Thermische Auffaltung von Myoglobin Optische Verfahren · 4 Optische Rotationsdispersion und...
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Thermische Auffaltung von Myoglobin
Optische Verfahren
Thomas Riedel
Philipp Wölte
25.05.05
Apparative Methoden
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Überblick
• Grundlagen der Optischen Rotationsdispersion und des Circulardichroismus
• Grundlagen der Fluoreszenzspektroskopie
• Anwendung dieser Optischen Methoden auf Myoglobin
Apparative Methoden
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Grundlagen der Optischen
Rotationsdispersion und des Circulardichroismus
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Allgemeines zum natürlichen Licht
– elektromagnetische Wellen verschiedener Wellenlängen
– elektrische und magnetische Feldvektoren isotrop im Raum verteilt
– elektrischer und magnetischer Feldvektor stehen senkrecht aufeinander
– überlagerte Transversalwellen in verschiedenen Ebenen
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Linear polarisiertes Licht
– elektrischer Feldvektor schwingt nur in einer Ebene mit einer Wellenlänge
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Linear polarisiertes Licht
– Kann aus zwei linear polarisierten Wellen dargestellt werden
• Feldvektoren senkrecht aufeinander
• Schwingung mit gleicher Wellenlänge
• Schwingung in gleicher Phase
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Linear polarisiertes Licht
– Addition zweier in gleicher Phase schwingender Wellen:
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Linear polarisiertes Licht
aus Vektoraddition ergibt sich:
linear polarisiertes Licht in anderer Ebene:
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Linear polarisiertes Licht
– Erzeugung aus isotropen Licht durch Polarisationsfilter:
• Filter besteht aus Kunststoffolie mit eingelagerten dichroitischen Kristallen
• doppeltgebrochenes Licht kann nur in einer Orientierung durchtreten
• Licht in der anderen Orientierung wird absorbiert
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Linear polarisiertes Licht
– kann aus zwei linear polarisierten Wellen dargestellt werden
• Feldvektoren senkrecht aufeinander
• Schwingung in gleicher Phase
– kann auch aus zwei circular polarisierten Wellen entgegengesetzter Drehrichtung dargestellt werden
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Circular polarisiertes Licht
– aus zwei linear polarisierten Wellen
• Feldvektoren senkrecht aufeinander
• Schwingung mit gleicher Wellenlänge/Amplitude
• phasenverschoben um 90°( λ/4 )
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Circular polarisiertes Licht
– Addition zweier um 90°-phasenverschobener Wellen liefert:
• rechtscircular polarisiertes Licht– in Ausbreitungsrichtung blickend im Uhrzeigersinn
• linkscircular polarisiertes Licht– in Ausbreitungsrichtung blickend gegen Uhrzeigersinn
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
-rechtscircular polarisiert:
-linkscircular polarisiert:
mit Uhrzeigersinn
gegen Uhrzeigersinn
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Circular polarisiertes Licht
– Erzeugung durch das λ/4-Plättchen:
• x- und y-Komponente eines linear polarisierten Lichts werden unterschiedlich stark gebrochen
� Phasenverschiebung um 90°
Eine Komponente gewinnt bei Durchtritt durch das λ/4-Plättchen zeitlichen Vorsprung ∆t
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Optische Rotationsdispersion (ORD)
– Physikalisches Prinzip:
• unterschiedliche Brechungsindices in optisch aktiven (chiralen) Substanzen
• unterschiedliche Winkelgeschwindigkeiten für links- und rechtscircular polarisiertes Licht
• zeitlicher Vorsprung einer circular polarisierten Komponente nach Austritt aus der Substanz
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Optische Rotationsdispersion
– Situation nach Austritt zweier circular polarisierter Wellen gleicher Amplitude aus einem optisch aktiven Medium
Änderung der Polarisationsebene um den Drehwinkel α
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Optische Rotationsdispersion
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Optische Rotationsdispersion– um α als spezifische Stoffkonstante angeben zu
