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Tierärztliche Hochschule Hannover
Die Oxidation der Methoxyphenole
Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol in
Pökellaken und in erhitzter Fleischmatrix
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Sarah-Maria Bölicke
Rostock
Hannover 2015
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Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Waldemar Ternes
Institut für Lebensmitteltoxikologie und
Chemische Analytik
Abteilung Chemische Analytik
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Waldemar Ternes
2. Gutachter: Prof. Dr. Lüppo Ellerbroek
Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2015
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Fritz-Ahrberg-Stiftung (Hannover) gefördert.
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Meiner Mutter und meinem Mann
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Teile dieser Arbeit wurden zur Veröffentlichung in der internationalen Fachzeitschrift
„Meat Science“ unter folgenden Titeln eingereicht:
Bölicke, S.-M., Ternes, W.
Isolation and identification of oxidation products of syringol from brines and heated meat
matrix
Und
Bölicke, S.-M., Ternes, W.
The formation of oxidation products of guaiacol in curing brine and heated meat matrix
Des Weiteren wurden Teile dieser Arbeit bereits als Poster unter folgendem Titel anlässlich
der Internationalen Fachmesse „EuroTier 2014“ vom 11.-14.November 2014 in Hannover
präsentiert und mit den Fachbesuchern diskutiert:
Kalbe, S.-M., Ternes, W.
Abbau von Phenolen in Fleischerzeugnissen und Bildung von Nitro-und Nitrosoverbindungen
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Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ..................................................................................................................................... I
1. Einleitung ................................................................................................................................... 1
2. Literaturübersicht ....................................................................................................................... 5
2.1. Rauch, Raucharomen und geräucherte Lebensmittel ............................................................. 5
2.1.1. Rauch .................................................................................................................................. 5
2.1.2. Raucharomen ...................................................................................................................... 5
2.1.3. Geräucherte Lebensmittel ................................................................................................... 6
2.2. Methoxyphenole des Räucherrauchs ...................................................................................... 7
2.2.1. Entstehung .......................................................................................................................... 7
2.2.2. Eigenschaften ..................................................................................................................... 9
2.2.3. Nachweis und Vorkommen in Raucharomen und geräucherten Fleischprodukten .......... 12
2.2.4. Reaktion mit Nitrit in wässrigem Milieu .......................................................................... 17
2.2.4.1. Nitrierung und Nitrosierung ......................................................................................... 17
2.2.4.2. Dimerisierung ............................................................................................................... 20
2.2.5. Reaktion mit Nitrit in Fleischprodukten ........................................................................... 23
2.3. Verwendung und Reaktion von Nitrit in Fleischprodukten .................................................. 24
2.4. Ascorbinsäure ....................................................................................................................... 27
2.4.1. Verwendung und Reaktion in Fleischprodukten .............................................................. 27
2.4.2. Antinitrosierende Wirkung ............................................................................................... 28
2.5. Analytische Methoden (Grundprinzipien) ............................................................................ 30
2.5.1. Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ................................................................ 30
2.5.2. Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und Flüssigchromatographie-
Massenspektrometrie (LC-MS) ........................................................................................ 31
3. Material und Methoden ............................................................................................................ 33
3.1. Geräte und Chemikalien ....................................................................................................... 33
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Inhaltsverzeichnis
II
3.2. Herstellung der Reagenzien .................................................................................................. 33
3.3. Probenherstellung und –aufbereitung ................................................................................... 34
3.3.1. Wässriges Reaktionsmodell .............................................................................................. 34
3.3.1.1. Herstellung ................................................................................................................... 34
3.3.1.2. Probenentnahme ........................................................................................................... 35
3.3.2. Fleischproben ................................................................................................................... 36
3.3.2.1. Herstellung ................................................................................................................... 36
3.3.2.1.1. Fleischproben mit unterschiedlichen NaNO2-Zusätzen ...................................... 36
3.3.2.1.2. Fleischschäume .................................................................................................. 37
3.3.2.1.3. Wiederfindungsraten .......................................................................................... 37
3.3.2.2. Versuchsdurchführung.................................................................................................. 38
3.3.2.3. Probenaufbereitung ....................................................................................................... 39
3.3.2.3.1. Methanolextraktion............................................................................................. 39
3.3.2.3.2. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction, SPE) ......................................... 40
3.4. Analyse der Methoxyphenole sowie ihrer Oxidationsprodukte mittels HPLC-UV/VIS ...... 41
3.4.1. HPLC-UV/VIS-System .................................................................................................... 41
3.4.1.1. Aufbau .......................................................................................................................... 41
3.4.1.2. Kalibrierung .................................................................................................................. 42
3.4.1.3. Probenmessung und Gehaltsbestimmung ..................................................................... 45
3.4.1.3.1. Proben aus wässrigem Reaktionsmodell ............................................................ 45
3.4.1.3.2. Fleischextrakt ..................................................................................................... 46
3.4.1.4. Nachweis- und Bestimmungsgrenzen .......................................................................... 47
3.4.1.5. Wiederfindungsraten .................................................................................................... 48
3.5. Qualitative Analyse der Methoxyphenole und ihrer Oxidationsprodukte ............................ 48
3.5.1. Probenaufbereitung........................................................................................................... 48
3.5.2. HPLC-DAD ...................................................................................................................... 49
3.5.3. HPLC-ECD ...................................................................................................................... 49
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Inhaltsverzeichnis
III
3.5.4. Spektrophotometrie .......................................................................................................... 50
3.5.5. GC-MS ............................................................................................................................. 51
3.5.6. LC-ESI-MS ...................................................................................................................... 51
3.6. Statistische Auswertung ....................................................................................................... 54
4. Ergebnisse und Diskussion ....................................................................................................... 55
4.1. Chromatographische Trennung und Identifizierung der Methoxyphenole und ihrer
Oxidationsprodukte mittels HPLC-UV/VIS und DAD, GC-MS und LC-ESI-MS .............. 55
4.1.1. Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol ......................................... 55
4.1.2. Syringol und Oxidationsprodukte ..................................................................................... 59
4.1.3. Guajakol und Oxidationsprodukte .................................................................................... 67
4.1.4. 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol und ihre Oxidationsprodukte ........................... 74
4.2. Oxidation von Syringol und Guajakol im wässrigen Reaktionsmodell und in der
Fleischmatrix ........................................................................................................................ 80
4.2.1. Methodenentwicklung und Wiederfindungsraten ............................................................ 80
4.2.2. Die Oxidation von Syringol in Pökellaken in Abhängigkeit vom pH-Wert und der
Ascorbinsäurekonzentration ............................................................................................. 84
4.2.2.1. Ergebnisse ..................................................................................................................... 84
4.2.2.2. Diskussion .................................................................................................................... 87
4.2.3. Die Oxidation von Syringol in der Fleischmatrix nach Erhitzen und simulierter
Verdauung in Abhängigkeit vom Nitrit- und Sauerstoffgehalt ........................................ 89
4.2.3.1. Ergebnisse ..................................................................................................................... 89
4.2.3.2. Diskussion .................................................................................................................... 94
4.2.4. Die Oxidation von Guajakol in Pökellaken in Abhängigkeit vom pH-Wert und der
Ascorbinsäurekonzentration ............................................................................................. 95
4.2.4.1. Ergebnisse ..................................................................................................................... 95
4.2.4.2. Diskussion .................................................................................................................... 97
4.2.5. Die Oxidation von Guajakol in der Fleischmatrix nach Erhitzen und simulierter
Verdauung in Abhängigkeit vom Nitrit- und Sauerstoffgehalt ........................................ 99
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Inhaltsverzeichnis
IV
4.2.5.1. Ergebnisse ..................................................................................................................... 99
4.2.5.2. Diskussion .................................................................................................................. 102
5. Zusammenfassung .................................................................................................................. 104
6. Summary................................................................................................................................. 108
7. Literaturverzeichnis ................................................................................................................ 111
8. Anhang ................................................................................................................................... 124
8.1. Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................................... 124
8.2. Glossar ................................................................................................................................ 125
8.3. Chemikalienliste ................................................................................................................. 125
8.4. Geräteliste ........................................................................................................................... 128
8.5. HPLC-UV/VIS-Chromatogramm der vier Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-
Methylsyringol und 4-Methylguajakol unter Verwendung der HPLC-Bedingungen für die
Pökellaken (vgl. Kap. 4.1.1.) .............................................................................................. 131
8.6. HPLC-UV/VIS-Chromatogramm der vier Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-
Methylsyringol und 4-Methylguajakol unter Verwendung der HPLC-Bedingungen für die
Fleischextrakte (vgl. Kap. 4.1.1.) ....................................................................................... 132
8.7. Übersicht der für die Identifizierung der aus den Pökellaken bzw. Fleischproben isolierten
Verbindungen verwendeten Analyseverfahren (vgl. Kap. 4.1.) ......................................... 133
8.8. Vergleichende Darstellung der LC-ESI-MS Spektren bzw. GC-MS Spektren der aus der
Pökellaken bzw. aus den Fleischproben isolierten Oxidationsprodukte 6-Nitrosoguajakol, 4-
Nitroguajakol und Nitrososyringol (vgl. Kap. 4.1.) ........................................................... 135
8.9. Messwerttabellen zur Berechnung des molaren Extinktionskoeffizienten von Syringol und
3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (vgl. Kap. 3.5.4. und 4.2.3.1.) .................. 138
8.10. Messwerttabellen der Gehalte an Guajakol und Syringol sowie ihrer Oxidationsprodukte in
den Pökellaken (vgl. Kap. 4.2.2. bis 4.2.5.) ........................................................................ 139
8.11. Messwerttabellen der Gehalte an Guajakol und Syringol sowie ihrer Oxidationsprodukte in
den Fleischproben (vgl. Kap. 4.2.2. bis 4.2.5.) ................................................................... 141
9. Abbildungsverzeichnis ........................................................................................................... 145
10. Tabellenverzeichnis ................................................................................................................ 150
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Inhaltsverzeichnis
V
11. Danksagung ............................................................................................................................ 152
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1. Einleitung
1
1. Einleitung
Das Räuchern gilt neben dem Trocknen und Salzen als eines der ältesten Verfahren zur
Haltbarmachung von Lebensmitteln. Gleichzeitig erfolgt durch den Rauch eine für dieses
Konservierungsverfahren typische Aromatisierung, welche durch den Eintrag veschiedenster
chemischer Verbindungen in das Räucherprodukt zustande kommt. Die Ausbildung dieses
Räucheraromas hat dazu geführt, dass die Anwendung verschiedener Räuchertechniken auch
heute noch eine große Rolle in der Zubereitung von Lebensmitteln spielt (BALTES et al.
1981).
Grundlage aller Räuchertechniken ist die thermische Zersetzung von Holz, die auch als
Pyrolyse bezeichnet wird. Bei der Pyrolyse der Holzbestandteile Cellulose, Hemicellulose
und Lignin kommt es zur Bildung verschiedenster flüchtiger chemischer Verbindungen, wie
Aldehyde, Phenole, Säuren, Carbonyle und Lactone, die neben antimikrobiellen und
antioxidativen auch über aromatisierende Eigenschaften verfügen (FREDE 2010) und sich
zusammen mit Teer- und Rußpartikeln auf der Oberfläche von geräucherten Lebensmitteln
anlagern bzw. in die Lebensmittelmatrix eindringen (WITTKOWSKI 1985).
Besondere Bedeutung kommt hierbei den phenolischen Verbindungen zu, die v.a. durch den
thermischen Abbau des Lignins entstehen. Sie verfügen sowohl über antioxidative
(KJÄLLSTRAND u. PETERSSON 2001b) als auch aromatisierende Wirkungen (BALTES u.
SÖCHTIG 1979), wobei innerhalb der Gruppe der Rauchphenole besonders die
Methoxyphenole von Bedeutung sind, da diese die größte Phenolfraktion der Räucherrauches
ausmachen (BALTES et al. 1981).
Vor dem Räuchern erfolgt bei vielen Lebensmitteln das Pökeln, d.h. der Zusatz von Pökelsalz
das überwiegend Kochsalz aber zu geringen Anteilen (0,4 %-0,5 %) auch Nitrit bzw. dessen
Salze enthält. Neben den positiven lebensmitteltechnologischen Eigenschaften des Nitrits, wie
z. B. der Konservierung, der Aromatisierung und Umrötung von Fleischprodukten, birgt
dessen Einsatz auch nachteilige Effekte (TERNES et al. 2005). Hierzu gehören u.a. die
Gefahr der Nitrosaminbildung sowie der Nitrosierung anderer im Lebensmitel enthaltener
Verbindungen, wie z. B. der Phenole. Für viele Phenole und ihre nitrosierten Derivate ist
bisher nachgewiesen worden, dass sie die Bildung kanzerogener Nitrosamine fördern und
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1. Einleitung
2
auch selbst genotoxisches Potential besitzen (DAVIES u. MCWEENY 1977; KIKUGAWA u.
KATO 1988). Aus diesem Grund gilt den Phenolen des Räucherrauches, welche sich in den
Lebensmitteln in Gehalten von bis zu 280 mg/kg anreichern können, besonderes Interesse
(LUSTRE u. ISSENBERG 1970).
In Abhängigkeit von vielen Faktoren, wie z. B. der verwendeten Holzart und des
Räucherverfahrens (HITZEL et al. 2013a; PÖHLMANN et al. 2013a, b) kommt es vor allem
zur Anreicherung der Methoxyphenole Syringol und Guajakol und ihren Derivaten im
Räucherrauch aber auch in Rauchkondensaten, die anstelle von frischem Rauch für die
Lebensmittelzubereitung verwendet werden (LUSTRE u. ISSENBERG 1969; GILBERT u.
KNOWLES 1975; BALTES u. SÖCHTIG 1979). Bei der Räucherung unter Verwendung von
Hartholz wie Birke oder Erle entstehen zum überwiegenden Teil Syringol und seine
alkylsubstituierten Derivate, während die Pyrolyse von Weichholz eher zur Bildung von
Guajakol und seinen Derivaten führt (KJÄLLSTRAND et al. 2000; KJÄLLSTRAND u.
PETERSSON 2001a).
In homogenisierten Räucherspeckproben konnten bis zu 84 mg/kg unsubstituiertes Syringol
und 35,6 mg/kg an Guajakol nachgewiesen werden (LUSTRE u. ISSENBERG 1970). Da sich
die Rauchinhaltstoffe und somit auch die Methoxyphenole besonders an der Oberfläche des
Lebensmittels anlagern, ist in den äußeren Schichten der geräucherten Produkte sogar mit
noch höheren Konzentrationen selbiger zu rechnen (BRATZLER et al. 1969; KNOWLES et
al. 1975a). Auch bei der Pökelung erfolgt die Einwirkung der Pökelstoffe vor allem in den
Randbereichen-abgesehen von der Spritzpökelung, bei der die Lake direkt in das Fleisch
injiziert wird (TERNES et al. 2005). Unter Einwirkung von Hitze, wie z. B. bei der
Heißräucherung (bis zu 80 °C) oder auch beim Braten von geräucherten und gepökelten
Lebensmitteln, besteht folglich die Gefahr der Nitrosierung der Phenole durch über die
Pökelung eingebrachtes Nitrit.
Die Möglichkeit der Bildung von Nitrosophenolen in den auf diese Weise zubereiteten
Fleischprodukten führte zu zahlreichen Untersuchungen, die sich unter anderem mit der
toxikologischen Charakterisierung von Nitrosophenolen (OHSHIMA et al. 1989), der Bildung
selbiger im wässrigen Milieu und schließlich ihrem Nachweis in Lebensmitteln befassten
(KNOWLES et al. 1974b, 1975b; HOFMANN 1990).
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1. Einleitung
3
Verschiedene nitrosierte geräucherte Fleischprodukte und Rauchkondensate zeigten in vitro
genotoxisches Potential. Besonders die aufgereinigte Phenolfraktion der Rauchkondensate
hatte nach ihrer Nitrosierung eine große genotoxische Wirkung in der Bakterienkultur. Die
Untersuchung der einzelnen Rauchphenole ergab, dass nitrosiertes Syringol in vitro keine
genotoxischen Eigenschaften besitzt, während für nitrosieretes Guajakol geringe genotoxische
Effekte nachgewiesen werden konnten (OHSHIMA et al. 1989; ROSENKRANZ et al. 1990).
Sowohl in vitro als auch in vivo verfügt Syringol über die Fähigkeit, die Nitrosaminbildung zu
verhindern (VIRK u. ISSENBERG 1985, 1986) und hat gleichzeitig antioxidative
Eigenschaften (BARCLAY et al. 1997).
Bisherige Extraktionsversuche von Reaktionsprodukten von Syringol mit Nitrit aus
geräucherten und gepökelten Lebensmitteln waren nicht erfolgreich. Im Gegensatz dazu
konnte nitriertes Guajakol und in einem Fall auch 6-Nitroso-4-propylguajakol und 6-Nitroso-
4-methylguajakol aus erhitztem Räucherspeck isoliert werden, wobei die eindeutige
Identifikation der letzten beiden Substanzen nicht erfolgte (KNOWLES et al. 1974b, 1975b).
Obwohl die Bildung von nitrosierten bzw. nitrierten Syringol- und Guajakolderivaten in
erhitzten und gepökelten Rauchprodukten wahrscheinlich ist, gelang somit deren Nachweis
nur in sehr begrenztem Umfang. Weitere Oxidationsprodukte der beiden Methoxyphenole
Guajakol und Syringol konnten bisher nur in wässrigem Medium nachgewiesen werden.
Guajakol reagiert im wässrigen saurem Milieu vor allem unter Bildung seiner
Nitroverbindungen (KUNG 1968; KITANOVSKI et al. 2014), während Syringol unter
selbigen Bedingungen und unter Einwirkung von UV-Licht, sowie bei enzymatischer oder
mikrobieller Oxidation vor allem dimerisiert (KUNG 1968; BETTS u. KING 1991; SUN et
al. 2010; ADELAKUN et al. 2012).
Abgesehen davon, dass bisher keine nitrosierten Reaktionsprodukte von Syringol, Guajakol,
4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol eindeutig in der Fleischmatrix nachgewiesen werden
konnten, gibt es keine Untersuchungen darüber, inwieweit unterschiedliche
Oxidationsbedingungen, z. B. verschiedene Nitritkonzentrationen, die Bildung von nitrierten
und nitrosierten Reaktionsprodukten dieser Phenole in der Fleischmatrix beeinflussen und ob
der zusätzliche Einsatz von Sauerstoff in Form von Schäumen, wie er bei der Herstellung von
Fleischmousses und –parfaits erfolgt (EHLERT et al. 1980), eine Auswirkung auf diesen
Prozess hat.
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1. Einleitung
4
Ziel dieser Studie ist es daher, die Bildung von Reaktionsprodukten der vier bedeutensten
Methoxyphenole des Räucherrauches unter Nitriteinwirkung sowohl im wässrigen Milieu als
auch in der Fleischmatrix zu erforschen. Als wässrige Reaktionsmodelle dienen hierbei
Pökellaken, die unterschiedliche Konzentrationen an Ascorbinsäure enthalten. Der
Phenolabbau und die Produktbildung wird in Abhängigkeit des Gehaltes dieses
Antioxidationsmittels, sowie bei verschiedenen pH-Werten untersucht.
Innerhalb der Fleischmatrix wird die Auswirkung unterschiedlicher Nitritkonzentrationen auf
Oxidation der Phenole untersucht, wobei neben der gesetzlich vorgegebenen
Nitrithöchstmenge von 150 mg/kg (Zusatzstoffzulassungsverordnung) auch höhere und -im
Falle von Syringol- auch niedrigere Nitritkonzentrationen zum Einsatz kommen, um die
Entstehung der Reaktionsprodukte auch unter mehr oder weniger begünstigten
Oxidationsbedingungen zu untersuchen. Des Weiteren wird der Effekt von erhöhten
Sauerstoffkonzentrationen in der Fleischmatrix auf die Produktbildung analysiert.
Die zu untersuchenden Fleischproben werden zunächst auf 80 °C erhitzt, um die
Hitzeeinwirkung beim Heißräuchern oder Braten von Fleischerzeugnissen nachzuahmen,
anschließend erfolgt die simulierte Verdauung der Fleischproben mittels Pepsin und
Salzsäure, um die Umsetzung der Analyten unter Reaktionsbedingungen, wie sie im
Magenmilieu vorliegen, zu untersuchen.
Die erzielten Ergebnisse sollen Aufschluss darüber geben, ob und in welchem Umfang es in
Pökellaken und innerhalb der Fleischmatrix zum Abbau der Methoxyphenole, v.a. von
Syringol und Guajakol, infolge der Umsetzung mit Nitrit kommt und welche
Reaktionsprodukte hierbei entstehen.
Hierbei ist zu vermuten, dass unter günstigen Oxidationsbedingungen, wie erhöhten Nitrit-
und Sauerstoffkonzentrationen, eine vermehrte Produktbildung stattfindet. Der Nachweis der
Bildung dieser Verbindungen unter Bedingungen, wie sie in der Lebensmittelverarbeitung
üblich sind, würde einen wichtigen Beitrag für die Bewertung gepökelter und geräucherter
Lebensmittel leisten.
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2. Literaturübersicht
5
2. Literaturübersicht
2.1. Rauch, Raucharomen und geräucherte Lebensmittel
2.1.1. Rauch
Das Räuchern ist eines der ältesten Verfahren zur Konservierung von Lebensmitteln. Als
Rauch wird hierbei laut "Aromenverordnung (Artikel 22 d. Verordnung zur Neuordnung
lebensmittelrechtlicher Kennzeichnungsvorschriften) in der Fassung der Bekanntmachung
vom 2. Mai 2006 (BGBl. I S. 1127), die zuletzt durch Artikel 1 der Verordnung vom 29.
September 2011 (BGBl. I S. 1996) geändert worden ist" der frisch entwickelte Rauch aus
naturbelassenen Hölzern, Zweigen, Heidekraut und Nadelholzsamenständen unter
Mitverwendung von Gewürzen definiert. Räucherrauch gilt als Zusatzstoff. Er enthält
verschiedene Komponenten, denen eine antimikrobielle (Aldehyde, Phenole, Säuren),
antioxidative (Phenole, Phenolaldehyde, Phenolsäuren) und aromabildende (Phenole,
Carbonyle, Lactone) Wirkung nachgewiesen worden ist. Des Weiteren sind Carbonyle und
Phenolaldehyde an der Farbbildung des Räuchergutes beteiligt.
Neben diesen Inhaltsstoffen, die die gewünschte Haltbarkeit geräucherter Lebensmittel
bewirken, kommt es beim Räuchern auch zur unerwünschten Bildung kanzerogener
polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAK). Diese entstehen bei der Verbrennung
organischen Materials, v.a. bei langen Räucherzeiten und hohen
Rauchentstehungstemperaturen (> 600 °C) (FREDE 2010).
2.1.2. Raucharomen
Laut „VERORDNUNG (EG) Nr. 2065/2003 DES EUROPÄISCHEN PARLAMENTS UND
DES RATES vom 10. November 2003 über Raucharomen zur tatsächlichen oder
beabsichtigten Verwendung in oder auf Lebensmitteln“ beginnt die Erzeugung von
Raucharomen mit der Gewinnung eines wässriges Primärrauchkondensats, einer
wasserunlöslichen Teerphase und einer wasserunlöslichen öligen Phase, welche durch die
Auftrennung kondensierten Rauchs gewonnen werden. Nach dem Aufreinigen des wässrigen
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2. Literaturübersicht
6
Primärrauchkondensates und bestimmter Fraktionen der Teerphase zur Beseitigung
gesundheitsschädlicher Rauchkomponenten können die gereinigten Anteile in oder auf
Lebensmitteln oder zur Herstellung von Raucharomen verwendet werden.
2.1.3. Geräucherte Lebensmittel
Das Auffinden von ca. 90.000 Jahre alten Räucherkammern im nördlichen Mitteleuropa gilt
als einer der ersten Belege für das Räuchern von Lebensmitteln zum Zwecke der
Haltbarmachung (BALTES et al. 1981). Im Laufe der Zeit wurden verschiedene
Räuchermethoden entwickelt, die jeweils zur Herstellung typischer Produkte verwendet
werden und sich vor allem in der Räuchertemperatur, der Behandlungsdauer und der
Räucherzeit unterscheiden (Tab.1).
Räucherverfahren Heißräuchern Warmräuchern Kalträuchern
Temperatur 50 bis 90 °C 25 bis 45 °C 15 bis 25 °C
Behandlungsdauer 20 bis 120 min 2 bis 4 h Bis ca. 6 Wochen
Räucherzeit 5 bis 100 min Kürzer als
Behandlungsdauer
Kürzer als
Behandlungsdauer
Typische Produkte Brühwurst,
Kochwurst,
Würstchen, Kasseler
Schweinebauch,
Schinken,
Bauernbratwurst,
Berliner Knacker
Roh-und
Dauerwürste,
Rohschinken,
Kochwurst
Tabelle 1 Merkmale verschiedener Räucherverfahren (modifiziert nach TERNES et al. (2005)
Bei allen Verfahren kommt es neben der Trocknung des Räuchergutes zur Anreicherung einer
Vielzahl von Rauchinhaltsstoffen vor allem auf der Oberfläche und in den äußeren Schichten
des geräucherten Produktes, welche sich verschiedenen Substanzklassen zuordnen lassen. In
der Gasphase des durch Holzpyrolyse freigesetzten Räucherrauchs finden sich neben
Alkoholen, Aldehyden, Ketonen, Lactonen und Estern verschiedene phenolische
Verbindungen, während sich die Teerphase aus Ruß-und Teerpartikeln zusammensetzt, die
sich ebenfalls auf dem Produkt niederschlagen (WITTKOWSKI 1985). Den Phenolen kommt
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2. Literaturübersicht
7
als Bestandteil der flüchtigen Rauchverbindungen besondere Bedeutung zu, da sie neben der
aromabildenden Wirkung durch ihre antioxidativen Eigenschaften besonders zur
Konservierung des Räuchergutes beitragen (TERNES et al. 2005).
2.2. Methoxyphenole des Räucherrauchs
2.2.1. Entstehung
Die drei wichtigsten Bestandteile des Holzes sind Cellulose (50 %), Hemicellulose (25 %)
und Lignin (25 %) (TERNES 2008). Durch die thermische Behandlung des Holzes während
des Räucherprozesses erfolgt in Abhängigkeit von der Temperatur die Pyrolyse dieser
Bestandteile, die jeweils ein charakteristisches Zerfallsmuster aufweisen. Die Hemicellulose
stellt den thermolabilsten Bestandteil dar, dessen Pyrolyse bereits bei einer Temperatur von
200 °C einsetzt, der pyrolytische Abbau der Cellulose beginnt ab 260 °C bis 310 °C und
Lignin wird ab 310 °C bis 500 °C umgesetzt (BALTES et al. 1981). Während die aus Glucose
aufgebaute Cellulose zu Oligo-und Polysacchariden sowie geringen Mengen Furanen und
Phenolen abgebaut wird, erfolgt die Pyrolyse der Hemicellulose größtenteils über die Bildung
von Furanen und aliphatischen Carbonsäuren (GILBERT u. KNOWLES 1975). Lignin, als
dritter Hauptbestandteil des Holzes, bildet die wichtigste Quelle für die Entstehung
phenolischer Verbindungen durch pyrolytischen Abbau. Bei Lignin handelt es sich um ein
Polymerisat aus Phenylpropaneinheiten, welches in das Cellulose-und Hemicellulosegerüst
der Pflanze eingelagert wird und zu zunehmender Verholzung der Zelle und letztendlich zum
Zelltod führt, sodass die vollständig lignifizierte Zelle vor allem Stützfunktion erfüllt.
Zwischenprodukte des thermischen Ligninabbaus bilden die Sinapinsäure sowie die
Ferulasäure. Beide Verbindungen werden zunächst durch Decarboxylierung zu ihren
Vinylhomologen abgebaut, um schließlich über die Syringa- bzw. Vanillinsäure zu Syringol
(2,6-Dimethoxyphenol) und Guajakol (2-Methoxyphenol) und ihren Derivaten oxidiert zu
werden (Abb.1) (WITTKOWSKI 1985).
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2. Literaturübersicht
8
Lignin
HO
OCH3
H3CO CH CH COOH
OCH3
HO
CH CH COOH
Sinapinsäure Ferulasäure
OCH3
HO
H3CO CH CH2
OCH3
HO
CH CH2
Vinylsyringol Vinylguajakol
OCH3
HO
H3CO CHO
OCH3
HO
CHO
Syringaldehyd Vanillin
HO
OCH3
H3CO COOH
OCH3
HO
COOH
Syringasäure Vanillinsäure
OCH3
HO
H3CO
OCH3
HO
Syringol Guajakol
Abbildung 1 Bildung von Syringol und Guajakol während des pyrolytischen Ligninabbaus (mod.
nach WITTKOWSKI (1985))
Die Gehalte an Syringol und Guajakol bzw. ihrer alkylsubstituierten Derivate variieren stark
in Abhängigkeit von der verwendeten Holzart (FUJIMAKI et al. 1974). Während Harthölzer
über zusätzliche Methoxygruppen innerhalb des Ligninpolymers verfügen und daher vor
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2. Literaturübersicht
9
allem zu Syringol und in geringem Umfang zu Guajakol abgebaut werden, wird bei der
Pyrolyse von Weichhölzern fast ausschließlich Guajakol freigesetzt (Tab. 2).
Weichholz Hartholz
Fichte (Picea) Kiefer (Pinus) Birke (Betula) Erle (Alnus)
Guajakol und
Guajakolderivate
(mg/m3)
70a 150a 70a 39b
Syringol und
Syringolderivate
(mg/m3)
-a -a 320a 143b
Tabelle 2 Gehalte von Guajakol und Guajakolderivaten sowie Syringol und Syringolderivaten im
Räucherrauch verschiedener Hart- und Weichholzarten (a KJÄLLSTRAND et al. (2000); b
KJÄLLSTRAND u. PETERSSON (2001a))
Die Derivatisierung von Guajakol und Syringol erfolgt über die Substitution von Methyl-,
Ethyl-, Propyl-, Vinyl-, Allyl- und Propenylgruppen in para- oder ortho-Stellung zu der
phenolischen Hydroxygruppe, wobei die Länge der Seitenkette die Anzahl von drei C-
Atomen nicht übersteigt (GILBERT u. KNOWLES 1975; KJÄLLSTRAND et al. 2000).
2.2.2. Eigenschaften
Phenole sind aromatische Kohlenwasserstoffe, an deren Phenylring eine oder mehrere
Hydroxygruppen gebunden sind. Durch den positiven mesomeren Effekt der Hydroxygruppe,
d. h. durch die Möglichkeit eines der Elektronenpaare des Sauerstoffatoms in den Phenylrest
zu verschieben, besteht im Bereich der ortho- bzw. para-Stellung zu Hydroxygruppe eine
erhöhte Ladungsdichte (Abb. 2), die dazu führt, dass elektrophile Substituenten bevorzugt an
diesen Positionen angreifen.
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2. Literaturübersicht
10
Abbildung 2 Mesomeriestabilisierung eines Phenols durch die phenolische Hydroxygruppe (nach
ZEECK et al. (2005))
Die Phenole reagieren mit einem durchschnittlichen pKs-Wert von 10 (Tab. 3) als schwache Säuren
(ZEECK et al. 2005).
Wichtige Methoxyphenole des
Räucherrauches
Strukturformeln pKS-Werte in wässriger
Lösung bei 25 °Ca
Syringol H3CO
OH
OCH3
9,98
4-Methylsyringol
H3CO
OH
OCH3
CH3
10,01
Guajakol
OH
OCH3
9,93
4-Methylguajakol
OH
OCH3
CH3
10,27
Tabelle 3 Strukturformeln und pKS-Werte (a RAGNAR et al. (2000)) vier wichtiger Methoxyphenole
des Räucherrauches
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2. Literaturübersicht
11
Phenolische Verbindungen kommen unter anderem in Pflanzen in Form von Aroma-, Farb-,
Gerb- und Geschmacksstoffen und Wachstumsregulatoren vor (TERNES et al. 2005). Sie
verfügen teilweise, wie im Fall des Polyphenols Epigallocatechin, sowohl über antioxidative,
antinitrosierende als auch anticarcinogene Eigenschaften, denen zum anderen nitrosierende
oder mutagene Wirkungen anderer Phenole gegenüberstehen (CHALLIS u. BARTLETT
1975; WALKER et al. 1982; D'ISCHIA et al. 2011; IWASAKI et al. 2011). Des Weiteren
konnte für einige phenolische Verbindungen eine antimikrobielle Aktivität in verschiedenen
Lebensmitteln nachgewiesen werden (RACCACH 1984).
Die im Räucherrauch vorkommenden Methoxyphenole Guajakol und Syringol, sowie ihre
methylierten Derivate zeichnen sich durch ihre aromagebende und antioxidative Wirkung aus.
Sie tragen entscheidend zum typischen Geruch und Geschmack geräucherter Lebensmittel
bei. Die von BALTES u. SÖCHTIG (1979) durchgeführte ausführliche sensorische
Beurteilung der genannten Methoxyphenole ergab, dass Guajakol und Syringol für den
rauchig-aromatischen, würzigen, sowie süß-scharfen Geruch und Geschmack von
Raucharomakondensaten und aromatisierten Brühwürsten verantwortlich sind, während das
4-Methylguajakol eine fruchtige, angenehme Räuchernote bewirkt. Untersuchungen von
WASSERMAN (1966) zeigten jedoch, dass ein reines Gemisch dieser drei wichtigen
Aromakomponenten nur ein entfernt raucharomaartiges Geruchs- bzw. Geschmacksprofil
aufweist. Es ist somit naheliegend, dass die genannten Methoxyphenole einen großen Einfluss
auf die Aromaentwicklung haben, diese aber nicht ausschließlich bestimmen, sondern eine
Modifikation durch andere weniger prominente Rauchkomponenten erfolgt.
Besondere Bedeutung kommt neben den geschmacksbildenden Eigenschaften von Syringol
und Guajakol, ihren antioxidativem und somit lebensmittelkonservierendem Potential zu.
Dieses lässt sich unter anderen von der Fähigkeit der Methoxyphenole herleiten, durch
Abspaltung des phenolischen Wasserstoffs der Hydroxygruppe mesomeriestabilisierte
Phenoxyradikale bilden zu können, die im Vergleich zu unsubstituierten Phenolen durch die
Methoxygruppe in ortho-Stellung zusätzlich stabilisiert werden. Aus diesem Grund verfügen
die aus den Harthölzern gebildeten 2,6-Dimethoxyphenole wie Syringol und seine Derivate
erwartungsgemäß über eine größere antioxidative Wirkung als die Monomethoxyphenole
Guajakol und 4-Methylguajakol (BARCLAY et al. 1997).
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2. Literaturübersicht
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Die gebildeten stabilen Phenoxyradikale (ArO●) wirken als Radikalfänger und sind somit in
der Lage andere radikalische Verbindungen wie zum Beispiel Peroxid- oder
Superoxidradikale (ROO●) abzufangen ohne die Kettenreaktion fortzusetzten und führen auf
diesem Wege zum Abbruch des Radikalketten-Mechanismus, beziehungsweise verhindern
effektiv dessen Initiation (BARCLAY et al. 1997; OGATA et al. 1997; KJÄLLSTRAND u.
PETERSSON 2001b).
ROO ArOH ROOH ArO
ROO ArO nicht radikalische Produkte
Abbildung 3 Radikalkettenabbruch durch Phenoxyradikale (nach BARCLAY et al. (1997))
Des Weiteren ist für Syringol eine antinitrosierende Wirkung nachgewiesen worden, die
vergleichbar ist mit der von Ascorbinsäure. Bei 37 °C und einem pH-Wert von 3 hemmt
Syringol die Nitrosierung des Amins N-Morpholin sowohl in vitro als auch in vivo und
erweist sich somit um das bis zu Neunfache wirksamer als ebenfalls getestetes Phenol (VIRK
u. ISSENBERG 1985, 1986).
2.2.3. Nachweis und Vorkommen in Raucharomen und geräucherten
Fleischprodukten
Aufgrund ihrer aromagebenden und antioxidativen Wirkung (Kap. 2.1.2) war die qualitative
und quantitative Bestimmung der in geräucherten Lebensmitteln vorkommenden Phenole
bisher Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Mit Hilfe colorimetrischer Bestimmung
wurde der Phenolgehalt geräucherter Brühwurst in unterschiedlichen Schichten des Produktes
ermittelt. Die höchste Konzentration an Phenolen war erwartungsgemäß in der äußersten
Schicht von 1,6 mm Dicke zu finden und betrug 37 mg/kg. In den inneren Schichten nahm die
Phenolkonzentration kontinuierlich ab, sodass in einer Tiefe von 11,2 mm nur noch 7,8 mg/kg
Phenole nachweisbar waren (BRATZLER et al. 1969). In der genannten Untersuchung wurde
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2. Literaturübersicht
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2,6-Trichloro-p-benzoquinoneimine verwendet, welches in para-Position an die Phenole
bindet und dabei die Farbbildung bewirkte, die colorimetrisch erfasst werden konnte. Da
hierfür die para-Position des Phenols unbesetzt sein muss, konnten para-substituierte
Verbindungen mit diesem Verfahren jedoch nicht erfasst werden (GILBERT u. KNOWLES
1975). Außerdem bildeten die einzelnen Phenole unterschiedliche Farbintensitäten aus, was
den Abgleich der komplexen aus den Proben isolierten Phenolextrakte mit Standardlösungen
(angefertigt aus wenigen phenolischen Referenzsubstanzen) erschwerte (LUSTRE u.
