1. INVESTIGANDO SOBRE LOS CROW TRIBUS INDIAS. 1. INVESTIGANDO SOBRE LOS CROW. TRIBUS INDIAS.
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TESE DE DOUTORADO
EFEITO DE ESTÍMULOS FÍSICOS SOBRE A ATIVIDADE DAS
BOMBAS DE PRÓTONS DE CÉLULAS VEGETAIS E SUA
PARTICIPAÇÃO NAS RESPOSTAS MORFOGÊNICAS
TATIANA DE FELICE ELIAS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIB EIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RIO DE JANEIRO
ABRIL DE 2008
iii
EFEITO DE ESTÍMULOS FÍSICOS SOBRE A ATIVIDADE DAS
BOMBAS DE PRÓTONS DE CÉLULAS VEGETAIS E SUA
PARTICIPAÇÃO NAS RESPOSTAS MORFOGÊNICAS
TATIANA DE FELICE ELIAS
“Tese submetida ao Centro de Biociências e Biotecnologia, da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Biociências e Biotecnologia”
Orientador: Prof. Arnoldo Rocha Façanha
CAMPOS DOS GOYTACAZES – R.J.
ABRIL DE 2008
iv
EFEITO DE ESTÍMULOS FÍSICOS SOBRE A ATIVIDADE DAS
BOMBAS DE PRÓTONS DE CÉLULAS VEGETAIS E SUA
PARTICIPAÇÃO NAS RESPOSTAS MORFOGÊNICAS
TATIANA DE FELICE ELIAS
“Tese submetida ao Centro de Biociências e Biotecnologia, da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Biociências e Biotecnologia”
Aprovada em 16 de Abril de 2008 Comissão Examinadora:
______________________________________________________________ Prof. Marcelo Gomes da Silva (D.S. – Física) – UENF
______________________________________________________________ Profª. Claudete Santa-Catarina (D.S. – Biotecnologia) – UENF
______________________________________________________________ Profª. Solange Silva Samarão (D.S. – Biociências e Biotecnologia) – FAETEC
______________________________________________________________ Prof. Ricardo Enrique Bressan-Smith (D.S. – Fisiologia Vegetal) – UENF
(Co-orientador)
______________________________________________________________ Prof. Arnoldo Rocha Façanha (D.S. – Química Biológica) – UENF
(Orientador)
v
Aos meus pais Elaine e Acir
Aos meus irmãos Nathalia e Fernando
Pela compreensão e incentivo
Dedico e ofereço
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida e oportunidades que me tem sido dadas.
Aos meus amados: pais e irmãos, pelo amor, amizade e constante incentivo.
A Jorge André Sacramento de Magalhães, pelo inestimável apoio, carinho e
compreensão. Por ter me dado força nos momentos mais difíceis.
A Antônio Carlos de Jesus Carvalho, meus tios e primos, e a todos os meus demais
familiares que torceram por esta conquista.
Ao Professor Arnoldo Rocha Façanha, pela confiança, apoio, oportunidade,
orientação e, amizade.
Ao Professor Ricardo Henrique Bressan-Smith, pelos ensinamentos, incentivo, co-
orientação e, principalmente, pela amizade.
A Paulo Marcelo de Souza, pela amizade e incentivo.
A Liane Cristina da S. Ferreira, pelo carinho, amizade, apoio. Obrigada pela
colaboração nos muitos trabalhos que desenvolvemos juntas durante todos esses
anos.
Aos amigos Leandro Viana, Alena Netto, Francisco Filho, Rosivany Gomes, Michelle
vii
Catunda, Inga Azevedo, pelo companheirismo, carinho e amizade dedicada.
Aos demais amigos, professores e técnicos do LBCT e LMGV (Setor de Fisiologia
Vegetal), por tornarem nossa convivência agradável e enriquecedora.
Aos funcionários do CBB e do CCTA, pelos valiosos serviços prestados.
À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), pela
oportunidade.
A CAPES, pela concessão da bolsa.
