Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Lincomycin và Spectinomycin trong dược...

8/18/2019 Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Lincomycin và Spectinomycin trong dược phẩm thú y bằng phương …

http://slidepdf.com/reader/full/tham-dinh-phuong-phap-xac-dinh-ham-luong-lincomycin-va-spectinomycin 1/77

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HUỲNH MINH KHÁNH

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁPXÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LINCOMYCIN VÀ

SPECTINOMYCIN TRONG DƯỢC PHẨM THÚ YBẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

VỚI ĐẦU DÒ UV – VIS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH: HÓA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ts. NGUYỄN THỊ HỒNG NHÂN

2014

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COMóng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú



TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------

Năm học 2014 – 2015

Đề tài:

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG

LINCOMYCIN VÀ SPECTINOMYCIN TRONG DƯỢC PHẨM THÚ Y

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

VỚI ĐẦU DÒ UV – VIS

LLỜỜII CCAAMM ĐĐOOAA N N

........ ......................................................................................................................

........ ......................................................................................................................

........ ......................................................................................................................

........ ......................................................................................................................

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

Luận văn tốt nghiệp đại học ngành: Hóa Học

Đã bảo vệ và được duyệt

Hiệu trưởng………………………………..

Trưởng khoa………………………………..

Trưởng Bộ môn Cán bộ hướng dẫn

Ts. Nguyễn Trọng Tuân Ts. Nguyễn Thị Hồng Nhân





Trường Đại học Cần Thơ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Khoa Khoa học Tự nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Bộ môn Hóa học ----------

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Nguyễn Thị Hồng Nhân

2. Đề tài: Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng lincomycin và

spectinomycin trong dược phẩm thú y bằng phương pháp sắc ký lỏng cao

áp với đầu dò UV – Vis3. Sinh viên thực hiện: Huỳnh Minh Khánh

MSSV: 2111927Lớp: Hóa Học – Khóa 37

4. Nội dung nhận xét:

a. Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

.......................................................................................................................

.......................................................................................................................

.......................................................................................................................

b. Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:

.......................................................................................................................

.......................................................................................................................

c. Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài:

.......................................................................................................................

.......................................................................................................................

d. Kết luận, đề nghị, điểm: .......................................................................................................................

.......................................................................................................................


Cán bộ hướng dẫn

Ts. Nguyễn Thị Hồng Nhân





Trường Đại học Cần Thơ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Khoa Khoa học Tự nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Bộ môn Hóa học ----------

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1. Cán bộ phản biện: ...........................................................................................

2. Đề tài: Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng lincomycin và

spectinomycin trong dược phẩm thú y bằng phương pháp sắc kỹ lỏng caoáp với đầu dò UV - Vis 3. Sinh viên thực hiện: Huỳnh Minh Khánh

MSSV: 2111927Lớp: Hóa Học – Khóa 37

4. Nội dung nhận xét:

a. Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

.......................................................................................................................

.......................................................................................................................

.......................................................................................................................

b. Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp: .......................................................................................................................

.......................................................................................................................

c. Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài:

.......................................................................................................................

.......................................................................................................................

d. Kết luận, đề nghị, điểm:

.......................................................................................................................

.......................................................................................................................


Cán bộ phản biện





i

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn tập thể quý Thầy, Cô bộ mônHóa học, khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là Cô cố

vấn học tập cô Lê Thị Bạch, cô Dương Kim Hoàng Yến đã tận tình truyền đạtkiến thức trong suốt thời gian em theo học tại trường và tạo mọi điều kiệnthuận lợi cho em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn ThịHồng Nhân đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt cho em kiến thức và kinh nghiệmtrong suốt thời gian chúng em thực hiện luận văn.

Em cũng xin gởi lời cảm ơn đến chị Huỳnh Như Thụy và các anh chịtrong phòng kiểm nghiệm của Công ty TNHH Thuốc Thú Y Á Châu đã nhiệttình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt luận văn này.

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn ở bên cạnh

động viên, giúp em hoàn thành tốt Luận văn này.

Cuối cùng, xin cảm ơn các bạn lớp Hóa học – K37 đã nhiệt tình hỗ trợ,giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận văn tốt nghiệp.

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Minh Khánh





ii

TÓM LƯỢC

Đề tài: “Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng lincomycin và

spectinomycin trong dược phẩm thú y bằng phương pháp sắc ký lỏng caoáp với đầu dò UV – Vis” được thực hiện với với mục tiêu xác định tính tuyến

tính, tính đặc hiệu, độ đúng và độ lặp lại, để áp dụng phương pháp đó vàokiểm nghiệm thuốc tiêm Speclin D và Spectinomycin 5% của Công ty TNHH

Thuốc Thú Y Á Châu.

Phương pháp sắc ký lỏng cao áp được thực hiện với cột XDB C18, pha

động hỗn hợp acetonitril, methanol và dung dịch pH=6 với tỉ lệ 18:14:68, tốcđộ dòng 1 mL/phút và được đo tại bước sóng 220 nm.

Phương pháp này cho kết quả tốt trong việc định lượng cả lincomycin và

spectinomycin: tính tuyến tính, tính đặc hiệu, độ đúng, hay độ lặp lại đều đạttheo chuẩn của GLP từ đó ứng dụng vào định lượng hoạt chất lincomycin vàspectinomycin trong Speclin D, spectinomycin trong Spectinomycin 5% đã đạt

hàm lượng theo TCCS (90– 110%).





iii

LỜI CAM ĐOAN

Tất cả dữ liệu và số liệu sử dụng trong nội dung bài luận văn được tham

khảo nhiều nguồn tài liệu khác nhau và được ghi nhận từ những kết quả thực

nghiệm mà tôi đã tiến hành khảo sát trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Tôixin cam đoan về sự tồn tại và tính trung thực khi sử dụng những dữ liệu và sốliệu này.

Huỳnh Minh Khánh





iv

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... i

TÓM LƯỢC ...................................................................................................... ii

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. iii

MỤC LỤC ........................................................................................................ ivDANH MỤC BẢNG ....................................................................................... vii

DANH MỤC HÌNH ....................................................................................... viii

DANH MỤC VIẾT TẮT .................................................................................. ix

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU................................................................................ 1

1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................ 1

1.2 Mục tiêu cụ thể ........................................................................................ 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................... 2

2.1 Sơ lược về kháng sinh ............................................................................. 2

2.2 Tổng quan về lincomycin ........................................................................ 2

2.2.1 Khái quát .......................................................................................... 2

2.2.2 Tính chất, công thức và danh pháp .................................................. 3

2.2.3 Cơ chế tác động ................................................................................ 3

2.2.4 Phổ kháng khuẩn .............................................................................. 4

2.2.5 Dược động học ................................................................................. 4 2.2.6 Tác dụng phụ .................................................................................... 4

2.2.7 Chỉ định và chống chỉ định .............................................................. 4

2.2.8 Liều lượng và cách dùng .................................................................. 5

2.2.9 Thận trọng ........................................................................................ 6

2.3 Tổng quan về spectinomycin................................................................... 6

2.3.1 Khái quát .......................................................................................... 6

2.3.2 Tính chất, cấu tạo và danh pháp ....................................................... 6

2.3.3 Cơ chế tác động ................................................................................ 7

2.3.4 Phổ kháng khuẩn .............................................................................. 7

2.3.5 Dược động học ................................................................................. 7

2.3.6 Chỉ định và chống chỉ định .............................................................. 8

2.3.7 Tác dụng phụ .................................................................................... 8

2.3.8 Liều lượng và cách dùng .................................................................. 8

2.3.9 Thận trọng ........................................................................................ 9

2.4 Tác dụng của việc kết hợp lincomycin và spectinomycin trong thú y .... 9

2.5 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ........................................................... 11

2.5.1 Nguyên tắc hoạt động .................................................................... 11





v

2.5.2 Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng cao áp ....................................... 12

2.5.3 Các yếu tố và thông số đặc trưng của máy sắc ký lỏng cao áp ...... 14

2.5.4 Định tính và định lượng bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp ........... 15

2.5.5 Ứng dụng của sắc ký lỏng cao áp .................................................. 18

2.6 Thẩm định phương pháp phân tích ........................................................ 18 2.6.1 Tính tuyến tính ............................................................................... 19

2.6.2 Tính đặc hiệu .................................................................................. 20

2.6.3 Độ lặp lại ........................................................................................ 21

2.6.4 Độ đúng .......................................................................................... 21

2.6.5 Giới hạn phát hiện .......................................................................... 22

2.6.6 Giới hạn định lượng ....................................................................... 22

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 24 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện ............................................................ 24

3.1.1 Địa điểm thực hiện ......................................................................... 24

3.1.2 Thời gian thực hiện ........................................................................ 24

3.2 Phương tiện thực hiện ............................................................................ 24

3.2.1 Thiết bị và dụng cụ......................................................................... 24

3.2.2 Hóa chất cần thiết và dung môi ...................................................... 24

3.3 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 25

3.4 Hoạch định thí nghiệm .......................................................................... 25

3.4.1 Thẩm định quy trình định lượng lincomycin và spectinomycin bằng

phương pháp sắc ký lỏng cao áp. ............................................................ 25

3.4.2 Áp dụng định tính và định lượng lincomycin và spectinomycin

trong sản phẩm Speclin D và S pectinomycin 5% của Công ty TNHH

Thuốc Thú Y Á Châu. ............................................................................. 26

3.5 Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 26

3.5.1 Khảo sát thời gian lưu lincomycin và spectinomycin .................... 29

3.5.2 Thẩm định quy trình định lượng .................................................... 29

3.5.3 Áp dụng định lượng vào dược phẩm thú y .................................... 32

CHƯƠNG 4: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ.............................................. 34

4.1 Khảo sát thời gian lưu của lincomycin và spectinomycin ..................... 34

4.2 Thẩm định quy trình định lượng ........................................................... 34

4.2.1 Tính tuyến tính ............................................................................... 34

4.2.2 Tính đặc hiệu .................................................................................. 39

4.2.3 Độ lặp lại ........................................................................................ 41

4.2.4 Độ đúng .......................................................................................... 43





vi

4.2.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .................................... 45

4.3 Áp dụng định lượng vào dược phẩm thú y ............................................ 45

4.3.1 Sản phẩm Speclin D ....................................................................... 45

4.3.2 Sản phẩm spectinomycin 5% ......................................................... 47

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 49

5.1 Kết luận ................................................................................................. 49

5.2 Kiến nghị ............................................................................................... 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 50

PHỤ LỤC ........................................................................................................ 52





vii

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Chuẩn bị mẫu khảo sát độ tuyến tính lincomycin và spectinomycin 29

Bảng 3. 2 Chuẩn bị mẫu khảo sát độ tuyến tính của lincomycin .................... 30

Bảng 3. 3 Chuẩn bị mẫu khảo sát độ tuyến tính của spectinomycin ............... 30

Bảng 3. 4 Chuẩn bị mẫu khảo sát độ đúng ...................................................... 32Bảng 4. 1 Kết quả khảo sát thời gian lưu của spectinomycin và lincomycin .. 34

Bảng 4. 2 kết quả khảo sát tính tuyến tính của lincomycin trong hỗn hợp chấtchuẩn ................................................................................................................ 35

Bảng 4. 3 khảo sát tính tuyến tính của spectinomycin trong hỗn hợp chuẩn .. 36

Bảng 4. 4 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của lincomycin .............................. 37

Bảng 4. 5 kết quả khảo sát độ tuyến tính của spectinomycin .......................... 38

Bảng 4. 6 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của lincomycin ............................... 40

Bảng 4. 7 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của spectinomycin ......................... 40 Bảng 4. 8 Kết quả mẫu chuẩn xác định độ lặp lại ........................................... 41

Bảng 4. 9 Kết quả khảo sát độ lặp lại .............................................................. 42

Bảng 4. 10 Kết quả mẫu chuẩn xác định độ đúng ........................................... 43

Bảng 4. 11 Kết quả phân tích sắc ký độ đúng của spectinomycin .................. 43

Bảng 4. 12 Kết quả xác định độ đúng của spectinomycin ............................... 43

Bảng 4. 13 Kết quả phân tích sắc ký xác định độ đúng của lincomycin ......... 44

Bảng 4. 14 Kết quả xác đinh độ đúng của lincomycin .................................... 44

Bảng 4. 15 Kết quả xác định mẫu chuẩn trong kiểm ứng dụng Speclin D ...... 46

Bảng 4.16 Kết quả kiểm ứng dụng Speclin D ................................................. 46

Bảng 4. 17 Kết quả kiểm ứng dụng Spectinomycin 5% .................................. 47





viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 2. 1 Công thức cấu tạo của lincomycin ..................................................... 3

Hình 2. 2 Công thức cấu tạo của spectinomycin ............................................... 7

Hình 2. 3 Một số sản phẩm thuốc thú y trên chứa lincomycin, spectinomycin10

Hình 2. 4 Hệ thống máy sắc ký lỏng cao áp .................................................... 11 Hình 2. 5 Bộ phận tiêm mẫu bằng tay ............................................................. 13

Hình 2. 6 Bộ phận bơm mẫu tự động (autosampler) ....................................... 13

Hình 2. 7 Cột sắc ký......................................................................................... 13

Hình 2. 8 Bơm cao áp ...................................................................................... 13

Hình 2. 9 Detector UV - Vis ............................................................................ 13

Hình 2. 10 Đồ thị phương pháp ngoại chuẩn ................................................... 16

Hình 2. 11 Đồ thị phương pháp nội chuẩn ...................................................... 17

Hình 3. 1 Hệ thống máy HPLC ....................................................................... 25 Hình 3. 2 Bể siêu âm ........................................................................................ 25

Hình 3. 3 Cân điện tử 4 số ............................................................................... 25

Hình 3. 4 Sản phẩm Speclin D ......................................................................... 26

Hình 3. 5 Sản phẩm Spectinomycin 5% .......................................................... 26 Hình 3. 6 Quy trình chuẩn bị dung dịch chất chuẩn ........................................ 27

Hình 3. 7 Quy trình chuẩn bị dung dịch mẫu thử ............................................ 28

Hình 4. 1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 0,5 mg/mL lincomycin và spectinomycin .... 34

Hình 4. 2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 0,55 mg/mL lincomycin và spectinomycin .. 34 Hình 4. 3 Phương trình hồi quy tuyến tính của licomycin trong hỗn hợp

chuẩn ................................................................................................................ 35

Hình 4. 4 Phương trình hồi quy tuyến tính của spectinomycin trong hỗn hợp

chuẩn ................................................................................................................ 36

Hình 4. 5 Phương trình hồi quy tuyến tính của chuẩn đơn lincomycin ........... 37

Hình 4. 6 Phương trình hồi quy tuyến tính của chuẩn đơn spectinomycin ..... 38

Hình 4. 7 Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn xác định tính đặc hiệu ..................... 39

Hình 4. 8 Sắc ký đồ mẫu thử xác định tính đặc hiệu ....................................... 39

Hình 4. 9 Sắc ký đồ mẫu trắng xác định tính đặc hiệu .................................... 40

Hình 4. 10 sắc ký đồ chất chuẩn kiểm ứng dụng Speclin D ............................ 46

Hình 4. 11 sắc ký đồ của mẫu Speclin D ......................................................... 46





ix

DANH MỤC VIẾT TẮT

MIC : Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration).

