ DMF

43,6 µl.

+ DMSO

44,53 µl.

+ Đệm photphat pH=7,42 (Sörensen) ):

1.411,87 µl.

Xử lý dữ liệu bằng chương trình thống kê SPSS 17.0, cho

thấy, độ tin cậy của điểm nhuộm 95,67% ± 0,76 (p = 0,95).

Kết quả nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người được thể

hiện trên bảng sau:

34

Bảng kết quả điểm nhuộm của 3-(N-thế cacbamoyl)naphtalen-2-yl-cacboxylat

OCOR 1

CONHRX

Chất X R R1 Điểm Chất X R R1 Điểm Chất X R R1 Điểm

IIIa o-CH3 C6H4 CH2Cl 235 IVa o-CH3 C6H4 CH3CHCl 301 Vb -H C6H4 CH2Cl 2

IIIb p-CH3 C6H4 CH2Cl 4 IVb p-CH3 C6H4 CH3CHCl 315 Vc -H C10H6 CH2Cl 259

IIIc o-Cl C6H4 CH2Cl 26 IVc o-Cl C6H4 CH3CHCl 350 Vd -H C14H8 CH2Cl 20

IIId p-Cl C6H4 CH2Cl 9 IVd p-Cl C6H4 CH3CHCl 89 Ve -H C6H10 CH3CHCl 9

IIIe o-Br C6H4 CH2Cl 22 IVe o-Br C6H4 CH3CHCl 159 Vf -H C6H4 CH3CHCl 5

IIIf p-Br C6H4 CH2Cl 6 IVf p-Br C6H4 CH3CHCl 42 Vg -H C10H6 CH3CHCl 50

IIIg o-NO2 C6H4 CH2Cl 138 IVg o-NO2 C6H4 CH3CHCl 188 Vh -H C14H8 CH3CHCl 15

35

IIIh p-NO2 C6H4 CH2Cl 58 IVh p-NO2 C6H4 CH3CHCl 180 VIa o-

CH3 C6H4 CH3CH2CH2 19

IIIi o-OCH3 C6H4 CH2Cl 256 IVi o-OCH3 C6H4 CH3CHCl 400 VIb o-

CH3 C6H4 CH3CH2CHCl 245

IIIj p-OCH3 C6H4 CH2Cl 48 IVj p-OCH3 C6H4 CH3CHCl 389 VIc o-

CH3 C6H4 C6H5CHCl 52

IIIk o-

COOCH3 C6H4 CH2Cl 62 IVk

o-

COOCH3 C6H4 CH3CHCl 79 VId

o-

OCH3 C6H4 CH3CH2CH2 26

IIIl p-

COOCH3 C6H4 CH2Cl 189 IVl

p-

COOCH3 C6H4 CH3CHCl 299 VIe

o-

OCH3 C6H4 CH3CH2CHCl 377

Va -H C6H10 CH2Cl 6 VIf o-

OCH3 C6H4 C6H5CHCl 41

36

3.3.2. Nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính

của cơ chất

3.3.2.1. Ảnh hưởng hiệu ứng electrron của các nhóm thế

X

Đối tượng để nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng electron

của nhóm thế X là các cơ chất dãy III và IV, có cấu trúc

phân tử như sau:

O

O

N

H

O R

X

Kết quả nhuộm cho thấy:

Độ đặc hiệu: kết quả nhuộm esteraza cho thấy, tất

cả 26 cơ chất ở trên đều đặc hiệu đối với các loại tế bào

bạch cầu người.

Độ nhạy: căn cứ điểm nhuộm trên bảng trang 10 có

thể thấy:

- Các naphtol AS-X cacboxylat IIIa-h, IVa-h đều

cho điểm nhuộm cao hơn (tức là có độ nhạy cao hơn) so với

naphtol AS cacboxylat Vb và VIb không có nhóm thế X

trong nhân N-phenyl amit.

- Không phân biệt vị trí, các nhóm thế đẩy electron

đều cho điểm nhuộm trung bình cao hơn so với các nhóm

R = CH2Cl: X = o-CH3 (IIIa), p-CH3 (IIIb), o-Cl

(IIIc), p-Cl (IIId), o-Br (IIIe), p-Br (IIIf), o-NO2 (IIIg),

p-NO2 (IIIh), o-OCH3 (IIIi), p-OCH3 (IIIj), o-

COOCH3 (IIIk), p-COOCH3 (IIIl).

R = CH3CHCl: X= o-CH3 (IVa), p-CH3 (IVb), o-Cl

(IVc), p-Cl (IVd), o-Br (IVe), p-Br (IVf), o-NO2 (IVg),

p-NO2 (IVh), o-OCH3 (IVi), p-OCH3 (IVj), o-

COOCH3 (IVk), p-COOCH3 (IVl).

R = CH3Cl: X = H (Vb); R = CH3CHCl: X = H (VIb)

37

thế hút electron; trong khi đó, hầu hết các nhóm thế hút

electron ở vị trí octo- có điểm nhuộm trung bình cao hơn so

với các nhóm thế cùng bản chất ở vị trí para- (trừ trường

hợp X = COOCH3).

- Điểm nhuộm trung bình của cơ chất naphtol AS-OL

-clopropionat (IVi) cao nhất, cao hơn cả cơ chất naphtol AS-

D cloaxetat do hãng Sigma bán trên thị trường. Điều đó chứng

tỏ, naphtol AS-OL -clopropionat có độ nhạy cao nhất đối với

phản ứng nhuộm esteraza bạch cầu người.

