Tests in vitro pour évaluer la sensibilité de P.falciparum aux drogues
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Transcript of Tests in vitro pour évaluer la sensibilité de P.falciparum aux drogues
Tests Tests in vitroin vitro pour pour éévaluer la sensibilitvaluer la sensibilitéé
de de P. falciparumP. falciparum aux droguesaux drogues
Marie Ange RasonMarie Ange Rason
Atelier Paludisme Atelier Paludisme –– 6eme 6eme ééditiondition10 Mars au 18 Avril 200810 Mars au 18 Avril 2008
Ministère de la Santé, du Planning
Familial et de la Protection Sociale
Madagascar
…, il est impératif de surveiller la
sensibilité/résistance de Plasmodium sp aux
antipaludiques, notamment dans les pays
d’endémie.
Test Test in vivoin vivo(traitement et suivi)(traitement et suivi)
Echantillon de sang Tests in vitro
Evaluation de la sensibilitEvaluation de la sensibilitéé de de P. falciparumP. falciparum aux antipaludiquesaux antipaludiques
Test de Test de chimiosensibilitchimiosensibilitéé
GGéénotypagenotypage(marqueurs de (marqueurs de rréésistance)sistance)
4
Test de chimiosensibilitTest de chimiosensibilitéé in vitroin vitro
Mise en culture Mise en culture des parasites des parasites
viablesviables
MicroscopiqueMicroscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 OMS, CTD/MAL/97.20 RevRev. 2 2001. 2 2001
ColorimColoriméétrique (trique (pLDHpLDH, HRPII), HRPII)Moreno et Moreno et alal. . MedMed Trop 2001; 61:545Trop 2001; 61:545--5757NoedlNoedl et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2002; 46:16582002; 46:1658--6464NoedlNoedl et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2005; 49:35752005; 49:3575--35773577
Isotopique (Isotopique (hypoxanthinehypoxanthine trititritiééee))Desjardins, Clin Desjardins, Clin PharmacolPharmacol TherTher 1979; 26:3271979; 26:327--2929Le Bras, Le Bras, AmAm J Trop J Trop MedMed HygHyg 1983; 32: 4471983; 32: 447--5151
CytomCytoméétrietrie en fluxen fluxPattanapanyasatPattanapanyasat et et alal.. CytometryCytometry 1997; 27: 841997; 27: 84--9191
MicrofluorimetriqueMicrofluorimetrique ((PicoGreenPicoGreen, , SybergreenSybergreen))Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24
Smilkstein et al. AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2004; 48:18032004; 48:1803--18061806
BennetBennet et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2004; 48: 18072004; 48: 1807--18101810
M.A. M.A. RasonRason et et alal. . TransTrans R Soc Trop R Soc Trop MedMed Hyg.Hyg. 2008; 102, 3462008; 102, 346--351351
5
Tests de chimiosensibilitTests de chimiosensibilitéé in vitroin vitro
MicroscopiqueMicroscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 OMS, CTD/MAL/97.20 RevRev. 2 2001. 2 2001
ColorimColoriméétrique (pLDH, HRPII)trique (pLDH, HRPII)Moreno et Moreno et alal. . MedMed Trop 2001; 61:545Trop 2001; 61:545--5757NoedlNoedl et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2002; 46:16582002; 46:1658--
6464
Isotopique (hypoxanthine Isotopique (hypoxanthine trititritiéée)e)
Desjardins, Clin Desjardins, Clin PharmacolPharmacol TherTher 1979; 26:3271979; 26:327--2929Le Bras, Le Bras, AmAm J Trop J Trop MedMed HygHyg 1983; 32: 4471983; 32: 447--5151CytomCytoméétrietrie en fluxen fluxPattanapanyasatPattanapanyasat et et alal.. CytometryCytometry 1997; 27: 841997; 27: 84--9191
MicrofluorimetriqueMicrofluorimetrique ((PicoGreenPicoGreen, , SybergreenSybergreen))Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24
Contraintes logistique et technique (communes)Contraintes logistique et technique (communes)
•• Clone de parasitesClone de parasites
•• ÉÉquipements de laboratoirequipements de laboratoire
•• Personnel compPersonnel compéétanttant
•• Bonnes pratiques de laboratoireBonnes pratiques de laboratoire
•• Souches de rSouches de rééfféérence de rence de P. falciparum P. falciparum ((3D7, FCM29, 3D7, FCM29, D6 D6 ……))
Questionnements : Questionnements : -- laboratoires rlaboratoires réégionaux en Afrique ?gionaux en Afrique ?-- collaborations collaborations sudsud--nordnord ??