ISSENBERG 1969). Eine weitere Methode zur Isolierung und Bestimmung von
Rauchphenolen aus der Fleischmatrix wurde von LUSTRE u. ISSENBERG (1970)
entwickelt. Hierfür wurde durch Eiweißfällung mittels 40 %iger Trichloressigsäure zunächst
ein Fleischextrakt gewonnen, aus dem anschließend durch Fraktionierung und
Diethyletherextraktion die gesuchten Phenole isoliert wurden. Bei der Fraktionierung wurde
mit Hilfe von 40 %iger Natronlauge zunächst ein pH-Wert von 12 eingestellt und
anschließend mit Diethylether extrahiert. Die Diethyletherphase, in welcher sich die Lipide
sowie neutrale Verbindungen befanden, wurde verworfen. Die Phenole, die bei pH 12 als
Salze in der wässrigen Phase vorlagen, wurden daraufhin durch Einleiten von
Kohlenstoffdioxid (pH-Wert Senkung auf 6,8) aus diesen gelöst und konnten durch
wiederholtes Waschen mit Diethylether extrahiert werden. Nach Aufkonzentrierung des
Extraktes erfolgte die Trennung und Detektion der Phenole mittels Gaschromatographie in
Kopplung mit Massenspektrometrie (GC-MS). Die Konzentration der durch diese Methode
aus geräucherten Schweinebauch isolierten Phenole betrug 280 mg/kg, wobei Syringol mit
einem Gehalt von 84 mg/kg, Guajakol mit 35,6 mg/kg, 4-Methylguajakol mit 28,6 mg/kg und
4-Methylsyringol mit 35,6 mg/kg nachgewiesen wurde (LUSTRE u. ISSENBERG 1970). Die
Bestimmung und Trennung der Phenole mittels GC-MS ermöglichte die Auftrennung und
quantitative Bestimmung einer Vielzahl von flüchtigen Verbindungen aus dem Rauch, wobei
die Sensitivität durch Bildung der Trimethylsilylether der untersuchten Phenole bedeutend
erhöht wurde (KORNREICH u. ISSENBERG 1972). Die trimethylsilylierten Derivate
zeichneten sich durch eine herabgesetzte Polarität und eine Erhöhung der Flüchtigkeit im
Vergleich zu den underivatisierten Phenolen aus, was zu einer verkürzten Retention und
verbesserten Peaksymmetrie führte. Mit Hilfe dieses Verfahrens konnten in aus Buchenholz
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2. Literaturübersicht
14
gewonnenem Räucherrauch bis zu 119 phenolische Verbindungen nachgewiesen werden
(WITTKOWSKI et al. 1981).
Die beschriebene Methode für die Isolierung der Methoxyphenole aus der Fleischmatrix und
ihr anschließender Nachweis mit Hilfe von GC-MS diente ISSENBERG et al. (1971)
zunächst zur Bestimmung der Wiederfindungsrate von 14C-Phenol aus dem Ethanolextrakt
geräucherten Schweinebauches. Die Wiederfindungsrate des kombinierten Verfahrens
(Ethanolextraktion und Fraktionierung auf Grundlage unterschiedlicher Acidität) betrug 59 %.
Durch LUTEN et al. (1979) wurde die Fraktionierung dahingehend modifiziert, dass sich an
die Extraktion mittels Diethylether noch die Zugabe gesättigter Kochsalzlösung und die
Extraktion der Phenole mittels Chloroform anschloss, was zu einer Wiederfindung von 84 %
bzw. 76 % für Guajakol bzw. 4-Methylguajakol aus kaltgeräuchertem Hering führte.
KNOWLES et al. (1975a) befassten sich mit der Extraktion von Rauchphenolen aus
Raucharomakondensaten sowie geräuchertem und gepökeltem Schinken unter Verwendung
der Issenbergschen Methode (siehe oben). In den untersuchten Raucharomakondensaten
machten die Methoxyphenole Guajakol, 4-Methylguajakol, Syringol, 4-Methylsyringol und
trans-Isoeugenol ca. 50 % des Gesamtphenolgehaltes aus. Insgesamt wurden 23
Hauptkomponenten der Phenolfraktion der Rauchkondensate mittels GC-MS identifiziert.
Des Weiteren gelang ihnen die gewebe- und schichtenabhängige semiquantitative
Gehaltsbestimmung der Phenole in mittels Elektrospray-Verfahrens geräuchertem Schinken.
Während sich in der Rinde des Schinkens (9,5 % der Gesamtmasse) 27 % der Phenole fanden,
lagen in der äußersten Muskelschicht (8,5 % der Gesamtmasse) 48 % der Phenole vor. Im Fett
(36 % der Gesamtmasse) und in der der inneren Muskelschicht (45,3 % der Gesamtmasse)
waren hingegen nur 5,7 % bzw. 18,6 % der Phenole zu finden. Im Zusammenhang mit diesen
Studien wurde wiederholt (GILBERT u. KNOWLES 1975; KNOWLES et al. 1975a) auf eine
gewisse Selektivität bei der Extraktion der Phenole aus der Fleischmatrix verwiesen, welche
auf die starke Proteinbindung derselben mit der Fleischmatrix zurückgeführt wurde, was die
erzielten Ergebnisse dahingehend einschränkte, dass nur qualitative und semiquantitative
Aussagen über den Phenolgehalt in den untersuchten Fleischprodukten getroffen werden
konnten. Die Bindung der unter anderem im Fleisch vorkommenden α-Aminosäure Lysin
durch die phenolische Fraktion von Rauchkondensaten wurde von CHEN u. ISSENBERG
(1972) untersucht. Es zeigte sich, dass die Phenolfraktion nach Zugabe zu einer
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2. Literaturübersicht
15
Fleischsuspension einen Verlust von 38 % des frei verfügbaren Lysins bewirkte, was einen
weiteren Hinweis auf die verstärkte Bindung der Phenole durch bestimmte Fleischproteine
gab.
Ein weiteres Verfahren zur Isolierung phenolischer und somit leicht flüchtiger Verbindungen
aus Rauch und Rauchprodukten stellt die Wasserdampfdestillation nach
ANTONACOPOULOS (1960) dar, die unter anderem von BALTES u. SÖCHTIG (1979) zur
Bestimmung niedermolekularer Verbindungen aus Raucharomapräparaten genutzt wurde.
Hierbei wurde nach Zugabe von Lithiumchloridlösung und konzentrierter Salzsäure die
Wasserdampfdestillation mit auf 140°C überhitztem Wasserdampf durchgeführt.
Anschließend wurde das Destillat auf pH 5,5 bis 6 angesäuert und die Analyten durch
mehrmaliges Waschen mit Diethylether extrahiert. Die Detektion erfolgte ebenfalls mittels
GC-MS. Die Untersuchung von 12 Raucharomapräparaten (davon 2 Räuchersalze) ergab,
dass Guajakol, 4-Methylguajakol und Syringol in allen Präparaten quantitativ bestimmt
werden konnten, während 4-Methylsyringol immerhin in 11 Präparaten nachweisbar war
(BALTES u. SÖCHTIG 1979). Die Konzentration von Guajakol variierte bei 10 Präparaten
(exklusive der 2 Räuchersalze) von 409 mg/kg bis 5869 mg/kg und für Syringol von
39 mg/kg bis 9609 mg/kg. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass selbst zwischen zwei
Chargen eines Rauchkondensates des gleichen Herstellers die Zusammensetzung der
phenolischen Fraktion starken Schwankungen unterlag und dass die Gehalte der Phenole
während einer Lagerung von vier Monaten um bis zu 30 % des Ausgangswertes abnahmen.
Der Phenolgehalt in geräuchertem Hering wird stark beeinflusst von der Dauer des
Räucherns, der verwendeten Räuchertemperatur, sowie dem angewendetem
Räucherverfahren, wobei mit es mit zunehmender Räucherdauer und steigender Temperatur
zu einem signifikanten Anstieg des Phenolgehaltes kommt (SÉROT et al. 2004).
Die Abhängigkeit der Phenolkonzentration in Fleischprodukten von verschiedenen
Räucherbedingungen war Gegenstand umfangreicher Untersuchungen, die sich mit dem
Einfluss unterschiedlicher Holzarten (HITZEL et al. 2013b), Darmtypen und Fettgehalte
(PÖHLMANN et al. 2013b), Raucherzeugungsverfahren (PÖHLMANN et al. 2013a) und
Räucherbedingungen im Glimmrauchverfahren (PÖHLMANN et al. 2012) befassten. Die
Extraktion der Phenole aus den untersuchten geräucherten Fleischprodukten (Minisalamis und
Brühwürstchen) erfolgte ebenfalls mit Hilfe der Wasserdampfdestillation der homogenisierten
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2. Literaturübersicht
16
Fleischproben und mehrmaliger Diethyletherextraktion (siehe oben). Nach Aufreinigung der
Proben mittels Kieselgel wurden die Gehalte der trimethylsilylierten Phenole Guajakol, 4-
Methylguajakol, Syringol, Eugenol und trans-Isoeugenol durch GC-MS bestimmt. Ein Teil
der Ergebnisse dieser Studien ist in Tabelle 4 dargestellt.
Untersuchtes
Fleischerzeugnis
Untersuchte Räucher-
/Produktkomponente
Gehalt des Phenols /der Gesamtphenole im Fleischprodukt in mg/kg
Guajakol 4-Methylguajakol Syringol Gesamtphenol-
gehalt
Minisalamisa Buchenholzrauch 16,4 11,6 14,2 53,5
Fichtenrauch 34,5 33,4 2,3 86,4
Brühwürstchena Buchenholzrauch 4,9 7,5 25,1 77,2
Fichtenrauch 10,2 24,9 2,8 122
Brühwürstchenb
(über Buche
geräuchert)
Schafsaitling 6,0 10,1 25,9 93,6
Cellulosedarm
(geschält) 2,9 4,9 17,3 48,8
Kollagen 2,0 3,6 15,0 46,6
Tabelle 4 Gehalte an Guajakol, 4-Methylguajakol und Syringol, sowie der Gesamtphenolgehalt
(Summe der Gehalte an Guajakol, 4-Methylguajakol, Syringol, Eugenol und trans-Isoeugenol) in
geräucherten Minisalamis und Brühwürstchen in Abhängigkeit von der Holzart und dem bei der
Wurstherstellung verwendeten Darmtyp (a :HITZEL et al. (2013b);b :PÖHLMANN et al. (2013b))
Der Anteil an Syringol in den über Hartholz (z. B. Buche) geräucherten Produkten war im
Vergleich zu den Gehalten an Guajakol und 4-Methylsyringol gleich bzw. größer, wobei eine
starke Abhängigkeit von dem untersuchten Fleischerzeugnis bestand. Beim Weichholz
(Fichte) überwog der Anteil von Guajakol und 4-Methylguajakol. Die Brühwürstchen im
Schafsaitling wiesen den höchsten Phenolgehalt auf, während Syringol durch die
Buchenholzräucherung bei allen Darmtypen wiederum den höchsten Gehalt im Vergleich zu
Guajakol und 4-Methylguajakol hatte.
Mit ansteigendem Fettgehalt der Brühwürstchen (von 9,9 % Fett auf 39,1 % Fett) nahm die
Konzentration von Syringol um 30 % ab, während der Gesamtphenolgehalt bei allen
Fettstufen mit 62,0 mg/kg bis 64,6 mg/kg relativ konstant blieb (PÖHLMANN et al. 2013b).
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2. Literaturübersicht
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Des Weiteren bestand eine Abhängigkeit des Phenolgehaltes vom Raucherzeugungsverfahren.
Dieser war am höchsten in mit Dampfrauch geräucherten Brühwürsten und am niedrigsten für
das Räuchern mit Friktionsrauch (PÖHLMANN et al. 2013a).
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Gehalte der im Räucherrauch, in
Rauchkondensaten und in geräucherten Lebensmitteln nachgewiesenen Phenole stark in
Abhängigkeit von den Herstellungsbedingungen, der Beschaffenheit des untersuchten
Produktes sowie im Falle von geräucherten Fleischprodukten auch innerhalb des Produktes in
Abhängigkeit vom untersuchten Gewebe/ der Gewebeschicht schwanken. Weiterhin wird die
Gehaltsbestimmung nicht zuletzt durch das verwendete Extraktionsverfahren beeinflusst, das
bisher auf der Verwendung hoher Extraktionstemperaturen (Wasserdampfdestillation) oder
der Einstellung stark alkalischer bzw. azider pH-Werte beruhte, die anschließend die
Extraktion mittels Diethylether ermöglichten.
Während die Detektion phenolischer Verbindungen aus pflanzlichen Matrices bereits vielfach
mit Hilfe von flüssigchromatograpischen Methoden in Kopplung mit Massenspektrometrie
erfolgte (LC-MS) (PAREJO et al. 2004; ALMELA et al. 2006; HOSSAIN et al. 2010),
wurden die Methoxyphenole des Räucherrauches nach ihrer Trimethylsilylierung bisher
überwiegend mittels gaschromatographischer Verfahren und Massenspektrometrie (GC-MS)
analysiert (siehe oben). Nur vereinzelt wurden glycosylierte und unglycosylierte
Phenolderivate des Rauches in Wein durch LC-MS bestimmt (CABONI et al. 2007;
HAYASAKA et al. 2010; DUNGEY et al. 2011). Dies liegt vor allem an den basischen pKS-
Werten der alkylierten und/oder alkoxylierten Rauchphenole (siehe Kap. 2.2.2.), die eine
ausreichende Ionisierung und somit eine Detektion z. B. mittels ESI-MS im sauren Milieu
verhindern. Nur die Verwendung alkalischer Eluenten ermöglicht die Detektion der
Methoxyphenole mit Hilfe von LC-ESI-MS (LÜDERS 1999).
2.2.4. Reaktion mit Nitrit in wässrigem Milieu
2.2.4.1. Nitrierung und Nitrosierung
Phenole werden mit Nitrit im wässrigen Milieu in Abhängigkeit von den
Reaktionsbedingungen nitriert, nitrosiert oder zu ihren Dimeren oxidiert. Die Nitrierung bzw.
Nitrosierung des Phenols erfolgt in para- oder ortho-Stellung zur Hydroxygruppe, da diese
einen positiven mesomeren Effekt hat und somit zu einer erhöhten negativen Ladungsdichte
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2. Literaturübersicht
18
an diesen Positionen führt (ZEECK et al. 2005). Nitrit kann in wässriger saurer Lösung
sowohl NO+ als auch NO2+ bilden, welche durch elektrophilen Angriff an den genannten
Positionen an das Phenol binden, sofern diese noch unsubstituiert sind (VIONE et al. 2000;
VOLLHARDT u. SCHORE 2011).
Die Reaktionskinetik der Phenolnitrierung ist hierbei stark abhängig von gegebenenfalls
bereits vorhandenen Substituenten, dem umgebenden Milieu, dem pH-Wert und der
Reaktionstemperatur. So können z. B. benachbarte Methylgruppen in meta-Position durch
sterische Blockierung die Nitrosierung in para-Position behindern (FERNANDEZ-
LIENCRES et al. 1997) und beim 3,5-Di-tert-butylphenol wird die Nitrosierung sogar
vollständig gehemmt (GONZALEZ-MANCEBO et al. 1999). Die Theorie der Entstehung von
Nitrophenol durch Oxidation des korrespondierenden Nitrosophenols, wie sie bereits in
Dioxan bei 40 °C bewiesen werden konnte (OGATA u. TEZUKA 1968), lies sich durch
Versuche in Aktivschlamm (JEWELL et al. 2014) und in wässrigem Medium (VIONE et al.
2004) nicht bestätigen. Ergebnisse der beiden letztgenannten Studien zeigten, dass die
Nitrierung und Nitrosierung der untersuchten Phenole weitgehend unabhängig voneinander
verlief.
Die Reaktion der Methoxyphenole des Rauches mit Nitrit wurde bisher vor allem in
Verbindung mit ihrer Bedeutung als Pyrolyseprodukte des Holzes in wässrigem Milieu
untersucht. Unter stark sauren Bedingungen (pH 2) und bei 70 °C reagierte Guajakol mit
salpetriger Säure zu 2-Methoxybenzochinon-4-monoxim, dem Tautomer von 4-
Nitrosoguajakol (UFFMANN 1967), sowie zu 6-Nitroguajakol, 4-Nitroguajakol und 4,6-
Dinitroguajakol. Wurde der pH-Wert auf 1 erniedrigt, entstanden bei einer
Reaktionstemperatur von 100 °C lediglich die Nitroguajakole. Wurde 4-Nitrosoguajakol unter
gleichen Bedingungen mit salpetriger Säure oxidiert, bildete sich 4-Nitroguajakol und 4,6-
Dinitroguajakol (KUNG 1968). Auch unter milderen Reaktionsbedingungen bei einem pH-
Wert von 4 und unter Einwirkung von UV-Licht konnte die Bildung von 4-Nitroguajakol, 6-
Nitroguajakol und geringer Mengen an 4,6-Dinitroguajakol durch Nitrierung von Guajakol in
wässriger Lösung nachgewiesen werden (KITANOVSKI et al. 2014).
Die Oxidation von 4-Methylguajakol mit salpetriger Säure bei 70 °C verlief über die Bildung
mehrerer Zwischenprodukte. Durch Substitution mittels NO+ erfolgte zunächst die
Nitrosierung zu 4-Methyl-6-nitrosoguajakol, welches anschließend zu 4-Methyl-6-
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2. Literaturübersicht
19
nitroguajakol weiteroxidiert wurde. Nach Demethylierung und Bildung eines chinoiden
Zwischenproduktes entstanden u.a. nicht-zyklische Endprodukte wie Oxalsäure (SOBOLEV
1961).
Wie Untersuchungen bezüglich der potentiellen Genotoxizität nitrosierbarer phenolischer
Verbindungen in Abhängigkeit von ihren strukturellen Eigenschaften zeigten, besitzt
nitrosiertes Syringol laut CASE Vorhersage im Gegensatz zu nitrosiertem Phenol keine
genotoxische Potenz. Das CASE Verfahren ist ein Verfahren zur Identifikation struktureller
Komponenten bestimmter Verbindungen, die für die Ausbildung möglicher Mutagenizität
sowie der geschätzten genotoxischen Potenz verantwortlich sind. Voraussetzung für die
Ausbildung einer solchen genotoxischen Potenz im Falle nitrosierter Phenole ist laut CASE
Methode das Vorhandensein unsubstituierter para- oder ortho-Positionen, sowie einer freien
meta-Position. Des Weiteren ist die Genotoxizität des jeweiligen Phenols abhängig von
dessen Fähigkeit reaktive Phenyldiazonium-Ionen auszubilden. Laut CASE Verfahren besteht
für nitrosiertes Guajakol ein geringes genotoxisches Potential (ROSENKRANZ et al. 1990).
Phenol reagiert mit Nitrit im sauren Milieu unter Bildung von mutagenem p-Diazochinon und
p-Nitrosophenol. Während das Diazochinon direkt mutagen wirkt, fördert p-Nitrosophenol
die Nitrosierung sekundärer Amine (siehe Kap. 2.3.2) (WALKER et al. 1979; KIKUGAWA
u. KATO 1988). Auch p-Nitroso-o-cresol, p-Nitrosothymol und 2,6-Dinitrosoresorcinol
katalysieren die Bildung von Nitrosaminen (DAVIES u. MCWEENY 1977; DAVIES et al.
1980). Nitrososyringol hingegen hemmt die Entstehung von Nitrosaminen vergleichbar mit
Ascorbinsäure, sowohl in vitro, als auch in in vivo Experimenten. Syringol reagiert schneller
mit Nitrit als die untersuchten Amine Morpholin oder Pyrrolidin und verhindert auf diesem
Wege deren Nitrosierung. Das entstehende 4-Nitrososyringol hat im Gegensatz zu den oben
genannten Nitrosophenolen keinen katalysierenden Einfluss auf die Nitrosaminbildung
(VIRK u. ISSENBERG 1985, 1986).
Weitere Genotoxizitätstest unter Verwendung von Bakterienkulturen bestätigten die geringen
bzw. nicht vorhandenen genotoxischen Eigenschaften nitrosierten Guajakols und Syringols.
Gleichzeitig wurde sowohl für nitrosierte Rauchkondensate als auch für nitrosierte
geräucherte Lebensmittel eine hohe Genotoxizität nachgewiesen, wobei die separat
untersuchte aufgereinigte nitrosierte Phenolfraktion der Kondensate die höchste Genotoxizität
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2. Literaturübersicht
20
zeigte. Ohne Nitritzusatz bei ansonsten gleichen Reaktionsbedingungen zeigten sich keine
genotoxischen Effekte in der Bakterienkultur (OHSHIMA et al. 1989).
2.2.4.2. Dimerisierung
Neben der Nitrierung bzw. Nitrosierung, spielt die Dimerisierung eine wichtige Rolle bei der
oxidativen Umsetzung von Phenolen. Hierbei kommt es zur radikalischen Kopplung zweier
Phenoxyradikale entweder in Form einer C-C Bindung zwischen den in para-Position zu der
phenolischen Hydroxygruppe befindlichen C-Atomen der Radikale oder zur C-O Bindung
zwischen dem O-Atom der phenolischen Hydroxygruppe und dem in para-Position
befindlichen C-Atom eines Phenoxyradikals (SUN et al. 2010). Im Falle von 2,6-
Dimethylphenol wird im sauren Milieu ausschließlich das C-C gekoppelte Dimer gebildet,
während unter dem Einfluss eines basischen Reaktionsmediums nur die C-O gekoppelte
Dimerisierung stattfindet (KOBAYASHI u. HIGASHIMURA 2003).
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2. Literaturübersicht
21
Abbildung 4 Radikalische Dimerisierung eines Phenols durch C-C bzw. C-O Kopplung in saurem und
basischem wässrigem Reaktionsmedium (mod. nach KOBAYASHI u. HIGASHIMURA (2003) und
SUN et al. (2010))
Die Bildung der Phenoxyradikale erfolgt über die Oxidation des entsprechenden Phenols
durch Oxidationsmittel, Basen, Säuren oder unter Einfluss von Katalysatoren wie Oxidasen,
Wasserstoffperoxid oder Peroxidasen (KOBAYASHI u. HIGASHIMURA 2003).
Die oxidative Dimerisierung unter Nitriteinwirkung in der Fleischmatrix wurde bereits für das
Phenol p-Cymen-2,3-diol, ein wichtiges Antioxidans des Thymians, belegt (RAINIS u.
TERNES 2013).
Für Syringol wurde die Dimerisierung als Folge enzymatischer Umsetzung mittels Laccase
(WAN et al. 2008), durch Mikroorganismen (Aspergillus ssp. und Pseudomonas ssp.)
(BETTS u. KING 1991) oder unter Einwirkung von UV-Licht mit und ohne
Wasserstoffperoxid als Katalysator nachgewiesen, während die Dimerisierung von Guajakol
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2. Literaturübersicht
22
unter Einfluss von UV-Licht und Wasserstoffperoxid untersucht worden ist (SUN et al. 2010).
Die Umsetzung erfolgte hierbei im wässrigen Milieu oder in organischen Lösemitteln. Für
Versuche in organischen Lösemitteln ist ein fördernder Einfluss auf die Dimerbildung v.a. für
Lösemittel relativ geringer Polarität wie. z. B. Aceton belegt worden (ADELAKUN et al.
2012). Während bei der Umsetzung des Syringols durch Enzyme wie Laccase und unter UV-
Bestrahlung das Dimer 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol entsteht, liegt bei der
oxidativen Kopplung durch Mikroorganismen und bei der Oxidation durch Salpetersäure im
stark sauren wässrigen Milieu (pH 2 und 70 °C) die chinoide Form als 3,3′,5,5′-
Tetramethoxydiphenochinon vor (Abb. 5) Im Zusammenhang mit der Chinonbildung wurde
stets die Entstehung von Präzipitaten aus lilafarbenen, nadelförmigen Kristallen beschrieben
(KUNG 1968; BETTS u. KING 1991) (vgl. hierzu Kap. 4.1.2.).
OH
H3CO OCH3
OCH3
OH
H3CO
O
O
H3CO OCH3
OCH3H3CO
3,3',5,5'-Tetramethoxy-1,1'-
biphenyl-4,4'-diol3,3',5,5'-Tetramethoxy-
diphenochinon
Abbildung 5 Strukturformel des Syringoldimers 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol und
seines Chinons 3,3′,5,5′-Tetramethoxydiphenochinon (nach ADELAKUN et al. (2012) und BETTS u.
KING (1991))
Aus wässrigem Raucharoma konnte sowohl das Syringoldimer 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-
biphenyl-4,4′-diol als auch das dimerisierte Guajakol 3,3′-4,4′-dihydroxy-1,1′-biphenyl
isoliert werden (GUILLEN u. IBARGOITIA 1998).
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2. Literaturübersicht
23
In Tests zur Bestimmung der antioxidativen Wirkung (DPPH und FRAP) wies das Dimer des
Syringols ein ungefähr doppelt so großes antioxidatives Potenzial wie undimerisiertes
Syringol auf (ADELAKUN et al. 2012) und auch für andere Phenoldimere, die sich von
Mono- oder Dimethoxyphenolen des Räucherrauches herleiten lassen, wurde eine
antioxidative Wirkung belegt, die die der Monomere nachweislich übertrifft (BARCLAY et
al. 1997).
2.2.5. Reaktion mit Nitrit in Fleischprodukten
Aufgrund des hohen Gehaltes an Methoxyphenolen in geräucherten Lebensmitteln und
Raucharomen (Kap. 2.2.3.) und den teilweise gesundheitlich bedenklichen Eigenschaften der
Reaktionsprodukte phenolischer Verbindungen mit Nitrit im wässrigen Milieu (Kap. 2.2.5.)
war der Nachweis selbiger Reaktionsprodukte in geräucherten und gepökelten
Fleischprodukten Gegenstand umfangreicher Untersuchungen. Zunächst erfolgte die
Untersuchung nitrosierter Raucharomapräparate, der sich vergleichende Studien über die
Bildung von Nitro-bzw. Nitrosophenolen in geräucherten und gepökelten Fleischprodukten
anschlossen (KNOWLES et al. 1974b, 1975b). Wiederholt wurde hierbei auf die
Schwierigkeit der Extraktion der entsprechenden Verbindungen aus der Fleischmatrix
hingewiesen (KNOWLES et al. 1974b; GILBERT u. KNOWLES 1975; KNOWLES et al.
1975b). Aus den nitrosierten Raucharomapräparaten wurden neben einer Vielzahl an
alkylsubstituierten Nitrophenolen die nitrierten Guajakolderivate 6-Nitroguajakol, 4-
Nitroguajakol und 6-Nitro-4-methylguajakol isoliert. Die Extraktion der gesuchten
Verbindungen aus gepökeltem und geräuchertem Schinkenspeck wurde mittels
Fraktionierung auf Grundlage unterschiedlicher Aziditäten und Diethyletherextraktion (siehe
Kapitel 2.2.3.) durchgeführt. Auch im Schinkenspeck konnten vor allem alkylsubstituierte
Nitrophenole (v.a. Methyl-, Ethyl- und Butylnitrophenole) nachgewiesen werden. Erst in den
Speckproben, die einer Hitzebehandlung (Braten in einer Elektrischen Pfanne) und/ oder
simulierter Verdauung (Zugabe von Salzsäure, 37 °C, 2 h) unterzogen wurden, erfolgte der
Nachweis der nitrierten Methoxyphenole 6-Nitroguajakol, 4-Nitroguajakol, 6-Nitro-4-
methylguajakol, n-Nitro-4-methylguajakol und 6-Nitro-4-allylguajakol. Bezüglich des
Nachweises nitrosierter Reaktionsprodukte des Guajakols bzw. des 4-Methylguajakols sind
die Angaben der Autoren widersprüchlich. Während KNOWLES et al. (1974b) über die
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2. Literaturübersicht
24
vorläufige Identifizierung von 6-Nitroso-4-methylguajakol und 6-Nitroso-4-propylguajakol
aus nitrosierten Raucharomen und gebratenem, traditionell geräuchertem Schinkenspeck
berichteten, gaben sie bei der späteren ausführlicheren Veröffentlichung ihrer Ergebnisse an,
sowohl aus den nitrosierten Raucharomen, als auch aus den Schinkenspeckproben keinerlei
Nitrosophenole isoliert zu haben (KNOWLES et al. 1975b). Die Gründe für das Fehlen von
Nitrosoverbindungen sahen die Autoren in der weiteren Oxidation der Nitrosophenole zu den
korrespondierenden Nitrophenolen. Des Weiteren fällt auf, dass in beiden Studien keinerlei
nitrierte bzw. nitrosierte Syringolderivate nachgewiesen wurden, obwohl Syringol und seine
alkylsubtituierten Derivate in den nicht nitrosierten Raucharomen und gepökelten und
geräucherten Schinkenspeckproben teilweise mehr als 50 % der gesamten Phenolfraktion
ausmachten (KNOWLES et al. 1975a). Als Gründe für das Fehlen der nitrierten bzw.
nitrosierten Syringolderivate vermuteten die Autoren eine erfolgte Demethylierung der
entsprechenden Verbindungen und somit die Bildung anderer Phenolderivate, die mit der
angewandten Methodik nicht nachweisbar waren, sehr langsam verlaufende
Nitrosierungsreaktionen oder eine Verhinderung der Nitrosierung durch das Fehlen
nitrosierbarer freier ortho- bzw. para-Positionen wie es z. B. beim 4-Methylsyringol der Fall
ist. Aufgrund von Extraktionsproblemen aus der Fleischmatrix erfolgte in keiner der
genannten Studien eine quantitative Bestimmung der Phenol- bzw. Nitrophenolgehalte
(KNOWLES et al. 1975b).
Auch HOFMANN (1990) gelang lediglich der Nachweis nitrierter alkylsubstituierter Phenole
sowie von 4-Nitroresorcin aus gepökelten, geräucherten rohen oder heißgeräucherten
Schinken und geräucherten Rohwürsten. Auch in dieser Studie wurde das Fehlen jeglicher
Nitrosophenole zum einen mit der möglichen sofortigen Oxidation der Nitrosophenole zu den
entsprechenden Nitrophenolen, zum anderen mit der Bildung von Chinonmonoximen, den
Tautomeren der Nitrosophenole, die mit der Methodik nicht erfasst werden konnten,
begründet. Als dritten Grund nennt der Autor die Möglichkeit der Oxidation der
Nitrosoverbindungen während der Extraktion und Probenaufreinigung.
2.3. Verwendung und Reaktion von Nitrit in Fleischprodukten
Während molekularer Stickstoff (N2) aufgrund seiner festen Dreifachbindung zwischen den
beiden Stickstoffatomen ein reaktionsträges Gas ist, verfügt das Stickstoffatom selbst über
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2. Literaturübersicht
25
eine komplexe Reaktivität. Aufgrund seiner 5 Außenelektronen besitzt es mehrere
Oxidationsstufen: von N3- (NH3) über N5+ (HNO3) und N3+ (N2O3 und HNO2), sowie N2+ und
N4+ in NO bzw. NO2. Letztere zwei Verbindungen entstehen im sauren Milieu, wie es z. B. in
Fleischprodukten vorliegt, unter Disproportionierung von N2O3, welches wiederum aus
salpetriger Säure (HNO2) generiert wird (Abb. 6) (HONIKEL 2008).
Abbildung 6 Umsetzung von HNO2 im sauren Milieu
Salpetrige Säure wird Fleischprodukten in Form von Pökelsalz zugesetzt. Dieses besteht
überwiegend aus Kochsalz (99,5-99,6 %) und 0,4-0,5 % salpetriger Säure (HNO2) oder
Salpetersäure (HNO3) bzw. aus deren Kalium- oder Natriumsalzen (DUNKELBERG et al.
2007). Die Pökelung dient der Konservierung, Farbstabilisierung und Aromatisierung von
Fleisch und Wurstwaren. Sie erfolgt entweder in Form der Nass- oder der Trockenpökelung.
Bei erster wird das Fleisch in die Pökellake eingelegt (Lakepökelung) oder diese wird direkt
in das Gewebe eingespritzt (Spritzpökelung). Bei der Trockenpökelung wird das Fleischstück
mit dem Salz eingerieben und anschließend 4-8 Wochen gelagert (TERNES et al. 2005).
Durch das Salz erfolgt der Wasserentzug aus dem Gewebe und es kommt zur Absenkung des
aw-Wertes (Maß für die Wasseraktivität), wodurch das mikrobielle Wachstum, dessen
Grundvoraussetzung die Verfügbarkeit von Wasser ist, effektiv gehemmt wird. Die
antimikrobielle und somit konservierende Wirkung des Nitrits entsteht durch die Bildung von
Stickoxiden, die über die Aminogruppe die Dehydrogenase von Bakterien blockieren, was in
Verbindung mit dem durch das Kochsalz hervorgerufenen Wasserentzug vor allem zur
Wachstumshemmung von Clostridium botulinum führt, welches das hochtoxische
Botulinustoxin bildet (SIELAFF 1996).
Die Umrötung des Fleisches und somit die Ausbildung des typischen „Pökelrotes“ ist eine
weitere erwünschte Wirkung des Nitrits im gepökelten Fleischprodukt. Hierzu kommt es
durch die Reaktion des Muskeleiweißes Myoglobin mit Nitrit zu Metmyoglobin, welches mit
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2. Literaturübersicht
26
dem durch Reduktion des Nitrits gebildeten Stickoxid (NO) weiter zu Nitrosometmyoglobin
reagiert. Das Nitrosometmyoglobin bildet in Verbindung mit direkt nitrosiertem Myoglobin
(Nitrosomyoglobin) stabile, leuchtend rote Komplexe („Pökelrot“), welche im Gegensatz zu
dem in ungepökeltem Fleisch vorliegenden Myoglobin auch nach dem Erhitzen ihre rote
Farbe behalten. Außerdem schützt Nitrosomyoglobin vor der Lipidperoxidation, d. h. vor dem
durch Fettsäureperoxylradikale hervorgerufenen Fettverderb (BELITZ et al. 2001).
Nitrit ist während der Pökelung an der Ausbildung des typischen Pökelaromas (CHO u.
BRATZLER 1970), wobei die Zugabe anderer aromatisierender Verbindungen z. B. durch
das gleichzeitige Räuchern der gepökelten Fleischprodukte diesen Effekt maskieren können
(WASSERMAN u. TALLEY 1972).
Nachteilige Effekte des Einsatzes von Nitrit bei der Fleischpökelung sind die Gefahr der
Nitrosaminbildung im Fleisch, sowie die der Nitritvergiftung durch die Einnahme toxischer
Mengen Nitrits (BRUNING-FANN u. KANEENE 1993; DUNKELBERG et al. 2007). Beide
Effekte treten im Zusammenhang mit dem Vorhandensein ungebundenen Nitrits auf, welches
nicht bereits mit anderen Inhaltstoffen wie zum Beispiel Myoglobin reagiert hat. Die Bildung
von Nitrosaminen in gepökelten Fleischprodukten erfolgt durch die Nitrosierung sekundärer
und tertiärer Amine (v.a. Prolin und Dimethylamin) durch Nitrosylkationen (NO+) zu
Nitrosopyrrolidin und Nitrosodimethylamin. Die Entstehung der kanzerogenen Nitrosamine
kann durch die Zugabe von antinitrosierenden Agenzien wie α-Tocopherol und Ascorbinsäure
um bis zu 90 % gehemmt werden (TERNES 2008). Erhitzen der Fleischprodukte in
Anwesenheit von Sauerstoff, wie es z. B. beim Braten von gepökeltem Speck erfolgt, führt zu
einer Zunahme der Nitrosaminbildung (DENNIS et al. 1982).
