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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR
ÁREA DE CONOCIMIENTOS DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA
TESIS
EXTRACCIÓN, CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD ANTICOAGULANTE
DE LOS POLISACÁRIDOS SULFATADOS DEL ALGA CAFÉ
HYDROCLATHRUS CLATHRATUS (C. AGARDH) M.A. HOWE
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA MARINA
PRESENTA
ILSE SÁNCHEZ LOZANO
DIRECTOR: DR. IVÁN MURILLO ÁLVAREZ
LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, 2013.
A mis padres y hermano
Elementos de mi formación,
fuente de inspiración
y mi apoyo desde siempre.
Los amo.
AGRADECIMIENTOS
A mi director de tesis, el Dr. Jesús Iván Murillo Álvarez por aceptarme como su
estudiante y guiarme en el desarrollo de este trabajo, y al Dr. Mauricio Muñoz
Ochoa, por dar a los tesistas siempre su apoyo, tiempo y ayuda. Por la
convivencia y sus enseñanzas les agradezco enormemente
A mis revisores, el Dr. Rafael Riosmena Rodríguez, el Dr. Juan Manuel López
Vivas y la M. en C. Erika Torres Ochoa, por sus buenos concejos y tiempo.
A mis padres, por todo el apoyo incondicional, el afecto, los regaños, ser todo un
ejemplo a seguir y haberme impulsado a crecer, a dar siempre más de mí y dejar
de lado las excusas. Por su muestra de fortaleza y enseñanzas, los amo. A mi
hermano, un gran hombre del que siempre estaré orgullosa y me ha motivado a
dar más. Gracias por ser la principal influencia de mi persona y estar a mi lado.
¡Te adoro, tú!
A mi familia, en especial a mis abuelitos, por el cariño. A mis tíos Angélica, Alfredo
y mi primas, Monse, Samy y Mely, por todo el apoyo desde el inicio de esta etapa
en mi formación. A la señora Rosa Amelia y su familia, por siempre estar al
pendiente de mí.
A mis maestros, de quienes aprendí y disfruté durante toda la carrera. A mis
amigos, Laura, Abraham, Pablo, Pao Soto y Fernando R. B. a quienes considero
ya como hermanos, por apoyarnos, reír, sufrir y aprender juntos, estoy orgullosa
de ustedes. Gracias por el cariño, los regaños, el afecto, aguantarme y dejarme
acércame y aprender de ustedes.
A mis compañeros del laboratorio de productos naturales de CICIMAR, Bernardo
(por ser tan ¡Super!), Valeria (mi biologuesco amor), Araceli (el oráculo de la
sabiduría del mundo mundial), Fany, Miguel, Ana y Dania, por su amistad, apoyo y
compañía en esta travesía y las siguientes.
A mis amigos Galle (Galletita) y Mario, Ale Mendicuti (Alce), Ale Hirales, Isis (Chibi
Sheep), Hugo y Leo, por sacarme un poco de la rutina con risas, bromas, LoL y
algo de bulling. Y en especial a Alejandro Plata (Bamboo), por todo el amor, afecto
y apoyo incondicional, muchas gracias por estar a mi lado y hacerme tan feliz.
A Naica y Julieta, por ser mi compañía incondicional 24/7, las amo.
Al mar, el cielo y la tierra, que con su enorme belleza despiertan en mi la
curiosidad, me impulsan a explorar y adentrarme más en el mundo natural. Me
siento afortunada de poderlos contemplar.
Y finalmente, gracias a la vida, que me ha enseñado que para conseguir algo se
debe dar algo del mismo valor a cambio, perseverancia y esfuerzo.
ÍNDICE
Índice de tablas……………………………………………………………...
Índice de figuras…………………………………………………………….
Resumen……………………………………………………………………..
Abstract……………………………………………………………………....
1. Introducción…………………………………………………….…....
2. Antecedentes………………………………………………………..
2.1 Generalidades de los fucoidanos…………………….…
2.2 Funcionamiento y estructura de la heparina…………..
2.3 Mecanismos de coagulación sanguínea…………….…
3. Descripción de Hidroclatrhus clathratus……………………….…
4. Justificación……………………………………………………….....
5. Hipótesis……………………………………………………………..
6. Objetivos……………………………………………………………..
7. Materiales y métodos…………………………………………….…
7.1 Recolección…………...………………………………….…
7.2 Obtención de extractos………………………………….…
7.3 Determinación de azúcares totales………………………
7.4 Fraccionamiento……………………………………………
7.5 Análisis de actividad anticoagulante……………………..
7.6 Determinación de ácidos urónicos……………………….
i ii iii iv 1 4 4 6 7 11 13 15 15 16 16 18 20 22 24 25
7.7 Determinación de fucosa………………………………….
7.8 Espectofotometría de infrarrojo…………………………..
8. Resultados…………………………………………………………...
9. Discusión…………………………………………………………….
10. Conclusión…………………………………………………………..
11. Referencias………………………………………………………....
25 26 26 34 37 37
i
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I. Forma en que fueron unidos los eluatos obtenidos del
extracto MM0417 CArp, dando lugar a seis fracciones….....
5
Tabla II. Porcentaje relativo del contenido de azúcares totales en los
extractos de H. clathratus obtenidos con agua fría y
caliente……………………………………………………………
27
Tabla III. Muestra los tiempos y coeficientes de coagulación, además
del rendimiento para los extractos MM0417F,
MM0417CArp y MM0417C obtenidos de H. clathratus……..
28
Tabla IV. Muestra el tiempo de coagulación en los ensayos TP y
TTPa de las seis fracciones del extracto MM0417CArp……
30
Tabla V. Muestra el rendimiento y el coeficiente de coagulación en
las pruebas TP y TTPa de las fracciones obtenidas a partir
del extracto MM0417CArp……………………………………...
30
ii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Representación estructural del fucoidano obtenido del
extracto del alga café L. saccharina………………………..
5
Figura 2. Representación estructural del pentasacárido con
potencial anticoagulante de la heparina (Flórez, 1997)….
7
Figura 3. Representación de la cascada de coagulación sanguínea
por las vías intrínseca y extrínseca (Modificado de:
Flórez, 1997)…………………………………………………..
9
Figura 4. Muestra del alga estudiada Hydroclathrus clathratus
(Guiry y Guiry, 2013)………………………………………….
13
Figura 5. Ubicación geográfica del área de recolección,
Balandra………………………………………………………..
17
Figura 6. Diagrama de flujo de la obtención de los tres extractos
principales de Hydroclathrus clathratus…………………….
21
Figura 7. Diagrama del fraccionamiento del extracto MM0717
CArp…………………………………………………………….