3.3.2.2. Ảnh hưởng của gốc N-R1 amit

Đối tượng được lựa chọn để khảo sát hiệu ứng không

gian gồm 8

cơ chất là 3-(xiclohexyl/phenyl/naphtalen-1-yl/antraxen-1-

ylcacbamoyl)

naphtalen-2-yl-cloaxetat và -clopropionat (Va-h) có kích

thước gốc N-hiđrocacbon amit khác nhau:

Va-h

CONHR1

O C

O

R

Kết quả nhuộm cho thấy:

Độ đặc hiệu: tất cả 8 cơ chất Va-h ở trên đều có

tính đặc hiệu đối với các loại tế bào bạch cầu người.

Độ nhạy: căn cứ điểm nhuộm trang 16 có thể thấy:

- Các gốc N-hiđrocacbon no (N-xiclohexyl) và không

chứa nhóm thế X (N-phenyl) nhóm amit, thể tích bé, án

R1 = Xiclohexyl : R = CH2Cl (Va), CH3CHCl (Vb).

R1 = C6H5 : R = CH2Cl (Vc), CH3CHCl (Vd).

R1 = Naphtyl : R = CH2Cl (Ve), CH3CHCl (Vf).

R1 = Antraxyl : R = CH2Cl (Vg), CH3CHCl (Vh).

38

ngữ không gian nhỏ, nhưng điểm nhuộm gần bằng nhau

và rất thấp, chứng tỏ độ nhạy đối với phản ứng nhuộm esteraza rất kém.

- Gốc N-antraxyl có kích thước lớn nhất, nhưng điểm

nhuộm cũng không cao, điều đó chứng tỏ điểm nhuộm

esteraza tế bào bạch cầu không tỷ lệ thuận với kích thước

gốc N-hiđrocacbon nhóm amit.

- Gốc N-naphtyl có kích thước trung bình, lớn hơn N-

xiclohexyl và N-phenyl, nhưng nhỏ hơn N-antraxyl, có

điểm nhuộm cao nhất trong dãy các cơ chất Va-h. Điều

đó chứng tỏ các gốc N-hiđrocacbon nhóm

amit kích thước trung bình thuận lợi hơn cho sự tấn công

của esteraza vào liên kết este cacboxylat. Điều đó là phù

hợp với lý thuyết về tính chọn lọc của các phản ứng có sự tham gia của enzym.

3.3.2.3. Ảnh hưởng của các gốc cacboxylat

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hiệu ứng điện tử của

các nhóm thế X trong các este IIIa-h, IVa-h và hiệu ứng

không gian của các gốc hiđrocacbon trong các este Va-h đã

tìm được AS-OL α-propionat (IVi) có độ nhạy cao nhất đối

với phản ứng nhuộm esteraza bạch cầu người. Để kết quả

có độ tin cậy cần thiết, đã nghiên cứu ảnh hưởng của gốc

cacboxylat với mạch hiđrocacbon kích thước khác nhau lên

độ nhạy và độ đặc hiệu của cơ chất. Các gốc cacboxylat

được lựa chọn, ngoài cloaxetat và α-clopropionat ở trên,

còn có butyrat, α-clobutyrat và α-clophenylaxetat. Để so

sánh đối chứng, đã đồng thời khảo sát thêm các cơ chất

naphtol AS-D cũng chứa các gốc cacboxylat kể trên. Trong

phần này cũng đã xem xét đánh giá vai trò của nguyên tử

clo đối với hoạt tính của cơ chất.

39

Các cơ chất khảo sát có cấu trúc như sau:

O

O

N

H

O R

X

Kết quả nhuộm cho thấy:

Độ đặc hiệu:

Tất cả 10 cơ chất trên đều có tính đặc hiệu với esteraza

đặc hiệu bạch cầu người.

Độ nhạy:

- Đối với cơ chất là các este điều chế từ naphtol AS-D và

naphtol AS-OL thì gốc cacboxylat với mạch hiđrocacbon 3 nguyên tử cacbon có độ nhạy cao nhất.

- Đối với các cơ chất với gốc cacboxylat giống nhau, chứa

từ 2-4 nguyên tử C thì este của naphtol AS-OL có độ

nhạy cao hơn của naphtol AS-D. Độ nhạy cao nhất thuộc

về naphtol AS-OL -clo-propionat (tức là gốc cacboxylat chứa ba nguyên tử cacbon).

- Các cơ chất mà gốc cacboxylat có chứa nguyên tử clo ở

vị trí alpha có độ nhạy đối với esteraza đặc hiệu cao hơn

khi không chứa clo.

- Gốc -clophenylaxetat (CHClC6H5) có độ nhạy thấp nhất

đối với phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu. Có

lẽ do nhóm CHClC6H5 thể tích lớn, không thuận lợi cho

sự tiếp cận của esteraza đến nguyên tử cacbon cacbonyl

của nó. Điều này hoàn toàn phù hợp bởi phản ứng thuỷ

phân este của naphtol AS-D (OL) xúc tác bằng esteraza

X = o-CH3: R = CH2Cl (IIIa), CH3CHCl (IVa), CH3(CH2)2 (VIa),

CH3CH2CHCl (VIb), C6H5CHCl (VIc)

X = o-OCH3: R = CH2Cl (IVa), CH3CHCl (IVi), CH3(CH2)2

(VId), CH3CH2CHCl (VIe), C6H5CHCl (VIf)

40

đặc hiệu có sự chọn lọc cao về cấu hình không gian tại

tâm hoạt động.

