TESIS-Evaluacion Del Tipo de Solvente y Estabilidad de Antocianinas de Flor de Mastuerzo
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1
I. INTRODUCCIÓN
Los efectos carcinogénicos y embriotóxicos causados por los colorantes
artificiales, se conocen, sin embargo su uso sigue siendo sin duda de gran
importancia en ciertos productos, ya que gracias al color se perciben
sensaciones agradables a la vista, además de ser un factor estético.
En los últimos tiempos, la industria cosmética, alimenticia y farmacéutica, se
han preocupado por brindar al consumidor productos de alta calidad que
sean seguros, es decir que posean los menores efectos secundarios y que a
la vez proporcionen vitaminas, minerales y todos aquellos elementos
capaces de mejorar la salud de la población.
Los colorantes naturales se han utilizado desde tiempos antiguos, pero hoy
en día vuelve a tener un papel importante en la industria, esto debido a la
gran exigencia de la población por consumir productos seguros, eficaces y
de calidad.
El mastuerzo es una planta muy conocida, autóctona del Perú. La población
desde nuestros antepasados lo empleaba para curar heridas. Su actividad
como antibiótico fue observado tempranamente. En medicina popular se
utiliza el cocimiento caliente de flores y ramas, en forma de compresas y
baños, para tratar afecciones de la piel y lavar heridas; esta misma
preparación se administra oralmente para combatir afecciones bronquiales y
de las vías urinarias; para estos mismos fines también se suele usar el jugo
2
fresco de la planta, que actualmente es de cultivo silvestre,
desaprovechando una fuente muy buena de colorante natural a partir de sus
pétalos de flores que pueden ser utilizados en la industria alimentaria como
en la industria farmacéutica y cosmética, sin mencionar su capacidad
antioxidante y contenido de compuestos bioactivos como los compuestos
fenólicos, antocianinas y betacaroteno.
En este trabajo de investigación se plantea la posibilidad de extracción de
colorante con disolventes orgánicos y el uso de los pétalos secos como
alternativa para su uso como colorante y evaluar su estabilidad, incentivando
así a la industrialización y contribución en la revalorización de la
biodiversidad de cultivos no tradicionales que tiene el departamento de Junín
permitiéndonos generar un soporte científico para validar una producción
sostenible.
En el presente trabajo se tienen los siguientes objetivos:
- Evaluar el efecto del solvente (agua, etanol y metanol) en el
rendimiento durante la extracción de antocianinas de los pétalos de
mastuerzo.
- Evaluar la estabilidad de las antocianinas frente a la temperatura, pH
y tiempo de almacenamiento.
3
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 El mastuerzo (Tropaeolum majus L.)
2.1.1 Historia
El Mastuerzo es junto con la papa, el tomate y el maíz, uno de los
grandes regalos que el continente americano hizo al europeo.
Aquellos conquistadores españoles, asombrados al ver ante sus
ojos tantas especies desconocidas para ellos (plantas, aves,
insectos), es muy posible que el Mastuerzo les llamara la atención
como simple planta ornamental. Y con esa intención se la llevaron
al viejo mundo. Pronto, sin embargo, se pusieron de manifiesto sus
notables propiedades medicinales.
Según Nanzi (1999), menciona que Francisco Hernández fue el
primero en escribir sobre las virtudes de esta planta, en su obra
Historia de las plantas de México, publicada en 1615, en “Flora
Española”, tomo IV, página 9, donde menciona que la planta es
originaria del Perú y por medio de nuestros descubridores llego a
España.
Esta planta crece en terrenos húmedos y aguanosos, todo el año
florece, la planta aplicada en heridas de la piel las cura y cicatriza,
el consumo de flores y hojas son buenas para las ulceras y
escorbutos de la boca. (Nanzi, 1999)
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2.1.2 Clasificación taxonómica
División : Fanerógama
Sub división : Angiosperma
Clase : Dicotiledóneas
Sud clase : Rosidae
Orden : Brassicales
Familia : Tropaeolaceae
Género : Tropaeolum L.
Especie : Tropaeolum majus L.
2.1.3 Habitat
La flor de Mastuerzo es una especie originaria de América del Sur
de la región de los andes, más precisamente del Perú.
Actualmente se cultiva en macetas y jardines por toda Europa, ya
que solo requiere tierra mullida y frecuentes riegos. En
Sudamérica es posible, además, encontrarla en estado silvestre,
desde México hasta Argentina. (Nanzi, 1999)
2.1.4 Denominaciones
Capuchina común, flor de amor, espuela de galán, cachaco de
muladar, jacinto, marañuelas, pelón, pensamiento, taco de reina,
berro de México, mastuerzo de indias, cappuccina (Italiano),
capucine (Francés), Nasturtium (Inglés), kapuzinerkresse
(Alemán), chagas, mastru, papagaios (Portugués). (Nanzi, 1999)
2.1.5 Descripción botánica
Planta herbácea con hojas alternas, simples, con limbo orbicular
7-12 cm, peciolo entre 12 y 40 cm de largo, flor hermafrodita,
hipógina con el receptáculo alargado por detrás y formando con la
5
base de los 3 sépalos posteriores un espolón de 2-3 cm de largo,
cáliz con 5 sépalos y pétalos unguiculados 23-38 x 24-35 mm, 8
estambres de diferentes tamaños, fruto esquizocárpico con 3
aquenios de 1 a 1,5 cm de diámetro, de forma globosa, con tres
ángulos redondeados. Souto et al. (2012) menciona que las flores
de la capuchina son de colores, membranáceas, lisas poco
cerosas, florece desde la primavera hasta el otoño y se multiplica
por semillas y gajos.
Las flores de Mastuerzo son de sabor picante, similar a los berros,
que es debido a la presencia de compuestos de azufre, sus frutos
son preparados en encurtidos a un estilo similar a la alcaparra
(Loja, 2002).
Habitat: Ambientes ribereños de riachuelos, acequias, lagunas.
Figura 1. Estructura de la flor de Mastuerzo (Nanzi, 1999)
6
Figura 2. Los pétalos y los sépalos, donde se puede observar que
los sépalos inferiores son conados, formando un espolón. Fuente: Souto et al., 2012
Fuente: Souto et al., 2012
Figura 3. Las variaciones de los colores de las flores de la capuchina (Tropaeolum majus L.)
Figura 4. Aspecto general de las flores de la capuchina (Tropaeolum
majus L.). Fuente: Salvat, 1977
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2.1.6 Principales Componentes Químicos
a) Glucosinolato: presente en la semilla como la Sinigrina.
b) Flavonoides: Quercetina, kaempferol, isoquercitina.
c) Antocianidinas: Delfinidina, cianidina, pelargonidina,
pelargonidina 3-soforosa.
d) Acidos Fenólicos: ac. P-hidroxibenzoico, ac.p-
hidroxifenilacético, ac. Vanilico, ac. Gentisico, ac.
Protocatequico, ac. Siríngico, p-cumarico, ac. Ferúlico, ac.
Cafeico, ac. Sinapico.
e) Polisacarido: Xiloglucano, restos de β-D galactosa.
f) Carotenoides: luteína, zeaxantina.
g) Fracción volátil: isocianato de bencilo.
h) Enzima: mirosinasa (hidroliza la glucotropaeoline en
tiocianato), β-glucosidasa.
i) Vitamina: vitamina C.
Detallado por (Ghedira y Goetz, 2013).
2.1.7 Composición química de la flor de mastuerzo
Tabla 1. Composición química de los pétalos de la flor de mastuerzo
Componentes Cantidad
Vitamina C (mg/100g) 59.17
pH 5.78
Acidez titulable (% de ác. Cítrico) 1.14
Azucares Reductores (mg glucosa/100g) 30.45
Antocianinas Totales (mg/100g) b.s 78.36
Fosforo (mg/100g) 0.48
Potasio (mg/100g) 3.80
Calcio (mg/100g) 0.34
Magnesio (mg/100g) 0.15
8
Sodio (mg/100g) 0.09
Hierro (mg/100g) 6.47x10−3
Magnesio (mg/100g) 5.85x10−3
Cobre (mg/100g) 1.17x10−3
Zinc (mg/100g) 9.07x10−3
Molibdeno (mg/100g) 0.29x10−3
Fuente: Souto et al. (2012)
2.1.8 Usos medicinales
El uso de la flor de mastuerzo se emplea contra las infecciones de
las vías respiratorias (Sinusitis, rinitis, faringitis, y especialmente
bronquitis), Infecciones de las vías urinarias, Favorece a la
cicatrización de la piel debido a su elevado contenido en azufre y
revitaliza el cabello (Nanzi, 1999).
El mastuerzo se puede clasificar como una hoja de verduras,
flores y varilla, ya que toda la planta puede ser consumido natural
o en salsas y/o conservas. Las flores, hojas y frutas tienen sabor
amargo y picante, ya que contienen los compuestos de azufre,
que también están presentes en el berro. Además, sus flores y
hojas tienen altas concentraciones de vitamina C y minerales y
fosfatos (Zurlo y Brandao, 1989, citado en Souto et al., 2012).
Las flores de mastuerzo son ricos en luteína, utilizados para
prevenir enfermedades como las cataratas y la degeneración
macular. Son también utilizados en el tratamiento contra el
escorbuto, porque es rica en vitamina C y minerales, tales como
nitrógeno, azufre, yodo, hierro, potasio y fosfatos en
enfermedades pulmonares y como expectorantes. Las hojas y las
flores de mastuerzo ayudan a los procesos digestivos y de lucha
contra la crisis nerviosa e insomnios. El maceramiento material
resultante de sus hojas fresco se utiliza para combatir la caída del
cabello y el fortalecimiento del cuero cabelludo. El mastuerzo por
lo tanto, puede ser considerado como vegetales nutritivos en sus
9
hojas y flores (Panizza, 1997 y Bremness, 1993, citado en Souto
et al., 2012)
2.2 Flores comestibles
Las flores comestibles aportan sustancias biológicamente activas como
vitaminas A, C, riboflavina, niacina, minerales como calcio, fosforo,
hierro y potasio beneficiando la salud de quien las consume. Sus
características organolépticas y valor nutricional pueden considerarse
un alimento funcional. No todas las flores pueden consumirse por ser
toxicas. (Lara-Cortes et al., 2013)
2.2.1 Características sensoriales de las flores comestibles
Las flores comestibles pueden ser usadas para adicionar color,
fragancia y sabor a los alimentos, el mayor componente de las
flores es agua (más del 80% de su composición) por tanto son
ingredientes calóricamente bajos.
Un ejemplo es la flor de jamaica, la flor de color purpura tiene un
sabor muy parecido al de la frambuesa. Los geranios (Pelargonium
zonale) brindan fragancia a los pasteles, los pensamientos (Viola x
wittrockiana) se usan en ensaladas dulces y saladas o para
acompañar quesos, las capuchinas regalan sabores picantes a
ensaladas. (Lara-Cortes et al., 2013)
2.2.2 Color
El color puede afectar e influir en las preferencias de consumo. Por
ejemplo en el caso de la flor de capuchina, pueden atraer y
estimular el apetito.
El color amarillo puede estar asociado con un sabor cítrico, agrio,
mientras que el azul, el cual es muy raro, puede relacionarse con
alimentos que tienden a ser azucarados.
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Tabla 2. Usos de las flores comestibles en la gastronomía
Nombre común
Origen Nombre
Científico Uso
Alheli Ecuador
Matthiola incana Son usadas especialmente en postres dulces.
Amapola Europa, Africa y Asia.
Papaver rhoeas Con los pétalos se aromatiza el vino.
Azucena Corea, China, Japon y zonas templadas de Asia.
Hemerocallis
fulva
En Asia se venden frescas o secas, y se conocen como agujas doradas. Se usan rellenas, en postres, ensaladas,
sopas y
compotas.
Begonia Zonas tropicales de Asia, Africa y América
Begonia x tuberhybrida, B. semperflorens.
Uso como
guarnición de
platos.
Boca de dragon
Portugal y sur de Francia, hasta el este de Turquia y Siria.
Antirrhinum
majus
Para ensaladas.
Borraja Norte de Africa y America del Sur.
Borago
officinalis
Para aderezar platos frios y ensaladas.
Campanilla Noreste asiatico, China y Japon.
Platycodon grandiflorus
Para ensaladas.
Capuchina Peru, Ecuador y Colombia.
Tropaeolum
majus
Para ensaladas se usan los petalos. Va muy bien con legumbres, patatas, arroz, o sopa.
Chira Costa Rica
Indigofera suffruticosa
Cremas, asadas
Claveles Cuenca mediterranea
Dianthus caryophyllus,
Ensaladas de frutas.
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D. barbatus, D. plumarius
Crisantemos Asia,principalmente en China.
Chrysanthemum spp
Para ensaladas, sopas, salsas y vinagretas.
Geranio Africa del sur
Pelargonium
spp
Para postres, pasteles y bebidas
Girasol Suroeste de E.U.A. y norte de Mexico
Helianthus
annuus
Los capullos sin abrir se pueden hacer al vapor como las alcachofas.
Gladiolo Africa del sur Gladiolus spp Para ensaladas
y guarnición de
platos.
Jamaica Mexico Hibiscus
sabdariffa
Infusiones,
extractos,
ensaladas,
tortas,
mermelada
Fuente: Lara-Cortes et al., 2013
2.2.3 Antocianinas
Las antocianinas encontradas con más frecuencia en las flores
están la pelargonidina, cianidina y delfinidina.
En flores de tulipan (Tulipa spp.) la pelargonidina es responsable
de los colores naranja a rojo, cianidina del color magenta y rojo, y
delfinidina el color purpura. En la flor de jamaica delfinidina-3
sambubiosido y cianidina-3-sambubiosido, en la azucena la
cianidina-3-rutinoside y delfinidina-3-rutinoside son las
responsables del color, los diferentes estudios han manifestado
las propiedades antioxidantes de estos pigmentos. (Lara-Cortes et
al., 2013)
12
2.2.4 Composición de flores comestibles
Tabla 3. Composición proximal de algunas Flores Comestibles (g /100 g de
muestra)
Flor Humedad Proteína Fibra Ceniza
Agave (Agave salmiana) 87.4 16.4* 12.7* 5.8*
Colorin (Erythrina
americana) 86.6 26.2* 17.3* 9.6*
Cuaresma (Euphorbia
radians) 90.1 25.1* 12.6* 9.4*
Cuchunuc (Gliricidia
sepium) 84.7 1.9** 2.4** 0.7**
Gasparito (Erythrina
caribaea) 88.5 27.4* 17.7* 10.1*
Loroco (Fernaldia
pandurata) 90.3 0.3** 1.3** 1.0**
Madroño (Arbutus
xalapensis) 89.7 11.3* 10.4* 6.9*
Moringa (Moringa oleifera) NR 18.9* 32.45* 9.7*
Taro (Colocasia esculenta) 88.8 10.1* 17.8* 5.1*
Yuca (Yucca filifera) 88.1 25.9* 8.5* 9.7*
NR: No Reportado, * Datos expresados en base seca, ** Datos expresados
en base húmeda.
Fuente: López – García, 2007
2.3 Compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos o polifenoles constituyen un amplio grupo de
sustancias químicas, considerados metabolitos secundarios de las
plantas, con diferentes estructuras químicas y actividad, englobando
más de 8000 compuestos distintos. Su forma más frecuente es la de
13
polímeros o lignina insoluble, mientras que su presencia en tejidos
animales está relacionada con el consumo e ingestión de alimentos
vegetales. La distribución de los compuestos fenólicos en los tejidos y
células vegetales varían considerablemente de acuerdo al tipo de
compuesto químico que se trate, situándose en el interior de las células
o en la pared celular.