22
Figura 8. Tiempo de la formación del coágulo (s) en los ensayos
TP y TTPa para los extractos MM0417F, MM0417CArp y
MM0417C obtenidos de H. clathratus…………………….
27
Figura 9. Tiempo de la formación del coágulo (s) en los ensayos
TP y TTPa para las fracciones obtenidas a partir del
extracto MM0417CArp………………………………………..
29
Figura 10. Porcentaje de fucosa, azúcares totales y ácidos urónicos
contenidos en las fracciones de MM0417CArp……………
31
Figura 11. Espectro de infrarrojo de la fracción MM0417CArp
CC1F3. El pico ubicada en la banda 833.73 demuestra
un grado de sulfatación característico de los
polisacáridos sulfatados……………………………………...
33
iii
RESUMEN
Los polisacáridos sulfatados contenidos en algas cafés, también llamados
fucoidanos, son metabolitos secundarios que han demostrado una gran cantidad
de actividades biológicas en los campos de la farmacéutica. Con el propósito de
conocer la actividad anticoagulante de Hydroclathrus clathratus (C. Agardh) M.A.
Howe, se aislaron los polisacáridos sulfatados de esta alga recolectada en
Balandra, Baja California Sur. El material algal fresco se lavó con agua corriente y
se secó al sol. Se pesaron 100 g de H. clathratus y fueron secuencialmente
extraídos, utilizando agua a los 25 y 80°C. El extracto con agua caliente fue
precipitado con una adición d cetilpiridium al 10%. El precipitado se fraccionó por
cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa. La columna fue eluída con
NaCl (0.5M, 1.0M, and 2.0M). Finalmente se obtuvieron seis fracciones, las cuales
fueron se sometieron a pruebas anticoagulantes, usando los ensayos de tiempo
de protombina y protombina parcial activada. La fracción tres, eluida con NaCl a
1.0M fue la más activa, incrementando el tiempo de la prueba TP y TTPa >300 s.
El espectro de infrarrojo mostró absorción en las bandas características de un
fucoidano (3450, 1730, 1640, 1250, 1130, 1040, 840, 580 cm-1). La banda a los
1730 cm-1 es característica de los grupos acetil, y la banda a los 840 cm-1,
sugieren una substitución de residuo de azúcar, posiblemente, C-4-0-SO3 o C-4-
O-COCH3.
iv
ABSTRACT
In search for bioactive polysaccharides from seaweeds, acetyl fucoidan was
isolated from Hydroclathrus clathratus (C. Agardh) M.A. Howe. Specimens were
collected in Balandra, Baja California Sur. Fresh material was washed with tap
water, sun dried and milled. One hundred grams of dried H. clathratus were
sequentially extracted ith distilled water at 25 and 80°C. The hot water extract was
precipitated by addition of 10% cetylpyrimidinium chloride to yield 3.673 f of
brownish power. The precipitated was fractionated bye ion exchange
chromatography over DEAE-cellulose. The column was eluted with aqueous NaCl
(0.5M, 1.0M, and 2.0M). At the end, six fractions were evaluated as anticoagulant
agents using the prothrombin time and activated partial thromboplastin time.
Fraction 3 eluted with NaCl 1.0M was the most active increasing the normal TP
and TTPa values at >300 s. The infrared spectrum of fraction 3 showed
characteristic absorption bands of fucoidanos (3446, 1730, 1639, 1230, 1030, 833,
580 cm-1). Band at 1730 cm-1 was assigned to an acetyl group, while the band at
840 cm-1, suggest the substitution patter of the sugar residue to be mainly, C-4-0-
SO3 or C-4-O-COCH3.
1
1. INTRODUCCIÓN
Los polisacáridos sulfatados forman una clase de macromoléculas biológicas con
estructuras diversas que representan variadas propiedades fisicoquímicas. Éstos
poseen estructuras diversas que representan variadas propiedades fisicoquímicas
que varían de acuerdo al largo de la cadena polisacárida, el peso de la molécula y
los parámetros estructurales (Talarico, 2008; Bo et al., 2008; Marcel et al., 2011).
Las capacidades metabólicas y fisiológicas de los organismos marinos que
les permiten sobrevivir en un hábitat complejo les brindan un gran potencial para
producir metabolitos únicos que no se encuentran en ambientes terrestres. Los
organismos marinos, en particular los invertebrados sésiles han sido reconocidos
como una fuente potencial para el desarrollo de compuestos farmacéuticos (Moo
et al, 2009).
El término fucoidano se refiere a los polisacáridos sulfatados producidos
como metabolitos secundarios de todas las algas, se encuentran principalmente
constituidos por L-fucosa y grupos éster sulfatados. Estos polisacáridos se
encuentran en la pared celular, además de espacios intercelulares (Marcel et al,
2011), mientras que a los polisacáridos sulfatados que provienen de animales,
principalmente invertebrados marinos, se les llama fucanos (Holtkamp et al, 2009).
Los fucoidanos se están presentes en muchos órdenes de algas,
principalmente en las alga cafés (Phaeophyceae), como en el orden de las
2
Fucales y Laminariales, además de Chordariales, Dictyotales, Dictyosiphonales,
Ectocarpales y Scytosiphonales (Berteau y Mulloy, 2003).
Fisiológicamente, algunos estudios han demostrado la existencia de una
correlación entre el contenido de fucoidanos y la profundidad a la que se
encuentran las algas, siendo que mientras más cercanas estén a la superficie,
éstas contienen una mayor cantidad de polisacáridos sulfatados. Además, los
fucoidanos juegan un rol en la organización de la pared celular, y pueden estar
relacionados con la vinculación entre alginatos y celulosa, además de encontrarse
relacionados con la morfogénesis del embrión de las algas (Berteau y Mulloy,
2003).
El potencial bioactivo y las propiedades de los fucoidanos depende de la
especie del alga, la composición de la molécula, la densidad, distribución, las
uniones de los sulfatos y la purificación del compuesto (Marcel et al., 2011). La
composición de los fucoidanos cambia además, el proceso de extracción del
compuesto, la temporada en que el alga es recolectada y las condiciones
climáticas (Berteau y Mulloy, 2003).
El método de extracción de los polisacáridos resulta ser crucial, pues de él
depende la actividad biológica específica del extracto (Marcel et al., 2011). Las
principales técnicas de extracción suelen ser mediante etanol, uso de agua
caliente y fría, digestión enzimática, fermentación, digestión proteolítica, hidrólisis
ácida, o la combinación de algunos de estos tratamientos. Estos polisacáridos se
3
encuentran mayormente constituidos por L-fucosa, y pueden llegar a representar
el 40% del peso seco de las paredes celulares (Jeon et al., 2008; Berteau y
Mulloy, 2003).