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance LiquidChromatography)

UV – Vis: Ultraviolet – VisibleDMPM: Dung môi pha mẫu. SD: Độ lệch chuẩn (Standard Deviation). RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation).

Speclin D: Sản phẩm thuốc tiêm có chứa spectinomycin và lincomycin

của Công ty TNHH Thuốc Thú Y Á Châu.

Spectinomycin 5%: Là sản phẩm thuốc tiêm có chứa spectinomycin của Công

ty TNHH Thuốc Thú Y Á Châu.

AAS: Phổ hấp thu nguyên tử (Atomic Absorption Spectroscopy).AES: Phổ phát xạ nguyên tử (Atomic Emission Spectroscopy).

MS: Phổ khối lượng (Mass Spectrometry).





Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học

GVHD: Nguyễn Thị Hồng Nhân 1 SVTH: Huỳnh Minh Khánh

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, ngành dược đang phát triển mạnh mẽ trong đó có kháng sinh.Sử dụng kháng sinh hợp lý có thể điều trị được những căn bệnh do nhiễmkhuẩn gây ra, nhưng nếu sử dụng quá liều hay không đủ liều lượng thì nó sẽgây ảnh hưởng xấu như: không khỏi bệnh hoặc nghiêm trọng hơn dẫn đến tìnhtrạng kháng thuốc. Kháng sinh được sử dụng rộng rãi trên người và trên cả vậtnuôi.

Lincomycin và spectinomycin là hai loại kháng sinh mới được đưa vàosử dụng trong thú y, nó có hiệu quả rất cao khi kết hợp lại với nhau đặc biệt

điều trị nhiễm khuẩn đường hô hấp và bệnh liên quan đến đến đường tiêu hóa.Với hiệu quả này đã có rất nhiều công ty trong và ngoài nước sản xuất ra sản

phẩm có chứa hai hoạt chất lincomycin và spectinomycin. Do đây là hai loạikháng sinh mới nên việc tìm ra một phương pháp định lượng cùng lúc hai loạikháng sinh này là vô cùng cần thiết.

Vì vậy, trong đề tài này việc xác định hàm lượng lincomycin vàspectinomycin trong sản phẩm dược thú y là điều rất cần thiết để sử dụng điềutrị trên vật nuôi. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp với đầu dò UV - Vis là một

phương pháp phổ biến, phù hợp với phòng kiểm nghiệm và độ chính xác cao. Nên đề tài “Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng lincomycin và

spectinomycin trong sản phẩm dược thú y bằng phương pháp sắc ký lỏngcao áp với đầu dò UV – Vis” được tiến hành nhằm đáp ứng nhu cầu kiểm trachất lượng dược phẩm tại phòng kiểm nghiệm Công ty TNHH Thuốc Thú Y ÁChâu.

1.2 Mục tiêu cụ thể

Đề tài thực hiện với các mục tiêu sau: Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng lincomycin và

spectinomycin trong sản phẩm dược thú y bằng phương pháp HPLC đầu dò

UV – Vis phải đạt theo tiêu chuẩn của GLP với tính tuyến tính (R ≥0,99), tính

đặc hiệu, độ đúng (98% ≤ Đ ≤ 102%), độ lặp lại (RSD ≤ 2%).

Áp dụng phương pháp vào định lượng lincomycin và spectinomycin vào

sản phẩm Speclin D và Spectinomycin 5% của Công ty TNHH Thuốc Thú Y

Á Châu.







CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về kháng sinh

Kháng sinh: là những chất có cấu trúc hóa học xác định, có nguồn gốc visinh vật, tổng hợp hoặc bán tổng hợp. Với liều dùng nhỏ có tác dụng kìmkhuẩn hoặc diệt khuẩn. Tác động trong sự chuyển hóa của vi khuẩn – vi nấm – tế bào[1,3].

Các nguyên tắc khi sử dụng kháng sinh[3]:

Chỉ sử dụng kháng sinh khi nhiễm khuẩn nhiễm nấm.

Dựa vào kinh nghiệm lâm sàng từ đó chọn kháng sinh thích hợp và lậpkháng sinh đồ.

Từ kết quả kháng sinh đồ chọn kháng sinh thích hợp theo nguyên tắc: + Phổ hẹp. + Ít tác dụng phụ. + Rẻ tiền. + Ít đề kháng.

Dùng liều tấn công ngay từ đầu, ngưng thuốc khi khỏi bệnh.

Phối hợp kháng sinh[3]:

Mục đích: mở rộng phổ kháng khuẩn, tăng cường khả năng diệt khuẩn,

giảm sự đề kháng của vi khuẩn. Nguyên tắc phối hợ p kháng sinh:

+ Không phối hợp nhiều hơn 2 loại kháng sinh. + Không phối hợp 2 kháng sinh cùng họ hoặc cùng cơ chế tác dụng. + Không điều trị bao vây khi không có chỉ định đặc biệt. + Không phối hợp 2 kháng sinh có cùng độc tính.

2.2 Tổng quan về lincomycin

2.2.1

Khái quátLincomycin là kháng sinh thuộc nhóm lincosamide, được ly trích vào

năm 1962 từ Treptomyces lincolnensis, phổ tác dụng và cơ chế tác dụng rấtgiống với nhóm macrolide[2].

Dẫn xuất chlor hóa của lincomycin là clindamycin (một kháng sinh khác

cũng thuộc nhóm lincosamide)[4].

Sự hiện diện của chứa amine bậc 4 trên phần acid amine làm cho phân tử

mang tính base

[2]

.







2.2.2 Tính chất, công thức và danh pháp

2.2.2.1 Tính chất Dạng base tự do tan ít trong nước (pKa=7,6). Muối hydrochloride

hemihydrate tan trong nước, ethanol nhưng không tan trong các dung môi hữucơ (acetone, chloroform, ether)[1].

2.2.2.2 Công thức[4] Công thức phân tử: C18H34 N2O6S

Khối lượng phân tử: 406,538g/mol

Công thức cấu tạo:

Hình 2. 1 Công thức cấu tạo của lincomycin

2.2.2.3 Danh pháp

(2S,4R)-N-[(1R,2R)-2-hydroxy-1-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-

(methylsulfanyl)oxan-2-yl]propyl]-1-methyl-4-propylpyrrolidine-2-

carboxamide[4].

2.2.3 Cơ chế tác động Lincomycin kết hợp với tiểu đơn vị 50S trên ribosom của vi khuẩn, ngăn

cản quá trình giải mã di truyền trong quá trình tổng hợp protein, do vậy sựtổng hợp tự nó bị ức chế. Quá trình kết hợp này xảy ra ở mức độ thấp nên quá

trình tổng hợp protein vẫn có thể diễn ra, lincomycin chỉ có tác dụng kìmkhuẩn ở các nồng độ trị liệu, ngược lại ở nồng độ cao có tác dụng diệt

khuẩn[3].

Khả năng kết hợp của lincomycin với ribosom của vi khuẩn Gram dươngvà Gram âm ở mức độ tương đương, tuy nhiên tác động mạnh hơn trên Gramdương do tính thẩm thấu qua màng tế bào Gam dương tốt hơn. Không kết hợp

với ribosom của động vật có vú[3].







2.2.4 Phổ kháng khuẩn Phổ tác dụng trên cầu khuẩn Gram dương và trực khuẩn Gram dương[1].

Mặc dù có phổ kháng khuẩn và cơ chế hoạt động tương tự với nhómmacrolide, nhưng lincomycin cũng có hiệu quả chống lại các vi sinh vật khác

bao gồm xạ khuẩn, mycoplasma, và một số loài plasmodium[2].

2.2.5 Dược động học[1-2] Uống: được hấp thu khoảng 20–35% qua ống tiêu hóa. Không uống

trong bửa ăn vì làm giảm nồng độ tới 50%. Sau khi uống 12 giờ, còn tìm thấyhoạt chất ở huyết tương.

Tiêm bắp: được hấp thụ hoàn toàn, đạt nồng độ trong huyết tương sau

khi tiêm 1 –2 giờ.

Phân phối vào dịch não tủy, kể cả khi viêm màng não, thấm tốt vào cácmô kể cả xương và dịch sinh vật. Qua được nhau thai và sữa mẹ. Không thẩmtách qua màng ruột.

Gần 80– 90% vào protein – huyết tương.

Chu kỳ bán rã của lincomycin là 4,51 giờ sau khi tiêm hoặc uống.

Được đào thải qua thận và mật.

2.2.6

Tác dụng phụ Đi lỏng, viêm màng ruột già, có khi buồn nôn, co cứng cơ bụng, ngứa

hậu môn, viêm lưỡi, vị giác bất thường [1].

Tiêm tĩnh mạch có thể gây viêm tĩnh mạch, hạ huyết áp[1].

2.2.7 Chỉ định và chống chỉ định

2.2.7.1 Chỉ định: Lincomycin thường được sử dụng trong nhiễm trùng yếm khí nặng.

Nhiễm khuẩn nặng do các vi khuẩn nhạy cảm, đặc biệt Staphylococcus[5]

(nhiễm khuẩn xương) , Streptococcus[21,23], Pneumococcus[22] ở người bệnh códị ứng với penicilin như: áp xe gan; nhiễm khuẩn phụ khoa; viêm màng bụng

thứ phát; áp xe phổi; nhiễm khuẩn huyết mụn nhọt biến chứng; loét do nhiễmkhuẩn kỵ khí[24].

Nhiễm khuẩn do kháng khuẩn penicilin. Nhiễm khuẩn ở các vị trí thuốckhác khó có thể tới được như cốt tủy cấp tính và mãn tính các nhiễm khuẩn do

bacteroide spp[24]

.







2.2.7.2 Chống chỉ định[2] Chống chỉ định với các trường hợp quá mẫn với với lincomycin và các

thuốc cùng họ với lincomycin. Do tác dụng phụ và độc tính của nó nên ngàynay nó ít được sử dụng trên người.

Trẻ sơ sinh dưới 1 tháng tuổi.

2.2.8 Liều lượng và cách dùng

2.2.8.1 Cách dùngThuốc có thể uống, tiêm bắp hoặc tiêm truyền tĩnh mạch[24]:

Uống: uống cách bữa ăn ít nhất khoảng 1 giờ ăn.

Tiêm: tiêm bắp hoặc tiêm truyền tĩnh mạch. Trước khi tiêm truyền tĩnhmạch phải pha với dung dịch glucose 5% hoặc dung dịch natri chloride 0,9%

trên cơ sở 1 g lincomycin pha ít nhất với 100 mL dung dịch thích hợp vàtruyền nhỏ giọt ít nhất trong 1 giờ (100 mL/giờ).

Tránh không tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch.

Với trường hợp bị suy thận chu kỳ bán rã 10–13 giờ, vì vậy cần phảigiảm liều, liều uống chỉ bằng 15–30% liều bình thường[1].

Khi bị suy gan chu kỳ bán rã là 9 giờ vì vậy cần giảm liều, liều uống chỉ bằng 40–50% liều bình thường[1].

2.2.8.2

Liều dùng[24] Uống: + Người lớn: 500 mg, 3 lần/24 giờ (mỗi lần uống cách nhau 8 giờ); nếu

rất nặng uống 1 g, 3 lần/24 giờ. + Trẻ em trên 1 tháng tuổi: 30 mg/kg thể trọng trong 24 giờ chia làm

3 –4 lần; nếu rất nặng 60 mg/kg thể trọng, chia làm 3–4 lần.