Sus principales funciones en las células vegetales son las de actuar
como metabolitos esenciales para el crecimiento y reproducción de las
plantas y como agentes protectores frente a la acción de patógenos,
siendo secretados como mecanismos de defensa. (Martinez-Valverde et
al., 2000)
2.3.1 Composición
Químicamente, los compuestos fenólicos son sustancias que
poseen un anillo aromático, un anillo benceno, con uno o más
grupos hidróxidos incluyendo derivados funcionales (ésteres, metil
ésteres, glicósidos, etc). La naturaleza de los polifenoles varía
desde moléculas simples como los ácidos fenólicos hasta
compuestos altamente polimerizados, como los taninos. Se
presentan en plantas en forma conjugada con uno o más residuos
de azúcar unidos a los gupos hidroxilo, aunque en algunos casos
se puede producir uniones directas entre una molécula de azúcar y
un carbono aromático. Por ello la forma más común de
encontrarlos en la naturaleza es en forma de glicósidos, siendo
solubles en agua y solventes orgánicos. Los azúcares asociados
a los polifenoles pueden ser monosacáridos, disacáridos o incluso
oligosacáridos. Los compuestos a los que se encuentran unidos
con más frecuencia son: glucosa, galactosa, arabinosa, ramnosa,
xilosa y ácidos glucorónico y galacturónico. También pueden
encontrarse unidos a ácidos carboxílicos, ácidos orgánicos,
aminas, lípidos y otros compuestos fenólicos. (Martinez-Valverde et
al., 2000).
14
Estos compuestos pueden acumularse como productos finales de
dos rutas bioquímicas distintas la ruta del shikímico, que genera los
fenilpropanoides y cumarinas, o la ruta del acetato, que
proporciona las fenonas más simples y varias quinonas. Además
pueden generarse a través de una ruta metabólica intermedia que
genera flavonoides, siendo éste el grupo más importante y
numeroso de los compuestos polifenólicos.(Piñeiro, 2005).
2.3.2 Clasificación
Según Harborne (1989) citado por Piñeiro, (2005), los compuestos
fenólicos se pueden agrupar en diferentes clases dependiendo de
la estructura química básica. Puede comprobarse que los ácidos
hidroxibenzoicos e hidroxicinámicos, así como los flavonoides,
están universalmente distribuidos en alimentos de origen vegetal.
Por el contrario los isoflavonoides constituyen un grupo discreto
cuya presencia queda confinada a la familia de las plantas
leguminosas.
a. Fenoles y ácidos hidroxibenzoicos
Dentro de este grupo los fenoles tienen una estructura C6 y C6-
C2, es necesario enfatizar la importancia de los ácidos
vainillínico gálico y p-hidroxibenzoico, abundantes en plantas
superiores y helechos.
b. Ácidos hidroxicinámicos
Constituyen el grupo más ampliamente distribuido de los
compuestos también conocidos como fenilpropanoides. Entre
ellos hay cuatro estructuras básicas que existen en su estado
natural libre y se corresponden con los ácidos cumárico, cafeico,
ferúlico y sinápico.
Muchas funciones biológicas están íntimamente relacionadas
15
con la presencia de estos compuestos en las plantas y
comprenden propiedades antibióticas y relacionadas con la
inhibición del crecimiento y germinación.
c. Estilbenos
Familia de compuestos constituida por dos ciclos benceno,
generalmente en lazados por una cadena etano o etileno (C6-C2-
C6). Entre los isómeros trans de estos compuestos, destaca el
resveratrol, o 3,5,4’-trihidroxiestilbeno, por sus propiedades
beneficiosas para la salud, y que parece generarse en la uva
como respuesta a una infección fúngica.
d. Xantonas
Estos compuestos poseen 2 anillos fenólicos unidos por un
átomo de carbono (C6-C1-C6). Las xantonas y sus derivados han
demostrado tener efectos beneficiosos sobre las enfermedades
cardiovasculares.
e. Taninos
Se refiere a una fracción de compuestos polifenólicos
especialmente astringentes, cuya característica fundamental es
su alto peso molecular. Estas estructuras poseen una alta
capacidad de asociación con otros polímeros biológicos
esenciales como las proteínas y los hidratos de carbono.
f. Flavonoides
Las principales estructuras de este grupo que podemos
encontrar distribuidas en alimentos son antocianinas, flavanoles,
flavanonas, flavonoles, flavonas, isoflavonoides y chalconas.
El término “aglicona” representa un flavonoide no unido a
ninguna otra sustancia química, independientemente del tipo de
flavonoide que se considere. El término “glicósido”, o más
generalmente “estructura glicosilada” se emplea para indicar
estructuras resultantes de la unión a cualquier tipo de azúcar.
16
2.4 Las antocianinas
Las antocianinas representan un factor muy importante en la
industria alimenticia debido a las restricciones sanitarias hacia el uso
de colorantes sintéticos (Konga et al., citado por López, Quiñones y
Echeverri .2007). Adicionalmente estas sustancias poseen un valor
agregado que es su capacidad antioxidante (Konga et al. y Jiao et al.,
citado por López, Quiñones y Echeverri .2007); por esta razón se
está creando un excelente mercado de exportación de frutas frescas
con un alto contenido de antocianinas.
Las antocianinas representa un grupo muy amplio de compuestos
fenólicos vegetales, estos son los pigmentos hidrosolubles rojos,
azules y púrpuras de las flores, frutas y verduras. Estas poseen una
estructura básica en común, químicamente son glicósidos de las
antocianinas (Wong, citado por Poo, 2005), es decir, están
constituidas por una molécula de antocianidina, que es la aglicona, a
la que se une un azúcar por medio de un enlace β-glucosídico. La
estructura química básica de estas agliconas es el ión flavilio. (Baudi,
1993), también llamado 2-fenil-benzopirilio (Wong, citado por Poo,
2005) que consta de dos grupos aromáticos: un benzopirilio (A) y
un anillo fenólico (B); el flavilio normalmente funciona como un catión.
(Badui, 2006, citado por Poo, 2005).
La estructura química básica de estas agliconas es el ion flavilio,
también llamado 2-fenil-benzopirilio que consta de dos grupos
aromáticos: un benzopirilio y un anillo fenólico; el flavilio normalmente
funciona como un catión (Wong, 1995 y Badui, 2006)
Con respecto a las estructuras de antocianidinas más ampliamente
distribuidas en el reino vegetal, los seis compuestos que se citan a
continuación son los responsables de la mayoría de la pigmentación en
los frutos: cianidina, normalmente encontrada en su estado molecular
libre (no glicosilado), es quizás la más común, seguida por la
17
delfinidina, peonidina, pelargonidina, petunidina y malvidina. (Piñeiro,
2005).
Las antocianinas son derivados del catión 2-fenilbenzopirilio y debido a
la poca solubilidad de éstas en agua, no se encuentran de manera libre
en la naturaleza, sino en su forma glucosilada siendo una de las más
abundantes la cianidina-3-glucósido (Walford, 1980; citado en Leyva,
2009)
Figura 5. Estructura del flavilio y la antocianina
Fuente: Poo, 2005
18
Figura 6. Estructuras de las Antocianidinas más importantes
Fuente: Espino, 2014
2.4.1 Biosíntesis de las antocianinas
Según Springob (2003) citado por Garzón (2008), Los
precursores de las antocianinas son bien conocidos, se ha
establecido experimentalmente que al anillo A de las antocianinas
se sintetiza por la ruta del ácido malónico con la condensación de
tres moléculas de malonil-CoA, mientras que el anillo B se sintetiza
por la ruta de ácido shikímico. El ácido shikímico da paso a la
fenilalanina que por acción de una fenilalanina amonia liasa (FAL),
y después de una pérdida de NH3 se convierte en ácido p-
cumárico. El p-cumaril-CoA luego participa en una reacción de
condensación con las tres moléculas de malonil- CoA para formar
una chalcona de 15 C, reacción propiciada por una chalcona
sintetasa.
Este compuesto intermedio de 15 C es transformado en una
flavanona en una reacción catalizada por una chalcona isómerasa.
Finalmente, la flavanona es transformada en la correspondiente
antocianidina por una reacción de hidroxilación en el carbono 3
seguida por una deshidratación. La molécula de antocianidina
19
se estabiliza por glicosilación del heterociclo; reacción en la que
interviene una glicosil transferasa y posterior posibles reacciones
de metilación de los hidroxilos seguidas de acilaciones.
2.4.2 Contenido de Antocianinas en alimentos
En el Tabla 4 y 5 se presenta el contenido de antocianinas en
frutas seleccionadas, bebidas y vegetales, de la información
proporcionada en el cuadro se desprende la importancia de las
frutas como principal fuente de antocianinas.
Algunas antocianinas muy estables, como las de uvas, col morada y
rábano, están aciladas, lo que permite que las antocianinas de
cáscara de uva y de jugo de col morada sean comercializadas como
colorantes de alimentos. (Badui, 2006).
Tabla 4. Color y distribución de antocianinas en algunas frutas y
vegetales
Fuente: Wang H. (1997) citado por Márquez (2011)
Componente
Color
Frutas y vegetales
Delfinidina
Rojo, azulado
Uva, mora, arándano, grosella
Cianidina
Anaranjado, rojo
Fresa, zarzamora, grosella,
cereza, col morada,
arándano, saúco, maíz, uva,
frambuesa, cebolla roja.
Pelargonidina
Anaranjado
Fresa, maíz morado
Malvidina
Rojo, azulado
Uva, mora, arándano
Peonidina
Rojo
Cereza, arándano, camote
morado, ciruela
20
2.4.3 Propiedades funcionales de las Antocianinas
Gui-Fang et al. (2010) Citado en Aguilera et al. (2011) señalan
que las antocianinas son compuestos considerados
fisiológicamente activos y/o promotores de la salud. Ejercen
efectos terapéuticos conocidos que incluyen la reducción de la
enfermedad coronaria, efectos anticancerígenos, antitumorales,
antiinflamatorios y antidiabéticos; además del mejoramiento de la
agudeza visual y del comportamiento cognitivo. Los efectos
terapéuticos de las antocianinas están relacionados con su
actividad antioxidante.
Tabla 5. Contenido de antocianinas totales en frutas y vegetales comunes
Alimento
Contenido de
antocianinas
totales*
Manzana 83 - 326 Bilberry
300 - 320
Mora 83 - 326
Grosella negra 130 - 400
Mirtillo 25 - 495
Col roja 25
Cereza 450
Arándano 60 - 200
Saúco Uvas 450 - 600
Kiwi 100
Cebollas rojas 7- 21
Ciruela 2 – 25
Rábanos rojos 1 – 60
Frambuesa negra 300 - 400
Frambuesa roja 20 – 60
Fresas 15 – 35
21
Trandescantia paluda (hojas)
120
Papa pulpa morada 240
Camote pulpa morada (d) 100 - 430 (d)
Judías secas 10 - 100
Ruibarbo 200
Melocotón 1 – 12
Fuente: Burin, B. (2010), citado por Márquez (2011) *Todos los valores expresados en mg/100 g peso fresco
excepto (d) expresado en mg/100 g peso seco.
Kowalczyk et al. (2003), Citado en Quispe (2012), compararon las
propiedades antioxidantes de las antocianinas con antioxidantes
ampliamente conocidos y encontraron que éstas tuvieron más alta
actividad antioxidante que la vitamina E (α-tocoferol), ácido
ascórbico y β-caroteno.
Las antocianinas son conocidas por ser efectivos en la eliminación
de radicales libres, lo cual ha sido demostrado in vitro a través de
ensayos como el método ORAC (Oxygen radical absorbing
capacity). Un elevado número de investigadores han reportado
una alta correlación lineal entre el contenido total de antocianinas y
valores ORAC, Moyer et al. ( 2002) y Wang et al. (1997)
estudiaron el efecto de la glicosilación y la variación en la
estructura del anillo B de la antocianina en los valores de ORAC,
encontrando que la estructura del anillo B tiene un marcado efecto
en la actividad antioxidante, la ortho-hidroxilación y metoxilación
incrementa sustancialmente la actividad antioxidante. Además
señalan que las antocianidinas tienen más altos valores de ORAC
que sus correspondientes glícosidos, lo cual explicaría porque los
aglicones son muy inestables y altamente reactivos.
22
2.4.4 Principales Factores que influyen a la antocianina
Los pigmentos de antocianinas son relativamente inestables y la
mayor estabilidad se presenta en condiciones acidas. Tanto el
tono del pigmento como su estabilidad se ven influenciados por los
sustituyentes en el aglicon. La degradación de antocianinas se
produce no sólo durante la extracción del tejido vegetal, sino
también durante el procesamiento y almacenamiento de los
alimentos que las contienen, esto limita su efectiva aplicación
como colorantes. El conocimiento de la química de las
antocianinas se puede utilizar para minimizar su degradación
mediante la adecuada selección de los procesos y por selección
de los pigmentos de antocianina que sean más adecuados para la
aplicación que se desee (Fennema, 2000).
Los principales factores que gobiernan la degradación de las
antocianinas son: su conformación química, el pH, la temperatura,
la concentración de oxígeno, luz. Aquellos factores que tienen
menos importancia son: la presencia de enzimas degradativas,
ácido ascórbico, dióxido de azufre, iones metálicos y azúcares
como se detalla.
a) Efectos estructurales
Las unidades glicosídicas y los grupos acilos unidos a la
aglicona y el sitio de su enlace tienen efecto significativo en
la estabilidad y reactividad de la molécula de antocianina.
También el patrón de sustitución de la antocianidina, el
número y posición de los grupos hidróxilos y metóxilos en el
aglicon afecta el comportamiento químico de la molécula del
pigmento (Rein, 2005).
23
Existen estudios discrepantes respecto al efecto de la
hidroxilación y metilación de las moléculas de antocianinas,
algunos estudios demuestran que el incremento de la
hidroxilación del aglicon estabiliza las antocianidinas por
ejemplo en un estudio realizado por Dao et al. (1998), citado
por Rein, (2005) se encontró que la delfinidina (2 grupos
hidroxilos) es más estable que cianidina (un grupo hidroxilo)
en metanol acidificado. En otra investigación conducida por
Cabrita et al. (2000). Encontraron que en una solución buffer a
pH 3.1 cianidina 3-glucósido fue más estable que
pelargonidina 3- glucósido pero la delfinidina 3 glucósido fue
menos estable que cianidina 3 glucósido, además que
encontraron petunidina 3- glucósido, la cual tiene un grupo
hidroxilo en el anillo B del ion flavilium fue menos estable que
peonidina 3-glucósido la cual no tiene un grupo hidroxilo en el
mismo anillo. Respecto a la metilación existen investigaciones
que demuestran que el incremento de la metilación de los
grupos hidroxilos disminuye la estabilidad de las antocianinas
(Mazza y Brouillard, 1987, Cabrita et al. 2000).
Por otro lado el patrón de hidroxilación y metoxilación influye
no solo en la estabilidad sino además en las tonalidades del
color de las antocianinas, al respecto Fennema (2000).
b) PH
La naturaleza iónica de las antocianinas permite los cambios
de estructura de la molécula de acuerdo al pH que
prevalece, resultando en diferentes colores y tonalidades,
además diferentes susceptibilidades a los factores
degradativos. En soluciones acuosas incluso en los alimentos
las antocianinas pueden existir en cuatro formas estructurales,
dependiendo del pH la base quinoidal azul, el catión flavilio
24
rojo (AH+), la base pseudocarbinol incolora y la chalcona
incolora (Fennema, 2000).
En un medio muy ácido (pH 0.5) el catión rojo flavilio es la
única especie en equilibrio presente. El incremento del pH
influye en el decrecimiento de la intensidad del color y la
concentración de catión flavilio debido a que es hidratado por el
ataque nucleofílico del agua por lo que la forma carbinol
incolora predomina. La forma carbinol ha perdido su doble
enlace conjugado entre los anillo A y B y por lo tanto no
absorbe la luz visible (Brouillard, 1982). También una pérdida
rápida de protones del catión flavilium toma lugar cuando el pH
se eleva más alto y aumentando la concentración de la forma
coloreada quinonoidal. Cuando el pH se eleva más la forma
carbinol rinde a través de la apertura del anillo la chalcona
incolora (Mazza y Brouillard, 1987).