El interés más reciente en polisacáridos sulfatados se centra en el beneficio
del potencial biológico de los fucoidanos en humanos como antitumorales,
antinflamatorios, antivirales, antitrombóticos, anticoagulantes y antioxidantes
(Marcel et al., 2011).
Los medicamentos con efectos antitrombóticos han sido bastante utilizados
en las terapias cardiovasculares, siendo la heparina el anticoagulante más
comercial. Esta biomolécula contiene un glucosoaminoglicano altamente sulfatado,
es obtenida mediante procesos químicos a partir de protoglicanos presentes en la
mucosa intestinal de cerdos y pulmones de animales bovinos, encontrándose en
baja concentración. El potencial anticoagulante de la heparina es logrado
mayormente por la potencialización de la antitrombina y el cofactor II de la
heparina (Pereira et al., 2002; Athukorala et al., 2006).
Las actividades anticoagulantes y antitrombóticas de las fracciones de
fucoidanos aumentan con el incremento del peso molecular y el contenido en
sulfatos que estas posean. Además, las fracciones en cuales el patrón nativo de
sulfatación se encuentra intacto resultan tener una mayor actividad que aquellas
que poseen el mismo peso molecular pero no el mismo grado de sulfatación
(Berteau y Mulloy, 2003).
4
En el siguiente trabajo, se realizó una extracción de polisacáridos sulfatados
del alga café Hydroclathrus clathratus (C. Agardh) M.A. Howe, a temperaturas de
25 y 80°C. Se realizarán las pruebas de contenidos de azúcares totales además
de ensayos TP y TTPa anticoagulantes con la finalidad de identificar el mejor
extracto para su fraccionamiento y estudio.
2. ANTECEDENTES
2.1 Generalidades de los fucoidanos
En el este de Asia, las algas marinas son usadas como una fuente de recursos
minerales, vitamínicos y fibras dietéticas. Por lo cual son altamente recetadas
como un suplemento alimenticio para el mantenimiento de la salud (Preeprame et
al., 2001).
El primer aislamiento de un polisacárido sulfatado a partir de un alga café
(Fucus vesiculosus) se realizó en el año de 1913, por Kylin. Desde ese momento
se han extraído una gran cantidad de fucoidanos con grandes variantes en su
composición química. Además de fucosa y sulfatos, los fucoidanos también están
constituidos de otros monosacáridos, como manosa, galactosa, glucosa y xilosa,
ácidos urónicos, grupos acetilo y algunas proteínas, las cuales le proporcionan
una estructura distinta a los fucoidanos de cada especie de alga (Bo et al., 2008).
Los polisacáridos sulfatados muestran una gran diversidad estructural entre
las diferentes especies. En la figura 1 se muestra esquemáticamente un fucoidano
5
obtenido del alga Laminaria saccharina. Esta estructura se encuentra
principalmente constituido por (13) α-L-fucopiranosa, con sulfatación en el C-4 y
en ocasiones en C-2 (Tutor et al, 2011).
Figura 1. Representación estructural del fucoidano obtenido del extracto del alga café L. saccharina.
En 1913, se reportó el primer aislamiento de un polisacárido sulfatado
proveniente de un alga café, posteriormente se reveló que éstas poseen una
mayor actividad anticoagulante que las algas rojas o verdes (Berteau y Mulloy,
2003; Athukorala et al., 2006).
Muchos estudios realizados han demostrado que la actividad anticoagulante
puede estar relacionada con el contenido de sulfatos y la posición, el peso
molecular y la composición del azúcar. Los grupos que poseen un alto contenido
de sulfatos presentan un mayor efecto anticoagulante, sin embargo se han
6
realizado estudios que demuestran que el peso molecular no influye tanto en la
actividad como el grado de sulfatación (Bo et al., 2008).
2.2 Funcionamiento y estuctura de la heparina
Los proteoglucanos se encuentran conformados por moléculas glucoproteicas
encontradas en el tejido conjuntivo. Estas moléculas están formadas por unidades
repetitivas de un disacárido derivado de aminoazúcar, además de contener al
menos un grupo carboxilo o sulfato cargado negativamente. Los principales
proteoglucanos son la heparina, el ácido urónico, el condrotín sulfato, ácido
hialurónico, el queratansulfato y heparán sulfato.
Estructuralmente, la heparina está constituida por una secuencia alternada
entre un ácido urónico y un α-D-glucosamina, unidos por un enlace glucosídico 1
4 (Figura 2). Algunos de los enlaces de la glucosamina se encuentran N-
acetilados, mientras que las demás están sulfatados. Además, la molécula
contiene radicales sulfato en parte de los ácidos idurónicos (C2) y en algunas
glucosaminas (C6). Las glucosaminas sulfatadas presentan además grupos
sulfato en los carbonos 3 y 6, dando a la molécula un carácter ácido (Flórez,
1997).
7
Figura 2. Representación estructural del pentasacárido con potencial anticoagulante de la heparina (Flórez, 1997).
La actividad anticoagulante de la heparina reside en una secuencia de
pentasacáridos encontrada irregularmente distribuida a lo largo de la cadena. Su
función anticoagulante se debe a que esta molécula actúa sobre la antitrombina III,
uniéndose y cambiando un cambio en la conformación estructural, acelerando la
velocidad de la antitrombina III para inactivar principalmente la trombina y los
factores Xa y IXa (Flórez, 1997).
2.3 Mecanismos de coagulación sanguínea
Al dañarse un vaso sanguíneo se inicia un proceso de reducción de pérdida de
sangre llamado hemostasia, el cual ocurre de forma secuencial con la
participación de factores vasculares, plaquetarios y plasmáticos (Figura 3) (Garrido
et al, 2006). A grandes rasgos, el proceso comienza con la activación de las
plaquetas o trombocitos, los cuales se adhieren a la zona lesionada de la pared
vascular, uniéndose al tejido conectivo endotelial debido a la secreción del factor
de von Willebrand, y comienzan la formación de un tapón compuesto por
8
trombocitos, deteniendo así el sangrado. Posteriormente, la enzima trombina se
encarga de formar un polímero de fibrina, el cual se incorpora al tapón, formando
un coágulo (Koolman y Röhm, 2004).
La coagulación sanguínea se lleva a cabo mediante varias reacciones,
donde la más importante es la conversión enzimática catalizada por una proteína
plasmática, la trombina del fibrógeno soluble (factor I), en un polímero de fibrina el
cual se depositará en el tapón primario. Por otro lado, la trombina (factor IIa) es
una serina proteinasa que hidroliza la molécula de fibrógeno y libera péptidos
pequeños, dejando accesibles algunos sitios de unión para la molécula de fibrina
dejando que se agreguen espontáneamente entre sí. Al final, se crea la formación
de una red covalente por acción de la tranglutaminasa (factor XIII) estabilizando de
este modo el tapón (Koolman y Röhm, 2004).