A todos que, na grandeza do anonimato, contribuíram para com o meu
Doutoramento.
viii
SUMÁRIO
RESUMO xii
ABSTRACT xiv
1. INTRODUÇÃO 01
2. REVISÃO DE LITERATURA 04
2.1 H+-ATPase de membrana plasmática 04
2.2 H+-ATPase vacuolar 06
2.3 H+-PPase vacuolar 10
2.4 H+-ATPase mitocondrial e cloroplastídica 13
2.5 Estímulos e estresses físicos 15
2.5.1 Estimulação e estresse luminoso 15
2.5.1.1 Fotorreceptores em plantas - Fitocromos e Criptocromos 17
2.5.1.2 Efeito fotoinibitório em plantas 22
2.5.1.3 Fluorescência da clorofila a 24
2.5.1.4 Efeito da luz na célula vegetal – o papel das H+-ATPases 25
2.5.2 Estimulação mecânica – “Brushing” 28
2.5.2.1 Perturbação mecânica 28
2.5.2.2 Efeito do toque no crescimento e desenvolvimento das plantas - o
papel das H+-ATPases 30
2.5.3 Estimulação Sonora 35
2.5.3.1 Som e ultrasom 35
2.5.3.2 Efeito do som e ultrasom na célula vegetal – o papel das H+-
ATPases. 37
3. OBJETIVOS 43
ix
3.1 Objetivo geral 43
3.2 Objetivos específicos 43
4. TRABALHOS 45
4.1 RÁPIDAS RESPOSTAS DOS LIPÍDIOS DE MEMBRANA E DA EFICIÊNCIA
FOTOQUÍMICA EM PLANTAS DE FEIJÃO COMUM E CAUPI (Phaseolus vulgaris e
Vigna unguiculata) SUBMETIDAS A ALTA IRRADIÂNCIA 46
4.1.1 RESUMO 47
4.1.2 ABSTRACT 48
4.1.3 INTRODUÇÃO 49
4.1.4 MATERIAL E MÉTODOS 51
4.1.4.1 Material vegetal 51
4.1.4.2 Condições de crescimento 51
4.1.4.3 Tratamento por alta irradiância 51
4.1.4.4 Fluorescência da clorofila a 52
4.1.4.5 Integridade das membranas - peroxidação lipídica 53
4.1.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 55
4.1.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 60
4.2 MODULAÇÃO DA V-ATPase E DA P-ATPase DE HIPOCÓTILOS
ESTIOLADOS DE CAUPI (Vigna unguiculata (L.) Walp.) PELA LUZ 65
4.2.1 RESUMO 66
4.2.2 ABSTRACT 68
4.2.3 INTRODUÇÃO 69
4.2.4 MATERIAL E MÉTODOS 72
4.2.4.1 Material vegetal 72
4.2.4.2 Condições de crescimento 72
4.2.4.3 Tratamentos de luz 73
4.2.4.4 Preparação da fração microssomal 73
4.2.4.5 Purificação das vesículas de membrana plasmática e de tonoplasto 74
4.2.4.6 Determinação de proteínas 74
4.2.4.7 Determinação da atividade ATPásica do tonoplasto e da plasmalema e
da atividade PPásica do tonoplasto 74
4.2.4.8 Monitoramento do gradiente de prótons 75
4.2.4.9 Determinação da velocidade inicial (V0) e da variação da fluorescência
máxima (∆Fmáx.) do transporte de prótons 76
x
4.2.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 78
4.2.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 87
4.3 ATIVIDADE DAS H+-ATPases DO TONOPLASTO E DA PLASMALEMA EM
RESPOSTA A ESTIMULAÇÃO MECÂNICA DE MAMOEIROS (Carica papaya L.) 91
4.3.1 RESUMO 92
4.3.2 ABSTRACT 94
4.3.3 INTRODUÇÃO 95
4.3.4 MATERIAL E MÉTODOS 98
4.3.4.1 Material vegetal 98
4.3.4.2 Condições de crescimento 98
4.3.4.3 Tratamento mecânico 98
4.3.4.4 Preparação da fração microssomal 99
4.3.4.5 Determinação de proteínas 99
4.3.4.6 Determinação da atividade ATPásica do tonoplasto e plasmalema 99
4.3.4.7 Monitoramento do gradiente de prótons 100
4.3.4.8 Determinação da velocidade inicial (V0) e da variação da fluorescência
máxima (∆Fmáx.) do transporte de prótons 101
4.3.4.9 Microscopia ótica convencional 102
4.3.4.10 Microscopia eletrônica de varredura 103
4.3.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 104
4.3.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 112
4.4 EFEITO DO ULTRASOM NA ATIVIDADE DAS BOMBAS DE PRÓTONS DO
TONOPLASTO E DA PLASMALEMA DE CÉLULAS DE TABACO (Nicotiana
tabacum L.) EM SUSPENSÃO 115
4.4.1 RESUMO 116
4.4.2 ABSTRACT 118
4.4.3 INTRODUÇÃO 120
4.4.4 MATERIAL E MÉTODOS 123
4.4.4.1 Material vegetal 123
4.4.4.2 Condições de crescimento 123
4.4.4.3 Preparo do pré-inoculo para isolamento de membranas 124