Tiêm bắp: + Người lớn 600 mg (2 mL) 1 lần trong 24 giờ; nếu rất nặng 600 mg

(2 mL) cách nhau 12 giờ. + Trẻ em trên 1 tháng tuổi: 10 mg/kg thể trọng 1 lần trong 24 giờ; nếu

rất nặng 10 mg/kg thể trọng cách nhau 12 giờ.

Tiêm truyền tĩnh mạch:+ Người lớn: 600 mg – 1 g cách nhau 8-12 giờ /lần nếu rất nặng liều tối

đa có thể là 8 g/24 giờ. + Trẻ em trên 1 tháng tuổi: 10 mg/kg/24 giờ. Tùy theo độ nặng của bệnh

mà phân chia giống như của người lớn.







2.2.9 Thận trọng Phải thận trọng khi dùng với người mắc bệnh tiêu hóa, đặc biệt có tiền sử

viêm đại tràng. Người bệnh cao tuổi hoặc nữ có thể bị tiêu chảy nặng hoặcviêm đại tràng có màng giả[2].

Cẩn thận đối với người bị dị ứng, suy gan hoặc suy thận nặng. Đối vớinhững trường hợp này phải điều trị với liều lượng thích hợp[2].

Khi điều trị lâu dài với lincomycin và với trẻ em thì cần phải theo dõiđịnh kỳ chức năng gan và huyết học [24].

Lincomycin có tác dụng chẹn thần kinh – cơ, nên thận trọng khi dùng cácthuốc khác có tác dụng tương tự (các thuốc chống tiêu chảy, thuốc phiện làmnặng thêm viêm đại tràng do làm chậm quá trình bày tiết độc tố)[24].

Lincomycin được bài tiết qua sữa mẹ tới mức có thể ảnh hưởng đến trẻem đang bú sữa mẹ. Vì vậy cần tránh cho con bú khi điều trị bằnglincomycin[24].

2.3 Tổng quan về spectinomycin

2.3.1 Khái quátSpectinomycin được phân lập streptomyces spectabilis (1961), trước kia

có tên là actinospectacin[1].

Dạng khô bảo quản được trên 36 tháng[1].

2.3.2 Tính chất, cấu tạo và danh pháp

2.3.2.1 Tính chất[1] Là chất rắn vô định hình. Có màu trắng, hơi háo ẩm.

Nhiệt độ nóng chảy: 184– 194oC.

Tan trong nước, ethanol, methanol, hầu như không tan trong các dung

môi acetone, các dung môi hydrocarbon.

Độ quay cực riêng: +15 đến +21 dung dịch 10%.

Dung dịch 1% có pH = 3,8– 5,6.

2.3.2.2 Công thức[2] Công thức phân tử: C14H24 N2O4

Khối lượng phân tử: 332,25 g/mol

Công thức cấu tạo







Hình 2. 2 Công thức cấu tạo của spectinomycin

2.3.2.3 Danh pháp

(1R,3S,5R,8R,10R,11S,12S,13R,14S)-8,12,14-trihydroxy-5-methyl-11,13-

bis(methylamino)-2,4,9-trioxatricyclo[8.4.0.0]tetradecan-7-one[2].

2.3.3 Cơ chế tác động Spectinomycin tác động bằng cách ức chế sinh tổng hợp protein của vi

khuẩn. Spectinomycin gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosom gây việc đọcnhằm tín hiệu dẫn đến sản xuất các protein lạ, vi khuẩn không sử dụng được[2].

2.3.4 Phổ kháng khuẩn

Là một kháng sinh kìm khuẩn. Phổ tác dụng in vitro rộng (phần lớnkhuẩn Gram dương và Gram âm)[1].

Spectinomycin tác dụng in vitro ở mức độ khác nhau trên nhiều vi khuẩnGram dương và Gram âm. Thuốc không có tác dụng đối với Treponema

pallinase hoặc Chlamydia trachomatis[24].

In vitro, ở nồng độ 1– 20 µg/mL, spectinomycin đặc biệt ức chế phần lớncác chủng Neisseria gonorrhoeae tiết hoặc không tiết penicilinase. Khi thử độ

nhạy cảm của Neisseria gonorrhoeae với spectinomycin chủng nào có nồngđộ tối thiểu ức chế (MIC) bằng hoặc dưới 32 µg /mL được coi là nhạy cảm;chủng nào có MIC bằng 32– 64 µg/mL được coi là nhạy cảm trung gian và từ128 µg /mL được coi là chủng kháng thuốc[24].

2.3.5 Dược động học[1] Được hấp thu nhanh: tiêm bắp liều duy nhất 2 g sẽ đạt nồng độ tối đa

trong huyết thanh 100 mg/L sau 1 giờ. Nếu tiêm bắp liều duy nhất 4g, thì nồng

độ đạt 160 mg/L (Tmax = 2 giờ). Sau khi tiêm 8 giờ, nồng độ huyết thanh

15mg/L (liều 2 g) hoặc 30 mg/L (đối với liều 4 g), mà MIC của chủng Neisseria gonorrhoeae là <16 mg/L.







Được thải hoàn toàn sau 48 giờ qua đường nước tiểu, dưới dạng còn hoạttính và nồng độ thuốc ở nước tiểu rất cao (1000– 2000 µg/mL). Khi suy thận,thời gian bán hủy là 4,7–29,3 giờ trong huyết thanh. Thẩm phân lọc máu làmgiảm hàm lượng trong huyết thanh tới 50%.

Chu kỳ bán rã là 2 giờ sau khi tiêm bắp.

Không vượt qua được hàng rào máu – não.

2.3.6 Chỉ định và chống chỉ định

2.3.6.1 Chỉ định[1] Dùng để chữa trị bệnh lậu cầu cấp hoặc những trường hợp không chịu

trứng:

Hội chứng hậu môn – ruột thẳng – sinh dục (viêm niệu đạo, viêm ruộtthẳng, viêm cổ tử cung).

Ở người dị ứng với -lactamin.

Điều trị luân phiên, dùng cùng thuốc khác.

Chữa bệnh lậu cầu ở trẻ em trước tuổi dậy thì.

2.3.6.2 Chống chỉ định Chống chỉ định với những bệnh nhân dị ứng với kháng sinh này[1].

2.3.7

Tác dụng phụ Rất hiếm gặp, chỉ có một vài chịu chứng: đau nơi tiêm, chóng mặt, buồn

nôn, nôn, nhức đầu, mất ngủ, co cứng cơ bụng, sốt giảm niệu. Không độc vớithính giác, thận và không gây quái thai[1].

2.3.8 Liều lượng và cách dùng

2.3.8.1 Cách dùngSpectinomycin được hấp thụ mạnh nhất khi tiêm bắp[1,8]

Khi pha thuốc để tiêm. Dùng 3,2 mL nước cất vô khuẩn cho vào lọ 2 gspectinomycin, hoặc 6,2 mL cho lọ 4 g để đạt tới nồng độ 400 mg/mL, lắcmạnh sau khi cho dung môi và trước khi hút mỗi liều [1].

Hút tiêm trực tiếp với những lọ thuốc tiêm.

2.3.8.2 Liều lượng Người lớn: 1 liều duy nhất 2 g, tiêm bắp sâu. Có thể dùng tới 4 g trong

những trường hợp khó điều trị và người bệnh ở những vùng có nguy cơ vi

khuẩn kháng kháng sinh cao[8].







Người cao tuổi: dùng liều của người lớn bình thường.

Trẻ em trên 2 tuổi: 40 mg/kg thể trọng.

2.3.9 Thận trọng

Spectinomycin không có tác dụng đối với giang mai đang ủ bệnh hay đã phát bệnh, nhưng khi dùng liều cao trong thời gian ngắn để chữa bệnh lậu thìspectinomycin lại che lấp hay làm chậm xuất hiện các triệu chứng của bệnhgiang mai. Do đó người trị bệnh lậu cần được theo dõi lâm sàng chặt chẽ từ

46 tuần và nếu có dấu hiệu giang mai thì cần phải theo dõi huyết thanh đầy

đủ vòng 4 tháng. Cẩn thận với những người mắc bệnh thận[25].

2.4 Tác dụng của việc kết hợp lincomycin và spectinomycin trong

thú ySự kết hợp của hai loại kháng sinh này hoàn toàn hợp với nguyên tắc kếthợp kháng sinh trong dược:

Không kết hợp nhiều hơn 2 loại kháng sinh.

Nên phối hợp kháng sinh của hai họ khác nhau, có cơ chế tác động, phổkháng khuẩn khác nhau.

Không nên phối hợp 2 kháng sinh có cùng độc tính.

Tác dụng khi kết hợp lincomycin và spectinomycin:

Những thí nghiệm thực hành điều trị trên những con lợn bị bệnh lỵ vớinhững loại thuốc tiêm khác nhau đã chứng tỏ rằng sự kết hợp li ncomycin – spectinomycin có hiệu quả trong điều trị bệnh lỵ[11].

Escherichia coli và Staphylococcus aureus là hai chủng vi khuẩn hoạtđộng mạnh mẽ và ảnh hướng rất lớn đến gia cầm đặc biệt là gà con, dospectinomycin có tác dụng chủ yếu với Escherichia coli và lincomycin có tác

dụng với Staphylococcus aureus, nên sự kết hợp giữa spectinomycin – lincomycin là một giải pháp hiệu quả để hạn chế sự ảnh hưởng của hai chủng

vi khuẩn trên và cũng kiểm soát được tỷ lệ tử vong trên đàn gà con

[12]

. Lincomycin và spectinomycin còn được sử dụng để trị liệu trên cừu khi

bị nhiễm khuẩn ureaplasmas (viêm niệu đạo không do lậu cầu, viêm tuyếntiền liệt, nhiễm trùng ối…)[13].

Điều trị nhiễm trùng pododermatitis (virulent foot_rot bệnh thối chân)trên cừu của lincomycin – s pectinomycin được so sánh tương đương với

penicillin-streptomycin[10].







Hình 2. 3 Một số sản phẩm thuốc thú y trên chứa lincomycin, spectinomycin







2.5 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp[14-16]

HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu tiên bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography),

trước kia gọi là sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).Phương pháp này ra đời từ năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ

phương pháp sắc ký cột cổ điển.

Sắc ký lỏng cao áp là một phương pháp tách hóa lý dựa vào ái lực khácnhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không trộn lẫn, một

pha động và một pha tĩnh. Trong đó pha động là chất lỏng chảy qua cột với tốcđộ nhất định và pha tĩnh chứa trong chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu

phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã

được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắcký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kíchcỡ (rây phân tử). Khi phân tích sắc ký các chất hòa tan trong dung môi thíchhợp và hầu hết sự phân tích đề xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà cácthuốc không bền với nhiệt khổng bị phân hủy khi sắc ký. Ngày nay sắc kýlỏng cao áp đã và đang được sử dụng trong các lĩnh vực hóa học nói chung và

cũng như trong kiểm tra chất lượng thuốc nói riêng.

2.5.1 Nguyên tắc hoạt động

Hình 2. 4 Hệ thống máy sắc ký lỏng cao áp

Hệ thống dung môi đóng vai trò là pha động được trộn với nhau theo tỷlệ thích hợp và có thể thay đổi thành phần bởi hệ thống Gradient.







Pha động được bơm liên tục qua hệ thống bơm cao áp.

Mẫu phân tích được đưa vào cột tách bằng bộ phận tiêm mẫu (injector,autosampler) sau đó được pha động đẩy vào cột tách, quá trình tách xảy ra ởđây.

Các chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau sẽđược phát hiện bởi các loại detector thích hợp.

2.5.2 Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng cao áp

Để thực hiện việc tách một hỗn hợp chất bằng kỹ thuật phân tích HPLC,chúng ta phải có hệ thống trang bị về kỹ thuật này. Hệ thống trang bị củaHPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC gồm các bộ phận chínhsau:

Bơm cao áp: có nhiệm vụ đẩy pha động vào trong cột, rửa giải chất tan rakhỏi cột sắc ký. Bơm có hai loại: bơm một piston (có áp suất xung) và bơmhai piston (có áp suất không xung).

Bộ phận tiêm mẫu: để bơm mẫu phân tích và cột tách theo những lượngmẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký. Có thể tiêm mẫu bằng tayhoặc tiêm mẫu tự động (autosampler). Tiêm mẫu bằng tay thì độ lặp lạithường không tốt, phụ thuộc rất nhiều vào kỹ thuật của người tiêm mẫu, tiêmmẫu tự động độ lặp lại tốt hơn nhiều.

Cột sắc ký: là cột chứa pha tĩnh, nó là yếu tố quyết định hiệu quả của quátrình tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu. Cột được làm bằng thép không rỉ,chiều dài từ 10-30 cm, đường kính, đường kính trong từ 4-10 mm, cỡ hạt phatĩnh thường 3-10 µm. Thường dùng cột dài 15 cm, 25 cm đường kính trong 4,6

mm, cỡ hạt 5 µm. Tiền cột giữ lại phần bẩn từ dung môi, bảo vệ cột phân tích.

Bộ phận phát hiện chất phân tích (detector): khi chất phân tích đi quađầu dò tạo tín hiệu điện, tín hiệu điện tỉ lệ với lượng chất đi qua đầu d ò, tín

hiệu này được đọc trên máy ghi. Đầu dò phải đạt yêu cầu: phát hiện nhanh vàlặp lại, độ nhạy cao, không làm thay đổi độ phân giải, không làm hỏng chất

phân tích.