Die Gefahr der Nitritintoxikation besteht v. a. für Kleinkinder und Säuglinge. Bei Aufnahme
toxischer Mengen an Nitrit wird Hämoglobin (zentrales Fe2+) zu Methämoglobin (zentrales
Fe3+) oxidiert, welches im Gegensatz zu Hämoglobin Sauerstoff irreversibel bindet, sodass
keine Sauerstoffabgabe in die Gewebe erfolgen kann (DUNKELBERG et al. 2007). Um
sowohl die Nitrosaminbildung im Fleischprodukt als auch eine mögliche Nitritvergiftung zu
verhindern, ist die einzuhaltende Höchstmenge an Natriumnitrit bzw. Kaliumnitrit in der
Zusatzstoffzulassungsverordnung (ZZulV Teil C Andere Konservierungsstoffe, Liste 1 Nitrite
und Nitrate; Stand: 21.05.2012) gesetzlich geregelt und beträgt 150 mg/kg in
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2. Literaturübersicht
27
Fleischerzeugnissen, wobei die Höchstmengen für einzelne traditionell gepökelte
Fleischprodukte zwischen 175 mg/kg und 50 mg/kg im Endprodukt liegen.
2.4. Ascorbinsäure
2.4.1. Verwendung und Reaktion in Fleischprodukten
Ascorbinsäure, auch bekannt als Vitamin C, ist ein Antioxidant, welches natürlicherweise vor
allem in pflanzlichen Geweben vorkommt, aber auch synthetisch hergestellt und als
Lebensmittelzusatzstoff (Ascorbinsäure (E 300), Natriumascorbat (E 301), Calciumascorbat
(E 302)) vielen Lebensmitteln zugesetzt wird (TERNES et al. 2005).
Unter Abspaltung eines Elektrons bildet sich aus L-Ascorbinsäure ein L-
Ascorbinsäureradikal, welches sowohl oxidative, als auch reduzierende Eigenschaften hat und
mit anderen Radikalen reagieren kann. Auf diesem Wege führt es zum Radikalkettenabbruch
und kann, wenn es Fetten in Form seines fettlöslichen Esters Ascorbylpalmitat zugesetzt wird,
die Lipidautoxidation durch Peroxidradikale verhindern (LIAO u. SEIB 1988). Da
unveresterte L-Ascorbinsäure nicht fettlöslich ist, kann sie selbst die Lipidautoxidation nicht
verhindern, kann jedoch die Wirkung anderer fettlöslicher Antioxidantien wie Tocopherol
durch dessen Regeneration verlängern und hat somit in Fetten synergistische Effekte
(TERNES et al. 2005). Die Zugabe von Ascorbinsäure in wässrige Systeme wie z. B.
Pökellaken und die dadurch bedingte Erniedrigung des pH-Wertes kann in Verbindung mit
hohen Nitritgehalten zu einem vermehrten Abbau von Antioxidantien wie Tocochromanolen
führen (GERLING u. TERNES 2014).
In gepökelten Fleischprodukten beschleunigt Ascorbinsäure die Umrötung (Kap. 2.3) durch
die Reduktion von Nitrit zu NO, das wiederum verstärkt mit Myoglobin reagieren kann
(FREDE 2010). Sie wird dabei selbst zu Dehydroascorbinsäure oxidiert (Abb. 7).
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2. Literaturübersicht
28
OO
OHHO
H
HHO
HO2 HNO2
O
O O
OHO
HO
H
H
2 NO 2 H2O
L-Ascorbinsäure Dehydroascorbinsäure
Abbildung 7 Redoxreaktion der Ascorbinsäure mit Nitrit (TERNES 2008)
Zur Verringerung der Nitritmenge in gepökelten Fleischprodukten (Kap. 2.3.) wird
Ascorbinsäure in einer Konzentration von 200-750 mg/kg eingesetzt. Oberhalb einer
Konzentration von 300 mg/kg im Fleischprodukt besteht jedoch die Gefahr der
Nitrosaminbildung infolge von Transnitrosierung gebildeter Nitrosohydroascorbinsäure
(TERNES 2008).
2.4.2. Antinitrosierende Wirkung
Weitere Bedeutung erlangt Ascorbinsäure durch die Hemmung der Nitrosaminbildung, indem
es selbst mit nitrosierenden Stickoxiden nach dem in Abbildung 8 gezeigtem Mechanismus
reagiert und so eine Nitrosierung anderer Verbindungen im wässrigen Milieu effektiv
verhindert (Abb. 8) (W. R. LICHT et al. 1988).
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2. Literaturübersicht
29
Abbildung 8 Mechanismus für die inhibitorsche Wirkung von Ascorbinsäure auf die
Nitrosaminbildung durch nitrosierende Stickoxide im offenen, aeroben System (mod. nach W. R.
LICHT et al. (1988))
Entscheidend für die Hemmung der Nitrosierung durch Ascorbinsäure im offenen System ist
hierbei der Abtransport des gebildeten NO (welches Amine nicht nitrosiert (TANNENBAUM
et al. 1991)) oder dessen Regeneration zu den nitrosierenden Stickoxiden. Im offenen in vivo
System wie dem Magen kann NO über die Mukosa absorbiert werden (WILLIAM R. LICHT
et al. 1986) während es in vitro als gasförmige Verbindung entweicht. In geschlossenen
Systemen oder bei nicht vollständigem Abtransport wird NO in Anwesenheit von Sauerstoff
zu reaktiven Stickoxiden regeneriert (TANNENBAUM 1980). Des Weiteren wird
Ascorbinsäure durch vorhandenen Sauerstoff verstärkt selbst oxidiert und steht deshalb nicht
mehr für den Abbau von Nitrit zu NO zur Verfügung (ARCHER et al. 1975; MIRVISH
1975). Während Ascorbinsäure im wässrigen System die Nitrosierung durch in Abbildung 8
angegebenen Mechanismus v. a. in Abwesenheit von Sauerstoff (ARCHER et al. 1975) und
bei niedrigen Reaktionstemperaturen effektiv verhindern kann (W. R. LICHT et al. 1988), hat
es in lipophilem Medium aufgrund seiner lipophoben Eigenschaften keine inhibitorische
Wirkung. Im heterogenen Milieu kann das gebildete NO in lipophile Bereiche diffundieren
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2. Literaturübersicht
30
und dort nach erfolgter Oxidation wiederum mit vorhandenen Aminen reagieren (BARTSCH
et al. 1988).
In gepökeltem Speck konnte nach Zusatz von Dimethylamin und Ascorbinsäure die
Entstehung von Nitrosodimethylamin nachgewiesen werden, wobei die Konzentration des
Nitrosamins nach dem Braten (95-100 °C) im Fettgewebe teilweise um das 10-fache höher
war als im angrenzenden Muskelgewebe. Des Weiteren zeigte sich ein antinitrosierender
Effekt der Ascorbinsäure, besonders wenn diese in equimolarem Verhältnis zum zugesetzten
Nitrit vorlag (MOTTRAM et al. 1975).
Da das Ascorbat-Ion (pKS 4,3) um das 230fache schneller mit Nitrit reagiert als
Ascorbinsäure, liegt das pH-Optimum für die antinitrosierende Wirkung von Ascorbinsäure
bei 3-5 (MIRVISH 1975). Aber auch bei neutralem und basischem pH verhindert
Ascorbinsäure effektiv die Nitrosierung von Morpholin (COONEY et al. 1986). In vitro
hemmt Ascorbinsäure im equimolaren Verhältnis zu Nitrit und selbst bei Anwesenheit von
Sauerstoff die Nitrosierung von Dimethylamin, Morpholin und Piperazin nahezu vollständig
(ARCHER et al. 1975; MIRVISH 1975). Auch in vivo blockiert Ascorbinsäure die
intragastrische Nitrosierung der genannten Amine im Tierversuch. Für den Menschen besteht
ein Zusammenhang zwischen der Aufnahme von Ascorbinsäure mit der Nahrung und einem
vermindertem Krebsrisiko im Bereich des Magens, des Ösophagus und der Mundhöhle
(BARTSCH et al. 1988).
2.5. Analytische Methoden (Grundprinzipien)
2.5.1. Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)
Bei der Hochleistungsflussigchomatographie (HPLC) erfolgt die chromatographische
Trennung von Stoffgemischen, indem eine stationäre, feste Phase (Säule) von einer mobilen
flüssigen Phase (Eluent) durchströmt wird. Die mobile Phase enthält hierbei die zu
trennenden Analyte, die durch unterschiedlich starke Wechselwirkungen mit dem
Trägermaterial der Säule zurückgehalten werden. Diese unterschiedliche Retention kann
anhand der Retentionszeit, d.h. der Zeit, die die Substanz benötigt, um durch die Trennsäule
zu wandern, bestimmt werden. Die Retentionszeit einer Substanz ist innerhalb eines Systems
für diesen Stoff charakteristisch, sodass das chromatographische Verhalten des Stoffes seiner
Identifizierung bzw. seiner Reinheitsbestimmung dienen kann (ZEECK et al. 2005).
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2. Literaturübersicht
31
Für die Trennung werden verschiedene Trägermaterialien der Säulen verwendet, die
unterschiedliche Wechselwirkungen mit den Analyten eingehen. Bei der Verwendung von
Normalphasen kommen v.a. Kieselgele zum Einsatz, die auf ihrer Oberfläche polare Gruppen
tragen und mit den Analyten hydrophile Wechselwirkungen eingehen. Umkehrphasen
hingegen verfügen über unpolare Oberflächen und reagieren mit dem Analyten über
hydrophobe Wechselwirkungen. Weitere Faktoren, die die Retention der Analyten
beeinflussen sind der Porendurchmesser des Trägermaterials, die Säulenlänge, der
Säulendurchmesser und die Zusammensetzung der mobilen Phase, die meist aus
Lösemittelgemischen aus Wasser, organischem Lösemittel und einem Puffer oder Ionenpaar-
Reagenz besteht (LOTTSPEICH u. ZORBAS 1998).
2.5.2. Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und
Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)
Bei der Gaschromatographie wird die flüssige Probe sofort nach dem Einspritzen verdampft
und mit der mobilen, gasförmigen Phase (Stickstoff oder Helium) in eine Kapillarsäule
eingeleitet, wo die Auftrennung der Analyten erfolgt. Dieses Verfahren eignet sich v.a. für die
Trennung flüchtiger organischer Verbindungen. Anschließend erfolgt deren Detektion mittels
Massenspektrometrie (OHLS 2010).
Bei der massenpektrometrischen Analyse wird die zu untersuchende Substanz in einer
Ionenquelle ionisiert. Anschließend erfolgt die Auftrennung der Ionen entsprechend ihrem
Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z) im Vakuum. Der Detektor registriert die eintreffenden
Ionen. Aus den detektierten Signalen werden Massenspektren erstellt, aus denen das m/z-
Verhältnis sowie die Signalintensitäten der jeweiligen Ionen ablesbar sind.
Für die Ionisierung der Analyten stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Bei der
Elektronenstoßionisation (EI) wird der Analyt mit energiereichen Elektronen beschossen und
es kommt zur Bildung eines Molekülions. Da die Ionisierungsenergie des Analyten bei
diesem Elektronenbeschuss oft überschritten wird, kommt es zu Zerfallsprozessen, d.h. zur
charakteristischen Fragmentierung der Molekülionen. Anhand des m/z-Verhältnisses dieses
Molekülions sowie seines Fragmentierungsmusters können Rückschlüsse auf dessen Identität
erfolgen (ZEECK et al. 2005).
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2. Literaturübersicht
32
Im Gegensatz zur Gaschromatographie gelangt der Analyt bei der Flüssigchromatographie in
der flüssigen mobilen Phase in die Ionenquelle, wo seine Ionisierung stattfindet.
Bei der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie kommen vor allem zwei
Ionisierungstechniken zum Einsatz, die Elektrospray-Ionisation (ESI) und die chemische
Ionisation bei Atmosphärendruck (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI). Bei der
Ionisation mittels ESI erfolgt zunächst die Zerstäubung der Probe in kleinste geladene
Tröpfchen in einem angelegten elektrischen Feld unter Verwendung eines Spraygases (z. B.
N2). Noch in diesen Tröpfchen enthaltenes Lösemittel verdampft und die nunmehr
verbleibenden Analyt-Ionen werden im Hochvakuum des Analysators (z. B.
Quadrupolmassenanalysator) entsprechend ihres m/z-Verhältnisses getrennt und in den
Massendetektor weitergeleitet. Bei der Ionisation mittels ESI können sowohl negativ geladene
(negativ ion mode) als auch positive geladene Ionen (positive ion mode) gebildet werden
(LOTTSPEICH u. ZORBAS 1998).
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3. Material und Methoden
33
3. Material und Methoden
3.1. Geräte und Chemikalien
Eine vollständige tabellarische Aufstellung aller verwendeten Chemikalien und Geräte
befindet sich im Anhang unter Kapitel 8.3 und 8.4.
3.2. Herstellung der Reagenzien
Phenollösungen
Für die Herstellung der Phenollösungen von Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol oder 4-
Methylguajakol wurden jeweils 500 mg des entsprechenden Phenols in 5 mL Ethanol gelöst
und anschließend je nach Versuchsaufbau der Pökellake oder der Fleischprobe in der
vorgegebenen Konzentration hinzugefügt.
Die Phenollösungen wurden im Dunkeln bei -18 °C aufbewahrt und erwiesen sich unter
diesen Bedingungen über einen Zeitraum von mindestens vier Wochen als stabil.
Salzsäurelösung 0,5 M
Für die Ansäuerung der hergestellten Marinaden auf pH 3, sowie für die Simulation der
Verdauung der Fleischproben wurde eine 0,5 molare Salzsäurelösung (HCl) hergestellt.
Hierfür wurden 10,35 mL einer 37 %igen rauchenden HCl-Lösung mit destilliertem Wasser
auf 250 mL verdünnt.
Ammoniaklösung 2 M
Für die Einstellung der Marinaden auf pH 5, sowie für die Anhebung des pH-Wertes der
Fleischproben nach der simulierten Verdauung wurde eine 2 M Ammoniaklösung (NH3)
hergestellt. Hierfür wurden 5,8 mL einer 30-33 %igen NH3-Lösung mit destilliertem Wasser
auf 50 mL verdünnt.
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3. Material und Methoden
34
Pepsinlösung
Die Pepsinlösung für die Simulation der Verdauung der Fleischproben wurde hergestellt mit
50 mg Pepsin auf 10 mL destilliertes Wasser, welches zuvor mit 0,5 M HCl-Lösung auf einen
pH von 4,5 eingestellt wurde. Die Pepsinlösung wurde vor jedem Verdauungsversuch kurz
vor ihrer Zugabe zur Fleischmatrix frisch hergestellt.
Nitritpökelsalz 0,45 %
Für die Herstellung des Nitritpökelsalzes mit 0,45 % Natriumnitrit wurde 0,9 %iges
Nitritpökelsalz mit Kochsalz im Verhältnis 1:2 verdünnt.
Nitrit-Kochsalzlösung 0,8 %
Für den Ansatz der Fleischproben mit einem Nitritgehalt von 400 mg/kg wurde eine wässrige
Nitrit-Kochsalzlösung hergestellt, hierfür wurden 4 g Kochsalz (NaCl) und 160 mg
Natriumnitrit (NaNO2) in 20 mL destilliertem Wasser gelöst.
Ascorbinsäure-Lösung 2 %ig
Für die Herstellung der Marinaden und der Fleischproben wurde eine 2 %ige Ascorbinsäure-
Lösung hergestellt, indem 100 mg Ascorbinsäure in 5 mL destilliertem Wasser gelöst wurden.
Die Herstellung der Ascorbinsäure-Lösung erfolgte jeweils unmittelbar vor ihrer Zugabe zu
den Proben.
3.3. Probenherstellung und –aufbereitung
3.3.1. Wässriges Reaktionsmodell
3.3.1.1. Herstellung
Die Pökellaken wurden als wässrige Lösungen hergestellt, die 1,66 % Nitritpökelsalz
enthielten. Der Nitritgehalt des Pökelsalzes betrug 0,9 %, sodass die resultierende
Konzentration an NaNO2 in der Pökellake 150 mg/L war. Des Weiteren erfolgte der Zusatz
des zu untersuchenden Methoxyphenols in einer Konzentration von 200 mg/L. Zuletzt wurden
gemäß den Versuchsmodellen zwei unterschiedliche Konzentrationen an Ascorbinsäure
hinzugegeben. Diese waren 100 mg/L und 500 mg/L Ascorbinsäure in der Lake.
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3. Material und Methoden
35
Sofort nach ihrer Herstellung wurde der pH-Wert der Laken gemessen. Die Pökellaken
wurden daraufhin im Wasserbad für 40 min bei 80 °C erhitzt und anschließend im Eisbad auf
18 °C gekühlt.
Die abgekühlten Proben wurden mit 0,5 M Salzsäurelösung auf einen pH-Wert von pH 3
angesäuert und in einem auf 40 °C temperiertem Wasserbad für 1 h erhitzt und anschließend
im Eisbad auf 18 °C abgekühlt. Zuletzt wurde der pH-Wert mit 2 M Ammoniaklösung auf pH
5 eingestellt, um eine weitere Reaktion der Analyten bei pH 3 zu unterbinden.
Für jeden Lakeversuch (je zwei unterschiedliche Ascorbinsäurekonzentrationen für jeweils
eines der vier untersuchten Methoxyphenole) wurden jeweils sechs Ansätze hergestellt.
Da sich v. a. in den Pökellaken mit Syringol-Zusatz nach dem Erhitzten bei 80 °C ein dunkler,
violett-brauner Niederschlag bildete, wurden weitere Versuche durchgeführt, um die
Entstehung desselben unter verschiedenen Reaktionsbedingungen näher zu untersuchen.
Hierfür wurden Pökellaken mit 100 mg/L Ascorbinsäure, 1,66 % Nitritpökelsalz (150 mg/kg
NaNO2) und 50 mg/L Syringol oder 1,66 % Nitritpökelsalz und 50 mg/L Syringol oder
100 mg/L Ascorbinsäure und 50 mg/L Syringol hergestellt und jeweils für 40 min bei 80 °C
erhitzt und anschließend bei 24 °C gelagert oder ohne Erhitzen im Dunkeln bei 24 °C oder
7 °C gelagert. Die Proben wurden jeweils nach 1, 3, 5 und 24 h auf die Bildung von
Niederschlägen optisch untersucht.
3.3.1.2. Probenentnahme
Die Probenentnahme erfolgte zunächst, nachdem die Laken auf 80 °C erhitzt und
anschließend auf 18 °C gekühlt worden waren, sowie ein zweites Mal nach der Einstellung
des pH-Wertes auf pH 5 mit 2 M Ammoniaklösung.
Es wurden jeweils 4 mL der Lake entnommen und mit Hilfe eines Spritzenfilters (Nylon,
Porendurchmesser 0,45 µm) filtriert. Dies geschah, um die dunklen, violett-braunen
Niederschläge zu entfernen, die sich in den Laken, die Guajakol oder Syringol enthielten,
gebildet hatten.
Schließlich wurden 2,5 mL der filtrierten Lakeproben zusammen mit 250 µL 4-
Methylguajakol (1 g/L) als internem Standard (bzw. 250 µL 4-Methylsyringol (1 g/L) als
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3. Material und Methoden
36
internem Standard für die Pökellaken, die 4-Methylguajakol als Analyten enthielten) in 5 mL
Messkolben überführt und mit destilliertem Wasser auf 5 mL aufgefüllt. Daraufhin wurden
die Proben mittels HPLC-UV/VIS bezüglich ihrer Phenolgehalte und der Entstehung von
Reaktionsprodukten analysiert.
Der abfiltrierte violett-braune Niederschlag der Pökellaken, die Syringol als Analyten
enthielten, wurde mit Methanol und destilliertem Wasser gespült und bei 37 °C im
Trockenschrank getrocknet. Ein Teil des getrockneten Niederschlages wurde mit destilliertem
Wasser gemischt und mikroskopisch untersucht.
Anschließend wurden 2 mg des Niederschlages mit 5 mL Chloroform gemischt, wobei ein
Teil des Niederschlages in Lösung ging. Ungelöste Anteile wurden mit einem Spritzenfilter
abfiltriert. Das klare, gelbe Filtrat wurde zunächst mittels HPLC-UV/VIS chromatographisch
getrennt und fraktioniert. Die einzelnen Fraktionen wurden mit Hilfe von GC-MS analysiert.
Der in Methanol gelöste Niederschlag aus den Pökellaken mit Guajakol-Zusatz wurde mittels
HPLC-UV/VIS sowie mit LC-MS analysiert.
3.3.2. Fleischproben
3.3.2.1. Herstellung
3.3.2.1.1. Fleischproben mit unterschiedlichen NaNO2-Zusätzen
Für die Herstellung der Fleischproben wurde gemischtes Hackfleisch aus 55 %
Schweinefleisch und 45 % Rindfleisch (Hackfleisch gemischt, Markendiscounter) verwendet.
Die Proben enthielten jeweils 100 mg/kg Ascorbinsäure, sowie 100 mg/kg Syringol oder 4-
Methylsyringol oder 60 mg/kg Guajakol oder 4-Methylguajakol. Des Weiteren wurde den
Proben entweder aus 1,66 % Nitritpökelsalz (enthält entweder 0,45 % oder 0,9 % NaNO2)
oder 5 % einer 0,8 % igen Nitrit-Kochsalzlösung zugesetzt. Die hieraus resultierenden
Konzentrationen an NaNO2 im Fleisch betrugen somit 75 mg/kg, 150 mg/kg oder 400 mg/kg.
Bevor die noch rohen Proben für die Versuche in Schraubdeckelgläser gefüllt wurden,
wurden sie mit Hilfe einer Moulinette homogenisiert.
Für jeden Versuch wurden jeweils sechs Ansätze hergestellt.
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3. Material und Methoden
37
3.3.2.1.2. Fleischschäume
Für die Simulation von Reaktionsbedingungen wie sie in Fleischmousses oder -parfaits
vorliegen, erfolgte die Herstellung von Fleischproben, denen 20 % w/w Eiklar zugesetzt
wurde. Das Eiklar wurde vorher entweder durch Aufschlagen mit Luft oder mit Sauerstoff zu
Eischnee verarbeitet und dann unter die bereits homogenisierte Fleischmasse gehoben. Die
Proben enthielten außerdem 100 mg/kg Ascorbinsäure, 1,66 % Nitritpökelsalz (0,9 % NaNO2)
und jeweils 100 mg/kg Syringol oder 4-Methylsyringol oder 60 mg/kg Guajakol oder 4-
Methylguajakol. Als Vergleichsproben wurden Fleischproben verwendet, die anstatt des
Eischaumes 20 % unaufgeschlagenes Eiklar enthielten.
Davon ausgehend, dass der Sauerstoffgehalt in der Luft, die für das Aufschlagen des Eiklars
verwendet wurde 20 % v/v ausmachte und im mit Sauerstoff angereichertem Luftgemisch ca.
80 % v/v betrug, errechnet sich ein Sauerstoffgehalt von 16 % v/v bzw. 64 % v/v in den
Schäumen. Zugrunde liegt dieser Berechnung, dass das Eiklar (100 mL) durch das
Aufschäumen auf das 5-fache (500 mL) seines Ausgangsvolumens gebracht wurde.
Für jeden Versuch wurden jeweils sechs Ansätze hergestellt.
3.3.2.1.3. Wiederfindungsraten
Für die Ermittlung der Wiederfindungsraten aus der Fleischmatrix, wurden Fleischproben
hergestellt, die jeweils 100 mg/kg Syringol oder 4-Methylsyringol oder 60 mg/kg Guajakol
oder 4-Methylguajakol enthielten. Es erfolgte kein Zusatz von Nitritpökelsalz oder
Ascorbinsäure. Die Bestimmung der Wiederfindungsraten erfolgte sowohl nach dem Erhitzen
(80 °C, 45 min) als auch nach der simulierten Verdauung (siehe unten).
Des Weiteren erfolgte die Bestimmung der Wiederfindungsraten der Oxidationsprodukte von
Syringol und Guajakol nach deren Zugabe zu Fleischproben, denen weder Nitritpökelsalz,
noch Ascorbinsäure oder unreagiertes Phenol zugesetzt worden waren. Hierfür wurden die
Reaktionsprodukte zunächst aus den Pökellaken mittels Festphasenextraktion extrahiert und
im Anschluss an ihre chromatographische Auftrennung fraktioniert. Die unterschiedlichen
Fraktionen wurden den Fleischproben vor dem Erhitzen auf 80 °C zugesetzt. Die Extraktion
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3. Material und Methoden
38
der Oxidationsprodukte erfolgte sowohl nach dem Erhitzen, als auch nach der simulierten
Verdauung der Fleischproben (siehe Versuchsdurchführung).
Die Stichprobenzahl war n = 6 für die Ermittlung der Wiederfindung der Phenole und der
Oxidationsprodukte von Guajakol und Syringol aus den erhitzten und auch aus den
„verdauten“ Fleischproben.
Um den Einfluss der Temperatur als auch der Dauer des Erhitzens auf die Extrahierbarkeit
von 6-Nitrosoguajakol und Nitrososyringol zu untersuchen, wurden weiterhin Fleischproben
ohne Nitritpökelsalz-, Ascorbinsäure- oder Phenolzusatz hergestellt, denen jeweils eines
dieser Oxidationsprodukte zugesetzt worden war. Ihre Extraktion erfolgte nachdem die
Proben entweder für 30 min bei 80 °C, für 45 min bei 60 °C oder für 30 min bei 60 °C erhitzt
worden waren. Die Stichprobenzahl für diese Versuche war jeweils n = 2
3.3.2.2. Versuchsdurchführung
Nach ihrer Herstellung wurden die Fleischproben in Schraubdeckelgläser gefüllt und im
Wasserbad bei 80 °C für 45 min erhitzt, um das Erhitzen bei der Lebensmittelherstellung
(z. B. Heißräucherung) bzw. -zubereitung (z. B. Braten) nachzustellen. Anschließend wurden
die Proben im Eisbad auf eine Kerntemperatur von 18 °C abgekühlt und erneut mit der
Moulinette homogenisiert. Der pH-Wert der homogenisierten Fleischmasse betrug 6,2.
Von der Probe wurden 3 g für die Extraktion abgenommen.
Die simulierte Verdauung der Fleischproben erfolgte unter Herstellung von dem Magenmilieu
ähnlichen Reaktionsbedingungen in Anlehnung an die von SØRENSEN u. BUKHAVE
(2010) entwickelte Methodik.. Die Zugabe von Pepsin und Salzsäure diente hierbei dem
Proteinaufschluss des Fleisches sowie der Herstellung eines sauren Reaktionsmilieus, wie es
im Magen vorliegt.
10 g der zuvor erhitzten und anschließend homogenisierten Fleischprobe (siehe oben) wurden
für die Durchführung der simulierten Verdauung in Zentrifugengläser gefüllt. Es erfolgte die
Zugabe von 5 mL 0,5 M HCl-Lösung sowie 1,5 mL Pepsinlösung zur Fleischmasse und deren
Homogenisierung mit Hilfe eines Stabhomogenisierers. Noch am Stab verbleibende Reste der
Fleischprobe wurden zusammen mit 1 mL destilliertem Wasser in das Zentrifugenglas
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3. Material und Methoden
39
überführt. Der pH-Wert der auf diese Weise hergestellten Fleischlösung war 3,6. Daraufhin
wurden die Proben bei 40 °C für 1 h im Wasserbad erhitzt und anschließend auf 18 °C
abgekühlt. Zuletzt erfolgte der Zusatz von 1 mL 2 M Ammoniaklösung zu der Fleischprobe.
Für die Extraktion wurden 5 g der Fleischprobe abgenommen.
Für die Lagerungsversuche wurden Fleischproben mit 1,66 % Nitritpökelsalz (0,9 % NaNO2),
100 mg/kg Ascorbinsäure und den oben angegebenen Phenolgehalten (60 bzw. 100 mg/kg)
hergestellt und wie bereits beschrieben bei 80 °C für 45 min erhitzt. Die verschlossenen
Schraubdeckelgläser wurden nach dem Abkühlen im Eisbad für 7 Tage bei 7 °C im Dunkeln
gelagert. Anschließend wurden die Proben mit der Moulinette homogenisiert und die
simulierte Verdauung wurde durchgeführt (siehe oben).
3.3.2.3. Probenaufbereitung
Die Extraktion der Methoxyphenole sowie ihrer Oxidationsprodukte aus der Fleischmatrix
erfolgte nach dem in Abbildung 9 dargestellten Schema.
3.3.2.3.1. Methanolextraktion
Zunächst wurde die Extraktion der Analyten mittels Methanol durchgeführt. Hierfür wurden
3 g bzw. 5 g der Fleischproben (siehe Versuchsdurchführung) in Zentrifugenröhrchen gefüllt
und zusammen mit 5 mL Methanol, welches zuvor auf ca. 50 °C erwärmt worden war, mit
Hilfe eines Stabhomogenisierers homogenisiert. Die Methanol-Fleisch-Emulsion wurde im
Gefrierschrank (-30 °C) auf eine Temperatur von 0 °C abgekühlt und anschließend bei 0 °C
und 20.000 rpm für 4 min zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand durch
einen Faltenfilter in einen 150 mL Messkolben abfiltriert.
Die Methanolextraktion wurde noch zweimal auf gleiche Weise wiederholt. In einem vierten
Extraktionsschritt wurden anstatt des Methanols 5 mL destilliertes Wasser verwendet,
ansonsten wurde wie bei den drei vorherigen Methanolextraktionen verfahren.
Der 150 mL Messkolben, in welchem sich das Filtrat aus den vier Extraktionsschritten
befand, wurde mit destilliertem Wasser aufgefüllt.
Es schloss sich die Festphasenextraktion (SPE, siehe Kap. 3.3.2.3.2.) des Methanol-Wasser-
Fleischextraktes an.
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3. Material und Methoden
40
Abbildung 9 Extraktionsschema für die Methoxyphenole und ihre Oxidationsprodukte aus der
Fleischmatrix
3.3.2.3.2. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction, SPE)
Die Festphasenextraktion des Fleischextraktes wurde durchgeführt, um störende
Matrixbestandteile, wie Fett und Eiklar, zu entfernen und eine Aufkonzentrierung der
Analyten zu erreichen. Sie erfolgte unter Verwendung von LiChrolut® EN SPE Kartuschen
(40-120 µm, 200 mg), die auf einer Vakuumkammer fixiert wurden, um die aufgebrachten
Flüssigkeiten unter Verwendung von Unterdruck durch die Kartuschen ziehen zu können.
Zunächst wurden die Kartuschen mit jeweils 10 mL Methanol gespült und anschließend mit
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3. Material und Methoden
41
10 mL destilliertem Wasser konditioniert. Danach wurden die 150 mL Methanol-Wasser-
Fleischextrakt aufgebracht. Nachdem der Extrakt vollständig durchgelaufen war, wurde die
Kartusche mit 10 mL destilliertem Wasser gewaschen und kurz getrocknet. Die auf der
Kartusche verbliebenen Analyten wurden mit 4 mL auf 40 °C erwärmtem Methanol eluiert.
Das Eluat wurde in einem Spitzkolben aufgefangen und bei 37 °C unter Stickstoffatmosphäre
auf 300 µL aufkonzentriert. Der konzentrierte Fleischextrakt wurde zusammen mit 50 µL
internem Standard (4-Methylguajakol bzw. 4-Methylsyringol, siehe Kap. 3.3.1.2.) in einen
1 mL Messkolben überführt und mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Daraufhin wurden die
Fleischextrakte mittels HPLC-UV/VIS analysiert, anschließend in Probengläschen gefüllt und
bei -30 °C im Dunkeln gelagert.
3.4. Analyse der Methoxyphenole sowie ihrer Oxidationsprodukte mittels
HPLC-UV/VIS
3.4.1. HPLC-UV/VIS-System
3.4.1.1. Aufbau
Die chromatographische Trennung der Methoxyphenole sowie ihrer Oxidationsprodukte aus
der Pökellake und dem Fleischextrakt wurde unter verschiedenen HPLC-Bedingungen
durchgeführt (Tabelle 5). Grund hierfür war zum einen die hohe Matrixbelastung in den
Fleischextrakten, die vor allem die Messung der Oxidationsprodukte bei einer Wellenlänge
von 272 nm behinderte, bei 330 nm jedoch keinen störenden Effekt hatte. Deshalb wurden die
Gehalte der Methoxyphenole bei 272 nm bestimmt, während ihre Oxidationsprodukte
überwiegend bei 330 nm vermessen wurden. Zum anderen musste bei den Fleischextrakten
eine kleinere Säule, eine niedrigere Flussrate und ein höheres Injektionsvolumen verwendet
werden, um die Oxidationsprodukte in den vorliegenden Konzentrationsbereichen erfassen zu
können, die im Vergleich zu den Pökellakeproben deutlich niedriger waren. Trotz des
hierdurch erhöhten Probenvolumens waren die Analytenpeaks der UV/VIS-Chromatogramme
basisliniengetrennt. Außerdem zeigten sich im Vergleich zu den Chromatogrammen der
Pökellaken, bei denen ein geringeres Probenvolumen appliziert wurde, keine Hinweise auf
eine Überladung der Säule wie z. B. verstärktes Peaktailing.
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3. Material und Methoden
42
HPLC-Bedingungen Pökellake Fleischextrakt
Verwendete RP-Säule 250 mm Nucleodur C-18
Isis® (Innendurchmesser
4,6 mm; Partikelgröße 5 µm)
ohne Vorsäule
150 mm Nucleodur C-18
Isis® (Innendurchmesser
3 mm; Partikelgröße 3 µm)
mit Vorsäule
Injektionsvolumen 20 µL 100 µL
Eluent Wasser/Acetonitril/TEAOH/Essigsäure
(69,2:30:0,5:0,3; v/v/v/v), isokratisch
Flussrate 1 mL/min 0,3 mL/min
Einstellung UV/VIS-
Detektor 272 nm 272 nm und 330 nm
Tabelle 5 HPLC-Bedingungen für die Analyse der Pökellake bzw. des Fleischextraktes
Das HPLC System bestand aus einer Knauer Maxistar K-1000 HPLC-Pumpe, einer Knauer
Interface Box und einem Injektionsventil mit einer 20 µL bzw. 100 µL Probenschleife. Die
Detektion der Analyte erfolgte mit einem Jasco 875 Intelligent UV/VIS Detektor. Nachdem
die Probe diesen passiert hatte, wurde sie über einen 641 VA-Detektor zu einem 650
Elektrochemischen Detektor weitergeleitet und dort abermals vermessen.
Die Aufzeichnung und Auswertung der erhaltenen Daten erfolgte mittels Eurochrom 2.05
Software.
HPLC-UV/VIS-Chromatogramme der vier Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-
Methylsyringol und 4-Methylguajakol gemessen mit den HPLC-Bedingungen, wie sie für die
Pökellaken und Fleischextrakte verwendet wurden, befinden sich im Anhang unter Kapitel
8.5. und 8.6..
3.4.1.2. Kalibrierung
Für die Durchführung einer externen Kalibrierung wurden aus den Stammlösungen der
Phenole Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol oder 4-Methylguajakol jeweils verschiedene
Verdünnungsstufen hergestellt, die den zu erwartenden Konzentrationsbereichen der aus den
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3. Material und Methoden
43
Pökellaken bzw. Fleischproben isolierten Phenole entsprachen. In jedem Fall erfolgte die
Herstellung von mindestens 5 Verdünnungsstufen. Aus den erhaltenen Peakflächen
(Peakfläche = area under the curve) der unterschiedlichen Verdünnungsstufen wurde in
Abhängigkeit zu der bekannten Konzentration des jeweiligen Phenols eine lineare
Kalibrierfunktion (y = mx+n) erstellt, anhand derer sich die unbekannten Phenolgehalte in der
anschließend vermessenen Pökellake- bzw. Fleischprobe bestimmen ließen. Die Variable m
gibt in der Kalibrierfunktion die Steigung der Kalibriergeraden an und ist ein Maß für die
Empfindlichkeit der Analysenmethode, während n für den Ordinatenabschnitt der Geraden
steht.
Abbildung 10 Beispiel für eine Kalibriergerade von Guajakol unter den für die Pökellakeproben
verwendeten HPLC-UV/VIS-Bedingungen (272 nm)
Die Kalibrierung erfolgte sowohl unter den HPLC-Bedingungen, die für die Analyse der
Pökellaken verwendet wurden als auch für die Bedingungen, die der Bestimmung der Phenole
und ihrer Oxidationsprodukte in den Fleischprodukten zugrunde lagen.
Für die Gehaltsbestimmung der Oxidationsprodukte von Guajakol und Syringol wurde
überwiegend 5-Nitroguajakol als Kalibriersubstanz verwendet, da es den Reaktionsprodukten
sowohl strukturell, als auch bezüglich seines UV-Spektrums ähnelt. Auch für die Anfertigung
der Kalibriergeraden für 5-Nitroguajakol wurden zunächst in Vorversuchen die zu
erwartenden Peakflächen der Analyten ermittelt, anschließend mit den Peakflächen für
unterschiedliche Verdünnungsstufen von 5-Nitroguajakol verglichen und die Gehalte der
Oxidationsprodukte anhand von 5-Nitroguajakoläquivalenten bestimmt.