En soluciones muy acidas (pH= 0.5) la especie AH+ de color
rojo, es la única que se encuentra en solución. Al aumentar el
pH, la concentración y el color de la antocianina disminuye,
según la especie AH+ 1) pierda un protón para formar la
forma quinoidal azul o 2) se hidrata para pasar a la base
carbinol incolora que después 3) se tautomeriza a una
chalcona. Como el porcentaje de base quinoidal es muy
pequeño frente al total a cualquier pH, las antocianinas tienen
poco color cuando el pH es superior a 4 (Dominic y Wong,
1989).
Por lo señalado la estabilidad de la antocianina es dependiente
del pH por el equilibrio de las cuatro formas, de las cuales el
catión flavilium AH+ es el más estable y la forma más
coloreada, por lo que si el pH no favorece la presencia de la
molécula en la forma catión flavilium las antocianinas son
susceptibles a la degradación.
25
Esto es debido a una deficiencia del núcleo del flavilio, estos
pigmentos funcionan como verdaderos indicadores de pH; es
decir, su color depende de las condiciones de acidez o
alcalinidad del sistema en que se encuentran: a pH ácido
adquiere una estructura estable del catión flavilio de color rojo,
representado por la fórmula (AH+); cuando se incrementa el pH,
la distribución electrónica se modifica hasta llegar a la forma
quinoidea azul (A) o base anhidra; tanto la sal del flavilio
como la base anhidra pueden convertirse a la base del
carbinol incolora (B) , que predomina en el intervalo de pH de 4
a 5 (Badui , 2006).
Figura 7. Estructura de la antocianina a diferentes pH’s
Fuente: Coultate (1984), citado en Garzón (2008)
26
Figura 8. Espectro de absorción del cianidín-3 ramnoglucósido en
soluciones tampón a pH 0,71-4,02. La concentración de pigmento es
1,6 x 102 g/L. Fuente: Fennema, 2000
c) Temperatura
La estabilidad de las antocianinas en los alimentos se ve
notablemente afectada por la temperatura. La velocidad de
degradación de la antocianinas se incrementa durante el
procesamiento y almacenamiento en tanto la temperatura
aumenta (Maccarone et al. 1985). La velocidad de
degradación frente a este factor también está influenciada por
la presencia de oxígeno, el pH y la conformación estructural.
En general las características estructurales que conducen a
un aumento de la estabilidad frente a cambios de pH también
llevan a la estabilidad térmica (Fennema, 2000).
Existen diversas teorías que explican el efecto de este factor
en la estabilidad de la antocianina pero el mecanismo preciso
no se ha esclarecido totalmente. Adam (1973) sugiere que la
elevación de la temperatura en soluciones de antocianinas a
pH 2-4 induce la pérdida de la mitad glicosil de la antocianina,
27
por hidrólisis, lo cual lleva a la pérdida del color desde que
los aglicones son menos estables que sus formas
glicosidicas. Otros autores postulan que el calor desplaza el
equilibrio hacia la chalcona (Markakis et al., 1957 y Adam,
1973) como primer paso. Eventualmente la degradación
térmica conduce a productos marrones, especialmente en
presencia de oxígeno. Fennema (2000) menciona que el
camarín 3,5 diglucósido es el producto común de la
degradación térmica de las antocianidinas (cianidina,
peonidina, delfinidina, petunidina y malvidina) 3,5 diglicósido,
menciona además que se han postulado tres posibles rutas
que explicarían la degradación térmica. En la primera el
catión flavilium primero se transforma en la base quinonoidal,
después en diversos intermediarios y finalmente en el
derivado cumarinico y un compuesto correspondiente al anilloB.
En la segunda ruta el catión flavilio primero se transforma
en la base carbinol incolora, después en chalcona y
finalmente en productos de degradación pardos. La tercera
ruta es similar excepto que los productos de degradación de
la chalcona se intercalan primero.
Badui, (2006) señala que su alta hidrosolubilidad de los los
pigmentos se pueden perder fácilmente por lixiviación en el
agua que se utiliza en los diferentes tratamientos; a medida
que aumenta la temperatura se acelera la decoloración de la
fruta, ya que se favorece tanto la extracción que incluso se
puede llegar a obtener productos prácticamente incoloros.
Las antocianidinas altamente hidrolizadas son menos
estables que las metiladas, glucosiladas o acetiladas
(Fennema, 2000).
28
Figura 9. Curva espectrofotométrica de la degradación de las antocianinas del jugo de uva durante el almacenamiento: (a) control sin calentar; (b) calentando a 99°C por 1 hora; (c) calentando a 99°C por 2 horas; (d) jugo de uva comercial.
Fuente: Badui (2006)
d) Luz
Las antocianinas preservan el color mantenidas en la
oscuridad y su vez se ha observado que los diglicósidos
acilados, metilados, son más estables que los diglicósidos no
acilados, los cuales a su vez son más estables que los
monoglicósidos, también se reportaron que diglucósidos
acilados presentes en vino fueron los más estables
seguidos por diglucósidos no acilados y monoglucósidos en
orden decreciente cuando fueron expuestos a la luz. Por lo
que las antocianinas sustituidas en los grupos hidroxilo C-5 son
más susceptibles a la fotodegradación que aquéllas que no
tienen sustituyentes en esta posición. (Fennema, 2000).
29
e) Oxígeno y ácido ascórbico
Según Nebesky et al. (1969) mencionado por Rein (2005)
señalan que la presencia de oxígeno junto con temperaturas
elevadas fue una de las combinaciones con efecto más severo
en el color dentro de los factores estudiados en jugos de
berries y antocianinas puras aisladas.
Al estudiar los cambios que experimentan los zumos de frutas
en el almacenamiento han comprobado que existe una pérdida
paralela de ácido ascórbico y de antocianinas y sugieren que
posiblemente hay una interacción entre los dos compuestos.
Esta interacción se debe a que las antocianinas al interactuar
con los peróxidos provenientes de la degradación de la
vitamina C se destruyen por lo que la oxidación del ácido
ascórbico puede implicar una pérdida de pigmentos.
(Braverman, 1980).
Por ello se recomienda el envasado de los productos en
atmósfera de nitrógeno eliminando al máximo el oxígeno del
espacio de cabeza (Yúfera, 1998).
2.5 Capacidad Antioxidante
El concepto básico de actividad antioxidante de varios compuestos
naturales y sintéticos comprende una transición redox mediante la cual
la molécula antioxidante dona un electrón o átomo de hidrogeno,
equivalente a la donación de un electrón y un H+ al radical libre R*
(Pineda, 1999).
La capacidad antioxidante de un alimento depende de la naturaleza y su
concentración.
La actividad antioxidante ha sido expresada en varias formas. Un modo
fácil de expresarlo es con un referente estándar el acido 6-hidroxi-
2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico, conocido como Trolox Prakash
30
(2001), citado por Villarroel (2008).
2.5.1 La oxidación y los agentes oxidantes
Químicamente la oxidación de un compuesto es la pérdida de
electrones, de hidrógenos o la ganancia de oxígeno en una
molécula. La reducción de un compuesto es exactamente lo
contrario; es decir, la ganancia de electrones, de hidrógenos o la
perdida de oxígeno. En tal sentido, un agente oxidante es una
molécula que se reduce al reaccionar con la molécula a la cual
oxida. Este par oxido-reductor es necesario químicamente y
esencial para entender la biología de las óxido-reducciones en el
organismo.
Las macromoléculas de importancia biológica (proteínas, ácidos
nucleicos, carbohidratos y lípidos) son moléculas nucleofílicas que
tienen electrones susceptibles de compartir, es decir, tienen
electrones en orbitales superficiales que pueden ser capturados
(oxidación) o compartidos en una reacción nucleofílica para formar
compuestos o aductos. Los oxidantes son compuestos
electrofílicos especies que tienen avidez por los electrones y que
tienen afinidad para reaccionar con macromoléculas nucleofílicas,
muchas de ellas de la mayor importancia biológica. Cervantes
(2005) citado por Quintanar y Calderón (2009).
Las especies reactivas de oxígeno (ERO) y nitrógeno (ERN), son
un subgrupo de moléculas oxidantes, que como su nombre lo
indica son altamente reactivas. Otro subgrupo son los radicales
libres que no solo tienen alta reactividad y capacidad oxidativa, sino
que adicionalmente pueden generar reacciones oxidativas en
cadena.
2.5.2 Los radicales libres
En forma general, un radical libre es un átomo o molécula que tiene
uno o más electrones desapareados en sus orbitales externos y es
31
capaz de tener una existencia independiente; sin embargo, es muy
reactivo ya que tiende a reducirse, es decir, sustrae un electrón de
átomos o moléculas estables, a las cuales oxida, con el fin de
alcanzar su propia estabilidad. Una vez que el radical libre ha
conseguido el electrón que necesita para aparear a su electrón
libre, la molécula estable que pierde el electrón se oxida y deja a
otro electrón desapareado, lo que la convierte a su vez en un
radical libre, iniciándose y después propagándose de la misma
manera, generando así una reacción en cadena. Hansberg (2002)
citado por Quintanar y Calderón (2009).
2.5.3 Tipos de radicales libres
Los radicales libres de importancia biológica pueden clasificarse
como:
1. Especies reactivas de oxígeno (ERO).
Las principales son el oxígeno molecular (O2), el ozono (O3) y el
oxígeno en singulete (O2), así como las especies de oxígeno que
están parcialmente reducidas; esto es, el anión superóxido (O2) el
peróxido de hidrógeno (H2O2), hidroperoxilo (HO2) y el radical
hidroxilo (OH). Estas especies son producto de la ruptura o de la
excitación del O2 y son más reactivos que el O2 en su estado basal.
El peróxido de hidrógeno, no es un radical libre pero está
estrechamente relacionado con la producción de radicales porque
es el principal precursor del radical hidroxilo. Estas ERO son
moléculas altamente reactivas que atacan constantemente al
organismo mediante reacciones bioquímicas de óxido-reducción,
que ocurren como parte normal del metabolismo celular o por
factores patológicos.
2. Metales de transición
Los elementos de la tabla periódica (Fe, Mn, Co, Ni y Cu)
pertenecen a los llamados metales de transición, tienen la
32
característica de llegar a ser estables por si mismos sin necesidad
de reaccionar con otro elemento, esto es, cuando a su último nivel
de energía le faltan electrones para estar completo los utiliza de los
niveles o subniveles internos, con lo cual logra su estabilidad, la
falta de electrones en el nivel de donde los transfirió se compensa
con otros electrones de otro nivel o subnivel, y así sucesivamente:
a este fenómeno se le llama transición electrónica. La mayoría de
los metales de transición tienen electrones desapareados y
precisamente gracias a esta transición pueden existir en forma de
radical libre.
3. Otros radicales libres.
Entre los que se encuentran los radicales libres de nitrógeno; tales
como, el óxido nítrico (NO) y el dióxido nítrico (NO2). El NO es un
radical muy reactivo y de importancia fisiológica puede oxidar y
dañar, pero es esencial en funciones biológicas complejas como
son la neurotransmisión y neurorregulación del sistema nervioso,
así como en procesos de agregación plaquetaria y coagulación
sanguínea, con el O2 genera NO2 y con el O2 forma peroxinitrito
(ONOO-). Este tipo de ERN son capaces de generar daño oxidativo
y muerte celular. Existen otros radicales libres que tienen diferente
naturaleza como el ión hipoclorito (ClO) y el radical triclorometilo
(CCl3) este último producido durante el metabolismo del CCl4 por el
citocromo.
La reactividad química de los diferentes tipos de radicales libres es
variable pero siempre elevada y de baja especificidad. La vida
media biológica del radical libre es de no más de microsegundos,
ya que puede reaccionar rápidamente con todo lo que esté a su
alrededor, pudiendo provocar un gran daño a macromoléculas y a
estructuras supramoleculares como las membranas. Rendón
(2005) citado en Quintanar y Calderón (2009).
33
2.5.4 Capacidad antioxidante de frutas y vegetales
En los últimos tiempos, ha existido un creciente interesen el estudio
de ciertas frutas y vegetales con alto poder antioxidante para
potenciar su consumo debido a su efecto positivo en la prevención
de ciertas enfermedades crónicas como el cáncer y enfermedades
cardiovasculares. (Rodrigo-García, 2006)
El efecto protector de los alimentos de origen vegetal se atribuye a
diversos nutrientes y fotoquímicos con actividad antioxidante.
(Pineda, 1999). Los extractos vegetales frescos muestran un efecto
antioxidante diferente y su actividad depende de la naturaleza y
concentración de los antioxidantes naturales presentes en el
alimento. (Pineda, 1999).
La actividad antioxidante de los compuestos fenólicos depende del
número y de la posición de los grupos hidroxilos, de la cantidad de
electrones donadores que contenga el anillo estructural, y de la
capacidad que tiene el grupo aromático de resistir el
desapareamiento de electrones (Kuskoski et al., 2005; Citado en
Almeida, 2012).
Tabla 6. Capacidad Antioxidante en Frutas
Frutas Total Capacidad antioxidante ORAC
(µmol eq-Trolox/g de muestra)
Base Humedad Bases Seca
Fresa 15.36 153.6
Ciruela 9.49 79.1
Naranja 7.50 51.7
Kiwi 6.02 36.5
Manzana 2.18 13.2
Tomate 1.89 7.8
34
Pera 1.34 9.6
Melón 0.97 12.9
Fuente: Cao (1996) citado en Villarroel (2008) eq-Trolox, equivalente trolox.
Tabla 7. Capacidad Antioxidante en Vegetales
Vegetales
Total
Capacidad
antioxidante
Base Seca
Ajos 23.2
Col 14.5
Brocoli 12.9
Remolacha 11.7
Maiz 7.2
Papa 4.6
Zanahoria 3.4
Apio 1.1
Expresado en (µmol eq-Trolox/g de muestra) Fuente: Cao (1996) citado en Villarroel (2008)
2.5.5 Métodos para evaluar la capacidad antioxidante
La actividad antioxidante de los frutos puede evaluarse in vitro e in
vivo por medio de experimentos sencillos. Con base a las
reacciones químicas involucradas, pueden dividirse en dos
categorías: ensayos basados en la transferencia de un átomo de
hidrógeno y ensayos basados en la transferencia de electrones
como se detalla en la Tabla N° 08.
Los métodos de transferencia de un átomo de hidrógeno están
basados en reacciones donde el antioxidante y el sustrato
compiten por el radical libre sintético, una molécula oxidable y un
35
antioxidante. Los métodos basados en la transferencia de un
electrón involucran una reacción de oxidación con el antioxidante
que es un indicador del punto final de la misma.
Las condiciones para el empleo de los métodos de transferencia de
electrón como el ABTS (ácido 2,2’azino-bis(6-sulfonato-3-
Etilbenzotiazolina)) y DPPH (α,α-difenil-β-picrilhidrazilo), pueden
variar de alguna u otra forma, (por ejemplo, el pH de los solventes
y la longitud de onda a la que se mide), dando diferentes
resultados. Sin embargo, son muy útiles para evaluar la actividad
antioxidante de sustancias y alimentos que los contienen. Estos
métodos pueden servir para evaluar si un proceso de
elaboración de un alimento influye sobre la actividad antioxidante,
además puede ser un indicativo del potencial antioxidante para su
consumo (Villarroel, 2008).
