ผลของ morelloflavone จากผลมะพดตอการหดตวของหลอดเลอดแดงธอราสค ในหนทไดรบซสพลาตน

The Effects of Morelloflavone from Garcinia dulcis on Contraction of Isolated Thoracic Aorta in Cisplatin Treated Rat

อฎฮา สมาล

Adha Sumalee

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญา วทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาสรรวทยา

มหาวทยาลยสงขลานครนทร A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of Master of Science in Physiology Prince of Songkla University

2560 ลขสทธของมหาวทยาลยสงขลานครนทร

(1)

ผลของ morelloflavone จากผลมะพดตอการหดตวของหลอดเลอดแดงธอราสค ในหนทไดรบซสพลาตน

The Effects of Morelloflavone from Garcinia dulcis on Contraction of Isolated Thoracic Aorta in Cisplatin Treated Rat

อฎฮา สมาล

Adha Sumalee

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญา วทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาสรรวทยา

มหาวทยาลยสงขลานครนทร A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of Master of Science in Physiology Prince of Songkla University

2560 ลขสทธของมหาวทยาลยสงขลานครนทร

(2)

(รองศาสตราจารย ดร.ศรพนธ หรญญะชาตธาดา)

ชอวทยานพนธ ผลของ morelloflavone จากผลมะพดตอการหดตวของหลอดเลอดแดง

ธอราสคในหนทไดรบซสพลาตน

ผเขยน นายอฎฮา สมาล สาขาวชา สรรวทยา อาจารยทปรกษาวทยานพนธหลก คณะกรรมการสอบ ………………………………………………….... ………………………….........ประธานกรรมการ (รองศาสตราจารย ดร.ศรพนธ หรญญะชาตธาดา) (รองศาสตราจารย ดร.เกสร สวรรณประเสรฐ) อาจารยทปรกษาวทยานพนธรวม …………………………..……….........กรรมการ …………………………………………………… .…………………………………...…...กรรมการ (รองศาสตราจารย ดร.วลาวลย มหาบษราคม) (ดร.ฐาปน เรงฤทธ) บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร อนมตใหนบวทยานพนธฉบบนเปนสวนหนงของการศกษา ตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาสรรวทยา

…………………………………………. (รองศาสตราจารย ดร.ธระพล ศรชนะ)

คณบดบณฑตวทยาลย

(3)

ขอรบรองวา ผลงานวจยนมาจากการศกษาวจยของนกศกษาเอง และไดแสดงความขอบคณ

บคคลทมสวนชวยเหลอแลว

ลงชอ………………………………………………. (รองศาสตราจารย ดร.ศรพนธ หรญญะชาตธาดา) อาจารยทปรกษาวทยานพนธ

ลงชอ………………………………………………. (นายอฎฮา สมาล) นกศกษา

(4)

ขาพเจาขอรบรองวา ผลงานวจยนไมเคยเปนสวนหนงในการอนมตปรญญาในระดบใดมากอน และ

ไมไดถกใชในการยนขออนมตปรญญาในขณะน

ลงชอ……………………. (นายอฎฮา สมาล) นกศกษา

(5)

ชอวทยานพนธ ผลของ morelloflavone จากผลมะพดตอการหดตวของหลอดเลอดแดงธอราสคในหนทไดรบซสพลาตน

ผเขยน นายอฎฮา สมาล สาขาวชา สรรวทยา ปการศกษา 2560

บทคดยอ

ผลขางเคยงทส าคญอยางหนงของ cisplatin คอผลตอระบบหวใจและหลอดเลอด สาเหตเกดจากการเพมขนของ reactive oxygen species สงผลใหการคลายตวของหลอดเลอดลดลง morelloflavone เปนสารสกดจากมะพดมคณสมบตตานอนมลอสระ สามารถกระตนใหหลอดเลอดในหนความดนเลอดปกตและหนความดนเลอดสงคลายตวผานการออกฤทธของ nitric oxide ทหลงจาก endothelium วตถประสงคการวจยนเพอศกษาผลแบบเฉยบพลนของ morelloflavone ตอการคลายตวของหลอดเลอดแดง thoracic ในหนทไดรบ cisplatin และศกษาผลในการปองกนความเสยหายของหลอดเลอดแดง thoracic ทเกดจาก cisplatin โดยการวดการหดตว การลดภาวะ oxidative stress และการปรบโครงสรางของหลอดเลอด การทดลองนใชหนตวผ สายพนธ Wistar โดยฉด cisplatin (7.5 mg/kg) หรอ vehicle (0.9% NaCl) เขาทางชองทอง เจดวนตอมาน าชนหลอดเลอดแดง thoracic ของหนกลม control ทม endothelium (intact) และกลมทท าลาย endothelium (denuded) และกลม cisplatin มาทดสอบการคลายตวทเกดจาก morelloflavone (10-12 - 10-5 M) การศกษาฤทธการปองกนความเสยหายของหลอดเลอดแดง thoracic ทเกดจาก cisplatin โดย morelloflavone ท าการทดสอบโดยแบงหนออกเปนสามกลม ไดแก vehicle control, cisplatin และ cisplatin+morelloflavone โดยหนจะไดรบ morelloflavone (0.1,1 และ 10 mg/kg) สองครงคอ 1 วน และ 10 นาทกอนการฉด cisplatin เจดวนตอมาวดการหดตวและคลายตวของชนหลอดเลอดแดง thoracic ตอ 10-10 - 10-5 M phenylephrine (PE), 10-12 - 10-5 M acetylcholine (ACh) และ sodium nitroprusside (SNP) ผลการทดลองพบวากลไกการออกฤทธ ของ morelloflavone ในการท าใหหลอดเลอดคลายตวเปนแบบ endothelium-dependent และหลอดเลอด thoracic aorta ของหนทไดรบ cisplatin จะมการหดตวตอบสนองตอ PE มากกวากลม control ในขณะทการคลายตวตอบสนองตอ ACh จะต ากวากลม control อยางมนยส าคญทางสถต ระดบ malondialdehyde ใน plasma ทสงขนในกลม cisplatin สามารถลดลงไดโดยการให morelloflavone ซงแสดงวาฤทธตานอนมลอสระของ morelloflavone จะเกดขนพรอมกบฤทธ การคลายตวของหลอดเลอด การตรวจทางเนอเยอวทยาพบวาการเพมขนาดของหลอดเลอดชน tunica media ในหนกลม cisplatin สามารถลดกลบเปนปกตไดเมอไดรบ morelloflavone

(6)

Thesis Title The effects of morelloflavone from Garcinia dulcis on the contraction of isolated thoracic aorta in cisplatin-treated rat

Author Mr. Adha Sumaalee Major Program Physiology Academic Year 2017

Abstract

One of the adverse effects in using a chemotherapeutic drug, cisplatin, is cardiovascular complication. Cisplatin effect on the blood vessels includes an increase in reactive oxygen species which may impair vascular smooth muscle relaxation. A plant biflavonoid extracted from Garcinia dulcis (Kurz), morelloflavone, has been shown to possess robust antioxidant activity and recently caused vasodilation via endothelium dependent nitric oxide signaling pathway in both normotensive and hypertensive rats. This study aimed to investigate an acute and protective effect of morelloflavone on the contractile function, oxidative status and structural damage of cisplatin-treated rat thoracic aorta. Male Wistar rats were used and either cisplatin (7.5 mg/kg) or vehicle (0.9% NaCl) was given intraperitoneally. An acute vasorelaxant effect of morelloflavone (10-12 - 10-5 M) was tested in isolated thoracic aortic rings of control (endothelium-intact and denuded) and cisplatin-treated rat on day 7 after the injection. To study the protective role of morelloflavone on the contractile function of the aortic rings, rats were divided into three groups including vehicle control, cisplatin and cisplatin + morelloflavone treated group. Morelloflavone (0.1, 1, 10 mg/kg, i.p.) were given twice, 1 day and 10 min before cisplatin injection. Seven days after the treatment, the contractile responses to 10-10 - 10-5 M phenylephrine (PE), 10-12 - 10-5 M acetylcholine (ACh) or sodium nitroprusside (SNP) were investigated. It is found that the vasorelaxation of morelloflavone is endothelium dependent and the contraction response to PE was significantly higher in cisplatin treated group whereas the relaxation responses to ACh found significantly lower when compared to control. Morelloflavone (1 mg/kg) treatment was able to improve the contractile responses to PE, ACh and SNP. Plasma malondialdehyde level which increased significantly in cisplatin group was also subsided by morelloflavone treatment suggesting its antioxidant action occurred along with the vasorelaxation effect. Histological

(7)

examination revealed the tunica media proliferation in cisplatin group was restored by morelloflavone treatment.

(8)

กตตกรรมประกาศ

ผเขยนขอขอบคณรองศาสตราจารย ดร.ศรพนธ หรญญะชาตธาดา อาจารยทปรกษาวทยานพนธ ทกรณาใหค าแนะน าในการท าวจย สอนเทคนค จดหาอปกรณ ตดตามงานในการท าวจยจนส าเรจลลวงไปไดดวยด ตลอดจนแนะน าการเขยนและแกไขวทยานพนธฉบบนใหสมบรณ และขอขอบคณรองศาสตราจารย ดร.วลาวลย มหาบษราคม อาจารยทปรกษาวทยานพนธรวม ส าหรบความอนเคราะหใหสารทดสอบทใชในการท าวจยในครงน ขอขอบคณคณะกรรมการการสอบและคณาจารยภาควชาสรรวทยาทกทานทมอบความร ค าแนะน า ชแนะขอบกพรองตาง ๆ บณฑตวทยาลย มหาวทยาสงขลานครนทร ทมอบทนการศกษาและทนวจยครงน ขอขอบคณราชกรฑาสโมสร และมลนธวฒนธรรมอสลามเพอการศกษาและการพฒนาทมอบทนการศกษา ขอขอบคณ คณเพทาย หรญพนธ ส าหรบสอนเทคนคการผาตดสตวทดลอง การเตรยมเครองมอการทดลอง ขอขอบคณ คณสภาพ นวลพลบ คณวรางคณา ราชช ารอง และเจาหนาทภาควชาสรรวทยาทกทานทใหความชวยเหลอทงในเรองการท าวจยและการจดท าเอกสารตาง ๆ ขอขอบคณพ ๆ นอง ๆ นกศกษาภาควชาสรรวทยาทกทานทใหความชวยเหลอทงทางดานการเรยนและใหก าลงใจตลอดมา ขอขอบคณ คณไมตร นวลพลบและบคลากรเรอนเลยงสตวทดลองทกทาน สดทายขอขอบพระคณพอแม ภรรยาทนารกและญาตพนอง ทคอยเปนก าลงใจและใหการสนบสนนการศกษาตลอดมา อฎฮา สมาล

(9)

สารบญ

หนา บทคดยอ (5) Abstract (6) กตตกรรมประกาศ (8) สารบญ (9) รายการตาราง (10) รายการรป (11) สญลกษณและตวยอ (13) 1. บทน า 1

บทน าตนเรอง 1 การตรวจเอกสาร 2 วตถประสงค 34

2. วธด าเนนการทดลอง 36 วสดและอปกรณ 37 วธด าเนนการ 38 การออกแบบการทดลอง 38

3. ผลการทดลอง 45 4. สรปและวจารณผลการทดลอง 59 5. สรปผลการทดลองและขอเสนอแนะ 66

เอกสารอางอง 67 ภาคผนวก 78 ประวตผเขยน 91

(10)

รายการตาราง ตารางท หนา 3.1 ผลของ morelloflavoneตอรอยละการตายและการเปลยนแปลงของน าหนกตว 45 ในหนทไดรบ cisplatin

ภาคผนวก 1. ผลของ phenylephrine (PE) ความเขมขนระหวาง 10-10- 10-4 M 78 ตอการหดตวของ aortic ring ทแสดงโดยคา % increase from resting tension 2. ผลของ acetylcholine (ACh) ตอการคลายตวของ aortic ring 79 ทท าใหหดตวกอนดวย 10-7M PE ทแสดงโดยคา % relaxation from 10-7 M PE precontraction 3. ผลของ morelloflavone (Mor) ตอการคลายตวของ aortic ring 80 กลม control (Con) ทม endothelium (intact endothelium) และ endothelium ถกท าลาย (denuded) และกลม cisplatin (Cis) ท าใหหดตวกอนดวย 10-7 M PE 4. ผลของ PE ตอการหดตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), 81 cisplatin 3 วน (Cis 3 days) 5. ผลของ AChตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), 82 cisplatin 3 วน (Cis 3 days) 6. ผลของ SNP ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), 83

cisplatin 3 วน (Cis 3 days) 7. ผลของ PE ตอการหดตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), 84 cisplatin (Cis), cisplatin+morelloflavone (Cis+Mor) 8. ผลของ AChตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), 86 cisplatin (Cis), cisplatin+morelloflavone (Cis+Mor) 9. ผลของ SNP ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ในกลม 88 control (Con), cisplatin (Cis), cisplatin+morelloflavone (Cis+Mor) 10. ผลของ cisplatin (7.5 mg/kg) (Cis) และ cisplatin+morelloflavone 90 (0.1,1และ 10 mg/kg) (Cis+Mor) ตอระดบ plasma MDA

(11)

รายการรป รปท หนา 1.1 โครงสรางโมเลกลของ cisplatin 2 1.2 กลไกการกลไกการเขาออกทผนงเซลลของ cisplatin 5 1.3 การสรางพนธะและผลของ cisplatin ตอเซลล 6 1.4 กลไกการเกด apoptosis และ necrosis ของเซลล จาก cisplatin 9 1.5 รปแบบหลกและแหลงทมาของ reactive oxygen species (ROS) 13 1.6 ผลกระทบหลกทเกดจากยาทท าใหเกด oxidative stress ในเซลล 14 1.7 กลไกการเกดปฏกรยา lipid peroxidation 16 1.8 ลกษณะผลสกและผลดบของมะพด 17 1.9 โครงสรางของ morelloflavone 18 1.10 โครงสรางปกตของผนงหลอดเลอดแดง 21 1.11 กลไกการหดตวของเซลลกลามเนอเรยบในผนงหลอดเลอด 23 1.12 การควบคม endothelial nitric oxide synthase (eNOS) 27 1.13 endothelium derived relaxing factor (EDRF) ทหลงจาก endothelium 29 1.14 endothelin-1 (ET1) 30 1.15 ระบบ renin-angiotensin ทเซลล endothelium 31 1.16 แผนภาพสมมตฐานงานวจย 35 2.1 แผนผงการทดลองศกษาการออกฤทธของ morelloflavone 42 ในหลอดเลอดแดง thoracic 2.2 แผนผงการทดลองศกษาการตอบสนองตอ PE, AChและ SNP 43 ในหลอดเลอดแดง thoracic 3.1 ผลของ phenylephrine (PE) ความเขมขนระหวาง 10-10-10-4M 47 ตอการหดตวของ aortic ring 3.2 ผลของ acetylcholine (ACh) ตอการคลายตวของ aortic ring 48 3.3 ผลของ morelloflavoneตอการคลายตวของ aortic ring 49 3.4 ผลของ PE ตอการหดตวของ thoracic aortic ring ในกลม cisplatin 3 วน 50 3.5 ผลของ AChตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ในกลม cisplatin 3 วน 51 3.6 ผลของ SNP ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ในกลม cisplatin 3 วน 51 3.7 ผลของ PE ตอการหดตวของ thoracic aortic ring 52

(12)

รายการรป (ตอ)

รปท หนา 3.8 ผลของ PE ตอการหดตวของ thoracic aortic ring 53

ทความเขมขนระหวาง 10-7 -10-5 M 3.9 ผลของ AChตอการคลายตวของ thoracic aortic ring 54 3.10 ผลของ AChตอการคลายตวของ thoracic aortic ring 54 ทความเขมขนระหวาง 10-7 – 10-5 M 3.11 ผลของ SNP ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring 55 3.12 ผลของ SNP ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring 56 ทความเขมขนระหวาง 10-7 – 10-5M 3.13 ผลของ cisplatin (7.5 mg/kg) (Cis) และ cisplatin+morelloflavone 57

(0.1,1 และ 10 mg/kg) (Cis+Mor) ตอระดบ plasma MDA 3.14 การศกษาทางเนอเยอพยาธวทยา 58

(13)

สญลกษณและตวยอ

= alpha 1 = alpha 1 = beta 1 = beta 1 2 = beta 2 AC = adenylate cyclase ACh = acetylcholine ADH = antidiuretic hormone ADP = adensinediphosphate AI = angiotensin I AII = angiotensin II AMP = adenosine monophophate ANP = atrial natriuretic peptide APAF-1 = apoptosis promoting activating factor-1 ATP = adenosine triphosphate AT receptor = angiotensin receptor BKCa = large conductance calcium-activated potassium channel CaM = calmodulin cAMP = cyclic adenosine monophosphate CAT = catalase cGMP = cyclic guanosine monophosphate Cis = cispaltin cNOS = constitutive nitric oxide synthase COX I = constitutive cyclooxygenase COX II = inducible cyclooxygenase Ctr1 = copper transporter 1 DAG = diacylglycerol DG = diacylglycerol DISC = death-inducing signaling complex

(14)

สญลกษณและตวยอ (ตอ)

DMSO = dimethyl sulfoxide DPPH = 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EP = epinephrine EC = effective concentration ECF = extracellular fluid EDCF = endothelium-derived contracting factor EDHF = endothelium-derived hyperpolarizing factor EDRF = endothelium-derived relaxing factor eNOS = endothelium nitric oxide synthase ET = endothelin ETA = endothelin ชนด A ETB = endothelin ชนด B ET-1 = endothelin-I GABA = -aminobutyric acid GC = guanylate cyclase Glut1 = glucose transporter 1 GTP = guanosine triphosphate GSH = glutathione HCl = hydrochloric acid IKCa = intermediate conductance calcium-activated potassium

channel IP3 = inositol triphosphate IP3-R = inositol triphosphate receptor ISF = interstitial fluid JNK = jun amino-terminal kinase KATP = ATP sensitive K+ channel KCa = calcium-dependent K+ channel KIR = inward rectifier K+ channel KV = delayed rectifier K+ channel หรอ voltage-dependent K+

channel

(15)

สญลกษณและตวยอ (ตอ) LDL = low density lipoprotein L-NOARG = NG-nitro-L-arginine MAPK = mitogen-activated protein kinase MDA = malondialdehyde MLCK = myosin light chain kinase MR = muscarinic receptor MW = molecular weight Na+/Ca2+ exchanger = sodium-calcium exchanger NADH = nicotinamide adenine dinucleotide NADPH oxidase = nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase NE = norepinephrine NO = nitric oxide NOS = nitric oxide synthase NSCLC = non-small cell lung cancer OCT2 = organic cation transporter-2 PDGF = platelet derived growth factor PE = phenylephrine PED = phosphodiesterase PED5 = phosphodiesterase type 5 PGE1 = prostaglandin E1 PGG2 = prostaglandin G2 PGH2 = prostaglandin H2 PGI2 = prostacyclin PGIS = prostacyclin synthase PIP2 = phosphatidyl inositol bisphosphate PKC = protein kinase C PKG = protein kinase G PLC = phospholipase C RNS = reactive nitrogen species ROC = receptor-operated nonselective cation channel

(16)

สญลกษณและตวยอ (ตอ) ROS = reactive oxygen species SAC = stretch-activated cation channel SCLC = small cell lung cancer SKCa = small conductance calcium-activated potassium channel SNP = sodium nitroprusside SOD = superoxide dismutase SR = sarcoplasmic reticulum TC = tension ของ resting tension (1 g) TPE = tension ทเกดจากการหยด PE TXA2 = thromboxane A2 VIP = vasoactive intestinal polypeptide VSM = vascular smooth muscle µl = microliter µm = micrometer

1

บทท 1 บทน า

1.1 บทน าตนเรอง

cisplatin เปนยาเคมบ าบดทใชในการรกษาโรคมะเรงตาง ๆ เชน มะเรงถงน าด มะเรงปอด มะเรงรงไข มะเรงอณฑะ เปนตน แมวา cisplatin จะมการใชอยางแพรหลายและใหผลการรกษาโรคมะเรงไดด แตพบวาการใช cisplatin ในปรมาณสงและตอเนองจะสงผลขางเคยงตออวยวะตาง ๆ ในรางกาย เชน nephrotoxicity, ototoxicity, neurotoxicity รวมถง vascular toxicity อกดวย cisplatin ท าใหเกดภาวะ oxidative stress ในหลอดเลอดเปนสาเหตหนงทท าใหเกด vascular toxicity (Deavall et al., 2012) สาเหตของ vascular toxicity อาจเกดจากการเพมระดบ malondialdehyde (MDA) ซง MDA เปน marker ตวหนงของการเกด lipid peroxidation การใหสารลดภาวะ oxidative stress ควบคกบการใหยา cisplatin จะชวยลดภาวะความเปนพษตออวยวะตาง ๆ จาก cisplatin ได

morelloflavone เปนสารทสกดจากผลมะพดซง เปนพชทพบในประเทศแถบเอเชยตะวนออกเฉยงใต เชน ประเทศไทย ฟลปปนส อนโดนเซย มาเลเซย มะพดเปนพชพนเมองของไทย ทถกน ามาใชเปนยาพนบาน ซง morelloflavone เปนสารในกลม flavanoid มฤทธเปนสารตานอนมลอสระ (antioxidant) สามารถยบยง oxidation ของ LDL ทแยกจาก human plasma โดยวดระดบ MDA (Hutadilok-Towatana et al., 2007) นอกจากนยงพบวา morelloflavone สามารถยบยงการเกดปฏกรยา oxidation ของ DPPH radical ได (Deachathai et al, 2005) แตยงไมมการทดลองมากอนวา morelloflavone มผลในการตานอนมลอสระทหลอดเลอด thoracic aorta ทเกดจากการไดรบ cisplatin ไดหรอไม

การทดลองครงนจงตองการศกษาวา cisplatin ท าใหเกดอนมลอสระทหลอดเลอด thoracic aorta และศกษาการออกฤทธของ morelloflavone ในการตานอนมลอสระทหลอดเลอด thoracic aorta โดยการวดระดบ MDA พรอมกบศกษาประสทธภาพในการหดตวและคลายตวของหลอดเลอดแบบ in vitro

2

1.2 การตรวจเอกสาร

1. Cisplatin Cisplatin หรอ cis-diamminedichloroplatinum (II) เปนสารประกอบทม

โมเลกลของแพลตทนมเปนองคประกอบ มลกษณะเปนผงสขาวหรอเหลองเขมทอณหภมหอง สามารถละลายไดในน าหรอ dimethylprimanide และ N,N-dimethylformamide cisplatin มความเสถยรทอณหภมหองและทความดนบรรยากาศ แตเมอเวลาผานไปอาจจะมการเปลยนแปลงโครงสรางไปส trans-isomer cisplatin มน าหนกโมเลกล 301.1 กรม/โมล ความหนาแนน 3.74 กรม/ซม.3 มจดหลอมเหลวทอณหภม 270 องศาเซลเซยส (Jamieson & Lippard, 1999)

รปท 1.1 โครงสรางโมเลกลของ cisplatin (Jamieson & Lippard, 1999)

cisplatin ถกสงเคราะหขนมาครงแรกในป ค.ศ. 1844 โดย M.Peyrone มการคนพบสตรโครงสรางทางเคมครงแรกโดย Alfred Werner ในป ค.ศ. 1893 อยางไรกตาม cisplatin กยงไมไดมการน าไปวเคราะหผลทางวทยาศาสตรกระทงป ค.ศ. 1960 มการศกษาครงแรกโดย Rosenberg และคณะ (1965) ทมหาวทยาลยมชแกนสเตต พบวาโมเลกลของแพลทตนมในสารประกอบ cisplatin เมอผานกระบวนการ electrolysis จะสามารถยบยงการแบงตวของ Escherichia coli ได จงคาดวาสามารถน าไปใชเพอยบยงการเจรญของเซลลมะเรงได ตงแตมการคนพบประโยชนของ cisplatin ทใชในการรกษาโรคมะเรงกไดมการศกษาสารประกอบทมอะตอมของโลหะเปนองคประกอบเพอใชรกษามะเรง เชน palladium และอน ๆ (Rosenberg et al., 1965)

cisplatin ไดรบความสนใจอยางแพรหลายหลงจากทพบวาสามารถยบยงการแบงตวของเซลลมะเรงในสวนตาง ๆ ของรางกายเชน มดลก อณฑะ ศรษะและล าคอ ในป ค.ศ. 1960 มรายงานการพบคณสมบตความเปนพษของยา cisplatin ในจ านวนของยาเคมบ าบดทงหลายนน cisplatin ถอวาเปนยาทไดรบความนยมสงทสด เนองจากไดรบการรบรองจาก Food and Drug Administration (FDA) หรอองคการอาหารและยาแหงสหรฐอเมรกา ในป ค.ศ. 1978 (Frezza et al., 2010)

3

cisplatin เปนยาทไดรบการพสจนทางการแพทยแลววาสามารถยบยงมะเรงชนดตาง ๆ ได เชน เนองอก (sacroma) มะเรงในเนอเยอ, กระดก, กลามเนอ และหลอดเลอด แมวา cisplatin จะใหผลในการรกษาท าใหอาการและสขภาพของผปวยดขน แตกยงมเรองทยงคงตองค านงในการรกษาจากการดอยาและผลขางเคยงตาง ๆ ทอาจเกดขนกบการใชยา cisplatin เปนยาเคมบ าบด

1.1 การใชยา cisplatin ในการรกษามะเรง 1.มะเรงปอด มะเรงปอดพบวาเปนหนงในชนดของมะเรงทมความรายแรง มะเรงปอดชนด

เซลลเลก (Small cell lung cancer, SCLC) พบมากถง 15% ในผปวยทเปนมะเรงปอด (Chen et al., 2009) ปจจบนมการใหยาเคมบ าบดทมแพลทตนมเปนองคประกอบในการรกษามะเรงชนดน ไดแกยา cisplatin และ carboplatin ในทางคลนก (Go & Adjei, 1999) cisplatin ถกน ามาใชในการรกษาเปนสวนมากเนองจากใหผลในการยบยงเซลลมะเรงไดด แตกมผลขางเคยงทเกดจากการใชยา cisplatin ตามมาเชนโรคไต หลอดเลอด และอน ๆ ผปวยทไดรบยา cisplatin มกมอาการวงเวยนศรษะและอาเจยน ดงนนเพอหลกเลยงผลขางเคยงทตามมาจงตองมการตดตามอาการของผปวยทไดรบยาอยางใกลชดและการใหยาในปรมาณทสงจะตองมความจ าเปนเทานน

ตามมาตรฐานการรกษาส าหรบผปวยมะเรงปอดชนดทไมใชเซลลเลก (non-small cell lung cancer, NSCLC) คอการผาตดตามดวยการใหเคมบ าบดดวยยา cisplatin ในผปวยระยะท 2 และระยะท 3 โดยมการศกษาพบวาการรกษาดวยเคมบ าบดแบบเสรมสงผลใหอตราการอยรอดในหาปเทากบ 5.3% (Pignon et al., 2008)

2.มะเรงรงไข มะเรงรงไขเปนมะเรงทมอตราการตายมากทสดในกลมของมะเรงทางนรเวช

ผปวยสวนมากทเปนมะเรงรงไขไดรบการวนจฉยในระยะสดทายเนองจากประสทธภาพการคดกรองผปวยรวมถงการไมมอาการบงชในระยะแรกของโรค การรกษาในระยะสดทายของโรคคอการผาตดเอากอนเนอออกตามดวยการใหเคมบ าบดดวยยา cisplatin และยาทม taxane เปนองคประกอบรวมดวย แมวาการรกษานจะใหผลดในระยะแรก แตกลบพบวาผปวย 75% กลบมาเปนโรคอก แลวผปวยในกลมนมกเกดภาวะดอตอยาเคมบ าบดในสดทและเสยชวตจากโรคน (Lynch et al., 2009) ประมาณรอยละ 90 ของผปวยทเปนโรคมะเรงรงไขเกดขนโดยไมทราบสาเหต สวนทเหลอเกดจากพนธกรรม และ/หรอ เกยวของกบการเปนมะเรงเตานมและล าไส