Hiện nay có nhiều loại detector: Detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV - Vis

Detector phổ nguyên tử AES hay AAS

Detector phổ huỳnh quang

Detector điện hóa

Detector chiết suất Detector đo độ dẫn nhiệt







Detector diode phát huỳnh quang và diode màng

Detector đo khối lượng (khối phổ: MS)

Trang bị chỉ thị kết quả: có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến nhấtlà các máy tự ghi để ghi tín hiệu dưới dạng các peak của các chất, rồi đến bộ

phận tích phân kế, sau đó máy tính và máy in kèm theo để xử lí và in kết quả.

Ngày nay còn có thêm bộ chương trình gradient dung môi, bơm mẫu tựđộng và pha loãng mẫu, bộ gia nhiệt và ổn nhiệt cho cột tách, máy tính và các

phần mềm điều khiển cho toàn bộ hệ thống sắc ký.

Hình 2. 5 Bộ phận tiêm mẫu bằng tay

Hình 2. 6 Bộ phận bơm mẫu tựđộng (autosampler)

Hình 2. 7 Cột sắc ký

Hình 2. 8 Bơm cao áp Hình 2. 9 Detector UV - Vis







2.5.3 Các yếu tố và thông số đặc trưng của máy sắc ký lỏng cao áp

2.5.3.1 Các yếu tố trong sắc ký lỏng cao áp

Pha tĩnh thường là silicagel gắn các nhóm phân cực ( diol , amine,

ciano,…) ít hay không phân cực (C18, C8, phenyl,…). Pha động là dung môi hay hệ dung môi .

Trong HPLC chia làm 2 loại: pha thường (pha thuận) có pha tĩnh phâncực, pha động không phân cực; pha đảo ngược lại, pha tĩnh không phân cực,

pha động thì phân cực.

Dung môi:

+ Các dung môi dùng trong HPLC đều phải lọc qua màng lọc có kích

thước lỗ là 0,45 µm hay 0,22 µm. (trừ một số dung môi mà nhà sản xuất đã lọc

trước: acetonitril, methanol…) + Dung môi là nước hoặc hệ đệm trong nước thì dùng màng lọc

cellulose acetate hay nitrat, hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước thì dùng màng

lọc polyamide hay nylon, dung môi hữu cơ thì qua màng lọc teflon.

2.5.3.2 Thông số đặc trưng trong sắc ký lỏng cao áp Thời gian chết (t 0 ): là thời gian cần thiết để pha động chạy qua hệ thống

tách.

Thời gian lưu (t R ): là thời gian cần thiết để từ khi chất được bơm vào cột

cho đến khi đạt được nồng độ cực đại trên detector. Thời gian lưu thực (t R’ ): tR’=tR – t0

Hệ số dung lượng (k’):

' 1 R

o

t k

t

Hệ số dung lượng tốt nhất 1<k’<8

Hệ số chọn lọc ( ):

'

'

'

'

B B R B

A A R A

K k t

K k t

.

B lưu giữ mạnh hơn A nên >1. Hệ số chọn lọc tốt nhất là 1,05 < < 2

Số đĩa lý thuyết (N):2

16.W

Rt N

với W là chiều rộng đáy peak.

N tốt nhất khi N bằng với gần bằng Nmax với 4000.maxr

L N

d với L

chiều dài cột (cm), dr là đường kính hạt pha tĩnh (µm)

Độ phân giải (R): độ phân giải giữa hai peak A và peak B được tính theocông thức :







2.

W W

R R B A

A B

t t R

Theo DĐVN3 thì R = 1,5 là hai peak tách nhau hoàn toàn (chỉ xen phủ0,3%). Vậy độ phân giải giữa hai peak tốt nhất là R ≥ 1,5.

Hệ số đối xứng (AS ): AS = W/(2A). Hệ số đối xứng tốt nhất là0,8<AS<1,2

2.5.4 Định tính và định lượng bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp

2.5.4.1 Định tính Nguyên tắc của phân tích định tính theo kỹ thuật HPLC là: so sánh thời

gian lưu của các peak sắc ký trong mẫu phân tích với thời gian lưu của peak

sắc ký trong mẫu chuẩn, từ đó sẽ xác định được trong mẫu sắc ký có chấ t nào,

nếu chúng có thời gian lưu giữ đúng với thời gian lưu của các peak trong mẫuchuẩn.

2.5.4.2 Định lượng a. Phương pháp ngoại chuẩn Phương pháp ngoại chuẩn là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó

hai mẫu chuẩn và thử được tiến hành sắc ký trong cùng một điều kiện.

So sánh diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu thử với diện tích (hoặc

chiều cao) của mẫu chuẩn sẽ tính được hàm lượng các chất trong mẫu thử.Phương pháp này có thể sử dụng chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm.

Chuẩn hóa một điểm: chọn nồng độ chất chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẫuthử. Tính nồng độ mẫu thử theo công thức:

s x s

x

S C

S C

Cx: nồng độ mẫu thử.

Cs: nồng độ chất chuẩn. Sx: diện tích (chiều cao) của peak mẫu thử.

Ss: diện tích (chiều cao) của peak chất chuẩn.

Chuẩn hóa nhiều điể m:

Chuẩn bị một dãy chuẩn với nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Cácđáp ứng thu được là các diện tích hay chiều cao peak ở mỗi điểm chuẩn.

Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích (chiều cao) peak

với nồng độ của chất chuẩn (C).







Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ các chấtcần xác định có 2 cách:

Áp dữ liệu diện tích (chiều cao) peak của chất thử vào đường chuẩn sẽsuy ra nồng độ

Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích(chiều cao) của peak với nồng độ của chất cần xác định

Y = aCX + b

Y: Diện tích (chiều cao) peak

a: Hệ số góc (độ dốc của đường chuẩn) b: Giao điểm giữa đường chuẩn với trục tung

CX: Nồng độ chất cần xác định

X

Y bC

a

Chú ý : Độ lớn của diện tích (chiều cao) peak phải nằm trong khoảng

tuyến tính của đường chuẩn.

b. Phương pháp nội chuẩn

Để giảm sai số và đạt độ lặp lại cao trong phép định lượng bằng sắc kýlỏng cao áp, người ta sử dụng phương pháp chuẩn hóa với chất thứ 2 thêm vào

chất chuẩn ngoại và mẫu thử. Chất này được gọi là chất chuẩn nội. Chất chuẩnnội phải có cấu trúc hóa học tương ứng với chất khảo sát. Trong cùng điều

kiện sắc ký, thời gian lưu của chất chuẩn nội và chất cần phân tích phải khácnhau hoàn toàn.

Chuẩn hóa một điểm: chất nội chuẩn được thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn

mẫu thử, rồi tiến hành sắc ký.

Hình 2. 10 Đồ thị phương pháp ngoại chuẩn







Công thức tính yếu tố hiệu chỉnh:

IS

IS

.

.

X

X

S C Fx

S C

Có thể suy ra công thức tính nồng độ mẫu:

IS

IS

. .S S X

S C C F

S

Fx: Yếu tố hiệu chỉnh. CX: Nồng độ dung dịch chuẩn. CIS: Nồng độ dung dịch nội chuẩn. SX: Diện tích (chiều cao) peak chuẩn. SIS: Diện tích (chiều cao) peak nội chuẩn.

Chuẩn hóa nhiều điểm:

Chuẩn bị một dãy chuẩn có chứa nhiều những lượng (hoặc nồng độ) chất

chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng chứa một lượng (hoặc nồng độ) chất nộichuẩn. Sau khi sắc ký và thu được các dữ kiện điện tích, tiến hành vẽ đườngchuẩn, biểu diễn sự tương quan giữa tỉ số diện tích peak của chuẩn trên chuẩnnội (SS/SIS) với tỉ số của nồng độ ngoại chuẩn trên nội chuẩn (CS/CIS).

Hình 2. 11 Đồ thị phương pháp nội chuẩn

Tiến hành sắc ký mẫu thử cũng được thêm nội chuẩn với lượng (hoặcnồng độ) như thang chuẩn.

Tính tỉ số diện tích (chiều cao) peak của chất thử trên diện tích (chiều

cao) peak nội chuẩn (ST/SIT) rồi dựa vào đường chuẩn sẽ tìm được nồng độ

của chất thử (CT)







c. Phương pháp thêm chuẩn Nguyên tắc của phương pháp này là dùng ngay chính dung dịch mẫu

phân tích để pha một dãy mẫu chuẩn của chất cần phân tích. Nếu mẫu phântích có nồng độ CX, ta thêm vào đó cấp số cộng ΔC chất chuẩn vào mẫu, tiến

hành phân tích sắc ký ta sẽ thu được các đáp ứng tương ứng.

. X a

C C S

S

Có Ca ta suy ra CX

Ưu điểm của phương pháp thêm chuẩn là có độ chính xác cao vì nó loạitrừ được sai số do các yếu tố ảnh hưởng, đặc biệt là ảnh hưởng của quá trìnhxử lý mẫu.

2.5.5 Ứng dụng của sắc ký lỏng cao áp Trong khoảng hơn chục năm trở lại đây, kỹ thuật phân tích HPLC đã

đóng một vai trò rất quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọilĩnh vực khác nhau, nhất là trong lĩnh vực hóa dược, hóa thực phẩm, sinh hóa,hóa nông, hóa dầu, hóa học hợp chất thiên nhiên, các loại chất có tác dụng độchại, phát hiện lượng dư thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, phân tích môi trường,…

Đặc biệt là tách và phân tích lượng vết của các chất.

2.6

Thẩm định phương pháp phân tích[17] Tầm quan trọng của việc thẩm định:

Thẩm định quy trình phân tích là một quá trình tiến hành thiết lập bảngthực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh phương

pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến. Nói cách khác, việc thẩm định một quy trình phân tích yêu cầu chúng ta phải chứng minh một cách khoa học rằngkhi tiến hành thí nghiệm các sai số là rất nhỏ và chấp nhận được.

Trong các tiêu chuẩn chúng ta phải xây dựng phương pháp phân tích haycũng gọi là quy trình thử nghiệm để giúp cho việc thực hiện kiểm tra chấtlượng cũng như các tiêu chí đề ra cho các tiêu chuẩn đó.

Mục tiêu của việc thẩm định các phương pháp phân tích là để chứng tỏrằng quy trình đáp ứng với yêu cầu dự kiến.

Phương pháp phân tích sau khi được thẩm định có thể đưa vào dược điểnhoặc đưa vào các tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) để xin đăng ký lưu hành.







Cơ sở cần thiết cho việc thẩm định phương pháp phân tích để định lượngnhững thành phần chủ yếu trong nguyên liệu làm thuốc, hoạt chất trong cácchế phẩm cần dựa vào các tiêu chuẩn sau:

Tính tuyến tính

Tính đặc hiệu Độ lặp lại Độ đúng

Giới hạn phát hiện

Giới hạn định lượng

2.6.1 Tính tuyến tínhTính tuyến tính (linearity) của một phương pháp phân tích là khả năng

nhận ra các kết quả thử của phương pháp bằng phép biến đổi toán học hay trực

tiếp dựa vào sự tương quan tỉ lệ giữa đại lượng đo được và nồng độ

Tính tuyến tính trong một miền giá trị được xác định bằng hệ số tương

quan.

Cách thực hiện:

Tiến hành thực nghiệm để xác định ứng với nồng độ x biết trước, các giátrị định lượng được y. Nếu y phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ x có nghĩa làtrong khoảng nồng độ cần khảo sát đường biểu diễn của y theo x là một đường

đường thẳng có phương trình sau: y = ax + b

Dựa trên các kết quả thực nghiệm thu được của x và y tương tự ta tính hệsố tương quan R:

2 2

.

.

x x y y R

x x y y

Nếu R = 1: có tương quan tuyến tính rõ rệt

R > 0: có tương quan đồng biến R < 0: có tương quan nghịch biến

R < 5: không có tương quan nghịch biến

R > 5: có phụ thuộc tuyến tính

R = 0: hoàn toàn không có tương quan tuyến tính

Sau khi xác định được khoảng tuyến tính của phương pháp, ta có thể xâydựng phương trình hồi quy của khoảng này tức là xác định hệ số a và b của

phương trình trên:







2

2

x y xy

na x

xn

b y ax

y: giá trị định lượng được

x: nồng độ định lượng

Phương trình hồi quy: y = ax + b

Tùy theo hoạch định mà chọn giá trị R. Nói chung R 0,99

2.6.2 Tính đặc hiệu Tính đặc hiệu (specificity) hay còn gọi là độ chọn lọc của một quy trình

phân tích là khả năng của quy trình cho phép xác định chính xác và đặc hiệuchất cần phân tích và không ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác cótrong mẫu thử. Cụ thể:

Với thử định tính: đảm bảo rằng chính xác đúng chất cần thử.

Với thử tinh khiết: đảm bảo rằng xác định đúng và chính xác hàm lượng

hoặc giới hạn các tạp chất có trong mẫu thử như các chất liên quan, kim loạinặng, các chất phân hủy,…

Với thử định lượng: đảm bảo rằng kết quả thu được của hàm lượng chấtcần phân tích trong mẫu là chính xác.