9
Figura 3. Representación de la cascada de coagulación sanguínea por las vías intrínseca y extrínseca (Modificado de: Flórez, 1997).
Generalmente, la trombina se encuentra presente en la sangre como una
proenzima inactiva. La protombina por su parte, pude ser activada mediante dos
mecanismos desencadenados por daños de la pared vascular. En estas dos vías
se forman cascadas de reacciones enzimáticas en donde las proenzimas inactivas
son transformadas proteolíticamente en proteinasas activas, y estas, a su vez,
activan a la proenzima siguiente. Algunas de las reacciones requieren además, de
10
factores proteicos adicionales, fosfolípidos aniónicos o iones de Ca2+ (Koolman y
Röhm, 2004).
La vía exógena, también llamada extravascular, se lleva a cabo cuando la
tromboplastina tisular (factor III), una proteína de membrana presente en las capas
más profundas de la pared vascular, activa al factor VII de la coagulación. Su
forma activa (VIIa) favorece autocatalíticamente su formación y libera a los
factores activos IXa y Xa. El factor IXa produce una mayor cantidad de factor Xa
con ayuda de fosfolípidos aniónicos y Ca2+. Éste último factor, apoyado por el
factor Va, lleva a la liberación final de la trombina activa (Koolman y Röhm, 2004).
Por otro lado, la vía endógena o intravascular se desencadena por los
factores por la liberación del factor tisular o factor III, el cual es liberado por los
tejidos como consecuencia de un traumatismo (Garrido et al, 2006). Además,
intervienen los factores XIIa, IXa, XIa y Xa (Koolman y Röhm, 2004.).
En ambas vías es necesaria la presencia de trombocitos activados, puesto
que en la superficie de éstos se llevan a cabo varias reacciones. En el complejo
protombinasa, los factores Xa y II, ayudados por iones de Ca2+ y fosfolípidos
aniónicos, se unen a la membrana de los trombocitos. Para que esta unión se
lleve a cabo, es necesario que los factores II y X contengan el aminoácido no
proteico –carboxil-glutamato (Gla), cuyos residuos se forman debido a la
carboxilación prostraduccional de los factores en el hígado. Estos residuos se
encuentran localizados en dominios especiales, los cuales generan el contacto
11
con los iones de Ca2+, además los factores VII y IX se encuentran unidos a la
membrana fosfolipídica por los residuos de Gla (Koolman y Röhm, 2004).
Además de transformar el fibrinógeno en fibrina, la trombina activa lleva a
su propia formación de manera indirecta, debido a que cataliza la formación de los
factores V y VII. La trombina también cataliza la activación del factor XIII,
desencadenando de esta manera la formación de la red de fibrina (Koolman y
Röhm, 2004).
3. DESCRIPCIÓN DEL ALGA
Hydroclathrus clathratus se caracteriza principalmente por su forma de red.
Inicialmente tiene forma globosa, y posteriormente se conforma por un irregular y
complejo arreglo de agujeros de distintos tamaños, a menudo cortados en
láminas; algo gruesa y resbaladiza, unida por un grupo de rizoides a lo largo de la
superficie inferior (Figura 4). Las perforaciones de la superficie son desde 1 mm de
diámetro hasta más de 3 cm. La distancia entre las perforaciones es generalmente
menor a 2 mm. El talo es menor a 200 µm en algunos casos y en otros llega a ser
mayor a 900 µm (Norris, 2010).
La médula tiene hasta más de 6 capas, con una pared delgada. Las células
medulares son ovoides o subesféricas y carecen de color, llegando a medir de 60
a 320 µm alrededor del hueco. La corteza se constituye de una a dos paredes de
12
células pigmentadas, las cuales miden entre 6 y 7.5 µm por 7 y 17 µm. La capa
superficial, en sección transversal con las papilas, tiene células convexas con un
tamaño de entre 10 y 15 µm (Norris, 2010).
Los esporangios pluriloculares son de 5 a 7 µm por 10 a 12 µm, en 2 a 3
hileras de 3 a 4 lóculos. Los soros se encuentran en un arreglo irregular,
usualmente cercanos a los mechones de pelo. Los soros crecen separados y
están dispersos, posteriormente se extienden y fusionan, cubriendo muchas veces
una gran parte de la superficie (Norris, 2010).
Habita generalmente sobre rocas en zonas de aguas poco profundas,
llegándose a encontrar hasta una profundidad de 2 m. ocasionalmente es epífita o
se encuentra enredada en otras algas (Norris, 2010; Britton y Millspaugh, 1920).
Se encuentra en climas templados, cálidos y tropicales, distribuyéndose en
países como Ecuador, Chile, Hawái, China, Japón, Vietnam, las Bermudas y
desde Florida hasta Brasil, algunas partes de Europa y África. En México se
encuentra en el Golfo de California, desde el noreste de la Isla Tiburón hasta
Bahía de Los Ángeles, de Bahía Concepción a Bahía de La Paz. En las costas del
pacífico mexicano se puede encontrar desde el sur de California hasta Laguna Ojo
de Liebre (Mendoza-González y Mateo-Cid, 1986; Pacheco-Ruíz y Zertruche-
Gonzáles, 1996).
13
Figura 4. Muestra del alga estudiada Hydroclathrus clathratus (Guiry y Guiry, 2013).
4. JUSTIFICACIÓN
Según datos publicados por la Secretaría de Salud, en México mueren alrededor
de 67,000 personas anualmente por causas relacionadas a trombosis arteriales,
coronarias y cerebrales, y se considera que hay alrededor de 15,000 muertes por
trombo embolismo venoso. Mientras que en Estados Unidos, la trombosis es
considerada como la causante más común de decesos, pues mueren alrededor de
14
dos millones de personas anualmente por trombosis arterial o venosa (Martínez y
Quintana, 2005).
La heparina es el fármaco más utilizado para el tratamiento de
enfermedades trombóticas, sin embargo su uso puede llegar a tener algunas
complicaciones. Además de que este se encuentra en bajas concentraciones, se
ha reportado incidencia en la presencia de priones debido a que la heparina es
extraída del intestino de cerdos y el pulmón de algunos bovinos. Por estas razones
se ha llevado a la búsqueda de un medicamento más seguro para la población,
que además, provea de una mayor cantidad de extracto, reduciendo los costos de
la obtención (Pereira et al., 2002). Los anticoagulantes utilizados como
medicamento traen consigo una serie de problemas asociados a su uso
prolongado, como lo es la osteoporosis, la cual se observa, generalmente después
de tres meses de uso, debido a que la heparina induce a la reabsorción ósea
acelerada (Trejo, 2004).