4

cisplatin เปนยาตวหลกทถกน ามาใชในการรกษามะเรงรงไขแมจะมผลคางเคยงตามมาทรนแรงและอาจน าไปสการดอยาในทสด cisplatin ถกน ามาใชรวมกบยาเคมบ าบดชนดอน ๆ เชน ihoney venom, withaferin, trichostatin A หรอ 5-aza-2’- deoxycytidine ในผปวยทมความตานทานตอยา cisplatin ทวไปจะมการใช cisplatin ไลโปโซม (Koch et al., 2013)

3.มะเรงคารซโนมา head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) เปนมะเรงทพบได

ทวไป โดยพบวามประชากรโลกทเปนมะเนงชนดนเพมขนถงปละ 600,000 คนในทกป (Parkin et al., 2005) ทงๆทมการปรบปรงการรกษาใหมสทธภาพทดข น HNSCC มความสมพนธกบอตราการตายทเพมสงขน อตราการรอดตายใน 5 ปประมาณ 50% ยงไมไดมการเปลยนแปลงในชวงทศวรรษทผานมา cisplatin เพยงอยางเดยวไมสามารถเปนยาทใหประสทธภาพในการรกษาโรคไดดพอจงมการรกษาโดยการใหยาตวอนรวมดวย เชน methotrexate, vinblastine, doxorubicin, และ/หรอ gemci-tabine (Matsuki et al., 2013)

4.มะเรงเตานม มะเรงเตานมเปนหนงในสาเหตส าคญของการตายของผหญงทวโลก การใหยา

เคมบ าบดเปนวธเดยวส าหรบการรกษาโรคมะเรงเตานม ซงจะยดอายของผปวยไดนานขน ยาเคมบ าบดมการพฒนาอยางตอเนองเพอตอสกบมะเรงเตานม ยา cisplatin เปนยาเคมบ าบดทม ประสทธภาพสงในการยบยงการแพรขยายของเซลลมะเรงเตานม แตกมผลขางเคยงตอผปวยทไดรบยาดวยเชนกน (Decatris et al., 2004)

5. มะเรงสมอง glioblastomamultiforme (GBM) เปนมะเรงทพบมากทสดในกลมมะเรงใน

สมอง เปนชนดทรายแรงถงขนเสยชวตได การรกษาในผปวยกลมนคอการผาตดและฉายรงสรวมกบการใหยาเทโมโซโลไมด (temozolomide) มรายงานวาการรกษาแบบผาตดและฉายรงสรวมกบการใหยาจะชวยยดอายใหผปวยอยรอดได 5 ป แตโดยรวมแลวสามารถชวยใหผปวยอยรอดไดเพยง 2.5 เดอนเทานน การใหยา cisplatin กมการใชในเดกทเปนเนองอกในสมองเชนเดยวกบการรกษามะเรงชนดอนดวยเชนกน (Khan et al., 1982)

1.2 กลไกการออกฤทธระดบโมเลกลของ cisplatin กลไกการน า cisplatin เขาและออกจากเซลลยงไมเปนทแนชด ปจจบนก าลงม

การศกษาอยางตอเนอง จากการศกษาพบวา cisplatin เขาสเซลลโดยกระบวนการ passive diffusion และการ influx ผานทาง copper transporter 1 (Ctr1) มการศกษาทดลองโดยการ

5

ท าลาย Ctr1 ทบรเวณเยอหมเซลลของยสตและหนไมซพบวา cisplatin เขาสเซลลไดนอยลงและท าใหเซลลมความตานทานตอยา cisplatin (Ishida et al., 2002) นอกจากนยงมการศกษาโดยการหยดการท างานของยน Ctr1 ในเซลลพบวาสามารถยบยงการเขาสเซลลของ cisplatin ได และเมอท าใหมการเพมขนของ Ctr1 กพบวามการสะสมของแพลทตนมในเซลลเปนจ านวนมาก เซลลมความไวตอ cisplatin มการคนพบโปรตน TMEM205 ซงเปนโปรตนทอยรอบ ๆ เยอหมเซลลมความเกยวของการการลดลงของ cisplatin ในเซลล การวเคราะหการโปรตน TMEM205 ในเนอเยอของมนษยพบความสมพนธระหวางปรมาณ TMEM205 ทมากขนกบการตานทานตอ cisplatin การคนพบนจะมประโยชนตอการศกษาการปองกนผลขางเคยงจาก cisplatin ตออวยวะตาง ๆ ไดในอนาคต นอกจาก Ctr1 แลว cisplatin ยงสามรถเขาสเซลลผานทาง glucose transporter 1 (Glut1) โดยพบวาการท าลาย Glut1 สงผลใหเซลลมความตานทานตอ cisplatin ได (Shen et al., 2012)

รปท 1.2 กลไกการเขาออกทผนงเซลลของ cisplatin นอกจากจะผานเขาสเซลลโดยวธ passive diffusion แลว cisplatin ยงสามารถเขาสเซลลโดยวธ Active transport ทาง copper transporter 1 (Ctr1). Copper-transporting P-type adenosine triphosphate (ATP7B) มบทบาทในการขบ cisplatin ออกจากเซลล ทง Copper และ cisplatin มสวนท าใหความสามารถในการแพรผานสารตวอนไดลดลง และยงท าใหเกดความเสยหายตอ Ctr1 ไดอกดวย (Wang & Lippard, 2005)

cisplatin จะถกกระตนเมอเขาสภายในเซลล ใน cytoplasm chloride atom ของ cisplatin จะถกแทนทดวยโมเลกลของน า เขาสภายในเซลล ซงมความเขมขนของ chloride ion 3 – 20 mM ซงมความเขมขนนอยกวาภายนอกท าใหไมเกด chloride shield แลวนน cisplatin จงเกดปฏกรยา hydrolysis หรอ aquation คอการแทนทดวยโมเลกลของน า ซงท าให cisplatin อยในรป aqua form ซงเปน active form หลงจากนน aqua form จะเขาไปท า

6

ปฏกรยากบ DNA ซง platinum atom จะไปสรางพนธะ co-ordinate covalent bond กบ N-7 ของ guanine และ adenosine ซงท าใหเกดความผดปกตในการซอมแซมและการท างานของ DNA สงผลใหเซลลมะเรงเกด apoptosis (Fuertes et al., 2003) การเกดพนธะแบบ 1,2- intrastrand cross-links ของ purine กบ cisplatin เปนเปนรปแบบทพบมากทสดทสงผลกบ DNA รปแบบของพนธะแบบ 1,2- intrastrand cross-links ไดแก 1,2- intrastrand d(GpG) adducts และ 1,2- intrastrand d (ApG) adducts พบมากถง 90% และ 10% ตามล าดบ ขณะทอกรปแบบคอ 1,3- intrastrand cross-links และ interstrand cross-links กมรายงานวาท าใหเกดความเสยหายตอ DNA ไดเชนกน ดวยเหตนงานวจยทไดรบการตพมพจากหลาย ๆ งานกลาวตรงกนวา DNA เปนเปาหมายของ cisplatin ทไปท าใหเกดความเสยหาย โดยมหลกฐานจากงานศกษาทงเซลล prokaryote และ eukaryote ทไมสามารถซอมแซม DNA ได (Fraval et al., 1978)

รปท 1.3 การสรางพนธะและผลของ cisplatin ตอเซลล cisplatin เกดปฏกรยาการแทนทดวยน า [Pt(NH3)2Cl(OH)2]

+ และ [Pt(NH3)2(OH2)2]2+ ในเซลล อะตอมของแพลตทนมของ cisplatin สรางพนธะ

covalent กบ N7 ของ purine เพอสรางเปน 1,2- หรอ 1,3- intrastrand crosslinks และ interstrand crosslinks (Wang & Lippard, 2005)

1.3 cisplatin กบการเกดภาวะ oxidative stress ในสภาวะปกตเซลลจะรกษาระดบของอนมลอสระดวยการรกษาความสมดลระหวางอนมลอสระและสารตานอนมลอสระ (เชน glutathione-GSH, superoxide dismutase-SOD, และ catalase-CAT) แตภายใตสภาวะ oxidative stress ปรมาณอนมลอสระทมากเกนไปจะไปท าลายโปรตน ไขมน และ DNA น าไปสการเปนมะเรง เซลลมะเรงมอนมลอสระมากกวาเซลลปกตหลายเทาตว สวนหนงมาจากการกระตนจากยนมะเรงท าใหมการเพมระดบการเผาผลาญและเกดความผดปกตของไมโตคอนเดรย ภาวะ oxidative stress เปนหนงในกลไกท

7

ส าคญของ cisplatin ทท าใหเกดความเปนพษ ไมโตคอนเดรยเปนเปาหมายหลกของ cisplatin ทท าใหเกด oxidative stress เกดการสญเสยโปรตนกลม sulfhydryl สงผลใหมการยบยงการดดซมแคลเซยมและลดการเกดศกยไฟฟาทบรเวณเยอหมเซลล (Saad et al., 2004) การเกด oxidative stress ท าใหสภาวะปกตในเซลลมความเสยหาย cisplatin เปนตวเหนยวน าใหเกดอนมลอสระทไปท าลายใหเซลลมะเรงเกดความเสยหาย เซลลตายไดดวยวธการทหลากหลายขนกบชนดของเซลลมะเรง การกอตวของอนมลอสระขนกบความเขมขนของตวยา cisplatin และระยะเวลาทไดรบ ภาวะสมดลของปฏกรยา redox ภายในเซลลถกควบคมโดยหม thiol (-SH) ทเปนสวนประกอบของโมเลกล ในบางสภาวะหม thiol เกดปฏกรยากบออกซเจนเกดเปนอนมลอสระทมออกซเจนเปนองคประกอบ (Desoize, 2002) อนมลอสระจ านวนมากสามารถท าใหเซลลตายไดจากทงภายในและภายนอกเซลล การตายจากภายนอกเซลลเกดจากอนมลอสระทถกสรางโดย fas ligand ผานกระบวนการ phosphorylation ซงจะไปจบกบโปรตนและ caspase 8 ท าใหเซลลตาย (apoptosis) การตายจากภายในเซลลเกดจากอนมลอสระทไปกระตนใหมการปลอย cytochrome C โดยการกระตน pore-stabilizing protein (Bcl-2 และ Bcl-xL) ซงเปนโปรตนยบยงและท าลายเซลล ทงนอนมลอสระในปรมาณสงกสามารถท าลายเซลลมะเรงได โดยการท าลายตวเอง (autophagy) ซงเปนกระบวนการยอยสลายตวมนเองของ cytoplasmic content ใน lysosomes (Shrivastava et al., 2011)

1.4 cisplatin modulation of calcium signaling cisplatin ภายใตความเขมขนของคลอไรดในเซลลต าจะถก hydrolyze ท าใหมการเปลยนไปเปนรปแบบตาง ๆ ไดแก monoaqua [cis-(NH)PtCI(HO)] และ diaqua [cis-(NH)Pt(HO)]2+ รปแบบตาง ๆ ทเกดจากการถก hydrolyze นจะเกดขนมากกวาพนครงเทยบกบ cisplatin ในสภาวะปกต และท างานผานการยบยงการท างานของไมโตคอนเดรยในการเกด oxidative phosphorylation ผลจากการขบแคลเซยมออกจากไมโตคอนเดรยและเพมระดบแคลเซยมในเซลลสงผลใหเกดการเสยสมดลของแคลเซยมท าใหเซลลไมสามารถท างานไดตามปกต

mitochondrial glutathione (GSH) มความส าคญในการควบคมการผานเขาออกของสารในชนในของไมโตคอนเครยและการท างานของ enzyme โดยการรกษา SH ใหเปนตวใหอเลกตรอนในปฏกรยารดอกซ เมอหม SH- ของ enzyme ไมเปนตวใหอเลกตรอนกจะอยในสถานะทไมถกกระตน (inactivated) cisplatin ท าใหเกดภาวะความเปนพษโดยเฉพาะตอไต โดยการลดปรมาณของ GSH และโปรตนทตอพนธะกบหม SH nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) เปนตวชวยในการรกษาหม SH ชวยลดความเปนพษจากการไดรบ cisplatin ดงนนการขาด GSH และ NADPH เปนการขาด enzyme dehydrogenase ท าใหเกด uncoupling of oxidative phosphorylation สงผลใหเกด oxidative stress ขน ปฏกรยา

8

ออกซเดชนของอนมลอสระอนมความไวตอชวโมเลกลซงเปนองคประกอบของเซลล ไดแก ไขมน โปรตน น าตาล และกรดนวคลอก ท าใหเซลลถกท าลาย (Aggarwal, 1998)

กลาวโดยสรปคอ cisplatin ท าใหเกดการเสยสมดลของแคลเซยมซงเปนตวเรมตนในกระบวนการทส าคญในเซลลเชน lipid peroxidation และการยบยงการท างานของ enzyme กระบวนการเหลานเสยหายจากการทไมโตคอนเครยเสยหาย มการยบยงการท างานของไมโตคอนเดรย การขาด adenosine triphosphate (ATP) และ cofactor อน ๆ สงผลสดทายท าใหเซลลตายทงแบบ apoptosis และ necrosis ดงนนหากมการเพมระดบของแคลเซยมผานการใหอาหารเสรมอาจชวยลดความเปนพษจาก cisplatin ได

1.5 cisplatin เหนยวน าใหเกด cell apoptosis apoptosis เปนรปแบบหนงของการตายของเซลลแบบทมการก าหนดไวของสงมชวตหลายเซลล ซงเกยวของกบชดของปฏกรยาทางชวเคมซงท าใหเซลลตายอยางมลกษณะทเฉพาะ หรอกลาวอยางจ าเพาะคอเปนชดของปฏกรยาทางชวเคมทท าใหเซลลมสณฐานวทยาเปลยนแปลงหลายรปแบบ เชน การบวมของเซลล (blebbing), การเปลยนแปลงของเยอหมเซลลเชนการเหยวของเซลล, นวเคลยสแตกเปนชนสวน, โครมาตนหนาตวขน และมการกระตน caspases การกระตน caspase เปนกระบวนการทส าคญทเปนการเรมตนใหเกด apoptosis เชนท าใหตวรบทเยอหมพลาสมาเสยหาย (caspase 8), มความผดปกตทไมโตคอนเดรย (caspase 9) caspases สามารถเปนไดทงตวเรมตนหรอตวท าใหเกด apoptosis ตวอยางของ caspases ทเปนตวเรมตนใหเกด apoptosis ไดแก caspases 8 และ caspases 9 สวน caspase ทเปนตวท าใหเกด apoptosis ไดแก caspases 3 และ caspases 7 ทสงผลให DNA เสยหายได (Salvesen & Abrams, 2004) cisplatin ท าใหเซลลตายโดยกระตนใหเกด apoptosis การทเซลลบางชนดรอดจากกระบวนการ apoptosis อาจเกดจากการดอตอยา cisplatin กระบวนการท าใหเกด apoptosis มสองทางไดแก

1. extrinsic pathway เกดขนเมอ ligand จบกบตวรบของ tumor necrosis factor-α (TNFα) เกดกระบวนการโอลโกเมอไรเซชน ท าใหเกด procaspase 8 ผานโมเลกลทเปนตวแปลงไปเปน death-inducing signaling complex (DISC)

2. intrinsic pathway เกดจากภาวะเครยดของเซลล เชน DNA เสยหายจะปลอย cytochrome-c จากไมโตคอนเดรยท าใหไปกระตน procapase 9 ผานการจบกบ interaction with apoptosis promoting activating factor-1 (APAF-1) และสรางเปน apoptosome complex

9

Bcl-2 ควบคมการเกด apoptosis โดยการควบคมการปลอย cytochrome-c ทตอบสนองตอ DNA เสยหาย cisplatin ท าใหเกดความเปนพษถงระดบยนทไปกระตนวถในกระบวนตาง ๆ ซงสงผลใหเกดไดทง apoptosis และ การดอตอยาเคมบ าบด

รปท 1.4 กลไกการเกด apoptosis และ necrosis ของเซลล จาก cisplatin ความเสยหายของ DNA ท าใหหยดวฏจกรของเซลลยบยงการ transcription และเรมตนการเกด apoptosis ของเซลล ความเสยหายของ DNA ทมากเกนไปท าใหเกดเพมการกระตนของ poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) PARP ตด NAD+ และเปลยน ADN-ribose moieties (ADPR) ไปเปนกลม carboxyl ของ nuclear protein จงท าใหเกดการสญเสย NAD+/ATP สงผลใหเซลล necrosis (TCR, transcription-coupled repair) (wang & Linpard, 2005)

1.6 cisplatin และ protein kinase C

protein kinase C (PKC) เปนตวทมความเกยวของกนอยางใกลชดกบ phospholopid ซงมความส าคญในกระบวนการตาง ๆ ของเซลลและการควบคมเซลล ปจจบนมงานศกษาทขดแยงกนเกยวกบ PKC และการตอบสนองตอ cisplatin ผลของ PKC ตอ cisplatin จะตอบสนองในรปแบบใดขนอยกบรปแบบไอโซไซมของ PKC ตามบรบทของเซลล

1.7 cisplatin และ mitogen-activated protein kinase (MAPK) mitogen-activated protein kinase (MAPK) เปนกลมของ enzyme ทท าหนาทตวกลางในการรบสญญาณจากภายนอกทมบทบาทส าคญในทางชววทยาหลากหลายอยาง เชน ควบคมการแบงตว การ differentiate การอยรอดของเซลลการปรบกจกรรมตาง ๆ ของเซลล

10

และการเคลอนทของเซลล enzyme กลมนท างานโดยไปปรบความสามารถในการท างานของโปรตนเปาหมายทจ าเพาะภายในเซลล โดยการเตมหม phosphate เขาไปยง protein เปาหมายท ต าแหนงกรดอะมโน serine หรอ threonine ทจ าเพาะ MAPK จงจดเปนกลม enzyme ทเรยกวา serine/threonine kinase cisplatin กระตนการท างานของ extracellular-signal-regulated kinase (ERK) p53 ตอบสนองตอการเสยหายของ DNA เพราะ ERK เตมหมฟอสเฟตใหกบ p53 ท าใหมการเพมจ านวนของ p21 ไปยบยงการเจรญของเซลลและท าให DNA เสยหาย ดงนนการกระตน ERK ท าใหวฏจกรของเซลลหยดลงและเหนยวน าใหเกดการเสยหายของ DNA ผาน p53

1.8 cisplatin และ jun amino-terminal kinase (JNK) c-Jun N-terminal kinase หรอ stress activated protein kinase เปนโปรตนทตอบสนองของเซลลตอภาวะกดดนตางๆ ถกกระตนไดจากตวกระตนหลายตว เชน DNA ทเสยหาย cisplatin ทอยในรป cis และ trans สามารถกระตน JNK pathway ได เมอ p73 ซงเปนตวกระตน apoptosis ของ p53 จบกบ JNK ท าให cisplatin เหนยวน าใหเกด apoptosis

1.9 cisplatin และ p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) ภาวะกดดนจากสงแวดลอม (environmental stress) เปนตวการทส าคญทท าให cisplatin เหนยวน าใหเกด apoptosis ดวยการกระตนโปรตนในกลม p38 MAPK มการศกษาพบวา EGFR เปนสารตงตนส าหรบ p38 MAPK และ cisplatin เคลอนเขาไปในเซลลไดรบการกระตนจากการเตมหมฟอสเฟตของ p38 ใหกบ receptor p38 MAPK รวมกบ p53 กระตนใหมการเพมขนของยนทท าใหเกด apoptosis ไดแก PUMA และ NOXA จงสงผลใหเซลลเกด apoptosis ดงนน p38 MAPK จงมบทบาทส าคญในการควบคมให cisplatin เหนยวน าใหเกดการตายของเซลล

1.10 cisplatin และ AKT AKT เปนโปรตนทอยในกลมของ serine / threonine kinase เกดจากการถกกระตนจาก growth factors ตางๆ เชน PDGF กระตนการเกด phosphorylation ของ phosphoinositide 3-kinase (PI3K) ซงจะไปกระตนใหปลอยโปรตน AKT จากเยอหมเซลล โปรตน AKT น จะท าใหเกดกระบวนการ phosphorylation ของสารสอประสาทตางๆ เชน BAD FKHR, caspase 9 เปนตน AKT มความส าคญตอกระบวนการตางๆ ภายในเซลลไดแก การแบงตวเพมจ านวนของเซลล การอยรอดของเซลล มรายงานการศกษาพบวา cisplatin เหนยวน าใหเกดความเสยหายตอ DNA ท าใหเกด phosphorylation ของ BAD ท ser136 ผาน AKT การศกษากอนหนานพบวา cisplatin เหนยวน าให DNA เกดความเสยหายกระตนใหเกด

11

phosphorylation ของ BAD ทง ser-112 ผาน ERK cascade และ ser-136 ผาน PI-3 K-PKB/Akt cascade การศกษาในเซลลมะเรงรงใขโดยการยบยง cascade ทงสองนพบวาการใหยา cisplatin มประสทธภาพมากขน

1.11 cisplatin ท าใหเกดความเสยหายตอ DNA การกลายพนธ (mutation) เกดจากหลายสญญาณทเกยวของกบความเครยด DNA ทไดรบความเสยหายจะมการกระตนการตรวจสอบวงจรเซลล ดงนนจงมการชะลอความกาวหนาของวงจรเซลลเพอการซอมแซม หรอเพอขจดเซลลอยางถาวรโดยการกระตนใหเกดการตายของเซลล การตอบสนองของเซลลตอ cisplatin เหนยวน าใหเกดการเสยหายของ DNA จะตดสนวาเซลลจะมชวตอยหรอตาย

1.12 p53 และความเสยหายขอ DNA เปนการตอบสนองตอ cisplatin p53 เปนโปรตนทมชวตชวงเวลาสนๆ เปน transcription factor ทควบคมวฏจกรเซลล ซงถกกระตนโดย ataxia telangiectasia mutated (ATM) ในสญญาณของ DNA ทเสยหาย ในภาวะปกต p53 จะจบอยกบ binding protein เชน MDM2 ซงจะสงเสรมการท าลาย p53 ผานกระบานการ ubiquitin/proteasome cell เมอไดรบ stress p53 กจะถกกระตน สงผลใหเกดการยบยง cell cycle และการซอมแซม DNA หรอ เกดการเสอมสลายของเซลล

1.13 ผลขางเคยงจากยา cisplatin 1.13.1 ผลขางเคยงจากยา cisplatin ตอระบบหวใจและหลอดเลอด มรายงานวามการเกดอบตการณสงของโรคหวใจและหลอดเลอดในผปวยท

ไดรบการท าเคมบ าบดจากยา cisplatin มทงในแบบเฉยบพลนหรอระยะยาว cisplatin ท าใหเกดการอดตนของหลอดเลอดแดงทไมสามารถรกษาใหหายขาดได (Grenader et al., 2006) ในผปวยบางรายทไดรบยา cisplatin พบวาเกดการฉดขาดขนในผนงหลอดเลอดแดง (Ghosh et al., 2008) การตดตามผลในระยะยาวในกลมผปวยมะเรงอณฑะทไดรบยา cisplatin เมอเทยบกบกลมควบคมทเปนปกตพบวา ผปวยทไดรบ cisplatin มการเพมขนความชกของโรคความดนโลหตสง (Sagstuen et al., 2005)

1.13.2 ผลขางเคยงจากยา cisplatin ตอระบบอนๆ 1. hepatotoxicity การไดรบยา cisplatin ในปรมาณสงจะท าใหเกดความเปนพษตอตบได (dos

Santos et al., 2007)ภาวะเครยดออกซเดชน (oxidative stress) เปนสาเหตหลกทท าใหเกดความเปนพษทตบเนองจากการไปลด glutathione GSH (Yilmaz et al., 2004) ประกอบกบมหลายงานศกษาพบวาระดบ MDA ของตบเพมขนอยางมนยยะส าคญและมการลดลงของสาร

12

ตานอนมลอสระในหนทไดรบยา cisplatin (Yilmaz et al., 2005) ตวชวดทมความส าคญโดยตรงทเกยวของในการกอใหเกดความเสยหายและความเปนพษตอเซลลคอ transaminase เพราะเปนไซโทพลาซมทถกปลอยตวเขาสระบบไหลเวยนหลงจากเซลลไดรบความเสยหาย การเพมขนของระดบ enzyme ของตบเซรมและบลรบนเปนตวชวดวาตบไดรบความเสยหาย (İşeri et al, 2007) ความเปนพษของ cisplatin ตอตบมการแสดงออกของ enzyme cytochrome P450-2E1 ทเพมขน การศกษาสงเกตการเปลยนแปลงทางจลพยาธวทยาพบวาความเสอมของเซลลตบรวมกบมการอกเสบของเซลลรวมดวย (Kart et al., 2010) ปจจบนไดมการศกษาถงวธการปองกนความเปนพษตอตบจาก cisplatin โดยใชตวยาตาง ๆ เชน selenium และ วตามนอ

2. nephrotoxicity ไตเปนอวยวะทมการสะสมของ cisplatin มากทสดและเปนเสนทางหลกส าหรบ

การขบออก ความเขมขนของ cisplatin ทสะสมในเยอบผวในหนวยกรองไตสวนตนมมากกวาในเซรมถง 5 เทา (Kuhlmann et al., 1997) การสะสมของ cisplatin ในปรมาณสงนท าใหเกดความเปนพษตอไต การสงเคราะหจากกรดอะมโน lysine และ methionine ท าใหเกดสารประกอบแอมโมเนยมทเรยกวา carnitine ซงจ าเปนส าหรบการขนสงกรดไขมนจาก cytosolเขาไปในไมโตคอนเดรยเพอสลายไขมนสรางพลงงาน การเสยหายของไตสงผลใหเกดการยบยงการการสงเคราะห carnitine และการดดซม carnitine ทกรองไตสวนตนเนองจากการผลต Carnitine ลดลง การศกษาในชวงไมกปทผานมาระบวา cisplatin สามารถเขาไปในเซลลผานเยอหมไดโดยสองชองทางคอ copper transporter-1 (Ctr1) และ organic cation transporter-2 (OCT2) ซง OCT2 พบมากในหนวยกรองไตสวนตน (Ishida et al., 2002) cisplatin ถกก าจดทไตโดยการกรองสารทโกลเมอรลสและการขบออกททอไต (Yao et al., 2007)

3. ototoxicity ความเสยหายทพบมากทสดของ cisplatin ทท าใหเกดความพษตอหพบในคอ

เคลย (cochlea) ประกอบไปดวยการสญเสยของเซลลขนดานนอก การศกษาพบวา cisplatin มผลตอ stria vascularis ท าใหมความบกพรองในการดดซมและการหลง K+ เขาสของเหลวเรยกวา endolymph และการเสยหายของสมดลเมแทบอลซมของเซลลขนทงทอยดานนอกและดานในสงผลตอการเปลยนแปลงทางโครงสรางและการท างานบกพรอง (Casares et al., 2012)

13

1.14 reactive oxygen species (ROS) และ cisplatin ปฏกรยาทางเคมทมออกซเจนเปนองคประกอบหรอเรยกวา reactive oxygen

species (ROS) การเกดปฏกรยาเกดขนเมอมอเลกตรอนทโดดเดยว (unpaired electron) อยในวงโคจรของโมเลกลท าใหไมเสถยร ท าใหอนมลอสระเปนสารทมความไวในการเขาท าปฏกรยาทางเคมกบสารอนสงมาก โดยอนมลอสระจะไปแยงจบหรอดงเอาอเลกตรอนจากโมเลกลหรออะตอมสารทอยขางเคยงเพอใหตวมนเสถยรเชนไฮโดรเจนเปอรออกไซด (H2O2) ตวอยางของ ROS ดงแสดงในรปท 1.4 ROS สามารถเกดขนไดจากหลายแหลงทงภายในและภายนอกเซลล หนงในแหลงทมาหลกของ ROS ภายในเซลลจากไมโตคอนเดรยทซปเปอรออกไซด •O2