Tabla 8 . Clasificación de los métodos para evaluar la actividad
antioxidante de acuerdo a las reacciones involucradas
Mecanismo
Método
Transferencia de
hidrogeno
a. TRAP (del ingles total radical trapping antioxidant parameter)
b. ORAC (del inglés Oxygen Radical Absórbanse Capacity)
c. Inhibición de la oxidación de las LDL (Low- density lipoprotein)
Transferencia de
un electron
a. TEAC (del ingles Trolox
equivalent antioxidant capacity)
b. ABTS (ácido 2,2’azinobis (6-
sulfonato-3- etilbenzotiazolina))
c. FRAP (del ingles ferric-reducing
antioxidant power)
d. DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo)
Fuente: Huang et al, (2005) Citado en Leyva (2009).
36
El método propuesto por Brand-Williams et al. (1995), citado en
Leyva (2009) método de DPPH• (2,2-difenil-1-picrilhidracilo), nos
permite evaluar la actividad de sustancias frente al radical libre
estable 2,2-difenil-1- picrilhidracilo (DPPH•), en una solución
metanólica que tiene un color violeta intenso que se pierde
progresivamente cuando se añade la muestra que contiene
antioxidantes. La decoloración del radical se determina a 517 nm
y la cuantificación se realiza por lo general empleando soluciones
patrón de Trolox. Este método es probablemente más eficiente
que el método ABTS en reacción con donadores de átomos de
hidrógeno. Sin embargo, el DPPH no reacciona con flavonoides
que no contenga grupos –OH en el anillo B al igual que con los
ácidos aromáticos que sólo contiene un grupo - OH (Roginsky y
Lissi, 2005; citado en Leyva, 2009). Pese a sus limitaciones, es
un método adecuado para medir la actividad antioxidante en
alimentos y extractos vegetales, mientras que no es adecuado
para la determinación de la capacidad antioxidante del plasma o
suero, ya que las proteínas precipitan con el metanol del medio de
reacción.
Los métodos para evaluar la capacidad antioxidante (CAOX)
pueden ser in vitro o in vivo. Una de las estrategias más
aplicadas en las medidas in vitro de la capacidad antioxidante
total de un compuesto, mezcla o alimento, consiste en
determinar la capacidad del antioxidante frente a sustancias
cromógenas de naturaleza radical; la pérdida de color ocurre de
forma proporcional con la concentración (Arena et al., 2001,
citados por Kuskoski et al., 2005). No obstante, las
determinaciones de la capacidad antioxidante realizadas in vitro
nos dan tan sólo una idea aproximada de lo que ocurre en
situaciones complejas in vivo.
37
Entre los métodos más aplicados para la determinación de la
CAOX están el ABTS y DPPH. Ambos presentan una excelente
estabilidad en ciertas condiciones, aunque también muestran
diferencias. El DPPH es un radical libre que puede obtenerse
directamente sin una preparación previa, mientras que el ABTS
tiene que ser generado tras una reacción que puede ser química
(dióxido de manganeso, persulfato potasio). (Arnao, 2000
citado en Kuskoski et al., 2005).
2.6 Determinación de las antocianinas
Existen distintas formas para determinar antocianinas ya sea en
forma total o en forma separada cada antocianina. Si se quiere
establecer las antocianinas en forma general muchos autores de
diversos estudios utilizan el método de pH diferencial. Pero si se
desea determinar las antocianinas en forma separada se recomienda
utilizar cromatografía. (Rebolledo, 2007. Citado en Cano, 2011).
2.6.1 Determinación de antocianinas de forma total.
La forma más utilizada para determinar antocianinas en forma total
es la basada en diferencial de pH. El contenido total de
antocianinas en extractos crudos que contiene otros materiales
fenólicos, que son determinadas por mediciones de absorción de
la solución a una determinada longitud de onda. Esto es posible
porque las antocianinas tienen una típica banda de absorción
entre 490 y 550 nm en la región del espectro visible. Esta banda
está lejos de la banda de absorción de otros fenoles, y tiene un
máximo espectro en el rango UV. En muchas instancias, sin
embargo, este simple método es inapropiado por la interferencia de
productos de degradación de antocianinas o melanoidinas de
38
reacciones de pardeamiento. En ambos casos, el acercamiento
debe ser usado para diferenciar y/o métodos sustractivos para
cuantificar antocianinas y su producto de degradación. (Rebolledo,
2007. Citado en Cano, 2011).
2.7 Solventes
Las disoluciones o soluciones son sistemas formados de dos
componenetes: el disolvente y el soluto. Suele denominarse disolvente
al componente más abundante y soluto al que se halla en menor
cantidad. (Oceano, 1995).
Un disolvente o solvente es una sustancia que permite la dispersión de
otra sustancia en esta a nivel molecular o iónico. Es el medio
dispersantes de la disolución. Normalmente, el disolvente establece el
estado físico de la disolución, por lo que se dice que el disolvente es el
componente de una disolución que está en el mismo estado físico que
la misma. Usualmente, también es el componente que se encuentra en
mayor proporción. (De.quimica, 2014).
Un buen solvente debe ser selectivo y con viscosidad suficientemente
baja para que pueda circular libremente, la concentración del soluto
aumentará y la relación de extracción disminuirá progresivamente
debido a que la gradiente de concentración se va reduciendo; y por lo
que la solución se hace más viscosa. (Chiboga y Francis, 1970 citado
en Medina, 2012)
Escoger el solvente adecuado es uno de los factores más importantes
en la obtención de extractos con alto contenido de compuestos
bioactivos. En general las formas agliconas altamente hidroxiladas de
los compuestos fenólicos son solubles en solventes tales como el
etanol, metanol y agua. Los solventes tales como acetato de etilo,
acetona y cloroformo se utilizan para los menos polares y altamente
metoxiladas (muy comunes en la piel de las frutas). (González-
Montelongo et al., 2010 citado en Paulino et al., 2013).
39
Las antocianinas son compuestos solubles en solventes polares y
comúnmente se extraen de sus fuentes naturales usando metanol o
etanol con pocas cantidades de algunos ácidos como ácido clorhídrico,
acético y fórmico, ya que el ácido mantiene el pH ácido lo que previene
el desplazamiento de los equilibrios químicos de hidratación y formación
de chalconas. Adicionalmente el uso de ácidos débiles previene la
degradación de las antocianinas no aciladas las cuales presentan
mayor labilidad. Sin embargo, durante el proceso de evaporación del
solvente acidificado puede ocurrir degradación de las antocianinas
aciladas, por la hidrólisis parcial o total de los ácidos enlazados a los
azúcares, especialmente en antocianinas aciladas con ácidos
dicarboxilicos como el ácido malónico. (Santacruz, 2011).
En relación a la extracción de estos pigmentos, (Rodríguez y Wrolstad,
1999 citado en Santacruz, 2011), señalan que el carácter polar de la
molécula de antocianina permite su solubilidad en variados solventes,
tales como alcoholes, acetona y agua. La elección del método de
extracción debe maximizar la recuperación de pigmentos con una
mínima cantidad de solventes y una degradación o alteración mínima
del estado natural. Dentro de los métodos más utilizados están la
extracción con metanol y la extracción con acetona y cloroformo.
El solvente escogido debe ser altamente selectivo, de baja viscosidad
que circule libremente, pero conforme la extracción trascurra, la
cantidad de soluto aumentara y el gradiente de concentración
disminuye, incrementando progresivamente la viscosidad.
Generalmente se utiliza etanol para la extracción de los principios
activos de las plantas, sin embargo el agua es considerada el solvente
universal por su capacidad de extracción en fase sólido-líquido. (Ullauri,
2010 citado en Almeida, 2012)
A. Polaridad de un disolvente
Las moléculas de líquidos que presentan dipolos permanentes,
presentan fuerzas intermoleculares más intensas. Estas dificultan o
40
incluso impiden la libre rotación de las moléculas, pues las elevadas
interacciones moleculares conducen a una asociación más o menos
estable de las moléculas vecinas. Una forma muy importante y
frecuente entre los alimentos son los enlaces mediante puentes de
hidrogeno de los dipolos.
Este efecto sobre la viscosidad es aún más intenso cuando la
asociación se extiende a un mayor número de moléculas. (Horst et
al., 2001)
La polaridad de un disolvente al parámetro que mide su polaridad y
le confiere propiedades de solubilización de diferentes solutos. En
general, las reacciones químicas tienen lugar en fase homogénea,
ya que, para que dos especies entren en contacto, deben estar en
la misma fase. En disolución, las especies reactivas gozan de
mayor libertad de movimiento y se difunden en el volumen total del
disolvente, aumentando así la probabilidad de colisión entre ellas.
El disolvente debe actuar sobre el soluto solvatándolo y venciendo
las fuerzas intermoleculares que lo mantienen unido, pero sin dar
lugar a la reacción. En función de la naturaleza del soluto y del
disolvente, las fuerzas de solvatación entre ambos pueden ser de
diferentes tipos: puentes de hidrógeno, interacciones polares y
fuerzas de London.
El disolvente idóneo suele tener unas características químicas y
estructurales similares a las del compuesto a disolver. La polaridad
y, consecuentemente, la solubilidad de los compuestos orgánicos
en disolventes polares, aumenta con la disminución de la longitud
de la cadena hidrocarbonada, la presencia de grupos funcionales
polares y la capacidad de formación de puentes de hidrógeno con el
disolvente. (Wikipedia, 2014)
B. Constante dieléctrica
La constante dieléctrica y el momento dipolar son propiedades
complementarias de una sustancia. Con frecuencia se utilizan
41
ambas constantes físicas para caracterizar su polaridad, aunque el
momento dipolar no representa la polaridad de un disolvente.
Cuando se quiere decir que una molécula es polar, se quiere decir
que tiene un elevado momento dipolar. Sin embargo, cuando se
dice que un disolvente es polar, significa que tiene una elevada
constante dieléctrica. En otras palabras, la polaridad de un
disolvente o constante dieléctrica, es una propiedad macroscópica
(a nivel macroscópico), mientras que la polaridad molecular o
momento dipolar es una propiedad de moléculas aisladas.
(Wikipedia, 2014)
C. Polaridad de enlace
Cuando dos átomos están unidos por un enlace covalente, el par de
electrones compartido puede ser atraído por igual por ambos
átomos, o puede ocurrir que uno de ellos lo atraiga más fuertemente
que el otro. Si ocurre lo primero, el centro de cargas positivas
coincide con el de negativas y el enlace no está polarizado. Pero si
el par de electrones no es atraído por igual por ambos núcleos, se
situará más próximo a uno de ellos y entonces los centros de las
cargas positiva y negativa no coincidirán y un extremo del enlace
tendrá un exceso de carga negativa y el otro extremo un defecto.
Habrá un centro o polo positivo y un centro o polo negativo y el
enlace estará polarizado.
La polaridad de los enlaces se debe a la electronegatividad
característica de cada átomo, que fue definida por Pauling como la
capacidad de cada átomo dentro de cada molécula para atraer los
pares de electrones hacia sí. Cuanto mayor sea la diferencia de
electronegatividad de dos átomos enlazados, mayor será la
polaridad del enlace entre ambos. Los átomos con distinta
electronegatividad presentan la densidad electrónica desplazada
hacia el átomo más electronegativo. (Wikipedia, 2014).
42
2.7.1 Propiedades de los solventes
2.7.1.1 Metanol
Alcohol metílico llamado también metanol o “espítiritu de la
madera” debido a la obtención de la destilación pirogenada
de la madera, líquido incolora muy móvil y volátil. Es un
líquido tóxico, ataca al nervio óptico causando ceguera. Es
considerada un solvente polar prótico (tiene la capacidad de
formar puentes de hidrógeno), es muy buen solvente de
sutancias hidrofílicas. Las propiedades físicas más
relevantes del metanol, en condiciones normales de presión
y temperatura se muestran en la siguiente
El metanol y el agua tienen propiedades semejantes debido
a que ambos tienen grupos hidroxilo que pueden formar
puente de hidrógeno. El metanol forma puente de hidrógeno
con el agua y por lo tanto es miscible (soluble en todas las
proporciones) en este solvente. Igualmente el metanol es
muy buen solvente de sustancias polares. (Wikipedia, 2014)
2.7.1.2 Etanol
El Etanol o alcohol etílico es un compuesto líquido,
incoloro, volátil, inflamable y soluble en agua cuyas
moléculas se componen de carbono, hidrógeno e hidróxilos
(CH3-CH2-OH).
El Etanol se produce a partir de 3
principales materias primas que son la sacarosa, almidón y
celulosa. El etanol, como ya hemos mencionado, es un
líquido incoloro, y altamente volátil, que está presente en la
mayoría de las bebidas fermentadas. Desde antaño se
producía etanol a través de la fermentación anaeróbica y
posterior destilación de las disoluciones que contenían en
su composición azúcar y levadura. (Wikipedia, 2014 y
Negrillo, 2014).
43
2.7.1.3 Agua
El agua es el disolvente universal, disuelve sales y
sustancias iónicas. También disuelve muchas otras
sustancias no iónicas pero con carácter polar, como
azúcares, alcoholes, aldehídos, cetonas y otros, cuyos
grupos carbonilos, aminos, hidroxilos y carboxilos
interaccionan con las moléculas de agua por medio de
puentes de hidrógeno (Badui, 2006).
Considerada el solvente universal, es de carácter polar
excelente solvente para solutos polares e iónicos, que se
denominan hidrofílicas.
La disolución de sólidos (sales) esta favorecida por
reacciones acido-.base, las reacciones de oxidación-
reducción, la hidratación y la hidrólisis. La velocidad de
disolución depende de factores, tales como la
concentración real en el agua, la superficie de contacto que
aumenta al triturar y al mezclar, la agitación, el tiempo y la
temperatura puesto que a mayor temperatura, mayor
velocidad de disolución. (Franco, 2014).
Tabla 9. Propiedades Químicas Generales
Propiedad Agua Etanol Metanol
Formula H2O CH3-CH2-OH (CH4O)
Peso molecular 18,16 g/mol 46.07 g/mol 32,04 g/mol
Temperatura crítica 374,1°C 241 °C -
Punto de ebullición 100°C 78 °C 65 °C
Punto de fusión 0°C -114 °C -97 °C
Densidad a 4°C 1 kg/m3 789 Kg /m3 791,8 kg/m3
Viscosidad 1,0020 cP a
20 °C
1.074 mPa·s
a 20 °C
0,59 mPa·s a
20 °C
Fuente: Wikipedia, (2011)
44
III. MATERIALES Y METODOS
3.1 Lugar de ejecución
El presente trabajo de investigación se llevó a cabo en los siguientes
laboratorios:
- Laboratorio de Análisis Instrumental –Universidad Nacional del Centro
del Perú
- Laboratorio de Control de calidad – Universidad Nacional del Centro del
Perú.
3.2 Materia Prima
- Pétalos de flores de mastuerzo (Tropaeolum majus L.) de color
anaranjado.
- Procedencia: Estación experimental El Mantaro – Universidad Nacional
del Centro del Perú.
3.3 Materiales y Equipos
3.3.1 Equipos
- Balanza analítica Marca Ohaus, capacidad max. 300 g
- Baño maría termo regulable Marca Thermostatic wáter bath
- Centrífuga
- Cocinilla eléctrica
45
- Espectrofotómetro Marca Shimatzu
- Estufa Marca WSU 200
- Mufla Marca 6000 Fumace Thermolyne
- Vortex Marca Heidoph reax Control
3.3.2 Materiales
Baguetas de vidrio, Campanas desecadora de vidrio, Cápsulas
de porcelana, Crisoles de porcelona, Celdas de cuarzo,
Embudos de vidrio, Fiolas de diferentes graduaciones, Frascos
ambar, Gradillas, Lunas de reloj, Micropipetas, Matraces de
diferentes graduaciones, Mortero, Papel filtro, Pinza metálica,
Picetas, Probetas de diferentes graduaciones, Termómetro,
Tubos de ensayo, Rejillas de asbestos, Tubos de centrífuga, y
Vasos de precipitación.
3.3.3 Reactivos
- Ácido clorhídrico al 37% q. p.