4.4.4.4 Tratamento sonoro 124
4.4.4.5 Preparação da fração microssomal 125
4.4.4.6 Determinação de proteínas 125
xi
4.4.4.7 Determinação da atividade ATPásica do tonoplasto e da plasmalema e
da atividade PPásica do tonoplasto 126
4.4.4.8 Microscopia ótica convencional 126
4.4.4.9 Eletroforese e “imunoblotting” de proteínas 126
4.4.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 129
4.4.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 134
5. CONCLUSÕES 137
6. BIBLIOGRAFIA GERAL 140
xii
RESUMO
As plantas são capazes de perceber e responder a estímulos internos e ambientais,
o que é de grande importância para a sobrevivência desses organismos. Entre os
estímulos ambientais mais comuns, detectados pelos organismos vivos estão as
variações de luz, temperatura, som e uma variedade de sinais mecânicos. A célula
vegetal pode perceber a gravidade; a pressão causada pelas células e estruturas
extracelulares adjacentes e pelo crescimento interno; o estresse mecânico gerado
pela neve, gelo, vento, chuva, toque, som; e o seu estado de hidratação (pressão de
turgor). Após processar essas informações, as células respondem com respostas
altamente reguladas, específicas do tipo de crescimento de cada espécie. A luz está
entre os sinais ambientais mais relevantes que afetam o desenvolvimento das
plantas, e essa pesquisa foi iniciada investigando as respostas, quanto à eficiência
fotoquímica e a integridade da membrana celular em Vigna unguiculata Walp.
Baseado na tolerância a alta irradiância demonstrada por essas espécies elas foram
escolhidas para verificarmos a sensibilidade das bombas de prótons ao estímulo
luminoso. As bombas de prótons das membranas plasmáticas (P-ATPase) e
vacuolares (V-ATPase e V-PPase) são essenciais para os eventos de absorção de
moléculas e íons e têm sido relacionadas ao controle do turgor e crescimento
celular. Estas bombas são reguladas por sinais internos e externos, e oscilações de
suas atividades em função de mudanças fisiológicas e/ou ambientais podem induzir
mudanças críticas no potencial de membrana e no funcionamento de canais iônicos
e outras proteínas relacionadas à sinalização celular. Em função disso, o presente
estudo investigou se essas bombas da célula vegetal funcionariam como sistemas
perceptores e/ou mediadores de estímulos físicos. Os resultados sugerem que a V-
ATPase é o sistema mais sensível ao estímulo luminoso. Vesículas de tonoplasto
xiii
isoladas de hipocótilos estiolados de caupi exibiram uma atividade maior quando
expostas à luz, sendo o estímulo de 30%. Quanto ao estímulo por toque e por
vibrações sonoras, os resultados sugerem que as bombas do tonoplasto e da
plasmalema são sensíveis a esses estímulos, atuando como mecanoperceptores da
célula vegetal. Vesículas de tonoplasto e plasmalema isoladas do caule de
mamoeiros estimulados mecanicamente exibiram aumento de transporte de prótons
e de atividade pelas ATPases quando estimuladas com 20 passadas (brushing) em
relação ao controle e uma redução do transporte de prótons e de atividade quando
estimuladas com 40 passadas. Para vesículas de tonoplasto e plasmalema isoladas
de células de tabaco em suspensão estimuladas por ondas ultrassônicas, os
resultados mostram um aumento da atividade da V e da P-ATPase e da V-PPase. A
PPase vacuolar exibiu pouca ou nenhuma resposta aos estímulos luminoso e por
toque. Esses resultados mostram que as V e as P-ATPases podem funcionar como
sistemas perceptores e/ou mediadores de estímulos físicos, participando
efetivamente do processo de desencadeamento e/ou transdução de sinais
ambientais na célula vegetal.