Kết quả thu được một lần nữa khẳng định rằng, cơ chất

có độ nhạy cao nhất đối với phản ứng nhuộm esteraza đặc

hiệu tế bào bạch cầu người chứa nhóm metoxi ở vị trí octo-

và có kích thước gốc cacboxylat trung bình, khoảng 3-4

nguyên tử cacbon. Căn cứ điểm nhuộm trên các bảng 3.21,

3.22 và 3.25 (xem luận án), naphtol AS-OL -clopropionat

có cấu trúc đáp ứng tốt nhất về mặt cấu hình, để esteraza

đặc hiệu bạch cầu phát huy tính chọn lọc đối với phản ứng

nhuộm tế bào [55, 89].

41

Hình 3.13. Kết quả nhuộm esteraza bạch cầu người

bằng các cơ chất naphtol AS-D và naphtol AS-OL

cloaxetat và -clopropionat

3.4. Nghiên cứu mối tương quan giữa hoạt tính và cấu

trúc của các cơ chất bằng phương pháp tính hóa lượng

tử

Sau khi đã tối ưu hóa cấu trúc hình học của phân tử cơ

chất bằng phần mềm Gaussian, sử dụng phương pháp tính

toán thống kê mối tương quan giữa góc nhị diện (tạo bởi

các liên kết quanh nhóm C=O este) và điểm nhuộm đã tìm

được phương trình hồi quy:

Naphtol AS-D cloaxetat

Naphtol AS-D -clopropionat

Naphtol AS-OL cloaxetat

Naphtol AS-OL -clopropionat

42

Log(điểm nhuộm) = 0,303 x G1 – 0,5855 x G2 + 159,609

(3.1)

Trong đó các góc G1 và

G2 là góc nhị diện tạo bởi

các liên kết quanh nhóm

C=O este.

Hình 3.14. Góc nhị diện

của

nhóm cacboxylat

Để kiểm tra độ chính xác của phương trình hồi quy đã

tính toán bằng phần mềm Gaussian đối với bốn cơ chất

VIa, b, d, e là những chất tương đồng về mặt cấu trúc (đều

là các este của naphtol AS-D và OL với các gốc este mạch

thẳng) và so sánh với điểm nhuộm thực nghiệm. Kết quả

cho thấy, phương trình hồi quy mô tả đúng so với thực

nghiệm là 86,8%.

3.5. Nghiên cứu sản xuất kít bằng cơ chất mới naphtol

AS-OL -clopropionat (IVi)

43

Ứng dụng kết quả kế hoạch hóa thực nghiệm, đã tiến

hành sản xuất bộ kít bằng cơ chất mới naphtol AS-OL -

clopropionat (IVi):

3.5.1. Thành phần bộ kít cho 50 tiêu bản nhuộm:

Dung dịch cố định 50 ml ký hiệu R1; dung dịch đệm

(Sörensen) pH=7,42 50 ml ký hiệu R4 và dung dịch nhuộm

nhân nuclear fast red 0,2% 50 ml ký hiệu R5 được bảo

quản ở nhiệt độ 250C. Dung dịch cơ chất 5 ml ký hiệu R2

và dung dịch muối điazo một lọ 5 ml ký hiệu R3, bảo quản

ở nhiệt độ <-200C.

3.5.2. Tài liệu hướng dẫn sử dụng bộ kít

Đã xây dựng tài liệu hướng dẫn nhuộm esteraza đặc

hiệu bạch cầu người bằng bộ kít chế tạo.

3.5.3- Đánh giá chất lượng bộ kít (xem phụ lục Biên bản

kiểm định)

Việc kiểm định được tiến hành tại Phòng tế bào của

Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương cho kết quả: Độ

nhạy tương đương, độ đặc hiệu tốt hơn của Sigma 1,188

lần.

3.5.4. Nghiên cứu thời gian bảo quản và sử dụng kít

Độ ổn định của bộ kít nằm trong khoảng 12-14 tháng.

3.5.5. Ứng dụng bộ kít để chẩn đoán dòng tế bào trên

bệnh nhân bị bệnh bạch cầu cấp

Đã sử dụng bộ kít sản xuất từ cơ chất naphtol AS-OL

-clopropionat tổng hợp được và kít của hãng Sigma với

cơ chất là naphtol AS-D cloaxetat nhuộm esteraza đặc hiệu

20 mẫu tuỷ của bệnh nhân đã được chẩn đoán dòng bằng

44

các phương pháp miễn dịch và di truyền theo tiêu chuẩn

FAB tại viện Huyết học-Truyền máu TW. Kết quả bộ kit

chế tạo được có tính đặc hiệu tương đương với sản phẩm

của hãng Sigma, nhưng độ nhạy cao hơn 1,22 lần. Đặc biệt

đối với thể M3 độ nhạy của bộ kít cao hơn 30% so với bộ

kít của hãng Sigma.

45

KẾT LUẬN

1. Đã nghiên cứu tổng hợp được 16 dẫn xuất 3-hiđroxi-N-(xiclohexyl/aryl thế)naphtalen-

2-cacboxamit, trong đó có ba chất mới bằng phương pháp truyền thống một giai đoạn

và bằng kỹ thuật mới sử dụng lò vi sóng. Kết quả thực nghiệm chứng tỏ phương pháp

lò vi sóng có ưu thế vượt trội về thời gian, năng lượng tiêu hao, hiệu suất sản phẩm,

nhờ đó các hợp chất cacboxamit thu được với giá thành hợp lý, có thể dùng làm

nguyên liệu để điều chế cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người.