- Acetona
- Metanol 98%
- Agua destilada
- Carbonato de sodio al 99.8% q. p.
- Folin Ciocalteau 0.2 N
- Hidroxido de sodio al 99.8% q. p.
- Hexano 96.8 % q. p.
- α,α-difenil-β-picrilhidrazilo (DPPH)
46
3.4 Metodología
3.4.1 Análisis Fisicoquímico de las flor de mastuerzo
a) pH: método potenciométrico recomendado por la AOAC
(1990).
Para la cuantificación del PH Se utilizó el método potenciométrico,
previamente calibrado el potenciómetro a Ph de 4.0 y de 7.0 con
soluciones Buffers.
b) Evaluación de Antocianinas Totales Monoméricas
Método del pH diferencial recomendado por Fuleki y Francis
(1968) modificado por Giusti y Wrolstad (2001) y citado en Gil
(2008).
El principio del método se basa en el cambio reversible del color
con el pH, de los pigmentos monomérícos antocianina. La forma
coloreada oxonium (catión flavilium) existe a pH 1,0 y la forma
hemicetal incolora (pseudo-base carbinol) predomina a pH 4,5. La
diferencia de absorbancia de estos pigmentos a 520 nm y 700 nm
es proporcional a la concentración del pigmento en la solución.
(Anexo 5)
c) Capacidad antioxidante
Se determinó utilizando el método basado en la reducción del
radical libre estable 2,2, difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). Las
sustancias antioxidantes de las pulpas reaccionan con el DPPH y la
reducción del reactivo es seguida midiendo la disminución de la
absorbancia a 517 nm. Los resultados se expresan como μmol de
trolox Equivalente/g. en base húmeda metodología propuesta por
(Brand Williams et al. 1995, Citado en Quispe, 2012). (Anexo 6)
47
3.4.2 Método experimental
Para la extracción de antocianinas se realizaron los siguientes
procedimientos.
A. Acondicionamiento de la materia prima
A.1 Materia Prima
Se emplearon flores de Mastuerzo de la Estación
experimental El Mantaro – Universidad Nacional del
Centro del Perú
A.2 Lavado
En esta operación se eliminaron partículas extrañas y
pedúnculos de las flores y se sumergió en agua clorada
al 0.1%.
A.3 Secado
Se colocaron solo los pétalos de la flor de Mastuerzo en
bandejas de madera con el objetivo que se sequen, a
temperatura ambiente de la ciudad de Huancayo-
Departamento de Junín (18°C a 22°C) por 3 min y con
una humedad aproximada de 44% y bajo sombra.
B. Molienda
Se realizó el licuado de los pétalos de Mastuerzo seco con el
solvente (Metanol, Etanol y Agua) a una proporción del 10%,
obteniéndose un extracto.
C. Macerado
Se realizó el macerado por 24 horas a una temperatura de
5°C.
D. Centrifugado
Se llevó a centrifugar por un tiempo de 20 min hasta obtener
el líquido sobrenadante.
E. Envasado
48
Figura 10: Diagrama de flujo para la obtención de antocianinas de
flores de Mastuerzo.
LAVADO
SECADO
MOLIENDA
MACERADO
CENTRIFUGADO
ENVASADO
CUANTIFICACION DE
ANTOCIANINAS
SOBRENADANTE
- Eliminación de Partículas - Sumergido en agua clorada
al 0.1% x 3 min
- T° Ambiente (18°C-22°C) - HR= 44% Aprox.
EXTRACTO
- Pétalos: Metanol (1:10) - Pétalos: Etanol (1:10) - Pétalos: Agua (1:10)
Por 24 horas a 5°C
MATERIA PRIMA
49
3.4.3 Evaluación de la estabilidad del extracto acuoso del colorante de
pétalos de mastuerzo frente al tratamiento térmico
Método recomendado por Morales (2007). Se prepararon los extractos
acuosos de colorante de pétalos de mastuerzo, y se regulò a pH de 3, 4 y 5
con HCl 0,25 N y NaOH 2% . Los extractos fueron distribuidos en tubos de
ensayo herméticos de 25 mL. Los tubos de ensayo fueron cubiertos con
papel aluminio y los extractos asì acondicionados fueron sometidos a
tratamiento tèrmico a una temperatura de ebullición (89 °C) por un periodo
de 60 minutos. Se tomaron muestras a 0, 15, 30, 45 y 60 minutos
3.4.4 Evaluación de la estabilidad del extracto acuoso del colorante de
pétalos de mastuerzo frente al almacenamiento
Método recomendado por Morales (2007). Se prepararon los extractos
regulando el pH de los extractos a 3, 4 y 5 con HCl 0,25 N y NaOH 2%.Los
extractos se distribuyeron en tubos de vidrio con tapa y cerrados
herméticamente. Los extractos así acondicionados se almacenaron a 4 °C y
25 °C por un periodo de 30 días. Se tomaron muestras cada 5 días.
50
3.5 Diseño experimental
3.5.1 Para la evaluación del tipo de solvente en el rendimiento de
Antocianinas
SOLVENTE 1: METANOL: HCl (0.01%)
SOLVENTE 2: AGUA: HCl (0.01%)
SOLVENTE 3: ETANOL: HCl (0.01%)
SOLVENTE 4: ETANOL: AC CÍTRICO (0.01%)
SOLVENTE 5: ETANOL: AC ASCÓRBICO (0.01%)
El diseño estadístico aplicado fue el Diseño Completamente al azar para la
evaluación del tipo de solvente en el rendimiento de antocianinas
El análisis estadístico se realizó utilizando el software Minitab.
PETALOS DE FLORES DE MASTUERZO
SOLVENTE 2 SOLVENTE 3 SOLVENTE 4 SOLVENTE 1 SOLVENTE 5
REPET. 1
REPET. 2
REPET. 3
REPET. 1
REPET. 2
REPET. 3
REPET. 1
REPET. 2
REPET. 3
REPET. 1
REPET. 2
REPET. 3
REPET. 1
REPET. 2
REPET. 3
51
3.5.2 Evaluación de la estabilidad del extracto acuoso del colorante de
pétalos de mastuerzo frente al tratamiento térmico
Los extractos acuosos se someterán a temperatura de ebullición a 3 pH por
un tiempo de 60 minutos tomando muestras cada 15 minutos.
t1 t2 t3 t4 t5 t1 t2 t3 t4 t5 t1 t2 t3 t4 t5
Datos:
pH1 = 3
pH2 = 4
pH3 = 5
t1=0 min
t2=15 min
t3=30 min
t4=45 min
t5=60 min
Se evaluó la cantidad final de antocianinas después de los 60 minutos.
EXTRACTO DE PETALOS DE
MASTUERZO
pH1 pH2 pH3
52
3.5.3 Evaluación de la estabilidad del extracto acuoso del colorante
de pétalos de Mastuerzo frente al almacenamiento.
Datos:
El extracto de Mastuerzo se Almaceno a 2 diferentes temperaturas.
T1= 4°C
T2= 24°C (Baño maria)
pH1 = 3
pH2 = 4
pH3 = 5
(Con repetición de 3 pHs)
El diseño estadístico aplicado fue el diseño completamente al azar o
también llamado análisis de varianza de dos factores con repetición y con
arreglo factorial 2x3x3.
El análisis estadístico se realizó utilizando el software Minitab
EXTRACTO DE PETALOS DE
MASTUERZO
T1 T2
PH2 PH1 PH3 PH2 PH1 PH3
53
3.5.4 Evaluación de la capacidad antioxidante frente al
almacenamiento
Datos:
El extracto de Mastuerzo se Almaceno a 2 diferentes temperaturas.
T1= 4°C
T2= 24°C (Baño maría)
pH1 = 3
pH2 = 4
pH3 = 5
(Con repetición de 3 pHs)
El diseño estadístico aplicado fue el diseño completamente al azar o también
llamado análisis de varianza de dos factores con repetición y con arreglo
factorial 2x3x3.
El análisis estadístico se realizó utilizando el software Minitab.
EXTRACTO DE PETALOS DE
MASTUERZO
T1 T2
PH2 PH1 PH3 PH2 PH1 PH3
54
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Evaluación del solvente en el rendimiento de antocianinas
Se evaluaron cinco tipos de solventes extractores teniendo como base el
metanol acidificado con ácido clorhídrico, etanol acidificado con ácido
clorhídrico, ácido ascórbico y ácido cítrico y agua acidificada con ácido
clorhídrico al 0,01%.
Tabla 10. Rendimiento de antocianinas con tipos de solvente.
Solvente Rendimiento
(mg/100mL)
METANOL:HCl (0.01%) 63,07±0.10
AGUA:HCl (0.01%) 43,47 ±0.34
ETANOL:HCl (0.01%) 62,90 ±0.10
ETANOL:AC CITRICO (0.01%) 60,34 ±0.19
ETANOL: AC ASCORBICO (0.01%) 58,06 ±0.39
55
Figura 11. Extracción de Antocianinas según el Solvente
Los resultados que se muestran en la figura 11 muestran un mayor
rendimiento de contenido de antocianinas en la extracción con metanol:
ácido clorhídrico, seguido de etanol ácido: clorhídrico y etanol: ácido cítrico.
.
(Rodríguez y Wolstrad, 1999 citado en Santacruz, 2011), señalan que el
carácter polar de la molécula de antocianina permite su solubilidad en
variados solventes, tales como alcoholes y agua. Por ello se trabajó con
metanol. Etanol y agua, cuyas moléculas interaccionan con los grupos
hidroxilo de la cianidina, formando puentes de hidrógeno (Del Carpio et al.,
2009, citado en Almeida, 2012).
El disolvente actúa sobre el soluto solvatándolo y venciendo las fuerzas
intermoleculares que lo mantienen unido, pero sin dar lugar a la reacción.
(Wikipedia, 2014)
Para mantener pH ácidos se trabajó con HCl, Ac Cítrico, y Ac. Ascórbico el
uso de estos ácidos previene el desplazamiento de los equilibrios químicos
de hidratación y formación de chalconas, formándose una mayor
63.07
43.47
62.90
60.34
58.06
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00
METANOL: HCl (0.01%)
AGUA: HCl (0.01%)
ETANOL: HCl (0.01%)
ETANOL: AC CÍTRICO (0.01%)
ETANOL: AC. ASCÓRBICO(0.01%)
Antocianinas (mg/100 mL)
So
lve
nte
Ac
idif
icad
o
Evaluacion del Solvente en el Rendimiento de Antocianinas
56
estabilidad, antocianina-solvente.
El ácido utilizado en los solventes puede causar hidrólisis parcial de las
fracciones acil en antocianinas aciladas, especialmente en aquellas con
ácidos dicarboxílicos tales como ácido malónico, por lo que el uso de
ácidos débiles es deseable, tal como ácido tartárico o cítrico para mantener
los sustituyentes dicarboxílicos intactos. (Almeida, 2012)
El tamaño de las partículas influye en la extracción porque los sólidos de
tamaño pequeño tienen una mayor superficie de contacto con el líquido y la
distancia de difusión entre el soluto y el solvente por lo tanto la cantidad de
soluto transferido es más alto (Ullauri, 2010, citado en Almeida, 2012). Por
otra parte partículas muy finas forman una mayor viscosidad lo cual es muy
difícil de separarlo.
De los disolventes evaluados, el metanol fue el que logro extraer mayor
cantidad de componentes antioxidantes, esto se debe a que este disolvente
tiene la capacidad de causar daño al tejido a nivel de pared celular,
permitiendo así la salida de componentes intracelulares esto ha sido
probado en diversos estudios.
Almeida (2012) también menciona que solventes de baja viscosidad
ayudan a una mejor circulación y extracción de antocianinas, por lo que si a
ello se le suma el agitado en el extracto aumenta la difusión y aumentando
la transferencia de masa desde las partículas solidad al líquido.
El metanol es reconocido como un eficiente agente de extracción, pero no
es considerado seguro. En cambio, el etanol representa una alternativa de
disolvente seguro en procesos de extracción para productos con fines
alimenticios.
Por ello el disolvente extractor a utilizado en la presente investigación fue el
etanol: ácido cítrico ya que este presenta varias ventajas al ser utilizado
como disolvente de extracción, por ejemplo: no es tóxico, es económico y
su capacidad de extracción es tan buena como la del metanol.
Al realizar el análisis estadístico se observó:
57
Tabla 11. Análisis estadístico de la Evaluación del Solvente en el
Rendimiento de Antocianinas
Fuente G.L. Suma de
Cuadrados
Cuadrado
de la Media F-Valor Pr>F
Solventes 4 797,479 199,369 3227,01 0.000
Error 10 0,617 0,0618
Total 14 798,097
(Anexo 1)
De la Tabla N°11, se evalúa el estadístico de los solventes presentando
además la significación de p=0.00, siendo significativo por ser ˂ 0.05 por lo
que se rechaza la hipótesis nula. Por lo tanto podemos decir que existen
diferencias significativas en la evaluación del solvente en el rendimiento de
antocianinas.
Utilizando el método de Tukey se muestra que no existe diferencia
significativa entre los solventes Metanol:HCl y Etanol:HCl, expresados con
la misma letra (A) de agrupación que se muestra a continuación:
Solventes N Media Agrupación
1 3 63,065 A
3 3 62,954 A
4 3 60,338 B
5 3 58,056 C
2 3 43,472 D
Dónde: (1) Metanol: HCl (0.01%), (2) Agua: HCl (0.01%), (3) Etanol: HCl
(0.01%), (4) Etanol: Ac. Cítrico (0.01%), (5) Etanol: Ac. Ascórbico (0.01%).
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
Se observa en el modelo de Tukey que el que tiene menor contenido de
antocianinas en el extracto es del solvente acuoso, presentando
58
43,472mg/100 ml esto se debe a que las antocianidinas son menos
solubles en el agua.
El solvente Etanol: Ac. Cítrico (0.01%), está representado por la letra B, lo
cual indica que es significativamente diferente al Metanol: HCl (0.01%) y
Etanol: HCl (0.01%).
El solvente Etanol: Ac. Cítrico (0.01%) su uso es de grado Alimentario para
la Industria a comparación de los anteriores, y presenta mayor extracción
que Agua: HCl (0.01%) y Etanol: Ac. Ascórbico (0.01%).
Por ello se recomienda trabajar con el solvente Etanol: Ac. Cítrico (0.01%).
4.2 Evaluación de la estabilidad del extracto de los pétalos de Mastuerzo
frente al Tratamiento Térmico y pHs.
Se evaluó la estabilidad del extracto obtenido a temperatura de ebullición por
un tiempo de 60 minutos a diferentes pHs.
El extracto fue llevado a tubos de ensayo y sometido a temperatura de
ebullición por un tiempo de 60 minutos y se evaluó la estabilidad del
colorante a temperatura de ebullición y a pHs igual 3,4 y 5.
En las tablas siguientes se muestra los resultados obtenidos de los
extractos sometidos a pHs diferentes y a temperatura de ebullición por 60
minutos.