0
10
20
30
40
0 20 40 60 80 100 120
Pea
kfl
äch
e (m
V*
min
)
Konzentration Guajakol (mg/L)
y = 0,312x + 0,810
R2 = 0,999
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3. Material und Methoden
44
Abbildung 11 Beispiel für eine Kalibriergerade von 5-Nitroguajakol unter den für die
Pökellakeproben verwendeten HPLC-UV/VIS-Bedingungen (272 nm)
Abbildung 12 Beispiel für eine Kalibriergerade von 5-Nitroguajakol unter den für die Fleischextrakte
verwendeten HPLC-UV/VIS-Bedingungen (330 nm)
Nur im Falle des gebildeten Syringoldimers 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol
diente Syringol aufgrund seines vergleichbaren UV-Spektrums als Vergleichssubstanz, sodass
die Gehalte dieses Dimers als Syringoläquivalente angegeben wurden.
Als interner Standard zur Feststellung messtechnisch bedingter Abweichungen diente 4-
Methylguajakol, da dieses Phenol weder mit den anderen untersuchten Phenolen, noch mit
einem ihrer Reaktionsprodukte unter den verwendeten HPLC-Bedingungen coeluiert. Bei den
Proben, die 4-Methylguajakol als zu untersuchendes Phenol enthielten, war 4-Methylsyringol
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8 10 12 14Pea
kfl
äch
e (m
V*
min
)
Konzentration 5-Nitroguajakol (mg/L)
0
5
10
15
20
25
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3Pea
kfl
äch
e (m
V*
min
)
Konzentration 5-Nitroguajakol (mg/kg)
y = 8,793x + 0,775
R2 = 0,999
y = 0,341x + 0,138
R2 = 0,994
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3. Material und Methoden
45
der interne Standard, welches ebenfalls keine chromatographischen Überlagerungen mit 4-
Methylguajakol oder seinen Oxidationsprodukten zeigt.
3.4.1.3. Probenmessung und Gehaltsbestimmung
3.4.1.3.1. Proben aus wässrigem Reaktionsmodell
Die Pökellakenproben wurden direkt nach ihrer Herstellung mittels HPLC-UV/VIS unter den
in Kap. 3.4.1.1. angegebenen Bedingungen vermessen.
Die Identifizierung der Substanzpeaks erfolgte mittels LC-ESI-MS und GC-MS nach ihrer
Fraktionierung und anschließenden Aufreinigung und Aufkonzentrierung mit Hilfe der
Festphasenextraktion (siehe Kap. 3.5.1.).
Die Gehalte an noch vorhandenem bzw. nicht bereits oxidiertem Phenol wurden anhand der
für die Pökellake erstellten Kalibrierfunktion für die einzelnen Phenole bestimmt, während
die Gehaltsbestimmung der Oxidationsprodukte unter Einbeziehung der Kalibrierfunktion für
5-Nitroguajakol für Pökellaken erfolgte (siehe Kap. 3.4.1.2.).
Die Bestimmung der Gehalte erfolgte hierbei über die Peakfläche der integrierten zugehörigen
Substanzpeaks der HPLC-UV/VIS-Chromatogramme unter Berücksichtigung der
Verdünnung der Pökellaken, die im Zuge ihrer Aufarbeitung für die Messungen stattfand
(Kap. 3.3.1.2.).
Für die Gehaltsberechnung ergab sich folgende Gleichung:
cP = ( (PA - n) / m) * VP / VR * z
cP = Konzentration des Analyten in der Pökellake in mg/L
PA = Peakfläche des Analyten in mV*min
n = Achsenabschnitt der Kalibriergeraden der zugehörigen Kalibriersubstanz
m = Steigung der Kalibriergeraden der zugehörigen Kalibriersubstanz
VP = tatsächliches Probenvolumen der Pökellakeproben in mL
VR = Bezugsvolumen der Pökellakeproben (50 mL)
z = Verdünnung der Pökellaken im Zuge der Probenaufarbeitung 1:2 (z = 2)
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3. Material und Methoden
46
3.4.1.3.2. Fleischextrakt
Auch die Fleischextrakte wurden nach ihrer Herstellung mittels HPLC-UV/VIS unter den in
Kap. 3.4.1.1. angegebenen Bedingungen vermessen.
Die Identifizierung der Substanzpeaks erfolgte mittels LC-ESI-MS und GC-MS nach ihrer
Fraktionierung und anschließenden Aufreinigung und Aufkonzentrierung mit Hilfe der
Festphasenextraktion (siehe Kap. 3.5.1.).
Die Gehalte an noch vorhandenem bzw. nicht bereits oxidiertem Phenol wurden anhand der
für die Fleischextrakte erstellten Kalibrierfunktion für die einzelnen Phenole bestimmt,
während die Gehaltsbestimmung der Oxidationsprodukte unter Einbeziehung der
Kalibrierfunktion für 5-Nitroguajakol für Fleischextrakte erfolgte. Im Falle des
Syringoldimers 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol erfolgte die
Gehaltsbestimmung in Syringoläquivalenten (siehe Kap. 3.4.1.2.).
Die Bestimmung der Gehalte erfolgte hierbei über die Peakfläche der integrierten zugehörigen
Substanzpeaks der HPLC-UV/VIS-Chromatogramme unter Berücksichtigung der
Aufkonzentrierung der Fleischextrakte, die im Zuge ihrer Aufarbeitung stattfand (Kap.
3.3.2.3.2.).
Für die Gehaltsberechnung der Analyte in den Fleischproben ergab sich folgende Gleichung:
cF = ( (PA - n) / m) * MP / MR * ER / EP * z
cF = Konzentration des Analyten in der Fleischprobe in mg/kg
PA = Peakfläche des Analyten in mV*min
n = Achsenabschnitt der Kalibriergeraden der zugehörigen Kalibriersubstanz
m = Steigung der Kalibriergeraden der zugehörigen Kalibriersubstanz
MP = tatsächliche Probenmasse der Fleischproben in g
MR = Bezugsmasse der Fleischproben (50 g)
ER = Bezugsmasse der für die Extraktion verwendeten Fleischprobe (erhitzte Probe: ER = 3 g; Probe mit
simulierter Verdauung: ER = 5 g)
EP = tatsächliche Masse der für die Extraktion verwendeten Fleischprobe
z = Faktor für die Verdünnung bzw. Aufkonzentrierung der Fleischproben im Zuge der Probenaufbereitung
(erhitzte Proben: z = 1/3; Probe mit simulierter Verdauung: z = 1/2,7)
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3. Material und Methoden
47
3.4.1.4. Nachweis- und Bestimmungsgrenzen
Die Nachweisgrenze gibt an, ab welcher Konzentration des Analyten in der Probe unter den
verwendeten Messbedingungen eine Aussage über dessen Vorhandensein in der Probe
getroffen werden kann, wohingegen die Bestimmungsgrenze diejenige Analytkonzentration
ist, die mindestens in der Probe vorliegen muss, damit eine Aussage über den Analytengehalt
getroffen werden kann. Unterhalb dieser Konzentration ist keine sichere quantitative
Bestimmung des Analyten möglich (GOTTWALD 2000).
Sowohl die Nachweis- als auch die Bestimmungsgrenze wurde über die Messung des
Basislinienrauschens der HPLC-UV/VIS-Chromatogramme von vier unabhängig voneinander
hergestellten Leerproben ermittelt, die jeweils doppelt vermessen wurden. Die Leerproben der
Pökellaken bzw. Fleischproben wurden unter Zusatz von 100 mg/L bzw. 100 mg/kg
Ascorbinsäure und 1,66 % Nitritpökelsalz ohne Zugabe von Phenolen hergestellt, auf 80 °C
für 40 min bzw. 45 min erhitzt und anschließend wie in Kapitel 3.3. beschrieben
aufgearbeitet.
Anhand der Signale ebenfalls eingespritzter niedrig konzentrierter Standardlösungen von
Guajakol, Syringol, 4-Methylsyringol, 4-Methylguajakol und 5-Nitroguajakol wurden
anschließend über die Signal/Rauschverhältnisse die Nachweisgrenzen (3-faches Rauschen)
und Bestimmungsgrenzen (6-faches Rauschen) bestimmt (Tabelle 6)
Pökellake Fleischproben
Methoxphenole NG (mg/L) BG (mg/L) NG (mg/kg) BG (mg/kg)
Syringol 3,06a 6,12a 0,64a 1,28a
4-Methylsyringol 1,40a 2,80a 0,25a 0,50a
Guajakol 0,58a 1,16a 0,07a 0,14a
4-Methylguajakol 0,38a 0,76a 0,08a 0,16a
5-Nitroguajakol 0,56a 1,12a 0,08b 0,16b
Tabelle 6 Nachweisgrenzen (NG) und Bestimmungsgrenzen (BG) der Methoxyphenole in den
Pökellaken und in den Fleischproben nach dem Erhitzen auf 80 °C; HPLC-Bedingungen siehe Kap.
3.4.1.1.; a NG und BG bestimmt bei 272 nm; b NG und BG bestimmt bei 330 nm
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3. Material und Methoden
48
3.4.1.5. Wiederfindungsraten
Die Bestimmung der Wiederfindungsraten in Abhängigkeit von der Probenmatrix für die vier
Methoxyphenole und die Oxidationsprodukte von Guajakol und Syringol erfolgte durch
Zugabe bekannter Mengen dieser Analyte zur Fleischmatrix und ihrer anschließenden
Extraktion (siehe Kapitel 3.3.2.1.3.). Nach der Messung der Fleischextrakte mittels HPLC-
UV/VIS wurden die Konzentrationen der extrahierten Analyte ermittelt und die
Wiederfindungsraten (WFR) unter Verwendung folgender Gleichung bestimmt:
WFR = [Konzentration der extrahierten Analyte in der Fleischprobe in mg/kg]*100/[erwartete
Konzentration der zugesetzten Analyte in der Fleischprobe in mg/kg]
3.5. Qualitative Analyse der Methoxyphenole und ihrer Oxidationsprodukte
3.5.1. Probenaufbereitung
Für die Identifizierung der mittels HPLC-UV/VIS aufgetrennten Methoxyphenole sowie ihrer
Oxidationsprodukte erfolgte zunächst ihre Fraktionierung und Aufreinigung aus den
Pökellaken bzw. Fleischextrakten. Diese wurden hierfür in das HPLC-UV/VIS-System
(Bedingungen siehe Kap. 3.4.1.1.) eingespritzt und die aufgetrennten Substanzen wurden,
nachdem sie den UV/VIS-Detektor passiert hatten, in gekühlten Erlenmeyerkolben
aufgefangen.
Zur Aufkonzentrierung der Analyten und ihrer Reinigung von im Eluenten befindlichem
TEAOH und Essigsäure erfolgte die Festphasenextraktion. Das aufgefangene Volumen wurde
zunächst im Verhältnis 1:3 mit destilliertem Wasser verdünnt, um den Anteil von Acetonitril
(30 % im Eluenten) auf 10 % des Gesamtvolumens zu verringern, damit die Analyten bei der
Probenaufgabe auf den Kartuschen verbleiben und nicht durch einen zu hohen Anteil an
organischem Lösemittel verfrüht eluiert würden.
Die Festphasenextraktion erfolgte nach dem in Kapitel 3.3.2.3.2. beschriebenen Verfahren.
Nach ihrer Elution von der SPE-Kartusche wurden die Analyten mit Stickstoff bei 37 °C auf
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3. Material und Methoden
49
300 µL aufkonzentriert und in Probengläschen überführt. Die Lagerung der Analytlösungen
erfolgte bei -30 °C im Dunkeln unter Argonatmosphäre.
3.5.2. HPLC-DAD
Die HPLC-Bedingungen, die zur Messung Probenlösungen und der fraktionierten Analyte
mittels HPLC-DAD verwendet wurden, waren identisch mit den in Kapitel 3.4.1.1.
beschriebenen. Die Detektion erfolgte mit einem Knauer WellChrom DAD K-2700 Detektor,
der mit einer Knauer WellChrom LAMP K-2701 verbunden war und durch eine Knauer
Interface box mit Hilfe von Eurochrom 2.05 Software kontrolliert wurde.
Der Eluent war Wasser/ Acetonitril (70:30, v/v).
3.5.3. HPLC-ECD
Für die Detektion der Probenlösungen sowie der fraktionierten Analyten mittels HPLC-ECD
wurde hinter den UV/VIS Detektor (siehe Kap. 3.4.1.1.) ein 641 VA-Detektor mit einem 650
Elektrochemischen Detektor angeschlossen. Die Proben wurden auf diese Weise, nachdem sie
den UV/VIS-Detektor passiert hatten, abermals mittels elektrochemischer Detektion erfasst.
Für die Bestimmung der Halbstufenpotentiale von Phenol, 4-Nitrosophenol, 4-Nitrophenol, 2-
Nitrophenol, 4-Methylguajakol, 4-Methylguajakol und von Syringol und Guajakol sowie
ihren Oxidationsprodukten aus den Pökellaken wurden Voltammogramme im Bereich von
300 mV bis 1250 mV in Intervallen von 50 mV erstellt. Die HPLC-Bedingungen entsprachen
denen für die Messung der Pökellaken unter HPLC-UV/VIS verwendeten. Die Konzentration
der Standardlösungen war 10 mg/L für Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-
Methylguajakol, 12,5 mg/L für Phenol, 25 mg/L für 4-Nitrosophenol und 100 mg/L für 2- und
4-Nitrophenol. Für die Messung der Oxidationsprodukte von Guajakol und Syringol aus den
Pökellaken wurden die Laken wie in Kapitel 3.3.1.1 beschrieben hergestellt und anschließend
mittels Festphasenextraktion (Kap. 3.3.2.3.2.) gereinigt, bevor sie ebenfalls elektrochemisch
vermessen wurden.
Die Berechnung der Halbstufenpotentiale aus den mit Hilfe der Voltammogramme erhaltenen
Graphen erfolgte unter Verwendung von GraphPad.Prism® 6.0 Software mittels nicht-linearer
Regression (Model: Y = Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope)) nach Bildung des
dekadischen Logarithmus von U.
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3. Material und Methoden
50
3.5.4. Spektrophotometrie
Die spektrophotometrische Analyse von Syringol und 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-
4,4′-diol erfolgte mittels eines Uvikon 930 Spektrophotometers bei einer Scan-
Geschwindigikeit von 200 nm/min, einem Scan-Interval von 1 nm und mit einer Küvette von
1 cm Schichtdicke. Für die spektrophotometrische Untersuchung wurde Syringol in
Chloroform gelöst und eine Lösung mit einer Konzentration von 50 mg/L hergestellt.
Für die Herstellung einer 50 mg/L 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol-Lösung aus
dem in den Pökellaken gebildeten Niederschlag wurden 10 mg des abfiltrierten und
getrockneten Niederschlages (Kap. 3.3.1.2.) in 100 mL Chloroform gelöst, noch vorhandene
dunkle Schwebstoffe wurden durch Zugabe von 80 mL destilliertem Wasser aus der
Chloroformphase in die wässrige Phase überführt, woraufhin beide Phasen klar und gelb
vorlagen. Die Chloroformphase wurde im Verhältnis 1:2 mit Chloroform verdünnt und
spektrophotometrisch untersucht.
Die Extinktion von fünf jeweils unabhängig voneinander hergestellten Analytlösungen wurde
bei einer Wellenlänge von 272 nm gemessen.
Die Berechnung der molaren Extinktionskoeffizienten von Syringol und 3,3′,5,5′-
Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol erfolgte mit Hilfe des Lambert-Beer`schen Gesetzes
(GOTTWALD u. HEINRICH 1998):
ε = E/c*d
ε = molarer Extinktionskoeffizient (L*cm/mol)
E = Extinktion
c = Konzentration des Analyten in mol/L
d = Schichtdicke der Küvette
Es ergab sich rechnerisch ein mittlerer molarer Extinktionskoeffizient von
ε = 1087 L*cm/mol für Syringol und ε = 8224 L*cm/mol für 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-
biphenyl-4,4′-diol (siehe Anhang unter 8.9.).
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3. Material und Methoden
51
3.5.5. GC-MS
Die fraktionierten Analytlösungen (Kap.3.5.1.) wurden mittels Gaschromatographie-
Massenspektrometrie untersucht. Hierfür wurde ein 3300/3400 Varian Gaschromatograph in
Verbindung mit einem Finnigan MAT SSQ 710 Massenspektrometer verwendet. Die
chromatographische Trennung erfolgte mit Hilfe einer J&W Scientific DB-5 Trennsäle mit
einer Länge von 60 m, einer Schichtdicke von 0,25 µm und einem Innendurchmesser von
0,25 mm. Als Trägergas wurde Helium genutzt.
Die Anfangstemperatur der Säule war 120 °C. Die Temperatur wurde innerhalb von 13 min
auf 250 °C und in den folgenden 6 min auf 300 °C erhöht und blieb dann für 20 min konstant
bei 300 °C.
Die Temperatur der Transferkapillare wurde gleichbleibend bei 300 °C gehalten, während der
Injektor von anfangs 120 °C innerhalb von 4 min auf 320 °C aufgeheizt wurde. Es wurden
6 µL Probe injiziert.
Die Auswertung der erhaltenen Signale erfolgte mittels ICIS EXECUTIVE Version 8.2.1
Software.
3.5.6. LC-ESI-MS
Die chromatographische Trennung und Detektion der Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-
Methylsyringol, 4-Methylguajakol, 5-Nitroguajakol und 2-Nitroso-5-methoxyphenol mittels
HPLC-ESI-MS erfolgte unter in den in Tabelle 7 und Abbildung 13 dargestellten
Bedingungen:
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3. Material und Methoden
52
Tabelle 7 HPLC-ESI-MS Bedingungen für die chromatographische Trennung und
massenspektrometrische Detektion von Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol, 4-Methylguajakol, 5-
Nitroguajakol und 2-Nitroso-5-methoxyphenol mittels HPLC-ESI-MS
Pumpe/Autosampler/Controller Waters 616 Gradientenpumpe und Waters
171 Plus Autosampler verbunden mit einer
Waters 600 Kontrolleinheit
Eluent Eluent A: Wasser/Acetonitril (90:10, v/v);
Eluent B: Wasser/Acetonitril (50:50, v/v)
beide Eluenten enthielten
Ammoniumhydrogencarbonat als Puffer in
einer Konzentration von n = 0,01 mol/L;
Gradientensystem (siehe Abb. 13)
Säule Nucleodur C 18 ISIS® (Länge: 150 mm;
Innendurchmesser: 3 mm; Partikelgröße:
3 µm)
Säulentemperatur 20 °C
Flussrate 0,3 mL/min
Injektionsvolumen 5 µL
Gas Stickstoff (Sheathgas-Strom 60 u, Hilfsstrom
10 u)
Detektor/Detektoreinstellungen Finnigan LCQ Classic Massenspektrometer
mit Elektrospray-Ionisation (ESI), negativer
Ionenmodus, Total-Ionen-Chromatogramm
Modus (TIC), Temperatur der Kapillare
250 °C
Massenbereich m/z 50 bis m/z 500
Software XCalibur 1.3 (Thermo Scientific)
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3. Material und Methoden
53
Abbildung 13 Schema des Gradientensystems für die Elution der Methoxyphenole Syringol,
Guajakol, 4-Methylsyringol, 4-Methylguajakol, 5-Nitroguajakol und 2-Nitroso-5-methoxyphenol
mittels HPLC-ESI-MS (Eluent A: Wasser/Acetonitril (90:10, v/v), Eluent B: Wasser/Acetonitril
(50:50, v/v), enthalten jeweils Ammoniumhydrogencarbonat (n = 0,01 mol/L))
Die Konzentration der Analyten in der zu messenden Lösung betrug jeweils 100 mg/L für
Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol und 50 mg/L für 5-Nitroguajakol
und 2-Nitroso-5-methoxyphenol.
Die massenspektrometrische Analyse der aus den Pökellaken bzw. Fleischproben isolierten
Oxidationsprodukte erfolgte unter nahezu identischen Bedingungen wie den in Tabelle 8
angeführten.
Für die chromatographische Trennung der in den Pökellaken bzw. Fleischextrakten
enthaltenen Substanzen wurde jedoch ein Eluent aus Wasser/Acetonitril/Essigsäure
(69,7:30:0.3, v/v/v) unter isokratischen Bedingungen verwendet.
Anschließend wurden die mittels HPLC-UV/VIS fraktionierten und mit Hilfe der
Festphasenextraktion aufgereinigten und aufkonzentrierten Analytlösungen (Kapitel 3.5.1.) in
das HPLC-ESI-MS-System appliziert und im TIC-Modus detektiert.
Zuletzt erfolgte die direkte Injektion der fraktionierten Analyte über die Probenkapillare in die
ESI-Quelle. Die auf diese Weise direkt eingespritzten Oxidationsprodukte wurden im MS
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60
An
teil
Elu
ent
in
%
Zeit in min
Eluent A
Eluent B
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3. Material und Methoden
54
bzw. MS/MS Modus analysiert, wobei die Fragmentierung mit einer Kollisionsenergie von
30 u durchgeführt wurde. Die erhaltenen Massenspektren wurden mit TunePlus 1.3 Software
ausgewertet.
3.6. Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der erhaltenen Daten wurde mit Hilfe des SAS Statistical
Analysis Program (SAS für Windows) Version 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)
durchgeführt. Für verbundene Stichproben erfolgte eine zweifaktorielle Varianzanalyse,
während unabhängige Proben der einfaktoriellen Varianzanalyse unter Verwendung des
Ryan-Einot-Gabriel-Welsch multiple range Tests unterzogen wurden. Der t-Test für
ungepaarte bzw. gepaarte Stichproben wurde durchgeführt, wenn lediglich zwei Gruppen auf
signifikante Unterschiede verglichen wurden. Für alle statistischen Untersuchungen galt ein
Signifikanzniveau von p ≤ 0,05. Die Berechnung der Mittelwerte und Standardabweichungen
erfolgte mit Excel 2010 Software (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA).
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4. Ergebnisse und Diskussion
55
4. Ergebnisse und Diskussion
4.1. Chromatographische Trennung und Identifizierung der Methoxyphenole
und ihrer Oxidationsprodukte mittels HPLC-UV/VIS und DAD, GC-MS
und LC-ESI-MS
Die qualitative Analyse der Reaktionsprodukte nach ihrer Isolation und Aufbereitung (Kap.
3.5.1.) wurde mit Hilfe von LC-ESI-MS und GC-MS unter Berücksichtigung ihrer
charakteristischen Fragmentierungsmuster durchgeführt. Für alle identifizierten Produkte
zeigten die LC-MS-Spektren der jeweils aus den Pökellaken und Fleischproben isolierten
Reaktionsprodukte identische Molekül- und Fragmentionen. Ebenso verhielt es sich mit den
GC-MS-Spektren. Lediglich im Falle des aus den Fleischproben extrahierten Nitrososyringols
und Nitrosyringols war die Bestimmung mittels GC-MS aufgrund der geringen Mengen der
isolierten Substanzen nicht möglich, aber auch für diese Verbindungen stimmten die
erhaltenen LC-MS Daten mit denen des aus den Pökellaken isolierten Nitrososyringols und
Nitrosyringols überein. Eine Übersicht der jeweils für die Identifizierung der Verbindungen
verwendeten Analyseverfahren befindet sich im Anhang unter 8.7..
Beispielhaft sind die LC-MS-Spektren von 6-Nitrosoguajakol und GC-MS-Spektren von 6-
Nitroguajakol aus der Pökellake und aus dem Fleischextrakt, sowie die LC-MS Spektren von
Nitrososyringol aus beiden Matrices im Anhang vergleichend dargestellt (Kap. 8.8.).
4.1.1. Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol
Die chromatographische Trennung der vier untersuchten Methoxyphenole wurde zunächst mit
Hilfe von HPLC-UV/VIS durchgeführt. Beispielchromatogramme für die Trennung unter
HPLC-Bedingungen, wie sie für die Analyse der Pökellaken bzw. der Fleischextrakte
verwendet wurden, befinden sich im Anhang unter Kapitel 8.5. und 8.6.. Die
chromatographische Trennung der vier Methoxyphenole sowie ihrer Oxidationsprodukte
mittels HPLC-UV/VIS erfolgte erstmalig im Rahmen dieser Studie, nachdem die bisherige
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4. Ergebnisse und Diskussion
56
Analyse dieser Substanzen vorrangig unter Verwendung von GC-MS durchgeführt worden
war (KNOWLES et al. 1975a, b; PÖHLMANN et al. 2012).
Die Analyse von alkyl- bzw. alkoxyl-substituierten Phenolen in umweltrelevanten Matrices
wurde intensiv von LÜDERS (1999) untersucht. Dem Autoren gelang die Detektion von
Syringol und Guajakol mittels ESI-MS im negativen Ionenmodus unter Verwendung einer
stark basischen mobilen Phase (pH 12, eingestellt mit Natronlauge). In der Studie wurden
jedoch weder Spektren noch Chromatogramme dieser beiden Verbindungen veröffentlicht.
Aufgrund der pKS-Werte der von uns untersuchten Methoxyphenole, die sich im basischen
Bereich zwischen 9,93 für Guajakol und 10,27 für 4-Methylguajakol befinden (Tab. 3)
(RAGNAR et al. 2000), liegen diese Verbindungen im sauren oder neutralen Milieu nicht
ausreichend ionisiert vor, sodass sie mittels ESI-MS nicht detektiert werden können. Daher
wurde in der vorliegenden Studie für die Trennung und Detektion der vier Methoxyphenole
Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol mittels HPLC-ESI-MS im
negativen Ionenmodus ein basischer Eluent verwendet. Optimal wäre hierbei ein pH-Wert des
Eluenten von 12 gewesen, da der pH-Wert des Eluenten beim Eintritt in die Ionenquelle 2 pH-
Einheiten oberhalb des pKS-Wertes des Analyten liegen sollte, um eine nahezu vollständige
Ionisation desselben zu erreichen (KROMIDAS 2006). Da die verwendete HPLC-Säule
jedoch nur bis zu einem pH-Wert von 10 einsetzbar war, wurde der pH-Wert des Eluenten
zwischen 8,3 und 9,1 eingestellt, wobei es während der Messungen innerhalb dieses
Bereiches aufgrund des Gradientenbetriebs zu pH-Schwankungen kam. Für die Einstellung
des pH-Wertes wurde Ammoniumhydrogencarbonat verwendet, da diese Verbindung sich
aufgrund ihrer Flüchtigkeit als optimaler Puffer im basischen Bereich anbietet (ESPADA u.
RIVERA-SAGREDO 2003).
Unter diesen Bedingungen war es erstmalig möglich, sowohl die vier Methoxyphenole
Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol als auch 5-Nitroguajakol und 2-
Nitroso-5-methoxyphenol chromatographisch zu trennen und mit Hilfe von ESI-MS zu
analysieren (siehe Abb. 14).
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4. Ergebnisse und Diskussion
57
Abbildung 14 HPLC-ESI-MS-Chromatogramm (TIC-Modus) von 2-Nitroso-5-methoxyphenol
(m/z 152) (I), Syringol (m/z 153) (II), Guajakol (m/z 123) (III), 5-Nitroguajakol (m/z 168) (IV), 4-
Methylsyringol (m/z 167) (V) und 4-Methylguajakol (m/z 137) (VI) im negativen Ionenmodus [M-H]-
Anschließend erfolgte die Fragmentierung der direkt in die ESI-Quelle eingespritzten Phenole
Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol, welche zuvor in alkalischem
Eluenten (pH 9,1) gelöst wurden.
Es bildeten sich die in Tabelle 8 aufgeführten Fragmente. Die ergänzende Analyse der
Phenole mittels GC-MS bestätigte die mit Hilfe von LC-ESI-MS erhaltenen Ergebnisse.
Die molekulare Masse aller vier Phenole stimmte mit den Werten für die Masse/Ladungs-
Verhältnisse (m/z) der Molekülionen, die sowohl durch LC-MS ([M-H]-) als auch GC-MS
([M]+) bestimmt wurden, überein. Die Fragmentierung unter LC-MS Bedingungen erfolgte
unter Verlust von 15 u und 28 u, welcher durch die Abspaltung eines Methylradikals von der
aromatischen Methoxygruppe, sowie von [CO] vom Sauerstoff der phenolischen
Hydroxygruppe und dem benachbarten Kohlenstoffatom verursacht wurde. Dieses
Fragmentierungsmuster erweist sich als charakteristisch für phenolische Verbindungen
(MCLAFFERTY u. TURECEK 1995) und war für alle der vier untersuchten Phenole
nachweisbar (Tab. 8). Während der Verlust von 15 u ebenfalls in der Fragmentierung mittels
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4. Ergebnisse und Diskussion
58
GC-MS nachweisbar war, zeigte sich bei der Auswertung der weiteren Fragmente (mit
Ausnahme von Syringol), dass unter GC-MS Bedingungen der gleichzeitige Verlust von
[CH3] und [CO] unter Bildung eines [M-43 u]-Fragmentes auftrat.
LC-MS GC-MS
Analyt Struktur Molare
Masse
(g/mol)
MS/MS Fragmentierung
m/z (relative Intensität
%)
Fragmentierung
m/z (relative Intensität %)
Syringol (IIa)
H3CO
OH
OCH3
154
153.0 [M-H]- (99.4),
137.9 (100.0),
125.0 (48.7), 109.1 (17.9)
154.0 [M]+ (71.1), 139.1 (28.1),
104.1 (38.5), 73.1 (100.0)
Guajakol (IIIa)
OH
OCH3
124
123.0 [M-H]-
(99.3),108.1 (100.0),
95.1 (55.5)
124.0 [M]+ (100.0), 109.0 (97.2),
81.0 (52.1), 63.1 (24.9)
4-Methylsyringol
(Va)
H3CO
OH
OCH3
CH3
168
166.9 [M-H]- (62.4),
151.9 (100.0),
139.0 (10.8), 134.6 (10.3)
168.0 [M]+ (100.0),153.0 (39.3),
125.1 (16.5), 104.1 (39.07),
73.1 (98.2)
4-Methylguajakol
(VIa)
OH
OCH3
CH3
138 137.0 [M-H]- (100.0),
122.1 (23.8), 109.1 (43.2)
138.0 [M]+ (100.0), 123.0 (72.1),
104.1 (29.1), 95.1 (20.2),
73.1 (66.9)
a Zahlen in Klammern beziehen sich auf Peak-Nummern im HPLC-ESI-MS Chromatogramm in Abbildung 13.
Tabelle 8 Molekülionen und Fragmente von Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-
Methylguajakol detektiert mit LC-ESI-MS und GC-MS
Die Analyse der Methoxyphenole des Räucherrauches wurde bei bisherigen Untersuchungen
stets mittels GC-MS durchgeführt, wobei zur Verbesserung des chromatographischen
Verhaltens (verkürzte Retentionszeiten, bessere Peaksymmetrie) meistens die vorherige
Derivatisierung in Form der Trimethylsylierung der Phenole erfolgte (KORNREICH u.
ISSENBERG 1972; KNOWLES et al. 1975a; PÖHLMANN et al. 2013a). Erste Versuche der
Bestimmung der Rauchphenole durch LC-MS Verfahren wurden ebenfalls nur an
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4. Ergebnisse und Diskussion
59
substituierten Verbindungen durchgeführt, wie z. B. Glycosilaten oder Fluorid-
Transferprodukten (HAYASAKA et al. 2010; YEE et al. 2013).
Die Trennung und Detektion der Rauchphenole mittels HPLC-ESI-MS, wie sie in der
vorliegenden Studie erfolgte, stellt somit eine Möglichkeit der direkten Analyse der
Rauchphenole ohne vorherige Derivatisierung dar. Allerdings sind weitere Versuche zur
Steigerung der Empfindlichkeit des Analyseverfahrens notwendig, da die analysierten
Phenole in dieser Studie in relativ hohen Konzentrationen von 100 mg/L (Syringol, Guajakol,
4-Methylsyringol, 4-Methylguajakol) bzw. 50 mg/L (5-Nitroguajakol, 2-Nitroso-5-
methoxyphenol) appliziert wurden.
Eine Möglichkeit der Empfindlichkeitssteigerung wäre hierbei sicherlich die Verwendung
höherer pH-Werte für die mobile Phase um eine stärkere Ionisation der Analyten zu erreichen,
wie es bereits von LÜDERS (1999) beschrieben worden ist.
Die Detektion der Oxidationsprodukte konnte jedoch auch -wie in den folgenden Kapiteln
beschrieben- unter Verwendung eines sauren Eluenten mittels LC-ESI-MS durchgeführt
werden (vgl Kap. 4.1.2. bis 4.1.4 und Anhang 8.7.).
4.1.2. Syringol und Oxidationsprodukte
Die chromatographische Trennung von Syringol und seinen Oxidationsprodukten aus den
Pökellaken wurde bei einer Wellenlänge von 272 nm durchgeführt, da in allen Laken hohe
Gehalte an Oxidationsprodukten vorlagen und die Probenmatrix zu keinen Interferenzen mit
den detektierten Verbindungen führte. Die hohen Konzentrationen an Oxidationsprodukten
erlaubten die Detektion bei einer Wellenlänge, die für diese Verbindungen nicht im
empfindlichsten Bereich lag, wie die in Abbildung 15 dargestellten UV-Spektren zeigen. Des
Weiteren war die Applikation eines geringeren Probenvolumens als bei den Fleischextrakten
möglich.
Die Fleischextrakte hingegen mussten jeweils bei zwei Wellenlängen (272 nm und 330 nm)
vermessen werden, wobei gleichzeitig die Applikation eines größeren Probenvolumens
erforderlich war. Zum einen war dies den geringen Mengen der gebildeten
Oxidationsprodukte in den Fleischproben geschuldet, die die Detektion bei an die UV-
Spektren angepasster Wellenlänge erforderte, zum anderen erwies sich die im Fleischextrakt
noch vorhandene Matrix bei der Vermessung bei 272 nm als störend. Die Bestimmung von
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4. Ergebnisse und Diskussion
60
Syringol und 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol erfolgte daher in Bezug auf ihre
UV-Spektren, welche ihr Maximum im Bereich von 270 nm bzw. 280 nm hatten (siehe Abb.
15), bei 272 nm. Die Detektion von Nitroso- bzw. Nitrosyringol wurde bei 330 nm
durchgeführt, da ihre UV-Spektren ein Maximum in diesem Bereich aufwiesen.
Abbildung 15 UV/VIS-Spektren von Syringol, 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-
diol, Nitrososyringol und Nitrosyringol
Unter diesen Bedingungen konnten mittels HPLC-UV/VIS drei Oxidationsprodukte des
Syringol aus der Pökellake aufgetrennt und detektiert werden (Abb. 16 A), von denen zwei
durch Analyse mit LC-ESI-MS und GC-MS als Nitrososyringol (I) und Nitrosyringol (III)
identifiziert wurden. Die Identität des dritten Reaktionsproduktes (uv) konnte nicht aufgeklärt
werden.
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4. Ergebnisse und Diskussion
61
Abbildung 16 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von Nitrososyringol (I), Syringol (II), Nitrosyringol
(III), 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (IV), einem nicht identifizierten
Oxidationsprodukt (uv), 4-Methylguajakol (als interner Standard, IS) und einem Matrixpeak (M) aus
der Pökellake (enthielt 200 mg/L Syringol (Ausgangskonzentration), 500 mg/L Ascorbinsäure und
150 mg/L NaNO2) nach Reaktion bei pH 3 bei 272 nm (A); Fleischextrakt (enthielt 100 mg/kg
Syringol (Ausgangskonzentration), 100 mg/kg Ascorbinsäure und 150 mg/kg NaNO2) nach simulierter
Verdauung bei 272 nm (B) und der gleiche Fleischextrakt gemessen bei 330 nm (C)
Zusätzlich wurde der in den Pökellaken gebildete Niederschlag isoliert und anschließend
massenspektrometrisch und mikroskopisch untersucht und konnte letztlich als kristallisiertes
3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol identifiziert werden.
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4. Ergebnisse und Diskussion
62
Im Fleischextrakt (Abb. 16 B und C) fanden sich neben nicht umgesetztem Syringol (II)
dessen Oxidationsprodukte Nitrososyringol (I), Nitrosyringol (III) und nicht kristallisiertes
3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (IV).
Die chromatographische Trennung von Syringol und seinen Oxidationsprodukten, deren
Bildung im Rahmen dieser Studie zum ersten Mal in der Fleischmatrix nachgewiesen werden
konnte, ist bisher nicht beschrieben.
Die Bildung eines Molekülions mit m/z 182 ([M-1]-) im LC-MS-Spektrum von
Nitrososyringol (Abb. 17 A) stimmte mit dessen berechneter molekularen Masse von
183 g/mol überein.