Las reacciones adversas asociadas a la formación de complejos inmunes
son el síndrome de trombocitopenia trombosis y trombosis cutánea. Además de
que la unión de la heparina con el factor plaquetario 4, pude llegar a la inducción
de la formación de autoanticuerpos. Los complejos inmunes son capaces de
activar a las plaquetas, provocando un estado de hipercoagulabilidad (Trejo,
2004).
15
Otro de los problemas con el uso de a heparina están involucrados con el
desarrollo de alopecia y malformaciones congénitas. Además, está la necrosis
cutánea, la cual puede ocurrir luego de 3 a 8 días de uso, se debe a que cuando el
anticoagulante se consume en altas dosis al iniciar la terapia, se actúa sobre las
proteínas anticoagulantes vitamina k-dependientes, como la proteína C, las cuales
tienen una menor vida media que los factores de coagulación. Debido a esto, se
llega a un estado de hipercoagubilidad paradójico, con trombosis de los vasos
pequeños y necrosis cutánea por isquemia (Trejo, 2004).
5. HIPÓTESIS
Los polisacáridos sulfatados extraídos del alga café Hydroclathrus clathratus
poseen la actividad anticoagulante potencial para ser utilizada como fármaco.
6. OBJETIVOS
Objetivos generales
Evaluar el potencial del alga Hydroclathrus clathratus como fuente de
polisacáridos sulfatados con actividad anticoagulante.
Objetivos particulares
16
Extracción, purificación y caracterización estructural de fracciones de
polisacáridos sulfatados del alga café Hydroclathrus clathratus.
Realizar pruebas de TP y APTT para conocer el tiempo de coagulación por
la vía externa e interna de la hemostasia.
7. MATERIAL Y MÉTODOS
7.1 Recolección
El alga H. clathratus fue recolectada en Balandra (110°18’15” N y 24°12’20” O),
Baja California Sur (Figura 5), el 12 de junio de 2004. Esta alga fue extraída en la
zona intermareal con ayuda de buceo libre y fue llevada al laboratorio de química
de algas marinas, en CICIMAR, donde se limpió con agua corriente y se liberó de
materiales externos al alga. Posterior a esto, se dejó secar al sol durante dos días.
La identificación se llevó a cabo en la Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas del Instituto Politécnico Nacional.
18
7.2 Extracción
Se pesaron 100 g de la muestra, y se les agregó 1 L de agua destilada a
una temperatura de entre 23 y 25°C. La muestra estuvo con agitación continua
durante 4 horas, y posterior a este tiempo de agitación, se filtró sobre un lienzo
limpio (Figura 6).
F. El filtrado obtenido se centrifugó a 3000 rpm (1700 xg) durante 30
minutos, manteniendo la temperatura de la centrífuga a 5°C. Posteriormente, se
descartó el sedimento y el sobrenadante recuperado se precipitó con 20 mL de
cloruro de cetil-piridium al 10% y se dejó reposar durante 6 h. El precipitado se
recuperó mediante centrifugación a 1700 xg durante 30 min. Se descartó el
sobrenadante y el pelet se resuspendió en 850 mL de cloruro de cetil-piridium al
0.05% y se dejó en reposo durante 24 h.
El precipitado se recuperó mediante centrifugación (5°C, 1700 xg), y éste se
resuspendió en 700 mL de 2M NaCl:EtOH (10:1.5), y precipitado con 2100 mL de
etanol absoluto, dejándolo reposar durante 24 h, y recuperándose posteriormente
mediante centrifugación. El pelet obtenido se puso a secar en la estufa eléctrica a
una temperatura de 50°C. El extracto seco se colocó en un vial y se le etiquetó
con la clave MM0417 F
C. Por otro lado, al residuo de la primera filtración, se le agregó 1 L de agua
destilada y se volvió a realizar la extracción, esta vez a 80°C, con agitación
continua durante 3 h. La mezcla fue posteriormente filtrada sobre un lienzo limpio
19
y centrifugada por 30 min (5°C. 1700 xg). El sobrenadante fue precipitado en 20
mL de solución de cloruro de cetil-piridium (CPC) al 10% y se reposó durante 24 h.
El precipitado se recuperó mediante centrifugación (5°C, 1700 xg por 30
min), y éste se resuspendió en 710 mL de solución al 0.05% de CPC, dejándose
reposar durante 24h a temperatura ambiente y recuperándose mediante
centrifugación (5° C, 1700 xg por 30 min). El precipitado obtenido se resuspendió
en 697 mL de NaCl al 2M, manteniéndose con agitación constante durante 18 h
posteriores a las cual se precipitó nuevamente con 2.1 L de etanol absoluto, y se
dejó reposar por 20 h. El precipitado se recuperó mediante centrifugación (5° C.
1700 xg), y se secó en la estufa eléctrica por 18 h a una temperatura de 50° C. El
extracto seco se colocó en un vial y se le dio la clave MM0417 CN.
El extracto seco fue resuspendido en 200 mL de agua destilada a
temperatura ambiente durante 15 h. Posteriormente, suspensión se trató con
ultrasonido y baño de agua caliente (50° C) durante 5 h, después se centrifugó por
30 minutos (5° C. 1700 xg). El sobrenadante se precipitó con tres volúmenes de
alcohol etílico y se dejó en reposo durante 24 h.
El precipitado se recuperó mediante centrifugación durante 30 minutos (5°
C. 1700 xg). El precipitado obtenido se dejó secar en la estufa eléctrica a 55° C
durante 6 h, mientras que el sobrenadante fue descartado. A esta fracción seca se
le colocó en un vial, y se le denominó MM0717 CArp.
20
C.1. Al sobrenadante obtenido del primer precipitado de la extracción con
CPC al 10%, se le volvió a precipitar con 1650 mL de etanol absoluto, y se dejó
reposar durante 18 h. Posteriormente se centrifugó (1700 xg, 5° C, 30 min), y el
sólido obtenido se secó con una estufa eléctrica durante 18 h a 50° C. El extracto
seco se colocó en un vial y se le dio la clave MM0417 CN.
7.3 Determinación de azúcares totales
Para conocer la cantidad de azúcares totales (Dubois, 1996) se colocaron
100 µL de cada fracción en un tubo de ensaye, al que posteriormente se le
agregaron 900 µL de agua destilada. A éstos se les agregó una solución de fenol-
ácido sulfúrico al 5% y se leyó el resultado a una longitud de onda a 490 nm. Este
ensayo se realizó primero para los extractos; posteriormente se sometieron todas
las fracciones obtenidas a esta prueba.