xiv
ABSTRACT
Higher plants are capable to perceive and respond to a wide range of internal and
environmental stimuli, what is of greatest importance for the survival of these
organisms. Light, temperature, sound and a variety of mechanical signals are among
the most common environmental stimuli detected by living organisms. The plant cell
may perceive gravity; strains caused by self-loading and internal growth; mechanical
loading by snow, ice, and fruit, wind, rainfall, touch, sound; and the state of hydration
within a cell (turgor pressure). After processing this information, they respond with
highly appropriate, typically growth-related responses. Light is among the most
relevant environmental signals that affects the plant development, and this research
was initiated investigating short-term responses of the photochemical efficiency and
cell membrane integrity in Vigna unguiculata Walp. Based on the tolerance to high
irradiance demonstrated by this species it was chosen to verify the sensibility of the
proton pumps to the light stimuli. The proton pumps of the tonoplast (V-ATPase e V-
PPase) and of the plasmalemma (P-ATPase) are essential for events of molecules
and ions absorption of the plant cell and they have been related to the control of the
turgor and cellular growth. These pumps are regulated by either internal or external
signals, and oscillations of their activities in function of physiological and/or
environmental signals can induce critical changes in the membrane potential and
functioning of ion channels and other proteins related to the cell signaling. In function
of this, the present study investigated whether these pumps of the plant cell could
function as perceptor and/or mediator systems of the physical stimuli such as light,
brushing and sound waves. The main results suggest that the vacuolar H+-ATPase
(V-ATPase) is the most sensitive system to the light. Tonoplast vesicles isolated from
etiolated hypocotyls of Vigna unguiculata Walp exhibited around 30% higher V-
xv
ATPase activitiy when exposed to the white light than when assayed in the dark. In
regard of the brushing and sound stimuli, the results suggest that both ATP-
dependent H+-pumps of tonoplast and plasmalemma are sensible to these stimuli,
acting also as mechanoperception of the plant cell. Tonoplast and plasmalemma
vesicles isolated from stems of papaya plants stimulated mechanically shown
increase of transport of protons and activity for the ATPases when stimulated with 20
steps of brushing in relation to the control and a reduction of the transport of protons
and activity when stimulated with 40 steps. For isolated vesicles of tonoplast and
plasmalemma of tobacco cells in suspension stimulated by ultrasonic waves, the
results show an increase of the activity of the V and the P-ATPase and the V-PPase.
In contrast, the vacuolar H+-PPase showed slight or no response to the light as well
as to the mechanical stimuli. These results show that the V and the P-ATPases can
function as perceptors and/or mediators systems of physical stimuli, participating
effectively of the process of triggering and/or transduction of environmental signals in
the plant cell.
1
1. INTRODUÇÃO
A habilidade dos organismos vivos para perceber e responder a estímulos
físicos sempre foi um fator crucial para a sobrevivência e evolução das espécies. Na
natureza, múltiplos estímulos físicos estão sempre presentes e influenciaram a
evolução de intrincados mecanismos bioquímicos responsáveis pela percepção da
luz, das sensações térmicas, do tigmotismo e uma miríade de respostas primárias e
secundárias oriundas das interações de diferentes estímulos ambientais. As plantas,
por serem organismos sésseis, precisaram desenvolver ao longo de sua evolução
mecanismos de sinalização que possibilitassem uma extensiva associação entre
vias de estímulos ambientais e respostas fisiológicas (Fasano et al., 2002). Dentre
os mecanismos bioquímicos de percepção mais estudados estão as cascatas de
sinalização desencadeadas por estímulos químicos hormonais e de
neurotransmissores. Todavia, os mecanismos pelos quais estímulos primários,
próprios do desenvolvimento da planta ou oriundos do meio ambiente, desencadeam
estas cascatas de sinalisadores químicos são menos conhecidos. Existem
relativamente poucos estudos abordando as respostas primárias da célula vegetal
aos estímulos físicos.
O movimento seletivo e a redistribuição de íons e pequenas moléculas
orgânicas através das membranas biológicas é essencial para a homeostase celular
e, consequentemente, para o desenvolvimento dos organismos. O controle dos
transportes desses íons e moléculas através da membrana plasmática e
endomembranas dos diferentes compartimentos celulares são desempenhados por
proteínas de membrana que constituem canais, carreadores e bombas
eletrogênicas. Esses sistemas possibilitam não somente os trânsitos de metabólitos
nessas membranas, como também estabelecem e mantêm gradientes iônicos que
2
são essenciais para vários processos metabólicos (Chasan e Schroeder, 1992; Taiz
e Zeiger, 1998). Os sistemas de transporte presentes nas biomembranas podem ser
divididos em dois grupos: os sistemas primários (bombas eletrogênicas), capazes de
gerar um gradiente eletroquímico ao transportar íons contra um gradiente de
concentração, utilizando-se da energia liberada na quebra de ligações covalentes, e
os sistemas secundários desempenhado por canais, carreadores ou
transportadores, onde o transporte de íons através da membrana não envolve
quebra de ligações covalentes, mas depende do desequilíbrio de cargas e diferença
de pH (∆pH) gerado na membrana pelos sistemas primários (Logan et al., 1997).