ProcProcéédure:dure:
Randrianarivelojosia et Randrianarivelojosia et alal, 2002, 2002Le Bras & Le Bras & DeloronDeloron, 1983, 1983
Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum (synchronis(synchroniséé))
PrPrééparation de la suspension parasitaire dans du RPSH paration de la suspension parasitaire dans du RPSH 10%(20010%(200µµl par puits sur plaque de 96 puits; 0,5% de l par puits sur plaque de 96 puits; 0,5% de parasitparasitéémie; 1,5% dmie; 1,5% d’’hhéématocrite; hypoxanthine tritimatocrite; hypoxanthine tritiéée 0,4 e 0,4 µµCiCi/puits)/puits)Incubation 42h Incubation 42h àà 3737°°C (atmosphC (atmosphèère micro are micro aéérophile et rophile et humide)humide)EvaluationEvaluation de la radioactivitde la radioactivitéé incorporincorporéée et calcul dese et calcul desCI50CI50
Conduite du test isotopique Conduite du test isotopique in vitroin vitro
Plaques de culturePlaques de culture
àà 96 puits, 96 puits, àà fond plat, fond plat,
prpréé mméédicamentdicamentéées es
Exemple de drogues :Exemple de drogues :
ChloroquineChloroquineMonodesethylMonodesethyl--AQAQQuinineQuinineDihydroDihydro--artartéémisininemisinine
Conduite du test isotopique Conduite du test isotopique in vitroin vitro
Mise en cultureMise en culture
Incubation pendant 42h Incubation pendant 42h àà3737°°C; atmosphC; atmosphèère humide; re humide; en en microamicroaéérophilierophilie
CongCongéélationlation
DDéécongcongéélation des plaques lation des plaques de culturede culture
Conduite du test isotopique Conduite du test isotopique in vitroin vitro
Salle de collecte, collecteur et filtre en fibre de verreSalle de collecte, collecteur et filtre en fibre de verre
SchSchéématisation de lmatisation de l’’incorporation de lincorporation de l ’’hypoxanthinehypoxanthinetrititritiéée dans le dans l’’ADN du parasiteADN du parasite
+
Hypoxanthine-3H
ADN plasmodial ADN plasmodial (d(déébut du test)but du test) ADN marqué
au tritium
Compteur Compteur àà scintillation liquide pilotscintillation liquide pilotéé par ordinateurpar ordinateur
. Comptage de la radioactivit. Comptage de la radioactivitéé((cpmcpm) ) ààll ’’aide du aide du MicrobetaMicrobeta
.. Calcul des Calcul des CI50 CI50 (concentration (concentration inhibitrice 50%)inhibitrice 50%)
. . SeuilSeuil resistanceresistance ::chloroquinechloroquine (100 (100 nMnM), ),
monodesethylamodiaquinemonodesethylamodiaquine (60 (60 nMnM) , ) ,
quinine (800 quinine (800 nMnM).).
RRéésultats du comptage de radioactivitsultats du comptage de radioactivitéé pour pour
un test de chimiosensibilitun test de chimiosensibilitéé in vitroin vitro de de P. falciparumP. falciparum
vert = Témoin négatif (puits sans médicaments)
Faibleconcentration
Forteconcentration
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 13819 13626 14042 13988 14141 14103 12061 12252 14425 11577 11489 14374
B 13276 12774 14926 15296 15550 14952 8243 7737 7353 8487 6670 8765
C 6373 5763 5547 12805 13048 12214 4816 5046 4912 1125 845 1106
D 859 1015 1112 880 914 1062 2916 2381 2746 700 479 672
E 549 593 549 417 392 444 1104 1250 1333 529 555 520
F 553 478 477 496 390 402 496 592 643 583 457 1015
G 567 485 13177 820 638 13372 746 766 12513 12014 466 1077
H 521 587 11900 783 635 11898 782 1210 11944 11444 700 495
CQ MAQ Q DHA
TDD01 TDD01 TDD01 TDD01
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Test de chimiosensibilitTest de chimiosensibilitéé in vitroin vitro
Mise en culture Mise en culture des parasites des parasites
viablesviables
MicroscopiqueMicroscopiqueOMS, CTD/MAL/97.20 OMS, CTD/MAL/97.20 RevRev. 2 2001. 2 2001
ColorimColoriméétrique (trique (pLDHpLDH, HRPII), HRPII)Moreno et Moreno et alal. . MedMed Trop 2001; 61:545Trop 2001; 61:545--5757NoedlNoedl et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2002; 46:16582002; 46:1658--6464NoedlNoedl et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2005; 49:35752005; 49:3575--35773577
Isotopique (Isotopique (hypoxanthinehypoxanthine trititritiééee))Desjardins, Clin Desjardins, Clin PharmacolPharmacol TherTher 1979; 26:3271979; 26:327--2929Le Bras, Le Bras, AmAm J Trop J Trop MedMed HygHyg 1983; 32: 4471983; 32: 447--5151
CytomCytoméétrietrie en fluxen fluxPattanapanyasatPattanapanyasat et et alal.. CytometryCytometry 1997; 27: 841997; 27: 84--9191
MicrofluorimetriqueMicrofluorimetrique ((PicoGreenPicoGreen,, SybergreenSybergreen))Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24
Smilkstein et al. AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2004; 48:18032004; 48:1803--18061806
BennetBennet et et alal. . AntimicrobAntimicrob Agents Agents ChemotherChemother 2004; 48: 18072004; 48: 1807--18101810
Rason et Rason et alal. . TransTrans R Soc Trop R Soc Trop MedMed Hyg.Hyg. 2008; 102, 3462008; 102, 346--351351
SYBR Green I is a DNA- intercaling dye that prefers G and C base pairs.