Tabla 12. Contenido de antocianinas a temperatura de ebullición por 60
minutos, a pH 3
PH=3 Contenido de Antocianinas (mg/100 g)
TIEMPO (MIN)
R1 R2 R3 Promedio
0 60,42 60,4 60,39 60,40 ±0.01
15 60,38 60,38 60,35 60,37 ±0.01
30 58,61 58,62 58,63 58,62 ±0.01
45 57,68 57,72 57,71 57,70 ±0.02
60 56,98 56,97 56,96 56,97 ±0.01
59
Tabla 13. Contenido de antocianinas a temperatura de ebullición por 60 minutos, a pH 4
(R1) Repetición N° 1, (R2) Repetición N° 2, (R3) Repetición N° 3
Tabla 14. Contenido de antocianinas a temperatura de ebullición por 60
minutos, a pH 5
(R1) Repetición N° 1, (R2) Repetición N° 2, (R3) Repetición N° 3
PH=4 Contenido de antocianinas (mg/100 g)
TIEMPO R1 R2 R3 Promedio
0 60,42 60,4 60,39 60,40 ±0.01
15 60,41 60,39 60,39 60,39 ±0.01
30 59,01 59,21 59,24 59,15 ±0.12
45 58,6 58,9 58,87 58,79 ±0.16
60 58,2 57,96 58,1 58,08 ±0.12
PH=5 Contenido de antocianinas (mg/100 g)
TIEMPO R1 R2 R3 Promedio
0 60,42 60,4 60,39 60,4 ±0.01
15 59,23 59,14 59,25 59,2 ±0.05
30 58,68 58,67 58,72 58,69 ±0.02
45 58,02 58,06 58,1 58,06 ±0.04
60 57,45 57,48 57,56 57,49 ±0.05
60
Figura 12. Variación del contenido de antocianinas a temperatura de
ebullición a diferentes pHs por 60 minutos
Figura 13. Contenido de antocianinas a diferentes pHs despues de 60 min.
A temperatura de ebullición
56 56.5 57 57.5 58 58.5
pH3
pH4
pH5
56.97
58.08
57.49
Contenido de antocianinas (mg/100 g.)
Dif
ere
nte
s p
Hs
Evaluación del contenido de Antocianinas
61
Se observa en la Figura 13, que a pH 4 se conserva mayor contenido de
antocianinas seguido del pH 5 y pH 3, observando contenidos muy cercanos
entre ellos.
La degradación de antocianinas se produce no sólo durante la extracción del
tejido vegetal, sino también durante el procesado y almacenamiento de los
tejidos alimentarios. (Fennema, 2000).
Los principales factores que gobiernan la degradación de las antocianinas
son el pH, la temperatura, oxigeno, y estructura.
La estabilidad de las antocianinas tiene una fuerte influencia de los
sustituyentes hidroxilo y metóxilo. La degradación no solo ocurre durante la
extracción del tejido de la planta sino también durante el proceso.
Los grupos hidroxilo, metóxilo, azucares y azucares asiladas tienen un
efecto marcado en el color y la reactividad de las antocianinas. El color es
influido por los rangos fisicoquímicos. Generalmente conforme se incrementa
el grupo hidroxilo, el color se transforma de rosa a azul, observándose el
efecto inverso con los grupos metóxilo. Mazza y Broullard (1987) citado en
Castillo (2006).
En el extracto de flor de mastuerzo se obtuvo un color naranja brillante por lo
que las antocianinas son conocidas para formar complejos débiles con
numerosos compuestos tales como proteínas, taninos, otros flavonoides y
polisacáridos por lo cual es referido como copigmentación intermolecular. La
mayoría de estos compuestos no son coloreados por ellos mismos, pero
cuando se asocian con las antocianinas ellos aumentan el color y la
estabilidad del cromóforo. (Aguilera, 2009). Frente a temperatura y pHs.
Las antocianinas tienen cambios importantes de color con las variaciones de
pH, cuando el pH es ácido su color es rojo intenso mientras que a pH neutro
se encuentra de manera incolora y a pH alcalino su coloración es amarilla y
pasa posteriormente a ser azul. Cuevas et al., 2008, citado en Almeida,
2012.
62
En la figura 8 se observa un gráfico en relación pH y absorbancia donde a
menor pH mayor absorbancia, que también lo podríamos relacionar con la
intensidad de color presentado en los extractos, entonces a mayor
intensidad de color entonces mayor cantidad de antocianinas esto debido a
su comportamiento estructural. Si la antocianina es estable en pHs bajos,
entonces la estabilidad térmica es mejor a altas temperaturas (Fennema,
2000).
Altas temperaturas y pHs neutros o alcalinos afectan a la pigmentación de
los extractos de antocianinas que es la degradación del color, la cual se
puede presentar como consecuencia de la exposición a la luz (foto
degradación), por acción de la temperatura efecto conocido como oxidación
térmica o descomposición térmica. Cuando los alimentos se someten a
elevadas temperaturas, el color de los mismos cambia entre tonalidades que
van desde un ligero amarillo hasta un intenso café, debido las reacciones de
caramelización que se producen en su interior (Badui, 2006).
Existen diversas teorías que explican el efecto de la temperatura en la
estabilidad de la antocianina pero el mecanismo preciso no se ha
esclarecido totalmente. Se sugiere que la elevación de la temperatura en
soluciones de antocianinas a pH 2-4 induce la pérdida de la mitad glicosil de
la antocianina, por hidrólisis, lo cual lleva a la pérdida del color desde que los
aglicones son menos estables que sus formas glicosidicas. Otros autores
postulan que el calor desplaza el equilibrio hacia la chalcona (Markakis et al.,
1957).
La pérdida de color de las antocianinas también se da por causa de las
reacciones enzimáticas que se producen en forma natural, en la enzima β-
glucosidasa hidrolizan al enlace glucosídico en el átomo de carbono 3,
separando al aglicón del azúcar. Existen enzimas del tipo de las
polifenolasas que también pueden causar una decoloración. (Almeida, 2012)
En la figura 13, se observa que a pH3 después de ser sometido a
temperatura de ebullición, el contenido de antocianinas es menor que a pH4
y pH5. Cuando interactúan pHs y Temperaturas, en el extracto de flor de
63
mastuerzo se activan las enzimas propias de la flor y a ello se suma la
acidificación del solvente que hacen que las antocianinas se hidrolicen y
sean menos estable, por ello se reporta un contenido bajo de antocianinas.
Rein (2005) señala que en general los mismos factores estructurales los
cuales mejoran la estabilidad de las antocianinas frente al pH también
incrementan su estabilidad térmica. En un estudio de la estabilidad de las
antocianinas de Sambucus canadensis y Sambicus nigra encontraron que la
acilación mejora la estabilidad frente al calor y la luz, mientras que la
glicosilación únicamente estabiliza las antocianinas en presencia de luz.
Rubinskiene et al. (2005). En un estudio del impacto de varios factores en la
composición y estabilidad de antocianinas de grosella negra concluyeron
que la cianidina 3-rutinosido fue la antocianina más estable frente al
tratamiento térmico a 95 °C frente a cianidina 3-glucósido, delfinidina 3-
glucósido y delfinidina 3- rutinósido, mientras cianidina y delfinidina
rutinosida fueron las más estables durante el almacenamiento.
Pero Centeno (2003) citado en Almeida (2012) discrepa con Rein (2005)
mencionando que a medida que se incrementa la temperatura la extracción
es mejor pero si el rango de temperatura está entre 70 y 100 °C el
rendimiento no aumenta de forma significativa para extracción de
antocianinas.
En la figura 13, se observa que a pH4 hay mayor cantidad de contenido de
antocianinas, Debido a que el núcleo del flavilio, es estable a pH ácidos o
bajos. Y en el pH5 se observa una pequeña disminución de contenido de
antocianinas es porque el catión flavilio de color rojo, representado por la
fórmula (AH+); cuando se incrementa el pH, la distribución electrónica se
modifica hasta llegar a la forma quinoidea azul o base anhidra que
pueden convertirse a la base del carbinol incolora, que predomina en el
intervalo de pH de 4 a 5 (Badui, 2006).
64
Linden y Lorient (1994), Citado en Almeida (2012) recomiendan utilizar
colorantes con antocianinas en la zona del pH entre 3,5 a 6,0 para lograr
colores que van desde el rojo violáceo hasta el rojo cereza.
En las siguientes figuras se muestra el porcentaje de retención de las
antocianinas a diferentes pHs.
Tabla 15. Porcentaje de Retención de antocianinas a temperatura de
ebullición por 60 minutos, a pH 3
TIEMPO (Min.)
Concentración de
antocianinas (mg/100g.)
Porcentaje de
retención (%)
0 60,40 100
15 60,37 99.45
30 58,62 97.05
45 57,70 95.52
60 56,97 94.32
Tabla 16. Porcentaje de Retención de antocianinas a temperatura de
ebullición por 60 minutos, a pH 4
TIEMPO (Min.)
Concentración de
antocianinas (mg/100g.)
Porcentaje de
retención (%)
0 60,40 100
15 60,39 99.98
30 59,15 97.93
45 58,79 97.33
60 58,08 96.15
65
Tabla 17. Retención de antocianinas a temperatura de ebullición por 60
minutos, a pH 5
TIEMPO (Min.)
Concentración de
antocianinas (mg/100g.)
Porcentaje de
retención (%)
0 60,40 100
15 59,20 98.01
30 58,69 97.16
45 58,06 96.12
60 57,49 95.18
Figura 14. Contenido de antocianinas expresado porcentualmente a
diferentes pHs despues de 60 min y a temperatura de ebullición
Se realizó los cálculos de porcentaje de retención de antocianinas
encontrándose que a pH 4 existe un mayor porcentaje de retención del
pigmento, mostrando una pérdida de pigmento hasta de un 6% a
temperatura de ebullición por 60 minutos.
Los extractos de antocianinas de la flor de Mastuerzo, se aplicaría fácilmente
en productos alimenticios como néctares, mermeladas, etc. Porque el uso de
altas concentraciones de azúcar (>20%) o jarabes para preservar frutas y
94.32%
96.15%
95.18%
93 93.5 94 94.5 95 95.5 96 96.5
pH3
pH4
pH5
PORCENTAJE DE CONTENIDO DE ANTOCIANINAS (%)
DIF
EREN
TES
pH
s
CANTIDAD DE CONTENIDO DE ANTOCIANINAS EXPRESADO PORCENTUALMENTE
66
derivados tiene un efecto protectivo global sobre los cromóforos de las
antocianinas, presumiblemente por la baja actividad de agua (aw). La aw
reducida está asociada con una reducida velocidad de degradación de
antocianinas: la hidratación de cromóforos de antocianinas a especies
descoloridas llega a ser menos favorable como el agua llegue a ser limitante.
Efectivamente, polvos de antocianinas deshidratadas (aw ≤ 0.3) son
relativamente estables a temperatura ambiente por varios años cuando son
mantenidos en contenedores sellados herméticamente (Jackman y Smith,
1992) Citado en Aguilera (2009).
4.3 Evaluación de la estabilidad del extracto acuoso de pétalos de
Mastuerzo frente al almacenamiento a temperaturas de 4°C y 24°C por
30 días a diferentes pHs.
Se muestra a continuación la pérdida de antocianinas en almacenamiento a
4 y 24°C por 30 días, y a diferentes pHs.
4.3.1 Temperatura de almacenamiento a 4°C
En las tablas siguientes se muestra el comportamiento de la
pérdida de antocianinas a la temperatura de almacenamiento de
4 ° C y diferentes pHs.
Tabla 18. Evaluación de la pérdida de antocianinas por efecto de la
temperatura de almacenamiento (4°C) a pH 3
PH=3 Contenido de antocianinas (mg/100g.)
Tiempo (Días)
R1 R2 R3 Promedio
0 60,42 60,40 60,39 60,40 ±0.01 5 60,40 60,41 60,42 60,41 ±0.01
10 60,40 60,39 60,40 60,39 ±0.005 15 59,84 59,86 59,89 59,86 ±0.02 20 59,25 59,26 59,32 59,27 ±0.03 25 58,96 58,89 58,86 58,90 ±0.05 30 58,64 58,68 58,72 58,68 ±0.04
(R1) Repetición N° 1, (R2) Repetición N° 2, (R3) Repetición N° 3
67
Tabla 19. Evaluación de la pérdida de antocianinas por efecto de la
temperatura de almacenamiento (4°C) a pH 4
Tabla 20. Evaluación de la pérdida de antocianinas por efecto de la
temperatura de almacenamiento (4°C) a pH 5
PH=5 Contenido de antocianinas (mg/100g.)
Tiempo (Días)
R1 R2 R3 Promedio
0 60,42 60,4 60,39 60,40 ±0.01
5 59,98 59,97 59,96 59,97 ±0.01
10 59,21 59,2 59,17 59,19 ±0.02
15 58,26 58,24 58,28 58,26 ±0.02
20 57,98 57,98 57,96 57,97 ±0.01
25 57,25 57,29 57,21 57,25 ±0.04
30 56,87 56,87 56,89 56,87 ±0.01
PH=4 Contenido de antocianinas (mg/100g.)
Tiempo (Dias)
R1 R2 R3 Promedio
0 60,42 60,4 60,39 60,40 ±0.01
5 60,01 59,96 60,24 60,07 ±0.14
10 59,78 59,76 59,76 59,76 ±0.01
15 59,12 59,16 59,07 59,11 ±0.04
20 58,56 58,58 58,62 58,58 ±0.03
25 58,01 57,98 58,00 57,99 ±0.01
30 57,81 57,75 57,75 57,77 ±0.03
68
4.3.2 Temperatura de almacenamiento a 24°C
En las siguientes tablas se muestra el contenido de antocianinas en
almacenamiento a diferentes pHs, a 24°C.
Tabla 21. Evaluación de la pérdida de antocianinas por efecto de la
temperatura de almacenamiento (24°C) a pH 3
(R1) Repetición N° 1, (R2) Repetición N° 2, (R3) Repetición N° 3
Tabla 22. Evaluación de la pérdida de antocianinas por efecto de la
temperatura de almacenamiento (24°C) a pH4
PH=3 Contenido de antocianinas (mg/100g.)
Tiempo (Días)
R1 R2 R3 Promedio
0 60,42 60,4 60,39 60,4 ±0.01
5 60,12 60,14 60,14 60,13 ±0.01
10 59,8 59,78 59,76 59,78 ±0.02
15 59,24 59,26 58,9 49,25 ±0.2
20 58,75 58,76 58,72 58,74 ±0.02
25 57,86 57,89 57,92 57,89 ±0.03
30 57,05 56,98 56,99 57,00±0.03
PH=4 Contenido de antocianinas (mg/100g.)
Tiempo (Días)
R1 R2 R3 Promedio
0 60,42 60,4 60,39 60,39 ±0.01
5 59,72 59,69 59,72 59,72 ±0.01
10 58,98 58,99 59,00 59,00 ±0.01
15 58,13 58,14 58,12 58,12 ±0.01
20 57,75 57,72 57,78 57,78 ±0.03
25 57,06 57,08 57,08 57,08 ±0.01
30 56,75 56,74 56,75 56,75 ±0.005
69
Tabla 23. Evaluación de la pérdida de antocianinas por efecto de la
temperatura de almacenamiento (24°C) a pH 5
Al realizar el análisis estadístico de los valores finales nos muestra que
existe diferencia significativa en el contenido de antocianinas a las dos
temperaturas de almacenamiento y diferentes pHs.
Tabla 24. Análisis estadístico de la Evaluación de la estabilidad de
contenido de antocianinas frente al almacenamiento a las temperaturas de
4°C y 24°C
(Anexo 2)
De la Tabla N°24, se evalúa el estadístico de la estabilidad contenido
antocianinas frente a temperatura de almacenamiento y pHs además la
significación de p=0.00, siendo significativo por ser ˂ 0.05 por lo que se
rechaza la hipótesis nula. Por lo tanto podemos decir que existen diferencias
PH=5 Contenido de antocianinas (mg/100g.)
Tiempo (Días)
R1 R2 R3 Promedio
0 60,42 60,4 60,39 60,40 ±0.01
5 59,09 59,12 59,11 59,11 ±0.01
10 58,47 58,39 58,39 58,41 ±0.04
15 57,32 57,35 57,32 57,33 ±0.01
20 56,42 56,44 56,42 56,42 ±0.01
25 55,89 55,84 55,86 55,86 ±0.02
30 55,09 55,04 55,06 55,06 ±0.02
Fuente G.L. Suma de
Cuadrados
Cuadrado
de la
Media
F-Valor Pr>F
Temperatura 1 10,17 10,17 12123,24 0,000
pHs 2 11,0228 5,5114 6569,89 0,000
Temperatura*pHs 2 0,5331 0,2665 317,74 0,000
Error 12 0,0101 0,0008
Total 17 21,736
70
significativas en la evaluación de la estabilidad de antocianinas frente a
temperatura de almacenamiento y pHs.