- ถกสรางขนเปนผลผลตไดจากกระบวนการ oxidative phosphorylation ปกต •O2

- นอกจากกจะท าใหเกดอนมลอสระ ROS แลว •O2

- มความสามารถไวตอการเกดปฏกรยากบไนตรกออกไซด (NO) กลายเปนอนมลอสระทมไนโตรเจนเปนองคประกอบส าคญ (reactive nitrogen species, RNS) เชน peroxynitrite และไนโตรเจนสายพนธตาง ๆ ไดแก NO, peroxynitrite และ nitrogen dioxide ผานกจกรรมของ enzyme เชน nitric oxide synthase 2 (NOS2) and NADPH oxidase (NOX)

รปท 1.5 รปแบบหลกและแหลงทมาของ reactive oxygen species (ROS): อนมลอสระกลมทมออกซเจนเปนองคประกอบมกเกดขนเปนผลผลตทไดจากกระบวนการหายใจระดบเซลลในไมโตคอนเดรย และยงสามารถเกดจากกจกรรมของ NADPH และ lipoxygenase เมอปลอยออกมาแลว ROS สามารถท าปฏกรยาไดกบ NO ทน าไปสการสราง reactive nitrogen species (RNS) โมเลกลของอเลกตรอนอสระจะแสดงเปนสแดง (Damian et al., 2012)

14

ROS มบทบาทในการสงสญญาณและการสรางสมดลของเซลล (Devasagayam et al., 2004) ตวอยางในระบบหลอดเลอด •O2

- มบทบาทในการจ ากดระยะเวลาของการตอบสนองตอ NO, เปนตวกลางส าคญในการท างานของหลอดเลอด เชนการควบคมกลามเนอเรยบหลอดเลอดและความดนโลหต การกระตนเกลดเลอด และการสงสญญาณของเซลลหลอดเลอด (Guzik et al., 2002) อยางไรกตามนอกเหนอจากบทบาททางสรรวทยาตามปกตแลวการผลต ROS ทมากเกนไปอาจเกดขนไดเพอตอบสนองตอความเครยดเชนความเปนพษ ความเสยหายจากรงสและโรคตาง ๆ สงผลใหความเครยดออกซเดชนเฉพาะทและตอบสนองตอการปรบตว

เซลลมกลไกการปองกนทหลากหลายซงขดขวางอนมลอสระเพอปองกนหรอจ ากดความเสยหายภายในเซลลและชวยลดผลกระทบทเปนอนตรายของ ROS เชนสารตานอนมลอสระทมน าหนกโมเลกลต า(วตามนซ, วตามนอ, กลตาไธโอน) และ enzyme ตานอนมลอสระ (thioredoxins, superoxide dismutase (SOD), catalase และ glutathione peroxidase) ผลจากกลไกการตานอนมลอสระเหลานท าใหระดบของ ROS ต า อยางไรกตามหากระดบของ ROS เพมขน ระบบปองกนไมสามารถท างานไดอยางมประสทธภาพท าใหเกดความเสยหายตอเซลล ถาเกดความไมสมดลของ ROS และสารตานอนมลอสระแลวจะท าใหเกดความเสยหายตอเซลล ความเสยหายนอาจเปนผลมาจากการเปลยนแปลงภายในเซลล เชน DNA โปรตนและไขมน และอาจปรบเปลยนสญญาณท าใหขาดสญญาณทชวยด ารงชพ (survival signaling)

รปท 1.6 ผลกระทบหลกทเกดจากยาทท าใหเกด oxidative stress ในเซลล การเพมขนของ ROS ภายในเซลลอาจท าใหเกดความเสยหายของ DNA ออกซเดชนของไขมนและโปรตน การสงสญญาณของ MAP kinase เปนตวกลางทส าคญในการตอบสนองของเซลล (Damian et al., 2012)

15

มหลกฐานทชดเจนวา oxidative stress ทเกดจากยา cisplatin เปนกลไกของความเปนพษในเนอเยอตาง ๆ ดงแสดงในรปท 1.5 ROS มผลตอเซลลเปาหมายส าคญ ไดแก DNA, ไขมน และโปรตนโมเลกลเลกๆ ROS อาจท าลายสวนประกอบของเซลลทส าคญเหลานในระดบโมเลกลทสงผลตอการรอดชวตของเซลลโดยผาน enzyme kinase ปจจยเหลานอาจมบทบาทส าคญในการเรมตนการตายของเซลลซงเปนการตอบสนองภาวะ oxidative stress

1.15 NADPH oxidases NADPH oxidases เปนแหลงส าคญของ ROS ในระบบหลอดเลอด การสราง superoxide จากโมเลกลของ oxygen ใช NADPH เปนตวให electron โดย oxidase เปน enzyme ทประกอบดวยหนวยยอยหลายตวมารวมกนจาก membrane จบกบ Nox ตวอยางของ NADPH oxidase subunits ในผนงหลอดเลอดพบวาม Nox1 (Lassègue et al., 2001) และ Nox4 (Ellmark et al., 2005) ซงพบในชนกลามเนอเรยบของหลอดเลอด ขณะท Nox2 (Görlach et al., 2000) พบมากในชน endothelium การเกด atherosclerosis ในคนเกยวของกบการเพมขนของ NADPH oxidase subunits ไดแก Nox2, p22phox, p47phox และ p67phox ในหลอดเลอดแดง coronary artery (Guzik et al., 2006) การศกษาพบวามการแสดงออกของ Nox2 ใน endothelium ของหลอดเลอดแดงของ apolipoprotein E-knockout (ApoE-KO) mice กอนการปรากฏตวของรอยโรค atherosclerosis ในหน mice ขณะท macrophages เปนแหลงส าคญของ Nox2 ในการท าใหเกด plaques (Judkins et al., 2010)

1.16 lipid peroxidation oxidative stress สามารถกอใหเกดความเสยหายทรนแรงตอเยอหมเซลลทซง

สงผลใหเกด lipid peroxidation ซงจะแปลงไขมนทไมอมตวใหเปน lipid hydroperoxides ทมข ว lipid peroxidation เกดจากปฏกรยาออกซเดชนแบบลกโซของกรดไขมนชนดไมอมตว อนมลอสระเพยง 1 อนมลสามารถท าใหเกดลปดเปอรออกไซด เปนจ านวนหลายรอยโมเลกลกอนทจะสนสดปฏกรยา เนองจากปฏกรยา lipid peroxidation สามารถเกดไดงายกบเยอหมเซลลทประกอบดวยลปด 2 ชน การเกด lipid peroxidation กบไขมนในเยอหมเซลลท าใหเยอหมเซลล มคณสมบตทเปลยนไป สงผลกระทบตอ enzyme และ receptor ตาง ๆ ทอยในเยอหมเซลล เพมปรมาณของเหลวในเยอหมเซลล และท าใหของเหลวในเซลลไหลออกนอกเซลล (Avery, 2011) เปนสาเหตในเกดโรคตาง ๆ ไดอกดวย ผลผลตทเกดขนมาจาก lipid peroxidation ไดแก สารไฮโดรคารบอน เชน ethane, ethene และ penthane รวมถง สาร ketone และสาร aldehyde เปนตน ซงสาร aldehyde ทมความส าคญ คอ malondialdehyde (MDA) MDA ท า

16

ปฏกรยากบฐานกรดนวคลอกเพอสราง dG, dA และ dC adducts และท าใหเกดการกลายพนธ (Niedernhofer et al., 2003) มการศกษาหลายชนทระบวาการวดคา MDA จากเซรมสามารถใชพยากรณความรนแรงของโรคทเกยวของกบระบบหวใจและหลอดเลอดได (Stocker & Keaney, 2004)

lipid peroxidation เปนปฏกรยาลกโซ ประกอบดวย 3 ขนตอน ไดแก ปฏกรยาเรมตนของการเกดโซ (initiation) ปฏกรยาการทวเพมขน (propagation) และการสนสดปฏกรยา (termination) ปฏกรยาลกโซเรมตนดวยการมอนมลอสระเกดขน และอนมลอสระนเขาท าปฏกรยากบลปดและท าใหเกดอนมลลปดดงภาพ 1.6 ทแสดงถงกลไกการเกดปฏกรยา lipid peroxidation

รปท 1.7 กลไกการเกดปฏกรยา lipid peroxidation (Laguerre et al., 2007)

17

2. มะพด

รปท 1.8 ลกษณะผลสกและผลดบของมะพด (นจศร 2547)

ชอสามญ Garcinia ชอวทยาศาสตร Garcinia dulcis Kurz จดอยในวงศมงคด

(Guttiferae) ตนมะพดเปนพนธไมทมถนก าเนดในเอเชยตะวนออกเฉยงใต ตนมะพดเปนไมยนตนขนาดกลาง มความสงประมาณ 7-15 เมตร ล าตนตงตรง เปลอกล าตนเปนสน าตาลเขม เรยบ และแตกเปนรองตน ๆ ตามยาวของล าตน โดยจะพบมากทางภาคตะวนออกเฉยงใต และภาคใตของประเทศ และยงพบในประเทศอนโดนเซย มาเลเซย และฟลปปนส เรยกวา mundu ลกษณะใบของตนมะพดเปนใบเดยว ลกษณะของใบเปนรปใบหอกหรอแกมรปขอบขนาน โคนใบกวางมนตดตรง เวาเลกนอยคลายกบรปหวใจและคอย ๆ สอบเรยวเลกไปทปลายใบ สวนขอบใบเรยบ ใบมขนาดกวางประมาณ 8-12 เซนตเมตรและยาวประมาณ 15-25 เซนตเมตร แผนใบมกเปนคลนเลกนอย เนอใบเหนยวและหนา หลงใบเรยบสเขยวเขม สวนทองใบมขนละเอยด เมอแหงเปนสเหลองอมสเทา สวนกานใบสนยนขรขระยาวประมาณ 1.5-2 เซนตเมตร และมขนบาง ๆ ขนปกคลม ดอกมะพดเปนสขาวอมเหลอง ดอกเปนแบบแยกเพศอยในตนเดยวกน ดอกมกลบดอก 5 กลบซอนกนอย ดอกมลกษณะตมเปนรปทรงกลม สวนกลบดอกมลกษณะเปนรปทรงกลม หนาและเปนสเหลองออน ผลมะพดมลกษณะเปนรปทรงกลมหรอเปนรปไข มขนาดเสนผานศนยกลางประมาณ 5-6 เซนตเมตร ผวผลเรยบและเปนมน ผลออนสเขยว เมอสกเตมทจะเปนสเหลองอมสสม เนอในผลเปนสเหลอง มรสเปรยวอมหวาน มะพดเปนพชสมนไพรทมสรรพคณทางทางยาซงชาวบานนยมน ามาใชเพอรกษาชวยแกอาการไอ อาการเจบคอ ชวยขบเสมหะ แกอาการรอนใน ผลมฤทธเปนยาระบายออน ๆ (นจศร, 2547) สารสกดจากมะพดประกอบดวย camboginal, dulciflavan, epicathechin, lupalbigenin, mangostin และ morelloflavone

18

3. morelloflavone

รปท 1.9 โครงสรางของ morelloflavoneประกอบดวย apigenin และ luteolin (Deachathai et al., 2005)

morelloflavone เปนสารสกดจากมะพด พบไดทงในใบ ผล ดอก เปนสารใน

กลม biflavonoid ประกอบดวย apigenin และ luteolin มน าหนกโมเลกล 556 เปนสารในกลม flavonoid morelloflavone มฤทธตานการหลง phospholipase A2 (PLA2) ในทดลองแบบ in vitro ซงสามารถยบยงการหลง PLA2 ในน าไขขอของมนษยและในพษของผง และยงมฤทธตานการอกเสบในหน mice ทถกเหนยวน าท าใหหอกเสบจาก 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA) ใหสามารถยบยงการหลง PLA2 โดยสามารถลดอาการบวมและลดระดบ myeloperoxidase ใน ear homogenates (Gil et al., 1997) นอกจากน morelloflavone สามารถยบยงความเปนพษ การบวมและการตานการแขงตวของเลอดทเกดจาก PLA2 จากพษง (Pereañez et al.,2014)

morelloflavone มฤทธยบยงเชอ HIV ชนด HIV-1 reverse transcriptase (HIV-1 RT) และ HIV-1 (strain LAV-1) ในเมดเลอดขาวของมนษย (Lin et al., 1997)

การศกษาของ Deachathai และคณะ (2005) พบวา morelloflavone มความสามารถดกจบอนมลอสระและมฤทธตานเชอแบคทเรย ทความเขมขนของ morelloflavone 10 µM สามารถก าจดอนมลอสระ DPPH radical ได 51% สอดคลองกบคา IC50 ท 13.00 µM

moreloflavone มความสามารถในการลดระดบไขมนในเลอดและปองกนการเกด atherosclerotic การยบยงการออกซเดชนของ LDL ในหลอดเลอดแดงในกระตายทถกชกน าใหมไขมนในกระแสเลอดสง นอกจากนปองกนการเกด lipid peroxidation สงผลใหปรมาณ MDA ในพลาสมาลดลง (Decha-Dier et al., 2008)

19

morelloflavone สามารถยบยง migration ของเซลลกลามเนอเรยบของหลอดเลอดโดยการลด activation ของ migration-related molecule ซงทความเขมขน 0.1-10 µM ชวยยบยงการเกด phosphorylation ของ ERK ซงเกยวของกบการเจรญและการเคลอนของเซลล นอกจากนยงพบวา morelloflavone ลดการเกด phosphorylation ของ FAK, c-Src และ ERK และกจกรรมของ RhoA ไดอยางมนยส าคญ นอกจากนในงานศกษาเดยวกนพบวา morelloflavone ยบยงการขยายตวของ neointimal ทเกดจากการบาดเจบในของหลอดเลอดแดงในหน mice ไดอกดวย โดย neointimal proliferation เกดจากการทหลอดเลอดมการบาดเจบแลวมการกระตน vascular smooth muscle cell (VSMC) ใหเพมจ านวนและเคลอนยาย cell เขาสผนงหลอดเลอดชน intimal สงผลใหเพมความหนาของผนงหลอดเลอดชนดงกลาวมากขนจนเกดเปนโรคหลอดเลอดแดงอดตน (atherosclerosis) (Pinkaew et al., 2009)

morelloflavone สามารถยบยงการท างานของ HMG-CoA reductase ทเตรยมโดยถายฝากยน plasmid pET 17b-CD-HMG ใน E.coli ซงเปน enzyme ทควบคมการสงเคราะหคอเลสเตอรอลในรางกาย โดยวดความสามารถเรงปฏกรยาในอตราสงสด (Vmax) และคาคงทของ Michaeliis (Km) โดยพบวาสามารถยบยงกจกรรมของ enzyme ไดด ซงการยบยงนเกดจากหนวยยอยของ morelloflavone แตละตวทต าแหนงวงแหวนฟนอลคเดยว (ring B) เขาแยงจบกบ enzyme (Tuansulong et al., 2011)

การศกษาผลของ morelloflavone ตอการคลายตวของหลอดเลอดในหนแรททถกตดแยกจากตวพบวา morelloflavone มฤทธท าใหหลอดเลอดคลายตวโดยอาศยกลไกกระตนผาน endothelium ซงกระตนการหลงไนตรกออกไซดเปนหลก และกระตนผานทาง KCa และ KATP channel (Lamai et al., 2013)

ในการศกษาครงนจะให morelloflavone เขาทางชองทอง และเนองจากยงไมมการทดลองมากอนวา morelloflavone สามารถถกดดซมเขากระแสเลอดไดมากนอยเพยงใด จงใชขนาดของ morelloflavone 0.1, 1 และ 10 เทา ของความเขมขนทไดจากการศกษาใน organ bath ของ Lamai et al., (2013) โดยค านวณวาการกระจายของยาจะอยในสวน extracellular fluid ซงมคา 20% ของน าหนกตว ดงนนขนาดทใชฉดทางชองทองจะเทากบ 0.1, 1 และ 10 mg/kg BW

4. กลามเนอเรยบหลอดเลอด (vascular smooth muscle) เลอดไหลเวยนในรางกายผานทางหลอดเลอด หลอดเลอดแดงเปนหลอดเลอดท

น าเลอดออกจากหวใจไปสสวนตางของรางกาย หลอดเลอดแดงทเลกทสดเรยกวา arteriole ซง

20

ตอกบเสนเลอดฝอยเลก ๆ ซงมการแลกเปลยนสารอาหารและของเสย จากนนมการรวมกบหลอดเลอดอนทออกจากเสนเลอดฝอยเพอใหเปนหลอดเลอดด าเลกทน าเลอดไปยงหลอดเลอดด าเสนเลอดใหญแลวสงเลอดกลบไปสหวใจ

หลอดเลอดแดงเปนหลอดเลอดทท าใหเลอดไหลออกจากหวใจซงหลอดเลอดแดงทงหมดมผนงหนาพอสมควรทสามารถทนตอความดนเลอดสงทไหลออกมาจากหวใจ อยางไรกตามหลอดเลอดทอยใกลกบหวใจมผนงทหนาทสดซงมเสนใยทมความยดหยนสง หลอดเลอดแดงชนดนเรยกวาหลอดเลอดแดงยดหยน (elastic artery)

ผนงหลอดเลอดแดงประกอบดวย 3 ชน ไดแก 1. tunica intima tunica intima (หรอทรจกกนในชอ tunica interna) ประกอบดวยชนเยอบผว

และเนอเยอเกยวพน ในชนนมการเคลอบบผวดวยเยอบผวชนดพเศษทเรยกวา endothelium ซงมความตอเนองตลอดแนวของหลอดเลอด ความเสยหายทเกดขนท endothelium และเลอดเขาไปสเสนใยคอลลาเจนขางใตเปนหนงในสาเหตหลกของการเกดเปนลมเลอด endothelium จงเปนขอบเขตระหวางเลอดในหลอดเลอดและผนงของหลอดเลอด ถดจาก endothelium เปน

basement membrane หรอ basal lamina ซงเปนตวทท าให endothelium กบเนอเยอเกยวพนยดตดกน basement membrane ใหความแขงแรงในขณะทยงรกษาความยดหยนและเปนเยอเลอกผานทใหสารบางชนดสามารถผานทะลได เยอชนนอกสดในชน tunica intima มเนอเยอเกยวพนเลกๆ ทประกอบดวยเสนใยยดหยนเพอใหมความยดหยนเพมเตม นอกจากนยงมเสนใยคอลลาเจนบางสวนเพอเพมความแขงแรง

ในหลอดเลอดแดงขนาดใหญมชนหนาทแตกตางจากเสนใยยดหยน เรยกวาเสนใยยดหยนชนใน (internal elastic membrane) ซงเปนขอบเขตกบชน tunica media เชนเดยวกบสวนประกอบอน ๆ ในชน tunica intima เสนใยยดหยนชนในนมโครงสรางทชวยขณะทหลอดเลอดยดออก และเตมไปดวยชองเลกๆ ทอนญาตใหมการแลกเปลยนสารตางๆ ระหวางชนของหลอดเลอด

2. tunica media ชน tunica media เปนชนกลางทส าคญของผนงหลอดเลอด โดยทวไปจะเปน

ชนทหนาทสดในหลอดเลอดแดงและมขนาดหนากวาหลอดเลอดด า ในชนนประกอบดวยชนของกลามเนอเรยบทรองรบโดยเนอเยอเกยวพนทท าจากเสนใยยดหยนซงจะจดเรยงกนเปนวงกลม มชนของกลามเนอตามยาว การหดตวและการคลายตวของหลอดเลอดท าใหขนาดเสนผาศนยกลางของหลอดเลอดลดลงและเพมตามล าดบ ในหลอดเลอดแดงการหดตวของ

21

หลอดเลอดท าใหการไหลเวยนของเลอดลดลงเนองจากกลามเนอเรยบในผนงของหลอดเลอดหดตวท าใหชอง lumen แคบและเปนการเพมความดนเลอด ในท านองเดยวกนการคลายตวของหลอดเลอดเพมการไหลเวยนของเลอดให lumen ขยายและความดนเลอดลดลง ชนกลามเนอเรยบนค าจนโดยเสนใยคอลลาเจนทยดกบชน tunica media ทงชนในและชนนอกควบคไปกบเสนใยคอลลาเจนเปนเสนใยยดหยนจ านวนมากทปรากฏเปนเสนหยก การแบงขอบเขตของ tunica media จาก tunica externa ในหลอดเลอดแดงใหญคอเสนใยยดหยนชนนอก (external elastic membrane) เสนใยนมกไมพบในหลอดเลอดแดงขนาดเลกและในหลอดเลอดด า

3. tunica externa ชน tunica externa หรอ tunica adventitia เปนชนนอกสด เปนเนอเยอท

ส าคญของเนอเยอเกยวพนประกอบดวยเสนใยคอลลาเจน ชนนอกของ tunica externa ไมชดเจน แตคอนขางจะกลมกลนกบเนอเยอเกยวพนทอยขางนอกของหลอดเลอดชวยยดหลอดเลอดไวใหอยในต าแหนงของมน หาก tunica externa ไมไดยดหลอดเลอดไวใหอยกบท หากมการเคลอนไหวใดๆ อาจสงผลใหเกดการรบกวนการไหลเวยนเลอดได

รปท 1.10 โครงสรางปกตของผนงหลอดเลอดแดง (Swift & Weinstein, 2009)

22

4.1 กลไกการท างานของหลอดเลอดแดง กลไกการเกด excitation-contraction coupling โดย Ca2+ เขาส cytoplasm ได

2 ทาง คอ ผาน calcium channel ทเยอหมเซลลและหลงจาก sarcoplasmic reticulum (SR) เมอ Ca2+ เพมจ านวนมากขนจะกระตนใหเกดการสราง crossbridge ระหวาง actin และ myosin filaments ซงเกดขนไดโดย Ca2+ ใน cytoplasm เขาจบกบ calmodulin เกด Ca2+- calmodulin complex ซงจะท าหนาทกระตน enzyme myosin light-chain kinase (MLCK) ท าใหเกด phosphorylation ของ myosin light chains จากนน actin กบ myosin จงจะสราง crossbridge ได แลวเกดการเคลอนทของ actin filament เขาหากน

calcium channel ทเยอหมเซลลของเซลลกลามเนอเรยบในผนงหลอดเลอดมอย 2 ชนด คอ receptor-activated calcium channel ซงเปดจากการกระตนดวยตวกระตนเคมโดยทไมตองเกด electrical excitation พบวาการท างานของ receptor-activated calcium channel เปนกลไกหลกในการเกดการหดตวของเซลลกลามเนอเรยบ สารทสามารถกระตน (agonists) channel น ไดแก catecholamines, serotonin, angiotensin II, vasopressin, endothelin, histamine, neuropeptide Y และ prostanoids เมอม agonists มาจบท receptor ท าให calcium channel เปดและ Ca2+ ใน extracellular fluid (ECF) เคลอนทเขาสเซลล แหลงของ Ca2+ ทใชในการหดตวของกลามเนอเรยบหลอดเลอด นอกจากจะมาจาก ECF แลว ยงไดจากการหลง Ca2+ จาก SR ซงเกดขนเมอ enzyme phospholipase C (PLC) ทเยอหมเซลลกลามเนอเรยบถกกระตน แลวเกดสลาย phosphatidyl inositol 4, 5 bisphosphate (PIP2)ไดเปน diacylglycerol (DAG) และ inositol triphosphate (IP3) จากนน IP3 กระตน SR ใหหลง Ca2+ เขาส cytoplasm การคลายตวของเซลลกลามเนอเรยบหลอดเลอด เกดขนเมอการท างานของ MLCK ถกยบยง ในขณะท Ca2+ ใน cytoplasm ลดลงจากการท Ca2+ ถกป มกลบส SR และ Ca2+ สวนหนงถกสงออกนอกเซลล ผานทาง Ca2+- pump และ Na+- Ca2+ exchanger ทเยอหมเซลล

23

รปท 1.11 กลไกการหดตวของเซลลกลามเนอเรยบในผนงหลอดเลอด (Berne et al., 2010)

4.2 การควบคมการท างานของหลอดเลอดแดง 1. การควบคมโดยระบบประสาท ระบบประสาทมบทบาทส าคญในการควบคมสมดลของหลอดเลอด ตวควบคม

หลกไดแกศนยหวใจและหลอดเลอดในสมองทควบคมทงการท างานของหวใจและหลอดเลอด นอกจากนยงมการตอบสนองทางระบบประสาทจากระบบ limbic และระบบประสาทอตโนมตเปนปจจยส าคญ

1.1 ระบบประสาทซมพาเทตก ระบบประสาทซมพาเทตกเปนศนยกระตนหวใจและหลอดเลอด โดยกระตนการ

ท างานของหวใจดวยการควบคมอตราการเตนของหวใจและปรมาตรของเลอดทออกจากหวใจผานการกระตนระบบประสาทซมพาเทตกจากเสนประสาทในการเรงการเตนของหวใจ postganglionic ของระบบประสาทซมพาเทตกอยท adventitial-medial border ของหลอดเลอดแดงและหลอดเลอดด าทวทงรางกาย venule และหลอดเลอดฝอยทไมมกลามเนอเรยบจะไมไดรบการหลอเลยงโดยตรงจากระบบประสาทซมพาเทตก norepinephrine (NE) ถกปลอยมาจากปลายประสาทซมพาเทตก จบกบตวรบ α1- หรอ α2-adrenergic ทบรเวณเซลลกลามเนอเรยบหลอดเลอด ท าใหมการเพมจ านวนของแคลเซยมในเซลล ดวยการปลอยแคลเซยมจาก sarcoplasmic reticulum (SR) หรอมาจากภายนอกเซลลทเขามาทางชองเปด plasmalemmal Ca2+ channel (Guimarães & Moura, 2001) การเพมขนของแคลเซยมในเซลลท าเกดการหดตวของกลามเนอเรยบหลอดเลอด โดยการกระตนของ calmodulin-dependent myosin light chain kinase ซงจ าเปนส าหรบการกระตน myosin ATPase และการจบกนของ myosin กบ

24

actin filament ในหลอดเลอดประกอบดวยชนกลามเนอเรยบใน tunica media หลายชน แตจะมเพยงชนนอกสดเทานนทไดรบสญญาณจากประสาทซมพาเทตก สวนชนกลามเนอเรยบทอยถดมาเกดการหดตวดวยเนองจากการแพรของ NE และ การสอสารระหวางเซลลหนงไปยงอกเซลลหนง (cell-to-cell communication) ผาน gap junction นอกจาก NE แลวระบบประสาทซมพาเทตกของหลอดเลอดยงประกอบไปดวย neuropeptide Y (NPY) หรอ ATP ทถกปลอยออกมาเปน cotransmitter ซงสามารถท าใหเกดการหดตวไดโดยการกระตนตวรบ NPY Y1 หรอ purinergic P2X ตามล าดบ ท าใหมการเพมขนของคลเซยมในเซลล (Pablo Huidobro-Toro & Verónica Donoso, 2004) 2. การควบคมทางระบบฮอรโมน นอกจากผลโดยตรงอยางรวดเรวและมผลชวงสน ๆ ของระบบประสาทซมพาเทตกในการท าใหเกดการหดตวของหลอดเลอดแดงและหลอดเลอดด าและการท างานของหวใจแลว ระบบประสาทซมพาเทตกยงสามารถกระตนไดอยางยาวนาน โดยกระตนทางออมตอระบบหวใจและหลอดเลอดโดยการกระตนทางระบบฮอรโมน ซงประกอบดวยการหลงฮอรโมนอะดรนาลน (sympathoadrenal system) และ renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) เซลลประสาทตวแรก (preganglionic neuron) ของระบบประสาทซมพาเทตกไปเลยงเซลล chromaffin ของตอมหมวกไตชนในซงท าหนาทในการสงเคราะหและหลง epinephrine (80%) และ norepinephrine (20%) เขาสกระแสเลอดไปควบคมระบบหวใจและหลอดเลอดโดยการกระตนทตวรบ adrenergic ผลทางสรรวทยาของการไหลเวยนของ norepinephrine มความคลายคลงกบ norepinephrine ทปลอยออกมาทางระบบประสาท การหดตวของหลอดเลอดเกดจากตวกระตนจบกบตวรบ α-adrenergic และ β-adrenergic ทหวใจ epinephrine กระตนทงตวรบ α- และ β-adrenergic แตการตอบสนองสทธขนอยกบความเขมขนของ epinephrine จ านวนของตวรบแตละประเภทและความไวตอการตอบสนองของตวรบแตละประเภท epinephrine ทความเขมขนสงท าใหเกดการหดตวของกลามเนอลาย แตหลอดเลอดทมความตานทานของกลามเนอลาย กลามเนอหวใจและตบจะขยายตว ขณะทหลอดเลอดทไต ผวหนงและระบบทางเดนอาหารจะหดตว ดงนนหนงในการตอบสนองทางสรรวทยาทส าคญของ epinephrine คอการล าเลยงสารตาง ๆ จากหวใจออกระหวางอวยวะตาง ๆ ฮอรโมนอกหนงตวทส าคญใน RAAS คอ renin เปนเซลลเฉพาะในไตทพบใน juxtaglomerular ตอบสนองตอการไหลเวยนของเลอดทลดลงโดยการหลง renin เขาสกระแสเลอด Renin เปลยนโปรตนพลาสมา angiotensinogen ซงผลตโดยตบใหอยในรปแบบทใชพรอมใชงาน angiotensin I จากนน angiotensin I ทไหลเวยนอยในกระแสเลอดและถกแปลงเปน angiotensin II ทปอด ปฏกรยานไดรบการกระตนดวยเอนไซม enzyme angiotensin converting enzyme (ACE)