können, bezieht man sich:• auf die Konzenration [c]
• auf die Schichtdicke d der Probe
– Angabe von Drehwert [α] explicit mit Temperatur und Wellenlänge
– Drehwert:
– bei Polymeren:
[ ]T
c dλ
αα =
⋅
3deg cm
g dm
⋅
⋅
[ ] [ ]T T MRWm MRW
c dλ λ
αα
⋅= ⋅ =
⋅
2deg cm
dmol
⋅
MRW: „mean residue weight“ (mittlere Molmasse)
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Circulardichroismus (CD)
– Physikalisches Prinzip:
• zusätzlicher Effekt zur ORD
• ungleiche Absorption von links- und rechtscircularpolarisierten Licht durch optisch aktive Moleküle
• unterschiedliche Extinktionskoeffizienten (ε) der optisch aktiven Substanz bezüglich den links- und rechtscircularpolarisierten Wellen (εl≠εr)
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Circulardichroismus
– Situation nach Austritt zweier circular polarisierter Wellen aus einem optisch aktiven Medium:
ungleiche Amplitude
Elliptizität Θ bei Austritt aus einem optisch aktiven Medium
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Circulardichroismus
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Circulardichroismus
– Elliptizität ist definiert als der Arcus-Tangens des Verhältnisses von kleiner Halbachse (b) zu großer Halbachse (a)
arctanb
aΘ =
b
aΘ =
,da b<<atan Θ = Θ
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Circulardichroismus
– In Analogie zur ORD:
• spez. Elliptizität:
• Bei Polymeren:
2deg cm
dmol
⋅
2deg cm
dmol
⋅
:g
cmol
MRE: „mean residue ellipticity“
MRW: „mean residue weight“ (mittlere Molmasse)
[ ]T
c dλ
ΘΘ =
⋅
[ ]T
MRW
MRWMRE
c dλ
⋅Θ= Θ =
⋅
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Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
• Schematischer Aufbau eines CD-Spektrometers:
L: Xenon-Lichtquelle
MC: Monochromator
P: Polarisator
Mod: Modulator
PR: Probenraum
PM: Photomultiplier
S: CD-Spektrum der Substanz
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Grundlagen der Fluoreszenzspektroskopie
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Fluoreszenzspektroskopie
• Fluoreszenz:
– Emission von Licht, die nur solange auftritt, wie die fluoreszierenden Moleküle durch Lichtabsorption angeregt werden
– fluoreszierende Moleküle werden Fluorophoregenannt
• in Proteinen: Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin
– Fluorophore absorbieren Licht spezifischer Wellenlänge für das jeweilige Molekül
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Fluoreszenzspektroskopie
• Morsepotential
– für r � 0:
• E �∞
– für r �∞:
• E � Dissoziations-grenze
– Gleichgewichtsabstand (r0)
Dissoziation
Abstoßung Anziehung
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Fluoreszenzspektroskopie
• Quantelung der Energie
Schrödingergleichung:
1
2n
E h nν
= ⋅ ⋅ +
H EΨ = Ψ
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Fluoreszenzspektroskopie
• Quantelung der Energie
Schrödingergleichung:
Aufenthaltswahrscheinlichkeit:(„Born´sche Interpretation“)
(„Korrespondenzprinzip“)
1
2n
E h nν
= ⋅ ⋅ +
H EΨ = Ψ
*Ψ ⋅Ψ
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Fluoreszenzspektroskopie
• Erster elektronisch angeregter Zustand (S1)
– um ∆E erhöhte Energie
– um ∆r erhöhter Gleichgewichtsabstand (r1) aufgrund einer größeren Elektronenwolke
∆∆∆∆E
∆∆∆∆r
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Fluoreszenzspektroskopie
• Licht aus UV-Vis-Bereich wird vom Molekül mit spezifischer Wellenlänge absorbiert
• Elektronischer Übergang (Absorption nach „Franck-Condon“)
– S0 � S1
– gleichzeitige Anregung von Schwingungen
• Anteile der Schwingungsenergie können durch WW an Umgebungs-molekülen (z.B. Lösungsmittel) übertragen werden
• gelangt strahlungslos in den elektronisch angeregten Schwingungsgrundzustand
• Elektronischer Übergang unter Lichtemission („Franck-Condon“)
– S1 � S0
Absorption Emission
Schwingung
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Fluoreszenzspektroskopie
Absorption Emission
• Licht aus UV-Vis-Bereich wird vom Molekül mit spezifischer Wellenlänge absorbiert
• Elektronischer Übergang (Absorption)
– S0 � S1
– gleichzeitige Anregung von Schwingungen
• Anteile der Schwingungsenergie können durch WW an Umgebungs-molekülen (z.B. Lösungsmittel) übertragen werden
• gelangt strahlungslos in den elektronisch angeregten Schwingungsgrundzustand