Das intensive Fragment mit m/z 167 konnte durch den Verlust von [CH3] von einer der beiden
Methoxygruppen in ortho-Position des Syringol begründet werden. Die weitere Bildung von
m/z 152 (Abb. 17 B) in Folge des Verlustes von 30 u durch die Abtrennung von [NO] vom
Molekülion war charakteristisch für die Massenspektren von Nitrosophenolen (SCHROLL et
al. 1967; KNOWLES et al. 1974a).
Das Molekülion mit m/z 183 ([M]+]) und die Eliminierung von [NO] ([M-30 u]) im
korrespondierenden GC-MS-Spektrum (Abb. 17 C) unterstützte hierbei die Ergebnisse der
LC-MS Analyse, wobei ein intensives Fragment bei [M-15 u] im GC-MS-Spektrum jedoch
nicht zu finden war.
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4. Ergebnisse und Diskussion
63
Abbildung 17 Massenspektren des Molekülions von Nitrososyringol (isoliert aus der Pökellake
(100 mg/L ASC sd)) mit m/z 182 (A) und seines Fragmentions mit m/z 167 (B) detektiert mit ESI-MS
im negativen Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des Molekülions von Nitrososyringol mit
m/z 183 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C)
Auch für Nitrosyringol (M = 199g/mol) zeigte sich ein charakteristisches
Fragmentierungsmuster (Abb. 18). Das Molekülion mit m/z 198 ([M-H]-) trat zusammen mit
einem Fragment bei m/z 168 auf (Abb. 18 A und B), welches für den Verlust von 30 u in
Folge der Fragmentierung von [NO] stand, welches ein typischer Fragmentierungsschritt für
para-substituierte Nitroaromaten ist (MCLAFFERTY u. TURECEK 1995; LAMBERT et al.
2012). Das prominente Fragment bei m/z 183 im LC-MS-Spektrum (Abb. 18 A) wies auf den
Verlust von [CH3] hin, der jedoch wie schon beim Nitrososyringol durch das GC-MS-
Spektrum (Abb. 18 C) nicht bestätigt wurde. Für die Bildung des Fragmentes bei m/z 153
(Abb. 18 B) war von der Abspaltung von [CH3NO] (45 u) vom Molekülion des Nitrosyringol
auszugehen, die typisch für Nitrophenole unter den vorliegenden Bedingungen zu sein
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4. Ergebnisse und Diskussion
64
scheint, da eine Standardlösung von 5-Nitroguajakol dasselbe Fragment bei [M-H-45 u] im
LC-MS-Spektrum aufwies.
Auch im GC-MS-Spektrum von Nitrosyringol war die Bildung eines Molekülions mit m/z 199
([M]+) nachweisbar (Abb. 18 C), sowie das Fragment bei m/z 169. Zusätzlich erfolgte die
Abspaltung von 46 u und die damit verbundene Bildung eines Fragmentes bei m/z 153,
welches den Verlust von [NO2] nahelegte (MCLAFFERTY u. TURECEK 1995).
Abbildung 18 Massenspektren des Molekülions von Nitrosyringol (isoliert aus der Pökellake
(100 mg/L ASC sd)) mit m/z 198 (A) und seines Fragmentions mit m/z 183 (B) detektiert mit ESI-MS
im negativen Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des Molekülions von Nitrosyringol mit m/z 199
detektiert mit GC-MS ([M]+) (C)
Die massenspektrometrische Analyse des in der Pökellake gebildeten Produktes „uv“ (siehe
Abb. 16 A) zeigte im LC-MS-Spektrum ein Molekülion mit m/z 168 [M-H]- und Fragmente
bei m/z 153, m/z 138 und m/z 125. Das GC-MS-Spektrum stimmte mit diesen Daten
dahingehend überein, dass das Molekülion und die Fragmente jeweils 2 u über den m/z-
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4. Ergebnisse und Diskussion
65
Verhältnissen der LC-MS Daten lagen, was zur Bildung eines Molekülions bei m/z 170 [M]+
und Fragmenten bei m/z 155und m/z 127 führte. Die erhaltenen Daten ließen keine nähere
Identifizierung der Verbindung zu. Es ist jedoch zu vermerken, dass sich bei der Reaktion von
4-Methylsyringol mit Nitrit in der Pökellake eine identisches Oxidationsprodukt (QL 2)
gebildet zu haben schien, welches sowohl in der Retentionszeit der HPLC-UV/VIS und
HPLC-ESI-MS, als auch von den massenspektrometrischen Daten mit dem Syringol-Produkt
„uv“ übereinstimmte (siehe Kap.4.1.4.).
Für die Identifikation des Syringoldimers 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol
(M = 306 g/mol) wurden die in Abbildung 19 dargestellten Massenspektren mit Daten aus der
Literatur verglichen.
Abbildung 19 Massenspektren des Molekülions von 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol
(isoliert aus der Fleischprobe (400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit m/z 305 (A) und
seines Fragmentions mit m/z 290 (B) detektiert mit ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-);
Massenspektrum des Molekülions von 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol mit m/z 306
detektiert mit GC-MS ([M]+) (C)
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4. Ergebnisse und Diskussion
66
Das Molekülion mit m/z 305 ([M-H]-) (Abb. 19 A) bildete Fragmente bei m/z 290, m/z 275,
m/z 261 und m/z 247 im mittels LC-MS generiertem Spektrum (Abb. 19 B). Dieses
Fragmentierungsmuster war identisch mit den LC-MS Spektren dieser Verbindung, welche
bereits mit ESI-MS im negativen Ionenmodus detektiert wurden und von ADELAKUN et al.
(2012) veröffentlicht worden sind.
Dem Verlust von einem [CH3]-Fragment aus einer der vier Methoxygruppen des Dimers
schloss sich hierbei die Abspaltung einer zweiten [CH3]-Einheit vom Molekülion an, wodurch
die Fragmente m/z 290 und m/z 275 gebildet wurden. Die weitere Fragmentierung und
Bildung von m/z 261 und m/z 247 erfolgte über die schrittweise Abspaltung von zwei [CH2]-
Fragmenten von den verbliebenen Methoxygruppen des m/z 275-Fragmentes.
Die Analyse mittels GC-MS resultierte in einem ähnlichen Fragmentierungsmuster (Abb.
19 C). Das Molekülion bei m/z 306 ([M]+) passte zu der molekularen Masse von 306 g/mol.
Die weiteren Fragmente stimmten mit den in der Literatur veröffentlichten Angaben überein
(GUILLEN u. IBARGOITIA 1998; WAN et al. 2008). Zusätzlich zu der Fragmentierung
unter LC-MS Bedingungen kam es zum gleichzeitigen Verlust von einem [CH3]- und zwei
[CH2]-Fragmenten also insgesamt 43 u, der zur Bildung von m/z 263 führte. Die Aufspaltung
des Dimers in die zwei Monomere begründete die Entstehung von m/z 153.
Zusätzlich zu den aus den Proben über präparative HPLC isolierten Substanzen, wurde der
braun-violette Niederschlag, der sich in den Pökellaken bei der Umsetzung von Syringol mit
Nitrit bildete, analysiert. Die mikroskopische Untersuchung ergab, dass der Niederschlag aus
dunkel-violetten nadelförmigen Kristallen bestand (Abb. 20).
Nachdem die Kristalle mit Chloroform gelöst worden waren, wurde die Substanz ebenfalls
mittels GC-MS analysiert. Die ermittelten GC-MS-Daten stimmten mit denen des Dimers
3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (Abb. 19 C) überein.
Die Bildung violetter Kristalle wurde im Zusammenhang mit der oxidativen Umsetzung von
Syringol im sauren wässrigen Milieu bereits von BETTS u. KING (1991) und KUNG (1968)
beschrieben (vgl. Kap. 2.2.4.). Die gebildete Substanz wurde jedoch mittels Massen-und
Infrarot-Spektrometrie als 3,3′,5,5′-Tetramethoxydiphenochinon identifiziert, welches von
dem 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol sowohl in seiner molekularen Masse
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4. Ergebnisse und Diskussion
67
(M = 304 g/mol) als auch durch das Masse/Ladungsverhältnis seines Molekülions (m/z 304)
unterschieden werden kann.
Es lässt sich somit daraus schließen, dass in den Pökellaken die weitere Oxidation des
Syringoldimers zu seinem Chinon nicht erfolgte, dass es aber trotzdem zur Ausbildung der
Kristalle kam, die vor der Vermessung der Proben mit HPLC-UV/VIS aus diesen entfernt
werden mussten, um ein Verstopfen der HPLC-Säule zu verhindern.
Abbildung 20 Mikroskopische Aufnahme der in der Pökellake gebildeten Kristalle aus 3,3′,5,5′-
Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (56-fache Vergrößerung)
4.1.3. Guajakol und Oxidationsprodukte
Wie bei der chromatographischen Trennung von Syringol und seinen Oxidationsprodukten,
erfolgte die Analyse von Guajakol und den dazugehörigen Reaktionsprodukten mittels HPLC-
UV/VIS aus den Pökellaken und den Fleischextrakten unter unterschiedlichen Bedingungen.
Auch in diesem Fall war dies durch die geringen Konzentrationen an Reaktionsprodukten und
durch die hohe Matrixbelastung in den Fleischextrakten begründet. Die Bestimmung der
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4. Ergebnisse und Diskussion
68
Guajakolgehalte aus den Fleischextrakten wurde bei 272 nm durchgeführt, während die
Oxidationsprodukte bei 330 nm detektiert wurden (Abb. 21)
Abbildung 21 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von 6-Nitrosoguajakol (a), Guajakol (b), 4-
Nitroguajakol (c), 6-Nitroguajakol (d), 4-Methylguajakol (als interner Standard, IS) und einem
Matrixpeak (M) aus der Pökellake (enthielt 200 mg/L Guajakol (Ausgangskonzentration), 500 mg/L
Ascorbinsäure und 150 mg/L NaNO2) nach Reaktion bei pH 3 bei 272 nm (A); Fleischextrakt (enthielt
60 mg/kg Guajakol (Ausgangskonzentration), 100 mg/kg Ascorbinsäure und 400 mg/kg NaNO2) nach
simulierter Verdauung bei 272 nm (B) und der gleiche Fleischextrakt gemessen bei 330 nm (C)
Auf diese Weise ließen sich von Guajakol (b) sowohl aus den Pökellaken als auch aus den
Fleischextrakten jeweils drei Oxidationsprodukte abtrennen, die unter Verwendung von LC-
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4. Ergebnisse und Diskussion
69
MS und GC-MS als 6-Nitrosoguajakol (a), 4-Nitroguajakol (c) und 6-Nitroguajakol (d)
identifiziert werden konnten.
Die Analyse dieser Verbindungen mittels HPLC-DAD ergab die in Abbildung 22
dargestellten UV-Spektren, die auch für diese Substanzen die Bestimmung bei einer
Wellenlänge von 330 nm begründeten, um störende Matrixeffekte der Fleischextrakte zu
umgehen und eine möglichst empfindliche Bestimmung zu ermöglichen.
Abbildung 22 UV/VIS-Spektren von Guajakol, 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-
Nitroguajakol
Auch in den Pökellaken, die Guajakol als zu untersuchenden Analyten enthielten, bildete sich
ähnlich wie bei den Versuchen mit Syringol während des Erhitzens der Laken bei 80 °C ein
brauner Niederschlag, der vor der Vermessung mittels HPLC-UV/VIS abfiltriert werden
musste. Dieser Niederschlag löste sich in Methanol und wurde in gelöster Form mit HPLC-
UV/VIS und LC-MS untersucht. Mit beiden Analyseverfahren konnte jedoch unter den
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4. Ergebnisse und Diskussion
70
verwendeten Bedingungen keine Detektion weiterer Substanzen und somit keine weitere
Charakterisierung des Niederschlages erfolgen. Des Weiteren erhöhten sich durch das Lösen
des Niederschlages die Gehalte der bereits identifizierten Oxidationsprodukte oder des
Guajakols nicht, sodass davon auszugehen ist, dass es sich bei dem Niederschlag nicht um
kristallisierte Anteile von Guajakol, 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol oder 6-Nitroguajakol
handelte.
Die Ergebnisse der Analyse der Oxidationsprodukte mittels LC-MS konnte durch weitere
Untersuchungen mit GC-MS abgesichert werden.
Zunächst erfolgte die Identifikation des präparativ aus den Pökellakeproben und
Fleischextrakten isolierten 6-Nitrosoguajakols (M = 153g/mol).
Zusätzlich zu dem Molekülion mit m/z 152 ([M-H]-) im LC-MS-Spektrum fand sich ein
intensives Fragmention bei m/z 137, welches für den Verlust von 15 u durch die Abspaltung
von [CH3] aus der Methoxygruppe in ortho-Position zur phenolischen Hydroxygruppe sprach
(Abb. 23 A).
Auch im GC-MS-Spektrum (Abb. 23 B) zeigte sich ein Molekülion bei m/z 153 ([M]+) und
ein Fragment bei m/z 138. Außerdem bildete sich ein Fragment bei m/z 123, welches durch
den Verlust von 30 u zustande kam, der wiederum auf die Abspaltung von [NO]
zurückzuführen war. Diese Fragmentierung ist charakteristisch für para- und ortho-
Nitrosoguajakol, wie sie durch KNOWLES et al. (1974a) beschrieben worden ist. Im
Gegensatz zu para-substituiertem 4-Nitrosoguajakol bildet ortho-substituiertes 6-
Nitrosoguajakol keine intensiven Fragmente bei m/z 139 und m/z 124 (KNOWLES et al.
1974a). Da beide Fragmente im GC-MS-Spektrum der untersuchten Substanz fehlten bzw.
nur in relativ geringer Intensität vorhanden waren, wurde davon ausgegangen, dass es sich bei
der vorliegenden Verbindung um 6-Nitrosoguajakol handelte.
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4. Ergebnisse und Diskussion
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Abbildung 23 Massenspektrum des Molekülions von 6-Nitrosoguajakol (isoliert aus der Fleischprobe
(400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit m/z 152 detektiert mit ESI-MS im negativen
Ionenmodus ([M-H]-) (A); Massenspektrum des Molekülions von 6-Nitrosoguajakol mit m/z 153
detektiert mit GC-MS ([M]+) (B)
Das aus den Proben isolierte Nitroguajakol wurde durch den Vergleich der dazugehörigen
Massenspektren mit den von KITANOVSKI et al. (2014) ermittelten
massenspektrometrischen Daten identifiziert. Der genannte Autor untersuchte die
Photonitrierung von Guajakol in wässrigem Medium und identifizierte die entstehenden
Oxidationsprodukte als 4-Nitroguajakol, 6-Nitroguajakol und 4,6-Dinitroguajakol mittels
HPLC-ESI-MS. Es zeigte sich, dass sich para- und ortho-substituiertes Nitroguajakol
hinsichtlich ihrer Fragmentierungsmuster unterscheiden und daher eine nähere
Charakterisierung der beiden Verbindungen mit m/z 168 ([M-H]-) möglich war (Abb. 24 A
und 25 A).
Sowohl 6- als auch 4-Nitroguajakol zeigten im LC-MS-Spektrum intensive Fragmente bei
m/z 153 und m/z 123 (Abb. 24 B und 25 B), welche durch den Verlust von 15 u bzw. 45 u
durch die Abspaltung von [CH3] bzw. den gleichzeitigen Verlust von [CH3] und [NO]
entstehen. Zusätzlich fanden sich im Spektrum von 6-Nitroguajakol Fragmentionen bei
m/z 125 und m/z 107, welche die Unterscheidung dieser Verbindung von ihrem Isomer 4-
Nitroguajakol ermöglichten. Gebildet wurden die beiden Fragmente durch den Verlust von
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4. Ergebnisse und Diskussion
72
[CO] (28 u) von dem Fragment bei m/z 153 und die Abspaltung von [NO2] und [CH3], d.h.
insgesamt 61 u, vom Molekülion (m/z 168 ([M-H]-)).
Abbildung 24 Massenspektren des Molekülions von 4-Nitroguajakol (isoliert aus der Fleischprobe
(400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit m/z 168 (A) und seines Fragmentions mit
m/z 153 (B) detektiert mit ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des
Molekülions von 4-Nitroguajakol mit m/z 169 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C)
Der Verlust von [NO] (30 u) vom Molekülion m/z 169, welcher typisch für die
Fragmentierung von Nitroaromaten ist (MCLAFFERTY u. TURECEK 1995), zeigte sich in
den GC-MS-Spektren beider Nitroguajakole (Abb. 24 C und 25 C). Die Bildung dieser
Fragmente, sowie die des Fragmentes bei m/z 123 in Folge der Abspaltung von [NO2] (46 u)
(MCLAFFERTY u. TURECEK 1995; LAMBERT et al. 2012) im GC-MS-Spektrum von 4-
Nitroguajakol ist bereits von DIMMEL et al. (1996) beschrieben worden. Die Fragmentierung
von [NO2] konnte durch Bildung eines Fragmentes bei m/z 138 (Abb. 25 B) im LC-MS-
Spektrum von 6-Nitroguajakol bestätigt werden.
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4. Ergebnisse und Diskussion
73
Abbildung 25 Massenspektren des Molekülions von 6-Nitroguajakol (isoliert aus der Fleischprobe
(400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit m/z 168 (A) und seines Fragmentions mit
m/z 153 (B) detektiert mit ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des
Molekülions von 6-Nitroguajakol mit m/z 169 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C)
Das GC-MS-Spektrum von 6-Nitroguajakol unterschied sich vom dem des 4-Nitroguajakol
durch die Entstehung der beiden Fragmente bei m/z 124 und m/z 152, außerdem fehlte ein
intensives Fragment bei m/z 123 (Abb. 25 C). Das erste der beiden zusätzlichen Fragmente
lässt sich unter Verweis auf das zugehörige LC-MS-Spektrum (Abb. 25 B) durch den Verlust
von [CH3] und [NO] erklären, während das zweite Fragment mit m/z 152 aus der Abspaltung
von 17 u im Zuge des Verlustes von [OH] resultierte.
Die UV-Spektren der Oxidationsprodukte 6-Nitroguajakol und 4-Nitroguajakol (Abb. 22)
entsprachen denen der bereits von KITANOVSKI et al. (2014) veröffentlichten, wobei 4-
Nitroguajakol von 6-Nitroguajakol (Maximum bei 295 nm) durch die Bildung eines
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4. Ergebnisse und Diskussion
74
Maximums bei der Wellenlänge 349 nm zu unterscheiden ist. Beide Verbindungen wiederum
grenzen sich bezüglich ihrer UV-Spektren deutlich von 6-Nitrosoguajakol ab, welches eine
Maximum von 317 nm und eine breite Schulter zwischen 360 nm und 400 nm aufweist.
4.1.4. 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol und ihre Oxidationsprodukte
Die Detektion der Oxidationsprodukte von 4-Methylguajakol und 4-Methylsyringol erfolgte
im Gegensatz zu der Analyse der Reaktionsprodukte von Syringol bzw. Guajakol
ausschließlich bei einer Wellenlänge von 272 nm, da die gesuchten Verbindungen bei 330 nm
nicht detektierbar waren, wie versuchsweise Messungen der Pökellaken und des
Fleischextraktes bei dieser Wellenlänge ergaben.
Wie aus den HPLC-UV/VIS-Chromatogrammen für die Pökellake und den Fleischextrakt
unter Zusatz von 4-Methylguajakol ersichtlich (Abb. 26 A und B), war in beiden Matrices
jeweils ein Oxidationsprodukt (PL 1 bzw. F 1) nachweisbar.
Abbildung 26 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von 4-Methylguajakol (4-MG), 4-Methylsyringol (als
interner Standard, IS), einem Matrixpeak (M) und zwei Oxidationsprodukten von 4-Methylguajakol
(PL 1, F 1) aus der Pökellake (enthielt 200 mg/L 4-Methylguajakol (Ausgangskonzentration),
100 mg/L Ascorbinsäure und 150 mg/L NaNO2) nach Reaktion bei pH 3 bei 272 nm (A);
Fleischextrakt (enthielt 60 mg/kg 4-Methylguajakol (Ausgangskonzentration), 100 mg/kg
Ascorbinsäure und 400 mg/kg NaNO2) nach simulierter Verdauung bei 272 nm (B)
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4. Ergebnisse und Diskussion
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Die unterschiedlichen Retentionszeiten (PL 1: RT = 32 min; F 1: RT = 22 min) dieser beiden
Produkte schienen hierbei größtenteils auf die unterschiedlichen HPLC-Bedingungen
zurückzuführen zu sein, welche für die Pökellaken bzw. Fleischextrakte für die Messung mit
HPLC-UV/VIS verwendet wurden (Kap. 3.4.1.1.), da die fraktionierten und aufgereinigten
Produkte, wenn sie jeweils unter einheitlichen Bedingungen in HPLC-ESI-MS appliziert
wurden, stets auch gleiche Retentionszeiten aufwiesen (Retentionszeit jeweils 25 min).
Die Bildung eines Molekülions bei m/z 182 ([M-H]-) war in den LC-MS Spektren beider
Produkte nachweisbar (Abb. 27 A und Abb. 28 A).
Abbildung 27 Massenspektren des Molekülions von PL 1 mit m/z 182 (A) und seines Fragmentions
mit m/z 167 (B) detektiert mit ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des
Molekülions von PL 1 mit m/z 183 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C)
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4. Ergebnisse und Diskussion
76
Für das Oxidationsprodukt PL 1 erfolgte weiterhin der Zerfall in die Fragmente m/z 167,
m/z 139 und m/z 137 (Abb. 27 B), welche durch den Verlust von 15 u, 43 u und 45 u
entstanden. Während das GC-MS-Spektrum des Produktes PL 1 die Bildung des Molekülions
bei m/z 183 [M]+ bestätigte, unterschieden sich die gebildeten Fragmente mit m/z 166,
m/z 153, m/z 135 und m/z 121 (Abb. 27 C) deutlich von den im LC-MS-Spektrum zu
findenden.
Für das Produkt F 1 stimmten im GC-MS-Spektrum weder das Molekülion (m/z 153), noch
dessen Fragmente (m/z 138, m/z 110) (Abb. 28 B) mit den GC-MS-Daten für PL 1 (Abb.
27 C) überein. Auch das für F 1 im LC-MS-Spektrum auftretende Molekülion mit m/z 182
([M-H]-) (Abb. 28 A) wurde durch das dazugehörige GC-MS-Spektrum nicht bestätigt (Abb.
28 B). Aus diesen Gründen war die Identifizierung der beiden gebildeten Produkte anhand der
Fragmentierungsmuster letztlich nicht möglich, auch wenn das unter LC-MS-Bedingungen
gebildete Molekülion von PL 1 und F 1 mit m/z 182 [M-H]-, welches zumindest für PL 1
durch GC-MS bestätigt werden konnte, die Bildung von 6-Nitro-4-Methylguajakol (molare
Masse M = 183 g/mol) vermuten lässt.
Abbildung 28 Massenspektren des Molekülions von F 1 mit m/z 182 detektiert mit ESI-MS im
negativen Ionenmodus ([M-H]-) (A); Massenspektrum des Molekülions von F 1 mit m/z 153 detektiert
mit GC-MS ([M]+) (B)
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4. Ergebnisse und Diskussion
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Auch die in der Pökellake und im Fleischextrakt gebildeten Oxidationsprodukte von 4-
Methylsyringol konnten anhand der GC-MS- und LC-MS-Daten nicht identifiziert werden.
Während in der Pökellake vier dieser Reaktionsprodukte nachgewiesen werden konnten
(QL 1, QL 2, QL 3, QL 4; Abb. 29 A), wurden aus dem Fleischextrakt lediglich zwei
Produkte isoliert (R 1 und R 2; Abb. 29 B). Das Produkt R 1 coeluierte mit Matrix aus dem
Fleischextrakt, wodurch der Substanzpeak fast vollständig von dem Matrixpeak überlagert
wurde.
Abbildung 29 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von 4-Methylsyringol (4-MS), 4-Methylguajakol (als
interner Standard, IS), Matrixpeak (M) und Oxidationsprodukten von 4-Methylsyringol (QL 1/ QL 2/
QL 3/QL 4, R 1/R 2) aus der Pökellake (enthielt 200 mg/L 4-Methylsyringol
(Ausgangskonzentration), 100 mg/L Ascorbinsäure und 150 mg/L NaNO2) nach Reaktion bei pH 3 bei
272 nm (A); Fleischextrakt (enthielt 100 mg/kg 4-Methylsyringol (Ausgangskonzentration),
100 mg/kg Ascorbinsäure und 400 mg/kg NaNO2) nach simulierter Verdauung bei 272 nm (B)
Die fraktionierten und aufgereinigten Produkte wurden sowohl der Analyse mittels LC-MS
als auch GC-MS unterzogen, wobei die in Tabelle 9 aufgeführten Molekülionen und
Fragmente detektiert werden konnten.
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4. Ergebnisse und Diskussion
78
Probematrix Oxidationsprodukt
(Vgl. Abb. 29)
Molekülionen ([M-
H]-) und Fragmente
mit LC-ESI-MS
(m/z)
Molekülionen
([M]+) und
Fragmente mit GC-
MS (m/z)
Pökellake
QL 1 (RT 3,5 min) 167.0 [M-H]-, 152.0,
139.1, 125.1 Nicht detektiert
QL 2 (RT 4,2 min) 168.0 [M-H]-, 153.0,
137.9, 125.0
170.1 [M]+, 155.0,
127.0, 112.1
QL 3 (RT 5,0 min)
180.9 [M-H]-, 165.9,
150.9
182.1 [M]+, 181.0,
167.0;
QL 4 (RT 10,3 min)
198.0 [M-H]-, 182.9,
183.0, 168.0, 152.9,
135.9
182.1 [M]+, 181.0,
167.0;
182.1 [M]+, 181.0,
169.1, 154.1, 138.1
Fleischextrakt
R 1 (RT 4,5 min) 181.1 [M-H]-, 165.9
121.3 [M-H]-
182.1 [M]+, 181.0,
167.0
R 2 (RT 5,3 min) 152.9 [M-H]-, 138.1,
123.2, 110.0
154.1 [M]+, 139.0,
111.1
Tabelle 9 Retentionszeiten (HPLC-UV/VIS) und Molekülionen/Fragmente (LC-ESI-MS und GC-MS)
der aus der Pökellake bzw. aus dem Fleischextrakt isolierten Oxidationsprodukte von 4-
Methylsyringol, die Bezeichnung der Oxidationsprodukte sowie ihre Retentionszeiten beziehen sich
auf die HPLC-UV/VIS-Chromatogramme in Abbildung 29
Zunächst war zu bemerken, dass mit Ausnahme der Produkte QL 2 und QL 4 die erhaltenen
LC-MS Daten durch die Analyse mit GC-MS dahingehend bestätigt werden konnten, dass die
gebildeten Molekülionen und Fragmente (unter Berücksichtigung von [M-H]- für LC-ESI-MS
im negativen Ionenmodus und [M]+ für GC-MS) nahezu identische m/z-Verhältnisse
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4. Ergebnisse und Diskussion
79
aufwiesen. Im Falle von QL 4 konnten sich die mit LC-MS ermittelten Daten für das
Molekülion durch die Analyse mittels GC-MS nicht bestätigen lassen.
Das LC-MS-Spektrum des Produktes QL 2 zeigte jeweils um 2 u erniedrigte m/z-Verhältnisse
für das Molekülion bzw. die Fragmentionen als das GC-MS-Spektrum (Tabelle 9). Dieselben
massenspektrometrischen Daten konnten bereits für ein Oxidationsprodukt von Syringol in
der Pökellake („uv“; siehe Kap. 4.1.2.) ermittelt werden. Des Weiteren wiesen beide
Verbindungen („uv“ und QL 2) dasselbe chromatographische Verhalten (Vgl. Abb. 16 A und
29 A) und nahezu identische UV-Spektren auf, die sich lediglich durch die Ausbildung einer
Schulter bei 320 nm bis 360 nm im UV-Spektrum von QL 2 unterschieden (siehe Abb. 30)
Abbildung 30 UV/VIS-Spektren des Oxidationsproduktes „uv“ von Syringol aus der Pökellake und
des Oxidationsproduktes QL 2 von 4-Methylsyringol aus der Pökellake
Es kann somit davon ausgegangen werden, dass es sich bei den beiden Reaktionsprodukten
„uv“ und QL 2 um ähnliche Verbindungen handelt, deren Identität jedoch nicht geklärt
werden konnte.
Auch die weiteren Oxidationsprodukte des 4-Methylsyringols QL 1, QL 3, QL 4, R 1 und R 2
konnten auf Grundlage der in Tabelle 9 aufgeführten Molekülionen und Fragmente und
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
200 250 300 350 400 450 500
Inte
nsi
tät
(mV
)
Wellenlänge (nm)
Syringol
Oxidationsprodukt
"uv"
QL 2
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4. Ergebnisse und Diskussion
80
aufgrund des Mangels an Literaturdaten über die Oxidationsprodukte von 4-Methylsyringol,
die zur vergleichenden Auswertung herangezogen werden könnten, nicht näher identifiziert
werden. Weitere Untersuchungen sind daher erforderlich, die sich mit der Strukturaufklärung
dieser Verbindungen (z. B. mit Hilfe von NMR-Verfahren) befassen, um näheren Aufschluss
über die Natur der in der Pökellake und im Fleischextrakt aus 4-Methylguajakol und 4-
Methylsyringol gebildeten Oxidationsprodukte zu erhalten.
4.2. Oxidation von Syringol und Guajakol im wässrigen Reaktionsmodell und in
der Fleischmatrix
4.2.1. Methodenentwicklung und Wiederfindungsraten
In früheren Untersuchungen, die sich mit der Isolation von Methoxyphenolen und ihren
Derivaten aus geräucherten Fleisch- bzw. Fischprodukten befassten, wurden stets
Extraktionsmethoden verwendet, die entweder ein Erhitzen der Probenmatrix im Zuge der
Wasserdampfdestillation (BALTES u. SÖCHTIG 1979; PÖHLMANN et al. 2012) oder das
Einstellen stark basischer bzw. alkalischer pH-Werte erforderten. Die Erhöhung bzw.
Erniedrigung des pH-Wertes während der Extraktion diente hierbei zunächst dem
Proteinaufschluss der Fleischmatrix und war anschließend Voraussetzung für die
Fraktionierung der Phenole auf Grundlage unterschiedlicher Aziditäten. Für die
durchzuführende Diethyletherextraktion wurde der pH-Wert des Fleischextraktes mit
Natronlauge bis auf 12 angehoben, d.h. ein stark basisches Milieu geschaffen, bevor er mit
konzentrierter Salzsäure auf 2 abgesenkt wurde (LUSTRE u. ISSENBERG 1970; KNOWLES
et al. 1975b). Auch die erst später entwickelte Extraktionsmethode von Nitrosophenolen aus
Fleischprodukten mittels Ethylacetat erforderte die Einstellung eines pH-Wertes von 2 mit
Schwefelsäure (HOFMANN 1990).
Die Oxidation der Methoxyphenole in der Fleischmatrix wurde bereits in verschiedenen
Studien untersucht. Hierfür erfolgte die Analyse der geräucherten und gepökelten
Fleischproben zunächst direkt nach ihrer Herstellung, nach ihrem Erhitzen (z. B. durch
Braten) und nach ihrer simulierten Verdauung mit der oben beschriebenen Methode der
Fraktionierung basierend auf unterschiedlichen Aziditäten und Diethyletherextraktion
(KNOWLES et al. 1974b, 1975b). Im Zuge der Extraktion wurden somit alle Proben starken
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4. Ergebnisse und Diskussion
81
pH-Veränderungen unterzogen, was zum einen eine verstärkte Oxidation der zu
extrahierenden Methoxyphenole mit in der Probe vorliegendem Nitrit oder aber die
Weiterreaktion der während des eigentlichen Versuches (z. B. Braten, simulierte Verdauung)
gebildeten Oxidationsprodukte bewirkt haben könnte.
Da mit den genannten Extraktionsmethoden bisher keine nitrosierten Methoxyphenole in der
Fleischmatrix nachgewiesen werden konnten (bzw. ihr Nachweis durch KNOWLES et al.
(1974b) letztlich durch spätere umfangreichere Untersuchungen nicht abgesichert werden
konnte (KNOWLES et al. 1975b)), war es nötig für eigene Untersuchungen eine neue
Methodik zu entwickeln.
Die in dieser Studie entwickelte Methodik, die auf der Extraktion der Analyten mittels
Methanol beruht, ermöglichte die schonende Isolierung der Methoxyphenole sowie ihrer
Oxidationsprodukte ohne die Einstellung stark basischer oder saurer pH-Werte, um das
Weiterreagieren der gebildeten Produkte bzw. einen verstärkten Abbau der Phenole während
der Extraktion zu verhindern.
Die Wiederfindungsraten der vier Methoxyphenole sowie der aus der Pökellake isolierten
Oxidationsprodukte von Syringol und Guajakol sind in Tabelle 10 dargestellt. Die Analyten
wurden der rohen Fleischmatrix ohne Zugabe von Nitrit oder Ascorbinsäure zugesetzt. Die
Fleischproben wurden anschließend erhitzt (80 °C) bzw. die simulierte Verdauung wurde
durchgeführt und die Analyten mittels Methanolextraktion isoliert. Die Wiederfindungsraten
der vier Methoxyphenole lagen für die erhitzten Proben zwischen 41,3 % und 54,3 % und
stiegen für die Proben, die zusätzlich der simulierten Verdauung unterzogen wurden, auf 54,2
% bis 58,4 % an. Auch bei den Oxidationsprodukten lagen die Wiederfindungsraten für die
Proben mit simulierter Verdauung (mit Ausnahme von 6-Nitrosoguajakol und 6-
Nitroguajakol) deutlich über denen der auf 80 °C erhitzten Proben. Die bessere
Extrahierbarkeit aus den „verdauten“ Proben lässt sich durch einen besseren Proteinaufschluss
durch das Ansäuern mit Salzsäure und die Zugabe der Pepsinlösung erklären, welcher eine
verminderte Bindung der Analyte durch die Fleischproteine bewirkt haben könnte. Dass eine
starke Bindung von Proteinen wie Lysin durch die im Räucherrauch enthaltenen Phenole
auftritt, wurde bereits durch CHEN u. ISSENBERG (1972) bewiesen.
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4. Ergebnisse und Diskussion
82
Analyt
Erwartete
Konzentration
des Analytena
nach Zusatz zu
der
Fleischmatrix
[mg/kg]
Nachgewiesene
Menge des
Analytena nach
Zusatz zu der
Fleischprobe,
Erhitzten auf
80 °C und
Extraktion aus
der
Fleischmatrix
[mg/kg]
WFRb des
Analytena nach
Zusatz zu der
Fleischprobe,
Erhitzten auf
80 °C und
Extraktion aus
der
Fleischmatrix
[%]
Nachgewiesene
Menge des
Analytena nach
Zusatz zu der
Fleischprobe,
Erhitzten auf
80 °C,
simulierter
Verdauung und
Extraktion aus
der
Fleischmatrix
[mg/kg]
WFRb des
Analytena nach
Zusatz zu der
Fleischprobe,
Erhitzten auf
80 °C,
simulierter
Verdauung und
Extraktion aus
der
Fleischmatrix
[%]
Syringol 100,00 45,94±2,98c 46,0 54,16±5,69d 54,2
Guajakol 60,00 24,76±1,91c 41,3 32,52±2,69d 54,2
4-Methylsyringol 100,00 54,29±5,04c 54,3 58,41±3,32d 58,4
4-Methylguajakol 60,00 26,82±0,68c 44,7 32,91±2,37d 54,6
Nitrososyringol 12,77 0,31±0,06c 2,4 0,40±0,06c 3,2
3,3′,5,5′-
Tetramethoxy-
1,1′-biphenyl-
4,4′-diol
5,96 1,07±0,25c 17,9 2,30±1,48c 38,6
Nitrosyringol 4,20 1,91±0,27c 45,5 2,28±0,23c 54,3
6-
Nitrosoguajakol 11,03 < NWGc,e 0,0 < NWGc,e 0,0
4-Nitroguajakol 1,36 0,77±0,07c 56,6 0,80±0,07c 58,6
6-Nitroguajakol 0,46 0,20±0,02c 43,6 0,17±0,01c 35,9
aStandardlösungen der Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-Methylguajakol oder 4-Methylsyringol, oder
Lösungen des jeweiligen Oxidationsproduktes nach dessen Extraktion und Aufreinigung aus der Pökellake
mittels Festphasenextraktion (SPE); b Wiederfindungsrate (WFR) = [Nachgewiesene Menge des Analytena nach
Zusatz zu der Fleischprobe und Extraktion aus der Fleischmatrix [mg/kg]] x 100 / [Erwartete Konzentration des
Analytena nach Zusatz zu der Fleischmatrix [mg/kg]]. c,d Stichprobenanzahl ( c n = 6, d n = 5). e < NWG : Wert
liegt unterhalb der Nachweisgrenze (siehe Tab. 6 in Kap. 3.4.1.4.))