21
Fig
ura
6.
Dia
gra
ma d
e f
lujo
de la o
bte
nció
n d
e los t
res e
xtr
acto
s p
rincip
ale
s d
e H
ydro
cla
thru
s c
lath
ratu
s.
22
7.4 Fraccionamiento
Se suspendieron 1.4 g del extracto MM0417CArp en 30 mL de agua
destilada, disueltos con ayuda de un sonicador durante 8 h a 50° C. A esta mezcla
se le agregaron 45 g de DEAE celulosa y se colocó en un embudo Buchner de 95
mm de diámetro (Figura 7).
Figura 7. Diagrama del fraccionamiento del extracto MM0717 CArp.
La mezcla fue eluída con 500 mL de NaCl al 0.5M, 600 mL de NaCl al 1M y
600 mL de NaCl al 2M, obteniéndose 18 eluatos a distintas concentraciones.
Posteriormente, los eluatos fueron unidos según la Tabla I.
23
Tabla I. Forma en que fueron unidos los eluatos obtenidos del extracto MM0417 CArp,
dando lugar a seis fracciones.
Eluato Clave
1 -4 MM0417CArp CC1F1
5-8 MM0417CArp CC1F2
9-10 MM0417CArp CC1F3
11-15 MM0417CArp CC1F4
16 MM0417CArp CC1F5
17-18 MM0417CArp CC1F6
Las fracciones unidas fueron dializadas en una membrana de celulosa
SpectraPor (Spectrum Medical Industries, Inc.) de 45 mm con un volumen de 6.4
mL/cm de 12000 a 14000 daltons. El proceso de diálisis fue en contra de agua
destilada por 48 h.
Posteriormente, las fracciones fueron precipitadas con tres volúmenes de
etanol y dejadas en reposo a 4° C durante 4 h. Después, se centrifugó cada una
de ellas durante 20 min (5° C. 1700 xg), se recuperó el sólido de cada fracción y
se colocó en la estufa eléctrica a 55° C durante 24 h.
24
7.5 Ensayos de actividad anticoagulante
La actividad anticoagulante de los seis extractos (MM0417CArpCC1F1-
MM0417CArpCC1F6) se observó mediante la realización de ensayos de tiempo de
protombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA), utilizando
plasma sanguíneo humano.
El plasma sanguíneo se obtuvo a partir de la extracción de 9 mL de sangre
de un donante anónimo. Esta muestra se colocó en un tubo de ensaye con 1 mL
de citrato de sodio al 3.5% y se centrifugó por 10 minutos, se recuperó el plasma
y se almacenó a -18° C.
En la prueba TP se agregaron 4 ml de agua destilada al recipiente del
ensayo. Posteriormente se colocaron a baño maría un tubo con 100 μL de plasma
y otro con 10 μL de la prueba del extracto incubada a una temperatura de 37° C
por un minuto. El control se realizó tomando 100 μL de plasma y 200 μL de la
prueba TP, incubada previamente a 37° C por 10 min., posterior a ese tiempo se
midió el tiempo de formación del coágulo.
Para el ensayo TTPa, se mezclaron 100 μL de plasma humano citrado y se
mezcló con 10 μL del extracto obtenido incubado a 37° C por un minuto.
Posteriormente se le agregaron 100 μL del reactivo de TTPa y se incubó a 37° C
durante 3 min posteriores a los cuales se agregaron 100 μL de CaCl2 al 0.25%, y
fue a partir de ese momento que se midió el tiempo de formación del coágulo.
25
La formación del coágulo se inspeccionó visualmente en todas las pruebas,
y éstas fueron realizadas por duplicado.
7.6 Determinación de ácidos urónicos
La determinación de ácidos urónicos se realizó mediante el método
propuesto por Blumenkanta y Asboe (1973). Se colocó 1 mL de cada fracción (100
μL mL -1) en agua con hielo por 30 s. Posteriormente se adicionaron 6 mL de
borato de sodio al 0.0125 M en H2SO4 y se dejó enfriar en agua con hielo 1 min,
posterior al cual se colocó a baño maría a 100°C durante 5 min. Terminando este
tiempo, la mezcla se colocó nuevamente en agua con hielo por 1 min y finalmente
se le agregararon 100 μL de 3-fenil al 0.15% en hidróxido de sodio al 0.5%. La
absorbancia fue medida a 520 nm, con un tiempo no mayor a 5 min. La
concentración de ácidos urónicos se obtuvo al interpolar la absorbancia de cada
fracción con una curva estándar realizada con ácido galacturónico. Las
determinaciones fueron realizadas por duplicado, calculando el promedio y la
desviación estándar.
7.7 Determinación de fucosa
La concentración de fucosa fue determinada por el método colorimétrico
propuesto por Dische (1955). En este ensayo se coloca 1 mL de cada fracción
disuelta en agua (100 μL mL -1) en un tubo de ensayo, enfriado dentro de un
contenedor con hielo. Se agregaron 4.5 mL de una mescla de 100 mL de agua
destilada con 600 mL de ácido sulfúrico. Después de enfriarse por 1 min se
26
transfirió a un baño de agua a 100°C durante 10 min, posteriormente se dejó
enfriar a temperatura ambiente. Se agregaron 100 μL de cisteína al 3% y se dejó
reposar por 30 min para finalmente medir a absorbancia a 396 y 427 nm. La
absorbancia de la fucosa se calculó mediante la ecuación: Afucosa= A396 nm – A427 nm.
La concentración de la fucosa fue determinada por la interpolación en una curva
estándar realizada con L-fucosa. Las determinaciones fueron realizadas por
duplicado, calculando el promedio y la desviación estándar.
7.8 Espectrofotometría de infrarrojo
Para la caracterización de las fracciones obtenidas a partir de las seis
muestras de extracto de Hydroclathrus clathratus se realizaran espectros de
infrarrojo, utilizando bromuro de potasio como soporte. A cada espectro se le
adicionaran repeticiones a una resolución de 4 cm-1 en el rango espectral de 400-
4000 cm-1.
8. RESULTADOS
Los tres extractos obtenidos en un inicio de H. clathratus (MM0417F,
MM0417C) fueron analizados con ensayos de contenido de azúcares totales. Se
encontró una mayor concentración promedio de azúcares en el extracto obtenido
con agua caliente, y aunque se encontró cierta cantidad de azúcares en el extracto
con agua fría, éste fue 4 veces menor en comparación (Tabla II).
27
Tabla II. Porcentaje relativo del contenido de azúcares totales en los extractos de H.
clathratus obtenidos con agua fría y caliente.