Trong định lượng, tính đặc hiệu được biểu thị bằng độ chênh lệch hay là

hiệu giữa các kết quả thu được từ một mẫu giả định với kết quả thu được từcác mẫu thử. Tính đặc hiệu cũng là độ nhiễu của phương pháp. Độ nhiễu càng

thấp tính đặc hiệu càng cao.


Chuẩn bị mẫu: ta tiến hành chuẩn bị một mẫu giả định có công thức vàcác thành phần của hoạt chất hoàn toàn giống như của mẫu thử và mẫu trắng

tức là lúc mẫu bao gồm các thành phần giống hệt như mẫu thử chỉ không chứahoạt chất mẫu thử.

Xác định các mẫu trên bằng phương pháp đề xuất. Kết quả thu được sovới mẫu trắng.

Xác định hiệu số sai lệch của các kết quả thu được.







Yêu cầu: Tính đặc hiệu của phương pháp đạt khi H% 1%

2.6.3 Độ lặp lại

Độ lặp lại (hay độ chính xác, precision) là mức độ sát gần giữa các kết

quả thử riêng lẻ với giá trị trung bình x thu được khi áp dụng phương pháp đềxuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định.

Độ lặp lại bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên.

Độ lặp lại thường được thể hiện bằng độ lệch chuẩn (SD) hay độ lệchchuẩn tương đối (RSD) của một loạt các lần thử nghiệm.

Cách thực hiện: Với cùng một mẫu được làm đồng nhất, tiến hành xácđịnh bằng phương pháp đề xuất n lần (n: từ 6–10 hay nhiều hơn). Sau đó ápdụng công thức tính SD và RSD của phương pháp.

2( )

1

i x X SD

n

.100%SD RSD X

i x X

n

X : giá trị trung bình. SD: độ lệch chuẩn. RSD: độ lệch chuẩn tương đối.

Yêu cầu: RSD càng nhỏ, phương pháp phân tích càng chính xác, RSD do

mỗi phòng thí nghiệm đưa ra. Thông thường ta chọn RSD 2%.

2.6.4 Độ đúng

Độ đúng (accuracy) của một phương pháp phân tích là mức độ sát gần

giữa các giá trị tìm thấy với giá trị thực khi áp dụng quy trình đề xuất trêncùng một mẫu thử đã được làm đồng nhất trong điều kiện xác định.

Đại lượng đặc trưng cho độ đúng: BIAS, tỉ lệ phục hồi. BIAS: là hiệugiữa hàm lượng thêm vào và hàm lượng tìm thấy bằng quy trình.

Kết quả định lượng mẫu giả định–kết quả định lượng mẫu trắng

H%=100% - .100%

Kết quả định lượng mẫu giả định







Độ đúng biểu thị tỉ lệ phần trăm phục hồi của giá trị thêm vào mẫu thử bằng phương pháp xây dựng.


Xác định hàm lượng của chất cần thử trong mẫu đem thử bằng phương pháp dự kiến. Cho vào mẫu thử một lượng chất chuẩn của chất cần thử có hàmlượng bằng 90%, 100%, 110% so với hàm lượng chất đó có trong mẫu thử, rồitiến hành xác định bằng phương pháp đề xuất.

Cách tính độ đúng:

Tỉ lệ phục hồi (Đ) .100% x

: hàm lượng tìm lại

x : hàm lượng chuẩn thêm vào

Yêu cầu: 98% Đtb 102%

2.6.5 Giới hạn phát hiện Giới hạn phát hiện (Limit Of Detection) là nồng độ thấp nhất của chất

thử trong mẫu thử còn có thể phát hiện bằng phương pháp đề xuất, nó là mộtthông số của phương pháp thử giới hạn.

Giới hạn phát hiện thường được biểu thị bằng nồng độ phần trăm, phầnnghìn, phần tỷ của chất cần thử trong mẫu. Việc xác định giới hạn phát hiệnkhông cần thiết phải định lượng chính xác mà chỉ cần xác định chất thử cónồng độ cao hơn hay thấp hơn một giới hạn nào đó.

Giới hạn phát hiện được xác định dựa vào phương trình hồi quy tuyếntính của mẫu thử và các thông số thống kê (F- phân phối Fischer và t- phân phối

Student).

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection: LOD) được tính theo công thức:

3,3. SD LODa

SD: độ lệch chuẩn. a: độ dóc (hệ số góc).

2.6.6 Giới hạn định lượng

Giới hạn định lượng (Limit Of Quantitation) là một thông số của phương

pháp phân tích định lượng các hợp chất có trong một khung mẫu với lượng

thấp như những tạp chất trong nguyên liệu làm thuốc và sản phẩm phân hủy cótrong chế phẩm. Giới hạn định lượng là nồng độ thấp nhất của chất cần phân







tích có trong một mẫu thí nghiệm còn có thể xác định được với độ đúng và độchính xác có thể chấp nhận được.

Giới hạn định lượng có thể được biểu thị bằng nồng độ phần trăm, phầnnghìn, phần tỷ của chất cần phân tích trong mẫu.

Giới hạn định lượng được xác định dựa vào phương trình hồi quy tuyếntính của mẫu thử và các thông số thống kê (F- phân phối Fischer và T-phân

phối Student)

Giới hạn định lượng (Limit Of Quantitation: LOQ) được tính theo côngthức:

10.SD

LOQa

SD: độ lệch chuẩn. a: độ dóc (hệ số góc).







CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

3.1.1

Địa điểm thực hiện

Địa điểm: Phòng kiểm nghiệm – Công ty TNHH Thuốc Thú Y Á Châu.

Địa chỉ: số 130 Quốc lộ 1A, phường Ba Láng , quận Cái Răng, ThànhPhố Cần Thơ.

3.1.2 Thời gian thực hiện

Từ ngày 01/08/2014 đến ngày 31/10/2014.

3.2

Phương tiện thực hiện

3.2.1 Thiết bị và dụng cụ

Máy sắc ký lỏng cao áp Agilent technologies 1260

Cân phân tích 4 số lẻ Boeco BBL – 32

Bể siêu âm Sturdy UC – 150

Thiết bị lọc áp suất thấp

Máy đo pH 700

Bình định mức, pipet, cốc thủy tinh, ống đong…

3.2.2 Hóa chất cần thiết và dung môi Nước cất (Công ty TNHH Thuốc Thú Y Á Châu) Acetonitril (Merck)

Methanol (Merck)

Acid phosphoric (H3PO4)

Natri hydroxide (NaOH)

Sodium 1-heptansulfonate (Merck)

Chuẩn lincomycin và spectinomycin của viện kiểm nghiệm thuốcthành phố Hồ Chí Minh







3.3 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu thử: Sản phẩm thuốc tiêm Speclin D và Spectinomycin 5% củaCông ty TNHH Thuốc Thú Y Á Châu.

3.4 Hoạch định thí nghiệm

3.4.1 Thẩm định quy trình định lượng lincomycin và spectinomycin

bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp. Khảo sát tính đặc hiệu

Khảo sát tính tuyến tính

Khảo sát độ chính xác (lặp lại)

Khảo sát độ đúng

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Hình 3. 1 Hệ thống máy HPLC

Hình 3. 2 Bể siêu âm

Hình 3. 3 Cân điện tử 4 số







3.4.2 Áp dụng định tính và định lượng lincomycin và spectinomycin

trong sản phẩm Speclin D và Spectinomycin 5% của Công ty TNHH

Thuốc Thú Y Á Châu.

3.5 Phương pháp nghiên cứu

Điều kiện sắc ký: + Cột XDB C18 (250:4,6 mm; 5 µm).

+ Pha động: Acetonitril – Methanol – Dung dịch pH = 6 (18:14:68).

+ Dung môi pha mẫu (DMPM): dung dịch pH = 6 – acetonitril

(90:10).

+ Detector quang phổ hồng ngoại UV – Vis với bước sóng: 220 nm. + Tốc độ dòng: 1 mL/phút.+ Thể tích tiêm: 20 µl.

Tiến hành:

Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử.

Phân tích sắc ký với dung dịch chất chuẩn và dung dịch mẫu thử trongđiều kiện cần thẩm định.

Tiến hành tính hàm lượng lincomycin và spectinomycin trong mẫu dược phẩm dựa vào diện tích peak của dung dịch chuẩn và dụng dịch thử.

Hình 3. 4 Sản phẩm Speclin D Hình 3. 5 Sản phẩm Spectinomycin5%







Quy trình chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử

Dung dịch chất chuẩn:

Cân 10 mgSpectinomycin

Cân 10 mgLincomycin

Bình định mức 20 mL

Hòa tan trong10 mL DMPM

Định mức tới vạch

bằng DMPM

Lọc qua màng lọc 0,45 µm,

vào vial

Tiến hành phân tích

sắc ký

Hình 3. 6 Quy trình chuẩn bị dung dịch chất chuẩn

Dùng sóng siêu âm hòatan trong 5 phút

Dùng sóng siêu âm hòa

tan trong 5 phút







Dung dịch mẫu thử:

Hút 2 mL Speclin D


Được dung dịch A


Hút 2 mL dung dịch A


Lọc qua màng lọc

0 45 m vào vial


Tiến hành phân tích


Hình 3. 7 Quy trinh chuẩn bị dung dịch mẫu thử Speclin D








3.5.1 Khảo sát thời gian lưu lincomycin và spectinomycin Mục đích:

Xác định thời gian lưu của từng chất để tiến hành định lượng.

Thực hiện:

Dung dịch chất chuẩn spectinomycin: cân 10 mg chuẩn spectinomycincho vào bình định mức 20 mL, tiến hành định mức bằng DMPM.

Dung dịch chất chuẩn lincomycin: cân 10 mg lincomycin cho vào bình

định mức 20 mL, tiến hành định mức bằng DMPM. Tiến hành sắc ký.

3.5.2 Thẩm định quy trình định lượng

3.5.2.1

Tính tuyến tính

Mục đích:

Khảo sát tính tuyến tính của dãy chuẩn 80%, 90%, 100%, 110%, 120%so với nồng độ mẫu cần định lượng.

Xác định phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính(R) giữa nồng độ và diện tích peak của mỗi kháng sinh spectinomyc in và

lincomycin.

Thực hiện: Chuẩn bị dãy chuẩn hỗn hợp: Cân chính xác 106,4 mg lincomycin và

106,4 mg spectinomycin vào bình định mức 100 mL, hòa tan trong 50 mL

DMPM, lắc nhẹ, hoàn tan bằng sóng siêu âm trong 5 phút, định mức tới vạch,tiếp tục hoàn tan bằng sóng siêu âm trong 5 phút. Được dung dịch C. Dùng

pipet hút dung dịch C theo Bảng 3.1 và thêm DMPM vào bình định mức 20mL, định mức tới vạch.

Bảng 3.1 Chuẩn bị mẫu khảo sát độ tuyến tính lincomycin và spectinomycin

STT Nồng độ

lincomycin

(mg/mL)

Nồng độspectinomycin

(mg/mL)

Thể tích dungdịch C hút vào

(mL)

Thể tích vừa đủ

(mL)

1 0,40 0,40 8 20

2 0,45 0,45 9 20

3 0,50 0,50 10 20

4 0,55 0,55 11 20

5 0,60 0,60 12 20

Chuẩn bị dãy chuẩn chỉ có lincomycin: Cân chính xác 106,4 mg







lincomycin vào bình định mức 100 mL, hòa tan trong 50 mL DMPM, lắc nhẹ,hoàn tan bằng sóng siêu âm trong 5 phút, định mức tới vạch, tiếp tục hoàn tan

bằng sóng siêu âm trong 5 phút. Được dung dịch D. Dùng pipet vạch hút dungdịch D theo Bảng 3. 2 và thêm DMPM vào bình định mức 20 mL, định mức

tới vạch.

Bảng 3. 2 chuẩn bị mẫu khảo sát độ tuyến tính của lincomycin

STT Nồng độ lincomycin

(mg/mL)

Thể tích dung dịchD hút vào (mL)


(mL)

1 0,40 8 20

2 0,45 9 20

3 0,50 10 20

4 0,55 11 20

5 0,60 12 20

Chuẩn bị dãy chuẩn chỉ có spectinomycin: Cân chính xác 212,8 mg

spectinomycin vào bình định mức 100 mL, hòa tan trong 50 mL DMPM, lắcnhẹ, hoàn tan bằng sóng siêu âm trong 5 phút, định mức tới vạch, tiếp tục hoàn

tan bằng sóng siêu âm trong 5 phút. Được dung dịch E. Dùng pipet vạch hútdung dịch E theo Bảng 3.3 và thêm DMPM vào bình định mức 20mL, định

mức tới vạch.

Từ các dung dịch vừa pha được, tiến hành phân tích sắc ký.Bảng 3. 3 Chuẩn bị mẫu khảo sát độ tuyến tính của spectinomycin

STT Nồng độ lincomycin

(mg/mL)

Thể tích dung dịchE hút vào (mL)


(mL)

1 0,8 8 20

2 0,9 9 20

3 1,0 10 20

4 1,1 11 20

5 1,2 12 20

3.5.2.2 Tính đặc hiệu

Mục đích:

Xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích và không ảnh hưởng

bởi sự có mặt của chất khác có trong mẫu thử.

Cách tiến hành:

Chuẩn bị mẫu chất chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng.







Dung dịch chất chuẩn: 10 mg lincomycin và 10 mg spectinomycin vào

bình định mức 20 mL, định mức bằng DMPM.