Tabelle 10 Wiederfindungsraten (WFR) der Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol
und 4-Methylguajakol sowie der Oxidationsprodukte von Syringol und Guajakol aus der Fleischmatrix
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4. Ergebnisse und Diskussion
83
Autoren früherer Studien, die sich mit der Extraktion von Rauchphenolen und ihren
Oxidationsprodukten aus der Fleischmatrix beschäftigten, berichteten ebenfalls von niedrigen
Wiederfindungsraten, die eine quantitative Bestimmung selbiger verhinderten und machten
hauptsächlich die Proteinbindung der Phenole sowie eine gewisse Selektivität der
verwendeten Methodik hierfür verantwortlich (GILBERT u. KNOWLES 1975; KNOWLES
et al. 1975a, b).
Wie aus den in Tabelle 10 dargestellten Daten ersichtlich wird, waren vor allem die
nitrosierten Reaktionsprodukte 6-Nitrosoguajakol und Nitrososyringol nicht bzw. in sehr
geringem Umfang extrahierbar (Wiederfindungsraten von 0,0 % und 2,4 %/ 3,2 %), nachdem
sie der Fleischmatrix zugesetzt und diese wie bereits beschrieben behandelt worden war. Eine
mögliche Erklärung hierfür wäre die bereits angeführte Bindung dieser Produkte an die
Fleischmatrix. Außerdem lässt sich eine Weiterreaktion der zugesetzten Verbindungen
während der Versuchsdurchführung (Erhitzen auf 80 °C und simulierte Verdauung) nicht
ausschließen, auch wenn kein Zusatz von Nitrit oder Ascorbinsäure zu den Proben erfolgte.
Da die Bildung der Oxidationsprodukte jedoch in den in Kapitel 4.2.3. und 4.2.5.
ausgewerteten Versuchen nachgewiesen werden konnte, ist davon auszugehen, dass diese
Produkte unter den dort aufgeführten Bedingungen in extrahierbarer Form vorlagen.
Ergänzend zu den Experimenten, deren Ergebnisse in Tabelle 10 dargestellt sind, erfolgten
weitere Untersuchungen, die die Abhängigkeit der Extrahierbarkeit von 6-Nitrosoguajakol
und Nitrososyringol von der Dauer des Erhitzens der Fleischprobe sowie den hierfür
verwendeten Temperaturen zeigen sollten. Die rohen Fleischproben wurden nach dem Zusatz
jeweils eines der beiden Analyten zunächst für 30 min auf 80 °C oder für 45 min oder 30 min
auf 60 °C erhitzt und anschließend die Extraktion der Substanzen durchgeführt. Auch für
diese Versuche lagen die Wiederfindungsraten der beiden Nitrosophenole zwischen 0,0 %
und 2,2 % und unterschieden sich somit nicht von den in Tabelle 10 dargestellten
Ergebnissen, was zu dem Schluss führt, dass die Extrahierbarkeit nicht wesentlich durch die
Erhitzungsdauer bzw. –temperatur beeinflusst wurde.
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4. Ergebnisse und Diskussion
84
4.2.2. Die Oxidation von Syringol in Pökellaken in Abhängigkeit vom pH-
Wert und der Ascorbinsäurekonzentration
4.2.2.1. Ergebnisse
Um den Abbau des Dimethoxyphenols Syringol und die Bildung möglicher
Oxidationsprodukte im wässrigen Milieu zu untersuchen wurden verschiedene Pökellaken
hergestellt, denen neben Syringol (200 mg/L) und 1,66 % Nitritpökelsalz (enthielt 0,9 %
NaNO2) auch jeweils 100 mg/L oder 500 mg/L Ascorbinsäure zugesetzt wurden. Der NaNO2-
Gehalt lag somit konstant bei 150 mg/L und entsprach der nach der
Zusatzstoffzulassungsverordnung geforderten Höchstmenge für den Einsatz in
Fleischerzeugnissen. Das Antioxidationsmittel Ascorbinsäure wurde in zwei
unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt, um seinen möglichen Einfluss auf die in der
Pökellake ablaufende Oxidation des Syringols durch Nitrit zu untersuchen.
Zunächst wurden die Pökellaken auf 80 °C für 40 min erhitzt, um die Oxidation nach
Hitzeeinwirkung, wie sie im Zuge der Lebensmittelverarbeitung z. B. beim Braten oder
Heißräuchern erfolgt, nachzustellen, anschließend wurden die Laken auf einen pH von 3
eingestellt und für 1 h bei 40 °C erhitzt, um Bedingungen zu simulieren wie sie im sauren
Milieu des Magens vorliegen. Beide Versuchsabläufe dienten der Simulation von
Reaktionsbedingungen wie sie später auch in ähnlicher Weise für die Versuche in der
Fleischmatrix hergestellt wurden und sollten die Oxidation des Syringols im wässrigen Milieu
darstellen ohne mögliche hemmende Einflüsse durch die Probenmatrix Fleisch.
Die Quantifizierung der entstandenen Reaktionsprodukte Nitrososyringol, Nitrosyringol und
„uv“ erfolgte mit Hilfe von 5-Nitroguajakoläquivalenten. In allen Pökellaken bildete sich
zusätzlich zu diesen Reaktionsprodukten ein dunkel-violetter Niederschlag, der zunächst für
die Durchführung der Probenmessung mittels HPLC-UV/VIS abfiltriert werden musste und
letztendlich als kristallisiertes 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol identifiziert
werden konnte. Da die Kristalle im wässrigen Medium nicht löslich waren, konnte mit der
verwendeten Methode keine quantitative Bestimmung dieser Verbindung erfolgen. Da sich
jedoch in allen Pökellaken eine relativ große Menge des Niederschlages bildete, wurde seine
Entstehung unter verschiedenen Reaktionsbedingungen untersucht.
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4. Ergebnisse und Diskussion
85
Die Ergebnisse der durchgeführten Untersuchungen sind in Tabelle 11 zusammenfassend
dargestellt.
Zeitpunkt der visuellen
Kontrolle nach
Probenherstellung
Pökellake A Pökellake B Pökellake C
80 °Ca 7 °Cb 24 °Cc 80 °Ca 7 °Cb 24 °Cc 80 °Ca 7 °Cb 24 °Cc
1 h +++ - - - - - - - -
3 h +++ - - - - - - - -
5 h +++ - + - - - - - -
24 h +++ + ++ ++ - - - - -
Pökellake A: enthält 50 mg/L Syringol, 1,66 % Nitritpökelsalz (150 mg/L NaNO2) und 100 mg/L Ascorbinsäure;
Pökellake B: enthält 50 mg/L Syringol und 1,66 % Nitritpökelsalz (150 mg/L NaNO2); Pökellake C: enthält
50 mg/L Syringol und 100 mg/L Ascorbinsäure; a Pökellake auf 80 °C erhitzt für 40 min, anschließend im
Dunkeln gelagert; bPökellake nicht erhitzt und sofort nach Herstellung bei 7 °C in Dunkeln gelagert; c Pökellake
nicht erhitzt und sofort nach Herstellung bei 24 °C in Dunkeln gelagert. +++ = starker Niederschlag,
++ = mittlerer Niederschlag, + = schwacher Niederschlag, - = kein Niederschlag
Tabelle 11 Bildung eines Niederschlages aus 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol-Kristallen
in Pökellaken unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen
Aus der Darstellung in Tabelle 11 wird deutlich, dass sich das kristallisierte Syringoldimer
3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol fast ausschließlich in den Pökellaken bildete,
die neben Syringol auch NaNO2 und Ascorbinsäure enthielten, wobei das Erhitzen der Lake
eindeutig einen fördernden Einfluss auf die Niederschlagsbildung hatte. Der Zusatz der
Ascorbinsäure in diesen Proben könnte sich durch die zwangsläufig damit verbundene
Erniedrigung des pH-Wertes ebenfalls begünstigend auf die Oxidation des Phenols durch das
Nitrit ausgewirkt haben. Beim ausschließlichen Einsatz von Syringol und Ascorbinsäure
(Pökellake C) war keine Kristallbildung nachweisbar. Enthielt die Lake nur Syringol und
NaNO2 war die Bildung des Niederschlages selbst nach dem Erhitzen erst nach 24 h
nachweisbar.
Nachdem auf diese Weise die Bedingungen für die Entstehung des Dimers untersucht worden
waren, wurden die einleitend beschriebenen Pökellakeversuche durchgeführt, deren
Ergebnisse in Abbildung 31 graphisch dargestellt sind.
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4. Ergebnisse und Diskussion
86
Abbildung 31 Gehalte an Syringol, Nitrososyringol, Nitrosyringol und der nicht identifizierten
Verbindung “uv” in auf 80 °C erhitzten Pökellaken und Pökellaken, deren pH anschließend mit
Salzsäure auf 3 eingestellt und die für 1 h auf 40 °C erwärmt wurden (sd). Die Pökellaken enthielten
200 mg/L Syringol (Ausgangskonzentration), 150 mg/L NaNO2 und 100 mg/L oder 500 mg/L
Ascorbinsäure (ASC). (Mittelwerte ± SD, n = 6). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen
signifikant unterschiedliche Gehalte derselben Substanz in den verschiedenen Pökellaken (P < 0,05).
(Die Gehalte der nicht identifizierten Substanz “uv” wurden nicht auf signifikante Unterschiede
überprüft.) (vgl. auch Messwerttabellen im Anhang unter 8.10)
Es zeigte sich, dass in den Pökellaken, die 100 mg/L Ascorbinsäure enthielten, nach dem
Erhitzen auf 80 °C nur noch 84 mg/L Syringol nachweisbar waren, was bedeutet, dass 58 %
des in einer Ausgangskonzentration von 200 mg/L vorliegenden Syringols abgebaut worden
waren. Wurde der pH anschließend mit Salzsäure auf 3 erniedrigt und die Proben für 1 h auf
40 °C erwärmt, wurde das Syringol vollständig umgesetzt.
Im Gegensatz dazu wurden in den Laken, die 500 mg/L Ascorbinsäure enthielten durch das
Erhitzen bei 80 °C 86 % des Syringols abgebaut, während nach dem Einstellen des pH-
Wertes auf 3 immerhin noch 9 mg/L (4,5 %) des Syringols nachgewiesen werden konnten.
Die Pökellaken mit den zwei unterschiedlichen Ascorbinsäurekonzentrationen unterschieden
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4. Ergebnisse und Diskussion
87
sich auch hinsichtlich ihres pH-Wertes. Die Laken mit 100 mg/L Ascorbinsäure wiesen einen
initialen pH-Wert von 4,7 auf, wohingegen ein Gehalt von 500 mg/L Ascorbinsäure den pH
auf 4,3 absenkte.
Bezüglich der Bildung von Nitroso- und Nitrosyringol in den Pökellaken mit 100 mg/L
Ascorbinsäure zeigten sich zwischen den Proben, die auf 80 °C erhitzt wurden und denen,
welche anschließend bei pH 3 für 1 h auf 40 °C erwärmt wurden, keine signifikanten
Unterschiede.
4.2.2.2. Diskussion
GERLING u. TERNES (2014) berichteten bereits über den pH-abhängigen Abbau von α-
Tocopherol und α-Tocotrienol in Pökellaken, die neben Nitritpökelsalz auch unterschiedliche
Mengen an Ascorbinsäure enthielten. Bezugnehmend auf die Untersuchungen dieser Autoren
ist es naheliegend, dass der vermehrte Verlust von Syringol in den Laken mit 500 mg/L
Ascorbinsäure größtenteils dem (zwangsläufig) erniedrigten pH-Wert aufgrund der höheren
Ascorbinsäurekonzentration zuzuschreiben war. Gleichzeitig bedingte der erhöhte pH-Wert
der Laken mit 100 mg/L Ascorbinsäure einen geringeren Verbrauch an Syringol. Wie
Untersuchungen von W. R. LICHT et al. (1988) zeigten, förderte die Erhöhung der
Reaktionstemperatur bei pH 3 im wässrigen Milieu die Bildung nitrosierender Stickoxid-
Verbindungen wie z. B. N2O3 aus Nitrit und führt gleichzeitig zu einem erhöhten Verbrauch
von Ascorbinsäure. Ascorbinsäure hemmt wiederum die Nitrosierung anderer Verbindungen
wie z. B. Amine.
Folglich ist der vollständige Verlust an Syringol in den Pökellaken mit 100 mg/L
Ascorbinsäure bei pH 3 nach dem Erwärmen auf 40 °C auf einen verminderten protektiven
Effekt der Ascorbinsäure durch deren eigenen verstärkten Abbau zu erklären.
Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass Syringol in den Proben mit 100 mg/L
Ascorbinsäure nach der simulierten Verdauung vollständig abgebaut wurde, war es
bemerkenswert, dass es unter diesen Bedingungen verglichen mit den Proben, die nur auf
80 °C erhitzt wurden, nicht zur vermehrten Bildung der beiden Oxidationsprodukte
Nitrososyringol und Nitrosyringol kam. Da auch von der nicht identifizierten Verbindung
„uv“ im Vergleich zu den anderen Proben keine größeren Mengen gebildet wurden, liegt
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4. Ergebnisse und Diskussion
88
daher der Schluss nahe, dass das Syringol vermehrt zu seinem Dimer 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-
1,1′-biphenyl-4,4′-diol oxidiert worden war, welches in großen Mengen kristallisierte, jedoch
aufgrund dieses Auskristallisierens nicht quantitativ erfasst werden konnte.
Autoren früherer Studien, die sich mit der Nitrosierung von Methoxyphenolen in
Raucharomapräparaten befassten, machten die schnelle Oxidation der Nitrosophenole zu den
korrespondierenden Nitrophenolen für das Misslingen des Nachweises dieser Nitrosophenole
verantwortlich (KNOWLES et al. 1975b). Neuere Untersuchungen von JEWELL et al. (2014)
zeigten jedoch, dass die Bildung nitrierten ortho-Phenylphenols im wässrigen Milieu bei pH
3,5 nicht durch Oxidation des nitrosierten ortho-Phenylphenols erfolgte, sondern dass sich
ersteres gleichzeitig aber unabhängig von letzterer Verbindung bildete. Auch VIONE et al.
(2004) bewiesen, dass unter ähnlichen Reaktionsbedingungen Nitrophenol nicht durch weitere
Oxidation von gleichzeitig gebildetem Nitrosophenol entsteht. Die Ergebnisse der in
Abbildung 31 dargestellten Versuche stimmen mit den Ergebnissen dieser Autoren überein.
Enthielten die Pökellaken 500 mg/L Ascorbinsäure, führte die pH-Absenkung auf pH 3 und
das Erwärmen bei 40 °C zwar zu einer vermehrten Bildung von Nitrososyringol, die
Konzentration von Nitrosyringol zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied zu dessen
Konzentration im Vergleich zu den Proben, welche lediglich auf 80 °C erhitzt worden waren.
Folglich bedingte der erhöhte Gehalt an Nitrososyringol nicht den gleichzeitigen Anstieg der
Nitrosyringolkonzentration, wie es der Fall gewesen wäre, wenn letztere Verbindung durch
Oxidation des ersten gebildet werden würde.
Auch die Auswertung der in Abbildung 32 dargestellten Halbstufenpotentiale von
Nitrososyringol und Nitrosyringol bestätigen die Annahme, dass die beiden
Oxidationsprodukte unabhängig voneinander gebildet wurden, denn mit einem
Halbstufenpotential von 767 mV ist Nitrosyringol leichter oxidierbar als Nitrososyringol mit
einem Halbstufenpotential von 938 mV. Es scheint daher unwahrscheinlich, dass die
Weiteroxidation von Nitrososyringol zu Nitrosyringol bevorzugt abläuft, wie von KNOWLES
et al. (1975b) ursprünglich vermutet worden ist.
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4. Ergebnisse und Diskussion
89
Abbildung 32 Voltammogramme von Syringol, Nitrosyringol und Nitrososyringol (Intervall: 50 mV,
n = 1); Halbstufenpotentiale von Syringol (577 mV), Nitrososyringol (938 mV) und Nitrosyringol
(767 mV) berechnet mit nicht-linearer Regression nach Bildung des dekadischen Logarithmus von U
(GraphPad.Prism® 6.0 Software)
4.2.3. Die Oxidation von Syringol in der Fleischmatrix nach Erhitzen und
simulierter Verdauung in Abhängigkeit vom Nitrit- und
Sauerstoffgehalt
4.2.3.1. Ergebnisse
Die Oxidation von Syringol in der Fleischmatrix wurde mit Hilfe von Fleischproben
untersucht, die jeweils 100 mg/kg Ascorbinsäure als Antioxidationsmittel sowie 100 mg/kg
Syringol enthielten. Zunächst wurde der Einfluss verschiedener Nitritkonzentrationen auf den
Abbau des Phenols und die Entstehung von Oxidationsprodukten ermittelt. Hierfür wurde
zum einen die durch die Zusatzstoffzulassungsverordnung vorgegebene Höchstmenge an
NaNO2 (150 mg/kg im Fleischerzeugnis) verwendet, zum anderen wurde die Hälfte dieser
Konzentration (75 mg/kg) und eine Konzentration von 400 mg/kg NaNO2 appliziert, um
vergleichend den Effekt dieser erniedrigten bzw. stark erhöhten Nitritkonzentration zu
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4. Ergebnisse und Diskussion
90
erforschen. Zusätzlich zu dem Erhitzen der Fleischproben bei 80 °C erfolgte deren
anschließende simulierte Verdauung unter Bedingungen ähnlich denen des Magenmilieus.
Der Einsatz von Salzsäure bewirkte hierbei den Abfall des pH-Wertes in der Fleischmatrix
von 6,2 auf 3,6.
Neben den schon in der Pökellake (Kap. 4.2.2.) vorliegenden Oxidationsprodukten
Nitrososyringol und Nitrosyringol konnte aus den Fleischproben ebenfalls das Syringoldimer
3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol isoliert werden. Nach der Methanolextraktion
lag das Dimer in gelöster Form vor, d.h. es konnte mittels HPLC-UV/VIS die Detektion
sowie seine quantitative Bestimmung erfolgen. Letztendlich kann jedoch nicht ausgeschlossen
werden, dass Anteile dieser Verbindung auch in der Fleischmatrix auskristallisierten und in
dieser –in Wasser und Methanol unlöslichen- Form nicht extrahiert werden konnten.
Im Gegensatz zu Nitrosyringol und Nitrososyringol welche mit Hilfe von 5-
Nitroguajakoläquivalenten quantifiziert wurden, erfolgte die Quantifizierung des Dimers
wegen vergleichbaren UV-Spektren (Abb. 15) und der strukturellen Ähnlichkeit der beiden
Substanzen mittels Syringoläquivalenten. Aufgrund der Tatsache, dass der im Rahmen dieser
Studie mittels Spektrophotometrie bestimmte molare Extinktionskoeffizienten von 3,3′,5,5′-
Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (ε = 8223,99 L*cm/mol bei einer Wellenlänge von
272 nm) um das 7,6-fache größer war als der von Syringol (ε = 1087,31 L*cm/mol bei einer
Wellenlänge von 272 nm) (siehe Anhang 8.9.), resultierte die anhand von
Syringoläquivalenten vorgenommene Gehaltsbestimmung des Dimers in den Fleischproben in
höheren errechneten Gehaltswerten als den tatsächlich vorliegenden, was im Hinblick auf die
in Abbildung 33 A und 33 B dargestellten Ergebnisse berücksichtigt werden muss.
In den Fleischproben mit unterschiedlichen NaNO2-Konzentrationen, die zunächst auf 80 °C
erhitzt wurden (Abb. 33 A I-III), war als einziges Oxidationsprodukt 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-
1,1′-biphenyl-4,4′-diol nachweisbar, wobei dessen Gehalte in diesen Proben sich nicht
signifikant voneinander unterschieden.
Signifikant mehr Syringol wurde aus den Proben isoliert, die 75 mg/kg NaNO2 enthielten,
nämlich 67 % des in einer Ausgangskonzentration von 100 mg/kg zugesetzten
Dimethoxyphenols, während in den Proben mit 150 mg/kg bzw. 400 mg/kg NaNO2 lediglich
57 % bzw 52 % des eingesetzten Syringols nachweisbar waren.
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4. Ergebnisse und Diskussion
91
Abbildung 33 Gehalte an Syringol, 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol, Nitrososyringol
und Nitrosyringol in erhitzten (80 °C) Fleischproben, denen jeweils 100 mg/kg Syringol, 100 mg/kg
Ascorbinsäure und unterschiedliche Konzentrationen an NaNO2 bzw. Sauerstoff zugesetzt wurden (A)
und in den gleichen Proben nach deren simulierter Verdauung (B und C). Die Proben enthielten
weiterhin: 75 mg/kg NaNO2 (I/Ia), 150 mg/kg NaNO2 (II/IIa), 400 mg/kg NaNO2 (III/IIIa),
150 mg/kg NaNO2 und Eiklar (IV/IVa), 150 mg/kg NaNO2 und Eischnee (Luft) (V/Va), 150 mg/kg
NaNO2 und Eischnee (O2) (VI/VIa). Unterschiedliche Buchstaben oberhalb einer Substanz innerhalb
einer Versuchsgruppe (verschiedene NaNO2-Gehalte (I(a)-III(a)); verschiedene Eiklar- bzw.
Eischneezusätze (IV(a)-VI(a))) kennzeichnen signifikant unterschiedliche Gehalte derselben Substanz
innerhalb dieser Gruppe (P < 0,05). (Mittelwerte ± SD, I-VI und IVa-VIa (n = 6), Ia-IIIa (n = 4)). *
Werte liegen zwischen Nachweis- und Bestimmungsgrenze (siehe Tab. 6 in Kap. 3.4.1.4.). (vgl. auch
Messwerttabellen im Anhang unter 8.11.)
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4. Ergebnisse und Diskussion
92
Nachdem die Fleischproben der simulierten Verdauung unterzogen worden waren, konnten
neben dem Syringoldimer 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol ebenfalls
Nitrososyringol und Nitrosyringol extrahiert werden (Abb. 33 B und C, Ia-IIIa).
Die Konzentrationen aller drei Reaktionsprodukte waren hierbei am höchsten in den
Fleischproben mit 400 mg/kg NaNO2, was mit dem gleichzeitigen Abfall des nachgewiesenen
Syringolgehaltes auf 14 % der Ausgangskonzentration verbunden war.
Die Menge an gebildetem 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol verringerte sich
durch den Einsatz von 150 mg/kg NaNO2 um das 4-fache von 662,3 mg/kg
(Syringoläquivalente) auf 167,2 mg/kg (Abb. 33 B Ia-IIIa) und auch die Gehalte der beiden
anderen Reaktionsprodukte Nitrososyringol und Nitrosyringol lagen bei Verwendung der
niedrigeren Nitritkonzentration in signifikant geringeren Gehalten vor (Abb. 33 C Ia-IIIa).
Der Einsatz von 75 mg/kg NaNO2 führte nur im Falle von 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-
biphenyl-4,4′-diol zu einem weiteren Absinken des Gehaltes auf 60,3 mg/kg
(Syringoläquivalente), während die Konzentrationen von Nitrososyringol und Nitrosyringol
im Vergleich zu den Proben mit 150 mg/kg NaNO2 nicht signifikant abnahmen.
Des Weiteren wurde unter den Bedingungen der simulierten Verdauung bei allen drei
Nitritkonzentrationen signifikant mehr 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol gebildet
als in den Fleischproben, die lediglich auf 80 °C erhitzt worden waren, obwohl nur für die
Proben mit 400 mg/kg NaNO2 eine deutliche Verminderung der Syringolkonzentration im
Vergleich der erhitzten mit den „verdauten“ Proben nachgewiesen werden konnte.
Wurden die Fleischproben mit 150 mg/kg NaNO2 nach dem Erhitzen auf 80 °C und vor ihrer
simulierten Verdauung für 7 Tage bei 7 °C im Dunkeln gelagert, zeigten sich bezüglich der
Konzentrationen an Syringol und der drei Oxidationsprodukte keine signifikanten
Unterschiede zu den nicht gelagerten Proben.
Zusammenfassend lässt sich daher feststellen, dass die Verwendung von 400 mg/kg NaNO2
nach der simulierten Verdauung der Fleischproben in einem verstärktem Abbau des Syringols
unter vermehrter Bildung der drei Oxidationsprodukte 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-
4,4′-diol, Nitrososyringol und Nitrosyringol resultierte, dass sich unter gleichen Bedingungen
jedoch auch in den Proben mit geringeren Nitritkonzentrationen alle drei Produkte
nachweisen ließen.
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4. Ergebnisse und Diskussion
93
Für die Untersuchung des Effektes unterschiedlicher Sauerstoffkonzentration in der
Fleischprobe auf die Oxidation von Syringol, wurden verschiedene Fleischschäume
hergestellt. Für die Zubereitung dieser Fleischschäume wurde Eischnee verwendet, der
entweder mit Luft oder Sauerstoff aufgeschlagen und anschließend unter die Fleischmasse
gehoben wurde. Die auf diese Weise zubereiteten Fleischproben sollten als Versuchsmodelle
für die v. a. in der traditionellen französischen Küche hergestellten Fleischmousses und –
parfaits dienen, deren Zubereitung unter Zusatz von aufgeschlagenem Eiklar bzw.
aufgeschlagener Sahne erfolgt.
Die durchgeführten Untersuchungen schlossen wie bei den vorherigen Proben mit
unterschiedlichen Nitritkonzentrationen das Erhitzen der Fleischproben auf 80 °C sowie die
anschließende simulierte Verdauung ein. Nitrit wurde den Proben gleichbleibend in einer
Konzentration von 150 mg/kg zugesetzt. Für den direkten Vergleich wurden außerdem
Proben hergestellt, die anstelle des Eischnees unaufgeschäumtes Eiklar enthielten.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Abbildung 33 A, B, C, IV(a)-VI(a) dargestellt.
Auch in diesen Fleischproben ließ sich nach dem Erhitzen auf 80 °C das Syringoldimer
3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol als einziges Oxidationsprodukt nachweisen
(Abb. 33 A IV-VI), wobei sich für die Proben mit unterschiedlichem Sauerstoffgehalten keine
signifikanten Unterschiede in der Konzentration dieser Substanz zeigten.
In den Fleischschäumen aber auch in den Fleischproben, die lediglich unaufgeschäumtes
Eiklar enthielten, kam es während der simulierten Verdauung zur Bildung der
Oxidationsprodukte 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol, Nitrososyringol und
Nitrosyringol (Abb. 33 B und C, IVa-VIa). Obwohl für die drei mit Eiklar hergestellten
Fleischproben hierbei kein verstärkter Abbau von Syringol nachgewiesen werden konnte, ließ
sich in den Fleischproben, die das aufgeschäumte Eiklar enthielten, eine vermehrte Bildung
aller drei Reaktionsprodukte feststellen. Unterschiede zwischen den Proben, die den mit
Sauerstoff oder den mit Luft aufgeschlagenen Eischnee enthielten, gab es jedoch keine.
Auch in den mit Eiklar zubereiteten Fleischproben wurde unter der simulierten Verdauung
mehr 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol gebildet als in den lediglich auf 80 °C
erhitzten Proben.
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4. Ergebnisse und Diskussion
94
Es lässt sich somit zusammenfassend feststellen, dass in Fleischschäumen die Entstehung von
Oxidationsprodukten des Syringol unter Bedingungen, wie sie bei der Verdauung im
Magenmilieu vorliegen, vermehrt stattfand. Es zeigte sich hierbei jedoch kein signifikanter
Unterschied zwischen den mit Sauerstoff oder lediglich mit Luft aufgeschäumten
Fleischproben.
4.2.3.2. Diskussion
In früheren Studien, die sich mit der Nitrosierung der Methoxyphenole des Räucherrauches in
gepökelten Fleischproben nach deren Erhitzen sowie der simulierten Verdauung befassten,
konnten weder die Bildung nitrosierter noch nitrierter Produkte des Syringols nachgewiesen
werden (KNOWLES et al. 1974b, 1975b). Die Autoren vermuteten, dass die nitrosative
Demethylierung oder Weiteroxidation der entstandenen Produkte während der
Verdauungsexperimente für das Fehlen nitrosierter Reaktionsprodukte verantwortlich wären.
Auch HOFMANN (1990) ging davon aus, dass die Weiteroxidation der entstandenen
Nitrosophenole während der Extraktion oder das Vorliegen von nicht extrahierbaren
Chinonen einen Nachweis der Nitrosophenole verhinderten.
Da es jedoch in der vorliegenden Studie gelang, sowohl Nitrososyringol als auch
Nitrosyringol aus der Fleischmatrix zu isolieren, können die oben angeführten Annahmen
nicht bestätigt werden. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass in den durchgeführten
Experimenten lediglich die Oxidation jeweils eines Rauchphenols untersucht worden ist,
während die Untersuchungen der genannten Autoren stets die Oxidation eines heterogenen
Phenolgemisches beinhalteten, das dem Fleisch in Form von Räucherrauch zugesetzt wurde.
Außerdem erfolgte die Isolation der Oxidationsprodukte in dieser Studie unter Verwendung
milderer Extraktionsbedingungen, die die Extraktion ohne Einstellung stark basischer oder
saurer pH-Werte ermöglichten.
Der förderliche Effekt von Sauerstoff auf die Oxidation von Syringol unter gleichzeitiger
Einwirkung von Nitrit und Ascorbinsäure kann bezugnehmend auf die
Untersuchungsergebnisse von ARCHER et al. (1975) und W. R. LICHT et al. (1988) erklärt
werden. Die Autoren untersuchten den Einfluss verschiedener pH-Werte und
Sauerstoffgehalte auf die Nitrosierung von Aminen durch Nitrit. Unter anaeroben
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4. Ergebnisse und Diskussion
95
Bedingungen verhinderte Ascorbinsäure die Bildung von Nitrosaminen nahezu vollständig,
indem sie nitrosierende Stickoxide wie N2O3 zu NO reduzierte. Erfolgte jedoch der Zusatz
von Sauerstoff zu dem Reaktionssystem, wurde die Ascorbinsäure innerhalb kurzer Zeit
vollständig oxidiert und verlor auf diese Weise ihre antinitrosierende Wirkung. Zusätzlich
wurde durch den Sauerstoff NO zu den nitrosierenden Stickoxiden regeneriert. Ein saures
Reaktionsmilieu unterstützte zusätzlich die Bildung reaktiver Stickoxide und förderte auf
diese Weise die Nitrosaminbildung.
Unter dem Arbeitstitel „Die Wechselwirkung zwischen Sauerstoff, Ascorbinsäure und
Carnosolsäure in mousseartigen feinen Fleischwaren“ (Autoren: M. Althaus-Fahjen, W.
Ternes) wurden Untersuchungen zu den Wechselwirkungen zwischen Sauerstoff und
Ascorbinsäure in auf gleiche Art hergestellten Fleischschäumen durchgeführt. Es zeigte sich,
dass die Ascorbinsäurekonzentration in den Fleischschäumen, die mit Sauerstoff
aufgeschlagenes Eiklar enthielten, im Vergleich zu den Fleischproben, die mit Stickstoff oder
Luft aufgeschäumtes Eiklar enthielten, um mehr als 50 % abnahm.
Folglich kann die vermehrte Bildung der drei Oxidationsprodukte des Syringol durch das
Aufschäumen der Fleischproben mit Eischnee zum einen durch die verminderte antioxidative
Wirkung der Ascorbinsäure, sowie die durch die vermehrte Bildung nitrosierender Stickoxide
aus dem zugesetzten Nitrit begründet werden.
4.2.4. Die Oxidation von Guajakol in Pökellaken in Abhängigkeit vom pH-
Wert und der Ascorbinsäurekonzentration
4.2.4.1. Ergebnisse
Die Oxidation von Guajakol in Pökellaken wurde unter denselben Bedingungen wie die
Oxidation des Syringol untersucht (vgl. Kap. 4.2.2.). Die Quantifizierung der
Reaktionsprodukte erfolgte mit Hilfe von 5-Nitroguajakoläquivalenten.
Die Ergebnisse der durchgeführten Experimente sind in Abbildung 34 graphisch dargestellt.
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4. Ergebnisse und Diskussion
96
Abbildung 34 Gehalte an Guajakol, 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol in auf
80 °C erhitzten Pökellaken und Pökellaken, deren pH anschließend mit Salzsäure auf 3 eingestellt und
die für 1 h auf 40 °C erwärmt wurden (sd). Die Pökellaken enthielten 200 mg/L Guajakol
(Ausgangskonzentration), 150 mg/L NaNO2 und 100 mg/L oder 500 mg/L Ascorbinsäure (ASC).
(Mittelwerte ± SD, n = 6). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen signifikant unterschiedliche
Gehalte derselben Substanz in den verschiedenen Pökellaken (P < 0,05). (vgl. auch Messwerttabellen
im Anhang unter 8.10)
Unabhängig von den Ascorbinsäuregehalten der auf 80 °C erhitzten Pökellaken wurden 30 %
des Guajakols abgebaut, sodass von einer Ausgangskonzentration von 200 mg/L Guajakol nur
noch 141 mg/L bei 100 mg/L Ascorbinsäure in der Pökellake bzw. 142 mg/L bei 500 mg/L
Ascorbinsäure nachweisbar waren. Die Umsetzung des Methoxyphenols erfolgte in den
Laken, die 100 mg/L Ascorbinsäure enthielten, überwiegend unter Bildung von 6-
Nitrosoguajakol, wobei sich bei pH 3 nach dem Erwärmen für 1 h bei 40 °C die Menge dieser
Verbindung in den Laken von 51,8 mg/L auf 112,8 mg/L mehr als verdoppelte. Auch die
Konzentration der anderen beiden Oxidationsprodukte 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol
nahm verglichen zu den lediglich auf 80 °C erhitzten Proben von 3,3 mg/L auf 5,6 mg/L bzw.
von 2,4 mg/L auf 15,7 mg/L signifikant zu.
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4. Ergebnisse und Diskussion
97
Wurden 500 mg/L Ascorbinsäure in den Pökellaken eingesetzt, stiegen die Gehalte aller drei
Oxidationsprodukte ebenfalls signifikant an, wenn die Proben auf pH 3 eingestellt und
anschließend für 1 h auf 40 °C erwärmt wurden. Allerdings verringerte sich die Konzentration
an Guajakol in diesen Proben lediglich auf 83,9 mg/L anstatt auf 27,6 mg/L wie es in den
Proben mit 100 mg/L Ascorbinsäure der Fall war. Während die Menge an gebildetem 6-
Nitrosoguajakol bei einem Zusatz von 100 mg/L Ascorbinsäure unter vergleichbaren
Bedingungen stets größer war als in den Proben mit 500 mg/L Ascorbinsäure, zeigte sich für
6-Nitroguajakol der entgegengesetzte Effekt. Die Konzentration an 4-Nitroguajakol nahm nur
für die auf pH 3 eingestellten Proben mit 500 mg/L Ascorbinsäure im Vergleich zu den
Proben mit 100 mg/L Ascorbinsäure signifikant zu. Für die Proben, die lediglich auf 80 °C
erhitzt wurden, gab es keine Unterschiede zwischen den Proben mit den beiden
unterschiedlichen Gehalten an Ascorbinsäure hinsichtlich des gebildeten 4-Nitroguajakols.
Hohe Gehalte an Ascorbinsäure (500 mg/L) in der Pökellake verhinderten somit die Bildung
von 6-Nitrosoguajakol im Vergleich zu den Laken, die eine geringere Konzentration an
Ascorbinsäure (100 mg/L) enthielten. Gleichzeitig förderte die höhere
Ascobinsäurekonzentration die Bildung von 6-Nitroguajakol und unter Bedingungen ähnlich
denen des Magenmilieus auch die Entstehung von 4-Nitroguajakol.
4.2.4.2. Diskussion
Der hemmende Effekt hoher Ascorbinsäurekonzentrationen auf die Nitrosierung anderer
Verbindungen wie z. B. Amine im wässrigen Milieu wurde bereits durch andere Autoren
beschrieben (MIRVISH 1975; BARTSCH et al. 1988) und konnte sogar in gepökeltem
Schweinefleisch nachgewiesen werden (MOTTRAM et al. 1975).
Der vermehrte Abbau von Guajakol und damit einhergehend die verstärkte Bildung aller drei
Oxidationsprodukte bei pH 3 ist in Anlehnung an die Untersuchungen von W. R. LICHT et al.
(1988) durch den erhöhten Ascorbinsäureabbau und die geförderte Entstehung nitrosierend
wirkender Stickoxide im sauren Milieu zu erklären.