25

angiotensin II ท าใหหลอดเลอดหดตวท าใหความดนโลหตเพมขน นอกจากนยงชวยกระตนการปลอย ADH และ aldosterone ซงเปนฮอรโมนทผลตโดยตอมหมวกไต aldosterone ชวยเพมการดดซมโซเดยมเขาสเลอดโดยไต เนองจากน าจะตามโซเดยมจงเปนเพมการดดซมน ากลบคนดวย ปรากฏการณนจะเพมปรมาณเลอดและเพมความดนโลหต angiotensin II ยงชวยกระตนศนยควบคมความกระหายของใน ไฮโปธาลามสเพอใหดมน ามากขนท าใหมการเพมปรมาณและความดนโลหต

5. endothelium endothelium เปนเนอเยอชนเดยวอยช นในสดของหลอดเลอดและตอมน าเหลอง ในผใหญ Endothelium มจ านวนมากถง 10 ลานลานเซลล endothelial cell เจรญมาจาก mesoderm รวม hematopoietic cell แตมลกษณะและหนาทแตกตางกน ในหลอดเลอดสวนมาก endothelial cell มลกษณะทตอกนและไมเปนตาขาย แตมนสามารถเชอมใหเปนตาขายไดขนอยกบหนาทของสวนตาง ๆ ของรางกาย endothelial cell มความสามารถในการสงเคราะหโปรตนทเกยวกบ basal lamina เชน matrix metalloproteinase ซงเกยวของกบการเปลยนแปลงรปรางของหลอดเลอด endothelial cell เสยหายเกดไดจากหลายสาเหต เชน โรคหลอดเลอดแดงแขง (atherosclerosis) เกดจาก ทมการหนาตวของผนงหลอดเลอดจากการสะสมไขมนและ fibrous tissue ทไปทบถมบน endothelial cell ซงกอใหเกด plaque และการแขงตวนกอใหเกดการตบของหลอดเลอด endothelial cell ทมอายมากกจะเสอมลงตามอายจากภาวะ telomere shortening ซงเกยวโยงกบอายของผสงวย แตยงมปจจยอนทเปนตวเรงใหเกดความเสอม ไดแก atherosclerosis, ความดนโลหตสง, การสบบหร, และปจจยตาง ๆ ทสงผลใหอตราการเตนของหวใจสงขน ท าใหปรมาณของอนมลอสระเพมขน สงผลใหเกดการหยดการเจรญของเซลล ขาดความสามารถในการซอมแซมความเสยหายทเกดในเซลล ท าให endothelial cell เสอมไปในทสด

5.1 การสรางสารทส าคญ 5.1.1 vasodilator 1. nitric oxide (NO) กลามเนอเรยบหลอดเลอดตอบสนองตอการกระตนของของระบบประสาทซม

พาเทตกและพาราซมพาเทตกเพอเพอรกษาสมดลความตงตวของระบบหวใจและหลอดเลอด การศกษาของ Robert Furchgott และคณะใน ค.ศ. 1980 พบวา acetylcholine ท าใหเกดการคลายตวของหลอดเลอดแดงของกระตายผาน endothelium เรยกวา endothelium-derived

26

relaxing factor (EDRF) ซงตอมามการคนพบวาเปน NO ท าให Robert Furchgott และผรวมวจยของเขาไดรบรางวลโนเบลในป ค.ศ. 1998 (Ignarro et al., 1987) เซลล endothelium ตอมาไดรบการยอมรบวามบทบาทส าคญในการควบคมความตงตวของหลอดเลอด NO ถกสรางมาจาก L-arginine โดย enzyme endothelial nitric oxide synthase (eNOS) การกระตนของ NOS ท าใหมการปลอยอนมลอสระ NO ซงงายตอการแพรผานเยอหมเซลล สงผลใหเกดการกระตน soluble guanylyl cyclase น าไปสการเพมขนของ cGMP ภายในเซลลกลามเนอเรยบหลอดเลอด ท าใหหลอดเลอดคลายตว (Moncada & Higgs, 1991) NO มบทบาททหลากหลายในการรกษาสภาวะสมดลของหลอดเลอด นอกจากจะกอใหเกด vasodilation แลวยงเปนตวตานการเจรญของเซลล, สารตานอนมลอสระและตานการอกเสบ และยงยบยงการเกดภาวะหลอดเลอดแขงไดอกดวย การท างานของ eNOS สามารถถกกระตนทรเซปเตอรผานตวกระตนตาง ๆ ไดแก bradykinin, acetylcholine และ thrombin ผาน palmitoylation โดยจบกบ calmodulin/calcium และหลงจาก plasma membrane

ปจจยเสยงทวไปซงท าใหเกดโรคทางระบบหวใจและหลอดเลอดไดแก ไขมนในเลอดสง ความดนโลหตสง การสบบหร และโรคเบาหวานลวนเกยวของกบการลดลงของระดบ NO ในผนงหลอดเลอด แทจรงแลวการท างานผดปกตของเนอเยอบโพรงหลอดเลอด (endothelial dysfunction) หมายถงการลดลงของฤทธทางฃวภาพของ NO เนองจากมรายการศกษาถงการรกษาโดยกระตนการหลง NO พบวาใหผลตอบสนองทดสามารถรกษา endothelial dysfunction และปองกนการเกดหลอดเลอดหนาตว (atherogenesis) นอกจากนยาทให NO (NO donor) เชน nitroglycerine ใชกนอยางแพรหลายในผปวยทเปนโรคทางระบบหวใจและหลอดเลอด (Yetik-Anacak & Catravas, 2006)

27

รปท 1.12 การควบคม endothelial nitric oxide synthase (eNOS) ในเยอหมเซลล eNOS จบกบ caveolin-1 ซงจะปองกนไมใหจบกบ calmodulin และเกดการกระตน eNOS การเพมขนของแคลเซยมภายในเซลลจะเปนตวกระตนท าให eNOS เคลอนออกจาก caveolae และการจบกบ calcium–calmodulin (CaM) complex จากนน hsp90 กมารวมเพอให calcium-activated CaM และปลอยจากตวจบของ caveolin ตอมา eNOS จะถกฟอสฟอรเลตจาก protein-kinase(PK) (เสนสแดง) และถกก าจดหมอะซตล (deacetylation) โดย SIRT1. การเกดฟอสฟอรเลชนทต าแหนง Ser 1177 โดย PKA, AKT (protein kinase B), PKC, และ adenosine monophosphate kinase (AMPK) จะเกดการกระตนการท างาน ในขณะทการเกดฟอสฟอรเลชนทต าแหนง Ser 116 และ Thr 495 จะยบยงการท างานของ eNOS สดทาย active eNOS จะเรงการเกดปฏกรยาเปลยนโมเลกลออกซเจนเปน NO โดยใช L-arginine เปนสารตงตน (Chris et al., 2012)

2. prostacyclin หรอ prostaglandin I2 (PGI2) สารทส าคญอกหนงตวทเปน EDRF ซงการปลดปลอยจะถกกระตนดวยแรง

เฉอน (shear stress) และตอบสนองตอ acetylcholine คอ PGI2 (Flammer & Lüscher, 2010) ถกสงเคราะหโดย cyclooxygenase-2 (COX-2) จาก arachidonic acid (Moncada et al., 1976) การท างานของ PGI2 จะจบกบรเซปเตอรคอ PGI2 receptor หรอ IP และไปเพม cyclic adenosine monophosphate (cAMP) ในกลามเนอเรยบหลอดเลอดเชนเดยวกบในเกลดเลอด (Smyth et al., 2008) ในผปวยทมการลดลงของระดบ NO เฃนในผปวย โรคหลอดเลอดแดงแขง (atherosclerosis) เมอ nitric oxide synthase (NOS) ถกยบยงหรอเสยหาย COX-2 กจะมการหลง PGI2 ใหมบทบาทเดนแทนในการท าใหหลอดเลอดคลายตว (Szerafin et al., 2006) นอกจากน PGI2 ยงมความส าคญในการยบยงการจบกนของเกลดเลอดโดยท างานรวมกบ NO เชนเดยวกน NO และ PGI2 ยงสามารถยบยง leukocyte adhesion และการขยายตวของกลามเนอเรยบหลอดเลอดไดอกดวย (Kawabeet al., 2010) หากมการเกดรบกวนสญญาณ

28

ประสาทหรอ crosstalk ระหวางสองตวแทนอย PGI2 จะเปนตวชวยในการหลง NO โดยเซลล endothelium ในทางตรงกนขามการท างานของ PGI2ในกลามเนอเรยบของหลอดเลอดถกกระตนใหมศกยภาพโดย NO โดยทางออมผานการยบยง phosphodiesterase 3 ชวยยดอายครงชวต (half-life) ของ cAMP ผลกระทบของ PGI2 ตอตานยา thromboxane (TXA2) ทสงเคราะหผาน COX-1 และท าใหเกดการเกาะกลมของเกลดเลอด (platelet aggregation), การหดตวของหลอดเลอด (vasoconstriction) และการขยายตวของกลามเนอเรยบหลอดเลอด ดงนนความสมดลของทงสอง prostanoids คอ PGI2 และ TXA2 จงมความส าคญในการรกษาสมดลระบบหวใจและหลอดเลอด ความส าคญของ COX-2 ในการสงเคราะห PGI2 อาจอธบายถงผลกระทบทเปนอนตรายของสารยบยง COX-2 อาจสงผลถงการเสยชวตจากโรคหวใจและหลอดเลอดได เนองจากการยบยง COX-2 ท าใหเกดภาวะเรงการเกดหลอดเลอดอดตนจากลมเลอด (prothrombotic state) ทท าใหมการลดลงของ PGI2

3. endothelium derived hyperpolarizing factor (EDHF) vasodilator ทกตวจะมการปรบตวเมอมการใหสารยบยงของ NO (เชน L-

NMMA) และ PGI2 (เชน aspirin) ซงเชอวามสารทท าใหเกดไฮเพอรโพลาไรเซชนของกลามเนอเรยบหลอดเลอด โดยมกลไลของการตอบสนองโดยการเพมขนของโพแตสเซยม (K+) ภายนอกเซลล สงผลใหมการลดลงของ K+ ภายในเซลล EDHF มฤทธส น ๆ แตกลไกยงไมทราบแนชด กลไกการออกฤทธททราบคอ กระตนชองโปแตสเซยมทไวตอ ATP (ATP-sensitive K+ channel) และ/หรอ Na+-K+ATPase ทกลามเนอเรยบหลอดเลอด ท าให K+ แพรออกจากเซลล และเกด hyperpolarization ตามล าดบ ภาวะเชนนท าใหชองแคลเซยมไอออนทไวตอศกยไฟฟา (โดยเฉพาะชนดแอล) ปด แคลเซยมไอออนแพรเขาเซลลลดลง และระดบแคลเซยมไอออนภายในเซลลลดลง ตามลาดบ นอกจากนยงลดความไวของโปรตนหดตว (contractile protein) ตอระดบแคลเซยมไอออนภายในเซลล ยบยงการกระตน phospholipase C ท าใหกลามเนอเรยบหลอดเลอดคลายตวในทสด โมเลกลและสารทเปนตวกลางทมกลไกเหมอนกบ EDHF ไดแก cytochrome P450 metabolites (Taddei et al., 2006), lipoxygenase products (Faraci et al., 2001), reactive oxygen species (H2O2) (Ellis & Triggle, 2003), C-type natriuretic peptide (Wei et al., 1994) และ electrical coupling through myoendothelial gap junctions (Griffith et al., 2004)

29

รปท 1.13 endothelium derived relaxing factor (EDRF) ทหลงจาก endothelium prostacyclin (PGI2) กระตน adenylate cyclase ท าใหมการเพมขนของ cyclic AMP (cAMP). Nitric oxide (NO) กระตน soluble guanylate cyclase ท าใหมการเพมของระดบ cyclic GMP (cGMP). Endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF) ท าใหเปดของ Ca2+-dependent K+ channels ในกลามเนอเรยบหลอดเลอด สงผลใหเกด hyperpolarization. สารทงสามตวนมความส าคญไมเทากน โดย NO มบทบาทเดนในหลอดเลอดแดงใหญ ขณะท EDHF มบทบาทในหลอดเลอดขนาดเลกและในหลอดเลอดแดงขนาดใหญในกรณท NO ถกรบกวนหรอมการท างานลดลง (AA, arachidonic acid; NOS, NO synthase; L-Arg, L-arginine; R, membrane receptor; SR, sarcoplasmic reticulum; X, unknown precursor) (Vanhoutte et al., 1998)

5.1.2 vasoconstrictor 1. endothelin-1 (ET-1) ET-1 เปนโปรตนทมกรดอะมโน 21 ตว สรางโดย endothelin converting

enzyme (ECE) จากตวตงตนขนาดใหญ big ET-1 (Yanagisawa et al., 1988) ET-1 เปนหนงใน endogenous vasoconstrictors ทมศกยภาพมากทสด สรางมาจากเซลล endothelium เปนหลก นอกจากนยงถกสรางมากจากเซลลกลามเนอเรยบหลอดเลอด, เซลลเมดเลอดขาว และ macrophage ET-1 และ NO มความสมพนธกนอยางใกลชด โดย NO ยบยงการปลดปลอย ET-1 ออกมาจาก endothelium และในทางกลบกน ET-1 ยบยงการ ท างานของ NO ทท าใหหลอดเลอดคลายตว (Thorin & Webb, 2010) endothelin ม 3ไอโซฟอรมไดแก ET-1, ET-2 และ ET-3 โดย ET-1 มสวนเกยวของมากทสดในระบบหลอดเลอดมสวนชวยในการรกษาความตงตวของหลอดเลอด การเพมขนของความเขมขนจากพยาธสภาพตาง ๆ ET-1 สามารถเปนตวกระตน

30

การอกเสบและกระตนการขยายตวของกลามเนอเรยบหลอดเลอด (Anggrahini et al., 2009) การเพมขนของ ET-1 มสวนเกยวของในการเกดพยาธสภาพจากความดนโลหตสง ภาวะหลอดเลอดและภาวะหวใจลมเหลว นอกจากนการแสดงออกทเพมขนของ ET-1 และ ECE กพบในคนทเปนโรคหลอดแดงแขงในระยะตาง ๆ กลไกทางชวภาพของ ET-1 เกดขนผานการกระตนของรเซปเตอรสองตวคอ ETA และ ETB ซงพบในเซลลกลามเนอเรยบหลอดเลอด ตวรบ ETA มความจ าเพาะมากตอ ET-1 ในขณะทตวรบ ETB จบไดดกบ endothelin ทงสามไอโซฟอรม ตวรบ ETA เมอถกกระตนจะท าใหหลอดเลอดหดตว สวนตวรบ ETB พบไดทงเซลลบผวหลอดเลอดและกลามเนอเรยบหลอดเลอด ถาตวรบ ETB ทกลามเนอเรยบหลอดเลอดถกกระตนจะท าใหหลอดเลอดหดตว แตถากระตนทเซลล endothelium จะท าใหหลอดเลอดคลายตวทางออม ผานการสรางและหลงสารในกลม EDRF ตาง ๆ โดยเฉพาะ NO และ PGI2 (De Nucci et al., 1988) ETB มบทบาทส าคญในการก าจด ET-1 โดยจบกบตวรบ ligand ทอยในเซลลและยอยสลายภายในเซลล ดงนนการลดลงของ ETB หรอการยบยงการท างานของตวรบ ETB จะท าใหความสามารถในการก าจด ET-1 ลดลง สงผลให ET-1 มปรมาณสงขน

รปท 1.14 endothelin-1 (ET1). Big endothelin-1 ถกตดใหเลกลงดวย endothelin converting enzyme (ECE) ใหอยในรปของ Endothelin-1 (ET-1). ตวรบของ Endothelin คอ ETA and ETB พบทเซลลกลามเนอเรยบหลอดเลอด เมอถกกระตนจะท าใหหลอดเลอดหดตว ETB ยงพบทเซลล endothelium (EC) ซงเมอถกกระตนจะท าใหหลอดเลอดคลายตวผาน NO และ PGI2 (Cahill & Redmond, 2016)

2. Angiotensin-II/AT1R

renin-angiotensin system (RAS) เปนระบบฮอรโมนหมนเวยนทควบคมความดนโลหต การไหลเวยนเลอด ปรมาณของเหลวและความสมดลของอเลคโตรไลท ผลการวจยลาสด

31

พบวา RAS ถกกระตนจากในหวใจและผนงหลอดเลอดทขยายตว ซงพบวามบทบาทส าคญในการเกดโรคหลอดเลอดแดงแขง เซลล endothelium สามารถสราง renin ใหท าหนาทเปน enzyme เปลยน angiotensinogen ซงเปนโปรตนทสรางจากตบ ใหเปลยนเปน angiotensin-I (Ang-I) สารนจะถกเปลยนตอไปเปน angiotensin-II (Ang-II) โดย enzyme angiotensin converting enzyme (ACE) ซงมมากทหลอดเลอดของปอด Ang-II เปนเปปไทดฮอรโมนทออกฤทธผานตวรบ Ang-I และ Ang-II ตอมา Ang-II จะถกขนสงออกจากเซลลบ endothelium ทงทางดานเลอดและดานตรงขาม Ang-II จบกบตวรบเฉพาะทเยอหมเซลลกลามเนอเรยบหลอดเลอด แลวท าใหแคลเซยมเขาเซลลมาก สงผลใหหลอดเลอดจงหดตวมากขนตามล าดบ (Fukuda & Sata, 2008) Ang-II เปนกลางทกระตนการเกดหลอดเลอดแดงแขง ท าใหหลอดเลอดหดตว และควบคมไมเฉพาะ adhesion molecule (VCAM-1, ICAM-1, P-selectin) เทานน แตยงรวมถง cytokine, chemokine และการหลงสารการเจรญเตบโตภายในผนงหลอดเลอดแดง (Tirapelli et al., 2009) ยาทเปนตวยบยง ACE และตวรบ angiotensin blockers (ARBs) เปนเครองมอเภสชวทยาทไดรบการยอมรบในการปองกนโรคหลอดเลอดแขง endothelium เปนอวยวะเปาหมายทส าคญส าหรบยาของระบบหวใจและหลอดเลอดรวมถงยาทเปนตวยบยง ACE โดยมหลกฐานแสดงวาไมเพยงแตความดนโลหตลดลง แตยงมการตานการอกเสบไดโดยตรง

รปท 1.15 ระบบ renin-angiotensin ทเซลล endothelium (ACE, angiotensin converting enzyme; AT1, AT2, angiotensin receptor subtype 1, 2) (Unger, 2002)

32

5.2 ความเสยหายของ endothelium ทเกดจากยา cisplatin ความเปนพษของยา cisplatin เกยวกบระบบหลอดเลอดไดมการศกษามากอน

หนาน การศกษาทางพรคลนคแบบ in vitro พบวา cisplatin อาจจะยบยงการเพมจ านวนของเซลล endothelium ซงผลจากการยบยงนเปนตวเสรมการท างานของยา cisplatin ในการยบยงเซลลมะเรง การศกษาเชงพรรณาผลขางเคยงจากการใชยา cisplatin โดยการวด human dermal microvascular endothelial cell line (HMEC-1) ซงวดจากการแสดงออกของ intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) และโปรตนสองชนดทเกยวของ fibrinolysis tissue-type plasminogen activator (tPA) และ plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) พบวามการลดลงของจ านวนเซลล endothelium ทอยรอด ซงเสยหายจากกระบวนการชกน าใหเกด apoptosis โดย cisplatin (Nuver et al., 2010) การศกษาหลอดเลอดใน stria vascularis ของหนตะเภาทไดรบยา cisplatin อยางเดยว และไดรบยา cisplatin รวมกบ gentamicin โดยใชกลองจลทรรศอเลกตรอน ซงมองเหนไดอยางชดเจนวา endothelium เสยหายเปนอยางมาก มการตกเปนผลกตะกอนของไมโตคอนเดรย มการหดของผนงในชน lumen (Kohn et al., 1997)

Nuver และคณะ (2005) ไดศกษาความชกของภาวะไมโครอลบมนนเรย (microalbuminuria) และการเพมขนของตวบงชความเสยหายของ endothelium ในพลาสมาไดแก vWF, PAI-1, t-PA และ c-reacting protein (CRP) ในผปวยทเปนมะเรงอณฑะจ านวน 90 คนทไดรบการรกษาเคมบ าบดดวยยา cisplatin เปรยบเทยบกบผปวยมะเรงในระยะแรกทไดรบการผาตดเอาลกอณฑะออก (orchidectomy) และคนทวไปทสขภาพด

การศกษาแบบ cohort study ในผปวยมะเรงอณฑะจ านวน 65 คนทไดรบการรกษาเคมบ าบดดวยยา cisplatin พบวามการหนาตวเพมขนอยางมนยยะส าคญของหลอดเลอดในชน intima-media ในหลอดเลอด carotid artery หลงจากไดรบยา 10 สปดาห เปรยบเทยบกบกอนไดรบการรกษา การหนาตวของหลอดเลอดนอาจน าไปสการเกดภาวะ atherosclerosis (Lorenz et al., 2007)

Vaughn และคณะ (2008) ไดศกษาโดยวดการท างานของเซลล endothelium ท brachial artery ดวยวธการวด flow-mediated dilation (FMD) ในผปวยมะเรงอณฑะทไดรบการรกษาดวยยา cisplatin พบวามคาลดลง นอกจากนมการศกษาในผปวยหญงทเปนมะเรงรงใขทไดรบยา cisplatin พบวามการลดลงของคา nitroglycerin-mediated vasodilation (NMD) ซงเปนคาแสดงการท างานของเซลลกลามเนอเรยบของหลอดเลอด (de Vos et al., 2004)

33

โดยทวไปในหลอดเลอดทปกต เซลล endothelium ทสมบรณจะมหนาทปองกนไมใหเกดลมเลอดภายในหลอดเลอดเพอท าใหหลอดเลอดปราศจากการอดตน cisplatin ชกน าใหเกดความเปนพษตอเซลล endothelium ท าใหมการกระตนการตอบสนองดงกลาวโดยไปกระตน procoagulant endothelial microparticles (EMPs) ท าใหสามารถกระตนใหเกดการสรางลมเลอดได (Lechner et al., 2007) การตอบสนองดงกลางของเซลล endothelium อาจเปนสาเหตทท าใหเกดการแขงตวของเลอดและท าใหเสยสมดลการสลายลมเลอดน าไปสการเกดภาวะลมเลอดอดตนในหลอดเลอดหลงจากไดรบยา cisplatin ได

Ito และคณะ (1995) ไดพบวาเลอดมการจบตวกนเปนกอนอยางรนแรงและพบความเสยหายของ endothelium ในหลอดเลอด superior mesenteric artery ในหนหลงจากไดรบยาซพลาตนทางหลอดเลอดแดง ซงความเสยหายนพบนอยกวาในหนทไดรบวตามนอรวมดวย เทยบกบหนทไดรบ cisplatin อยางเดยว

cisplatin ยงท าใหเกดโรคทางเสนประสาทโดยการท าลายเซลล endothelium ท าใหเกดการอกเสบของหลอดเลอดทไปเลยงเสนประสาท (vasa nervorum) สงผลใหเกดภาวะขาดเลอดของระบบประสาท นอกจากน cisplatin สามารถกระตนการแสดงออกของ ICAM-1 ผานกลไก nuclear factor kappa-B (NF-κB) ซงท าใหเกดความเปนพษตอหลอดเลอด (Yu et al., 2008) การศกษาแบบ in vitro ไดพสจนมาแลววา cisplatin กระตนเกลดเลอด เซลลในกลม mononuclear และเซลล endothelium ซงอาจท าใหเกดภาวะเรงการเกดภาวะหลอดเลอดอดตนจากลมเลอด (prothrombotic state) (Togna et al., 2000)

การศกษาในผปวยมะเรงอณฑะทไดรบยา cisplatin ตอเนองมากกวา 400 mg/m2 พบวามความสมพนธกบโรคความดนโลหตสง ซงชใหเหนวา cisplatin มความเปนพษตอระบบหลอดเลอด (Bokemeyer et al., 1996) ความเสยหายของ endothelium อาจน าไปสการเพมขนของอบตการณการเกดโรคลมเลอดอดตนและอาจเปนพษตอหวใจแบบเฉยบพลนได มการศกษาผปวยมะเรงอณฑะทไดรบยา cisplatin จ านวน 65 คนพบวามผปวยทเปนโรคลมเลอดอดตน 9% สอดคลองกบรายงานกอนหนานทพบวาผปวยทไดรบยา cisplatin 179 คนเปนโรคลมเลอดอดตน 14 คน คดเปนรอยละ 9 (Weijl et al., 2000) ในรายงานการศกษาเดยวกนยงพบวามการเพมขนของคา vWF และมการหนาตวขนของผนงหลอดเลอด carotid artery มการศกษาพบวาการเพมขนของระดบ vWF และโรคลมเลอดอดตนสมพนธกบผปวยมะเรงทไดรบยา cisplatin (Licciardello et al., 1985)

การศกษาเมอไมนานมานของ Pikerry และคณะ (2005) พบวามการเพมขนของอบตการณโรคลมเลอดอดตนในผปวยมะเรงอณฑะจ านวน 100 คนทเขารบการท าเคม

34

บ าบดดวยยา cisplatin โดยเปรยบเทยบในเพศ ชวงอาย และไดรบยาเคมบ าบดในระยะเวลาเดยวกน

เกยวกบผลขางเคยงของโรคหวใจและหลอดเลอด cisplatin ท าใหเกดการหนาตวขนของผนงหลอดเลอดจงกอใหเกดโรคหลอดเลอดอดตนในระยะยาวได ในการศกษาผปวย non-small-cell lung cancer (NSCLC) ทไดรบยา cisplatin มอบตการณเกดโรค 22% หลงจากไดรบการรกษาตอเนอง 1 ป (Numico et al., 2005)

มรายงานวาพบผปวยทเปนความดนโลหตสง 14% ในผปวย 21 คนทเปนมะเรงรงใขทรบการรกษาดวย cisplatin และ 24% เปน microalbuminuria เทยบกบประชากรหญงทภมหลงและชวงอายเดยวกนมอบตการณเกดเพยง 3.2% (57) การสญเสยอลบมนทางปสสาวะอาจเปนสญญาณของความเสยหายของ endothelium และเปนตวคาดการณโรคระบบหวใจและหลอดเลอด (Hillege et al., 2002)

ขนาดของ cisplatin ทมการศกษาเกยวกบหลอดเลอดมหลากหลายขนาดดวยกน การศกษาของ Atalik และคณะ (2010) ใช cisplatin ขนาด 10 mg/kg เปนเวลา 8 วน พบวา aortic ring ตอบสนองตอ PE และ KCl มากกวากลม control อยางมนยส าคญ การศกษาของ Wehaish และคณะ (2014) ใช cisplatin ขนาด 4 mg/kg ตอสปดาห เปนเวลา 4 สปดาห ท าใหผนงหลอดเลอดหนาตวกวากลม control ซงเชอวาเปนการเกด proliferation ของกลามเนอเรยบของหลอดเลอด การศกษาครงนใช cisplatin ขนาด 7.5 mg/kg ฉดเขาทางชองทอง โดยอางองการศกษาของ Kunworarath และคณะ (2014) ทใช cisplatin ขนาด 7.5 mg/kg ฉดเขาทางชองทอง ซง cisplatin ขนาดนเปนขนาดต าทสดทท าใหหนเปนไตวายเฉยบพลน ในวนท 3 หลงการฉด ซงหากใชขนาดสงกวานจะท าใหหนตายเปนจ านวนมาก