Dung dịch mẫu thử: hút 2 mL S peclin D vào bình định mức 20 mL, địnhmức bằng DMPM (dung dịch A). Tiếp tục hút 2 mL dung dịch A cho vào bình

định mức 20 mL và định mức bằng DMPM.

Mẫu trắng: hút 2 mL mẫu trắng (thành phần tá dược, dung môi giống vớidung dịch thuốc nhưng không có hoạt chất) vào bình định mức 20 mL, địnhmức bằng DMPM. Hút 2 mL dung dịch vừa pha được cho vào bình định mức

20 mL và định mức bằng DMPM.

Tiến hành sắc ký trên điều kiện đã chọn.

Quan sát sắc ký đồ và đưa ra nhận xét.

3.5.2.3 Độ lặp lại

Mục đích:

Xác định giá trị độ lệch chuẩn tương đối của phương pháp (RSD ≤ 2%).

Cách tiến hành:

Dung dịch chất chuẩn: Cân 10 mg lincomycin và 10 mg spectinomycin

vào bình định mức 20 mL, định mức bằng DMPM, lọc qua màng lọc rồi phân

tích sắc ký. Dung dịch thử: hút 2 mL Speclin D cho vào bình định mức 20 mL, định

mức bằng DMPM (dung dịch A). Hút 2 mL dung dịch A cho vào bình địnhmức 20 mL, định mức bằng DMPM, lọc qua màng lọc và phân tích sắc ký.

Hàm lượng phần trăm (%) hoạt chất trong mẫu thử được tính theo côngthức:

% . .10

T

C

S m X A

S

ST: diện tích peak của mẫu thử. SC: diệc tích peak của mẫu chuẩn (với hàm lượng mẫu chuẩn là 10mg). m: khối lượng chuẩn lincomycin (hoặc spectinomycin) đem cân (mg). A: phần trăm hàm lượng chuẩn lincomycin (hoặc spectinmycin).







3.5.2.4 Độ đúng

Mục đích:

Khảo sát độ đúng (độ phục hồi) của chuẩn lincomycin và spectinomycinkhi cho vào mẫu thử ở mức 90%, 100%, và 110% so với nồng độ của các hoạtchất có trong mẫu thử.

Cách tiến hành:

Dung dịch chuẩn: Cân 10 mg lincomycin hydrochloride và 10 mgspectinomycin vào bình định mức 20 mL định mức bằng DMPM, lọc qua

màng lọc rồi phân tích sắc ký.

Dung dịch thử: hút 2 mL Speclin D vào bình định mức 2 mL, định mức

tới vạch (dung dịch A). Hút 2 mL dung dịch A cho vào bình định mức 20 mL,định mức bằng DMPM.

Dung dịch chuẩn gốc: cân 42,6 mg lincomycin và 42,6 mg spectinmycin

vào bình định mức 20 mL, hòa tan và định mức bằng DMPM (dung dịch B)

Tiến hành phân tích.

Bảng 3. 4 Chuẩn bị mẫu khảo sát độ đúng

Các mức độ đúng 90% 100% 110%

Thể tích hút dung dịch thử gốc (mL) 2 2 2Thể tích hút dung dịch chuẩn gốc (mL) 4,5 5 5,5

Thêm DMPM đến vạch (mL) 20 20 20

3.5.3 Áp dụng định lượng vào dược phẩm thú y

3.5.3.1 Sản phẩm Speclin D

Mục đích:

Xác định chính xác hàm lượng spectinomycin và lincomycin có trongsản phẩm thuốc tiêm Speclin D.

Cách tiến hành:

Dung dịch chất chuẩn: Cân 10 mg lincomycin và 10 mg spectinomycin

vào bình định mức 20 mL và định mức bằng DMPM, lọc qua màng lọc rồi phân tích sắc ký.

Dung dịch mẫu thử: hút 2 mL Speclin D cho vào bình định mức 20 mL,

định mức bằng DMPM (dung dịch A). Hút 2 mL dung dịch A cho vào bình







định mức 20 mL, định mức bằng DMPM, lọc qua màng lọc và phân tích sắcký.

3.5.3.2 Sản phẩm Spectinomycin 5%

Mục đích:

Xác định chính xác hàm lượng spectinomycin có trong sản phẩmspectinomycin 5%.

Cách tiến hiện:

Dung dịch chuẩn: Cân 20 mg spectinomycin vào bình định mức 20 mL

và định mức bằng DMPM, lọc qua màng lọc rồi phân tích sắc ký.

Dung dịch thử: hút 2 mL Spectinomycin 5% cho vào bình định mức

20 mL, định mức bằng DMPM (dung dịch B). Hút 2 mL dung dịch B cho vào bình định mức 10 mL, định mức bằng DMPM, lọc qua màng lọc và phân tích

sắc ký.







CHƯƠNG 4: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

4.1 Khảo sát thời gian lưu của lincomycin và spectinomycin

Từ kết quả sắc ký ta có bảng số liệu sau:

Kết luận: Vậy thời gian lưu của spectinomycin là 2,394 phút và thờigian lưu của lincomycin là 11,471 phút

4.2 Thẩm định quy trình định lượng

4.2.1 Tính tuyến tính

4.2.1.1 Thực hiện với hỗn hợp chuẩn

Sắc ký đồ khi thực hiện phân tích sắc ký hỗn hợp mẫu chuẩn:

Hình 4. 1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 0,5

mg/mL lincomycin và spectinomycin

Hình 4. 2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn0,55 mg/mL lincomycin và

spectinomycin

Bảng 4. 1 Kết quả khảo sát thời gian lưu của spectinomycin và lincomycin

Lần đo Thời gian lưu

(phút)

Thời gian lưu trung bình

(phút)

Spectinomycin

1 2,394

2,3942 2,394

3 2,395

Lincomycin1 11,445

11,4712 11,446

3 11,521







Lincomycin


Bảng 4. 2 kết quả khảo sát tính tuyến tính của lincomycin trong hỗn hợp chuẩn

STT Nồng độ (mg/mL)

Lần đo Thời gian lưu tR

(phút)Diện tích

peakDiện tích peak TB

1 0,401 11,4 798,1

788,12 11,5 778,1

2 0,451 11,5 893,3

891,32 11,4 889,2

3 0,501 11,4 965,7

9662 11,3 966,2

4 0,55 1 11,5 1066,0 1058,22 11,4 1050,4

5 0,601 11,5 1166,7

1162,52 11,5 1158,2

y = 1944.1x

R 2 = 0.9933

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Nồng độ mg/mL

D i ệ n t í c h

p e a k

Hình 4. 3 Phương trình hồi quy tuyến tính của licomycin trong hỗn hợp

chuẩn

R 2 = 0,9933 => R = 0,9966

Thực hiện các các phương pháp thống kê trong trong Microsoft Excel2003:

Tra chuẩn bằng các hàm thống kê: (phụ lục 4)

Phân phối Student lý thuyết đối: tlt = TINV(0.05,4)[27] = 2,7764.

Phân phối Student thực nghiệm: ttn = 185,6709.

tlt < ttn

Hệ số góc a = 1944,1 (độ dốc) có ý nghĩa

[26]

. Phân phối Fischer lý thuyết: Flt = FINV(0.05,1,4) = 7,0786







Phân phối Fischer thực nghiệm: Ftn= 34473,68 => Flt < Ftn

=> Phương trình hồi quy tuyến tính của lincomycin y = 1944,1x có ý nghĩa.

Kết luận: Vậy trong khoảng nồng độ 0,4– 0,6 mg/mL thì nồng độ và diệntích peak của lincomycin trong hỗn hợp chất chuẩn tuyến tính với nhau.

Spectinomycin

Từ kết quả sắc ký ta có bảng số liệu sau

Bảng 4. 3 khảo sát tính tuyến tính của spectinomycin trong hỗn hợp chuẩn

STT Nồng độ

(mg/mL)Lần đo

Thời gian lưutR (phút)

Diện tích peak

Diện tích peak TB

1 0,401 2,4 41,6

422 2,3 42,3

2 0,451 2,4 46,8

46,42 2,4 46,0

3 0,501 2,4 51,3

52,12 2,4 52,9

4 0,551 2,3 60,8

59,42 2,3 57,9

5 0,601 2,4 65,8

64,32 2,4 64,4

y = 105.26x

R 2 = 0.992

0

10

20

30

40

50

60

70

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Nồng độ (mg/ml)

D i ệ n t í c h p e a

Hình 4. 4 Phương trình hồi quy tuyến tính của spectinomycin trong hỗn hợp

chuẩn

R 2 = 0,992 => R = 0,996

Thực hiện các các phương pháp thống kê trong trong Microsoft Excel2003:








Phân phối Student lý thuyết: tlt=TINV(0.05,3)=2,7764.

Phân phối Student thực nghiệm: ttn=171,0532.

tlt<ttn=> Hệ số góc a=105,26 (độ dốc) có ý nghĩa

Phân phối Fischer lý thuyết: Flt=FINV(0.05,1,4)=7,7086. Phân phối Fischer thực nghiệm: Ftn= 29259,1826 => Flt<Ftn

=> Phương trình hồi quy tuyến tính của lincomycin y=105,26x có ý nghĩa.

Kết luận: Vậy trong khoảng nồng độ 0,4– 0,6 mg/mL thì nồng độ và diệntích peak của spectinomycin trong hỗn hợp chất chuẩn tuyến tính với nhau.

4.2.1.2 Thực hiện với từng chất chuẩn a.

Lincomycin


Bảng 4. 4 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của lincomycin

STT Nồng độ

(mg/mL)Lần đo


Diện tích peakDiện tích peak TB

1 0,401 12,0 848,2

840,32 11,8 832,3

2 0,451 11,8 913,1

908,82 11,7 904,5

3 0,501 11,7 1020,9

1013,32 11,8 1005,6

4 0,551 11,6 1114,7

11202 11,6 1125,2

5 0,601 11,6 1199,9

1193,22 11,7 1186,5

y = 2018.6x

R 2 = 0.9947

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Nồng độ mg/mL

D i ệ n t í c h p e a k

Hình 4. 5 Phương trình hồi quy tuyến tính của chuẩn đơn lincomycin







R 2 = 0,9947 => R = 0,9973

Thực hiện các các phương pháp thống kê trong trong Microsoft Excel 2003: Tra chuẩn bằng các hàm thống kê: (phụ lục 4)

Phân phối Student lý thuyết:: tlt = TINV(0.05,4) = 2,7764

Phân phối Student thực nghiệm: ttn = 203,716tlt < ttn=> Hệ số góc a = 2018,6 (độ dốc) có ý nghĩa

Phân phối Fischer lý thuyết: Flt = FINV(0.05,1,4) = 7,7086.

Phân phối Fischer thực nghiệm: Ftn= 41499,23 => Flt<Ftn

=> Phương trình hồi quy tuyến tính của lincomycin y = 2018,6x có ý nghĩa.

Nhận xét: Vậy trong dung dịch chỉ chứa lincomycin ở khoảng nồng độ

0,40,6 mg/mL thì nồng độ và diện tích peak tuyến tính với nhau.

b.

Spectinomycin


Bảng 4. 5 kết quả khảo sát độ tuyến tính của spectinomycin

STT Nồng độ

(mg/mL)Lần đo


Diện tích peak

Diện tích peak TB

1 0,401 2,4 81,1

82,52 2,4 83,8

2 0,451 2,4 98,3

97,2

2 2,4 96,1

3 0,501 2,4 106,5

108,22 2,3 109,9

4 0,551 2,4 118,6

119,42 2,4 120,1

5 0,601 2,4 126

127,12 2,4 128,2

y = 106.97x

R 2 = 0.9869

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

Nồng độ mg/ml


Hình 4. 6 Phương trình hồi quy tuyến tính của chuẩn đơn spectinomycin







R 2=0,9869 => R=0,9934

Thực hiện các các phương pháp thống kê trong trong Microsoft Excel 2003:


Phân phối Student lý thuyết: tlt= TINV(0.05,3)=2,7764.

Phân phối Student thực nghiệm: tlt=120,7386.tlt<ttn=> Hệ số góc a=106,97 (độ dốc) có ý nghĩa

Phân phối Fischer lý thuyết: Flt=FINV(0.05,1,3)=7,7086.

Phân phối Fischer thực nghiệm: Ftn= 14577,81=> Flt<Ftn

Phương trình hồi quy tuyến tính của lincomycin y=106,97x có ý nghĩa.

Nhận xét: Vậy trong dung dịch chỉ chứa spectinomycin ở khoảng nồng

độ 0,81,2 mg/mL thì nồng độ và diện tích peak tuyến tính với nhau.

Hình 4. 7 Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn xác định tính đặc hiệu

Hình 4. 8 Sắc ký đồ mẫu thử xác định tính đặc hiệu

4.2.2

Tính đặc hiệu







Hình 4. 9 Sắc ký đồ mẫu trắng xác định tính đặc hiệu

Spectinomycin:

Bảng 4. 6 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của lincomycin

STT Mẫu

Khối lượng

cân (mg)

Thời gian lưu

TR (phút)

Diện tích

peak

Hàm lượng

(%)

1 Mẫu trắng - - - -

2 Thử đặc hiệu - 2,4 63,4 94,6

3 Chuẩn đặc hiệu 10,8 2,4 68,5 94

94,6 0% 100% .100% 0%

94,6 H

Lincomycin:

Bảng 4. 7 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của spectinomycin

STT Mẫu Khối lượng

cân (mg)

Thời gian lưu

TR (phút)

Diện tích peak

Hàm lượng(%)

1 Mẫu trắng - - - -

2 Thử đặc hiệu - 11,4 943,4 95,2

3 Chuẩn đặc hiệu 10,5 11,5 977,8 94

Kết quả định lượng mẫu giả định–kết quả định lượng mẫu trắng

H%=100%-

.100%

Kết quả định lượng mẫu giả định







95,2 0% 100% .100% 0%

95,2 H

Kết luận: Dựa vào Hình 4.9, Hình 4.10, Hình 4.11 và H% củalincomycin và spectinomycin đều bằng 0% (H% < 2%), chứng tỏ phương

pháp có tính đặc hiệu cao.