2. Đã nghiên cứu cải tiến quy trình phản ứng giữa các 3-hiđroxi-N-(xiclohexyl/ aryl

thế)naphtalen-2-cacboxamit với dẫn xuất α-clo của clorua axít khác nhau. Kết quả đã

tổng hợp được 38 este 3-(xiclohexyl/aryl thế cacbamoyl)naphtalen-2-yl

cacboxylat, trong đó có 36 chất mới có thể làm cơ chất nhuộm tế bào bạch cầu người.

3. Đã nghiên cứu xác định độ tinh khiết, cấu trúc của các dẫn suất 3-hiđroxi-N-

(xiclohexyl/aryl thế)naphtalen-2-cacboxamit và các cơ chất tương ứng bằng các

phương pháp hóa lý hiện đại. Kết quả thu được đã khẳng định các hợp chất tổng hợp

được có cấu trúc phù hợp với dự kiến và đạt độ tinh khiết tương đương sản phẩm

nhập ngoại.

4. Đã nghiên cứu sử dụng các cơ chất điều chế được để nhuộm tế bào bạch cầu. Kết quả

cho thấy cả 38 dẫn xuất 3-(xiclohexyl/aryl thế cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat

đều có hoạt tính đối với esteraza đặc hiệu bạch cầu người, trong đó naphtol AS-OL

α-clopropionat có hoạt tính cao hơn sản phẩm thương mại naphtol AS-D cloaxetat do

hãng Sigma chế tạo.

5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hiệu ứng electron, hiệu ứng không gian của các

nhóm thế và các góc nhị diện tạo bởi nhóm cacboxyl lên độ đặc hiệu, độ nhạy của cơ

chất đối với phản ứng nhuộm esteraza cho thấy: Các nhóm thế đẩy cho điểm nhuộm

cao hơn các nhóm thế hút điện tử, các nhóm thế hút điện tử ở vị trí octo- cho điểm

nhuộm cao hơn ở vị trí para-; điểm nhuộm cao nhất thuộc về các nhóm N-

hiđrocacbon amit thế và cacboxylat kích thước trung bình.

6. Đã nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm esteraza bằng phương pháp quy hoạch hóa

thực nghiệm đơn hình và ứng dụng để chế tạo bộ kít nhuộm esteraza đặc hiệu bạch

cầu người bằng cơ chất mới naphtol AS-OL α-clopropionat tổng hợp được. Kết quả

kiểm định trên máu của người bình thường và tủy bệnh nhân ở Viện Huyết học-

Truyền máu trung ương cho thấy, bộ kit chế tạo được có tính đặc hiệu tương đương

với sản phẩm của hãng Sigma, nhưng độ nhạy cao hơn 1,188 lần, được khuyến cáo

đưa vào sản xuất thay thế sản phẩm nhập ngoại.

46

KIẾN NGHỊ

Được nghiên cứu triển khai sản xuất kít nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người

thương mại cung cấp cho các phòng xét nghiệm Huyết học - Truyền máu tại Việt Nam

thay thế hàng nhập khẩu.

References

TIẾNG VIỆT

1. Đỗ Thị Vinh An, Phạm Quang Vinh, Phan Văn Chi, Nguyễn Thị Bích Nhi

(2010), “Bước đầu tìm hiểu một số biến đổi protein ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng

lympho tại khoa Huyết học Truyền máu bệnh viện Bạch Mai”, Tạp chí Y học Việt Nam

tập 373, tr. 267-270.

2. Nguyễn Bá Đức, Nguyễn Chấn Hùng, Huỳnh Quyết Thắng, Nguyễn Duy

Thăng, Lại Phú Thưởng, Nguyễn Văn Vy, Phó Đức Mẫn, Tôn Thất Cầu, Vũ Hô, Nguyễn

Lam Hòa, Nguyễn Hoài Nga và CS (2004), “Kết quả bước đầu nghiên cứu dịch tễ học

mô tả một số bệnh ung thư tại 6 vùng địa lý Việt Nam giai đoạn 2001-2003”, Tạp chí Y

học thực hành tập 498, tr. 11-15.

3. Nguyễn Phương Liên, Nguyễn Ngọc Diệp, Nguyễn Tấn Bỉnh (2010), “Xác

định kiểu hình dấu ấn miễn dịch tế bào phù hợp để đánh giá tế bào tồn lưu ác tính ở bệnh

nhân mắc bệnh bạch cầu cấp”, Tạp chí Y học Việt Nam tập 373, tr. 339-344.

4. Phan Tống Sơn, Trần Quốc Sơn, Đặng Như Tại (1980), Cơ sở hóa học hữu

cơ, tập 1, NXB ĐH&THCN, Hà Nội.

5. Đặng Như Tại, Ngô Thị Thuận (2010), Hóa học hữu cơ tập 1, NXBGD, Hà

Nội.

6. Nguyễn Anh Trí (2010), Tiền lơxêmi và lơxêmi cấp, Nhà xuất bản Y học,

Hà Nội.

7. Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Thị Kim Định, Phan Thị Xinh (2010),

“Khảo sát 4 tổ hợp gen thường gặp trong bạch cầu cấp dòng lympho tại BV Truyền máu-

Huyết học TP HCM”, Tạp chí Y học Việt Nam tập 373, tr. 180-185.

8. Nguyễn Triệu Vân, Lê Xuân Hải, Thiều Thị Hằng (2010), “Bước đầu ứng

dụng kỹ thuật flow cytometry để xếp loại lơxêmi cấp tại Viện Huyết học-Truyền máu

trung ương”, Tạp chí Y học Việt Nam tập 02, tr. 237-243.