Extracto Porcentaje de contenido de azúcares
MM0417 Frío 2.18
MM0417 Caliente 9.0
Las pruebas anticoagulantes realizadas para los extractos F, CN y CArp
demuestran que para el ensayo TP doblaron el tiempo de coagulación del blanco
(13 s), siendo más activa la fracción MM0417CArp (Figura 8), con un coeficiente
de coagulación de 5.5 . Mientras que para los ensayos de TTPa no se mostró
alguna diferencia entre los tres extractos, puesto que la formación del coaguló se
observó después de los 300 s, aumentando nueve veces el tiempo de coagulación
del blanco, el cual se formó a los 33 s.
Figura 8. Tiempo de la formación del coágulo (s) en los ensayos TP y TTPa para los extractos
MM0417F, MM0417CArp y MM0417C obtenidos de H. Clathratus.
0
50
100
150
200
250
300
350
MM0417F MM0417CArp MM0417CN Blanco
Fo
rmació
n d
el
co
ág
ulo
(s)
Extracto de H. clathratus
TP promedio
TTPa promedio
28
El mayor rendimiento fue de 6.7591 y se obtuvo en el extracto MM0417F.
En cuanto a los ensayos anticoagulantes se encontró que los tres extractos
obtuvieron un coeficiente de coagulación de 9.09 en la prueba TTPa; no siendo el
mismo caso para el ensayo TP, puesto que el mayo coeficiente de coagulación se
encontró en el extracto MM0417CArp, con un tiempo de coagulación promedio de
71.5. Debido a que este último presentó una mayor actividad anticoagulante, se
procedió a realizar el fraccionamiento de éste (Tabla III).
Tabla III. Muestra los tiempos y coeficientes de coagulación, además del rendimiento para
los extractos MM0417F, MM0417CArp y MM0417C obtenidos de H. clathratus.
Extracto
TP (s)
Coeficiente de
coagulación
TTPa
(s)
Coeficiente de
coagulación
Rendimiento
MM0417F 33.5 2.57 >300 9.09 6.7591
MM0417CArp 71.5 5.5 >300 9.09 2.1221
MM0417CN 50.5 3.88 >300 9.09 1.396
Blanco 13 ----- 33 ------- -----
Las seis fracciones resultantes del extracto MM0417CA (Tabla I), se
analizaron con ensayos anticoagulantes. En la figura 9 se observa que todas las
fracciones presentaron el mismo tiempo de coagulación para el ensayo TTPa
(>300 s) aumentando el tiempo de coagulación del blanco (33 s).
29
0
50
100
150
200
250
300
350
Fo
rmació
n d
el
co
ág
ulo
(s)
Fracciónes de H. clathratus
TP promedio
TTPa promedio
Figura 9. Tiempo de la formación del coágulo (s) en los ensayos TP y TTPa para las fracciones obtenidas a partir del extracto MM0417CArp.
Para el ensayo TP, se mostró una variación en el tiempo de coagulación de
las seis fracciones, siendo cinco las que lograron doblar el tiempo de coagulación
del blanco (13 s). La mayor actividad se encontró en la fracción MM0417CA
CC1F3 (>300 s), seguida por la fracción CC2F4 con un promedio de 228 s y la
fracción CC1F5, cuya formación del coágulo se observó a los 164 s, mientras que
la fracción CC1F1, aunque logró prolongar la coagulación a un promedio de 21.17
s, ésta no dobló el tiempo de coagulación del blanco (Tabla IV)
30
Tabla IV. Muestra el tiempo de coagulación en los ensayos TP y TTPa de las seis
fracciones del extracto MM0417CArp.
Fracción TP (s) TTPa (s)
MM0417CA CC1F1 21.17 >300
MM0417CA CC1F2 38.515 >300
MM0417CA CC1F3 >300 >300
MM0417CA CC1F4 228 >300
MM0417CA CC1F5 164 >300
MM0417CA CC1F6 54.83 >300
Blanco 13 33
En la tabla V se observa que el coeficiente de coagulación en el ensayo
TTPa fue de 9.09 en las seis fracciones. Mientras que la fracción con mayor
coeficiente de coagulación en las pruebas TP se encontró en la CC1F3,
aumentando 23 veces el tiempo de coagulación, además, en este misma fracción
se encontró un mayor rendimiento.
Tabla V. Muestra el rendimiento y el coeficiente de coagulación en las pruebas TP y TTPa
de las fracciones obtenidas a partir del extracto MM0417CArp.
Fracción Coeficiente de coagulación TP
Coeficiente de coagulación TTPa
Rendimiento
MM0417CA CC1F1 1.62 9.09 0.0854
MM0417CA CC1F2 2.96 9.09 0.0384
MM0417CA CC1F3 23.07 9.09 0.257
MM0417CA CC1F4 17.53 9.09 0.0536
MM0417CA CC1F5 12.61 9.09 0.057
MM0417CA CC1F6 4.217 9.09 0.0143
31
En la Figura 10 se muestra que en la fracción CC1F3 se encontró un mayor
porcentaje de fucosa, seguidas por la fracción F2 y F1; mientras que en las
fracciones F4, F5 y F6 no se encontró contenido de fucosa. En las seis fracciones
se encontró contenido de ácidos urónicos, siendo la fracción F1 y F2 las que
contuvieron un mayor porcentaje, mientras que la fracción F3 fue la que menor
proporción de éste compuesto contuvo. Finalmente, el porcentaje de azúcares
encontrados en las fracciones fue más alto en las fracciones F1 y F2,
encontrándose el mínimo en la fracción F6. Además, se muestra que la menor
cantidad de ácidos urónicos se encuentra en la fracción F3, la cual por el contrario,
demuestra tener un mayor porcentaje de fucosa. Por otro lado, la fracción F1 con
un mayor porcentaje de ácidos urónicos, contienen un mínimo contenido de
fucosa.
Figura 10. Porcentaje de fucosa, azúcares totales y ácidos urónicos contenidos en las fracciones
de MM0417CArp.
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0
MM0417CA CC1F1
MM0417CA CC1F2
MM0417CA CC1F3
MM0417CA CC1F4
MM0417CA CC1F5
MM0417CA CC1F6
Porcentaje
Fra
cció
nes d
e H
. c
lath
ratu
s
Porcentaje defucosa
Porcentaje deazúcares
Porcentaje deácidosurónicos
32
El espectro de infrarrojo de la fracción MM0417CA F3 (Figura 11), muestra
bandas de absorción en 3446 cm-1 es atribuida al enlace del grupo hidroxilo,
mientras que las señales observadas a los y 1358.7 cm-1 corresponden los
enlaces carboxilo. La existencia de grupos sulfato se puede constatar con la
presencia de las bandas 1247.3 y 602.5 cm-1, mientras que la banda en 811.24
cm-1 indica sulfato en posición ecuatorial. La banda que se encuentra en 1031.2
cm-1 es atribuida a la presencia de un anillo de azúcar, mientras que la banda en
900 cm-1 es un indicador de un polisacárido (Manoj et al., 2013, Bo et al., 2008).