As H+-ATPases, são as principais bombas eletrogênicas responsáveis pela
interconversão da energia química, elétrica e luminosa nas células de todos os
organismos vivos. Nas membranas das células vegetais, encontram-se três
diferentes tipos de H+-ATPases (a H+-ATPase da membrana vacuolar e
endomembranas – tipo V, a H+-ATPase da membrana plasmática – tipo P e a H+-
ATPase das membranas do cloroplasto e mitocôndrio – tipo F) que se distinguem
por suas estruturas, funções, mecanismos de ação e evolução, cada uma
representando uma das três classes de ATPases translocadoras de cátions
(Pedersen e Carafoli, 1987).
Uma outra classe de enzimas, as pirofosfatases (H+-PPases) têm sido
caracterizadas tanto ao nível bioquímico quanto molecular e, atualmente, são
consideradas como um quarto grupo de enzimas translocadoras capazes de acoplar
a hidrólise do pirofosfato inorgânico à translocação de prótons através do tonoplasto
(Rea et al., 1992).
As bombas de prótons das membranas vacuolar e plasmática exercem um
papel fundamental no controle do pH citoplasmático e na manutenção da
homeostase celular, bem como no transporte de moléculas e íons e no crescimento
celular (Taiz e Zeiger, 1998). As H+-ATPases e H+-PPases vacuolares, geram um
gradiente eletroquímico de prótons através do tonoplasto, acidificando o vacúolo e
fornecendo energia para o transporte de íons e outros metabólitos. Isso possibilita a
incorporação de solutos e de água no vacúolo, induzindo à expansão da célula
devido à pressão de turgescência gerada pelo vacúolo central (Frey e Randall,
1998). A H+-ATPase de membrana plasmática, acidifica o apoplasto, o que ativa as
expansinas (proteínas que promovem a quebra e reorganização dos polímeros de
celulose da parede celular), possibilitando assim, o crescimento celular (Buchanan et
3
al., 2000). Além disso, o gradiente eletroquímico de prótons que se desenvolve
através da membrana plasmática impulsiona o transporte secundário possibilitando a
absorção de nutrientes (Serrano, 1989; 1990).
Foi postulado que dado à essencialidade das bombas eletrogênicas para os
eventos de absorção de moléculas e íons, quaisquer variações detectadas no
crescimento celular, sejam elas reguladas por fitohormônios, sinais químicos, luz, ou
estímulos mecânicos podem ter forte associação com alterações no funcionamento
dessas bombas (Serrano, 1989; 1990). Apesar disso, pouco se conhece sobre os
efeitos da luz, da estimulação mecânica (brushing) e do som sobre a atividade
destes sistemas, principalmente das bombas de H+ do tonoplasto. Nesse estudo,
objetivou-se avaliar o efeito destes estímulos (ou estresses) físicos e mecânicos
sobre a atividade das enzimas H+-ATPase e H+-PPase do tonoplasto e da H+-
ATPase da plasmalema. Com isso pretende-se estabelecer uma nova dimensão do
papel regulador dessas enzimas sobre o desenvolvimento das plantas, investigando
também o potencial destes sistemas como marcadores bioquímicos para prospecção
da intensidade e qualidade de estímulos mais efetivos à produtividade vegetal e para
a determinação fisiológica mais precisa das condições de estresse. O uso destes
marcadores poderá vir a guiar a programação de protocolos de robotização para
brushing e outros sistemas controlados de estimulação mecânica e luminosa, além
de fornecer informações básicas, necessárias à futura compreensão dos limites que
devem ser impostos em áreas agrícolas no que concerne ao controle mecânico pelo
toque e por vibrações sonoras (vento, mecanização da lavoura, pisoteio do gado,
proximidade de rodovias, e etc.) visando maximizar a produtividade agrícola.
4
2. REVISAO DE LITERATURA
2.1 H+-ATPase de membrana plasmática
A H+-ATPase de membrana plasmática (P-ATPase) de plantas desempenha
funções chave na fisiologia das plantas. Ela bombeia prótons através da membrana
plasmática do citoplasma para o exterior da célula (apoplasto) a partir da utilização
da energia proveniente da hidrólise da ligação fosfato terminal da molécula de ATP.
A bomba de prótons da membrana plasmática é uma H+-ATPase tipo P,
caracterizando-se por assumir dois estados conformacionais designados E1 e E2
(Serrano, 1989). A enzima é formada por um único polipeptídio de 100 KDa, que é
ativo nas formas monomérica e homodimérica. O monômero tem 10 domínios
transmembranares e uma grande alça hidrofílica contendo a região de ligação do
ATP (Sze et al., 1999) (Figura 1). As ATPases de membrana plasmática são inibidas
por ortovanadato (H2VO4-) (Sze et al., 1999) e por complexos de fluoreto de alumínio
(Façanha e de Meis, 1995) por competirem com o fosfato pelo sítio de fosforilação
da enzima .