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4. Ergebnisse und Diskussion
98
Da eine vermehrte Bildung von 6-Nitrosoguajakol nicht mit der gleichzeitigen Zunahme der
Reaktionsprodukte 6-Nitroguajakol und 4-Nitroguajakol verbunden war (vgl. Abb. 34
100 mg/L ASC sd und 500 mg/L ASC sd) bestätigt dies die Annahme, dass die Nitrierung des
Guajakols nicht über die Weiteroxidation nitrosierter Zwischenprodukte, sondern -wie schon
durch VIONE et al. (2004) für Phenol beschrieben- unabhängig von der Nitrosierung erfolgt.
Abbildung 35 Voltammogramme von 4-Nitrosophenol, Phenol, 2-Nitrophenol und 4-Nitrophenol (A);
Guajakol, 6-Nitroguajakol, 6-Nitrosoguajakol und 4-Nitroguajakol (B) und Syringol, Nitrosyringol
und Nitrososyringol (Intervall: 50 mV, n = 1); Halbstufenpotentiale von Phenol (1114 mV), 4-
Nitrosophenol (939 mV), 2-Nitrophenol (1201 mV), 4-Nitrophenol (1241 mV), Guajakol (706 mV), 6-
Nitroguajakol (854 mV), 6-Nitrosoguajakol (916 mV), 4-Nitroguajakol (949 mV), Syringol (577 mV),
Nitrosyringol (767 mV) und Nitrososyringol (938 mV) berechnet mit nicht-linearer Regression nach
Bildung des dekadischen Logarithmus von U (GraphPad.Prism® 6.0 Software)
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4. Ergebnisse und Diskussion
99
Verglichen mit den Ergebnissen zum oxidativen Abbau von Syringol in den Pökellaken (Kap.
4.2.2.) wurde Guajakol unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen in weitaus geringerem
Umfang abgebaut als Syringol. Die Halbstufenpotentiale dieser beiden Methoxyphenole
zeigten (Abb. 35 B und C), dass Syringol mit einem Halbstufenpotential von 577 mV leichter
oxidierbar war, als Guajakol mit einem Halbstufenpotential von 706 mV, was die vermehrte
Umsetzung von Syringol unter gleichen Oxidationsbedingungen erklären könnte.
Des Weiteren ließ sich feststellen, dass 6-Nitrosoguajakol (im Gegensatz zu Nitroso- und
Nitrosyringol (Abb. 35 C)) ein niedrigeres Halbstufenpotential aufweist als 4-Nitroguajakol
(Abb. 35 B). Das Halbstufenpotential für ebenfalls untersuchtes 4-Nitrosophenol war sogar
kleiner, als die Potentiale der beiden nitrierten Phenolderivate (Abb. 35 A). Somit ließ sich
eine generell leichtere Oxidierbarkeit der Nitro(methoxy)phenole im Vergleich zu den
Nitroso(methoxy)phenolen wie sie beim Syringol auftrat, für Guajakol und Phenol nicht
bestätigen.
4.2.5. Die Oxidation von Guajakol in der Fleischmatrix nach Erhitzen und
simulierter Verdauung in Abhängigkeit vom Nitrit- und
Sauerstoffgehalt
4.2.5.1. Ergebnisse
Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Oxidation von Guajakol in der Fleischmatrix in
Proben mit unterschiedlichen Nitritkonzentrationen bzw. in Fleischschäumen sind in Tabelle
12 zusammenfassend dargestellt.
Aus den Proben konnten jeweils zwischen 30,1 % und 57,4 % bzw. zwischen 18,07 mg/kg
und 34,46 mg/kg des in einer Konzentration von 60 mg/kg den Fleischproben zugesetzten
Guajakols extrahiert werden.
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4. Ergebnisse und Diskussion
100
Konzentration des Analyten in der Fleischprobe in mg/kgc
Fleischprobe Guajakol 6-Nitroso-
guajakol
4-Nitro-
guajakol
6-Nitro-
guajakol
Fleischprobea enthält 150 mg/kg NaNO2
erhitzt auf 80°C für 45 min 23,23±1,72 < NWG < NWG < NWG
Fleischprobea enthält 150 mg/kg NaNO2
nach simulierter Verdauung 30,02±3.61 < NWG < NWG < NWG
Fleischprobea mit 400 mg/kg NaNO2
erhitzt auf 80°C für 45 min 28,72±3,38 < NWG < NWG < NWG
Fleischprobea mit 400 mg/kg NaNO2 nach
simulierter Verdauung 24,77±4,88 0,52±0,04 0,58±0,08 0.16±0,03
Fleischprobea mit 150 mg/kg NaNO2,
erhitzt auf 80°C für 45 min und
anschließender Lagerung bei 7 °C für 7 d
28,65±4,45 < NWG < NWG < NWG
Fleischprobeb mit 20 % w/w Eiklar, erhitzt
auf 80°C für 45 min 33,93±2,76 < NWG < NWG < NWG
Fleischprobeb mit 20 % w/w Eiklar nach
simulierter Verdauung 18,07±7,39 < NWG < NWG < NWG
Fleischschaumb mit 20 % w/w Eischnee
(Luft)e, erhitzt auf 80°C für 45 min 31,73±2,39 < NWG < NWG < NWG
Fleischschaumb mit 20 % w/w Eischnee
(Luft)e, nach simulierter Verdauung 30,82±3,36 0,13±0,03d < NWG < NWG
Fleischschaumb mit 20 % w/w Eischnee
(Sauerstoff)f, erhitzt auf 80°C für 45 min 32,96±4,70 < NWG < NWG < NWG
Fleischschaumb mit 20 % w/w Eischnee
(Sauerstoff)f nach simulierter Verdauung 34,46±5,38 0,21±0,04 < NWG < NWG
a Fleischproben enthalten eine Ausgangskonzentration von 60 mg/kg Guajakol und 100 mg/kg ASC; b
Fleischproben enthalten eine Ausgangskonzentration von 60 mg/kg Guajakol, 100 mg/kg ASC und 1,66 %
Nitritpökelsalz (150 mg/kg NaNO2);c Konzentration von 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-
Nitroguajakolbestimmt mittels 5-Nitroguajakoläquivalenten, (Mittelwerte ± SD, n = 6); d Wert liegt zwischen
Nachweis und Bestimmungsgrenze (siehe Tab. 6 in Kap. 3.4.1.4.), e Eischnee aufgeschlagen mit Luft, f Eischnee
aufgeschlagen unter Sauerstoffatmosphäre; < NWG : Wert liegt unterhalb der Nachweisgrenze
Tabelle 12 Gehalte an Guajakol, 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol in den
Fleischproben (vgl. auch Messwerttabellen im Anhang unter 8.11.)
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4. Ergebnisse und Diskussion
101
Es schien jedoch kein Zusammenhang zwischen der extrahierten Menge an Guajakol und der
Bildung von Reaktionsprodukten in den Proben zu bestehen, da aus den Fleischproben mit
niedrigen Gehalten an extrahiertem Guajakol mehrheitlich keine Oxidationsprodukte isoliert
werden konnten. Im Gegensatz dazu ließen sich aus den Proben mit 400 mg/kg NaNO2 nach
deren simulierter Verdauung 24,77 mg/kg bzw. 41,3 % des Guajakols isolieren, obwohl sich
in diesen Proben alle drei Oxidationsprodukte nachweisen ließen. Es ist daher wahrscheinlich,
dass die unterschiedliche Extrahierbarkeit im Zusammenhang mit der unterschiedlichen
Probenmatrix der verschieden zubereiteten (z. B. Zusatz von Eiweiß bzw. Eischnee) bzw.
aufgearbeiteten (Erhitzen auf 80 °C bzw. anschließende simulierte Verdauung) stand, die eine
mehr oder weniger starke Bindung des Guajakols mit der Fleischmatrix verursachte.
Weiterhin ist es möglich, dass das Guajakol anderweitig reagierte und dieser
Reaktionsprozess mit den verwendeten Methoden nicht erfasst werden konnte.
Bei der Analyse der Fleischproben, die jeweils 150 mg/kg bzw. 400 mg/kg NaNO2 enthielten,
ließen sich nur in den Proben mit 400 mg/kg NaNO2, die nach ihrem Erhitzen auf 80 °C der
simulierten Verdauung unterzogen wurden, Oxidationsprodukte des Guajakols nachweisen.
Bei den Oxidationsprodukten handelte es sich um 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-
Nitroguajakol, welche in Konzentrationen von 0,52 mg/kg, 0,58 mg/kg und 0,16 mg/kg
(Konzentrationen jeweils bestimmt anhand von 5-Nitroguajakoläquivalenten) extrahiert
wurden.
Die Lagerung der Fleischproben mit 150 mg/kg NaNO2 für 7 Tage bei 7 °C nach ihrem
Erhitzen bei 80 °C und vor ihrer simulierten Verdauung führte im Vergleich zu den nicht
gelagerten Proben zu einem erhöhten Gehalt an extrahiertem Guajakol aber auch in diesen
Proben ließen sich keine Reaktionsprodukte nachweisen.
In den Fleischschäumen wurde während der simulierten Verdauung nur 6-Nitrosoguajakol
gebildet. Die Konzentration war hierbei in den Fleischproben, die das unter
Sauerstoffatmosphäre aufgeschlagene Eiweiß enthielten mit 0,21 mg/kg signifikant höher als
in den Proben, denen der mit Luft aufgeschlagene Eischnee zugesetzt wurde (0,13 mg/kg).
Zusätzlich zu den selbst hergestellten Fleischproben wurden industriell hergestellte, gepökelte
und unter Verwendung von Tannenholzrauch geräucherte Proben von Schwarzwälder
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4. Ergebnisse und Diskussion
102
Schinken untersucht. Aus diesen Proben konnten zwar sowohl nach dem Erhitzen auf 80 °C
als auch nach der simulierten Verdauung die beiden Methoxyphenole Guajakol und 4-
Methylguajakol extrahiert werden (identifiziert mittels GC-MS), die Isolation etwaiger
Oxidationsprodukte dieser beiden Verbindungen war mit der in dieser Studie verwendeten
Extraktionsmethode jedoch nicht möglich.
4.2.5.2. Diskussion
Der Nachweis von 6-Nitrosoguajakol in der Fleischmatrix erfolgte erstmalig im Rahmen
dieser Studie. Aus gepökelten und geräucherten Fleischprodukten konnten nach deren
Erhitzen durch Braten und/oder anschließender simulierter Verdauung bereits die beiden in
ortho- bzw. para-Position nitrierten Guajakolderivate 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol
isoliert werden (KNOWLES et al. 1974b). Hinsichtlich der Bildung nitrosierter
Oxidationsprodukte des Guajakols konnten jedoch in denselben Untersuchungen keine
eindeutigen Ergebnisse erzielt werden. So wurde die Entstehung von vermeintlichem 6-
Nitroso-4-methylguajakol und 6-Nitroso-4-propylguajakol in späteren Untersuchungen nicht
bestätigt (KNOWLES et al. 1974b, 1975b).
Auch in der vorliegenden Studie wurden bei Nitritkonzentrationen, wie sie nach der
Zusatzstoffzulassungsverordnung für Fleischerzeugnisse vorgeschrieben sind (150 mg/kg
NaNO2), keine Oxidationsprodukte des Guajakols nachgewiesen, worin die erzielten
Ergebnisse mit den Untersuchungen anderer Autoren übereinstimmen (KNOWLES et al.
1974b, 1975b; HOFMANN 1990). Der Zusatz von Eischnee zu den Fleischproben führte
jedoch zur Bildung von 6-Nitrosoguajakol, auch wenn die gesetzlich vorgeschriebene
Höchstmenge von 150 mg/kg NaNO2 eingehalten wurde. Eine erhöhte
Sauerstoffkonzentration förderte hierbei die Entstehung dieser Verbindung während der
simulierten Verdauung. In Anlehnung an die für die Oxidation von Syringol in den
Fleischschäumen erzielten Ergebnisse (Kap. 4.2.3.), ist davon auszugehen, dass auch die
Oxidation von Guajakol indirekt durch den oxidativen Abbau von Ascorbinsäure und die
Regeneration nitrosierend wirkender Stickoxide aus NO unterstützt wurde (ARCHER et al.
1975; W. R. LICHT et al. 1988). Folglich ist die Bildung dieses Oxidationsproduktes in
Fleischschäumen (z. B. Fleischmousses und –parfaits), die in ähnlicher Weise wie die in
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4. Ergebnisse und Diskussion
103
dieser Studie verwendeten Fleischproben hergestellt werden (EHLERT et al. 1980), möglich,
besonders unter Bedingungen, wie sie während der Verdauung im Magen vorliegen.
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5. Zusammenfassung
104
5. Zusammenfassung
Sarah-Maria Bölicke
Die Oxidation der Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-
Methylguajakol in Pökellaken und in erhitzter Fleischmatrix
Die Räucherung von Lebensmitteln gehört zu den ältesten Konservierungsverfahren, welches
auch in der heutigen Lebensmittelherstellung eine breite Anwendung findet. Dies ist neben
den antioxidativen auch den geschmacksgebenden Eigenschaften der Rauchinhaltsstoffe
zuzuschreiben, wobei bezüglich dieser Eigenschaften besonders die phenolischen
Verbindungen hervorzuheben sind, welche vor allem durch den pyrolytischen Abbau des
Holzbestandteils Lignin entstehen. Innerhalb dieser Phenolfraktion spielen die
Methoxyphenole Syringol und Guajakol sowie ihre alkylsubstituierten Derivate aufgrund
ihrer starken aromatisierenden und antioxidativen Wirkung und ihrer hohen Konzentrationen
im Rauch aber auch in den geräucherten Fleischprodukten eine bedeutende Rolle.
Obwohl die Konzentrationen dieser vier Methoxyphenole in Lebensmitteln, Räucherrauch
und Raucharomen in Abhängigkeit von verschiedenen Räucherverfahren, Holzarten,
Räucherprodukten und anderen lebensmitteltechnologischen Faktoren bereits intensiv
untersucht worden sind, liegen bezüglich ihrer Oxidation in Fleischprodukten bisher wenige
und teilweise widersprüchliche Daten vor. Der Abbau der Phenole und die Bildung von
Oxidationsprodukten sind von besonderer Bedeutung, wenn den Lebensmitteln neben dem
Räucherrauch auch Nitritpökelsalz zugesetzt wird, wie es beim Pökeln der Fall ist. Neben den
lebensmitteltechnologisch als positiv zu bewertenden Eigenschaften der Pökelung, wie der
Konservierung, der Aromatisierung und der Umrötung des gepökelten Fleisches wurden im
Zusammenhang mit diesem Konservierungsverfahren auch negative Effekte, wie die Bildung
von kanzerogenen Nitrosaminen nachgewiesen. Da das Räuchern und die Pökelung von
Fleischerzeugnissen oft als miteinander kombinierte Herstellungsverfahren für
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5. Zusammenfassung
105
Fleischerzeugnisse auftreten, besteht folglich die Möglichkeit der Nitrierung bzw.
Nitrosierung der durch den Rauch in das Fleisch eingebrachten phenolischen Verbindungen.
Für verschiedene Nitrosophenole ist bereits ein fördernder Effekt auf die Nitrosaminbildung
nachgewiesen worden und auch die Nitrosophenole selbst weisen teilweise genotoxische
Wirkungen auf. Daher ist die Aufklärung des Abbaus der vier Methoxyphenole Guajakol,
Syringol, 4-Methylguajakol und 4-Methylsyringol in geräucherten und gepökelten
Fleischerzeugnissen hinsichtlich der damit gegebenenfalls verbundenen Bildung solcher
nitrosierten bzw. nitrierten Oxidationsprodukte von besonderem Interesse.
Ziel dieser Studie war es daher, die Oxidation dieser vier Verbindungen in selbst hergestellten
Fleischproben zu untersuchen, sowie gebildete Oxidationsprodukte zu isolieren und zu
identifizieren. Des Weiteren wurden Pökellaken hergestellt, mit Hilfe derer die Oxidation im
wässrigen Modell unter ähnlichen Bedingungen, wie den in den Fleischproben hergestellten,
untersucht werden sollte. Hierfür wurden zunächst geeignete HPLC-UV/VIS, GC-MS sowie
HPLC-MS Methoden entwickelt, um die chromatographische Trennung sowie die sichere
Identifikation der Phenole und der aus den Pökellaken und Fleischproben isolierten
Substanzen zu gewährleisten. Die Entwicklung einer schonenden Extraktionsmethode für die
Oxidationsprodukte der Phenole aus der Fleischmatrix wurde durchgeführt, da die in
vorherigen Studien verwendeten Methoden bisher keine sichere und erfolgreiche Extraktion
eventuell gebildeter Nitrosophenole ermöglichten.
Sowohl aus den Pökellaken als auch aus den Fleischproben gelang die Extraktion der
Oxidationsprodukte von Syringol und Guajakol, welche mittels GC-MS und LC-ESI-MS als
6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol, 6-Nitroguajakol, Nitrososyringol, Nitrosyringol und
3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol identifiziert werden konnten. Mit Ausnahme
von 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol wurde die Bildung der genannten
Oxidationsprodukte im Rahmen dieser Studie erstmalig in der Fleischmatrix nachgewiesen.
Die Untersuchung ihrer Entstehung in Abhängigkeit vom pH-Wert und der
Ascorbinsäurekonzentration in Pökellaken bzw. von der Nitrit-und Sauerstoffkonzentration in
Fleischproben wurde auf diese Weise das erste Mal durchgeführt.
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5. Zusammenfassung
106
Auch im Falle von 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol wurden verschiedene
Oxidationsprodukte aus beiden Probenmatrices isoliert, deren Identität jedoch nicht aufgeklärt
werden konnte.
Die Pökellaken, die unter Zugabe der Phenole, 1,66 % Nitritpökelsalz (150 mg/kg NaNO2)
und unterschiedlichen Konzentrationen des Antioxidationsmittels Ascorbinsäure hergestellt
wurden, wurden zunächst für 40 min auf 80 °C erhitzt und anschließend für 1 h bei pH 3 und
40 °C erwärmt. Erstes Verfahren sollte der Simulation des Erhitzens während der Herstellung
des Räucherproduktes z. B. durch das Heißräuchern bzw. Braten dienen, während das
Absenken des pH-Wertes sowie das Erwärmen der Laken die Bedingungen, wie sie während
der Verdauung im Magen herrschen, nachstellen sollten.
Es zeigte sich, dass Ascorbinsäure bei einer Konzentration von 500 mg/L in der Pökellake im
Vergleich zu einem Ascorbinsäurezusatz von 100 mg/L nach dem Erhitzen auf 80 °C zu
einem verstärkten Abbau von Syringol aber nicht von Guajakol führte. Eine Erniedrigung des
pH-Werts auf 3 förderte den Abbau des jeweiligen Phenols, wobei dies (mit Ausnahme der
Proben, die Syringol und 100 mg/L Ascorbinsäure enthielten) bezogen auf 6-Nitrosoguajakol,
4-Nitroguajakol, 6-Nitroguajakol und Nitrososyringol stets mit einer vermehrten Bildung der
jeweiligen Oxidationsprodukte verbunden war.
Auch die Fleischproben, die neben den Phenolen ebenfalls Ascorbinsäure als
Antioxidationsmittel enthielten, wurden auf 80 °C erhitzt und anschließend der simulierten
Verdauung durch Zugabe von Salzsäure und Pepsin sowie dem Erwärmen auf 40 °C für 1 h
unterzogen. Hierbei sollte der Effekt unterschiedlicher Nitritkonzentrationen in den
Fleischproben auf die Oxidation der Phenole bestimmt werden. Weiterhin wurden
Fleischschäume, die mit Luft oder unter Sauerstoffatmosphäre aufgeschlagenen Eischnee
enthielten, auf die Entstehung der Oxidationsprodukte hin untersucht.
Während sich 6-Nitrosoguajakol zusammen mit 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol nur
unter den Bedingungen der simulierten Verdauung bei stark erhöhten Nitritkonzentrationen
von 400 mg/kg in den Fleischproben bildeten, war 6-Nitrosoguajakol als einziges
Oxidationsprodukt des Guajakols auch in den mit Luft und Sauerstoff aufgeschäumten
Fleischproben, welchen lediglich 150 mg/kg NaNO2 zugesetzt wurde, nach deren simulierter
Verdauung nachweisbar.
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5. Zusammenfassung
107
Das Produkt 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol bildete sich in allen
Fleischproben, wobei unter den Bedingungen der simulierten Verdauung stets mehr dieses
Syringoldimers entstand, als nach dem alleinigen Erhitzen auf 80 °C. Je höher hierbei die
Nitritkonzentration war, desto mehr dieser Verbindung wurde gebildet, wobei sich dessen
Konzentration bei 400 mg/kg NaNO2 in der Fleischprobe im Vergleich zu den Proben mit
150 mg/kg um das 4-fache erhöhte. Für die Produkte Nitrososyringol und Nitrosyringol,
welche nur nach der simulierten Verdauung der Fleischproben vorlagen, zeigte sich ebenfalls
eine Vervielfachung der Konzentration in den Proben mit 400 mg/kg NaNO2 im Vergleich zu
den Proben mit 150 mg/kg NaNO2 bzw. der Hälfte dieser Konzentration (75 mg/kg NaNO2).
Die Applikation der gesetzlich nach Zusatzstoffzulassungsverordnung erlaubten
Höchstmenge von 150 mg/kg NaNO2 im Fleischerzeugnis (oder der Hälfte dieser
Konzentration) ohne gleichzeitige Zugabe von Eischnee führte folglich nur beim Syringol zur
Bildung von Oxidationsprodukten. In Fleischschäumen, wie sie z. B. in der traditionellen
französischen Küche hergestellt werden (Fleischmousses und –parfaits), ist jedoch auch bei
einer Nitritkonzentration von 150 mg/kg während der Verdauung die Nitrosierung von
Guajakol möglich.
Da besonders im Falle von Syringol und seinem im Fleisch bevorzugt gebildetem
Reaktionsprodukt 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol bereits deren antioxidative
und für Syringol auch antinitrosierende Wirkungen nachgewiesen wurden, ist gerade beim
Einsatz dieses v.a. beim Räuchern mit Hartholz gebildetem Methoxyphenols von einem
lebensmitteltechnologisch positiven Effekt auszugehen. Da bezüglich der Wirkung der
Oxidationsprodukte von Guajakol wenige Daten vorliegen, sind vor der Bewertung dieses
Methoxyphenols weitere Untersuchungen erforderlich.
Die Bildung der in dieser Studie nachgewiesenen Oxidationsprodukte ist bei der Entwicklung
lebensmitteltechnologischer Verfahren, besonders bei dem Einbringen von sauerstoffhaltigen
Schäumen, wie sie bei der Herstellung von Fleischmousses und –parfaits verwendet werden,
zu berücksichtigen. Dies sollte besonders im Hinblick darauf geschehen, dass selbst wenn im
geräucherten und gepökelten Fleischprodukt kein Nachweis der jeweiligen Reaktionsprodukte
erfolgt, sogar bei der Verwendung gesetzlicher vorgegebener Nitrithöchstmengen eine
Bildung selbiger im Magenmilieu nach Auswertung der Ergebnisse dieser Studie als
wahrscheinlich zu betrachten ist.
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6. Summary
108
6. Summary
Sarah-Maria Bölicke
The oxidation of the methoxyphenols syringol, guaiacol, 4-methylsyringol and 4-
methylguaiacol in curing brine and in heated meat matrix
The smoking of food products is one of the oldest preservation methods, which is used also
for modern food processing. This is caused mainly by the antioxidant and flavoring properties
of the smoke constituents such as phenolic compounds formed by the pyrolysis of lignin.
Because of their high concentration in smoke and in smoked food products the most important
components of the phenolic fraction are the methoxyphenols syringol, guaiacol and their
alkylated derivatives.
Although the contents of this methoxyphenols in smoked foods, smoke and smoke flavorings
were studied in dependence of smoking conditions, kind of wood and kind of food products
little information are available about the oxidation of these compounds in the meat matrix.
The oxidation and degradation of these phenols are of particular interest, if smoking is applied
to cured meat products, because the nitration or nitrosation of smoke derived phenols is
possible. For many nitrosophenols an enhancing effect to nitrosamine formation had been
determined and even the nitrosophenols themselves can develop genotoxicity.
Therefore the investigation of oxidative degradation of the four methoxyphenols guaiacol,
syringol, 4-mehylguaiacol and 4-methylsyringol is of specific interest regarding the formation
of nitrated or nitrosated reaction products in cured and smoked meat.
Because of these considerations the aim of the present study was to analyze the oxidation of
these methoxyphenols by extraction and identification of their associated oxidation products
formed in curing brine and meat matrix. Therefore HPLC-UV/VIS, GC-MS and LC-MS
methods were developed to enable the chromatographic separation and identification of the
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6. Summary
109
extracted compounds. In addition a extraction method had to be used, because extraction
methods of earlier studies seemed to be not applicable for the isolation of formed
nitrosophenols from meat matrix.
In this study the extraction of the oxidation products of guaiacol and syringol was performed,
which were identified by GC-MS and LC-ESI-MS as 6-nitrosoguaiacol, 4-nitroguaiacol, 6-
nitroguaiacol, nitrososyringol, nitrosyringol and 3,3′,5,5′-tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-
diol. With exception of 4-nitroguaiacol and 6-nitroguaiacol the formation of these reaction
products was determined for the first time in meat matrix.
In addition the investigation of their formation under different oxidation conditions such as
different concentrations of ascorbic acid and pH-values in the curing brines as well as
different amounts of sodium nitrite or oxygen contents in the meat matrix had not been
performed yet.
Although oxidation products of 4-methylsyringol and 4-methylguaiacol were extracted from
curing brine and meat samples, it was not possible to identify these isolated compounds in this
study.
The brines were prepared by addition of the phenols, 1,66 % curing salt (containing 0,9 %
NaNO2), and different concentrations of ascorbic acid. The brines were heated to 80 °C for
40 min and afterwards the pH was adjusted to 3 with hydrochloric acid and the samples were
heated to 40 °C for 1 hour. The first procedure was applied in order to simulate heating during
food processing such as hot smoking or frying while the second experiment was made to
simulate reaction conditions during gastric digestion.
It was shown that a concentration of 500 mg/L ascorbic acid in the brine led to a higher
degradation of syringol if the samples were heated to 80 °C compared to the brines which
contained 100 mg/L ascorbic acid. For guaiacol no differences appeared comparing these two
batches. Lowering the pH to 3 following simulated digestion enhanced the degradation of
both methoxyphenols and formation of the oxidation products 6-nitrosoguaiacol, 4-
nitroguaiacol, 6-nitroguaiacol and nitrososyringol (with exception of the brines, which
contained syringol and 100 mg/L ascorbic acid).
The meat samples, which contained the phenols, ascorbic acid at a constant concentration of
100 mg/kg and different contents of NaNO2 were heated to 80 °C. Afterwards simulated
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6. Summary
110
digestion was applied to the samples by addition of hydrochloric acid and pepsin and by
heating at 40 °C for 1 hour. In addition meat mousses were prepared containing 150 mg/kg
NaNO2, ascorbic acid and foamed egg whites, which were foamed with air or under oxygen
atmosphere in order to determine the effect of different oxygen contents on phenol oxidation
in meat matrix.
Whereas 6-nitrosoguaiacol, 4-nitroguaiacol and 6-nitroguaiacol were successfully isolated
from the batches containing 400 mg/kg sodium nitrite after simulated digestion, in the meat
mousses only 6-nitrosoguaiacol was formed during simulated digestion.
Formation of the dimer 3,3′,5,5′-tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol was determined in all
meat samples, while nitroso- and nitrosyringol were isolated only after the digestion
experiments. Furthermore application of simulated digestion after heating at 80 °C enhanced
the generation of the syringol dimer.
After simulated digestion the concentration of 3,3′,5,5′-tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol
in the samples which contained 400 mg/kg NaNO2 raised to the fourfold compared to the
samples which contained only 150 mg/kg NaNO2 and also the concentration of
nitrososyringol and nitrosyringol was highest in the samples with 400 mg/kg NaNO2 as well.
In conclusion application of the legally allowed level of nitrite (150 mg/kg in meat products
following the german food additive law) without further addition of foam led to product
formation only in case of syringol, while formation of 6-nitrosoguaiacol was determined in
the meat mousses after simulated digestion even at 150 mg/kg NaNO2.
For syringol and its main reaction product in meat matrix, the dimer 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-
1,1′-biphenyl-4,4′-diol, antioxidative properties had been determined. Since syringol is one of
the most important flavoring components of smoke, its specific application in smoke-derived
products during meat processing could be one possible implementation to exploit the
beneficial properties of this compound and its predominant oxidation product.
Further investigations on the oxidation of guaiacol in cured and smoked meat are required,
since the formation of its oxidation products was also shown in meat mousses at moderate
sodium nitrite levels after simulated digestion in this study.
In summary oxidation of the smoke phenols and formation of the associated reaction products
should be considered an important aspect of food processing especially for the production of
oxygen containing meat mousses and parfaits.
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Stand: Zuletzt geändert durch Art. 3 V v. 21.5.2012 I 1201
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8. Anhang
124
8. Anhang
8.1. Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
Abs Absorbance
ASC Ascorbinsäure
BG Bestimmungsgrenze
DAD Diode Array Detection (Dioden Array Detektion)
ECD Electrochemical Detection (Elektrochemische
Detektion)
entsp. entspricht
ESI Elektrospray-Ionisation
GC-MS Gaschromatographie-Massenspektrometrie
HPLC High performance liquid chromatography
(Hochleistungsflüssigchromatographie)
h Stunde
Kap. Kapitel
L Liter
LC-MS Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie
M molare Masse
µL Mikroliter
min Minute
mg Milligramm
mV Millivolt
m/z Masse/Ladungs-Verhältnis
NWG Nachweisgrenze
pH potentia hydrogenii (pH-Wert)
rpm Rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
SD Standard Deviation (Standardabweichung)
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8. Anhang
125
sd simulated digestion (simulierte Verdauung)
Tab. Tabelle
TIC Total Ion Chromatogram
U Spannung
UV Ultraviolett
„uv“ nicht identifizierte Verbindung (vgl. Kap. 4.1.2.)
vgl. vergleiche
WFR Wiederfindungsrate
8.2. Glossar
Fleischmousse mit Schlagsahne oder Eischnee hergestellte
Fleischschaumspeise
Nitrosierende Stickoxide aus Stickstoff und Sauerstoff bestehende
Verbindungen (z. B. N2O3), die mit anderen
Verbindungen wie z. B. Aminen und Phenolen
unter Nitrosierung bzw. Nitrierung selbiger
reagieren
Fleischparfait aus einer feinen Farce zubereitete Fleischspeise,
die durch Unterschlagen von Eischnee oder Sahne
locker gehalten wird
8.3. Chemikalienliste
Chemikalien Hersteller/Lieferant
Acetonitril (HPLC- und LC-MS-Grade) Fisher Scientific, Loughborough, UK
Ammoniaklösung 30-33 %, reinst Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe,
Deutschland
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8. Anhang
126
Ammoniumhydrogencarbonat LC-MS Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,
Deutschland
Ascorbinsäure (L(+)) ≥ 99 % p.a. Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe,
Deutschland
Chloroform 99+ % Fisher Scientific, Loughborough, UK
Essigsäure Supra 100 % ROTIPURAN® Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe,
Deutschland
Ethanol Fisher Scientific, Loughborough, UK
Guajakol (2-Methoxyphenol) 98 % TCI Chemicals, Tokio, Japan
Helium 5.0, 99,99 % Linde AG, Pullach, Germany
Methanol HPLC-Grade Fisher Scientific, Loughborough, UK
4-Methylguajakol (4-Methyl-2-
Methoxphenol) > 98 %
TCI Chemicals, Tokio, Japan
4-Methylsyringol (4-Methoxy-2,6-
Dimethoxyphenol) > 97 %
TCI Chemicals, Tokio, Japan
Natriumchlorid ≥ 99,5 % Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe,
Deutschland
Natriumnitrit ≥ 99 % Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe,
Deutschland
5-Nitroguajakol 98 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,
Deutschland
2-Nitrophenol 98 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,
Deutschland
4-Nitrophenol > 99,5 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,
Deutschland
2-Nitroso-5-methoxyphenol 98 % Molekula, Newcastle upon Tyne, UK
4-Nitrosophenol > 98 % TCI Chemicals, Tokio, Japan
Pepsin 0,7 Ph. Eur.-E/mg Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe,
Deutschland
Phenol ≥ 99,5 % p.a. TCI Chemicals, Tokio, Japan
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8. Anhang
127
Salzsäure, rauchend 37 %, p.a.
ROTIPURAN®
Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe,
Deutschland
Sauerstoff (g) 5.0, 99,99 % Linde AG, Pullach, Germany
Stickstoff (g) 5.0, 99,99 % Linde AG, Pullach, Germany
Syringol (2,6-Dimethoxyphenol) 99 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,
Deutschland
TEAOH (Tetraethylammoniumhydroxid) 25
% (w/w)
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,
Deutschland
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8. Anhang
128
8.4. Geräteliste
Gerät Modell/ Hersteller
Analysenwaage Kern 770/G. Kern & Sohn GmbH, Albstadt,
Deutschland
Elektrochemischer Detektor 641 VA-Detektor/ 650 Electrochemical
Detector, Metrohm AG, Herisau, Schweiz
Eurochrom® Software Eurochrom® Software (Version 2.05),
Knauer, Berlin, Deutschland
GC-Chromatograph/ -Detektor 3300/3400 Varian Gas Chromatograph,
Agilent Technologies, Santa Clara, CA,
USA;
Finnigan Mat SSQ 710 Mass Spectrometer,
Thermo Fisher Scientific Inc., Bonn,
Deutschland
GC-Säule DB-5, 60 m, 0,250 mm (i.d.), 0,25 μm Film,
Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA
GC-MS Software ICIS EXECUTIVE® Software Version 8.2.1.,
Thermo Fisher Scientific Inc., Bonn,
Deutschland
GraphPad.Prism®Software GraphPad.Prism®Software (Version 6.0),
GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA
HPLC-DAD-Detektor Well Chrom DAD K-2700, Well Chrom
LAMP K-2701, Knauer GmbH, Berlin,
Deutschland
HPLC-Interface Boxen Interface Box, Knauer GmbH, Berlin,
Deutschland
HPLC-Pumpe Maxistar K-1000, Knauer, Berlin,
Deutschland
HPLC-Säule (Messung Pökellaken) NUCLEODUR C-18 ISIS® (250 mm x.
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8. Anhang
129
4,6 mm (i.d.), 5 µm; Macharey-Nagel GmbH
& Co. KG, Düren, Deutschland
HPLC-Säule + Vorsäule (Messung
Fleischextrakt)
NUCLEODUR C-18 ISIS® (150 mm x.
3 mm (i.d.), 3 µm; Macharey-Nagel GmbH
& Co. KG, Düren, Deutschland
HPLC-UV/VIS-Detektor Jasco 875 Intelligent UV/VIS Detector,
JASCO Labor- und Datentechnik GmbH,
Groß-Umstadt, Deutschland
Laborwaage 1205 MP (bis 2 Kg) Satorius, Satorius
AG, Göttingen, Deutschland
LC-MS Pumpe Waters 616 Gradienten Pumpe, Waters
GmbH, Eschborn, Deutschland
LC-MS Autosampler Waters 171 Plus Autosampler, Waters
GmbH, Eschborn, Deutschland
LC-MS Detektor Finnigan LCQ Classic Mass Spectrometer,
Thermo Fisher Scientific Inc., Bonn,
Deutschland
LC-MS Säule NUCLEODUR C-18 ISIS® (150 mm x.
3 mm (i.d.), 3 µm; Macharey-Nagel GmbH
& Co. KG, Düren, Deutschland
LC-MS Software XCalibur 1.3 software, Thermo Fisher
Scientific Inc., Bonn, Deutschland;
Tune Plus 1.3 software, Thermo Fisher
Scientific Inc., Bonn, Deutschland
Mikroskop MBS-10, LOMO PLC, St. Petersburg,
Russland
Moulinette Krups Moulinette, Krups GmbH, Frankfurt
am Main, Deutschland
pH-Elektrode SE 102 N, Knick GmbH, Berlin,
Deutschland
pH-Meter 766 Calimatic, Knick GmbH, Berlin,
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8. Anhang
130
Deutschland
Pipetten 1-5 mL: Carl Roth GmbH & Co KG,
Karlsruhe, Deutschland;
10-100/100-1000 µL: GILSON, Middleton,
USA
Pipettenspitzen SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht,
Deutschland
Probengläschen und Schraubkappen 2 mL / 4 mL AMBVIAL AMBER
Rotilabo®, Carl Roth GmbH & Co KG,
Karlsruhe, Deutschland
Schraubdeckelgläser DURAN® 100 mL Schraubdeckelgläser mit
DL 45 Schraubkappen, Schott AG,
Mitterteich, Deutschland
Spektrophotometer Uvikon 930 Spektrophotometer, Kontron
AG, Augsburg, Deutschland
SPE-Kartuschen LiChrolut® EN Kartuschen (40-120 µm,
200 mg), Merck-Hitachi®, Darmstadt,
Deutschland
Stabhomogenisierer Ultra-Turrax®, Janke & Kunkel, IKA®
Werke GmbH & Co. KG, Staufen,
Deutschland
Statistik Software SAS Statistical Analysis Program (SAS für
Windows) Version 9.3, SAS Institute Inc.,
Cary, NC, USA
Ultraschallbad DT 106 BANDELIN SONOREX
DIGITEC, Berlin, Deutschland
Wasserbad Köttermann, Hänigsen, Deutschland
Zentrifuge Sigma Laborzentrifuge 3K30, Sigma
Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz,
Deutschland
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8. Anhang
131
8.5. HPLC-UV/VIS-Chromatogramm der vier Methoxyphenole Syringol,
Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol unter Verwendung der
HPLC-Bedingungen für die Pökellaken (vgl. Kap. 4.1.1.)
HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von Syringol (A), Guajakol (B), 4-Methylsyringol (C) und 4-
Methylguajakol (D) unter Verwendung der HPLC-Bedingungen für die Pökellaken, Konzentration der
Phenole jeweils 125 mg/L
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8. Anhang
132
8.6. HPLC-UV/VIS-Chromatogramm der vier Methoxyphenole Syringol,
Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol unter Verwendung der
HPLC-Bedingungen für die Fleischextrakte (vgl. Kap. 4.1.1.)
HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von Syringol (A), Guajakol (B), 4-Methylsyringol (C) und 4-
Methylguajakol (D) unter Verwendung der HPLC-Bedingungen für die Fleischextrakte, Konzentration
der Phenole: Syringol und 4-Methylsyringol jeweils 20 mg/kg, Guajakol und 4-Methylguajakol
jeweils 12 mg/kg
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8. Anhang
133
8.7. Übersicht der für die Identifizierung der aus den Pökellaken bzw.
Fleischproben isolierten Verbindungen verwendeten Analyseverfahren (vgl.
Kap. 4.1.)
Verfahren zur Analyse bzw. zur Aufarbeitung der untersuchten Verbindung
Verbindung (Matrix) Analytische
HPLC-UV/VIS
(vgl. Kap. 3.4.)
Präparative HPLC-
UV/VIS
(vgl. Kap. 3.5.1.)
LC-ESI-MS
(vgl. Kap. 3.5.6.)
GC-MS
(vgl. Kap. 3.5.5.)
Syringol (Pökellakea) + + -d +
Syringol (Fleischprobeb) + + -d +
Nitrososyringol
(Pökellakea) + + + +
Nitrososyringol
(Fleischprobeb) + + + ●
„uv“ (Pökellakea) + + + +
Nitrosyringol
(Pökellakea) + + + +
Nitrosyringol
(Fleischprobeb) + + + ●
3,3′,5,5′-Tetramethoxy-
1,1′-biphenyl-4,4′-diol
(Pökellakea)
-c -c -c + (gelöst in
Chloroform)
3,3′,5,5′-Tetramethoxy-
1,1′-biphenyl-4,4′-diol
(Fleischprobeb)
+ + + +
Guajakol (Pökellakea) + + -d +
Guajakol (Fleischprobeb) + + -d +
6-Nitrosoguajakol
(Pökellakea) + + + +
6-Nitrosoguajakol
(Fleischprobeb) + + + +
4-Nitroguajakol
(Pökellakea) + + + +
4-Nitroguajakol
(Fleischprobeb) + + + +
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8. Anhang
134
6-Nitroguajakol
(Pökellakea) + + + +
6-Nitroguajakol
(Fleischprobeb) + + + +
4-Methylguajakol
(Pökellakea) + + -d +
4-Methylguajakol
(Fleischprobeb) + + -d +
PL 1a (4-Methylguajakol
vgl. Kap. 4.1.4.) + + + +
F 1b (Methylguajakol
vgl. Kap. 4.1.4.) + + + +
4-Methylsyringol
(Pökellakea) + + -d +
4-Methylsyringol
(Fleischprobeb) + + -d +
Oxidationsprodukte von
4-Methylsyringol (siehe
Kap. 4.1.4.)
+ + Siehe Tabelle 9 in Kap. 4.1.4.
a Verbindung isoliert aus der Pökellake (100 mg/L ASC sd); b Verbindung isoliert aus der Fleischprobe
(400 mg/kg NaNO2, nach der simulierten Verdauung; + Bestimmung mittels des Analyseverfahrens erfolgt; ●
Bestimmung aufgrund zu geringer Gehalte der isolierten Analyten mit Analyseverfahren nicht möglich (vgl.
Kap. 4.1.);-c Bestimmung mittels HPLC wegen Kristallisation nicht möglich (vgl. Kap. 4.1.2.);-d Bestimmung
mittels LC-ESI-MS im sauren Eluenten nicht möglich (vgl. Kap. 4.1.1.)
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8. Anhang
135
8.8. Vergleichende Darstellung der LC-ESI-MS Spektren bzw. GC-MS Spektren
der aus der Pökellaken bzw. aus den Fleischproben isolierten
Oxidationsprodukte 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und
Nitrososyringol (vgl. Kap. 4.1.)
1. LC-MS-Spektren von 6-Nitrosoguajakol aus der Pökellake und aus der
Fleischprobe
LC-MS-Spektren von 6-Nitrosoguajakol nach seiner Isolierung aus der Pökellake (100 mg/L ASC sd)
(A) und aus der Fleischprobe (400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) (B) (vgl. Anhang 8.7.)
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8. Anhang
136
2. GC-MS-Spektren von 6-Nitroguajakol aus der Pökellake und aus der
Fleischprobe
GC-MS-Spektren von 6-Nitroguajakol nach seiner Isolierung aus der Pökellake (100 mg/L ASC sd)
(A) und aus der Fleischprobe (400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) (B) (vgl. Anhang 8.7.)
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8. Anhang
137
3. LC-MS-Spektren von Nitrososyringol aus der Pökellake und aus der
Fleischprobe
LC-MS-Spektren von Nitrososyringol nach seiner Isolierung aus der Pökellake (100 mg/L ASC sd)
(A) und aus der Fleischprobe (400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) (B) (vgl. Anhang 8.7.)
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8. Anhang
138
8.9. Messwerttabellen zur Berechnung des molaren Extinktionskoeffizienten von
Syringol und 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (vgl. Kap. 3.5.4.
und 4.2.3.1.)
Syringol
Probe Nr. Extinktiona Molarer Extinktionskoeffizientb in Abs Mittelwert ± SD
1 0,34 1048,41 1087,31 ± 36,63
2 0,34 1039,72
3 0,37 1130,76
4 0,36 1116,43
5 0,36 1101,24
a Extinktion gemessen bei 272 nm und einer Konzentration von 50 mg/L Syringol in Chloroform (entspr. einer
Stoffmengenkonzentration von 3,24675 * 10-4 mol/L); b berechnet nach dem Lambert-Beerschen-Gesetz:
ε = E/c * d in L*cm/mol (ε = molarer Extinktionskoeffizient; E = Extinktion; c = Stoffmengenkonzentration in
mol/L; d = Schichtdicke der Küvette (1 cm))
3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol
Probe Nr. Extinktiona Molarer Extinktionskoeffizientb Mittelwert ± SD
1 1,20 7364,70 8223,99 ± 691,35
2 1,25 7658,74
3 1,34 8222,15
4 1,53 9333,83
5 1,40 8540,54
a Extinktion gemessen bei 272 nm und einer Konzentration von 50 mg/L 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-
4,4′-diol in Chloroform (entspr. einer Stoffmengenkonzentration von 1,63399 * 10-4 mol/L); bberechnet nach
dem Lambert-Beerschen-Gesetz: ε = E/c * d in L*cm/mol (ε = molarer Extinktionskoeffizient; E = Extinktion;
c = Stoffmengenkonzentration in mol/L; d = Schichtdicke der Küvette (1 cm))
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8. Anhang
139
8.10. Messwerttabellen der Gehalte an Guajakol und Syringol sowie ihrer
Oxidationsprodukte in den Pökellaken (vgl. Kap. 4.2.2. bis 4.2.5.)
1. Gehalte an Guajakol und seinen Oxidationsprodukten in Pökellaken mit
unterschiedlichen Ascorbinsäurekonzentrationen
Konzentration Analyt in mg/L
(Mittelwert ± Standardabweichung, n = 6)
Pökellakea Guajakol 6-Nitroso-guajakolc 4-Nitro-guajakolc 6-Nitro-guajakolc
100 mg/L ASC, 80 °C 140,85 ± 9,94 51,76 ± 8,83 3,27 ± 0,70 2,43 ± 2,18
100 mg/L ASC,
80 °C + simul. Verd.b 27,64 ± 9,07 112,78 ± 18,35 5,59 ± 1,70 15,71 ± 4,42
500 mg/L ASC, 80 °C 142,38 ± 8,54 13,41 ± 4,46 4,10 ± 1,66 14,26 ± 1,16
500 mg/L ASC,
80 °C + simul. Verd.b 83,92 ± 9,13 80,02 ± 22,00 7,84 ± 0,87 19,26 ± 1,44
a alle Pökellaken enthalten eine Ausgangskonzentration von 200 mg/L Guajakol und 1,66 % Nitritpökelsalz (0,9
% NaNO2, entspr. 150 mg/L NaNO2 in der Pökellake); b Pökellaken nach Erhitzen auf 80 °C (40 min) und
simulierter Verdauung (pH 3, 40 °C, 1 h); c Konzentration in 5-Nitroguajakoläquivalenten
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8. Anhang
140
2. Gehalte an Syringol und seinen Oxidationsprodukten in Pökellaken mit
unterschiedlichen Ascorbinsäurekonzentrationen
Konzentration Analyt in mg/L
(Mittelwert ± Standardabweichung, n = 6)
Pökellakea Syringol
Nitrososyringolc Nitrosyringolc „uv“c
100 mg/L ASC, 80 °C 84,09 ± 7,88 13,55 ± 1,46 1,05 ± 0,65 14,36 ± 3,97
100 mg/L ASC,
80 °C + simul. Verd.b < NWG 14,78 ± 2,32 1,08 ± 0,62 23,34 ± 7,62
500 mg/L ASC, 80 °C 27,78 ± 8,75 3,66 ± 1,00 3,89 ± 1,20 28,73 ± 8,40
500 mg/L ASC,
80 °C + simul. Verd.b 9,08 ± 6,23 19,16 ± 4,07 4,73 ± 0,79 38,49 ± 9,86
a alle Pökellaken enthalten eine Ausgangskonzentration von 200 mg/L Syringol und 1,66 % Nitritpökelsalz (0,9
% NaNO2, entspr. 150 mg/L NaNO2 in der Pökellake); b Pökellaken nach Erhitzen auf 80 °C (40 min) und
simulierter Verdauung (pH 3, 40 °C, 1 h); c Konzentration in 5-Nitroguajakoläquivalenten; < NWG : Wert liegt
unterhalb der Nachweisgrenze (siehe Tab. 6 in Kap. 3.4.1.4.)
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8. Anhang
141
8.11. Messwerttabellen der Gehalte an Guajakol und Syringol sowie ihrer
Oxidationsprodukte in den Fleischproben (vgl. Kap. 4.2.2. bis 4.2.5.)
1. Gehalte an Guajakol und seinen Oxidationsprodukten in Fleischproben mit
unterschiedlichen NaNO2-Konzentrationen
Konzentration Analyt in mg/kg
(Mittelwert ± Standardabweichung, n = 6)
Fleischprobe mit
unterschiedlichen
Nitritkonzentrationena
Guajakol 6-Nitroso-guajakolc 4-Nitro-guajakolc 6-Nitro-guajakolc
150 mg/kg NaNO2, 80 °C 23,23±1,72 < NWG < NWG < NWG
150 mg/kg NaNO2,
80 °C + simul. Verd.b 30,02±3,61 < NWG < NWG < NWG
400 mg/kg NaNO2, 80 °C 28,72±3,38 < NWG < NWG < NWG
400 mg/kg NaNO2,
80 °C + simul. Verd.b 24,77±4,88 0,52±0,04 0,58±0,08 0,16±0,03
150 mg/kg NaNO2,
80 °C + simul. Verd.b und
Lagerung (7 °C, 7 Tage)
28,65±4,45 < NWG < NWG < NWG
a alle Fleischproben enthalten eine Ausgangskonzentration von 60 mg/kg Guajakol und 100 mg/kg ASC; b
Fleischproben nach Erhitzen auf 80 °C (45 min) und simulierter Verdauung (Salzsäure + Pepsin, 40 °C, 1 h); c
Konzentration in 5-Nitroguajakoläquivalenten; < NWG : Wert liegt unterhalb der Nachweisgrenze (siehe Tab. 6
in Kap. 3.4.1.4.)
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8. Anhang
142
2. Gehalte an Guajakol und seinen Oxidationsprodukten in Fleischproben mit
Zusatz von Eiklar bzw. Eischnee
Konzentration Analyt in mg/kg
(Mittelwert ± Standardabweichung, n = 6)
Fleischprobea mit Zusatz
von Eiklar/ Eischnee
Guajakol 6-Nitroso-guajakolc 4-Nitro-guajakolc 6-Nitro-guajakolc
Eiklar, 80 °C 33,93±2,76 < NWG < NWG < NWG
Eiklar, 80 °C + simul.
Verd.b 18,07±7,39 < NWG < NWG < NWG
Eischnee Luft, 80 °C 31,73±2,39 < NWG < NWG < NWG
Eischnee Luft,
80 °C + simul. Verd.b 30,82±3,36 0,13±0,03d < NWG < NWG
Eischnee O2, 80 °C 32,96±4,70 < NWG < NWG < NWG
Eischnee O2,
80 °C + simul. Verd.b 34,46±5,38 0,21±0,04 < NWG < NWG
a alle Fleischproben enthalten eine Ausgangskonzentration von 60 mg/kg Guajakol, 100 mg/kg ASC und 1,66 %
Nitritpökelsalz (0,9 % NaNO2, entspr. 150 mg/kg NaNO2 in der Fleischprobe); b Fleischproben nach Erhitzen
auf 80 °C (45 min) und simulierter Verdauung (Salzsäure + Pepsin, 40 °C, 1 h); c Konzentration in 5-
Nitroguajakoläquivalenten; d Wert liegt zwischen Nachweis- und Bestimmungsgrenze (siehe Tab. 6 in Kap.
3.4.1.4.); < NWG : Wert liegt unterhalb der Nachweisgrenze (siehe Tab. 6 in Kap. 3.4.1.4.)
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8. Anhang
143
3. Gehalte an Syringol und seinen Oxidationsprodukten in Fleischproben mit
unterschiedlichen NaNO2-Konzentrationen
Konzentration Analyt in mg/kg
(Mittelwert ± Standardabweichung)
Fleischprobe mit
unterschiedlichen
Nitritkonzentrationena
Syringol Nitrososyringol c Nitrosyringol c 3,3′,5,5′-
Tetramethoxy-
1,1′-biphenyl-
4,4′-diol d
75 mg/kg NaNO2, 80 °Ce 66,56 ± 3,55 < NWG < NWG 2,75 ± 0,82
75 mg/kg NaNO2,
80 °C + simul. Verd.b,f 59,78 ± 3,63 0,11 ± 0,06g 0,08 ± 0,02g 60,29 ± 11,11
150 mg/kg NaNO2, 80 °Ce 57,19 ± 1,33 < NWG < NWG 2,75 ± 0,88
150 mg/kg NaNO2,
80 °C + simul. Verd.b,f 50,36 ± 9,12 0,13 ± 0,02g 0,21 ± 0,05 167,18 ± 25,07
400 mg/kg NaNO2, 80 °Ce 51,92 ± 3,89 < NWG < NWG 1,66 ± 0,38
400 mg/kg NaNO2,
80 °C + simul. Verd.b,f 14,40 ± 2,70 0,46 ± 0,04 2,27 ± 0,28 662,25 ± 61,87
150 mg/kg NaNO2,
80 °C + simul. Verd.b,e und
Lagerung (7 °C, 7 Tage)
37,60 ± 7,75 0,14 ± 0,02g 0,34 ± 0,13 286,04±117,74
a alle Fleischproben enthalten eine Ausgangskonzentration von 100 mg/kg Syringol und 100 mg/kg ASC; b
Fleischproben nach Erhitzen auf 80 °C (45 min) und simulierter Verdauung (Salzsäure + Pepsin, 40 °C, 1 h); c
Konzentration in 5-Nitroguajakoläquivalenten; d Konzentration in Syringoläquivalenten; e n = 6; f n = 4; g Wert
liegt zwischen Nachweis- und Bestimmungsgrenze (siehe Tab. 6 in Kap. 3.4.1.4.)
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8. Anhang
144
4. Gehalte an Syringol und seinen Oxidationsprodukten in Fleischproben mit
Zusatz von Eiklar bzw. Eischnee
Konzentration Analyt in mg/kg
(Mittelwert ± Standardabweichung, n = 6)
Fleischprobea mit Zusatz
von Eiklar/ Eischnee
Syringol Nitrososyringolc Nitrosyringolc 3,3′,5,5′-
Tetramethoxy-
1,1′-biphenyl-
4,4′-diold
Eiklar, 80 °C 65,08±4,70 < NWG < NWG 13,78±1,77
Eiklar, 80 °C + simul.
Verd.b 53,01±13,49 0,08±0,04e 0,18±0,03 113,36±25,70
Eischnee Luft, 80 °C 58,96±2,77 < NWG < NWG 14,23±3,64
Eischnee Luft,
80 °C + simul. Verd.b 51,92±3,79 0,21±0,06 0,37±0,13 236,68±73,08
Eischnee O2, 80 °C 53,43±3,59 < NWG < NWG 4,86±1,95
Eischnee O2,
80 °C + simul. Verd.b 47,49±4,52 0,21±0,07 0,38±0,16 256,27±79,00
a alle Fleischproben enthalten eine Ausgangskonzentration von 100 mg/kg Syringol, 100 mg/kg ASC und 1,66 %
Nitritpökelsalz (0,9 % NaNO2, entspr. 150 mg/kg NaNO2 in der Fleischprobe); b Fleischproben nach Erhitzen
auf 80 °C (45 min) und simulierter Verdauung (Salzsäure + Pepsin, 40 °C, 1 h); c Konzentration in 5-
Nitroguajakoläquivalenten; d Konzentration in Syringoläquivalenten; e Wert liegt zwischen Nachweis- und
Bestimmungsgrenze (siehe Tab. 6 in Kap. 3.4.1.4.)
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9. Abbildungsverzeichnis
145
9. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Bildung von Syringol und Guajakol während des pyrolytischen Ligninabbaus
(mod. nach WITTKOWSKI (1985)) .......................................................................................... 8
Abbildung 2 Mesomeriestabilisierung eines Phenols durch die phenolische Hydroxygruppe
(nach ZEECK et al. (2005)) ..................................................................................................... 10
Abbildung 3 Radikalkettenabbruch durch Phenoxyradikale (nach BARCLAY et al. (1997))12
Abbildung 4 Radikalische Dimerisierung eines Phenols durch C-C bzw. C-O Kopplung in
saurem und basischem wässrigem Reaktionsmedium (mod. nach KOBAYASHI u.
HIGASHIMURA (2003) und SUN et al. (2010)) .................................................................... 21
Abbildung 5 Strukturformel des Syringoldimers 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-
diol und seines Chinons 3,3′,5,5′-Tetramethoxydiphenochinon (nach ADELAKUN et al.
(2012) und BETTS u. KING (1991)) ....................................................................................... 22
Abbildung 6 Umsetzung von HNO2 im sauren Milieu ........................................................... 25
Abbildung 7 Redoxreaktion der Ascorbinsäure mit Nitrit (TERNES 2008) .......................... 28
Abbildung 8 Mechanismus für die inhibitorsche Wirkung von Ascorbinsäure auf die
Nitrosaminbildung durch nitrosierende Stickoxide im offenen, aeroben System (mod. nach W.
R. LICHT et al. (1988)) ............................................................................................................ 29
Abbildung 9 Extraktionsschema für die Methoxyphenole und ihre Oxidationsprodukte aus
der Fleischmatrix ...................................................................................................................... 40
Abbildung 10 Beispiel für eine Kalibriergerade von Guajakol unter den für die
Pökellakeproben verwendeten HPLC-UV/VIS-Bedingungen (272 nm) ................................. 43
Abbildung 11 Beispiel für eine Kalibriergerade von 5-Nitroguajakol unter den für die
Pökellakeproben verwendeten HPLC-UV/VIS-Bedingungen (272 nm) ................................. 44
Abbildung 12 Beispiel für eine Kalibriergerade von 5-Nitroguajakol unter den für die
Fleischextrakte verwendeten HPLC-UV/VIS-Bedingungen (330 nm) .................................... 44
Abbildung 13 Schema des Gradientensystems für die Elution der Methoxyphenole Syringol,
Guajakol, 4-Methylsyringol, 4-Methylguajakol, 5-Nitroguajakol und 2-Nitroso-5-
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9. Abbildungsverzeichnis
146
methoxyphenol mittels HPLC-ESI-MS (Eluent A: Wasser/Acetonitril (90:10, v/v), Eluent B:
Wasser/Acetonitril (50:50, v/v), enthalten jeweils Ammoniumhydrogencarbonat
(n = 0,01 mol/L)) ...................................................................................................................... 53
Abbildung 14 HPLC-ESI-MS-Chromatogramm (TIC-Modus) von 2-Nitroso-5-
methoxyphenol (m/z 152) (I), Syringol (m/z 153) (II), Guajakol (m/z 123) (III), 5-
Nitroguajakol (m/z 168) (IV), 4-Methylsyringol (m/z 167) (V) und 4-Methylguajakol
(m/z 137) (VI) im negativen Ionenmodus [M-H]- .................................................................... 57
Abbildung 15 UV/VIS-Spektren von Syringol, 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′- . 60
Abbildung 16 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von Nitrososyringol (I), Syringol (II),
Nitrosyringol (III), 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (IV), einem nicht
identifizierten Oxidationsprodukt (uv), 4-Methylguajakol (als interner Standard, IS) und
einem Matrixpeak (M) aus der Pökellake (enthielt 200 mg/L Syringol
(Ausgangskonzentration), 500 mg/L Ascorbinsäure und 150 mg/L NaNO2) nach Reaktion bei
pH 3 bei 272 nm (A); Fleischextrakt (enthielt 100 mg/kg Syringol (Ausgangskonzentration),
100 mg/kg Ascorbinsäure und 150 mg/kg NaNO2) nach simulierter Verdauung bei 272 nm
(B) und der gleiche Fleischextrakt gemessen bei 330 nm (C) ................................................. 61
Abbildung 17 Massenspektren des Molekülions von Nitrososyringol (isoliert aus der
Pökellake (100 mg/L ASC sd)) mit m/z 182 (A) und seines Fragmentions mit m/z 167 (B)
detektiert mit ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des Molekülions
von Nitrososyringol mit m/z 183 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C) ........................................ 63
Abbildung 18 Massenspektren des Molekülions von Nitrosyringol (isoliert aus der Pökellake
(100 mg/L ASC sd)) mit m/z 198 (A) und seines Fragmentions mit m/z 183 (B) detektiert mit
ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des Molekülions von
Nitrosyringol mit m/z 199 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C) ................................................... 64
Abbildung 19 Massenspektren des Molekülions von 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-
4,4′-diol (isoliert aus der Fleischprobe (400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit
m/z 305 (A) und seines Fragmentions mit m/z 290 (B) detektiert mit ESI-MS im negativen
Ionenmodus ([M-H]-); Massenspektrum des Molekülions von 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-
biphenyl-4,4′-diol mit m/z 306 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C) ........................................... 65
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9. Abbildungsverzeichnis
147
Abbildung 20 Mikroskopische Aufnahme der in der Pökellake gebildeten Kristalle aus
3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol (56-fache Vergrößerung) ............................... 67
Abbildung 21 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von 6-Nitrosoguajakol (a), Guajakol (b), 4-
Nitroguajakol (c), 6-Nitroguajakol (d), 4-Methylguajakol (als interner Standard, IS) und
einem Matrixpeak (M) aus der Pökellake (enthielt 200 mg/L Guajakol
(Ausgangskonzentration), 500 mg/L Ascorbinsäure und 150 mg/L NaNO2) nach Reaktion bei
pH 3 bei 272 nm (A); Fleischextrakt (enthielt 60 mg/kg Guajakol (Ausgangskonzentration),
100 mg/kg Ascorbinsäure und 400 mg/kg NaNO2) nach simulierter Verdauung bei 272 nm
(B) und der gleiche Fleischextrakt gemessen bei 330 nm (C) ................................................. 68
Abbildung 22 UV/VIS-Spektren von Guajakol, 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-
Nitroguajakol ............................................................................................................................ 69
Abbildung 23 Massenspektrum des Molekülions von 6-Nitrosoguajakol (isoliert aus der
Fleischprobe (400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit m/z 152 detektiert mit
ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-) (A); Massenspektrum des Molekülions von 6-
Nitrosoguajakol mit m/z 153 detektiert mit GC-MS ([M]+) (B) .............................................. 71
Abbildung 24 Massenspektren des Molekülions von 4-Nitroguajakol (isoliert aus der
Fleischprobe (400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit m/z 168 (A) und seines
Fragmentions mit m/z 153 (B) detektiert mit ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-);
Massenspektrum des Molekülions von 4-Nitroguajakol mit m/z 169 detektiert mit GC-MS
([M]+) (C) ................................................................................................................................. 72
Abbildung 25 Massenspektren des Molekülions von 6-Nitroguajakol (isoliert aus der
Fleischprobe (400 mg/kg NaNO2, nach simulierter Verdauung) mit m/z 168 (A) und seines
Fragmentions mit m/z 153 (B) detektiert mit ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-);
Massenspektrum des Molekülions von 6-Nitroguajakol mit m/z 169 detektiert mit GC-MS
([M]+) (C) ................................................................................................................................. 73
Abbildung 26 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von 4-Methylguajakol (4-MG), 4-
Methylsyringol (als interner Standard, IS), einem Matrixpeak (M) und zwei
Oxidationsprodukten von 4-Methylguajakol (PL 1, F 1) aus der Pökellake (enthielt 200 mg/L
4-Methylguajakol (Ausgangskonzentration), 100 mg/L Ascorbinsäure und 150 mg/L NaNO2)
nach Reaktion bei pH 3 bei 272 nm (A); Fleischextrakt (enthielt 60 mg/kg 4-Methylguajakol
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9. Abbildungsverzeichnis
148
(Ausgangskonzentration), 100 mg/kg Ascorbinsäure und 400 mg/kg NaNO2) nach simulierter
Verdauung bei 272 nm (B) ....................................................................................................... 74
Abbildung 27 Massenspektren des Molekülions von PL 1 mit m/z 182 (A) und seines
Fragmentions mit m/z 167 (B) detektiert mit ESI-MS im negativen Ionenmodus ([M-H]-);
Massenspektrum des Molekülions von PL 1 mit m/z 183 detektiert mit GC-MS ([M]+) (C) .. 75
Abbildung 28 Massenspektren des Molekülions von F 1 mit m/z 182 detektiert mit ESI-MS
im negativen Ionenmodus ([M-H]-) (A); Massenspektrum des Molekülions von F 1 mit
m/z 153 detektiert mit GC-MS ([M]+) (B) ............................................................................... 76
Abbildung 29 HPLC-UV/VIS-Chromatogramm von 4-Methylsyringol (4-MS), 4-
Methylguajakol (als interner Standard, IS), Matrixpeak (M) und Oxidationsprodukten von 4-
Methylsyringol (QL 1/ QL 2/ QL 3/QL 4, R 1/R 2) aus der Pökellake (enthielt 200 mg/L 4-
Methylsyringol (Ausgangskonzentration), 100 mg/L Ascorbinsäure und 150 mg/L NaNO2)
nach Reaktion bei pH 3 bei 272 nm (A); Fleischextrakt (enthielt 100 mg/kg 4-Methylsyringol
(Ausgangskonzentration), 100 mg/kg Ascorbinsäure und 400 mg/kg NaNO2) nach simulierter
Verdauung bei 272 nm (B) ....................................................................................................... 77
Abbildung 30 UV/VIS-Spektren des Oxidationsproduktes „uv“ von Syringol aus der
Pökellake und des Oxidationsproduktes QL 2 von 4-Methylsyringol aus der Pökellake ........ 79
Abbildung 31 Gehalte an Syringol, Nitrososyringol, Nitrosyringol und der nicht
identifizierten Verbindung “uv” in auf 80 °C erhitzten Pökellaken und Pökellaken, deren pH
anschließend mit Salzsäure auf 3 eingestellt und die für 1 h auf 40 °C erwärmt wurden (sd).
Die Pökellaken enthielten 200 mg/L Syringol (Ausgangskonzentration), 150 mg/L NaNO2
und 100 mg/L oder 500 mg/L Ascorbinsäure (ASC). (Mittelwerte ± SD, n = 6).
Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen signifikant unterschiedliche Gehalte derselben
Substanz in den verschiedenen Pökellaken (P < 0,05). (Die Gehalte der nicht identifizierten
Substanz “uv” wurden nicht auf signifikante Unterschiede überprüft.) (vgl. auch
Messwerttabellen im Anhang unter 8.10) ................................................................................ 86
Abbildung 32 Voltammogramme von Syringol, Nitrosyringol und Nitrososyringol (Intervall:
50 mV, n = 1); Halbstufenpotentiale von Syringol (577 mV), Nitrososyringol (938 mV) und
Nitrosyringol (767 mV) berechnet mit nicht-linearer Regression nach Bildung des
dekadischen Logarithmus von U (GraphPad.Prism® 6.0 Software) ........................................ 89
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9. Abbildungsverzeichnis
149
Abbildung 33 Gehalte an Syringol, 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol,
Nitrososyringol und Nitrosyringol in erhitzten (80 °C) Fleischproben, denen jeweils
100 mg/kg Syringol, 100 mg/kg Ascorbinsäure und unterschiedliche Konzentrationen an
NaNO2 bzw. Sauerstoff zugesetzt wurden (A) und in den gleichen Proben nach deren
simulierter Verdauung (B und C). Die Proben enthielten weiterhin: 75 mg/kg NaNO2 (I/Ia),
150 mg/kg NaNO2 (II/IIa), 400 mg/kg NaNO2 (III/IIIa), 150 mg/kg NaNO2 und Eiklar
(IV/IVa), 150 mg/kg NaNO2 und Eischnee (Luft) (V/Va), 150 mg/kg NaNO2 und Eischnee
(O2) (VI/VIa). Unterschiedliche Buchstaben oberhalb einer Substanz innerhalb einer
Versuchsgruppe (verschiedene NaNO2-Gehalte (I(a)-III(a)); verschiedene Eiklar- bzw.
Eischneezusätze (IV(a)-VI(a))) kennzeichnen signifikant unterschiedliche Gehalte derselben
Substanz innerhalb dieser Gruppe (P < 0,05). (Mittelwerte ± SD, I-VI und IVa-VIa (n = 6), Ia-
IIIa (n = 4)). * Werte liegen zwischen Nachweis- und Bestimmungsgrenze (siehe Tab. 6 in
Kap. 3.4.1.4.). (vgl. auch Messwerttabellen im Anhang unter 8.11.) ...................................... 91
Abbildung 34 Gehalte an Guajakol, 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol
in auf 80 °C erhitzten Pökellaken und Pökellaken, deren pH anschließend mit Salzsäure auf 3
eingestellt und die für 1 h auf 40 °C erwärmt wurden (sd). Die Pökellaken enthielten
200 mg/L Guajakol (Ausgangskonzentration), 150 mg/L NaNO2 und 100 mg/L oder
500 mg/L Ascorbinsäure (ASC). (Mittelwerte ± SD, n = 6). Unterschiedliche Buchstaben
kennzeichnen signifikant unterschiedliche Gehalte derselben Substanz in den verschiedenen
Pökellaken (P < 0,05). (vgl. auch Messwerttabellen im Anhang unter 8.10) .......................... 96
Abbildung 35 Voltammogramme von 4-Nitrosophenol, Phenol, 2-Nitrophenol und 4-
Nitrophenol (A); Guajakol, 6-Nitroguajakol, 6-Nitrosoguajakol und 4-Nitroguajakol (B) und
Syringol, Nitrosyringol und Nitrososyringol (Intervall: 50 mV, n = 1); Halbstufenpotentiale
von Phenol (1114 mV), 4-Nitrosophenol (939 mV), 2-Nitrophenol (1201 mV), 4-Nitrophenol
(1241 mV), Guajakol (706 mV), 6-Nitroguajakol (854 mV), 6-Nitrosoguajakol (916 mV), 4-
Nitroguajakol (949 mV), Syringol (577 mV), Nitrosyringol (767 mV) und Nitrososyringol
(938 mV) berechnet mit nicht-linearer Regression nach Bildung des dekadischen Logarithmus
von U (GraphPad.Prism® 6.0 Software)................................................................................... 98
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10. Tabellenverzeichnis
150
10. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 Merkmale verschiedener Räucherverfahren (modifiziert nach TERNES et al. (2005)
.................................................................................................................................................... 6
Tabelle 2 Gehalte von Guajakol und Guajakolderivaten sowie Syringol und Syringolderivaten
im Räucherrauch verschiedener Hart- und Weichholzarten (a KJÄLLSTRAND et al. (2000); b
KJÄLLSTRAND u. PETERSSON (2001a)) ............................................................................. 9
Tabelle 3 Strukturformeln und pKS-Werte (a RAGNAR et al. (2000)) vier wichtiger
Methoxyphenole des Räucherrauches ...................................................................................... 10
Tabelle 4 Gehalte an Guajakol, 4-Methylguajakol und Syringol, sowie der
Gesamtphenolgehalt (Summe der Gehalte an Guajakol, 4-Methylguajakol, Syringol, Eugenol
und trans-Isoeugenol) in geräucherten Minisalamis und Brühwürstchen in Abhängigkeit von
der Holzart und dem bei der Wurstherstellung verwendeten Darmtyp (a :HITZEL et al.
(2013b);b :PÖHLMANN et al. (2013b)) .................................................................................. 16
Tabelle 5 HPLC-Bedingungen für die Analyse der Pökellake bzw. des Fleischextraktes ...... 42
Tabelle 6 Nachweisgrenzen (NG) und Bestimmungsgrenzen (BG) der Methoxyphenole in
den Pökellaken und in den Fleischproben nach dem Erhitzen auf 80 °C; HPLC-Bedingungen
siehe Kap. 3.4.1.1.; a NG und BG bestimmt bei 272 nm; b NG und BG bestimmt bei 330 nm 47
Tabelle 7 HPLC-ESI-MS Bedingungen für die chromatographische Trennung und
massenspektrometrische Detektion von Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol, 4-
Methylguajakol, 5-Nitroguajakol und 2-Nitroso-5-methoxyphenol mittels HPLC-ESI-MS... 52
Tabelle 8 Molekülionen und Fragmente von Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-
Methylguajakol detektiert mit LC-ESI-MS und GC-MS ......................................................... 58
Tabelle 9 Retentionszeiten (HPLC-UV/VIS) und Molekülionen/Fragmente (LC-ESI-MS und
GC-MS) der aus der Pökellake bzw. aus dem Fleischextrakt isolierten Oxidationsprodukte
von 4-Methylsyringol, die Bezeichnung der Oxidationsprodukte sowie ihre Retentionszeiten
beziehen sich auf die HPLC-UV/VIS-Chromatogramme in Abbildung 29 ............................. 78
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10. Tabellenverzeichnis
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Tabelle 10 Wiederfindungsraten (WFR) der Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-
Methylsyringol und 4-Methylguajakol sowie der Oxidationsprodukte von Syringol und
Guajakol aus der Fleischmatrix ................................................................................................ 82
Tabelle 11 Bildung eines Niederschlages aus 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol-
Kristallen in Pökellaken unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen ............................... 85
Tabelle 12 Gehalte an Guajakol, 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol in
den Fleischproben (vgl. auch Messwerttabellen im Anhang unter 8.11.) .............................. 100
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11. Danksagung
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11. Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Professor Dr. W. Ternes für die intensive fachliche
Betreuung und Beratung sowie für seine vertrauensvolle Unterstützung.
Des Weiteren möchte ich mich beim gesamten Arbeitskreis Chemische Analytik und im
Besonderen bei Frau Dr. Astrid Drotleff für ihre fachlichen Ratschläge und bei Frau Jutta
Barras-Akhnoukh, Frau Julia Hausmann und Herrn Alexander Krybus für ihre
Hilfsbereitschaft und freundschaftliche Zusammenarbeit bedanken.
Von ganzem Herzen danke ich meiner Mutter Anneliese und meinem Mann Lars, die stets an
mich geglaubt haben und auch in schwierigen Phasen immer für mich da waren und ohne
deren Unterstützung diese Arbeit wahrscheinlich nie zustande gekommen wäre.
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