33
4000
450
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
100 7980828486889092949698
cm-1
%T
3446
.1
2939
.5
1639
833.
73
973.
62
1230
.7
1030
.3
909.
35
580.
43
1385
.7
Fig
ura
11. E
sp
ectr
o d
e infr
arr
ojo
de la f
racció
n M
M0
417C
Arp
CC
1F
3.
El pic
o u
bic
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n la b
anda
83
3.7
3 d
em
uestr
a u
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rad
o d
e
sulfata
ció
n c
ara
cte
rístico d
e los p
olis
acári
dos s
ulfata
dos.
34
9. DISCUSIÓN
En la realización de este estudio se encontró que H. clathratus posee actividad
anticoagulante, siendo en primera instancia, el extracto MM0417CArp el que
mostró una mayor actividad. Aunque las en las pruebas de TTPa los resultados
fueron los mismos para los tres extractos (>300 s) lo que denotó un cambio en el
potencial del extracto obtenido con agua caliente fueron los ensayos TP, ya que
en esta prueba el tiempo de coagulación fue mayor (50 s). Las diferencias entre el
tiempo de coagulación pueden deberse a que la actividad anticoagulante que tiene
un polisacárido está determinada por el grado de sulfatación en la cadena, y se
tiene registrado que para H. clathratus la cantidad de sulfatos es mayor cuando los
polisacáridos se obtienen de una extracción con agua caliente (Berteau y Mulloy,
2003; Awar et al, 2009).
Awar y colaboradores en el 2009 reportaron que el extracto caliente de H.
clathratus posee un mayor contenido de fucosa, galactosa y xilosa, mientras que
los extractos obtenidos con agua fría contienen una mayor cantidad de ácido
glucurónico y galacturónico. Sin embargo, la extracción con agua caliente no
puede considerarse como el mejor método para la obtención de fucoidanos. En el
mismo trabajo realizado por Adwar et al, se realizó también la extracción de
polisacáridos del alga Padina pavonia. En este caso el porcentaje relativo de
fucosa para P. pavonia fue mayor con la utilización de agua fría, mientras que con
el agua caliente se obtuvo un mayor porcentaje de ácidos glucurónicos.
35
Demostrando de este modo que las características del alga en cada especie llevan
a la obtención de distintos resultados bajo un mismo método de extracción (Bo et
al., 2008).
En cuanto al tiempo de coagulación de las fracciones se obtuvo que
MM0417CArp tuvo la mayor actividad en las pruebas TP y TTPa, elevando a >300
s el tiempo de coagulación en el ensayo TP. Además, fue esta fracción la que
contuvo un mayor porcentaje de fucosa. Los fucoidanos en general, han
demostrado tener una gran capacidad anticoagulante, siendo las fracciones más
activas fracciones más activas aquellas que contienen un nivel más alto de
sulfatación (Trejo, 2004; Shanmugam y Mody, 2000). Además, las diferencias
entre los tiempos de coagulación entre ambas pruebas pueden deberse a que
éstas analizan distintas vías de coagulación, implicando distintos factores a los
que pueden no ser afines los polisacáridos extraídos (Pereira et al., 2002).
De igual manera, las diferencias de las actividades anticoagulantes entre
las fracciones obtenidas para ambas pruebas pueden deberse al método de
extracción, puesto que este método obtiene compuestos con un distinto peso
molecular, dando así diferentes propiedades en la estructura. Además, no se
puede descartar que esta alga pueda tener una mayor actividad anticoagulante de
lo que se obtuvo en este trabajo, puesto que debe de tomarse en cuenta que la
formación de los metabolitos secundarios dependen de las necesidades
fisiológicas del alga, las cuales reporta Matsubara et al en el 2010, están dadas
36
por las condiciones oceánicas como temperatura, nutrientes, y estrés, además de
la época del año en que ésta es recolectada y periodo de reproducción. Lo cual da
una posibilidad de encontrar diferencias en las estructuras y los potenciales
activos de los fucoidanos que se encuentran en un alga de la misma especie en
diferentes periodos de recolección.
La posición de los grupos sulfato tiene un rol importante en la actividad
biológica del fucoidano. Uno de los métodos más utilizados para determinar la
posición del sulfato es la espectroscopia de infrarrojo, la cual muestra que la
mayoría de los grupos sulfato se encuentra en posición axial y el resto en posición
ecuatorial, de acuerdo a una banda a los 824 cm-1 y un desnivel a los 820 cm-1 en
el espectro (Bo et al., 2008). En cuanto a la caracterización estructural de las
fracciones, en la figura 11 se pueden observar bandas características de un
polisacárido sulfatado (banda a los 833.73 cm-1).
De igual manera que lo reportado por Manoj et al. 2013, quienes trabajaron
con los espectros de infrarrojo para las algas cafés Sargassum tenerrimum,
Sargassum wightii, Turbinaria conoides, Turbinaria ornata y Padina
tetrastromatica, se encontró que H. clathratus presenta una banda en 909 cm-1, la
cual resulta ser característica de los fucoidanos. Además, se observaron bandas
en 1230 y 580 cm-1, las cuales indican la presencia de grupos sulfato ésteres,
mientras que el pico encontrado en la banda 1639 corresponde a grupos hidroxilo
37
y carboxilo (Silva, et al., 2005). La banda encontrada a 1030 corresponde a un
anillo de azúcar como lo reporta Muñoz en el 2006.
Finalmente, se tiene entendido que los polisacáridos sulfatados existentes
en H. clathratus tienen un amplio potencial anticoagulante, puesto que una de las
fracciones logró inhibir el tiempo de formación del coágulo de una forma similar a
la heparina (F3), mientras que el resto, tuvieron un potencial anticoagulante
sumamente alto sólo para la prueba TTPa.
10. CONCLUSIONES
El alga Hydroclathrus clathratus demostró tener fucoidanos con actividad
anticoagulante. Aunque sólo una de las fracciones obtenidas mostró una actividad
similar a la de la heparina para las pruebas TP y TTPa, ésta fue la fracción que
mostró un mayor rendimiento. Podría proponerse la fracción MM0417CArp CC1F3
como un candidato a ser un fármaco, sin embargo, aún falta la realización de
purificación del extracto y pruebas de citotoxicidad.
11. REFERENCIAS
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