A H+-ATPase de membrana plasmática constitui uma base para processos de
transporte pela membrana plasmática, devido à formação do gradiente de pH e do
potencial elétrico gerado pela bomba. Contudo, além do fluxo dirigido através de
outros sistemas de transporte, a H+-ATPase de membrana plasmática representa
várias outras funções essenciais na biologia celular da planta. A acidificação da
parede celular induz a plasticidade da parede, possibilitando, assim, a expansão
celular, e a bomba também é essencial na remoção do excesso de H+ do citossol. A
alcalinização do citoplasma talvez seja um dos fatores disparadores da divisão
celular (Serrano, 1989; Serrano, 1990).
5
Figura 1. Estrutura geral da H+-ATPase de membrana plasmática, exibindo os 10
domínios hidrofóbicos e a grande alça que contém a região de ligação do ATP.
Fonte: Buchanan et al., 2000.
Como outras enzimas, a ATPase de membrana plasmática é regulada por
variáveis tais como a concentração de substrato (ATP), pH, temperatura e
fosforilação/desfosforilação (Sze et al., 1999). Moléculas individuais de H+-ATPase
podem ser reversivelmente ativadas ou desativadas em resposta a uma variedade
de sinais, tais como luz, hormônios, ataque de patógenos, dentre outros. Esse tipo
de regulação é mediado por um especializado domínio autoinibitório da região C-
terminal da cadeia polipeptídica, o qual age como uma válvula, regulando a atividade
da bomba de prótons (Taiz e Zeiger, 1998).
Eventos de fosforilação e desfosforilação são mecanismos de regulação das
H+-ATPases de membrana plasmática que podem alterar a atividade da bomba.
Assim, a promoção ou inibição da atividade dessas enzimas, resulta da modulação
dependente de fosforilação, promovendo com isso, a ligação da proteína 14-3-3
ativada ao domínio autoinibitório. A ligação da proteína 14-3-3 depende da
fosforilação de um resíduo de treonina na conservada seqüência C-terminal da
enzima. Análises desse complexo formado entre a H+-ATPase de membrana
plasmática e a proteína 14-3-3 (H+-ATPase●14-3-3) mostram que ele apresenta a
estrutura em forma de roda, com 6 H+-ATPases associadas por 6 proteínas 14-3-3.
6
A H+-ATPase de membrana plasmática é mais efetivamente regulada ao nível pós-
translacional (Kanczewska et al., 2005; Ottmann et al., 2007).
As proteínas 14-3-3 estão presentes em todos os eucariotos e agem como
reguladores em várias vias de transdução de sinal, desempenhando um papel
funcional chave em muitas rotas fisiológicas que são reguladas por fosforilação. Sua
função é completar o processo de tradução de sinais, atuando como ligante
fisiológico; completando uma mudança na estrutura, o que regula a atividade de
enzimas (DeLille et al., 2001).
2.2 H+-ATPase vacuolar
A H+-ATPase vacuolar (V-ATPase) está presente em endomembranas de
todos os eucariotos. Isso inclui o retículo endoplasmático, o aparelho de Golgi, o
lisossomo, o tonoplasto, e vesículas intracelulares que traficam entre todas essas
membranas (Dettmer et al., 2006).
Os sistemas de transporte primários de prótons da membrana vacuolar de
plantas, denominada tonoplasto, exercem um papel fundamental no controle do pH
citoplasmático e na manutenção da homeostase celular. Sob condições de estresse
como salinidade, seca, frio, estresse ácido, anoxia e excesso de metais pesados no
solo, a sobrevivência da célula depende fortemente da manutenção ou ajuste da
atividade da V-ATPase (Dietz et al., 2001). Por isso, fatores que afetam a atividade
dessas enzimas geralmente provocam reflexos severos sobre o desenvolvimento da
planta (Taiz e Zeiger, 1998).