formule chimique: C32H37N4S - cyanines asymétriques (fluorophores)
Excitation is at 488nm and emission at 510 to 550
Mise en culture des parasites. Plaque prémédicamentée. Lavage 3x avec RPMI-1640 . RPSH 10% sans hypoxanthine tritiée. Parasitémie à 0.5%, hématocrite à 1,5% . Incubation 72 h à 37°C, atmosphère microaérophile et humide. Congélation plaque
lecture:. Décongeler les plaques pendant 2 H au moins à RT . Transférer 100 µL de la suspension parasitaire dans une plaque vierge. Préparer mix: 0,2µL/ml de Sybr Green avec tampon lyse MSF(Malaria Sybr Green fluorescence). Ajouter 100µL/puits de ce mix dans la suspension parasitaire. Incuber 30 mn à RT, à l’abri de la lumière. Lecture 485/535 nm au fluorimètre
MMééthode avec thode avec SybrSybr Green (Green (fluorophorefluorophore))____________________________________________________________________________________________
Méthode isotopique Méthode avec Sybr Green
Plaque prémédicamentée Plaque prémédicamentée
Suspension parasitaire + hypox-3H
Incubation culture (72H)Incubation culture (42H)
Suspension parasitaire
Transfert sur filtre
Séchage filtre
Rajout liquide scintillant
scellé
Compteur à scintillation liquide
Transfert 100µL+ rajout Tp Lyse MSF
avec Sybr Green
Incubation 30mn
Lecture / Fluorimètre
Table 1: Comparison of the isotopic and SYBR Green I measurements for clinical isolates of P. falciparum tested against four drugs
______________________________________________________________________________________________________________
Drug tested No. isolates Geometric mean (nM) [95%CI] P-valueaαcb
tested ___________________________________
Isotopic assay [3H]- SYBR Green I
hypoxanthine
_________________________________________________________________________________________________
50% inhibitory concentration
Chloroquine 138 20.2 [16.5-27.7] 22.3 [18.7-26.7] 0.46 0.93
Monodesethylamodiaquine 138 7.6 [6.6-8.8] 7.2 [6.3-8.3] 0.61 0.92
Quinine 135 48.7 [40.6-58.4] 52.3 [44.7-61.3] 0.56 0.90
Dihydroartemisinine 130 0.80[0.65-0.97] 0.80[0.65-0.96] 0.99 0.81
90% inhibitory concentration
Chloroquine 138 116.6[98.0-138.8] 119.4[102.3-139.5] 0.84 0.68
Monodesethylamodiaquine 138 32.9[28.8-37.7] 35.5[30.8-40.8] 0.45 0.73
Quinine 135 342.1[296.7-394.4] 335.8[287.7-391.9] 0.86 0.72
Dihydroartemisinine 130 4.4[3.8-5.1] 4.6[3.95-5.46] 0.66 0.58
____________________________________________________________________________________________________________
a Significances by Mann-Whitney U tests are given for the difference in inhibitory concentrations measured with the two assays.b Concordance coefficient correlation.
Correlation between individual IC50s (in nM) for chloroquinedetermined by the SYBR Green I and the isostopic assays(n=541; r = 0.93, CI95% 0.92-0.94) P< 0.0001
0,01 0,1 1 10 100 1000
1000
100
10
1
0,1
0,01
Log IC50 SYBR Green I
Lo
g I
C5
0 i
soto
pic
Avantages et Inconvénients_________________________________________________
Méthode isotopique Méthode avec Sybr Green
. Radioélément . Fluorophore
. Référence . Simple
. Radioprotection . Rapide
. Personne compétant . très sensible
. Compteur à scintillation . Fluorimètre
. Incubation 42H . Incubation 72H
. Résultats en cpm(coups/minutes) . RFU(Relative Fluorescence Units)
. 50US$par plaque 96 puits . 0,88US$ par plaque 96puits
Fluorescence-based assays: conclusions
Of published methods, SYBR Green I/MSF assay is preferable on the basis of signal, flexibility and cost
Optimization likely to be ongoing and sometimes site-specific
Unequivocal utility as a drug testing method– Ideal for high-throughput screening– Appropriate for side-by-side comparisons– Feasible for field use