1.3 วตถประสงคการทดลอง 1. เพอศกษาผลของ morelloflavone ตอการคลายตวของหลอดเลอด

thoracic aorta ในหนทฉด cisplatin เทยบกบหนในกลม control intact endoheliun และ denuded

2. เพอศกษาความเสยหายของหลอดเลอด หลงจากไดรบ cisplatin 3 วน และ 7 วน

3. เพอศกษาผลการปองกนของ morelloflavone ตอ cisplatin ทท าใหเกดความเสยหายตอหลอดเลอด

35

1.4 สมมตฐานงานวจย

: เพมขน : ลดลง : ไมเปลยนแปลง

รปท 1.15 แผนภาพสมมตฐานงานวจย cisplatin กระตน enzyme NADPH oxidase ท าใหเกด ROS morelloflavone มผลยบยงหรอลดการท างานของ NADPH oxidase เพอลดการเกด ROS (ROS, reactive oxygen species; eNOS, endothelial nitric oxide synthase; VSMC, vascular smooth muscle cell; NADPH oxidase, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase; PE, phenylephrine; Ach, acetylcholine; SNP, sodium nitroprusside)

36

บทท 2 วธด าเนนการทดลอง

วสดและอปกรณ

2.1 สตวทดลอง การศกษาวจยครงนท าการทดลองในหนแรทเพศผสายพนธ Wistar น าหนก

ระหวาง 250 - 300 g จากสถานสตวทดลองภาคใต คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร สตวทดลองทงหมดถกเลยงในหองปรบอากาศทมอณหภม 23-25๐C ความชนสมพทธ 50 - 55% โดยควบคมใหมปรมาณแสงใหมสดสวนความมดและความสวาง 12:12 h เลยงดวยอาหารเมดส าเรจรป (S.W.T., Thailand) และดมน าประปาสะอาดไมจ ากดปรมาณ

การทดลองจะตองผานการพจารณาเหนชอบจาก คณะกรรมการจรรยาบรรณการใชสตวทดลอง มหาวทยาลยสงขลานครนทร เลขท 20/2015 2.2 การเตรยมสารสกด morelloflavone จากมะพด

ในการทดลองครงน ไดรบความอนเคราะหสารบรสทธ morelloflavone จากหองวจย รศ.ดร.วลาวลย มหาบษราคม ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร (Deachathai et al., 2005)

ผลมะพดในการทดลองเกบจากอ าเภอเมอง จงหวดสงขลา ประเทศไทยและไดเกบตวอยางพชไวใน herbarium (Collection. No. 02, Herbarium No. 0012652) ภาควชาชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร

น าผลมะพดผลดบ 8 kg หนเปนชนเลก ๆ แชใน acetone เปนเวลา 5 วน หลงจากนนเกบสารละลายหรอสารสกดทไดจาก acetone ไว จากนนแชมะพดใน methanol อกเปนเวลา 3 วน แลวเกบสารละลายหรอสารสกดทไดจาก methanol ไว น าสารละลายหรอสารสกดทไดจาก acetone และ methanol ไประเหย (evaporation) สารสกดหยาบทไดจาก acetone ประมาณ 165.80 g ซงแยกออกเปน 2 ชน คอ 1) ชนบน (upper layer) เมอท าใหแหงโดยวธลดความดน พบวาสารสกดหยาบมลกษณะเหนยวหนด (fraction A, 84.85 g) 2) ชนลาง (lower layer) สกดตอดวย butanol ตามดวย dichloromethane และ ethyl acetate ไดเปน dichloromethane soluble (fraction B1, 7.50 g)

37

ซงใน ethyl acetate soluble (fraction B2, 37.53 g) พบสาร morelloflavone ไดจาก fraction B2I ประมาณ 20.60 mg ม MW 556 โดยการน า fraction B2 ไปแยกสารสกดดวยวธ column chromatography ไดเปน fraction B2A-B2K ซง fraction B2I น าไปแยกสารสกดโดยใชตวท าละลาย dichloromethane-acetone ดวยวธ column chromatography ไดเปนสาร morelloflavone 2.3 ยาและสารเคม 1. phenylephrine hydrochloride (C9H13NO2), Sigma, St.Louis, MO, USA 2. acetylcholine (C7H16NO21), Sigma, St.Louis, MO, USA 3. sodium nitroprusside (C5FeN6Na2O.2H2O), Sigma, St.Louis, MO, USA

4. calcium chloride – dihydrate (CaCl2· HCl), Merck, Darmstadt, Germany 5. D(+)-glucose monohydrate (C6H12O6 · H2O), Riedel-de Haën, Seelze,

Germany 6. dimethylsulfoxide (DMSO) (C2H6OS) Sigma, St. Louis, MO, USA 7. magnesium sulphate (MgSO4 · 7H2O), May & Baker, Dagenham, England 8. potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4), Riedel-de Haën, Seelze,

Germany 9. potassium chloride (KCl), Riedel-de Haën, Seelze, Germany 10.sodium chloride (NaCl), Ajax Finechem, Seven Hills, Australia 11. sodium hydrogen carbonate (NaHCO3), Asia Pacific Specialty, Seven Hills,

Australia 12. sisplatin Pfizer Pty Limited, Bentley, Australia and 13. thiopental sodium Scott-Edil Pharmacia Ltd., Soltan (H.P.), India

2.4 อปกรณ

1. ชดเครองมอผาตดสตวทดลอง 2. ชด isolated organ bath ขนาด 20 ml 3. เครองควบคมอณหภมน า (thermostat-heater-circulator) model DIN12879

KLASSE I W, HAAKE, Karlsruhe, Germany 4. เครองบนทก MacLab, model 4/20 ADInstruments พรอมอปกรณประกอบดวย

force transducer, Model 1030, bridge Amplifier, model 110, และโปรแกรม

38

chart version 7 ส าหรบบนทกการทดลอง, ADInstruments Pty Ltd, New South Wales, Australia

5. เครองชงละเอยดสต าแหนง, model AE200, CH-8606, Greifensee, Switzerland 6. ไปเปตตอตโนมต (automatic pipettes), Eppendorf, Geritebau, Hamburg,

Germany 7. เครองวดความเปนกรด-ดาง (pH meter), model UB-5, Denver Instruments,

Denver, USA 8. ถงกาซคารโบเจน (95%O2 + 5% CO2) พรอมตวปรบกาซ (gas regulator) 9. เครองเหวยงตะกอนความเรวสง (centrifuge), Model 4232, A. L. C., Milan, Italy

10. mixer, model VTX-3000L, Tokyo, Japan 11. spectrophotometer (model Spectro SC, Labomed, Culver City, California,

USA)

2.5 วธการด าเนนการทดลอง

2.5.1 ขอบเขตการวจย 1.การศกษาผลการคลายตวของ morelloflavone แบงเปน 2 กลม กลมละ 6 ตว

1.1 control แบงเปนสองกลมยอย คอ intact endothelium และ denuded หนกลมนจะไดรบการฉด 0.9% NaCl

1.2 cisplatin หนกลมนจะไดรบการฉด cisplatin 7.5 mg/kg ทางชองทอง 2. การศกษาผลของ morelloflavone ตอการหดตวและคลายตวของหลอดเลอดแดงธอราสคในหนทไดรบ cisplatin แบงการทดลองออกเปน 3 กลมหลก หรอ 6 กลมยอย กลมละ 6-8 ตว ดงน

2.1 vehicle control หนกลมนจะไดรบการฉด DMSO ทใชเปนตวท าละลาย morelloflavone (1 ml/kg) 1 วนและ 10 นาท กอนฉดตวท าละลายของ cisplatin (0.9% NaCl) 15 ml/kg เขาทางชองทอง การทดลองแบงออกเปน 2 กลมยอย ไดแก intact endothelial group และ denuded group

2.2 กลม cisplatin หนกลมนจะไดรบการฉด DMSO (1 ml/kg) 1 วนและ 10 นาท กอนฉด cisplatin ขนาด 7.5 mg/kg เขาทางชองทอง

39

2.3 กลม cisplatin + morelloflavone หนกลมนจะแบงออกเปน 3 กลมยอยตามขนาดของ morelloflavone 0.1, 1 และ 10 mg/kg BW ละลายใน DMSO 1 วนและ 10 นาท กอนฉด cisplatin ขนาด 7.5 mg/kg เขาทางชองทอง

2.5.2 วธด าเนนการทดลอง

1. การเตรยมสารละลาย Krebs Henseleit

การเตรยมสารละลาย Krebs Henseleit ในการทดลองเพอศกษาการหดตวและคลายตวของ thoracic aortic ring ซงสารละลาย Krebs Henseleit ประกอบดวยสาร ตาง ๆ ทความเขมขนในหนวย mM/L ดงน KCl 4.6, MgSO4.7H2O 1.12, KH2PO4 1.18, NaHCO3 25.0, D-glucose 11.66, NaCl 118.41, CaCl2 1.90 โดยน าสารทตองการเตรยมมาชงน าหนกโดยค านวณคาความเขมขนทตองการเปน Molar (M) จากสตร (M) = น าหนกสาร (g)/ น าหนกของมวลโมเลกล (MW) และละลายสารในน ากลน แลวปรบ pH ใหเทากบ 7.4 ดวย hydrochloric acid (HCl) ทความเขมขน 2 N

2. การเตรยม stock solution ของ morelloflavone

ชงสาร morelloflavone ซงมลกษณะเปนผงโดยใชเครองชงละเอยดสต าแหนง โดยค านวณคาความเขมขนทตองการเปน Molar (mole/L) จากสตร (M) = น าหนกสาร (g)/ น าหนกของมวลโมเลกล (MW) แลวละลายดวย dimethyl sulfoxide (DMSO) จนไดความเขมขนของ stock solution 8 ขนาด ระหวาง 10-9-10-2M แตละขนาดตางกน 10 เทา ดงน 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10- 5, 10- 4, 10- 3 และ 10- 2 M

3. การเตรยม stock solution ของ phenylephrine (PE), acetylcholine (ACh), และ sodium nitroprusside (SNP)

น าสารทตองการเตรยมมาชงน าหนกโดยค านวณคาความเขมขนทตองการเปน Molar (mole/L) จากสตร (M) = น าหนกสาร (g)/ น าหนกของมวลโมเลกล (MW) จากนนน ามาละลายดวยน ากลน ใหไดความเขมขนของ stock solution ดงน คอ PE 6 ขนาด ระหวาง 10-7-10-1 M แตละขนาดตางกน 10 เทา, ACh 8 ขนาด ระหวาง 10-9-10-2 M และ SNP ระหวาง 10-9-10-2 M

4. การทดลองในหลอดเลอดแดง thoracic aorta น าหนมาชงน าหนก จากนนฉดยาสลบ thiopental sodium ขนาด 60 mg/kg

น าหนกตวหน เขาทางชองทอง รอใหหนสลบลก จากนนท าใหหนเสยชวตดวยการตดคอโดยเครอง guillotine ท าการผาตดเปดหนาอกตดแยกหลอดเลอดแดง thoracic ยาวประมาณ 2.5 -

40

3 cm ออกแชใน Krebs Henseleit solution ทอณหภม 4๐C น าหลอดเลอดมาแยก connective tissue และไขมนรอบ ๆ ออกบน petri dish ทม Krebs Henseleit solution และ carbogen gas (95% O2, 5% CO2) ผานตลอดเวลาและตดหลอดเลอดใหไดขนาด 4-5 mm ตอชน จ านวน 4 ชน ส าหรบการเตรยม denuded aortic rings ท าโดยวธ mechanical disruption แบบ gentle denuded คอการท าลายชน tunica intima แตไมถงชน tunica media (Fingerle et al., 1990) โดยการสอด stainless steel ขนาด เสนผานศนยกลาง 0.6 mm เขาไปในหลอดเลอดแลวถผนงดานในหลอดเลอดเบา ๆ ประมาณ 30 วนาทจากนนน าหลอดเลอดไปแขวนใน organ bath ทม Krebs Henseleit solution ท 37๐C โดยให carbogen gas ผานตลอดเวลา และตดหลอดเลอดความยาว 2 mm 2 ชนส าหรบศกษา histopathology

5. แผนการทดลองใน isolated thoracic aortic ring

5.1 การศกษาขนาดของ PE ตอการหดตวของ aortic ring การบนทกการหดตวของกลามเนอ เรมการทดลองโดยปรบใหหลอดเลอดมความ

ตงขณะพกท 1 g และ equilibrate หลอดเลอด 45 นาท โดยเปลยนสารละลาย Krebs Henseleit ใน organ bath ทก ๆ 15 นาท การทดลองจะเรมเมอหลอดเลอดทงหมดทมแรงตงคงทประมาณ 0.9-1.09 g การทดลองเรมดวยการหยด stock solution PE จ านวน 8 ความเขมขน ระหวาง 10-7- 10-1 M ตามล าดบ แตละขนาดหยดครงละ 20 µl ซงท าใหไดความเขมขนใน organ bath เทากบ 10-10-10-4 M ตามล าดบ เปนการใหสารแบบ cumulative บนทก tension ตลอดเวลาการทดลองและอานคาทก ๆ 5 นาท จากนนลางออกดวย Krebs Henseleit solution รอใหเสนบนทกคงท

ความเขมขนของ PE ทเลอกใชในการชกน าใหเกด precontraction กอนการทดลองขอ 5.2 คอความเขมขนทท าให aortic ring หดตวประมาณ 70% ของคา maximal tension

5.2 การศกษาขนาดของ ACh และ SNP ตอการคลายตวของ aortic ring กระตนการหดตวของหลอดเลอดโดยใช PE ความเขมขนทไดจากขอ 5.1 ให

การหดตวคงท จากนนหยด stock solution ของ ACh จ านวน 9 ขนาด ระหวาง 10-10 - 10-2 M ตามล าดบ แตละขนาดหยดครงละ 20 µl การทดลองแบงเปน 2 กลมไดแก กลมทม endothelium (intact endothelium) และกลมทมการท าลาย endothelium (denude) เปนการใหสารแบบ cumulative บนทก tension ตลอดเวลาการทดลองและอานคาทก ๆ 5 นาท จากนนลางออกดวย Krebs Henseleit solution รอใหเสนบนทกคงท จากนนบนทกคา resting tension หลงจากนนกระตนการหดตวของหลอดเลอดโดยใช PE ความเขมขนทไดจากขอ 5.1 ใหการหด

41

ตวคงท จากนนหยด stock solution ของ SNP จ านวน 9 ความเขมขน ระหวาง 10-9 – 10-2 M ตามล าดบ แตละขนาดหยดครงละ 20 µl ซงท าใหไดความเขมขนใน organ bath เทากบ 10-12–10-5 M ตามล าดบ ท าการทดสอบการหดตวและการคลายตวของหลอดเลอดอกครงหนง ดวย PE และ ACh จากนนทดสอบการคลายตวของหลอดเลอดโดยใช SNP ความเขมขนใน organ bath เทากบ 10-5 M เพอทดสอบการคลายตวของกลามเนอเรยบหลอดเลอดตรวจสอบในกรณท endothelium ถกท าลายหรอเสยหายระหวางการทดลอง

6. การศกษาฤทธของ morelloflavone ตอคลายตวของ aortic ring ทท าใหหดตวกอนดวย PE

เรมการทดลองโดยปรบความตงของหลอดเลอดใหมความตงขณะพกท 1 g จากนน equilibrate หลอดเลอด 45 นาท โดยเปลยนสารละลาย Krebs Henseleit ใน organ bath ทก ๆ 15 นาท การทดลองจะเรมเมอหลอดเลอดทงหมดทมแรงตงคงทประมาณ 0.9 - 1.09 g ทดสอบการคลายตวของหลอดเลอดเพอยนยนวาเปนกลมทม endothelium (intact endothelium) และกลมทมการท าลาย endothelium (denuded) โดยกระตนการหดตวของหลอดเลอดโดยใช PE ความเขมขนทไดจากขอ 5.1 ใหการหดตวคงท จากนนหยด ACh ความเขมขนทไดจากขอ 5.2 aortic rings ทมการคลายตวไดมากกวาหรอเทากบ 80% ถอวาเปน intact endothelium สวนกลมทไมคลายตวถอวาเปนกลม denuded หลงจากนนลางออกดวยสารละลาย Krebs Henseleit

ตอมากระตนการหดตวของหลอดเลอดโดยใช PE ความเขมขนทไดจากขอ 5.1 ใหการหดตวคงท จากนนหยด stock solution ของ morelloflavone จ านวน 9 ขนาด ระหวาง 10-10- 10-2 M ตามล าดบ แตละขนาดหยดครงละ 20 µl การทดลองแบงเปน 3 กลมไดแก กลมทม endothelium (intact endothelium), กลมทมการท าลาย endothelium (denude) และกลมทไดรบการฉด cisplatin (Cis) เปนการใหสารแบบ cumulative บนทก tension ตลอดเวลาการทดลองและอานคาทก ๆ 5 นาท จากนนลางออกดวย Krebs Henseleit solution รอใหเสนบนทกคงท จากนนบนทกคา resting tension ท าการทดสอบการหดตวและการคลายตวของหลอดเลอดอกครงหนง ดวย PE และ ACh จากนนทดสอบการคลายตวของหลอดเลอดโดยใช SNP ความเขมขนใน organ bath เทากบ 10-5 M เพอทดสอบการคลายตวของกลามเนอ เรยบหลอดเลอดตรวจสอบในกรณท endothelium ถกท าลายหรอเสยหายระหวางการทดลอง

42

รปท 2.1 แผนผงการทดลองศกษาการออกฤทธของ morelloflavone ในหลอดเลอดแดง thoracic

7. การศกษาผลของ phenylephrine (PE), acetylcholine (ACh) และ

sodium nitroprusside (SNP) ตอการหดตวและการคลายตวของ thoracic aortic ring

เรมการทดลองโดยปรบใหหลอดเลอดมความตงขณะพกท 1 g และ equilibrate หลอดเลอด 45 นาท โดยเปลยนสารละลาย Krebs Henseleit ใน organ bath ทก ๆ 15 นาท หยด stock solution PE จ านวน 8 ความเขมขน ระหวาง 10-7- 10- 2 M ตามล าดบ แตละขนาดหยดครงละ 20 µl ซงท าใหไดความเขมขนใน organ bath เทากบ 10-10 - 10-5 M ตามล าดบ เปนการใหสารแบบ cumulative บนทก tension ตลอดเวลาการทดลองและอานคาทก ๆ 5 นาท จากนนลางออกดวย Krebs Henseleit solution รอใหเสนบนทกคงท

จากนนกระตนการหดตวของหลอดเลอดโดยใช PE ความเขมขนทไดจากขอ 5.1 ใหการหดตวคงท จากนนหยด stock solution ของ ACh จ านวน 9 ขนาด ระหวาง 10-10- 10-2 M ตามล าดบ แตละขนาดหยดครงละ 20 µl ซงท าใหไดความเขมขนใน organ bath เทากบ 10-

12 –10-5 M ตามล าดบ จากนนลางออกดวย Krebs Henseleit solution รอใหเสนบนทกคงท หลงจากนนกระตนการหดตวของหลอดเลอดโดยใช PE ความเขมขนทไดจากขอ

5.1 ใหการหดตวคงท จากนนหยด stock solution ของ SNP จ านวน 9 ความเขมขน ระหวาง 10-9 – 10-2 M ตามล าดบ แตละขนาดหยดครงละ 20 µl ซงท าใหไดความเขมขนใน organ bath เทากบ 10-12 – 10-5 M ตามล าดบ

43

รปท 2.2 แผนผงการทดลองศกษาการตอบสนองตอ PE, ACh และ SNP

8. การหาคา lipid peroxidation ของ plasma

ท าโดยหาปรมาณ MDA ตามวธของ Ohkawa et al.,(1979) โดยน า plasma ทเตรยมไวมา 0.8 ml จากนนเตม 8.1% SDS 0.2 ml, 20% acetic acid 1.5 ml ปรบใหได pH 3.5 ดวย NaOH เตม 0.8% TBA 1.5 ml ผสมสารทงหมดแลวปรบปรมาตรดวยน ากลนใหได 4 ml น าไปตมทอณหภม 95-100 ºC นาน 60 นาท ตงทงไวใหเยนแลวเตมน ากลน 1 ml และ n-butanol 5 ml เขยาสารแลวน าไป centrifuge 4,000 rpm นาน 10 นาท น าสารชนบนมาวดคาดดกลนแสงทความยาวคลน 532 nm แลวหาคาความเขมขนของสารโดยการอานคาจากกราฟความสมพนธระหวางความเขมขนมาตรฐานของ 1,1,3,3 tetramethoxypropane ซงใชเปน standard กบคา absorbance ปรมาณ MDA จะแสดงในหนวย µmole

9. การศกษา histopathology

หลอดเลอดแดง 2 ชน ความยาว 2 mm fix ใน Bouin’s solution เปนเวลา 48 ชวโมง แลวน ามา embed ใน paraffin น าชนเนอไปตดดวย rotary microtome ท 6 µm จะไดเนอเยอออกมาเปนแผน ribbon น าไปตดทแผนสไลด จากนนน าตวอยางไปยอมดวยส Mayer’s hematoxylin-eosin (H&E) จากนนตรวจสอบความเปลยนแปลงของเนอเยอหลอดเลอดโดยวธทางพยาธวทยาโดยใชกลองจลทรรศน Olympus DP 73 microscope (Olympus Optical Co, Ltd, Tokyo, Japan) ก าลงขยาย 40 เทา

44

2.6 การค านวณ

2.6.1 วธการค านวณคา % increase from resting tension และ % relaxation from precontraction ทไดจากการทดลองในหลอดเลอดแดง thoracic โดยใชสตร

% increase from resting tension = TPE – TC TC % relaxation from precontraction = (TPE – TC) - (TM – TC) (TPE – TC)

โดย TPE คอคา tension ทเกดจากการหยด 10-7M PE TM คอคา tension ทเกดจากการหยด morelloflavone, ACh และ SNP TC คอคาของ control tension (resting tension)

2.7 การวเคราะหขอมลทางสถต ขอมลจากการทดลองในแตละกลมจะเปนคาเฉลยของจ านวนหนแตละกลม ซง

หนแตละตวในกลมจะมผลการทดลองเปนคาเฉลยจากผลการทดลองใน aortic ring 4 ชน ในหน 1 ตว จะน าเสนอเปนคาเฉลยและคาผดพลาดเฉลยมาตรฐาน (mean ± S.E.M) วเคราะหความแตกตางของคาเฉลยระหวางกลมโดย t-test และ one-way analysis of variance (ANOVA) ตามดวย Student-Newman Keul post hoc test วเคราะหแตกตางของตวแปรในกลมเดยวกนใช one-way repeated measure ANOVA และ Student-Newman-Keul post hoc test โดยยอมรบความแตกตางทมนยส าคญทางสถตเมอ P value < 0.05

× 100

× 100

45

บทท 3 ผลการทดลอง

3.1 ผลของ morelloflavone ตอ รอยละการตายและการเปลยนแปลงของน าหนกตวในหนทไดรบ cisplatin

หลงจากฉด cisplatin เปนเวลา 7 วนพบวาหนมอตราการรอดชวต 55.6% ในกลมทไดรบ morelloflavone 0.1 และ 1 mg/kg พบวาสามารถลดอตราการตายของหนลงท าใหหนมอตราการรอดชวต 61.5% และ 71.4% ตามล าดบ ในขณะทกลมทไดรบ morelloflavone 10 mg/kg พบวามอตราการตาย 50% สวนหนในกลม vehicle control (Con) ไมมหนตายเกดขน แสดงในตารางท 3.1 ในกลม vehicle control น าหนกของหนเพมขน 25.7 ± 2.9 g การเพมขนของน าหนกหนในกลม vehicle control เปนการแสดงการเจรญแบบปกตของหน ในหนกลมทไดรบ cisplatin (7.5 mg/kg) ท าใหน าหนกตวลดลงอยางมนยส าคญเมอเทยบกบกลม vehicle control 44.3 ± 5.9 g (P<0.05) การลดลงของน าหนกแสดงใหเหนถงความเปนพษของ cisplatin ตอสมดลอาหารและของเหลวในรางกาย morelloflavone 1 mg/kg ชวยปองกนความเปนพษจาก cisplatin ท าใหหนมน าหนกเพมขน 7.5 ± 5.2 g ตางจากกลม cisplatin อยางมนยส าคญ (P<0.05) ดงแสดงในตารางท 3.1 สวนกลมทไดรบ morelloflavone 0.1 และ 10 mg/kg ไมไดตางจากกลม cisplatin อยางมนยส าคญ ตารางท 3.1 ผลของ morelloflavone ตอรอยละการตายและการเปลยนแปลงของน าหนกตวในหนทไดรบ cisplatin, vehicle control (Con) n=6; cisplatin (Cis) n=18 ; cisplatin+morelloflavone 0.1 mg/kg (Cis+Mor 0.1 mg/kg) n=13 ; cisplatin+morelloflavone 1 mg/kg (Cis+Mor 1 mg/kg) n=14 ; cisplatin+morelloflavone 10 mg/kg (Cis+Mor 10 mg/kg) n=16 ;+ = เพมขน, - = ลดลง

Treatment Pre-BW (g)

Post-BW (g)

BW (g)

Survival rate (%)

Vehicle control 266.7 ± 4.5 292.3 ± 6.5 25.7 ± 2.9 100 Cis (7.5 mg/kg) 280.4 ± 3.4 236.1 ± 5.1 -44.3 ± 5.9* 55.6 Cis+Mor 0.1 mg/kg 270.8 ± 5.7 239.8 ± 4.8 -31.0 ± 7.2* 61.5 Cis+Mor 1 mg/kg 265.0 ± 4.7 270.1 ± 6.7 7.5 ± 5.2*# 71.4 Cis+Mor 10 mg/kg 269.0 ± 5.6 228.0 ± 8.7 -41.0 ± 7.3* 50 *, # P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม Con และ Cis ตามล าดบ (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test)

46

3.2 การศกษาผลของ phenylephrine (PE) และ acetylcholine (ACh) ตอการหดตวและการคลายตวของ thoracic aortic ring 3.2.1 การตอบสนองของ PE ตอ aortic ring ผลของ PE ตอการหดตวของ aortic ring แสดงในรปท 3.1 จากการทดลองเมอให PE ทความเขมขน 10-10 – 10-4 M แตละขนาดมความเขมขนแตกตางกน 10 เทา พบวาหลอดเลอดมความแรงในการหดตวเพมขนอยางมนยยะส าคญ (P<0.05) จากคา resting tension ตงแตความเขมขน 10-7 – 10-4 M ทความเขมขน 10-7 M 89.07 ± 5.46%, ท 10-6 M 138.1 ± 6.57%, ท 10-5 M 145.44 ± 7.6%, ท 10-4 M 126.64 ± 5.54% ตามล าดบ ผลของ PE ตอการหดตวของ denuded ring แสดงในรปท 3.1 จากการทดลองเมอให PE ทความเขมขน 10-10 – 10-4 M แตละขนาดมความเขมขนแตกตางกน 10 เทา พบวาหลอดเลอดมความแรงในการหดตวเพมขนอยางมนยยะส าคญ (P<0.05) จากคา resting tension ตงแตความเขมขน 10-8 – 10-4 M ทความเขมขน 10-8 M 53.75 ± 5.96, ท10-7 M 139.48 ± 11.71%, ท 10-6 M 180.82 ± 5.18%, ท 10-5 M 186.79 ± 5.39%, ท 10-4 M 181.11 ± 5.06% ตามล าดบ เมอเปรยบเทยบการหดตวของ aortic ring ทไดรบ PE ทความเขมขนเดยวกนระหวางกลม intact endothelium และกลม denuded พบวา aortic ring กลม denuded มการหดตวมากกวากลม intact endothelium อยางมนยส าคญ (P<0.05) ตงแตความเขมขน 10-8 - 10-4