47

TIẾNG ANH

9. Albert Bartk-Partay (2010), The Gaussian Approximation Potential: An

Interatomic Potential Derived from first principles quantum mechanic, Springer, New

York.

10. Ales Imramovsky, Jarmila Vinsova, Juana Monreal Ferriz, Vladimir

Buchta, Josef Jampilek (2009), “Salicylanilide esters of N-protected amino acid as novel

antimicrobial agent”, Bioogarnic & medicinal chemistry letters, Czech Vol 19, pp. 348-

351.

11. Allen D W., John C. Tebby, C Dennis Hall (2005), Organophosphorus

Chemistry, Vol 34, Royal Society of Chemistry.

12. Ankit K. Jain, Rajeev K. Singla (2011), “An overview of microwave

assisted technique: green synthesis”, Pharmaceutical sciences, India Vol 2 (9), pp. 1-3.

13. Arieh Warshel (2001), Computer modeling of chemical reactions in

enzymes and solutions, John Wiley & Sons, Inc., New York.

14. Barrnett, R. J. And Seligman, A. M. (1951), “Histochemical demonstration

of esterase by production of indigo”, Science Vol 114, pp. 579-582.

15. Barth EE, Hallworth R, Nichols MG (2005), “A comparison of the

sensitivity of photodamage assays in rat basophilic leukemia cells”, J. Photochem

Photobiol Vol 81 (3), pp. 556-62.

16. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, et al.(1976), “Proposals for the

classification of the acute leukaemias. French-American-British (FAB) co-operative

group”, Br. J. Haematol. Vol 33 (4), pp. 451–458.

17. Bruce C. Gates, Helmut Knözinger (2006), Advances in Catalysis,

Academic press, Elsevier, California.

18. Burstone, M. S. (1957), “Esterase activity of developing bones and teeth”,

A. M. A. Arch. Path. Vol 60, pp. 164 – 167.

19. Carl A. Burtis, Edward R. Ashwood, DBruns (2006), Tietz textbook of

Clincal chemistry and molecular diagnostics, Elsevier Saunders, USA.

20. Catovsky D (1994), Practical Haematology, Churchill Livingstone, Hong

Kong.

21. Charlotte Wiles, Paul Watts (2011), Micro Reaction Technology in Organic

Synthesis, CRC Press, New York.

22. Chemat F., M. Poux, J-L Di Martino, J. Berlan (1996), “An original

microwave-ultrasound combined reactor suitable for organic synthesis: application to

48

pyrolysis and esterification”, J. of microwave power and electromagnetic energy Vol

31(1), pp. 19-21.

23. Christoph Tamm (1992), “Pig liver esterase catalysed hydrolysis substrate

specificity and stereoselectivity”, Pure & Pppl. Chem Vol 64 (8), pp. 1187-1191.

24. Clément Cazorla, Émilie Pfordt, Marie-Christine Duclos, Estelle Métay and

Marc Lemaire (2011), “O-Alkylation of phenol derivatives via a nucleophilic

substitution”, Green Chem. Vol (13), pp. 2482-2488.

25. David C. Young (2001), Computational chemistry, John Wiley & Sons

Inc., Canada.

26. David M. Levine, Mark L. Berenson, David Stephan (1997), Statistics for

managers using Microsoft® Excel, Prentice-Hall Inc., New York.

27. David Swirsky and Barbara J. Bain (2006), Practical Haematology,

Churchill Livingstone, Hong kong.

28. Davis NF, Callanan A, McGuire BB, Flood HD, McGloughlin TM. (2011),

“Evaluation of viability and proliferative activity of human urothelial cells cultured onto

xenogenic tissue-engineered extracellular matrices”, J. Urology Vol 77 (4), pp.

1001-7.

29. Divyen Patel and et al (2008), “Subcellular Fractionation studies indicate

an intracellular localzation for human specific esterase (MSE)”, British Journal of

Haematology Vol 84 (4), pp. 608-614.

30. Donald W. Rogers (2003), Computational chemistry using the PC, John

Wiley & Sons, Inc., New Jersey.

31. Eric Jean Amigues, Christopher Hardacre, Gillian Keane, Marie Eugenie

Migaud (2008), “Solvent-modulated reactivity of PCl3 with amines”, J. Green

Chemistry Vol 10 (6), pp. 660-669.

32. European Commission (1997), European Customs Inventory of Chemical

Substances: Numerical list (by CUS-number); Correlation between CAS- and CUS-

numbers, Office for Official Publications of the European Communities.

33. Evelyn H.Wilson, Highland Park, N.J (1959), Process for producing oxy

aromatic acid chlorides, United States, Patent 2899458.

34. Fei Xuenging, Zhang Tiangyong, Zhou Chunlong (1999), “Synthesis of

derivatives of naphtol AS containing polar group and modification used for C.I. pigment

red 57”, Dyes and pigments Vol 40, pp. 199-204.

49

35. Fei Xuening, Zhang Tianyong, Zhou Chunlong (1999), “Synthesis of

derivatives of Naphtol AS containing polar groups and modification used for C.I.

Pigment Red 57”, Dyes and Pigments, Elsevier Vol 40(2), pp. 199–204.

36. Gaithersburg MD (2010), NIST Standard Reference Database, National

Institute of Standards and Technology.

37. George V. Artwelle, Francis G. Wislon, Marc Ansseau, Julien S. Baker,

Carolyn A. Bondy (2008), New Human Growth Hormone Research, Nova Science

Publishers, Inc., New York.