4.2.3 Độ lặp lại

Mẫu chuẩn:

Từ quá trình sắc ký mẫu chuẩn ta có bảng số liệu sau:

Bảng 4. 8 Kết quả mẫu chuẩn xác định độ lặp lại

Chuẩn 1 Chuẩn 2

Spectinomycin Lincomycin Spectinomycin Lincomycin

Khối lượng cân

(mg)10,1 10 10 10

Thời gian lưu(tR )

2,4 11,3 2,4 11,3

Diện tích peak 52,6 942,9 51,3 939,6

Diện tích peakTB(ứng 10mg) Spectinomycin: 51,7 Lincomycin: 941,3







Mẫu thử:

Bảng 4. 9 Kết quả khảo sát độ lặp lại

Mẫu

Spectinomycin Lincomycin

Thời gian

lưu

(TR )

Diện tích

peak

(ST)

Hàm

lượng

(%)

Thời gian

lưu

(TR )

Diện tích

peak

(ST)

Hàm

lượng

(%)

Thử 1 2,4 55,7 101,3 11,2 986,1 98,5

Thử 2 2,3 55,5 100,9 11,2 965,4 96,4

Thử3 2,4 55 100,0 11,2 983,2 98,2

Thử 4 2,4 56 101,8 11,8 970,0 96,9

Thử 5 2,3 55,5 100,9 11,3 991,2 98,9

Thử 6 2,4 55,3 100,5 11,3 973,4 97,2

Xử líkếtquả

(Phụlục 5)

n = 6

X = 100,9%

SD = 0,623

RSD= .100%SD

X =0,617%

t = TINV(0.05,5)=2,571.

100%t SD

en

0,654 %

100,9 0,654 X e %

n = 6

X = 97,7%

SD = 0,99

RSD= .100%SD

X =1,013%

t = TINV(0.05,5)=2,571.

100%t SD

en

1,016 %

97,7 1,06 X e %

Với:n: số lần lặp lại

X : giá trị trung bình (mean). SD : độ lệch chuẩn.

RSD: độ lệch chuẩn tương đối. t: phân phối student. e: giới hạn tin cậy.

: khoảng tin cậy

Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối của spectinomycin là RSD = 0,617%

và của lincomycin RSD = 1,013 đều < 2%. Vì vậy phương pháp đạt được độlại (độ chính xác).







4.2.4 Độ đúng

Dung dịch chuẩn:

Bảng 4. 10 Kết quả mẫu chuẩn xác định độ đúng

Chuẩn 1 Chuẩn 2

spectinomycin Lincomycin spectinomycin Lincomycin

Khối lượng

cân (mg)10,3 10,4 10 10,9

Thời gian lưu

(phút)2,3 12,1 2,3 12,1

Diện tích peak 57,5 962,6 52,1 1003,2

Diện tích peakTB(ứng10mg)

Spectinmycin: 53,9 Lincomycin: 922,7

Spectinomycin:

Bảng 4. 11 Kết quả phân tích sắc ký độ đúng của spectinomycin

Bảng 4. 12 Kết quả xác định độ đúng của spectinomycin

Tỉ lệ (%)

Diệntích

peak

TB

Tổng

tìm thấy(mg)

Lượng

ban đầu(mg)

Lượngthêm

vào

(mg)

Lượngtìm lại

Tỉ lệ

phục hồi(%)

90% 107,6 18,8 10 9 8,8 97,8

100% 114,6 20 10 10 10 100

110% 119,9 20,9 10 11 10,9 99,1

Nồng độ Lần đo Thời gian lưu Diện tích peak Diện tích peak TB

90%1 2,4 108,2

107,62 2,4 106,9

100%1 2,4 113.9

114,62 2,3 115.2

110%1 2,4 120.6

119.92 2,4 119,1







Nhận xét:

Tỉ lệ hồi phục trung bình:

ĐTB97,8 100 99,1

99%

3

Tỉ lệ phục hồi trung bình là: 99% ( 98% 100,3% 102% ) nằm trong giới

hạn cho phép của tỉ lệ hồi phục vậy độ đúng đạt yêu cầu.

Lincomycin:

Bảng 4. 13 Kết quả phân tích sắc ký xác định độ đúng của lincomycin

Bảng 4. 14 Kết quả xác đinh độ đúng của lincomycin

Tỉ lệ (%) Diệntích

peak

Tổngtìm thấy

(mg)

Lượng ban đầu

(mg)

Lượng

thêm

vào

(mg)

Lượngtìm lại

Tỉ lệ phục hồi

(%)

90% 1842 18,8 9,9 9 8,9 98,9

100% 1941,6 19,8 9,9 10 9,9 99

110% 2040,7 20,8 9,9 11 10,9 99,1

Nhận xét:

Tỉ lệ hồi phục trung bình:

ĐTB98,9 99 99,1

99%3

Tỉ lệ phục hồi trung bình là: 99% ( 98% 100,3% 102% ) nằm trong giới

hạn cho phép của tỉ lệ hồi phục vậy độ đúng đạt yêu cầu.

Nồng độ Lần đo Thời gian lưu Diện tích peak Diện tích peak TB

90%

1 12,3 1830,3

18422 12,2 1853,6

100%1 12,2 1937,7

1941,62 12,2 1945,5

110%1 12,4 2047,3

2040,72 12,3 2034,1







4.2.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Công thức tính giới hạn phát hiện:

3,3.SD

LODa

Công thức tính giới hạn định lượng: 10.

SD LOQ

a

SD: độ lệch chuẩn = standard error. a: hệ số góc của phương trình hồi qui (độ dốc).

Spectinomycin:

SD = 1,6939

a = 105,261,6939

3,3. 3,3. 0,053 / 53 /105,26

SD LOD mg ml g ml a

1,693910. 10. 0,161 / 161 /

105,26

SD LOQ mg ml g ml

a

Vậy giới hạn phát hiện của spectinomycin là 53 / g ml và giới hạn định

lượng là 161 / g ml .

Lincomycin:

SD = 11,1738; a = 1948,611,1738

3,3. 3,3. 0,019 / 19 /1948,6

SD LOD mg ml g ml a

11,173810. 10. 0,057 / 57 /

1948,6

SD LOQ mg ml g ml

a

Vậy giới hạn phát hiện của lincomycin là 19 / g ml và giới hạn đinh

lượng là 57 / g ml .

4.3 Áp dụng định lượng vào dược phẩm thú y

4.3.1

Sản phẩm Speclin D Hàm lượng phần trăm (%) hoạt chất trong mỗi viên được tính theo công

thức:

% . .10

T

C

S m X A

S

ST: diện tích peak của mẫu thử. SC: diệc tích peak của mẫu chuẩn. m: khối lượng chuẩn lincomycin (hoặc spectinomycin) đem cân (mg).

A: phần trăm hàm lượng chuẩn lincomycin (hoặc spectinmycin).







Mẫu chuẩn:

Bảng 4. 15 Kết quả xác định mẫu chuẩn trong kiểm ứng dụng Speclin D

Chuẩn 1 Chuẩn 2

spectinomycin Lincomycin spectinomycin Lincomycin

Khối lượng cân 10,3 10,4 10 10,9

Thời gian lưu 2,3 11,3 2,3 11,3

Diện tích peak 57,5 962,6 52,1 1003,2

Diện tích peakTB (ứng 10mg)

Spectinmycin:53,9 Lincomycin 922,7

Mẫu thử:

Bảng 4.16 Kết quả kiểm ứng dụng Speclin D

Mẫu

Spectinomycin Lincomycin

Thời gianlưu(TR )

Diện tích

peak (ST)

Hàm

lượng(%)

Thời gianlưu(TR )

Diện tích

peak(ST)

Hàm

lượng(%)

Thử 1 2,3 57,7 100,6 12,1 982,9 100,1

Thử 2 2,3 57 99,4 12,2 959,1 97,7

TB - 57,4 100 - 971 98,9

Nhận xét: Hàm lượng spectinomycin 100% và lincomycin: 98,9% nằm

trong khoảng giới hạn cho phép (90%100% ). Vậy sản phẩm Speclin D đạt

tiêu chuẩn theo yêu cầu.

Hình 4. 10 sắc ký đồ chất chuẩn kiểmứng dụng Speclin D

Hình 4. 11 sắc ký đồ của mẫuSpeclin D







4.3.2 Sản phẩm spectinomycin 5% Hàm lượng phần trăm (%) hoạt chất trong mỗi viên được tính theo công

thức:

% . .20

T

C

S m X A

S

ST: diện tích peak của mẫu thử. SC: diệc tích peak của mẫu chuẩn. m: khối lượng chuẩn spectinomycin đem cân (mg). A: phần trăm hàm lượng chuẩn spectinomycin.

Bảng 4. 17 Kết quả kiểm ứng dụng Spectinomycin 5%

Mẫu

Khối

lượng cân

(mg)

Thời gian

lưu

(TR )

Diện tích

peak

(ST)

Diện tích

peak trung

bình

Hàm

lượng

(%)

Nhận xét: Hàm lượng spectinomycin của sản phẩm Spectinomycin 5%

là 97,8% nằm trong khoảng cho phép (90%

110%). Vậy sản phẩm đạt hàmlượng theo yêu cầu.

Việc thẩm định phương pháp định lượng spectinomycin và lincomycinđạt được kết quả sau:

Spectinomycin:

+ Có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak, với

R= 0,9933 nằm trong khoảng 0,99 1 R .

+ Phương pháp có tính đặc hiệu với H% = 0, thỏa điều kiện (H%<1%). +

Phương pháp đạt độ chính xác, với RSD = 0,017%, thỏa điều kiệnRSD 2%.

+ Độ đúng ĐTB = 99% (98% ĐTB 102%) đạt yêu cầu.

+ Giới hạn phát hiện 53 / g ml .

+ Giới hạn định lượng 161 / g ml .

Lincomycin:

+ Có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak, với R =

0,996 nằm trong khoảng 0,99 1 R .

+

Phương pháp có tính đặc hiệu với H% = 0, thỏa điều kiện (H% < 1%). + Phương pháp đạt độ chính xác, với RSD = 1,013% (thỏa điều kiện:

Chuẩn 1 20,1 2,4 108,9109,7 94

Chuẩn 2 20,2 2,4 111,3

Thử 1 - 2,4 108,4114,1 97,8

Thử 2 - 2,4 119,7







RSD 2%)

+ Độ đúng ĐTB = 99% (98% ĐTB 102%) đạt yêu cầu.

+ Giới hạn phát hiện 19 / g ml .

+ Giới hạn định lượng 57 / g ml .

Áp dụng định lượng cho sản phẩm Speclin D hàm lượng lincomycin:98,9%; hàm lượng spectinomycin: 100% và Spectinomycin 5% đều đạt yêucầu.







CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1 Kết luận

Quá trình khảo sát hàm lượng lincomycin và spectinomycin trong sản phẩm Speclin D bằng phương pháp HPLC, đầu dò UV – Vis, thu được kết quả

sau:

Thử nghiệm và chọn lựa được một phương pháp định tính và định lượnglincomycin và spectinmycin dễ dàng, ít tốn thời gian và cho độ nhạy cao.

Việc thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu, độđúng, độ lặp lại đều đạt tiêu chuẩn GLP và tuyến tính trong khoảng nồng độ

0,40,6 mg/mL.

Áp dụng định lượng cho sản phẩm Speclin D và Spectinomycin 5% đềuđạt yêu cầu về hàm lượng lincomycin và spectinomycin.

5.2 Kiến nghị

Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn, nên chỉ dừng lại ở việc thẩmđịnh phương pháp định lượng lincomycin và spectinomycin dưới dạng thuốctiêm do đó đề nghị phát triển đề tài với các sản phấm thuốc khác nhau: thuốc

bột, thuốc viên nén để có thể áp dụng phương pháp trên nhiều loại dược phẩm

hơn.







TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Nguyễn Hữu Quỳnh (chủ biên). Từ điển bách khoa dược học, 1999.

Nhà xuất bản từ điển bách khoa. Trang 347-375.

[2] Lê Minh Trí, Huỳnh Thị Ngọc Phương (chủ biên). Hóa dược 1, 2011. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam. Trang 224- 225, 261-263.

[3] Phạm Thị Tố Liên. Hóa dược. 2013, trang 31-40

[4] Birkenmeyer, R. D.; Kagan, F. (1970). Lincomycin. XI. Synthesis and

structure of clindamycin, a potent antibacterial agent. Journal of Medicinal

Chemistry 13 (4): 616 – 619.