• Elektronischer Übergang unter Lichtemission
– S1 � S0
• Emissionswellenlänge immer größer als Anregungswellenlänge
Schwingung
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Fluoreszenzspektroskopie
• Schema eines Fluoreszenzspektrometers
Fluoreszenzemission wird im 90°Winkel zur Ausbreitungsrichtung des Anregungsstrahls gemessen
Monochromatisierung des Lichtes
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Anwendung dieser Optischen Methoden auf Myoglobin
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Versuch
• Strukturen der Proteine
Primärstruktur (AS-Sequenz)
Sekundärstruktur(α-Helix; β-Faltblatt)
Tertiärstruktur(räumliche Anordnung)
Quatärstruktur
(Proteinkomplex)
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Versuch
• Strukturen der Proteine
Sekundärstruktur(α-Helix; β-Faltblatt)
Tertiärstruktur(räumliche Anordnung)
Fluoreszenzspektroskopie
CD-Spektroskopie
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Versuch
• Untersuchung der thermischen Auffaltung von Proteinen
• Annahme: 2-Zustands-Modell
entweder:
– Nativ (biologisch funktionsfähig) N
oder:
– Denaturiert (biologisch inaktiv) D
DK
N=
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Versuch
• Anwendung dieser Methoden auf Myoglobin
• Myoglobin:
– Protein (Biopolymer) besitzt Chiralitätszentren
• chirales α-C-Atom
• axiale Chiralität (α-Helix, β-Faltblatt)
Optische Aktivität
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Versuch
• Optische Aktivität
[ ]Θ
Effekt ORD und CD stets gekoppelt
[ ]α
Versuch zur Bestimmung der Sekundärstruktur
40
Versuch
• Nativer Zustand
– Im N-Zustand ist Signal Θ relativ groß, da:
• Großteil optisch aktiver C-Atome in chiraler Umgebung
• Optisch aktive C-Atome räumlich nah beieinander
– unterschiedlich starke Absorption von links- und rechtcircular polarisiertem Licht
Starkes Signal
41
Versuch
• Denaturierter Zustand
– Im D-Zustand ist Signal Θ relativ klein, da:
• asymmetrische Umgebung geht verloren
– „random coil“
• Optisch aktive C-Atome räumlich weit voneinander entfernt
Schwaches Signal
42
Versuch
• Versuchsdurchführung:
– Bei der CD-Spektroskopie werden mit steigender Temperatur Werte für Θ gemessen
• Ausnutzung des Effektes, dass durch Verlust der Sekundärstruktur (Zerstörung von α-Helix und β-Faltblatt) die optische Aktivität verringert wird
43
Versuch
• Auswertung der CD-Messwerte
– Wellenlänge: 222 nm
– Fitten der Parameter: DK
N=
1m
DT K
N→ = =
( )m
H Steigung beiT°∆
( )p
C Krümmung der Kurve∆
Tm
44
-15
-10
-5
0
5
10
15
270 280 290 300 310 320 330 340 350
T [K]
∆∆ ∆∆G
° [k
J/m
ol]
Versuch
• Auswertung der CD-Messwerte
• Stabilitätsgleichung:
( )( ) ( ) ln
( )
mp m m
m m m
H T TG T C T T T T
T T T T
°°
∆∆ = + ∆ ⋅ − − ⋅ ⋅ −
Tm‘
(282K)
Tm
(334K)
}
}
Nativ
Denaturiert
45
Versuch
• Auswertung der CD-Messwerte
– Protein zwischen Tm‘ und Tm stabil
– Im Maximum der Stabilitätskurve ist das Gleichgewicht am weitesten auf der nativen Seite
• entspricht Körpertemperatur des Menschen
• Optimaler Wirkungsgrad
46
Versuch
• Versuchsdurchführung:
– bei der Fluoreszenz wird mit steigender Temperatur die Lichtemission gemessen
• Ausnutzung des Effektes, dass durch Verlust der Tertiärstruktur (Zerstörung der räumlichen Anordnung) vermehrt Schwingungsenergie auf Umgebungsmoleküle (Lösungsmittel) übertragen werden kann und das Signal der Fluoreszenz verringert wird
47
Versuch
• Analog zur CD:– fitten der Kurve
• Werte für ∆H°und ∆Cpentsprechen denen der CD-Spektroskopie
• Tm um ~6K höher• gleiche
Messbedingungen– Gleichgewichtsreaktion– Druck
Auswertung der Fluoreszenz-Messwerte:
Werte vergleichbar
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Versuch
• Vergleich der beiden Stabilitätskurven
temperaturabhängige Stabilitätskurve
-15
-10
-5
0
5
10
15
270 280 290 300 310 320 330 340 350 360
T [K]
DG
° [k
J/m
ol]
CD-Spektroskopie
Fluoreszenz-Spektroskopie
nicht identisch
49
Versuch
• Vergleich von CD- und Fluoreszenz-Spektroskopie:
– unterschiedliche Werte für Tm (~ 6 K Abweichung)
– 2-Zustands-Modell beschreibt die thermische Denaturierung von Myoglobin nicht korrekt
neues Modellsystem mit Zwischenstufe
N ZS D↔ ↔
50
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