Utilizando la prueba de Tukey se muestra que existe diferencia significativa
en el contenido de antocianinas a las dos temperaturas y pHs que se
muestra a continuación:
.
Temperatura pHs N Media Agrupación
1 1 3 58,7 A
1 2 3 57,8 B
2 1 3 57,0 C
1 3 3 56,9 D
2 2 3 56,7 E
2 3 3 55,1 F
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. A
temperatura de 4°C y pH3 hay un contenido mayor de antocianinas.
Figura 15. Contenido de antocianinas durante el almacenamiento en
teperaturas de 4°C y 24°C despues de 30 dias.
53 54 55 56 57 58 59
pH3
pH4
pH5
58.68
57.77
56.87
57
56.75
55.06
Contenido de Antocianina (mg/100g.)
Va
ria
cio
n d
e p
Hs
Evaluación de la estabilidad de contenido de antocianinas frente al almacenamiento a las
temperaturas de 4°C y 24°C
T = 24°C
T = 4°C
71
En general se observa que al variar la temperatura de 4 a 24°C existe mayor
retención de contenido de antocianinas a 4°C y a medida que aumenta el pH
la concentración de antocianinas disminuye para las dos temperaturas.
Por lo que decimos que hay mayor contenido de antocianinas en extracto de
la flor de Mastuerzo a 4°C y a pH 3.
En general los pigmentos de los extractos de antocianinas de la flor de
mastuerzo son notoriamente destruidos por el calor durante el
procesamiento y almacenamiento de los alimentos. El aumento de la
temperatura produce la perdida de una molécula de azúcar en la posición 3 y
como consecuencia la ruptura del anillo y como efecto la formación de
chalconas incoloras (Garzón, 2008) citado en (Fennema, 2000). Esto se
aprecia en los resultados obtenidos después de los 30 días de
almacenamiento.
Las antocianinas son relativamente inestables, siendo únicamente su
comportamiento aceptable cuando se encuentran en medio acido, se
degradan cambiando el color durante el almacenamiento sobre todo cuando
es más elevada la temperatura.
Las diferentes coloraciones de las antocianinas también se deben a la
conversión del catión flavilo a formas secundarias de las antocianinas en
medios acuosos así como a interacciones moleculares. Debido a una
deficiencia del núcleo de flavilo, estos pigmentos funcionan como verdaderos
indicadores de pH. A pH ácidos adquieren una estructura estable de catión
flavilo colorido. Al aumentar el pH se promueve la desprotonación del catión
flavilo; a pH 7.0 y superiores debido a la desprotonación continuada
predominan las formas quinoidales, en estos casos el efecto batocrómico.
El cambio de color de los vinos de rojo púrpura a café-rojizo se debe a la
formación de polímeros estables de antocianina-taninos, resultado de la
copigmentación. A medida que el vino se añeja, cambia de un rojo brillante a
un rojo-café o más oscuro; esto va acompañado de una reducción de la
concentración de las antocianinas monoméricas y de un incremento en la
producción de compuestos poliméricos. (Badui, 2006).
72
4.4 Evaluación de la capacidad Antioxidante frente a la Temperatura
de Ebullición.
Se evaluó la capacidad antioxidante en los procesos de evaluación de
estabilidad del colorante extraídos cuyos resultados se muestran en las
siguientes tablas:
Tabla 25. Variación de la capacidad antioxidante al variar el tiempo de
exposición a Temperatura de Ebullición a pH 3
PH=3 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
(umol TE/g. de muestra)
Tiempo (Min.)
R1 R2 R2 Promedio
0 298,65 298,69 298,72 298,69 ±0.03 15 292,75 292,74 292,69 292,73 ±0.03 30 285,32 286,56 285,56 285,81 ±0.6 45 284,86 284,25 284,57 284,56 ±0.3 60 280,63 280,65 280,69 280,66 ±0.03
Tabla 26. Variación de la capacidad antioxidante al variar el tiempo de
exposición a Temperatura de Ebullición a pH 4
PH=4 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
(umol TE/g. de muestra)
Tiempo (Min.)
R1 R2 R2 Promedio
0 298,65 298,69 298,72 298,69 ±0.03
15 293,56 293,84 293,45 293,62 ±0.2
30 289,25 289,35 289,28 289,29 ±0.05
45 286,25 286,35 286,29 286,3 ±0.05
60 282,56 282,54 282,46 282,52 ±0.05
umol TE=micromol trolox equivalente
(R1) Repetición N° 1, (R2) Repetición N° 2, (R3) Repetición N° 3
73
Tabla 27: Variación de la capacidad antioxidante al variar el tiempo de
exposición a Temperatura de Ebullición a pH 5
Figura 16. Evaluación de la capacidad antioxidante en diferentes pHs despues de 60 min. Expuestos a temperatura de ebullición.
umol TE=micromol trolox equivalente
En la evaluación de la actividad antioxidante en extractos de flores de
Mastuerzo se obtuvieron resultados mediante el método de captura de
radicales libres que utiliza el radical 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH). Este
método es probablemente más eficiente que el método ABTS (ácido
2,2’azinobis (6-sulfonato-3-etilbenzotiazolina)) por capturar mayores
280.66
282.52
279.28
277.00 278.00 279.00 280.00 281.00 282.00 283.00
pH3
pH4
pH5
Capacidad Antioxidante (µmol TE/g. de muestra)
Dif
ere
nte
s p
Hs
Evaluación de la Capacidad Antioxidante
PH=5 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
(umol TE/g. de muestra)
Tiempo (Min.)
R1 R2 R2 Promedio
0 298,65 298,69 298,72 298,69 ±0.03
15 294,23 294,56 294,58 294,46 ±0.19
30 289,35 289,65 289,64 289,55 ±0.17
45 281,21 281,35 281,26 281,27 ±0.07
60 279,25 279,35 279,24 279,28 ±0.06
74
electrones (Sánchez-Moreno, 2002) citado en (Leyva, 2009).
Existen factores que afectan la actividad antioxidante de los compuestos
fenólicos. Así, el número y posición de grupos hidroxilo, la presencia de
azúcares unidos y el grado de polimerización determinarán propiedades de
los compuestos fenólicos tales como la solubilidad y la tendencia a ceder
electrones o átomos de hidrógeno. (Leyva, 2009).
En la figura 16, se puede identificar que la diferencia de pérdida de la
capacidad antioxidante es mínima para los 3 pHs.
Los resultados indican que el contenido de la capacidad antioxidante es
mayor a pH4, por lo que el ion flavilio se encuentra más estable a pHs
ácidos. A pHs muy ácidos y temperaturas elevadas se hidrolizan las
antocianinas siendo más inestables como en el pH3 a las cuales no solo
reacciona la acidez sino también las reacciones enzimáticas naturales de la
flor disminuyen la capacidad antioxidante.
4.5 Evaluación de la capacidad antioxidante del extracto de pétalos de
Mastuerzo frente al almacenamiento a temperaturas de 4°C y 24°C por
30 días a diferentes pHs.
Se realizó la evaluación también en almacenamiento a 4 y 24°C.
4.5.1 Almacenamiento a temperatura de 4°C
Tabla 28. Evaluación de la pérdida de capacidad antioxidante por efecto de
la temperatura de almacenamiento (4°C) a pH 3
PH=3 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
(umol TE/g. de muestra)
Tiempo (Dias)
R1 R2 R2 Promedio
0 298,65 298,69 298,72 298,65 ±0.03
5 298,64 298,61 298,61 298,04 ±0.01
10 296,84 296,87 296,87 296,61 ±0.01
15 295,95 296,25 296,12 295,91 ±0.15
20 295,45 295,65 295,52 295,36 ±0.1
25 294,93 294,96 294,97 294,75 ±0.02
30 294,23 294,32 294,36 294,30 ±0.06
75
Tabla 29. Evaluación de la pérdida de capacidad antioxidante por efecto de
la temperatura de almacenamiento (4°C) a pH 4
Tabla 30. Evaluación de la pérdida de capacidad antioxidante por efecto de
la temperatura de almacenamiento (4°C) a pH 5
umol TE=micromol trolox equivalente
(R1) Repetición N° 1, (R2) Repetición N° 2, (R3) Repetición N° 3
PH=4 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
(umol TE/g. de muestra)
Tiempo (Dias)
R1 R2 R2 Promedio
0 298,65 298,69 298,72 298,62 ±0.03
5 298,56 298,54 298,53 298,31 ±0.01
10 297,89 297,86 297,84 297,34 ±0.02
15 296,21 296,31 296,28 295,97 ±0.05
20 295,32 295,36 295,38 294,97 ±0.03
25 294,25 294,23 294,24 294,15 ±0.01
30 293,98 293,95 293,98 293,97 ±0.01
PH=5 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
(umol TE/g. de muestra)
Tiempo (Dias)
R1 R2 R2 Promedio
0 298,65 298,69 298,72 298,40 ±0.03
5 297,95 297,89 297,85 297,66 ±0.05
10 297,12 297,15 297,14 296,91 ±0.01
15 296,45 296,42 296,46 296,28 ±0.02
20 295,85 295,89 295,96 295,29 ±0.05
25 294,12 294,15 294,14 293,81 ±0.01
30 293,12 293,16 293,18 293,15 ±0.03
76
4.5.2 Almacenamiento a temperatura de 24°C
Tabla 31. Evaluación de la pérdida de capacidad antioxidante por efecto de
la temperatura de almacenamiento (24°C) a pH 3
PH=3 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
(umol TE/g. de muestra)
Tiempo (Dias)
R1 R2 R2 Promedio
0 298,65 298,69 298,72 298,69 ±0.03
5 297,89 297,84 297,84 297,86 ±0.02
10 296,45 296,48 296,51 296,48 ±0.03
15 295,89 295,87 295,89 295,88 ±0.01
20 295,01 295,09 295,06 295,05 ±0.04
25 294,21 294,23 294,28 294,24 ±0.03
30 293,2 293,25 293,14 293,2 ±0.05
Tabla 32. Evaluación de la pérdida de capacidad antioxidante por efecto de
la temperatura de almacenamiento (24°C) a pH 4
PH=4 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
(umol TE/g. de muestra)
Tiempo (Dias)
R1 R2 R2 Promedio
0 298,65 298,69 298,72 298,69 ±0.03
5 297,45 297,48 297,46 297,46 ±0.01
10 296,48 296,48 296,35 296,44 ±0.07
15 295,78 295,72 295,74 295,75 ±0.03
20 294,87 294,87 294,98 294,91 ±0.06
25 294,01 294,08 298,07 295,39 ±2.32
30 292,45 292,52 292,58 292,52 ±0.06
77
Tabla 33. Evaluación de la pérdida de capacidad antioxidante por efecto de
la temperatura de almacenamiento (24°C) a pH 5
PH=5 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
(umol TE/g. de muestra)
Tiempo (Dias)
R1 R2 R2 Promedio
0 298,65 298,69 298,72 298,69 ±0.03
5 297,21 297,2 297,18 297,2 ±0.01
10 296,45 296,45 296,48 296,46 ±0.01
15 295,05 295,08 295,02 295,05 ±0.03
20 294,12 294,15 294,13 294,13 ±0.01
25 293,45 293,48 293,49 293,47 ±0.02
30 292,01 291,86 291,86 291,91 ±0.08
Tabla 34. Análisis estadístico de la Evaluación de la capacidad antioxidante
de antocianinas frente al almacenamiento a las temperaturas de 4°C y 24°C
(Anexo 3)
De la Tabla N° 34, se evaluó el estadístico de la capacidad antioxidante
frente a la temperatura de almacenamiento y a pHs diferentes, la
significación obtenida de p=0.00 y p=0.001, siendo significativo por ser ˂
0.05 por lo que se rechaza la hipótesis nula. Por lo tanto podemos decir que
existen diferencias significativas en la evaluación de la capacidad
antioxidante.
Utilizando el método de Tukey se muestra que existe diferencia significativa
Fuente G.L. Suma de
Cuadrados
Cuadrado
de la
Media
F-Valor Pr>F
Temperatura 1 7,2327 7,2327 2123,79 0,000
pHs 2 4,4950 2,2475 659,96 0,000
Temperatura*pHs 2 0,0915 0,0457 13,43 0,001
Error 12 0,0409 0,0034
Total 17 11,8601
78
en el contenido de capacidad antioxidante en almacenamiento a diferentes
temperaturas y diferentes pHs.
T pHs(Varios) N Media Agrupación
1 1 3 294,3 A
1 2 3 294,0 B
2 1 3 293,2 C
1 3 3 293,2 C
2 2 3 292,5 D
2 3 3 291,9 E
Al realizar el análisis se obtuvo que existe diferencia significativa, habiendo
mayor capacidad antioxidante en la agrupación A, que se encuentra a
temperatura de 4°C y a Ph3.
Figura 17. Contenido de antocianinas a diferentes temperaturas de
almacenamiento despues de 30 dias.
La actividad antioxidante es un parámetro de gran interés para valorar la
capacidad antioxidante de un sistema biológico. La actividad antioxidante
290.00 291.00 292.00 293.00 294.00 295.00
pH 3
pH 4
pH 5
294.36
293.98
293.20
293.2
292.52
291.91
Contenido de Antocianina (mg/100g.)
Var
iaci
on
de
pH
s
Evaluación de la Capacidad Antioxidante frente al almacenamiento a las temperaturas de 4°C y 24°C
T = 24°C
T = 4°C
79
comprende una transición redóx mediante la cual la molécula
antioxidante dona un electrón o átomo de hidrógeno, equivalente a la
donación de un electrón y un H+ al radical libre R* (Cadenas, 2000).
La capacidad antioxidante varía en función de compuestos estudiados y sus
solubilidad en fase acuosa o lipídica y está fuertemente condicionada por
el sistema usado como sustrato, las condiciones de catálisis de la
oxidación, las propiedades redóx de sus grupos hidrofenólicos y la relación
estructural entre las diferentes partes de la estructura química (Pokorny,
2001)
La capacidad antioxidante tiene directa relación con el número de grupos
hidroxilos unidos a los carbonos de los anillos, entre mayor número de
grupos OH mayor capacidad antioxidante (Gross, 1987) Citado en (Castillo,
2006).
Nicoli et al. (1999), indican que en la mayoría de los casos, el procesamiento
es el responsable de pérdidas significativas de los antioxidantes naturales.
Esto es debido a que la mayoría de antocianinas son relativamente
inestables al tratamiento térmico. Por lo que los extractos de flor de
mastuerzo aplicado a diferentes temperaturas muestran disminución en la
capacidad antioxidante por ser oxidados a altas temperaturas (Yoshioka et
al., 1990) citado por (Larrauri et al., 1998). Esto se aprecia en los extractos
almacenados a 24°C.
En la figura 17 se observa que hay una mayor capacidad antioxidante en
condiciones de pH3 y temperatura de almacenamiento a 4°C, esto debido
que en los extractos de flor de mastuerzo pueden deberse a la acilación que
presentan las moléculas de antocianina con ácidos cinámicos y otros
compuestos que poseen capacidad antioxidante. (Lock, 1997)
En un estudio realizado en vinos con moras negras se encontró que la
actividad antioxidante se ve influenciada por el porcentaje de antocianinas
poliméricas que se forman durante el añejamiento, por el contrario el
contenido de antocianinas monoméricas se ve disminuida con el tiempo de
almacenamiento (Tsai et al., 2004) citado en (Leyva, 2009). Con lo cual
confirmaríamos que a mayor tiempo de almacenamiento hay una
80
disminución de las antocianinas monoméricas.
.
4.6 Relación entre el contenido y capacidad antioxidante de las
Antocianinas
Se realizó una relación del efecto de la pérdida de capacidad
antioxidante respecto al contenido de antocianinas que se muestra
en las siguientes tablas tanto a 4°C como a 24°C y a pH3.