M ดงนนการศกษาผลของ morelloflavone จากผลมะพดตอการหดตวของหลอดเลอดแดงธอราสคในหนทไดรบ cisplatin จะเลอกใชความเขมขนของ PE ทท าใหหลอดเลอดเกดการหดตวกอน (preconstriction) ประมาณ 70% ของคา maximal tension คอ 10-7 M

3.2.2 การตอบสนองของ ACh ตอ aortic ring ทท าใหหดตวกอนดวย 10-7

M PE ผลของ ACh ตอการคลายตวของ aortic ring ทท าใหหดตวกอนดวย 10-7 M PE ในกลม intact endothelium แสดงในรปท 3.2 ผลการทดลองเมอให ACh จ านวน 8 ขนาด ทท าใหความเขมขน ใน organ bath แตละขนาดมความเขมขนแตกตางกน 10 เทา ระหวาง 10-12-10-5 M ผลการทดลองนแสดงคา % relaxation from 10-7 M PE precontraction พบวา aortic ring กลม intact endothelium มการคลายตวอยางมนยส าคญ (P<0.05) เมอเปรยบเทยบกบคา control ตงแตความเขมขน 10-11, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6 และ 10-5 M ดงน ทความเขมขน 10-11 M 10.01 1.28%, ท 10-10 M 18.72 ± 1.34%, ท 10-9 M 22.72 ± 1.91%, ท 10-8 M 26.74 ± 2.37%, ท 10-7 M 69.69 ± 3.45%, ท 10-6 M 100.11 ± 0.78% และท 10-5 M 103.89 ± 0.92% ตามล าดบ

47

ผลของ ACh ตอการคลายตวของ aortic ring ทท าใหหดตวกอนดวย 10-7 M PE ในกลม denude แสดงในรปท 3.2 จากการทดลองเมอให ACh จ านวน 8 ขนาด ทท าใหความเขมขนใน organ bath แตละขนาดมความเขมขนแตกตางกน 10 เทา ระหวาง 10-12-10-5M พบวา aortic ring กลม denude มการคลายตวไมแตกตางกนอยางมนยส าคญ เมอเปรยบเทยบกบคา control

เมอเปรยบเทยบการคลายตวของ aortic ring ทไดรบ ACh ทความเขมขนเดยวกนระหวางกลม intact endothelium และกลม denude พบวา aortic ring กลม denude มการคลายตวนอยกวากลม intact endothelium อยางมนยส าคญ (P<0.05) ตงแตความเขมขน 10-12- 10-5 M

จากการทดลอง จงเลอกใช ACh ทความเขมขน 10-5 M ซงเปนความเขมขนทท าให aortic ring คลายตวไดสงสด จากคา control ซง ACh จะน าไปทดสอบการคลายตวของ aortic ring กอนและหลงการทดลอง

รปท 3.1 ผลของ phenylephrine (PE) ความเขมขนระหวาง 10-10- 10-4 M ตอการหดตวของ aortic ring ทแสดงโดยคา % increase from resting tension คาท แสดงคอ mean ± S.E.M. (n=6) *P< 0.05 เมอเปรยบเทยบกบคา control ของกลมเดยวกน (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test) #P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม intact endothelium (unpaired t-test)

48

รปท 3.2 ผลของ acetylcholine (ACh) ตอการคลายตวของ aortic ring ทท าใหหดตวกอนดวย 10-7 M PE ทแสดงโดยคา % relaxation from 10-7 M PE precontraction คาทแสดงคอ mean ± S.E.M. (n=6) *P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบคา control ของกลมเดยวกน (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test) #P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม intact endothelium (unpaired t-test) 3.3 การศกษาฤทธของ morelloflavone ตอคลายตวของ aortic ring ทท าใหหดตวกอนดวย 10-7M PE ผลของ morelloflavone ตอคลายตวของ aortic ring กลม vehicle control (Con) ทม endothelium (intact endothelium) และ endothelium ถกท าลาย (denuded) และกลม cisplatin (Cis) ทท าใหหดตวกอนดวย 10-7M PE แสดงในรปท 3.3 ผลการทดลองนแสดงคา % relaxation from 10-7 M PE precontraction เมอให morelloflavone จ านวน 8 ขนาด ทท าใหความเขมขน ใน organ bath แตละขนาดมความเขมขนแตกตางกน 10 เทา ระหวาง 10-12-10-5 M พบวา aortic ring ทไดรบ morelloflavone ตงแตความเขมขน 10-11,10-10,10-9, 10-8, 10-

7, 10-6 และ 10-5 M aortic ring ในกลม Cis มการคลายตวนอยกวาเมอเปรยบเทยบกบกลม Con (intact endothelium) อยางมนยส าคญ (P<0.05) ดงน ทความเขมขน 10-11 M 8.97 ± 1.06 และ 15.22 ± 1.39, ท 10-10 M 14.55 ± 1.51 และ 29.88 ± 2.5, ท 10-9 M 20.24 ± 1.89 และ 38.93 ± 2.79, ท 10-8 M 26.06 ± 1.76 และ 45.34 ± 2.76, ท 10-7 M 31.18 ± 1.45 และ 49.82 ± 2.83, ท 10-6 M 37.76 ± 1.76 และ 57.11 ± 3.51 ตามล าดบโดยมคา maximal relaxation, Emax (%) ทความเขมขน 10-5 M ของกลม Cis และ กลม Con (intact endothelium) เทากบ 75.44 ± 0.95% และ 57.54 ± 3.53% ตามล าดบ โดยในกลม Con (denuded) ถกยบยงการคลายตวโดยสมบรณ

49

การศกษาผลของ morelloflavone ตอคลายตวของ aortic ring พบวา morelloflavone ท าให aortic ring คลายตวโดยผานกลไกของ endothelium ซงในกลม Cis มความเสยหายของ endothelium ท าใหคลายตวไดนอยกวากลม Con (intact endothelium)

รปท 3.3 ผลของ morelloflavone ตอการคลายตวของ aortic ring กลม control (Con) ทม endothelium (intact endothelium) และ endothelium ถกท าลาย (denuded) และกลม cisplatin (Cis) ท าใหหดตวกอนดวย 10-7 M PE คาทแสดงคอ mean ± SEM (n=6 ทกกลมการทดลอง) *, # P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม Con (intact endothelium) และ Con (denuded) ตามล าดบ (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test) 3.4 การศกษาผลของ phenylephrine (PE), acetylcholine (ACh) และ sodium nitroprusside (SNP) ตอการหดตวและการคลายตวของ thoracic aortic ring หลงจากไดรบ cisplatin 3วน การศกษาผลของ phenylephrine (PE) ตอการหดตวของ thoracic aortic ring หลงจากไดรบ cisplatin 3 วน แสดงในรปท 3.4 จากการทดลองเมอหลอดเลอดไดรบ PE ความเขมขน 10-10 - 10-5 M ทท าใหความเขมขน ใน organ bath แตละขนาดมความเขมขนแตกตางกน 10 เทา พบวา aortic ring ในกลม Cis มการหดตวไมไดแตกตางจากกลม Con อยางมนยส าคญ

50

รปท 3.4 ผลของ PE ตอการหดตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), cisplatin 3 วน (Cis 3 days), คาทแสดงคอ mean ± SEM

การศกษาผลของ acetylcholine (ACh) ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ทท าใหหดตวกอนดวย 10-7 M PE ในกลม Con และ Cis 3 days แสดงในรปท 3.5 ผลการทดลองนแสดงในคา % relaxation from 10-7 M PE precontraction เมอให ACh จ านวน 8 ขนาด ทท าใหความเขมขน ใน organ bath แตละขนาดมความเขมขนแตกตางกน 10 เทา ระหวาง 10-12- 10-5 M พบวา aortic ring ในกลม Cis 3 days มการคลายตวไดไมแตกตางกนอยางมนยส าคญเมอเปรยบเทยบกบกลม Con

การศกษาผลของ sodium nitroprusside (SNP) ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ทท าใหหดตวกอนดวย 10-7 M PE หลงจากไดรบ cisplatin 3 วน ในกลม Con, Cis, แสดงในรปท 3.6 ผลการทดลองนแสดงในคา % relaxation from 10-7 M PE precontraction เมอให SNP จ านวน 8 ขนาด ทท าใหความเขมขน ใน organ bath แตละขนาดมความเขมขนแตกตางกน 10 เทา ระหวาง 10-12- 10-5 M พบวา aortic ring ตอบสนองตอการคลายตวตอ SNP ไมมความแตกตางกนอยางมนยส าคญของทงสองกลม

จากผลการศกษาผลของ phenylephrine (PE), acetylcholine (ACh) และ sodium nitroprusside (SNP) ตอการหดตวและการคลายตวของ thoracic aortic ring หลงจากไดรบ cisplatin 3 วน พบวากลม Con และ Cis ไมไดมความแตกตางกนอยางมนยส าคญ จงไดท าการฉด cisplatin ขนาด 7.5 mg/kg เปนเวลา 7 วน เพอดความเสยหายทเกดขนของหลอดเลอดและเพอศกษาผลการปองกนของ morelloflavone ตอ cisplatin ตอไป

51

รปท 3.5 ผลของ ACh ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), cisplatin 3 วน (Cis 3 days), คาทแสดงคอ mean ± SEM

รปท 3.6 ผลของ SNP ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), cisplatin 3 วน (Cis 3 days), คาทแสดงคอ mean ± SEM

52

3.5 การศกษาผลของ phenylephrine (PE), acetylcholine (ACh) และ sodium nitroprusside (SNP) ตอการหดตวและการคลายตวของ thoracic aortic ring หลงจากไดรบ cisplatin 7 วน

การศกษาผลของ phenylephrine (PE) ตอการหดตวของ thoracic aortic ring หลงจากไดรบ cisplatin 7 วน แสดงในรปท 3.7 และตารางท 7 ในภาคผนวก จากการทดลองเมอหลอดเลอดไดรบ PE ความเขมขน 10-10- 10-5 M ทท าใหความเขมขน ใน organ bath แตละขนาดมความเขมขนแตกตางกน 10 เทา พบวา aortic ring ในกลม Cis มการหดตวมากกวากลม Con อยางมนยส าคญ (P<0.05) ตงแตความเขมขนท 10-7, 10-6, 10-5 ดงน 120.76 ± 5.22, 161.91 ± 3.09 และ 170.36 ± 2.28 ตามล าดบ

ในกลม Cis+Mor 1 mg/kg สามารถลดความแรงของการหดตวเมอเทยบจากกลม Cis มการหดตวนอยกวากลม Cis อยางมนยส าคญ (P<0.05) ดงแสดงในรปท 3.8 ตงแตความเขมขนท 10-7, 10-6, 10-5 ดงน 96.64 ± 2.15, 142.53 ± 2.48, 154.42 ± 1.34 ตามล าดบ ในขณะทกลม Cis+Mor 0.1 และ 10 mg/kg มการหดตวไมตางจากกลม Cis อยางมนยส าคญ

ในรปท 3.7 แสดงในรปกราฟเสนโดยแสดงเครองหมาย * มความแตกตางอยางมนยส าคญ (P<0.05) เมอเทยบกบกลม Con เพยงอยางเดยว ในรปท 3.8 แสดงในรปของกราฟแทงทความเขมขนของ PE ระหวาง 10-7 – 10-5 M เปนการขยายจากรปท 3.7 โดยแสดงเครองหมาย * และ # มความแตกตางอยางมนยส าคญ (P<0.05) เมอเทยบกบกลม Con และ Cis ตามล าดบเพอใหเหนภาพไดอยางชดเจนมากขน

รปท 3.7 ผลของ PE ตอการหดตวของ thoracic aortic ring ในกลม vehicle control (Con), cisplatin (Cis), cisplatin+morelloflavone (Cis+Mor) คาทแสดงคอ mean ± SEM * P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม Con (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test)

53

รปท 3.8 ผลของ PE ตอการหดตวของ thoracic aortic ring ทความเขมขนระหวาง 10-7 - 10-5 M ในกลม control (Con), cisplatin (Cis), cisplatin+morelloflavone (Cis+Mor) คาทแสดงคอ mean ± SEM *, # P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม Con และ Cis ตามล าดบ (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test)

การศกษาผลของ acetylcholine (ACh) การคลายตวของ thoracic aortic ring ทท าใหหดตวกอนดวย 10-7 M PE ในกลม Con, Cis, Cis+Mor (0.1, 1 และ 10 mg/kg) แสดงในรปท 3.9 ผลการทดลองนแสดงในคา % relaxation from 10-7 M PE precontraction เมอให ACh จ านวน 8 ขนาด ทท าใหความเขมขน ใน organ bath แตละขนาดมความเขมขนแตกตางกน 10 เทา ระหวาง 10-12-10-5 M พบวา aortic ring ทไดรบ ACh ตงแตความเขมขน 10-9, 10-8, 10-7, 10-6 และ 10-5M aortic ring ในกลม Cis มการคลายตวนอยกวาเมอเปรยบเทยบกบกลม Con (intact endothelium) อยางมนยส าคญ (P<0.05) ดงน ทความเขมขน 10-9 M 14.16 ± 1.8%, ท 10-8 M 16.65 ± 1.57%, ท 10-7 M 40.13 ± 2.98%, ท 10-6 M 85.68 ± 2.05% และท 10-5 M 95.14 ± 1.16% ตามล าดบ

กลม Cis+Mor 1 mg/kg มการคลายตวมากกวาเมอเปรยบเทยบกบกลม Cis อยางมนยส าคญ (P<0.05) ดงแสดงในรปท 3.10 ตงแตความเขมขน 10-7, 10-6 และ 10-5 M ดงน ทความเขมขน 10-7 M 57.1 ± 0.89%, ท 10-6 M 95.53 ± 2.18% และท 10-5 M 101.19 ± 1.4% ตามล าดบ

กลม Cis+Mor 0.1 และ 10 mg/kg มการคลายตวไมแตกตางอยางมนยส าคญเมอเปรยบเทยบกบกลม Cis แตมความแตกตางอยางมนยส าคญ (P<0.05) เมอเทยบกบกลม Con ตงแตความเขมขน 10-9, 10-8, 10-7, 10-6 และ 10-5M

โดยมคา maximal relaxation, Emax (%) ทความเขมขน 10-5 M ของกลม Con, Cis และ Cis+Mor (0.1, 1 และ 10 mg/kg) เทากบ 107.6 ± 1.34, 95.14 ± 1.16, 94.28 ± 1.27, 101.19 ± 1.4 และ 94.45 ± 1.08 ตามล าดบ

54

รปท 3.9 ผลของ ACh ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), cisplatin (Cis), cisplatin+morelloflavone (Cis+Mor) คาทแสดงคอ mean ± SEM * P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม Con (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test)

รปท 3.10 ผลของ ACh ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ทความเขมขนระหวาง 10-7 – 10-5 M ในกลม control (Con), cisplatin (Cis), cisplatin+morelloflavone (Cis+Mor) คาทแสดงคอ mean ± SEM *, # P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม Con และ Cis ตามล าดบ (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test)

55

การศกษาผลของ sodium nitroprusside (SNP) ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ทท าใหหดตวกอนดวย 10-7 M PE ในกลม Con, Cis, Cis+Mor (0.1, 1 และ 10 mg/kg) แสดงในรปท 3.11 ผลการทดลองนแสดงในคา % relaxation from 10-7 M PE precontraction เมอให SNP จ านวน 8 ขนาด ทท าใหความเขมขน ใน organ bath แตละขนาดมความเขมขนแตกตางกน 10 เทา ระหวาง 10-12- 10-5 M พบวา aortic ring ตอบสนองตอการคลายตวตอ SNP ไมมความแตกตางกนอยางมนยส าคญของทกกลม แตพบวา SNP ทความเขมขน 10-7 M ในกลม Cis+Mor 10 mg/kg คลายตวนอยกวาอยางมนยส าคญ (P<0.05) (87.92 ± 3.18%) เมอเทยบกบกลม Con (107.12 ± 1.93%) และ Cis (102.80 ± 4.14%) ตามล าดบ

SNP เปนสารทให NO ซงท าใหหลอดเลอดคลายตวโดยไมตองอาศยกลไกของ endothelium (endothelium-independent) การคลายตวในกลม Cis+Mor 10 mg/kg ทนอยกวากลม Con และ Cis แสดงวาอาจจะเปนผลจากความผดปกตของ vascular smooth muscle cell ทอาจมการเปลยนแปลงของโครงสรางซงสงผลตอการตอบสนองตอ SNP การเปลยนแปลงของโครงสรางของ vascular smooth muscle แสดงในการศกษาทาง histopathology ตอไป

รปท 3.11 ผลของ SNP ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), cisplatin (Cis), cisplatin+morelloflavone (Cis+Mor) คาทแสดงคอ mean ± SEM * P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม Con (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test)

56

รปท 3.12 ผลของ SNP ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ทความเขมขนระหวาง 10-7 – 10-5 M ในกลม control (Con), cisplatin (Cis), cisplatin+morelloflavone (Cis+Mor) คาทแสดงคอ mean ± SEM *, # P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม Con และ Cis ตามล าดบ (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test) 3.6 ผลของ morelloflavone ตอระดบ plasma MDA

ระดบของ plasma MDA แสดงในรปท 3.13 Plasma MDA ในกลม Cis สงกวากลม Con อยางมนยส าคญ (75.52 ± 5.70 vs 30.83 ± 2.04 µmol/L, P<0.05) เมอให morelloflavone 1 mg/kg พบวาสามารถลดระดบ plasma MDA ลงไดอยางมนยส าคญเมอเทยบกบกลม Cis (48.32 ± 2.16 และ 75.52 ± 5.70 µmol/L, P<0.05) ในขณะท morelloflavone 0.1 และ 10 mg/kg พบวาไมมความแตกตางอยางมนยส าคญเมอเทยบกบกลม Cis (รปท 3.13)

MDA เปนตวชวดของระดบ lipid peroxidation ทเกดจากอนมลอสระ morelloflavone 1 mg/kg สามารถลดระดบ plasma MDA ลงจงมคณสมบตเปนสารตานอนมลอสระ

57

รปท 3.13 ผลของ cisplatin (7.5 mg/kg) (Cis) และ cisplatin+morelloflavone (0.1,1 และ 10 mg/kg) (Cis+Mor) ตอระดบ plasma MDA ) คาทแสดงคอ mean ± SEM *, # P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม Con และ Cis ตามล าดบ (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test) 3.7 histopathological study

การศกษาทางเนอเยอวทยา แสดงในรปท 3.14 หลอดเลอดทไดรบการยอมดวยวธ Hematoxylin and eosin stain (H&E) ในกลม Con, Cis, Cis+Mor (0.1, 1 และ 10 mg/kg) แสดงใหเหนวาไมพบการเปลยนแปลงส าคญทบรเวณชน tunica intima (TI) ในขณะทช น tunica media (TM) ของกลม Cis พบวามขนาดหนากวากลม Con และไมสามารถระบโครงสรางไดอยางชดเจน morelloflavone (0.1 and 1 mg/kg) ชวยลดความหนาของชน TM และสามารถเหนโครงสรางของกลามเนอหลอดเลอดไดชดเจนมากขน สวน morelloflavone (10 mg/kg) ท าใหกลามเนอเรยบหลอดเลอดมขนาดหนากวาทกกลม นอกจากนพบความไมตอเนองกนของ elastic lamina ในชน TM และไมสามารถระบโครงสรางในชนกลามเนอเรยบได

58

รปท 3.14 การศกษาทางเนอเยอวทยา หลอดเลอดทไดรบการยอมดวยวธ Hematoxylin and eosin stain (H&E) ในกลม control (Con), cisplatin (Cis), cisplatin+morelloflavone (Cis+Mor) 0.1, 1 และ 10 mg/kg (scale bar = 20 µm, x40)

TM

TI

Cis+Mor 0.1 mg/kg

TM TI

Cis+Mor 1 mg/kg

Cis+Mor 10 mg/kg

TM

TI

Con

TM

TI

Cis

TM TI

20 µm

59

บทท 4 สรปและวจารณผลการทดลอง

4.1 ผลของ morelloflavone ตออตราการตาย (%) และการเปลยนแปลงของน าหนกตวในหนทไดรบ cisplatin

การศกษาครงนพบวาในหนทไดรบ cisplatin หนมอตราการรอดชวต 55.56% โดยสาเหตการตายของหนยงไมทราบแนชด แตเปนไปไดวามาจากหลายสาเหต เนองจาก cisplatin มผลขางเคยงตอระบบตาง ๆ ในรางกาย เชนไตวายเฉยบพลน morelloflavone ขนาด 0.1 และ 1 mg/kg สามารถลดอตราการตายของหนทดลองได เปนมาจากคณสมบตการตานอนมลอสระทปองกนพษจาก cisplatin

ในหนทไดรบ cisplatin ท าใหน าหนกลดลงอยางมนยส าคญเมอเทยบกบกลม control สาเหตเกดจากผลคางเคยงของยา cisplatin ทท าใหทองอด ทองเสย ลดความอยากในการดมน าและอาหาร ซงสาเหตทกลาวมาขางตนลวนเปนสาเหตทท าใหหนในกลม cisplatin น าหนกลดลง Jacoby และคณะ (2000) ไดท าการผากระเพาะอาหารของหนทถกฉด cisplatin 9 mg/kg พบวากระเพาะอาหารมความเสยหายเกดขน Francescato และคณะ (2001) ไดศกษาในหนทถกฉด cisplatin ขนาด 5 mg/kg พบวามโรคทองรวงและลดการดมน าและกนอาหาร ในการศกษาครงน morelloflavone มผลในการปองกนการลดลงของน าหนกตวซงเปนผลมาจากการปองกนการเกดทองเสย และเพมการดมน าและกนอาหาร

4.2 การศกษาผลของ phenylephrine (PE) และ acetylcholine (ACh) ตอการหดตวและการคลายตวของ thoracic aortic ring การศกษาวจยในครงนไดท าการศกษาแบบ in vitro ซงปนการตดการควบคมจากใยประสาทจากระบบประสาทอตโนมตในและระบบฮอรโมนควบคมการท างานของหลอดเลอด โดยทวไปในหลอดเลอดปกตในรางกายถกควบคมโดยระบบประสาทอตโนมตคอ sympathetic และ parasympathetic ซงระบบประสาท sympathetic มใยประสาทไปเลยงหลอดเลอด 2 ชนด คอ sympathetic adrenergic fiber ปลายประสาทหลง NE ท าใหหลอดเลอดหดตวและ sympathetic cholinergic fiber ปลายประสาทหลง ACh ท าใหหลอดเลอดคลายตว ในการศกษาครงนเลอกใช PE แทนเนองจากเปน selective α1-adrenergic receptor (Hussain & Marshall, 1997) ในขณะท NE ไมจ าเพาะตอ receptor ท าใหสามารถจบกบ adrenergic receptor ไดหลายตว ไดแก α1, α2, β1, β2, β3

60

4.2.1 การตอบสนองของ PE ตอ aortic ring ในการศกษาทดลองครงนไดเลอกใช PE ความเขมขน 10-7 M ในการนท า

precontraction หรอท าใหหลอดเลอดหดตวกอน ซงทความเขมขนนท าให aortic ring หดตวไดประมาณ 70% เทยบกบคา resting tension ซงเปนการออกแบบใหหลอดเลอดมความตงตว เนองจากระบบประสาทอตโนมตถกตดขาด

จากการศกษาผลการตอบสนองของ PE ตอการหดตวของ thoracic aortic ring ในกลม intact endothelium และกลม denude เมอเปรยบเทยบการหดตวของ aortic ring ทไดรบ PE ทความเขมขนเดยวกนระหวางกลม intact endothelium และกลม denuded พบวา aortic ring กลม denuded มการหดตวมากกวากลม intact endothelium อยางมนยส าคญ อธบายไดวาในหลอดเลอดทไมม endothelium จะท าใหขาดสารในกลม vasodilator ทสรางจาก endothelium เพอรกษาสมดลของหลอดเลอด จงท าใหหลอดเลอดกลม denuded ตอบสนองตอการกระตนมากกวา

จากกราฟผลการตอบสนองของ PE ตอการหดตวของ thoracic aortic ring พบวา PE ความเขมขน 10-7 M กราฟมความชนมาก สวนความเขมขน 10-6 – 10-4 M การตอบสนองใกลเคยงกนมการเพมขนเลกนอย เหตผลเนองจากอตราการเกดปฏกรยาทเพมสงขนอยางรวดเรวทความเขมขนน สวนทความเขมขนสงนนการตอบสนองจะไมตางกนมากเนองจาก receptor ทกตวมการจบกบ PE ไปหมดแลว จงไมสามารถกระตนไดมากกวานน

4.2.2 การตอบสนองของ ACh ตอ aortic ring ทท าใหหดตวกอนดวย 10-7

M PE จากการศกษาผลการตอบสนองของ ACh ตอการคลายตวของ thoracic aortic

ring ในกลม intact endothelium และกลม denude เมอเปรยบเทยบการคลายตวของ aortic ring ทไดรบ ACh ทความเขมขนเดยวกนระหวางกลม intact endothelium และกลม denude พบวา aortic ring กลม denude มการคลายตวนอยกวากลม intact endothelium อยางมนยส าคญ เนองจากกลไกของ ACh ออกฤทธผาน endothelium โดยการจบกบ muscarinic receptor ท endothelial cell (Grześk et al., 2014) ท าใหมการสรางและหลง vasodilator ไดแก NO, PGI2 และ EDHF จาก endothelial cell (Triggle et al., 2012) ในขณะท aortic ring กลม denude จะขาด vasodilator ทมาจาก endothelial cell ท าใหคลายตวลดลง

จากกราฟผลการตอบสนองของ ACh ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring พบวา ACh ความเขมขน 10-7 M กราฟมความชนมาก สวนความเขมขน 10-6 - 10-5 M การตอบสนองใกลเคยงกนมการเพมขนเลกนอย เหตผลเนองจากอตราการเกดปฏกรยาทเพมสงขนอยางรวดเรว สวนทความเขมขนสงนนการตอบสนองจะไมตางกนมากเนองจาก receptor ทก

61

ตวมการจบกบ ACh ไปหมดแลว จงไมสามารถกระตนไดมากกวานน เชนเดยวกบการกระตนดวย PE กอนหนาน

ในการทดสอบการคลายตวของหลอดเลอดโดยการควบคมจาก endothelium จะ เลอกใช ACh ทความเขมขน 10-5M ซงท าใหเกดการคลายตวไดมากทสด 4.3 การศกษาฤทธของ morelloflavone ตอคลายตวของ aortic ring ทท าใหหดตวกอนดวย 10-7M PE

การคลายตวของหลอดเลอดของ morelloflavone เกดจากการกระตนผานกลไกของ endothelium ตามรายงานการศกษากอนหนาน (Lamai et al., 2013) โดยกลไกของ morelloflavone ทกระตนใหหลอดเลอดคลายตวเกยวของ nitric oxide (NO) จาก endothelium เปนหลก โดยการกระตน phosphorylation ของ eNOS ใหมการสรางและหลง NO นอกจากน morelloflavone เปนสารในกลม flavonoid ซงมรายงานวาท าใหหลอดเลอดคลายตวได (Luna-Vázquez et al, 2013) อยางไรกตามในหนกลมทไดรบการฉด cisplatin เปนเวลา 7 วนพบวามการตอบสนองตอการคลายตวของหลอดเลอดลดลงหลงจากให morelloflavone เมอเทยบกบหนในกลม control ซงแสดงใหเหนวาในกลม cisplatin มความเสยหายเกดขนท endothelium ซงสงผลตอการตอบสนองตอ morelloflavone

4.4 การศกษาผลของ phenylephrine (PE), acetylcholine (ACh) และ sodium nitroprusside (SNP) ตอการหดตวและการคลายตวของ thoracic aortic ring หลงจากไดรบ cisplatin 3 วน การศกษาผลของ PE ตอการหดตวของ thoracic aortic ring หลงจากไดรบ cisplatin 3 วน แสดงในรปท 3.4 จากการทดลองพบวา aortic ring ในกลม Cis มการหดตวไมไดแตกตางจากกลม Con อยางมนยส าคญ