[5] Macleod Aj; Ross Hb; Ozere Rl; Digout G; Van Rooyenc, 1964. A newantibiotic active against staphylococci and other gram-positive cocci: clinicaland laboratory studies. Canadian Medical Association Journal vol.91:

10561060.[6] Spectinomycin Hydrochloride. The American Society of Health-

System Pharmacists. Retrieved Apr 24, 2014.[7] Hutt DM, Judson F. Epidemiology and treatment of oropharyngeal

gonorrhea. Ann Intern Med. 1986; 104:655-658.

[8] Pharmacia & Upjohn. Trobicin (spectinomycin) for injectablesuspension prescribing information. Kalamazoo, MI. 2003.

[9] J. Spizek .T. R ezanka, 2004. Lincomycin, clindamycin and theirapplications. Appl Microbiol Biotechnol (2004) 64: 455-464.

[10] CM Venning, MA Curtis and JR Egerton. Treatment of virulen footrotwith lincomycin and spectinomycin. Australian veterinary journal vol.67,

No.6, 1990. 258-260.

[11] J Comp Med, 1974. Therapeutic effect of Lincomycin and

Spectinomycin water medication on swine dysentery. Canadian Journal of

Veterinary vol.38(1) 1-6.

[12] Avian Dis, 1979. Effect of a single injection of lincomycin,

spectinomycin, and linco spectin on early chick mortality caused by

Escherichia coli and Staphylococcus aureus.[13] S. Marcus, G. Ziv, A. Glickman, 1994, Lincomycin and spectinomycin

in the treatment of breeding rams with semen contaminated with ureaplasmas.

Veterinary Science 1994, 57, 393-394.

[14] Nguyễn Thị Diệp Chi. Các phương pháp phân tích hiện đại. 2008

[15] L. R. Snyder, J.J. Kirkland, and J. W. Dolan, Introduction to ModernLiquid Chromatography, John Wiley & Sons, New York, 2009.

[16] M.W. Dong, Modern HPLC for practicing scientists. Wiley, 2006.[17] Nguyễn Thị Diệp Chi. Các phương pháp kiểm nghiệm dược phẩm thực

phẩm. 2008.



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=MACLEOD%20AJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14217764

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=ROSS%20HB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14217764

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=OZERE%20RL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14217764

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=DIGOUT%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14217764

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=VAN%20ROOYENC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14217764

http://www.drugs.com/monograph/spectinomycin-hydrochloride.html

http://www.drugs.com/monograph/spectinomycin-hydrochloride.html

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=VAN%20ROOYENC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14217764

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=DIGOUT%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14217764

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=OZERE%20RL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14217764

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=ROSS%20HB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14217764

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=MACLEOD%20AJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14217764





[18] http://www.arcsciences.com/Editor/assets/antec/brochures,%20apps%2

0and%20ppts/217_019_03%20spectinomycin%20and%20lincomycin.pdf

[19] http://wenku.baidu.com/view/ff0a85dc551810a6f524863e.htmL

[20] http://aleksandra.madaj.w.interii.pl/HPLC/124.pdf

[21] http://www.rxlist.com/lincocin-drug/indications-dosage.htm[22] http://www.toku-e.com/Assets/MIC/Lincomycin%20HCl%20EP.pdf[23] http://antibiotics.toku-e.com/antimicrobial_783.h[24] http://www.dieutri.vn/l/30-5-2011/S670/Lincomycin-hydrochlorid.htm[25] http://www.dieutri.vn/s/14-6-2011/S799/Spectinomycin.htm[26] Huỳnh Kim Liên. Thống kê hóa học và tin học trong hóa học, 2006.

Trang 30-35, 57-62[27] Nguyễn Thị Ánh Hồng. Khái niệm cơ bản trong thống kê, 2013. Trang

91-93



http://www.arcsciences.com/Editor/assets/antec/brochures,%20apps%20and%20ppts/217_019_03%20spectinomycin%20and%20lincomycin.pdf




http://wenku.baidu.com/view/ff0a85dc551810a6f524863e.html



http://aleksandra.madaj.w.interii.pl/HPLC/124.pdf



http://www.rxlist.com/lincocin-drug/indications-dosage.htm



http://www.toku-e.com/Assets/MIC/Lincomycin%20HCl%20EP.pdf



http://antibiotics.toku-e.com/antimicrobial_783.html



http://www.dieutri.vn/l/30-5-2011/S670/Lincomycin-hydrochlorid.htm



http://www.dieutri.vn/s/14-6-2011/S799/Spectinomycin.htm
















PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Giá trị tương đương với độ tin cậy P và bậc số tự do f = n – 1(t chuẩn student).

fP

0,9 0,95 0,99

6,31 12,7 63,7

2 2,92 4,3 9,92

3 2,35 3,18 5,84

4 2,13 2,78 4,6

5 2,01 2,57 4,036 1,94 2,45 3,71

7 1,89 2,36 3,5

8 1,86 2,31 3,36

9 1,83 2,26 3,25

10 1,81 2,23 3,17

Phụ lục 2: Giá trị Q tương ứng với độ tin cậy P và số lần đo n.

fP

0,9 0,95 0,99

3 0,89 0,94 0,99

4 0,68 0,77 0,89

5 0,56 0,64 0,76

6 0,48 0,56 0,7

7 0,43 0,51 0,64

8 0,4 0,48 0,58

Phụ lục 3: Công thức tính Qtn, giới hạn tin cậy e và giá trị thực M

1

ax min

n n

tn

m

x xQ

x x

Xn: giá trị nghi ngờ (thường là giá trị lớn nhất hay nhỏ nhất).

Xn+1: giá trị lân cận.







Nếu Qtn > Qlt: mắc sai số thô => loại giá trị xn.

Nếu Qtn Qlt: không mắc sai số thô giá trị xn được giữ lại.

.%

t SDe

n

;

Giá trị thực M nằm trong khoảng % M x e

Phụ lục 4: Các thông số trong phương trình hồi quy xử lí bằng excel. Lincomycin trong hỗn hợp chuẩn

SUMMARY OUTPUT

Regression Statistics

Multiple R 0.999942R Square 0.999884

Adjusted R Square 0.749884Standard Error 11.82305

Observations 5

ANOVA

df SS MS F Significance F

Regression 1 4818884 4818884 34473.68 3.45E-07

Residual 4 559.1377 139.7844

Total 5 4819444

Intercept X Variable 1Coefficients 0 1944.098Standard Error #N/A 10.47067t Stat #N/A 185.6709

P-value #N/A 5.05E-09 Lower 95% #N/A 1915.027Upper 95% #N/A 1973.169

Lower 95.0% #N/A 1915.027Upper 95.0% #N/A 1973.169

Spectinomycin trong hỗn hợp chuẩn SUMMARY OUTPUT


Multiple R 0.99993165

R Square 0.99986331

Adjusted R Square 0.74986331

Standard Error 1.69393027

Observations 5







ANOVA


Regression 1 14089.44 14089.44 29259.182 4.40579E-07

Residual 4 1.926157 0.481539

Total 5 14091.37

Intercept X Variable 1

Coefficients 0 105.121569

Standard Error #N/A 0.61455497

t Stat #N/A 171.053157

P-value #N/A 7.0069E-09

Lower 95% #N/A 103.41529

Upper 95% #N/A 106.827847Lower 95.0% #N/A 103.41529

Upper 95.0% #N/A 106.827847

Chuẩn đơn lincomycin SUMMARY OUTPUT


Multiple R 0.999952R Square 0.999904Adjusted R Square 0.749904

Standard Error 11.18909Observations 5

ANOVA


Regression 1 5195523 5195523 41499.23 2.61E-07Residual 4 500.7826 125.1957Total 5 5196024

Intercept X Variable 1Coefficients 0 2018.643Standard Error #N/A 9.909222t Stat #N/A 203.7136

P-value #N/A 3.48E-09 Lower 95% #N/A 1991.131Upper 95% #N/A 2046.156

Lower 95.0% #N/A 1991.131Upper 95.0% #N/A 2046.156

Chuẩn đơn spectinomycin

SUMMARY OUTPUT








Multiple R 0.999859212

R Square 0.999718445

Adjusted R Square 0.749718445

Standard Error 2.027003971

Observations 5

ANOVA


Regression 1 58355.67 58355.67 14202.8 1.3E-06

Residual 4 16.43498 4.108745

Total 5 58372.1


Coefficients 0 106.9686

Standard Error #N/A 0.897572

t Stat #N/A 119.1755

P-value #N/A 2.97E-08

Lower 95% #N/A 104.4766

Upper 95% #N/A 109.4607

Lower 95.0% #N/A 104.4766

Upper 95.0% #N/A 109.4607

Phụ lục 5 Các thông số trong xây dựng đường chuẩn y = ax + b

Chuẩn lincomycin trong hỗn hợp chuẩn:

y = 1831x + 57.68

R 2 = 0.9972

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Nồng độ mg/mL

D i ệ n t í c h p e a k








Intercept X Variable 1Coefficients 57.68 1831Standard Error 28.14381282 55.73305

t Stat 2.049473551 32.85304 P-value 0.132831197 6.2E-05 Lower 95% -31.8861731 1653.633Upper 95% 147.2461731 2008.367

Lower 95.0% -31.8861731 1653.633Upper 95.0% 147.2461731 2008.367

Tra chuẩn bằng các hàm thống kê:

Phân phối Student lý thuyết đối với giá trị b (tung độ góc): tlt=TINV(0.05,1)=12,0762.

Phân phối Student thực nghiệm đối với giá trị b (tung độ góc): ttn=2,049

tlt>ttn=> Giá trị b = 57,68 (tung độ góc) không có ý nghĩa. => Thiết lập phương trình đường thẳng ở đường thẳng y = ax

Đường chuẩn spectinomycin trong hỗn hợp

y = 111,2x - 3,1

R 2 = 0.9968

0

10

20

30

40

50

60

70

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Nồng độ (mg/ml)

D i ệ

n t í c h p e a



Coefficients -3.1 111.2Standard Error 1.829098138 3.622154055

t Stat -1.694824315 30.69996425

P-value 0.188680624 7.59278E-05

Lower 95% -8.921006612 99.67268921

Upper 95% 2.721006612 122.7273108

Lower 95.0% -8.921006612 99.67268921

Upper 95.0% 2.721006612 122.7273108

Tra chuẩn bằng các hàm thống kê: Phân phối Student lý thuyết đối với giá trị b (tung độ góc):







tlt=TINV(0.05,1)=12,0762.

Phân phối Student thực nghiệm đối với giá trị b (tung độ góc):

ttn= -1,6948

tlt>ttn=> Giá trị b = -3,1 (tung độ góc) không có ý nghĩa.

=> Thiết lập phương trình đường thẳng ở đường thẳng y = ax Đường chuẩn lincomycin trong chuẩn đơn

y = 1932.8x + 43.78

R 2 = 0.9967

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Nồng độ mg/mL


Thực hiện các các phương pháp thống kê trong trong Microsoft Excel 2003: Intercept X Variable 1

Coefficients 43.78 1932.8

Standard Error 32.61541 64.58813

t Stat 1.34231 29.925P-value 0.272036 8.2E-05

Lower 95% -60.0168 1727.252

Upper 95% 147.5768 2138.348

Lower 95.0% -60.0168 1727.252

Upper 95.0% 147.5768 2138.348



Phân phối Student thực nghiệm đối với giá trị b (tung độ góc): ttn= 1,3423

tlt>ttn=> Giá trị b = 43,78 (tung độ góc) không có ý nghĩa. => Thiết lập phương trình đường thẳng ở đường thẳng y = ax







Đường chuẩn spectinomycin trong chuẩn đơn

y = 111,4x - 4,52

R 2

= 0,9885

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

Nồng độ mg/ml


Thực hiện các các phương pháp thống kê trong trong Microsoft Excel 2003: Intercept X Variable 1

Coefficients -4.52 111.4

Standard Error 7.00491256 6.935896962

t Stat -0.64526144 16.06136893

P-value 0.56470937 0.000524923

Lower 95% -26.8127581 89.32688034

Upper 95% 17.7727581 133.4731197

Lower 95.0% -26.8127581 89.32688034

Upper 95.0% 17.7727581 133.4731197



Phân phối Student thực nghiệm đối với giá trị b (tung độ góc):ttn= -0,6453

tlt>ttn=> Giá trị b = -4,52 (tung độ góc) không có ý nghĩa. => Thiết lập phương trình đường thẳng ở đường thẳng y = ax







Phụ lục 6 Các thông số của thống kê mô tả trong khảo sát độ lặp lại bằngexcel.

spectinomycin lincomycin

Mean 100.9 Mean 97.68333333Standard Error 0.254296415 Standard Error 0.404488703

Median 100.9 Median 97.7

Mode 100.9 Mode

Standard Deviation 0.62289646 Standard Deviation 0.99079093

Sample Variance 0.388 Sample Variance 0.981666667

Kurtosis 0.089541928 Kurtosis -2.000025366

Skewness 5.14422E-14 Skewness -0.068954189

Range 1.8 Range 2.5

Minimum 100 Minimum 96.4

Maximum 101.8 Maximum 98.9

Sum 605.4 Sum 586.1

Count 6 Count 6







Phụ lục 7: Các peak sắc ký điển hình:

Chất chuẩn lincomycin

Chất chuẩn spectinomycin







Chuẩn spectinomycin







Chất chuẩn hỗn hợp lincomycin và spectinomcyin







Mẫu spectinomycin 5%






Mẫu speclin D


Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Lincomycin và Spectinomycin trong dược...

Documents

Transcript of Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Lincomycin và Spectinomycin trong dược...