Tabla 35. Variación de la capacidad antioxidante al variar el contenido de
antocianinas por efecto de la temperatura de almacenamiento (4°C) a pH 3
umol TE=micromol trolox equivalente
T = 4°C
TIEMPO (dias)
CONTENIDO DE ANTOCIANINAS
(mg/100g.)
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (µmol TE/g de
muestra)
0 60,40 298,65
5 60.,41 298,04
10 60,40 296,61
15 59,86 295,91
20 59,28 295,36
25 58,90 294,75
30 58,68 294,36
81
Figura 18. Capacidad antioxidante vs el contenido de antocianas a 4°C
Tabla 36. Variación de la capacidad antioxidante al variar el contenido de
antocianinas por efecto de la temperatura de almacenamiento (24°C) a pH 3.
T = 24°C
TIEMPO (dias)
CONTENIDO DE ANTOCIANINAS
(mg/100g.)
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (µmol TE/g de
muestra)
0 60,40 298,69
5 60,13 297,86
10 59,78 296,48
15 59,25 295,88
20 58,74 295,05
25 57,89 294,24
30 57,01 293,20
y = -0.0665x + 60.702 R² = 0.9186
y = -0.227x + 299.12 R² = 0.8715
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
250.00
300.00
350.00
0 5 10 15 20 25 30 35
Co
nte
nid
o d
e a
nto
cian
inas
C
apac
idad
an
tio
xid
ante
Tíempo (días)
Variación de la capacidad antioxidante al variar contenido de antocianinas a 4°C
82
Figura 19. Variación de capacidad antioxidante al variar el contenido de
antocianas a 24°C
En la relación de antocianinas y capacidad antioxidante, se muestra que a
medida disminuye el contenido de antocianinas también disminuye la
capacidad antioxidante.
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenólicos parece estar
también relacionado con su capacidad para quelar metales, inhibir la
lipoxigenasa y captar radicales libres, aunque en ocasiones también pueden
promover reacciones de oxidación in vitro.
Leyva (2009) menciona que la actividad antioxidante no siempre está
relacionado con el mayor contenido de fenoles en un producto, lo cual
sugiere que existen otros metabolitos que están aportando actividad
antioxidante, como la vitamina C. y Kalt (2005), citado en Quispe (2012)
afirma que las frutas fuertemente coloreadas con un alto nivel de
antocianinas, tales como la grosella negra, baya de sauco y arándano
poseen típicamente una capacidad antioxidante mayor.
y = -0.1122x + 60.713 R² = 0.9595
y = -0.1795x + 298.61 R² = 0.9931
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
250.00
300.00
350.00
0 5 10 15 20 25 30 35
Co
nte
nid
o d
e a
nto
cian
inas
C
apac
idad
an
tio
xid
ante
Tiempor (días)
Variación de la capacidad antioxidante al variar el contenido de antocianinas a 24°C
83
Entonces podemos afirmar lo que nos dice Kalt (2005), citado en Quispe
(2012) que a mayor contenido de antocianinas, habrá una mayor capacidad
antioxidante en los extractos elaborados con flor de mastuerzo.
84
V. CONCLUSIONES
1. El mayor rendimiento de extracción del contenido de antocianinas
de la flor de mastuerzo se obtuvo con el solvente metanol: HCl
(0.01%) con 63,07±0.10 mg/100ml, seguido del etanol: HCl (0.01%)
con 62,9 ±0.1 mg/100ml y etanol: ácido cítrico (0.01%) con 60,34
±0.19 mg/100ml, las cantidades de antocianinas obtenidos en los
extractos son muy cercanos por lo que se optó en trabajar con el
solvente etanol: ácido cítrico por ser de grado alimentario, evitando
trabajar con metanol y HCl por producir malestares a la salud
humana y en mayores cantidades su toxicidad.
2. La mayor estabilidad térmica del extracto de antocianinas
sometidas por 60 minutos y a una temperatura de ebullición se
obtuvo del extracto a pH4 con un contenido de 58,08 ±0.12 mg/100
g comparado al extracto de pH3 con un contenido de 56,97 ±0.01.
3. La mayor estabilidad de contenido de antocianinas después de 30
días de almacenamiento se obtuvo en las condiciones de
temperatura de almacenamiento de 4°C y a pH 3 con un contenido
de 58,68 ±0.04 mg/100 g. a comparación del extracto de
antocianina almacenado a temperatura de 24°C (baño maría) con
un pH 5 obteniéndose un contenido de 55,06 ±0.02 mg/100 g.
85
4. Se obtuvo la mayor capacidad antioxidante de los extractos de la
flor de mastuerzo después de ser sometidos a tratamiento térmico
a 89ºC durante 60 minutos, en las condiciones de pH 4 con un
contenido de 282,52 ±0.05 umol TE/g. de muestra (umol TE, micro
mol trolox equivalente) a comparación del extracto sometido a pH 5
con un contenido de 279,28 ±0.06 umol TE/g.
5. La mayor estabilidad de la capacidad antioxidante de los extractos
obtenidos después de 30 días de almacenamiento se obtuvo en las
condiciones de temperatura de almacenamiento de 4°C y a pH 3
con un rendimiento de capacidad antioxidante de 294,30 ±0.06
umol TE/g. de muestra a comparación del extracto de antocianina
almacenado a temperatura de 24°C (baño maría) con un pH 5
obteniéndose un rendimiento de capacidad antioxidante de 291,91
±0.08 umol TE/g
6. En la relación de contenido de antocianinas y capacidad antioxidante
en condiciones de almacenamiento de 4°C y a pH 3 el
comportamiento muestra que a mayor contenido de antocianinas,
habrá una mayor capacidad antioxidante y a un menor contenido de
antocianinas habrá una menor capacidad antioxidante.
86
VI. RECOMENDACIONES
1. Promover la producción de flor de mastuerzo, con cuidados desde la
plantación hasta la cosecha, para mejorar la producción.
2. Promover el consumo directo de la flor de mastuerzo, en ensalada o
cocido, para beneficiarse de sus bondades.
3. Los resultados obtenidos permiten recomendar la flor de mastuerzo para
una producción dirigida a ser comercializada en la industria, debido a su
elevado contenido de antocianinas benéficos para la salud y por ser una
fuente de pigmento para la industria alimentaria y farmacéutica.
87
VII. BIBLIOGRAFÍA
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Bioquímica. Brasília: Editora Kiron, 2012.
60. Textoscientíficos.com, (2014). METANOL. Página:
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61. Villarroel Diaz, Galia Janina (2008). Determinación de la Actividad
Antioxidante de la Guinda (Prunus capulí). Universidad Nacional Del
Centro Del Peru. Facultad de Ingeniería En Industrias Alimentarias.
62. Wang, H., Cao, G., Prior, R. (1997) Oxygen Radical Absorbing Capacity
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63. Wikipedia, (2014). Polaridad de un Disolvente. Página:
http://es.wikipedia.org/wiki/Polaridad_de_un_disolvente
64. Wong, D. (1995). Química de los Alimentos: Mecanismos y Teoría. Ed.
Acribia, S. A. España. 476.
65. Yúfera E. (1998) “Química de los alimentos”. Edit. Síntesis S.A Madrid –
España. Zaragoza – España. 111-115 pp.
94
ANEXOS
95
ANEXO 1. ANALISIS ESTADISTICOS DE LOS DATOS
1. DE LA EVALUACION DEL SOLVENTE
ANOVA unidireccional: Antocianinas Monomericas vs. Solventes Fuente GL SC CM F P
Solventes 4 797.4798 199.3699 3227.01 0.000
Error 10 0.6178 0.0618
Total 14 798.0976
S = 0.2486 R-cuad. = 99.92% R-cuad.(ajustado) = 99.89%
ICs de 95% individuales para la media
basados en Desv.Est. agrupada
Nivel N Media Desv.Est. --------+---------+---------+---------+-
1 3 63.065 0.096 *)
2 3 43.472 0.337 *)
3 3 62.954 0.000 (*
4 3 60.338 0.193 (*
5 3 58.056 0.386 (*
--------+---------+---------+---------+-
48.0 54.0 60.0 66.0
Desv.Est. agrupada = 0.249
Agrupar información utilizando el método de Tukey
Solventes N Media Agrupación
1 3 63,065 A
3 3 62,954 A
4 3 60,338 B
5 3 58,056 C
2 3 43,472 D
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
Intervalos de confianza simultáneos de Tukey del 95%
Todas las comparaciones de dos a dos entre los niveles de Solventes
Nivel de confianza individual = 99.18%
Solventes = 1 restado de:
Solventes Inferior Centro Superior
2 -20.260 -19.593 -18.926
3 -0.779 -0.111 0.556
4 -3.395 -2.728 -2.060
5 -5.676 -5.009 -4.342
Solventes -------+---------+---------+---------+--
2 (*
3 (*
4 (*
96
5 (*
-------+---------+---------+---------+--
-12 0 12 24
Solventes = 2 restado de:
Solventes Inferior Centro Superior -------+---------+---------+---------
+--
3 18.814 19.482 20.149 *)
4 16.198 16.865 17.533 (*)
5 13.917 14.584 15.251 *)
-------+---------+---------+---------
+--
-12 0 12
24
Solventes = 3 restado de:
Solventes Inferior Centro Superior -------+---------+---------+---------
+-
4 -3.284 -2.616 -1.949 (*
5 -5.565 -4.898 -4.230 (*
-------+---------+---------+---------
+-
-12 0 12
24
Solventes = 4 restado de:
Solventes Inferior Centro Superior -------+---------+---------+---------
+--
5 -2.949 -2.281 -1.614 *)
-------+---------+---------+---------
+--
-12 0 12
24
Gráfica de caja de Antocianinas Monomericas
54321
65
60
55
50
45
Solventes
An
tocia
nin
as M
on
om
eri
ca
s
Gráfica de caja de Antocianinas Monomericas
97
ANEXO 2: Evaluación de la estabilidad
2.1 Modelo lineal general: Tacys vs. Temperatura, pHs Factor Tipo Niveles Valores
Temperatura fijo 2 1, 2
pHs fijo 3 1, 2, 3
Análisis de varianza para Tacys, utilizando SC ajustada para pruebas
Fuente GL SC Sec. SC Ajust. CM Ajust. F P
Temperatura 1 10.1700 10.1700 10.1700 12123.24 0.000
pHs 2 11.0228 11.0228 5.5114 6569.89 0.000
Temperatura*pHs 2 0.5331 0.5331 0.2665 317.74 0.000
Error 12 0.0101 0.0101 0.0008
Total 17 21.7360
S = 0.0289636 R-cuad. = 99.95% R-cuad.(ajustado) = 99.93%
Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95.0%
Temperatura N Media Agrupación
1 9 57.8 A
2 9 56.3 B
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95.0%
pHs N Media Agrupación
1 6 57,8 A
2 6 57,3 B
3 6 56,0 C
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95.0%
Temperatura pHs N Media Agrupación
1 1 3 58,7 A
1 2 3 57,8 B
2 1 3 57,0 C
1 3 3 56,9 D
2 2 3 56,7 E
2 3 3 55,1 F
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
98
ANEXO 3: Modelo lineal general: C.A vs. T, pHs (Varios) Factor Tipo Niveles Valores
T fijo 2 1, 2
pHs(Varios) fijo 3 1, 2, 3
Análisis de varianza para C.A, utilizando SC ajustada para pruebas
Fuente GL SC Sec. SC Ajust. CM Ajust. F P
T 1 7.2327 7.2327 7.2327 2123.79 0.000
pHs(Varios) 2 4.4950 4.4950 2.2475 659.96 0.000
T*pHs(Varios) 2 0.0915 0.0915 0.0457 13.43 0.001
Error 12 0.0409 0.0409 0.0034
Total 17 11.8601
S = 0.0583571 R-cuad. = 99.66% R-cuad.(ajustado) = 99.51%
Observaciones inusuales de C.A
EE de Residuo
Obs C.A Ajuste ajuste Residuo estándar
16 292.010 291.910 0.034 0.100 2.10 R
R denota una observación con un residuo estandarizado grande.
Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95.0%
T N Media Agrupación
1 9 293,8 A
2 9 292,5 B
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95.0%
pHs(Varios) N Media Agrupación
1 6 293,8 A
2 6 293,2 B
3 6 292,5 C
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95.0%
T pHs(Varios) N Media Agrupación
1 1 3 294,3 A
1 2 3 294,0 B
2 1 3 293,2 C
1 3 3 293,2 C
2 2 3 292,5 D
2 3 3 291,9 E
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
99
ANEXO 4. IMÁGENES DE LAS ANTOCIANINAS EXTRAIDAS Y
PREPARADAS ANTES DE SU LECTURA.
100
Anexo 5: Método de pH diferencial
A. Procesos para la preparación de los reactivos:
A.1 Buffer pH 1,0 (cloruro de potasio 0,025 M).- Pesar 1,86 g de KCL en un
vaso de precipitacion, agregar agua hasta los 980 ml. Medir el pH y ajustar a
1,0 con HCl concentrado. Transferir a una probeta de 1 L y enrasar con agua
destilada.
A.2 Buffer pH 4,5 (acetato de sodio 0,4 M).- Pesar 54,43 g de CH3CO2Na-
3H2O en un vaso de precipitacion, agregar 960 ml. de agua destilada. Medir
el pH y ajustar a 4,5 con HCI concentrado.Transferir a una probeta de 1 L y
enrasar con agua destilada.
B. Preparación de la muestra:
Determinar la absorbancia de la muestra diluída con los buffers de pH 1,0 y
4,5 a 520 nm y 700 nm. Las muestras diluidas son leídas contra un blanco
de agua destilada. Medir las absorbancias entre los 20 y 50 minutos de la
preparación de la muestra
C. Cálculos:
Se calcula la concentración de pigmento antocianina, expresado como
cianidina-3 glucósido equivalente, mediante la siguiente fórmula:
Antocianinas (mg
L) =
A ∗ MW ∗ DF ∗ 103
ε ∗ 1
Dónde:
A = (A52Onm - A700nm)pH 1,0 - (A520nm - A700nm)pH 4,5.
MW = 449,2 g/mol (peso molecular) para la cianidina-3-glucósido.
DF = factor de dilución establecido previamente.
101
1 = espesor de la celda del espectro fotómetro (1 cm).
Ɛ = 26900 coeficiente de extinción molar en L mol-1cm-1, para cianidina-3-
glucósido.
103 = conversión de g a mg.
Anexo 6: Método del 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH)
En este análisis se utilizó una solución madre de DPPH, a partir de la cual
se obtuvo otra solución diluida, mezclando 10 ml de la solución madre con
45ml de metanol aproximadamente hasta obtener una solución con una
absorbancia de 1.1 ± 0.02 a una longitud de onda de 515 nm.
Para la cuantificación de la capacidad antioxidante se mezcló en un tubo de
ensayo 150 μL de muestra con 2850 μL de la solución diluída de DPPH,
luego se dejó en agitación, a temperatura ambiente y en un ambiente oscuro
por el tiempo de reacción que le correspondía a la muestra y luego se
procedió a la lectura de la muestra a 515 nm.
Reemplazando la absorbancia en la siguiente ecuación:
Y = (0.8676(ΔAbs)+0.013)(Vextracto/mmuestra)(Dil.)
Dónde:
Y = Capacidad antioxidante expresada en μmol TE/g de muestra
ΔAbs = Diferencia de absorbancia que existen entre el blanco y la muestra
Vextracto= Volumen final obtenido de la extracción en ml.
mmuestra= Cantidad de muestra utilizada en la extracción en gramos
Dil. = Dilucion del extracto (ml de alícuota/ml de extracto)
La capacidad antioxidante total se expresó como μmol equivalentes de
Trolox (TE) por g en base seca