O vacúolo é a maior organela da maioria das células vegetais, podendo
compreender mais de 90% do espaço intracelular de uma célula madura (Taiz,
1992). No tonoplasto, encontram-se duas diferentes bombas de prótons, uma H+-
ATPase do tipo V e uma próton-pirofosfatase (H+-PPase) ligadas à membrana (Rea
et al., 1992). Ambas as enzimas são capazes de gerar um gradiente eletroquímico
de prótons no tonoplasto pela hidrólise de ATP ou de PPi, os quais são utilizados
para energizar a translocação de solutos (como íons inorgânicos, açúcares e ácidos
orgânicos) do citoplasma para o interior do vacúolo (Rea e Sanders, 1987). Essa
atividade é de vital importância para o controle da concentração de metabólitos e
para a compartimentação de agentes tóxicos, que, eventualmente, possam vir a
acessar o citoplasma (Taiz, 1992). Esse gradiente de H+ gerado através da
7
membrana vacuolar pode, também, impulsionar a síntese de ATP e PPi, devido à
capacidade de reversibilidade dos ciclos catalíticos dessas enzimas (Façanha e de
Meis, 1998).
A H+-ATPase do tonoplasto consiste de várias subunidades polipeptídicas, as
quais estão localizadas em dois domínios, um domínio globular hidrofílico na
periferia da membrana (V1), contendo o sítio de ligação nucleotídica, e um domínio
hidrofóbico integral da membrana (V0), contendo o canal de próton (Ratajczak, 2000)
(Figura 2). Análises de membranas vacuolares utilizando técnicas de microscopia
eletrônica, revelaram que a ATPase vacuolar apresenta uma estrutura “cabeça e
talo” similar na forma mas diferente no tamanho àquele apresentada pela H+-ATPase
do tilacóide e da membrana mitocondrial (F-ATPase) (Figura 4) (Bowman et al.,
1989). Apesar do alto grau de homologia estrutural entre essas enzimas, “in vivo” as
V-ATPases operam hidrolisando o ATP, enquanto as F-ATPases promovem a
síntese do ATP (Grabe et al., 2000).
Devido a grande semelhança estrutural existente entre as V-ATPases e as F-
ATPases, acredita-se que as V-ATPases também compartilhem um modelo
mecânico funcional comum com as F-ATPases, onde cada subunidade da V-ATPase
seria atribuída a uma das 4 partes da “máquina mecânoquímica” de Paul Boyer (F-
ATPase), apresentando-se da seguinte forma: 1-unidade catalítica, 2-talo, 3-gancho
e 4-turbina. A unidade catalítica seria composta pelas subunidades A e B, o
tradicional tronco agora dividido em gancho seria composto pelas subunidades E e
G, o talo pela subunidade D, e, a turbina seria composta pelas subunidades a e c. O
setor catalítico teria a função de ligar e hidrolisar ATP, promovendo uma rotação
momentânea do talo, que por sua vez irá rodar a turbina. A turbina tem a função de
conduzir H+ através da membrana e o gancho previne a rotação da unidade
catalítica (Nelson e Harvey, 1999).
A homologia na seqüência de várias subunidades das ATPases do tilacóide e
da membrana mitocondrial com a ATPase do tonoplasto e a similaridade na
estrutura das holoenzimas sugerem a existência de uma proteína ancestral comum
no passado evolutivo de ambas as ATPases (Ratajczak, 2000). Entretanto, as
ATPases do tonoplasto mostram uma complexidade ainda maior que suas parentais,
as ATPases do tipo F (Lai et al., 1991).
A ATPase vacuolar de plantas possui um peso molecular de,
aproximadamente, 730 kDa, mas, tem sido observado que a composição das
8
subunidades da ATPase do tonoplasto em preparações de diferentes espécies de
plantas não tem sido a mesma. Se a composição da subunidade realmente variar
entre espécies, a atividade enzimática também poderia sofrer variações entre as
espécies (Ratajczak, 2000).
A configuração básica da porção periférica (V1) consiste em três cópias da
subunidade catalítica A, onde se situam os sítios de ligação de ATP (Nelson e Taiz,
1989), intercaladas por três cópias da subunidade B, subunidade não-catalítica de
ligação do substrato; apresentando massa molecular de 67 a 73 kDa e 55 a 60 kDa,
respectivamente (Ratajczak, 2000). As subunidades A e B apresentam semelhanças
estruturais com as subunidades ββββ e αααα, respectivamente, da ATPase do tilacóide e da
membrana mitocondrial. As subunidades D (32 a 33 kDa) e G (12-16 kDa) participam
no acoplamento da hidrólise de ATP e no transporte de H+ (Ratajczak, 2000)
enquanto as subunidades F (13-14 kDa) e E (28 a 32 kDa) parecem estar envolvidas
na conexão dos setores V0 e V1, mantendo a estabilidade estrutural da enzima
(Tomashek et al., 1997). Podemos observar ainda as subunidades C (40 a 45 kDa) e
H (51-54 kDa). A configuração básica da porção integral de membrana (V0) é
composta por 6 subunidades (a, c, c' , c'' , d e e). A subunidade c é um peptídio
altamente hidrofóbico (Ratajczak, 2000; Drory e Nelson, 2006) e parece estar
envolvida diretamente na translocação de H+ (Figura 2).