38. Gignac SM, Hu ZB, Denkmann SA, Uphoff CC, Drexler HG (1996),

“Esterase isoenzyme profiles of 255 leukemia-lymphoma cell lines from all

hematopoietic cell lineages”, Leuk Lymphocytesm Vol 22, pp. 143-151.

39. Gomori G (1953), “Chloroacyl esters as histochemical substrates”,

J. Histochemistry & Cytochemistry Vol 1, pp. 469-470.

40. Guo L, Q L Wang, Q Q Jiang, Q J Jiang, Y B Jiang (2007), “Anion-Trigger

Sub-Dependent Conformation Switch of Salicylanilide. Rel Understanding Inhibitory

Mech Salicylanilide [protein tyrosine kinase EGFR]”, JOC Vol.72 (26), pp. 9947-9953.

41. Hashimoto Mitsuru (1981), New disazo compound and production thereof,

Japan, Patent No. 56152868.

42. Hashimoto, Mitsuru (1995), Bisazo compounds useful as charge generating

materials, Japan, Patent No. 5459247.

43. Hayhoe FGJ, Quaglino D (1980), Haematological cytochemistry,

Edinburgh Churchill Livingstone, London.

44. Henryk Dancygier (2010), Clinical Hepatology: Principles and Practice of

Hepatobiliary Diseases, Vol 1, Springer, New York.

45. Herbst W, Hunger K (2004), Industrial organic pigments, Wiley-VCH,

Darmstadt.

46. Horwitz D. A., D.Allinson P., Ward & Nancy Kight (1977), “Identification

of human mononuclear leukocyte populations by”, Clin. exp. Immunol. Vol 30, pp. 289-

298.

47. Jagat J. Mukherjee, Francis T. Jay and Patrick C.Choy (1993),

“Purification, characterization and modulation of a microsomal carboxylesterase in rat

liver for the hydrolysis of acyl-CoA”, J. Biochem Vol 295, pp. 81-86.

48. Jan-Christer Janson (2011), Protein Purification: Principles, High

Resolution Methods, and Applications, Wiley, New Jersey.

50

49. Janice L. Hyatt, Randy M. Wadkins, Lyudmila Tsurkan, Latorya D. Hicks,

M. Jason Hatfield, Carol C. Edwards, Charles R. Ross II, Stephanie A. Cantalupo, Guy

Crundwell, Mary K. Danks, R. Kip Guy, Philip M. Potter (2007), “Planarity and

constraint of the carrbonyl groups in 1,2-diones are determinants for selective inhibition

of human carboxylesterase 1”, J. Med. Chem Vol 50 (23), pp. 5727–5734.

50. Janice R. Connor, Robert A. Dodds, Ian E. James, Maxine Gowen (1995),

“Human osteoclast and giant cell differentiation, The apparent switch from nonspecific

esterase to tartrate resistant acid phosphatase activity coincides with the in situ expression

of osteopontin mRNA”, J. Histochemistry and Cytochemistry Vol 43 (12), pp. 1193-

1201.

51. Jarmila Vinsova, Ales Imramovsky, Vladimir Buchta, Martina Ceckova,

Martin Dolezal, Frantisek Staud, Josef Jampilek and Jarmila Kaustova (2007),

“Salicylanilide acetates: Synthesis and antibacterial evaluation”, J. Molecular, pp.

1420-3049.

52. Jeanette E. Stok, Andrey Goloshchapov, Cheng Song, Craig E. Wheelock,

Maher B.H. Derbel, Christophe Morisseau, Bruce D. Hammock (2004), “Investigation of

the role of a second conserved serine in carboxylesterases via site-directed mutagenesis”,

Archives of Biochemistry and Biophysics Vol 430, pp. 247–255.

53. John P. Greer, John Foerster, George M. Rodgers, Frixos Paraskevas, Bertil

Glader, Daniel A. Arber, Robert T. Means, Jr. (2009), Wintrobe’s clinical hematology

Vol 1, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, USA.

54. John Shore, Geoffrey Hallas (2002), Colorants and auxiliaries organic

chemistry and application properties, Society of dyers and colourists, Bradford.

55. Jose Manuel Andrade-Garda (2009), Basic Chemometric Techniques in

Atomic Spectroscopy, RSC Publishing, London.

56. Joseph Chayen, Lucille Bitensky (1994), Practical histochemistry, Wiley,

London.

57. Judith E. Karp (2007), Acute myelogenous leukemia, Humana Press,

Totowa, New Jersy.

58. Kaphalia BS, Fritz RR, Ansari GA (1997), “Purification and

characterization of rat liver microsomal fatty acid ethyl and 2-chloroethyl ester synthase

and their relationship with carboxylesterase, issue pI 6,1”, Chem Res Toxical Vol 10 (2),

pp. 211-218.

51

59. Kock-Yee Law, Ihor W. Tarnawskyj (1994), “Azo pigments and their

intermediates. A new class of couplers for red and near-IR sensitive photogenerating azo

pigments”, Dyes and Pigments Vol 25 (4), pp. 281–293.

60. Koichi Tanaka (2003), Solvent-free organic synthesis, Wiley-VCH Verlag

GmBH & Co. KGaA, Weinheim.

61. Kurt Faber (2011), Biotransformations in Organic Chemistry: A Textbook,

Springer, New York.

62. Langmann T, Aslanidis C, Schuierer M and Schmitz G (1997),

“Differentiation-dependent expression of a human carboxylester- ase in monocytic cells

and transcription factor binding to the promoter”, Biochem Biophys Res Vol 230, pp.

215-219.

