实验 27

阳性单菌落扩增与 小量 DNA制备

目 的

1．为进一步鉴定重组质粒提供适量的质粒 DNA 排除自身环化。鉴定方法主要有： （1）PCR法。采用载体两端的引物进行 PCR，一旦插入

成功，则可以在电泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小一致的 PCR产物。 （2）Southern bl ot 法。将培养皿上的菌落转移到硝酸

纤维素膜上，变性、固定，以插入片段为探针作 Southern bl ot。重组成功者，在相应的菌落位置上可以见到放射自显影的黑点，培养皿上对应的菌落即为重组成功者。 （3）酶切鉴定法。

2．提供一定数量的 DNA以满足一些实验 比如： （1）测序； （2）准备杂交用的探针。 这是该实验的两个主要目的。

原 理

挑选单一菌落，培养扩增。离心收集扩增了的大肠杆菌，用碱性液裂解细菌，再经酸性溶液处理形成钾-SDS-蛋白质-膜复合物，离心后，此复合物与细菌染色体 DNA、高分子量的 RNA 等得到沉淀，而细菌中小分子量的质粒DNA将溶于上清之中。上清经乙醇沉淀后，得到质粒 DNA。

实验准备

（参考教材）

实验步骤

1．第一天（通常为下午） 从琼脂平板上挑取单一菌落，接种到 Fal con 管内的

5ml LB 培养液（含氨卞青霉素或相应的抗生素）中。放入37℃恒温摇床中，225-250 rpm剧烈摇晃培养过夜（O/ N），扩增大肠杆菌。

2．第二天（通常上午开始） （1）吸取 1. 5ml 培养液，移入 Eppendorf 管中，台式

离心机室温下 1. 4万转离心 2分钟，弃上清，重复一至二次，以取得较大的沉淀。剩余培养液存入 4℃冰箱。

（2）弃上清，加入 100ul 溶液 I，盖 上盖，剧烈震荡（可以将管底抵于试管架 面上，划 15下），充分浮悬细胞沉淀，置 -20℃冰箱内 5分钟。 （3）自冰箱中取出试管，加入 200ul

溶液 I I，轻轻颠倒混匀，放于冰上 5分钟。 （4）加入 150ul 溶液 I I I，轻轻颠倒混匀，放于冰上

15分钟。 （5）放入台式离心机，室温下 1. 4万转离心 3分钟，

将上清移入一新的 Eppendorf 管，加入 1ml 100％乙醇，混匀，放入-20℃冰箱 5分钟。 （6）自冰箱中取出试管，迅速移入 4℃环境下的台式

离心机，1. 4万转离心 5分钟，小心弃去上清，倒置试管于纸巾上流尽乙醇。

（7）加入 300ul TE和 2ul RNase，重浮悬沉淀，放试管于 37℃的水浴中温育 30分钟。

（8）加入 3M NaAC 34ul，混匀，加入 1ml 预冷的 100％乙醇，-20℃存放 5分钟。

（9）自冰箱中取出试管，迅速移入 4℃环境下的台式离心机，1. 4万转离心 5分钟，弃去上清。

（10）加入 1ml 预冷的 75％乙醇，迅速移入 4℃环境下

的台式离心机，1. 4万转离心 10分钟，弃去上清。 （11）旋转真空干燥 10分钟。于冰上，溶解沉淀于 20ul

水中。

实验结果

通常可获得 3-5ugDNA。

注意事项

1．在培养箱温度不够稳定等因素的影响下，有时隔夜后没有菌落形成，此时不必急于怀疑实验失败。建议再倒置培养一些时候，比如等到中午，或更晚一些时候，培养皿上会出现菌落。

2．挑取菌落必须是单菌落，而不是那些融合的菌落。如果培养皿上的菌落全部融合，则建议重新划板培养，直至有单菌落为止。不然一旦混有不同的菌落，可能会给以后的实验带来麻烦。

3．有关微型离心柱回收的利弊。原理与本实验近似，区别在于在 DNA的回收阶段，不是采用醋酸钠-乙醇沉淀，而是采用微型柱。回收产物中往往留有痕量乙醇，这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性，使后续工作困难。

4．离心要求平衡。方法是保证离心机转子对面两侧的试管孔内有含有相等数量的离心物和试管，使两侧平衡。如果仅有一个离心管，则要求对面放置另一根相同规格的离心管，管内加入与样品数量相等的水。具体方法可以参考生化有关书籍。

5．DNA的离心通常采用 1. 4万转的转速，10分钟的时

间，这足以满足沉淀 DNA的要求。 6．沉淀 DNA或 RNA离心时，应把 Eppendorf 管盖的连

接蒂指向外侧，以保证离心后沉淀位于管底靠连接蒂的一侧，当 DNA或 RNA量少至难以辨认时，吸取上清之际，可避免吸头触及这一区域把所需沉淀吸起。

7．室温下，DNA 沉淀容易浮起，所以整个操作过程应保持在 4℃环境下进行，手指持试管上部，切勿接触试管底部。

8．吸取上清时动作要轻而快，加入 75％乙醇时，应将

乙醇沿管壁轻轻加入，以免将沉淀冲起。 9．通常，实验对 RNA污染不是有严格要求的话，比如

做酶切鉴定的话，实验的 7、8、9步骤可以免去。这样可以提高实验速度。

10．离心后大肠杆菌的裂解物会黏附于管壁和浮于离心

液表面，为避免大肠杆菌的裂解物堵塞吸头，可以一面将吸头推出气体，一面插入表面含有大肠杆菌的裂解物的离心液。