Thema: Eukaryotische Genregulation und...
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Thema: Eukaryotische
Genregulation und RNA-
Prozessierung
Spleißen, Capping, Polyadenylierung,
RNA-Editieren
Erwin R. Schmidt
11. 01. 2013
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Worin unterscheiden sich die Gene bzw.
die Genprodukte von Eukaryoten und Prokaryoten?
Prokaryoten Eukaryoten
Keine Introns (i. d. Regel) Exon-Intron-Struktur (i. d.
Regel)
Gene in Operons Keine Operons*
mRNA polycistronisch mRNA monocistronisch*
Nur eine RNA-Polymerase 3(4) RNA-Polymerasen
Shine-Dalgarno Sequenz Capping
Keine Polyadenylierung Polyadenylierung (i. d. Regel)
Transkription + Translation
simultan
Transkription +Translation
zeitl. u. räumlich getrennt
Kein Chromatin Gene in Chromatin
* Ausnahme mikroRNAs
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Transkription der Gene im Zellkern(ZK) als
Primärtranskripte (hnRNA), Prozessierung der
RNA im ZK, reife mRNA und Translation im
Cytoplasma hnRNA: heterogene nukleäre RNA
mRNA: messenger RNA
DNA
hnRNA
mRNA
ZK
Cytoplasma
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Genstruktur der Eukaryoten
je nach Genklasse ist die Struktur verschieden:
1. RNA Pol I – Gene für 18S, 5,8S, 28S rRNA
2. RNA Pol II – Gene für alle mRNAs
3. RNA Pol III – Gene für tRNAs, 5S rRNA, einige snRNAs
4. RNA Pol IV mi/siRNAS
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RNA-Polymerase I-Gene sind
tandem-repetitiv organisiert
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Elektronenmiskropische Darstellung
der rDNA-Transkription durch RNA-Pol I
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RNA-Polymerase I Gene:
5,8
5,8 S
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RNA-Polymerase I Gene
• Promotor 5´stromaufwärts
• Primärtranskript enthält 18S, 5,8S und 28S rRNA sowie interne „spacer“ RNA
• Gene immer repetitiv vorhanden
• Gene in Gruppen („cluster“) tandemartig angeordnet (i. d. Regel „head to tail“)
• nur bei manchen Organismen:
„Gen-Amplifikation“( = zusätzliche, extrachromosomale Genkopien in speziellen Geweben)
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RNA Polymerase II Gene
Promotor
+1 -100
5´-
UTR
ATG
Intron1
GT AG
TAA
TGA
TAG
3´-
UTR
AATAAA A
DNA
Primär-
transkript
TA
TA
AA
-25
mRNA
Gm7 AUG AAUAAA
© ERS
Termination?
Poly A
UAA
UGA
UAG
Exon 1 Exon2
UTR = „untranslatierte Region“
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RNA – Polymerase II Gene
• 5-´stromaufwärts Promotor (oft TATA-Box bei -25)
• Intron – Exon – Struktur (i. d. Regel)
• Primärtranskript („hnRNA“) enthält 5´UTR, alle Exons und Introns, 3´- UTR
• Transkriptionsstart = +1, = „Cap-Site“
• An Intron/Exongrenzen „consensus splice sites“ (Exon/ GT..Intron..AG/Exon)
• Polyadenylierungssignal
• Termination oft ungenau definiert
• Regulation durch „Enhancer“
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RNA Pol II Promotorelemente
Sequenz: Position: Funktion
Name Sequenz Position Funktion
TATA-Box
Hogness-
Box
TATAAA -25 bis -30 Definiert
Transkript-
startpunkt
CAT-Box GGCCAATC -60 bis -80 Polymerase-
Bindung via
CBP
GC-Box GGGCG Variabel und
mehrfach
-1 bis -167
Definiert RNA-
Pol
Bindungstelle
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Regulierte und unregulierte Gene
„Luxusgene“ und „Haushaltsgene“
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Promotor Elemente RNA-Pol II
DPE: downstream promotor element
UCE: upstream control element
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Beispiele für eukaryotische Promotoren
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Aus Nature 424, 147 - 151 (10 July 2003); Transcription regulation and animal
diversity MICHAEL LEVINE* AND ROBERT TJIAN*†
ARC: activator recruited cofactor
CRSP: Cofactor required for SP1 activation
SWI/SNF: sucrose non fermenting factor
PBAF: Polybromo- and BRG1 (603254)-associated factor
DRE: DNA replication related element
WSTF: Williams Syndrome Transcription Factor
TRF: TBP-related factor
TAFs: TBP-associated factors
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An der Aktivierung von Pol II-Genen beteiligte
Komplexe
SAGA:Spt-Ada-Gcn5-Acetyltransferase
SRB: Suppressor of RNA-PolymeraseII
The multiprotein Mediator complex is a coactivator required for transcriptional
activation of
RNA polymerase II transcribed genes by DNA binding transcription factors.