การศกษาผลของ ACh ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ทท าใหหดตวกอนดวย 10-7 M PE ในกลม Con และ Cis 3 days แสดงในรปท 3.5 ผลการทดลองพบวา aortic ring ในกลม Cis 3 days มการคลายตวไดไมแตกตางกนอยางมนยส าคญเมอเปรยบเทยบกบกลม Con

การศกษาผลของ SNP ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring แสดงในรปท 3.6 ผลการทดลองพบวา aortic ring ตอบสนองตอการคลายตวตอ SNP ไมมความแตกตางกนอยางมนยส าคญของทงสองกลม การชกน าใหหลอดเลอดเกดความเสยหายโดย cisplatin 3 วน ไมพบความแตกตางจากกลม control ดงนนการศกษาในครงนจงเลอกท าการฉด cisplatin ขนาด 7.5 mg/kg

62

เปนเวลา 7 วน เพอดความเสยหายทเกดขนและเพอศกษาผลการปองกนความเสยหายของหลอดเลอดโดยใช morelloflavone 4.5 การศกษาผลของ phenylephrine (PE), acetylcholine (ACh) และ sodium nitroprusside (SNP) ตอการหดตวและการคลายตวของ thoracic aortic ring หลงจากไดรบ cisplatin 7 วน

บทบาท morelloflavone ในการปองกนความเสยหายของหลอดเลอดในการหดตวและคลายตวไดท าการทดสอบในขนตอนตอมา (รปท 3.7 และ 3.8) การหดตวทสงกวากลม control ของกลม cisplatin นนอาจเปนผลมาจากความเสยหายของ endothelium ทท าใหเกดความผดปกตในการผลตสารทท าใหหลอดเลอดคลายตว โดยหลอดเลอดปกต endothelium จะมสารทหลงมาเพอคอยควบคมสมดลของหลอดเลอดทไมใหหดตวแรงเกนไป นอกจากนน cisplatin อาจจะไปกระตนใหรเซปเตอรของ PE มความไวตอการตอบสนองมากกวาปกตจงท าเพมความแรงการหดตว โดยการใส PE ใน organ bath จะไปจบกบ α1-adrenergic receptor ทกลามเนอเรยบหลอดเลอด อยางไรกตามความไวตอการตอบสนองตอ PE ทเพมขนยงไมเปนทแนชด (Russell & Watts, 2000) แตอาจมความเปนไปไดวามกลไกทไปกระตนการสงสญญาณของตวรเซปเตอรทท าใหความแรงการหดตวเพมขนไดเชนเดยวกบการศกษาของกอนหนานทศกษาในหลอดเลอดหนทไดรบ cisplatin พบวามความแรงตอการตอบสนองตอทง PE และ KCl มากกวากลมทไมไดรบ cisplatin (Atalik et al., 2010) morelloflavone จ านวน 3 ขนาด คอ 0.1, 1 และ 10 mg/kg น าหนกตวไดท าการฉด 24 ชวโมง และ 10 นาท กอนการฉด cisplatin การศกษาผลของ PEตอการหดตวพบวา morelloflavone ชวยลดความแรงของการหดตวเมอเทยบจากกลมทไดรบ cisplatin เพยงอยางเดยว โดยขนาดของ morelloflavone ทไดผลดคอ 1 mg/kg ในขณะทขนาด 0.1 และ 10 mg/kg ใหผลไมตางจากกลม cisplatin

การศกษาผลของ morelloflavone ในการปองกนความเสยหายของ endothelium จากยา cisplatin โดยใช ACh กระตนใหหลอดเลอดคลายตว การศกษาพบวาในกลมทไดรบ cisplatin ขนาด 7.5 mg/kg เปนเวลา 7 วน ท าให endothelium เสยหายบางสวน โดยผลของ ACh ทท าใหหลอดเลอดคลายตวพบวาการคลายตวในกลม cisplatin นอยกวากลม control อยางมนยส าคญ (รปท 3.9 และ 3.10) ในชน endothelium ของหลอดเลอดมการสรางสารทกระตนการคลายตว เชน nitric oxide (NO), prostaglandin (PGI2) และ endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF) (Higashi et al., 2009) ความเสยหายทเกดขนของ endothelium ทท าใหหลอดเลอดคลายตวไดนอยลงเกดจากการลดลงของสาร NO ซงเปนสารหลกทท าใหเกดการคลายตวของหลอดเลอด หรออาจจะเกดจากความผดปกตทท าให NO บางสวนไมท างาน และ/หรอ สาเหตจากความผดปกตของ cyclic guanosine monophosphate

63

(cGMP) ในการศกษาครงนไดใช SNP ซงเปนสารทให NO กระตนการคลายตวของ thoracic aortic ring ผลการศกษาพบวาการคลายตวของหลอดเลอดทกกลมมการคลายตวเหมอนกน (รปท 3.11 และ 3.12) แสดงวาเปนการยนยนวาความเสยหายเกดขนท endothelium อยางไรกตามการเปลยนแปลงของกลามเนอเรยบหลอดเลอดทเปนผลมาจาก cisplatin กมสวนดวยเชนกน การให morelloflavone ขนาด 1 mg/kg กอนฉด cisplatin พบวาท าใหความเสยหายของ endothelium ลดลง (รปท 3.9 และ 3.10)

oxidative stress ทเกดจาก cisplatin มสวนส าคญอยางมากทท าใหเกดความเสยหายตอ endothelium โดยขนแรกมาจากการลดการเกดออกซเดชนอยางรวดเรวของ NO โดย superoxide จ านวนมาก ขนตอมา oxidative stress ท าใหเกด enos uncoupling เชนการแยก O2 ออกจากการสงเคราะห NO ท าใหไมสามารถสราง NO ได แตไปเกดเปน superoxide กลไกการพรองของ BH4 ซงเปน cofactor ทส าคญส าหรบ eNOS นาจะเปนอกสาเหตของการเกด eNOS uncoupling และสงผลใหเกด endothelial dysfunction โดย Peroxynitrite ซงเปนผลตภณฑจากปฏกรยาโดยตรงของ NO และ Superoxide มความสามารถในการ oxidize BH4 และท าใหเกดการขาด BH4 (Li & Förstermann, 2013)

กลไกการปองกนของ morelloflavone มผลตอ enzyme NADPH oxidase โดยลดการท างานลงแบบ non-compettive inhibitor (Tuansulong et al., 2011) ชวยยบยงการเกด eNOS uncoupling ทสงผลใหเกดความเสยหายตอ endothelium ซงการให morelloflavone กอนตามดวยการฉด cisplatin ทท าใหเกด ROS จะมโอกาสเกด peroxynitrite ชากวาหรอเกดไดนอยกวาเพราะการเขาไปรวมกบ superoxide ทจะถก SOD scavenge ตอไปเปน hydrogen peroxide เเตถาให cisplatin กอนเหมอนการรกษาปกตเเละเกด thrombosis และ vascular inflammation เเลวเเละให morelloflavone จะไมสามารถชวยอะไรเพราะ superoxide ทเกดขนมปรมาณสงมาก ขณะท morelloflavone กระตนการหลง NO ผานการกระตนการเกด phosphorylation ของ eNOS ซง NO ทไดจะเขาไปรวมกบ superoxide เกดเปน peroxynitrite ซงเปน RNS ความเสยหายทเกดขนของหลอดเลอดเกดไดทง ROS และ RNS ปฏกรยาการรวมเกดขนเรวกวาการเปลยนไปเปน hydrogen peroxide 4.6 ผลของ morelloflavone ตอระดบ plasma MDA

การวดระดบของ lipid peroxidation ถกน ามาใชในการศกษาในสตวทดลองเพอวด oxidative tress ทเกดขนในรางกาย ซง MDA เปนทรจกกนแพรหลายเปนตวบงชถง plasma หรอ tissue lipid peroxidation ซงสามารถเปนตวแทนการเกด oxidative tress ในเซลลได ในการศกษาครงนไดวด plasma MDA ซงพบวาในกลม cisplatin มปรมาณสงกวาในกลม control อยางมนยส าคญ แสดงวามภาวะ oxidative stress เกดขนอยางรนแรง การศกษากอนหนานชวา oxidative stress ท าใหเกดโรคทางระบบหวใจและหลอดเลอดไดมากมาย เชน

64

หลอดเลอดตบ ความดนโลหตสง หวใจลมเหลว เปนตน oxidative stress เกดจากการเพมขนของ ROS ทสงผลใหเซลลเกดความเสยหายและตายในทสด ซง cisplatin ท าใหเกดความเสยหายตอเซลลและในสตวทดลองไดแสดงใหเหนในการศกษาทผานมา morelloflavone ขนาด 1 mg/kg สามารถยบยงการเกด oxidative stress ไดอยางมนยส าคญเมอเทยบกบกลม cisplatin (รปท 3.13) ในขณะทขนาด 0.1 และ 10 mg/kg ไมสามารถยบยงการเกด oxidative stress ได ความสามารถของ morelloflavone ทปองกนการเกด plasma lipid peroxidation เกดจากคณสมบตการตานอนมลอสระทมการศกษามากอนหนาน (Hutadilok-Towatana et al., 2007, Decha-Dier et al., 2008, Deachathai et al., 2005)

4.7 histopathological study

การศกษาทางเนอเยอพยาธวทยาของหลอดเลอด thoracic aortic ring ในชน tunica intima ไมสามารถยนยนถงความเสยหายทางโครงสรางทเกดขนในชน endothelium จากการยอมแบบ H&E ได (รปท 3.14) อยางไรกตามในชน tunica media ซงเปนชนของกลามเนอเรยบหลอดเลอด ในกลม cisplatin พบวามความหนามากวากลม control ซงเกดจากการเพมจ านวนเซลล (proliferation) ของเซลลกลามเนอเรยบหลอดเลอดตามทมการศกษามากอนหนาน (Wehaish et al., 2010, Saleh et al., 2014) หนงในหนาททส าคญของ NO คอการยบยงการเพมจ านวนเซลล ดงนนการลดลงของ NO จงสงผลใหเกดการ proliferation ของกลามเนอเรยบหลอดเลอดได (Tsutsui et al., 2010) morelloflavone ขนาด 10 mg/kg ท าใหหลอดเลอดหนาทสด การศกษาทางเนอเยอพยาธวทยานพบวา morelloflave ทขนาดต า (0.1 และ 1 mg/kg) ชวยยบยงการเพมจ านวนเซลลได (Decha-Dier et al., 2008)

65

: เพมขน : ลดลง : ไมเปลยนแปลง

รปท 4.1 แผนภาพผลการทดสอบตามสมมตฐานงานวจย cisplatin กระตน enzyme NADPH oxidase ท าใหเกด ROS โดย morelloflavone มผลยบยงหรอลดการท างานของ NADPH oxidase เพอลดการเกด ROS ลดการเกด endothelium dysfunction (ROS, reactive oxygen species; eNOS, endothelial nitric oxide synthase; VSMC, vascular smooth muscle cell; NADPH oxidase, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase; PE, phenylephrine; Ach, acetylcholine; SNP, sodium nitroprusside)

66

บทท 5 สรปผลการทดลองและขอเสนอแนะ

1. morelloflavone มฤทธท าใหหลอดเลอด thoracic aortic ring คลายตว โดยใชกลไก

ผาน endothelium

2. cisplatin ท าให endothelium เสยหาย ยนยนไดจากการตอบสนองตอ ACh นอยกวาใน

กลม control และตอบสนองตอการหดตวจาก PE มากกวากลม control

3. ความเสยหายของ endothelium ทเกดจาก cisplatin ท าใหสารตาง ๆ ทสรางจาก

endothelium ลดลง มผลใหเกดการตอบสนองตอ PE มากกวากลม control และกระตน

การขยายตวและเพมจ านวนของกลามเนอเรยบหลอดเลอด

4. การให morelloflavone 1 mg/kg กอนการฉด cisplatin ชวยลดความเสยหายของหลอด

เลอดทงในทางสรรวทยาและกายวภาคศาสตร

5. กลไกของ morelloflavone ในการปองกนความเสยหายของหลอดเลอดเกดจาก

คณสมบต antioxidant และกลไกกระตนการคลายตวของหลอดเลอดของ

morelloflavone ผาน nitric oxide ทหลงจาก endothelium

6. การศกษาในครงนเปนการศกษาเบองตน ซงผลการทดลองทไดควรจะน าไปศกษาตอ

เพมเตมถงรายละเอยดกลไกทเกยวของ เพอสามารถน ามาพฒนาตอไปได

67

เอกสารอางอง นจศร เรองรงษ. 2547. มะพด. สมนไพรไทย เลม 1. ส านกพมพบ เฮลทต กรงเทพฯ Aggarwal, S. K. 1998. Calcium modulation of toxicities due to Cisplatin. Metal-Based

Drugs, 5(2), 77–81. Anggrahini, D. W., Emoto, N., Nakayama, K., Widyantoro, B., Adiarto, S., Iwasa, N.,

Hirata, K. 2009. Vascular endothelial cell-derived endothelin-1 mediates vascular inflammation and neointima formation following blood flow cessation. Cardiovascular Research, 82(1), 143–151.

Atalik, K. E., Keleş, B., Uyar, Y., Dündar, M. A., Öz, M., & Esen, H. H. 2010. Vasoprotection by melatonin and quercetin in rats treated with cisplatin. Indian Journal of Experimental Biology, 48(12), 1188–1193.

Avery, S. V. 2011. Molecular targets of oxidative stress. Biochemical Journal, 434(2), 201–210.

Berne, R. M., Koeppen, B. M., & Stanton, B. A. 2010. Berne & Levy physiology. Mosby, Elsevier.

Bokemeyer, C., Berger, C. C., Kuczyk, M. A., & Schmoll, H. J. 1996. Evaluation of long-term toxicity after chemotherapy for testicular cancer. Journal of Clinical Oncology, 14(11), 2923–2932.

Cahill, P. A., & Redmond, E. M. 2016. Vascular endothelium e Gatekeeper of vessel health. Atherosclerosis, 248, 97–109.

Casares, C., Ramrez-Camacho, R., Trinidad, A., Roldn, A., Jorge, E., & Garca-Berrocal, J. 2012. Reactive oxygen species in apoptosis induced by cisplatin: Review of physiopathological mechanisms in animal models. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology, 269(12), 2455–2459.

Chen, G., Huynh, M., Fehrenbacher, L., West, H., Lara, P. N., Yavorkovsky, L. L., Lau, D. 2009. Phase II Trial of Irinotecan and Carboplatin for Extensive or Relapsed Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology, 27(9), 1401–1404.

Coletta Francescato, H. Della, Costa, R. S., Rodrigues Camargo, S. M., Zanetti, M. A., Lavrador, M. A., & Bianchi, M. de L. P. 2001. Effect of oral selenium administration on cisplatin-induced nephrotoxicity in rats. Pharmacological Research, 43(1), 77–82.

68

Deachathai, S., Mahabusarakam, W., Phongpaichit, S., & Taylor, W. C. 2005. Phenolic compounds from the fruit of Garcinia dulcis. Phytochemistry, 66(19), 2368–2375.

De Nucci, G., Thomas, R., D ’orleans-Juste, P., Antunes, E., Walder, C., Warner, T. D., & Vane, J. R. 1988. Pressor effects of circulating endothelin are limited by its removal in the pulmonary circulation and by the release of prostacyclin and endothelium-derived relaxing factor (lung/guinea pig/rat/icosanoids/cyclooxygenase inhibitors), 85, 9797–9800.

Deavall, D. G., Martin, E. A., Horner, J. M., & Roberts, R. 2012. Drug-induced oxidative stress and toxicity. Journal of Toxicology, 2012, 1–13.

de Vos, F. Y. F. L., Nuver, J., Willemse, P. H. B., van der Zee, A. G. J., Messerschmidt, J., Burgerhof, J. G. M., Gietema, J. A. 2004. Long-term survivors of ovarian malignancies after cisplatin-based chemotherapy. European Journal of Cancer, 40(5), 696–700.

Decatris, M. ., Sundar, S., & O’Byrne, K. . 2004. Platinum-based chemotherapy in metastatic breast cancer: current status. Cancer Treatment Reviews, 30(1), 53–81.

Decha-Dier, U., Hutadilok-Towatana, N., Mahabusarakam, W., Sawangjaroen, K., & Pinkaew, D. 2008. Anti-atherogenic effects of morelloflavone from Garcinia dulcis leaves in cholesterol fed rabbits. Journal of Natural Remedies, 8(2), 151–159.

Desoize, B. 2002. Cancer and metals and metal compounds: part I--carcinogenesis. Critical Reviews in Oncology/hematology, 42(1), 1–3.

Devasagayam, T. P. A., Tilak, J. C., Boloor, K. K., Sane, K. S., Ghaskadbi, S. S., & Lele, R. D. 2004. Free radicals and antioxidants in human health: current status and future prospects. The Journal of the Association of Physicians of India, 52, 794–804.

Dos Santos, N. A. G., Martins, N. M., Curti, C., Pires Bianchi, M. de L., & dos Santos, A. C. 2007. Dimethylthiourea protects against mitochondrial oxidative damage induced by cisplatin in liver of rats. Chemico-Biological Interactions, 170(3), 177–186.

Ellis, A., & Triggle, C. R. 2003. Endothelium-derived reactive oxygen species: their relationship to endothelium-dependent hyperpolarization and vascular tone. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, 81(11), 1013–1028.

Ellmark, S. H. M., Dusting, G. J., Ng Tang Fui, M., Guzzo-Pernell, N., & Drummond, G. R. (2005). The contribution of Nox4 to NADPH oxidase activity in mouse vascular

69

smooth muscle, 65(2), 495–504. Faraci, F. M., Sobey, C. G., Chrissobolis, S., Lund, D. D., Heistad, D. D., & Weintraub,

N. L. 2001. Arachidonate dilates basilar artery by lipoxygenase-dependent mechanism and activation of K(+) channels. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, 281(1), R246-53.

Fingerle, J., Au, T., Clowes, A. W., & Reidy, M. A. 1990. Intimal lesion formation in rat arotid arteries after endothelial denudation in the absece of medal injury. Arteriosclerosis, 10, 1082–1087.

Flammer, A. J., & Lüscher, T. F. 2010. Human endothelial dysfunction: EDRFs. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology, 459(6), 1005–1013.

Fraval, H. N. A., Rawlings, C. J., & Roberts, J. J. 1978. Increased sensitivity of UV-repair-deficient human cells to DNA bound platinum products which unlike thymine dimers are not recognized by an endonuclease extracted from Micrococcus luteus. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 51(1), 121–132.

Frezza, M., Hindo, S., Chen, D., Davenport, A., Schmitt, S., Tomco, D., & Dou, Q. P. 2010. Novel metals and metal complexes as platforms for cancer therapy. Current Pharmaceutical Design, 16(16), 1813–25.

Fukuda, D., & Sata, M. 2008. Role of bone marrow renin–angiotensin system in the pathogenesis of atherosclerosis. Pharmacology & Therapeutics, 118(2), 268–276.

Ghosh, N., Chow, C.-M., Korley, V., & Chisholm, R. 2008. An unusual case of chronic coronary artery dissection: Did cisplatin play a role? Can J Cardiol, 24, 795–797.

Gil, B., Sanz, M. J., Terencio, M. C., Gunasegaran, R., Payá, M., & Alcaraz, M. J. 1997. Morelloflavone, a novel biflavonoid inhibitor of human secretory phospholipase A2 with anti-inflammatory activity. Biochemical Pharmacology, 53(5), 733–740.

Go, R. S., & Adjei, A. A. 1999. Review of the Comparative Pharmacology and Clinical Activity of Cisplatin and Carboplatin. Journal of Clinical Oncology, 17(1), 409–409.

Görlach, A., Brandes, R. P., Nguyen, K., Amidi, M., Dehghani, F., & Busse, R. 2000. A gp91phox Containing NADPH Oxidase Selectively Expressed in Endothelial Cells Is a Major Source of Oxygen Radical Generation in the Arterial Wall. Circulation Research, 87(1).

Grenader, T., Shavit, L., Ospovat, I., Gutfeld, O., & Peretz, T. 2006. Aortic occlusion in patients treated with Cisplatin-based chemotherapy. The Mount Sinai Journal of

70

Medicine, New York, 73(5), 810–2. Griffith, T. M., Chaytor, A. T., & Edwards, D. H. 2004. The obligatory link: role of gap

junctional communication in endothelium-dependent smooth muscle hyperpolarization. Pharmacological Research, 49(6), 551–564.

Grześk, E., Stolarek, W., Wiciński, M., Szadujkis-szadurska, K., & Grześk, G. 2014. Effect of acetylcholine on vascular smooth muscle contraction induced by phenylephrine , angiotensin II, and mastoparan-7. Folia Medica Copernicana, 2(3), 98–101.

Guimarães, S., & Moura, D. 2001. Vascular adrenoceptors: an update. Pharmacological Reviews, 53(2), 319–56.

Guzik, T. J., Sadowski, J., Guzik, B., Jopek, A., Kapelak, B., Przybyłowski, P., Channon, K. M. (2006). Coronary artery superoxide production and nox isoform expression in human coronary artery disease, 26(2), 333–339.

Guzik, T. J., West, N. E. J., Pillai, R., Taggart, D. P., & Channon, K. M. 2002. Nitric oxide modulates superoxide release and peroxynitrite formation in human blood vessels. Hypertension (Dallas, Tex. : 1979), 39(6), 1088–94.

Higashi, Y., Noma, K., Yoshizumi, M., & Kihara, Y. 2009. Endothelial function and oxidative stress in cardiovascular diseases. Circ J, 73, 411–418.

Hillege, H. L., Fidler, V., Diercks, G. F. H., van Gilst, W. H., de Zeeuw, D., van Veldhuisen, D. J., Prevention of Renal and Vascular End Stage Disease (PREVEND) Study Group. 2002. Urinary albumin excretion predicts cardiovascular and noncardiovascular mortality in general population. Circulation, 106(14), 1777–82.

Hussain, M. B., & Marshall, I. 1997. Characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes mediating contractions to phenylephrine in rat thoracic aorta, mesenteric artery and pulmonary artery. British Journal of Pharmacology, 122(5), 849–58.

Hutadilok-Towatana, N., Kongkachuay, S., & Mahabusarakam, W. 2007. Inhibition of human lipoprotein oxidation by morelloflavone and camboginol from Garcinia dulcis. Nat Prod Res, 21(7), 655–662.

Ignarro, L. J., Byrns, R. E., Buga, G. M., & Wood, K. S. 1987. Endothelium-derived relaxing factor from pulmonary artery and vein possesses pharmacologic and chemical properties identical to those of nitric oxide radical. Circulation Research,

71

61(6). İşeri, S., Ercan, F., Gedik, N., Yüksel, M., & Alican, İ. 2007. Simvastatin attenuates

cisplatin-induced kidney and liver damage in rats. Toxicology, 230(2–3), 256–264. Ishida, S., Lee, J., Thiele, D. J., & Herskowitz, I. 2002. Uptake of the anticancer drug

cisplatin mediated by the copper transporter Ctr1 in yeast and mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences, 99(22), 14298–14302.

Ishida, S., Lee, J., Thiele, D. J., & Herskowitz, I. 2002. Uptake of the anticancer drug cisplatin mediated by the copper transporter Ctr1 in yeast and mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99(22), 14298–302.

Ito, H., Okafuji, T., & Suzuki, T. 1995. Vitamin E prevents endothelial injury associated with cisplatin injection into the superior mesenteric artery of rats. Heart and Vessels, 10(4), 178–84.

Jacoby, H., Wnorowski, G., Sakata, K., & Maeda, H. 2000. the effect of mgn-3 on cisplatin and adriamycin induced toxicity in the rat. Int. J. Immunother, 14.

Jamieson, E., & Lippard, S. 1999. Structure , Recognition , and Processing of Cisplatin − DNA Adducts. Chem. Rev., 99(9), 2467–2498.

Judkins, C. P., Diep, H., Broughton, B. R. S., Mast, A. E., Hooker, E. U., Miller, A. A., Drummond, G. R. 2010. Direct evidence of a role for Nox2 in superoxide production, reduced nitric oxide bioavailability, and early atherosclerotic plaque formation in ApoE-/- mice. AJP: Heart and Circulatory Physiology, 298(1), H24–H32.

Kart, A., Cigremis, Y., Karaman, M., & Ozen, H. 2010. Caffeic acid phenethyl ester (CAPE) ameliorates cisplatin-induced hepatotoxicity in rabbit. Experimental and Toxicologic Pathology, 62(1), 45–52.

Kawabe, J., Ushikubi, F., & Hasebe, N. 2010. Prostacyclin in Vascular Diseases. Circulation Journal, 74(5), 836–843.

Khan, A. B., D’Souza, B. J., Wharam, M. D., Champion, L. A., Sinks, L. F., Woo, S. Y., Leventhal, B. G. 1982. Cisplatin therapy in recurrent childhood brain tumors. Cancer Treatment Reports, 66(12), 2013–20.

Koch, M., Krieger, M. L., Stölting, D., Brenner, N., Beier, M., Jaehde, U., Bendas, G. 2013. Overcoming chemotherapy resistance of ovarian cancer cells by liposomal

72

cisplatin: Molecular mechanisms unveiled by gene expression profiling. Biochemical Pharmacology, 85(8), 1077–1090.

Kohn, S., Fradis, M., Podoshin, L., Ben-David, J., Zidan, J., & Robinson, E. 1997. Endothelial injury of capillaries in the stria vascularis of guinea pigs treated with cisplatin and gentamicin. Ultrastructural Pathology, 21(3), 289–99.

Kuhlmann, M., Burkhardt, G., & Kohler, H. 1997. Insights into potential cellular mechanisms of cisplatin nephrotoxicity and their clinical application. Nephrology Dialysis Transplantation, 12(12), 2478–2480.

Kunworarath, N., Muangnil, P., Itharat, A., & Hiranyachattada, S. 2014. Acute and subchronic treatment of Hibiscus sabdariffa Linn. extract on renal function and lipid peroxidation in cisplatin-induced acute renal failure rats. J Physiol Biomed Sci, 27(1), 5–12.

Laguerre, M., Lecomte, J., & Villeneuve, P. 2007. Evaluation of the ability of antioxidants to counteract lipid oxidation : Existing methods , new trends and challenges, 46, 244–282.

Lamai, J., Mahabusarakam, W., Ratithammatorn, T., & Hiranyachattada, S. 2013. Effects of Morelloflavone from Garcinia dulcis on Vasorelaxation of Isolated Rat Thoracic Aorta. J Physiol Biomed Sci, 26, 13–17.

Lassègue, B., Sorescu, D., Szöcs, K., Yin, Q., Akers, M., Zhang, Y., Griendling, K. K. 2001. Novel gp91phox Homologues in Vascular Smooth Muscle Cells. Circulation Research, 88(9).

Lechner, D., Kollars, M., Gleiss, A., Kyrle, P. A., & Weltermann, A. 2007. Chemotherapy-induced thrombin generation via procoagulant endothelial microparticles is independent of tissue factor activity. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 5(12), 2445–2452.

Li, H., & Förstermann, U. 2013. Uncoupling of endothelial NO synthase in atherosclerosis and vascular disease. Current Opinion in Pharmacology, 13(2), 161–167.

Licciardello, J. T., Moake, J. L., Rudy, C. K., Karp, D. D., & Hong, W. K. 1985. Elevated plasma von Willebrand factor levels and arterial occlusive complications associated with cisplatin-based chemotherapy. Oncology, 42(5), 296–300.

Lin, Y.-M., Anderson, H., Flavin, M. T., Pai, Y.-H. S., Mata-Greenwood, E., Pengsuparp, T., Chen, F.-C. 1997. In Vitro Anti-HIV Activity of Biflavonoids Isolated from Rhus

73

succedanea and Garcinia multiflora. Journal of Natural Products, 60(9), 884–888. Lorenz, M. W., Markus, H. S., Bots, M. L., Rosvall, M., & Sitzer, M. 2007. Prediction of

Clinical Cardiovascular Events With Carotid Intima-Media Thickness: A Systematic Review and Meta-Analysis. Circulation, 115(4), 459–467.