63. Lawrence I. Gilbert, Sarjeet S. Gill (2010), Insect Pharmacology: Channels,

Receptors, Toxins and Enzymes, Elsevier, San Diego.

64. Leder L. D (1970), “Diagnostic experiences with the naphthol AS-D

chloroacetate esterase reaction”, Annals of Hematology Vol. 21 (1), pp. 1-8.

65. Li CY, Lam KW, Yam LT (1973), Esterases in human leucocytes”,

J. Histochem. Cytochem Vol 21, pp. 1-12.

66. Li Xu (2008), Mass spectrometric analysis of environmentally relevant

phenolic compounds, Proquest, New Jersey.

67. Liu, W. Yan, Q. Wang, H. Xiong, J. Zhou, He, H. Yang, C. Hu (2001),

“Process for preparing Naphthol AS products”, Chem Abstr, Faming Zhuanli Shenging

Gongkai Shuomingshu, CN 1251834.

68. Margaret Robson Wright (2004), An introduction to chemical kinetics,

John Wiley & Sons, Ltd, UK.

69. Mark David Gottsegen (2006), The painter's handbook: a complete

reference, Watson-Guptill.

70. Medda S, Proia RL (1992), “The carboxylesterase family exhibits C-

terminal sequence diversity reflecting the presence or absence of endoplasmic-reticulum-

retention sequences”, “Eur J Biochem” Vol 206 (3), pp. 801-806.

71. Meniai-Belayat FZ, Coignoul F, Meniai K, Dewaele A (1990), “Alveolar

macrophages of sheep: purification and identification”, Ann Rech Vet. Vol 21 (3), pp.

205-209.

72. Merck (1995), “Enzyme cytochemistry Leucognost/HematoGnost Fe;

Working instructions for simpified cytochemical staining for differentiation of

leukaemias and myelodysplastic syndromes”, E. Merck, D-64271 Darmstadt, pp. 9-17.

52

73. Michael Coleman (2010), Human Drug Metabolism: An Introduction,

Wiley, Wilts, UK.

74. Moe W., Kazutaka K., Yasushi M. et al (2008), “Diagnosis of acute

myeloid leukemia according to the WHO classification in the Japan adult leukemia study

group AML-97 protocol”, International Journal of Hematology Vol 87 (2), pp. 144-151.

75. Nicola J. Roger, Simon C. Apte (2004), “Azo dye method for mapping

relative sediment enzyme activity in situ at precise spatial locations”, Environ. Sci.

Technol Vol 38, pp. 5134-5140.

76. Paul R. Blakemore, Philip J. Kocieński, Andrew Morley, Kenneth Muir

(1999), “A synthesis of herboxidiene”, J. Chem. Soc Vol 1, p. 955.

77. Pedro J. Chedrese (2009), Reproductive Endocrinology: A Molecular

Approach, Springer, New York.

78. Ramesh Chandra Gupta (2009), Handbook of toxicology of chemical

warfare agents, Elservier, San Diego.

79. Robert E. Lenga, Kristine L. Votoupal (1993), The Sigma-Aldrich library

of regulatory and safety data, Sigma-Aldrich Corporation Vol 2, pp. 2275 - 2033.

80. Robert Irving Krieger, Wayland J. Hayes (2010), Hayes’ handbook of

pesticide toxicology, Elsevier, San DiegoVol 2, p. 1435.

81. Robert N. Fontaine, Christopher P. Carter, David Y. Hui (1991), “Structure

of the rat pancreatic cholesterol esterase gene”, Biochemistry Vol 30 (28), pp. 7008–

7014.

82. Robert O. Dillman (2009), Principles of Cancer Biotherapy, 5th edition,

Springer, California.

83. Ronai A, Berning W, Gaa A, von Deimling O. (1993), “Esterase-30 (ES-

30) of the house mouse: biochemical characterization and genetics of a new

carboxylesterase isozyme linked to cluster-2 loci on chromosome 8”, Biochem Genet Vol

31 (7-8), pp. 279-294.

84. Rozenszajn L, Leibovich M, Shoham D, Epstein J (1968), “The esterase

activity in megaloblasts, leukaemic and normal haemopoietic cells”, Br. J. Haematol, Vol

14, pp. 605-619.

85. Ruth Nussinov, Gideon Schreiber (2009), Computational protein-protein

interactions, Taylor & Francis group, LLC., Maryland.

86. Sabnis R.W. (2007), Hand book of acid-Base indicators, Taylor and frames,

inc, San Francisco.

53

87. Scott DF, Chacko TL, Maxwell DM, Schlager JJ, Lanclos KD (1999),

“Expression and partial purification of a recombinant secretory form of human liver

carboxylesterase”, Protein Expr Purif Vol 17 (1), pp.16-25.

88. Shiotsuki T, Kato Y (1999), “Induction of carboxylesterase isozymes in

Bombyx mori by E. coli infection”, Insect Biochem Mol Biol Vol 29 (8), pp. 731-736.

89. Sigma-Aldrich (2003), “Naphthol AS-D Chloracetate Esterase” (Procedure

No.91), Catalougue, Sigma-Aldrich, pp. 1-3.

90. Sir John V. Dacie, S.M Lewis (1994), Practical Haematology, Longman

Group Ltd, Hong Kong.

91. Stefan Faderl, Hagop Kantarjian (2011), Leukemias: Principles and

Practice of Therapy, Blackwell, Oxford.

92. Steven D. Brown, L. A. Sarabia,Johan Trygg (2009), Comprehensive

chemometrics: chemical and biochemical data analysis, Elsevier, Amsterdam.