Funktion= Chromatin-remodelling
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Die Kontrollregion bei Eukaryoten
kann sehr komplex sein
Aus:Nature 424, 147 - 151 (10 July 2003); Transcription regulation and animal diversity
MICHAEL LEVINE* AND ROBERT TJIAN*†
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Enhancer sind cis-regulatorische Kontrollelemente,
die unabhängig von ihrer Orientierung,
Lage oder Distanz zum Gen
die Aktivität eines Gens steigern können
Silencer Wirkungsweise wie negativer Enhancer,
setzt Genaktivität herab
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Typische Aktivatorproteine sind DNA-
Bindeproteine mit mehreren Domänen
• DNA-binde-Domäne
• Dimerisierungsdomäne
• Aktivatordomäne
• Liganden-binde-Domäne
DNA-Bindung Protein-Bindung Liganden-Bind. Aktivierung
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Hormon induzierte Genaktivität Beispiel für Genaktivierung durch externe Signale
Hsp90/Hsp70
FKBP52
GRE
GRE: Glucocorticoid-Response-Element
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Hormon induzierte Genaktivität Beispiel für Genaktivierung durch externe Signale
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Hormon-
regulation
von Genen
durch
Membran-
rezeptoren
und „second
messenger“
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Schema der eukaryotischen
Genregulation („loop“-Modell)
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Vergleich Prokaryoten - Eukaryoten
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Chromatin und Genaktivität
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Inaktives / Aktives Chromatin
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RNA-Polymerase I Gene
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Nach der Transkription:
„posttranskriptionelle“ Modifikationen
typisch für eukaryotische mRNA:
„Capping“, „Splicing“, Polyadenylierung,
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„Capping“ der mRNA
CH3 +
- - -
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Funktion der Cap-Struktur
• erhöht Stabilität der mRNA
• induziert Splicing
• fördert Export aus dem Nukleus
• vermittelt Bindung der Ribosomen an
mRNA und macht Translation möglich
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Poly-Adenylierung am 3´Ende der
mRNA
1. „Trimmen“ des Primärtranskripts an
definierter Stelle (23-24 Basen stromabwärts
des Poly A-Signals AAUAAA)
2. Anfügen von ca. 100-250 Adenin-Nukleotiden
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„Polyadenylierung“:
Trimmen der mRNA und Anhängen
von mehreren Adeninnukleotiden
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Die
Polyadenylierung
wird von einem
Enzymkomplex
aus mehreren
Enzymen erledigt
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Die Polyadenylierung ist ähnlich
komplex wie die Initiation! Aus: Strange bedfellows: polyadenylation factors at the promoter
Olga Calvo1 and James L. Manley, GENES & DEVELOPMENT 17:1321–1327 © 2003
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Funktion der Poly-
Adenylierung?
- Stabilität der mRNA
- Translatierbarkeit
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„Splicing“/Spleißen
• Intronabschnitte werden aus dem
Primärtranskript entfernt
• Die Exons werden miteinander zur
„funktionsfähigen“ RNA verbunden
• „funktionsfähig“ kann aber auch bedeuten,
dass ein nicht funktionsfähiges Protein
gebildet wird
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RNA Polymerase II Gene
Promotor
+1 -100
5´-
UTR
ATG
Intron1
GT AG
TAA
TGA
TAG
3´-
UTR
AATAAA A
DNA
Primär-
transkript
TA
TA
AA
-25
mRNA
Gm7 AUG AAUAAA
© ERS
Termination?