Luna-Vázquez, F. J., Ibarra-Alvarado, C., Rojas-Molina, A., Rojas-Molina, I., & Zavala-Sánchez, M. Á. 2013. Vasodilator compounds derived from plants and their mechanisms of action. Molecules, 18(5), 5814–5857.

Lynch, H. T., Casey, M. J., Snyder, C. L., Bewtra, C., Lynch, J. F., Butts, M., & Godwin, A. K. 2009. Hereditary ovarian carcinoma: heterogeneity, molecular genetics, pathology, and management. Molecular Oncology, 3(2), 97–137.

Matsuki, M., Takahashi, A., Katou, S., Takayanagi, A., Takagi, Y., & Kamata, K. 2013. Pathological complete response to gemcitabine and cisplatin chemotherapy for advanced upper tract urothelial carcinoma: a case report. Nihon Hinyokika Gakkai Zasshi. The Japanese Journal of Urology, 104(1), 33–7. Retrieved from

Moncada, S., Gryglewski, R., Bunting, S., & Vane, J. R. 1976. An enzyme isolated from arteries transforms prostaglandin endoperoxides to an unstable substance that inhibits platelet aggregation. Nature, 263(5579), 663–665.

Moncada, S., & Higgs, E. A. 1991. Endogenous nitric oxide: physiology, pathology and clinical relevance. European Journal of Clinical Investigation, 21(4), 361–374.

Niedernhofer, L. J., Daniels, J. S., Rouzer, C. A., Greene, R. E., & Marnett, L. J. 2003. Malondialdehyde, a Product of Lipid Peroxidation, Is Mutagenic in Human Cells. Journal of Biological Chemistry, 278(33), 31426–31433.

Numico, G., Garrone, O., Dongiovanni, V., Silvestris, N., Colantonio, I., Di Costanzo, G., Merlano, M. 2005. Prospective evaluation of major vascular events in patients with nonsmall cell lung carcinoma treated with cisplatin and gemcitabine. Cancer, 103(5), 994–999.

Nuver, J., De Haas, E. C., Van Zweeden, M., Gietema, J. A., & Meijer, C. 2010. Vascular damage in testicular cancer patients: a study on endothelial activation by bleomycin and cisplatin in vitro. Oncology Reports, 23(1), 247–53.

Nuver, J., Smit, A. J., van der Meer, J., van den Berg, M. P., van der Graaf, W. T. A., Meinardi, M. T., Gietema, J. A. 2005. Acute Chemotherapy-Induced Cardiovascular Changes in Patients With Testicular Cancer. Journal of Clinical Oncology, 23(36), 9130–9137.

74

Ohkawa, H., Ohishi, N., & Yagi, K. 1979. Assay for Lipid Peroxides in Animal Tissues Thiobarbituric Acid Reaction, 358, 351–358.

Pablo Huidobro-Toro, J., & Verónica Donoso, M. 2004. Sympathetic co-transmission: the coordinated action of ATP and noradrenaline and their modulation by neuropeptide Y in human vascular neuroeffector junctions. European Journal of Pharmacology, 500(1–3), 27–35.

Parkin, D. M., Bray, F., Ferlay, J., & Pisani, P. 2005. Global cancer statistics, 2002. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 55(2), 74–108. Retrieved from

Pereañez, J. A., Patiño, A. C., Núñez, V., & Osorio, E. 2014. The biflavonoid morelloflavone inhibits the enzymatic and biological activities of a snake venom phospholipase A2. Chemico-Biological Interactions, 220, 94–101.

Pignon, J.-P., Tribodet, H., Scagliotti, G. V., Douillard, J.-Y., Shepherd, F. A., Stephens, R. J., LACE Collaborative Group. 2008. Lung Adjuvant Cisplatin Evaluation: A Pooled Analysis by the LACE Collaborative Group. Journal of Clinical Oncology, 26(21), 3552–3559.

Piketty, A.-C., Fléchon, A., Laplanche, A., Nouyrigat, E., Droz, J.-P., Théodore, C., & Fizazi, K. 2005. The risk of thrombo-embolic events is increased in patients with germ-cell tumours and can be predicted by serum lactate dehydrogenase and body surface area. British Journal of Cancer, 93(8), 909–914.

Pinkaew, D., Cho, S. G., Hui, D. Y., Wiktorowicz, J. E., Hutadilok-Towatana, N., Mahabusarakam, W., Fujise, K. 2009. Morelloflavone blocks injury-induced neointimal formation by inhibiting vascular smooth muscle cell migration. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, 1790(1), 31–39.

Rosenberg, B., Van Camp, L., & Krigas, T. (1965). Inhibition of Cell Division in Escherichia coli by Electrolysis Products from a Platinum Electrode. Nature, 205(4972), 698–699.

Russell, A., & Watts, S. 2000. Vascular Reactivity of Isolated Thoracic Aorta of the C57BL/6J Mouse 1. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 294, 598–604.

Saad, S. Y., Najjar, T. A., & Alashari, M. 2004. Role of non-selective adenosine receptor blockade and phosphodiesterase inhibition in cisplatin-induced nephrogonadal toxicity in rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 31(12), 862–867.

75

Sagstuen, H., Aass, N., Fosså, S. D., Dahl, O., Klepp, O., Wist, E. A., … Bremnes, R. M. 2005. Blood pressure and body mass index in long-term survivors of testicular cancer. Journal of Clinical Oncology : Official Journal of the American Society of Clinical Oncology, 23(22), 4980–90.

Saleh, R. M., Awadin, W. F., Elseady, Y. Y., & Waheish, F. E. 2014. Renal and Cardiovascular Damage Induced by Cisplatin in Rats. Life Science Journal, 11(2), 191–203.

Salvesen, G. S., & Abrams, J. M. (2004). Caspase activation – stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene, 23(16), 2774–2784.

Shen, D.-W., Pouliot, L. M., Hall, M. D., & Gottesman, M. M. (2012). Cisplatin Resistance: A Cellular Self-Defense Mechanism Resulting from Multiple Epigenetic and Genetic Changes. Pharmacological Reviews, 64(3), 706–721.

Shrivastava, A., Kuzontkoski, P. M., Groopman, J. E., & Prasad, A. 2011. Cannabidiol Induces Programmed Cell Death in Breast Cancer Cells by Coordinating the Cross-talk between Apoptosis and Autophagy. Molecular Cancer Therapeutics, 10(7), 1161–1172.

Smyth, E. M., Grosser, T., Wang, M., Yu, Y., & FitzGerald, G. A. 2008. Prostanoids in health and disease. The Journal of Lipid Research, 50(Supplement), S423–S428.

Stocker, R., & Keaney, J. F. 2004. Role of Oxidative Modifications in Atherosclerosis. Physiological Reviews, 84(4), 1381–1478.

Swift, M. R., & Weinstein, B. M. 2009. Arterial-venous specification during development. Circulation Research, 104(5), 576–88.

Szerafin, T., Erdei, N., Fülöp, T., Pasztor, E. T., Edes, I., Koller, A., & Bagi, Z. 2006. Increased Cyclooxygenase-2 Expression and Prostaglandin-Mediated Dilation in Coronary Arterioles of Patients With Diabetes Mellitus. Circulation Research, 99(5), e12-317.

Taddei, S., Versari, D., Cipriano, A., Ghiadoni, L., Galetta, F., Franzoni, F., Salvetti, A. 2006. Identification of a Cytochrome P450 2C9-Derived Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor in Essential Hypertensive Patients. Journal of the American College of Cardiology, 48(3), 508–515.

Thorin, E., & Webb, D. J. 2010. Endothelium-derived endothelin-1. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology, 459(6), 951–958.

76

Tirapelli, C. R., Bonaventura, D., Tirapelli, L. F., & de Oliveira, A. M. (2009). Mechanisms underlying the vascular actions of endothelin 1, angiotensin II and bradykinin in the rat carotid. Pharmacology, 84(2), 111–26.

Togna, G. I., Togna, A. R., Franconi, M., & Caprino, L. 2000. Cisplatin triggers platelet activation. Thrombosis Research, 99(5), 503–9.

Triggle, C. R., Samuel, S. M., Ravishankar, S., Marei, I., Arunachalam, G., & Ding, H. 2012. The endothelium: influencing vascular smooth muscle in many ways. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, 90(6), 713–738.

Tsutsui, M., Shimokawa, H., Otsuji, Y., & Yanagihara, N. 2010. Pathophysiological relevance of NO signaling in the cardiovascular system: Novel insight from mice lacking all NO synthases. Pharmacology & Therapeutics, 128(3), 499–508.

Tuansulong, K. A., Hutadilok-Towatana, N., Mahabusarakam, W., Pinkaew, D., & Fujise, K. 2011. Morelloflavone from Garcinia dulcis as a novel biflavonoid inhibitor of HMG-CoA reductase. Phytotherapy Research, 25(3), 424–428.

Unger, T. 2002. The role of the renin-angiotensin system in the development of cardiovascular disease. The American Journal of Cardiology, 89(2), 3–9.

Vanhoutte, P., Wolfe, C. J., & Hole, W. 1998. Vascular biology Old-timer makes a comeback. Nature, 396, 213–216.

Vaughn, D. J., Palmer, S. C., Carver, J. R., Jacobs, L. A., & Mohler, E. R. 2008. Cardiovascular risk in long-term survivors of testicular cancer. Cancer, 112(9), 1949–1953.

Wang, D., & Lippard, S. J. 2005. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Delivery, 4(4), 307–320.

Wehaish, F. E., Elseady, Y. Y., Saleh, R. M., & Elshal, M. F. 2014. Molecular and Immunohistochemical Evidences for Cardiovascular Damage in Addition to Renal Toxicity of Cisplatin. Life Science Journal, 11(6), 1–8.

Wei, C. M., Hu, S. L., Miller, V. M., & Burnett, J. C. 1994. Vascular Actions of C-Type Natriuretic Peptide in Isolated Porcine Coronary Arteries and Coronary Vascular Smooth Muscle Cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 205(1), 765–771.

Weijl, N. I., Rutten, M. F. J., Zwinderman, A. H., Keizer, H. J., Nooy, M. A., Rosendaal, F. R., Osanto, S. 2000. Thromboembolic Events During Chemotherapy for Germ Cell Cancer: A Cohort Study and Review of the Literature. Journal of Clinical

77

Oncology, 18(10), 2169–2178. Yanagisawa, M., Inoue, A., Ishikawa, Tomohi., Kasuya, Y., Kimura, S., KUMAGAYEt,

S., Masaki, T. 1988. Primary structure, synthesis, and biological activity of rat endothelin, an endothelium-derived vasoconstrictor peptide, 85, 6964–6967.

Yao, X., Panichpisal, K., Kurtzman, N., & Nugent, K. 2007. Cisplatin Nephrotoxicity: A Review. The American Journal of the Medical Sciences, 334(2), 115–124.

Yetik-Anacak, G., & Catravas, J. D. 2006. Nitric oxide and the endothelium: History and impact on cardiovascular disease. Vascular Pharmacology, 45(5), 268–276.

Yilmaz, H. R., Iraz, M., Sogut, S., Ozyurt, H., Yildirim, Z., Akyol, O., & Gergerlioglu, S. 2004. The effects of erdosteine on the activities of some metabolic enzymes during cisplatin-induced nephrotoxicity in rats. Pharmacological Research, 50(3), 287–290.

Yilmaz, H. R., Sogut, S., Ozyurt, B., Ozugurlu, F., Sahin, S., Isik, B., Ozyurt, H. 2005. The activities of liver adenosine deaminase, xanthine oxidase, catalase, superoxide dismutase enzymes and the levels of malondialdehyde and nitric oxide after cisplatin toxicity in rats: protective effect of caffeic acid phenethyl ester. Toxicology and Industrial Health, 21(1–2), 67–73.

Yu, M., Han, J., Cui, P., Dai, M., Li, H., Zhang, J., & Xiu, R. 2008. Cisplatin up-regulates ICAM-1 expression in endothelial cell via a NF-κB dependent pathway. Cancer Science, 99(2), 391–397.

78

ภาคผนวก

ตารางท 1 ผลของ phenylephrine (PE) ความเขมขนระหวาง 10-10-10-4M ตอการหดตวของ aortic ring ทแสดงโดยคา % increase from resting tension คาท แสดงคอ mean ± S.E.M. (n=6) *P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบคา control ของกลมเดยวกน (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test) #P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม intact endothelium (unpaired t-test)

Isolated aortic ring concentration % increase from resting tension

Intact endothelium

Control 0 ± 0 10-10 M PE 1.67 ± 0.76 10-9 M PE 2.13 ± 0.91 10-8 M PE 8.17 ± 2.68 10-8 M PE 89.07 ± 5.46 10-7 M PE 138.1 ± 6.57* 10-6 M PE 145.44 ± 7.6* 10-5 M PE 126.64 ± 5.54*

denuded

Control 0 ± 0 10-10 M PE 0.76 ± 0.29 10-9 M PE 1.71 ± 0.33 10-8 M PE 53.75 ± 5.96*# 10-7 M PE 139.48 ± 11.71*# 10-6 M PE 180.82 ± 5.18*# 10-5 M PE 186.79 ± 5.39*# 10-4 M PE 181.11 ± 5.06*#

79

ตารางท 2 ผลของ acetylcholine (ACh) ตอการคลายตวของ aortic ring ทท าใหหดตวกอนดวย 10-7M PE ทแสดงโดยคา % relaxation from 10-7M PE precontraction คาทแสดงคอ mean ± S.E.M. (n=6) *P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบคา control ของกลมเดยวกน (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test) #P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม intact endothelium (unpaired t-test)

Isolated aortic ring concentration % relaxation from 10-7M

PE precontraction

Intact endothelium

Control 0 ± 0 10-12 M ACh 4.35 ± 0.58 10-11 M ACh 10.01 ± 1.28* 10-10 M ACh 18.72 ± 1.34* 10-9 M ACh 22.72 ± 1.91* 10-8 M ACh 26.74 ± 2.37* 10-7 M ACh 69.69 ± 3.45* 10-6 M ACh 100.11 ± 0.78* 10-5 M ACh 103.89 ± 0.92*

denuded

Control 0 ± 0 10-12 M ACh 0.36 ± 0.37# 10-11 M ACh 0.81 ± 0.32# 10-10 M ACh 1.12 ± 0.27# 10-9 M ACh 1.67 ± 0.86# 10-8 M ACh 1.82 ± 1.12# 10-7 M ACh 1.01 ± 1.35# 10-6 M ACh 1.67 ± 1.09# 10-5 M ACh 2.47 ± 0.73#

80

ตารางท 3 ผลของ morelloflavone (Mor) ตอการคลายตวของ aortic ring กลม control (Con) ทม endothelium (intact endothelium) และ endothelium ถกท าลาย (denuded) และกลม cisplatin (Cis) ท าใหหดตวกอนดวย 10-7M PE คาทแสดงคอ mean ± SEM (n=6 ทกกลมการทดลอง) *, # P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม Con (intact endothelium) และ Con (denuded) ตามล าดบ (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test)

Isolated aortic ring concentration % relaxation from 10-7M PE precontraction

Intact endothelium

Control 0 ± 0 10-12 M Mor 5.65 ± 0.56 10-11 M Mor 15.22 ± 1.39 10-10 M Mor 29.88 ± 2.5 10-9 M Mor 38.93 ± 2.79 10-8 M Mor 45.34 ± 2.76 10-7 M Mor 49.82 ± 2.83 10-6 M Mor 57.11 ± 3.51 10-5 M Mor 75.44 ± 0.95

denuded

Control 0 ± 0 10-12 M Mor -0.08 ± 0.38 10-11 M Mor 0.96 ± 1.09* 10-10 M Mor 2.08 ± 1.18* 10-9 M Mor 3.61 ± 1.53* 10-8 M Mor 4.69 ± 1.63* 10-7 M Mor 6.33 ± 1.98* 10-6 M Mor 7.5 ± 2.36* 10-5 M Mor 8.92 ± 2.31*

Cis

Control 0 ± 0 10-12 M Mor 4.18 ± 0.53 10-11 M Mor 8.97 ± 1.06*# 10-10 M Mor 14.55 ± 1.51*# 10-9 M Mor 20.24 ± 1.89*#

81

10-8 M Mor 26.06 ± 1.76*# 10-7 M Mor 31.18 ± 1.45*# 10-6 M Mor 37.76 ± 1.76*# 10-5 M Mor 57.54 ± 3.53*#

ตารางท 4. ผลของ PE ตอการหดตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), cisplatin 3 วน (Cis 3 days), คาทแสดงคอ mean ± SEM

Isolated aortic ring concentration % increase from resting

tension

Con

Control 0 ± 0 10-10 M PE 0.66 ± 0.37 10-9 M PE 1.66 ± 0.36 10-8 M PE 3.7 ± 0.55 10-7 M PE 83.31 ± 5 10-6 M PE 132.37 ± 5.98 10-5 M PE 145.76 ± 6.31

Cis 3 days

Control 0 ± 0 10-10 M PE 0.79 ± 0.4 10-9 M PE 1.73 ± 0.62 10-8 M PE 6.78 ± 1.19 10-7 M PE 89.03 ± 5.36 10-6 M PE 139.85 ± 2.81 10-5 M PE 154.88 ± 3.39

82

ตารางท 5. ผลของ ACh ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), cisplatin 3 วน (Cis 3 days), คาทแสดงคอ mean ± SEM

Isolated aortic ring concentration % relaxation from 10-7M PE precontraction

Con

Control 0 ± 0 10-12 M ACh 3.99 ± 0.94 10-11 M ACh 11.34 ± 2.14 10-10 M ACh 16.96 ± 2.8 10-9 M ACh 20.97 ± 3.08 10-8 M ACh 27.36 ± 4.58 10-7 M ACh 71.37 ± 7.76 10-6 M ACh 102.78 ± 3.87 10-5 M ACh 107.87 ± 2.34

Cis 3 days

Control 0 ± 0 10-12 M ACh 3.56 ± 0.88 10-11 M ACh 10.34 ± 1.76 10-10 M ACh 15.37 ± 1.68 10-9 M ACh 18.81 ± 1.51 10-8 M ACh 24.42 ± 2.18 10-7 M ACh 65.37 ± 6.29 10-6 M ACh 100.44 ± 3.28 10-5 M ACh 106.04 ± 2.8

83

ตารางท 6. ผลของ SNP ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), cisplatin 3 วน (Cis 3 days), คาทแสดงคอ mean ± SEM

Isolated aortic ring concentration % relaxation from 10-7M

PE precontraction

Con

Control 0 ± 0 10-12 M SNP 6.59 ± 1.19 10-11 M SNP 17.27 ± 2.85 10-10 M SNP 24.72 ± 4.08 10-9 M SNP 42.6 ± 3.68 10-8 M SNP 86.63 ± 1.86 10-7 M SNP 108.23 ± 2.34 10-6 M SNP 109.86 ± 2.18 10-5 M SNP 110.15 ± 2.18

Cis 3 days

Control 0 ± 0 10-12 M SNP 6.08 ± 1.8 10-11 M SNP 20.73 ± 6.57 10-10 M SNP 28.64 ± 8.93 10-9 M SNP 38.84 ± 10.06 10-8 M SNP 80.07 ± 8.48 10-7 M SNP 100.92 ± 3.31 10-6 M SNP 107.89 ± 0.94 10-5 M SNP 108.07 ± 1.24

84

ตารางท 7. ผลของ PE ตอการหดตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), cisplatin (Cis), cisplatin+morelloflavone (Cis+Mor) คาทแสดงคอ mean ± SEM *, # P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม Con และ Cis ตามล าดบ (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test)

Isolated aortic ring Concentration

% increase from resting

tension

Con

Control 0 ± 0 10-10 M PE 0.65 ± 0.25 10-9 M PE 0.95 ± 0.32 10-8 M PE 12.39 ± 0.98 10-7 M PE 83.54 ± 3.99 10-6 M PE 131.28 ± 3.44 10-5 M PE 144.83 ± 2.73

Cis

Control 0 ± 0 10-10 M PE 0.67 ± 0.2 10-9 M PE 0.93 ± 0.23 10-8 M PE 19.26 ± 0.48* 10-7 M PE 120.76 ± 5.22* 10-6 M PE 161.91 ± 3.09* 10-5 M PE 170.36 ± 2.28*

Cis+Mor 0.1 mg/kg

Control 0 ± 0 10-10 M PE 0.65 ± 0.31 10-9 M PE 0.97 ± 0.32 10-8 M PE 16.54 ± 0.86* 10-7 M PE 116.16 ± 2.91* 10-6 M PE 154.56 ± 1.75* 10-5 M PE 165.55 ± 2.57*

Cis+Mor 1 mg/kg

Control 0 ± 0 10-10 M PE 0.72 ± 0.19 10-9 M PE 1.13 ± 0.23 10-8 M PE 11.42 ± 1.17

85

10-7 M PE 96.64 ± 2.15*# 10-6 M PE 142.53 ± 2.48*# 10-5 M PE 154.42 ± 1.34*#

Cis+Mor 10 mg/kg

Control 0 ± 0 10-10 M PE 2.2 ± 1 10-9 M PE 3.64 ± 1.35 10-8 M PE 16.27 ± 1.11* 10-7 M PE 126.48 ± 8.44* 10-6 M PE 167.58 ± 3.15* 10-5 M PE 178.77 ± 3.03*

86

ตารางท 8. ผลของ ACh ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), cisplatin (Cis), cisplatin+morelloflavone (Cis+Mor) คาทแสดงคอ mean ± SEM *, # P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม Con และ Cis ตามล าดบ (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test) Isolated aortic ring concentration % relaxation from 10-7M

PE precontraction

Con

Control 0 ± 0 10-12 M ACh 3.8 ± 1.18 10-11 M ACh 9.07 ± 1.26 10-10 M ACh 15.66 ± 1.67 10-9 M ACh 20.74 ± 2.07 10-8 M ACh 26.94 ± 2.59 10-7 M ACh 72.55 ± 4.99 10-6 M ACh 103.75 ± 1.71 10-5 M ACh 107.6 ± 1.34

Cis

Control 0 ± 0 10-12 M ACh 3.15 ± 1.02 10-11 M ACh 8.21 ± 1.26 10-10 M ACh 12.09 ± 1.72 10-9 M ACh 14.16 ± 1.8* 10-8 M ACh 16.65 ± 1.57* 10-7 M ACh 40.13 ± 2.98* 10-6 M ACh 85.68 ± 2.05* 10-5 M ACh 95.14 ± 1.16*

Cis+Mor 0.1 mg/kg

Control 0 ± 0 10-12 M ACh 2.8 ± 0.33 10-11 M ACh 6.27 ± 0.53 10-10 M ACh 10.46 ± 1.04 10-9 M ACh 13.78 ± 1.42* 10-8 M ACh 19.29 ± 1.09* 10-7 M ACh 47.44 ± 0.94*

87

10-6 M ACh 85.16 ± 1.53* 10-5 M ACh 94.28 ± 1.27*

Cis+Mor 1 mg/kg

Control 0 ± 0 10-12 M ACh 3.08 ± 0.51 10-11 M ACh 7.42 ± 0.61 10-10 M ACh 11.11 ± 1.12 10-9 M ACh 15.79 ± 1.24* 10-8 M ACh 19.79 ± 0.96* 10-7 M ACh 57.1 ± 0.89*# 10-6 M ACh 95.53 ± 2.18*# 10-5 M ACh 101.19 ± 1.4*#

Cis+Mor 10 mg/kg

Control 0 ± 0 10-12 M ACh 2.34 ± 0.58 10-11 M ACh 6.29 ± 1.48 10-10 M ACh 11.01 ± 1.29 10-9 M ACh 13.37 ± 0.79* 10-8 M ACh 16.37 ± 1.13* 10-7 M ACh 43.61 ± 4.01* 10-6 M ACh 82.3 ± 4.24* 10-5 M ACh 94.45 ± 1.08*

88

ตารางท 9. ผลของ SNP ตอการคลายตวของ thoracic aortic ring ในกลม control (Con), cisplatin (Cis), cisplatin+morelloflavone (Cis+Mor) คาทแสดงคอ mean ± SEM *, # P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม Con และ Cis ตามล าดบ (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test)

Isolated aortic ring concentration % relaxation from 10-7M

PE precontraction

Con

Control 0 ± 0 10-12 M SNP 6.53 ± 1.22 10-11 M SNP 15.69 ± 2.89 10-10 M SNP 26.88 ± 3.22 10-9 M SNP 46.19 ± 6.63 10-8 M SNP 85.68 ± 5.36 10-7 M SNP 107.12 ± 1.93 10-6 M SNP 109.33 ± 2.07 10-5 M SNP 109.23 ± 2.03

Cis

Control 0 ± 0 10-12 M SNP 7.14 ± 1.26 10-11 M SNP 18.39 ± 1.84 10-10 M SNP 25.28 ± 1.82 10-9 M SNP 40.59 ± 2.14 10-8 M SNP 80.41 ± 6.7 10-7 M SNP 102.8 ± 4.14 10-6 M SNP 106.04 ± 3.03 10-5 M SNP 108.46 ± 1.47

Cis+Mor 0.1 mg/kg

Control 0 ± 0 10-12 M SNP 9.49 ± 1.1 10-11 M SNP 18.68 ± 4.39 10-10 M SNP 25.92 ± 5.79 10-9 M SNP 41.88 ± 5.8 10-8 M SNP 81.96 ± 7.27 10-7 M SNP 102.8 ± 2.56

89

10-6 M SNP 105.35 ± 1.75 10-5 M SNP 106.21 ± 2.02

Cis+Mor 1 mg/kg

Control 0 ± 0 10-12 M SNP 6.15 ± 1.34 10-11 M SNP 17.05 ± 1.83 10-10 M SNP 27.77 ± 3.06 10-9 M SNP 42.37 ± 2.21 10-8 M SNP 83.68 ± 3.01 10-7 M SNP 101.15 ± 1.95 10-6 M SNP 105.2 ± 1.41 10-5 M SNP 107.27 ± 1.36

Cis+Mor 10 mg/kg

Control 0 ± 0 10-12 M SNP 5.11 ± 2.14 10-11 M SNP 12.25 ± 2.88 10-10 M SNP 19.51 ± 4.37 10-9 M SNP 32.82 ± 5.11 10-8 M SNP 71.78 ± 3.96 10-7 M SNP 87.92 ± 3.18*# 10-6 M SNP 100.01 ± 2.43 10-5 M SNP 104.3 ± 1.45

90

ตารางท 10. ผลของ cisplatin (7.5 mg/kg) (Cis) และ cisplatin+morelloflavone (0.1,1 และ 10 mg/kg) (Cis+Mor) ตอระดบ plasma MDA คาทแสดงคอ mean ± SEM *, # P<0.05 เมอเปรยบเทยบกบกลม Con และ Cis ตามล าดบ (one-way ANOVA with multiple comparison using Student-Newman-Keuls post hoc test)

Treatment Plasma MDA level (µmol/L) Con 30.83 ± 2.04 Cis 75.52 ± 5.7* Cis+Mor 0.1 mg/kg 70.44 ± 9.34* Cis+Mor 1 mg/kg 48.32 ± 2.16*# Cis+Mor 10 mg/kg 73.42 ± 8.94*

91

ประวตผเขยน

ชอ สกล นายอฎฮา สมาล รหสประจ าตวนกศกษา 5710220117 วฒการศกษา

วฒ ชอสถาบน ปทส าเรจการศกษา

วทยาศาสตรบณฑต (สาขากายภาพบ าบด)

จฬาลงกรณมหาวทยาลย

2557

ทนการศกษา 1. ทนผชวยสอน คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร ปการศกษา 2557 - 2559 2. ทนราชกรฑาสโมสร ปการศกษา 2557 - 2559 3. ทนมลนธวฒนธรรมอสลามเพอการศกษาและการพฒนา (วกพ.) ปการศกษา 2557 - 2559 การตพมพเผยแพรผลงาน Sumalee, A., Mahabusarakum, W., Kirirat, P. and Hiranyachattada, S. 2015. Effect of

morelloflavone from Garcinia dulcis on the contraction of isolated thoracic aorta of cisplatin-treated Rat. The 8th Scientific Congress Federation of Asian and Oceanian Physiological Societies (FAOPS) 2015, Bangkok, Thailand. P:130