93. Suno M, Kunisawa T, Yamagishi A, Ono T, Yamamoto J, Yamada T,

Tasaki Y, Shimizu K, Iwasaki H, Matsubara K. (2009), “Detection of landiolol using

high-performance liquid chromatography/fluorescence: a blood esterase-sensitive ultra-

short-acting beta(1)-receptor antagonist”, J. Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life

Sci Vol 877 (16-17), pp. 1705-1708.

94. Suzanne M. Gignac, Dr. Hans G. Drexler (1990), “Monocyte-specific

esterase isoenzyme demonstrated by isoelectric focusing”, Electrophoresis Vol 11 (10),

pp. 819–824.

95. Tetsuo Satoh, Ramesh C. Gupta (2010), Anticholinesterase Pesticides

Metabolism, Neurotoxicity, and Epidemiology, Wiley, New Jersey.

96. Tomasz Puzyn,Jerzy Leszczynski, Mark T. D. Cronin (2010), Recent

Advances in QSAR Studies: Methods and Applications, Springer, New York.

97. Ueno Ryuzo, Itoh Shigeru, Fujimoto Shine, KomatsuYumiko, Tsuchiya

Hiroaki (1986), Process for producing azo pigments, Japan, Patent No. 4655844.

98. Ursula Buzli-Trepp (2007), Systematic nomenclature of organic,

organometallic and coordination chemistry, CRC Press, India.

99. Van Lith HA, Haller M, Van Zutphen BF, Beynen AC (1991),

“Determination of rat plasma esterase-1 (ES-1) activity by scanning densitometry of

gradient polyacrylamide gels with zymogram detection”, Electrophoresis Vol 12 (12), pp.

1045-1050.

54

100. Vasantha S, B. V. Ravi Kumar, S. D. Roopashree, Sarala Das and S. K.

Shankar (1992), “Neuroanatomy of Cysticercus cellulosae (Cestoda) as revealed by

acetylcholinesterase and nonspecific esterase histochemistry”, Parasitol Res Vol 78, pp.

581-586.

101. Vicente Gotor, Ignacio Alfonso (2008), Asymmetric Organic Synthesis

with Enzymes, Wiley-VCH, Weinheim.

102. Vidotto V, M. Melhem, S. Pukinskas, Sh. Aoki, C. Carrara1 & A. Pugliese

(2005), “Extracellular enzymatic activity and serotype of Cryptococcus neoformans,

strains isolated from AIDS patients in Brazil”, Rev Iberoam Micol Vol 22, pp. 29-33.

103. Viedma Contreras JA (1999), “Leucocyte activation markers in clinical

practice”, Clin Chem Lab Med Vol 37 (6), pp. 607-622.

104. Von Heijne, G (1983), “Palmitoyl-coenzyme A hydrolyzing activity in rat

kidney and its relationship with carboxylesterase”. J. Lipid Res Vol 34, pp. 1773-1781.

105. William C. Moloney, Kenneth McPherson, Lila Fliegelman (1959),

“Esterase activity in leukocytes demonstrated by the use of naphtol AS-D chloroacetate

substrate”, J Histochem Cytochem Vol. 8 (3), pp. 200-207.

106. William E. Paul (2008), Fundamental immunology, Wolters Kluwer,

Philadenphia.

107. William H. Brown, Christopher S. Foote, Brent L. Iverson, Eric V. Anslyn,

Bruce M. Novak (2011), Organic Chemistry, CengageBrain, Belmont.

108. William H. Emig (1941), Stain technique, The Science press printing

company lancaster.

109. Wolf D. Kuhlmann, M.D. (2010), Enzyme cytochemical substrate solution,

http://www.immunologie-labor.com/cellmarker_files/IET_reagents_06.pdf

110. Xiaoli Meng James L. Maggs, David C. Pryde, Simon Planken, Rosalind E.

Jenkins, Torren M. Peakman, Kevin Beaumont, Christopher Kohl,. Kevin Park, and

Andrew V. Stachulski (2007), “Cyclization of the Acyl Glucuronide Metabolite of a

Neutral Endopeptidase Inhibitor to an Electrophilic Glutarimide:  Synthesis, Reactivity,

and Mechanistic Analysis”, J. Med. Chem Vol 50 (24), pp. 6165–6176.

111. Yamada T, Hosokawa M, Satoh T, Moroo I, Takahashi M, Akatsu H,

Tamamoto T (1994), “Immunohistochemistry with an antibody to human liver

carboxylesterase in human brain tissues” Brain Res, Vol 258, pp. 163-167.

112. Yin QW, Xue S. (1993), “Histo-electrophoretic analysis of the

microheterogeneity and region-specificity of isozymes”, Appl Theor Electrophore Vol 2

(2-3), pp. 79-86.

55

113. Yokoda S, Himeno M, Roth J, Brada D, Kato K (1995), “Formation of

autophagosomes during degradation of excess peroxisomes induced by di-, issue 2-

ethylhexylphthalate treatment”, Eur J cell Biol Vol 62, p.372-83.

114. Zschunke F, Salmassi A, Kreipe H, Buck F, Parwaresch MR, Radzun HJ

(1991), “cDNA cloning and characterization of human monocyte /macrophage serine

esterase-1”, Blood Vol 15 (2), pp. 506-512.

115. Zygmunt Boruszczak & Jan Kraska (1998), “Synthesis and properties of

bis-arylides of 3-hydroxy-2-naphthoic acid, derivatives of 1,4-phenylenediamines”, Dyes

and pigments Vol. 36 (4), pp. 339-346.