Poly A
UAA
UGA
UAG
Exon 1 Exon2
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Je nach Spleißmechanismus
werden vier verschiedene Gruppen
von Introns unterschieden:
• tRNA Introns
• Autokatalytische Introns Gruppe I
• Autokatalytische Introns Gruppe II
• hn-/mRNA Introns
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tRNA Splicing: = zwei Stufenprozess
1. Herausschneiden
des Introns durch
RNA- Endonuklease
2. Verknüpfen der
Exons durch DNA-
Ligase
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Autokatalytisches Splicing/
Ribozyme
Beim autokatalytischen Spleißen sorgt die Intron-
RNA selbst (autokatalytisch) dafür, dass die RNA an den
Intron-Exon-Grenzen geschnitten und die beiden Exon-
Enden (3´-Ende von Exon n mit dem 5´-Ende von Exon m)
über eine Phosphodiester-bindung verknüpft werden. Weil
die RNA bei diesem Prozess wie ein Enzym katalytisch
aktiv ist, werden diese RNAs auch als Ribozyme
bezeichnet
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Ribozym-
Struktur Entdecker der Ribozyme
Th. R. Cech; Sydney Altman
Nobelpreis 1989
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Autokatalytisches Spleißen der Gruppe I Introns
bei Prä-rRNA von Tetrahymena
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Mechanismus der autokatalytisch
spleißenden Gruppe I Introns
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Autokatalytisches Splicing Gruppe II
Introns
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mRNA-Spleißen
an der „Consensus Splice Site“ /GU...A..AG/
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Beim Spleißen
bildet sich ein
„Lariat“(Lasso)
im heraus-
gelösten Intron
über eine
2´-5´-Phospho-
diesterbindung
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Am Spleißen
von mRNAs
sind
Spliceosome
n
mit
„SN(U)RPS“
beteiligt
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snRNPs (SNURPS) enthalten
die
snRNAs (sn = „small nuclear“)
U1, U2, U4/6 und U5
(snRNPs= small nuclear
ribonucleoprotein)
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Zeitliche Abfolge
der Vorgänge
am Spliceosom
Nur für
Interessierte!!!
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Zusammenfassung
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Warum überhaupt Introns?
• Erleichtern die Enstehung komplexer
Gene! • (mehrere Minigene = Exons werden zu Makrogene
zusammengepackt)
• „Exon shuffling“ • (einzelne Exons kodieren für Proteindomämen )“Module“,
verschiedene Module ergeben zusammen immer wieder neue
Proteine)
• Alternatives Spleißen
• (durch Kombination verschiedener Exons auf Ebene der RNA kann
ein Gen für viele Proteine kodieren)
• Transspleißen
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Prinzip des alternativen
Spleißens
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Alternatives oder differenzielles
Spleißen erhöht die Zahl der Proteine:
aus einem Aktivatorprotein kann sogar ein Repressor
werden!!
DNA-Bindung Dimerisierung Ligandenbindung Aktivierung
DNA-Bindung Ligandenbindung Aktivierung Dimerisierung Aktivator-
protein
DNA-Bindung Ligandenbindung Dimerisierung Repressorprotein
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Alternatives Spleißen bestimmt bei Drosophila
melanogaster das Geschlecht
Nur für Interessierte!
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Beim DSCAM-Gen (115 Exons) gibt es bis zu 38.016
verschiedene Spleißvarianten
Besteht immer aus 24 Exons,
aber A, B, C, D sind variabel
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Genregulation durch miRNA
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Entstehung der miRNA
Quelle: http://www.dkfz.de/de/genetics/pages/projekte/funk_tumorgenetik/identifizierung_gene.html
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RNA-Editierung http://dna.kdna.ucla.edu/rna/index.aspx
Stop-Codon
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RNA-Editierung http://dna.kdna.ucla.edu/rna/index.aspx
(APOBEC-Complexing Factor)
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RNA-Editierung bei ca. 5- 6 % der menschlichen Gene der
Fall
"Nature Biotechnology" (Bd. 22, S. 1001, August 2004)
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Vielen Dank für‘s Zuhören und vielleicht ein
Wiedersehen in der Molekulargenetik (Modul 13)
oder in der Gentechnologie (Master Modul 8)