Figura 2. Estrutura geral da H+-ATPase do tonoplasto mostrando o setor V1,
orientado para o citossol, e o setor V0, integral de membrana com suas múltiplas
subunidades. Fonte: Forgac, M. (1998).
exterior celular
citoplasma
membrana
9
Liu et al. (2004) mostraram que a fosforilação aumentou a atividade da V-
ATPase em vesículas isoladas de raízes de milho. Os autores identificaram a
subunidade A como sendo fosforilada em um resíduo serina conservado da
subunidade. Em virtude da seqüência de aminoácidos dessa região fosforilada e
pelo fato da subunidade A da V-ATPase parecer ser homóloga com a subunidade β
da F-ATPase, foi hipotetizado que a V-ATPase pode interagir com membros da
família de proteínas 14-3-3, de maneira dependente de fosforilação, justamente
como as F-ATPases. Recentemente foi encontrado que a subunidade β da F-
ATPase de plantas pode se ligar a proteínas 14-3-3, o que resulta na inibição da
atividade das ATPases (Bunney et al., 2002).
As V-ATPases são estimuladas por ânions, como o cloreto, e,
especificamente, inibidas por nitrato e pelos antibióticos bafilomicina A1 e
concanamicina A, e podem, também, ser inibidas pelo ADP citosólico, que compete
com o ATP pelo sítio catalítico (Kettner et al., 2003). Entretanto, são insensíveis ao
inibidor da ATPase de membrana plasmática (ortovanadato) e ao inibidor da ATPase
do tilacóide e da membrana mitocondrial (azida e oligomicina). O nitrato promove a
dissociação entre os setores V1 e V0 da enzima (Kane et al., 1989; Bowman et al.,
1989). A ação da bafilomicina A1 se dá pela ligação desse inibidor ao setor V0 da V-
ATPase impedindo assim o fluxo de prótons através do canal de prótons da enzima
(Crider et al., 1994). Foi demonstrado que a ligação da bafilomicina A1 ao setor V0
ocorre na subunidade c (16 kDa) (Bowman e Bowman, 2002).
O pH ótimo para atividade dessas enzimas está entre 7.0 e 8.0. Diferentes
mecanismos estão envolvidos na regulação da atividade dessas enzimas, tais como:
fosforilação das subunidades da ATPase do tonoplasto, modificações do estado
redox da enzima por oxidação e redução de grupos sulfidrilas essenciais, presentes
nas subunidades A e B da ATPase do tonoplasto (Merzendorfer et al., 1997).
Mudanças na disponibilidade do substrato Mg-ATP no citoplasma e os fosfolipídios
presentes na fase cristalina líquida do tonoplasto são importantes fatores para a
regulação, o que mostra a complexidade dos mecanismos regulatórios da atividade
dessas enzimas (Merzendorfer et al., 1997). Outro mecanismo de regulação da V-
ATPase é a dissociação reversível do complexo enzimático (setores V1 e V0 da
enzima) (Kane, 1995; 2000). Os setores V1 e V0 da V-ATPase quando dissociados
não são capazes de hidrolisar ATP e transportar H+, diferentemente dos setores F1 e
F0 da F-ATPase (Zhang et al., 1992; Finbow e Harrison, 1997; Parra et al., 2000).
10
A mudança na eficiência do acoplamento do transporte de H+ à hidrólise de
ATP é outro mecanismo de regulação da H+-ATPase vacuolar (Sze et al., 1999,
Forgac, 1999). Vários fatores podem causar mudanças na taxa de acoplamento do
transporte de prótons e hidrólise de ATP (Forgac, 1998; Müller et al., 1999). A
atividade da V-ATPase também pode ser regulada pela interação com proteínas
ativadoras e inibidoras de baixo peso molecular (Merzendorfer et al., 1997).
Além da regulação no nível protéico (pós-traducional), a regulação da
expressão de genes da V-ATPase também é uma importante forma de se modular
os fenômenos associados a atividade desta enzima. Foi observado que a
quantidade de RNAs mensageiros das subunidades da V-ATPase e da holoenzima é
alterada em resposta a estresses ambientais como temperatura e salinidade bem
como por fitormônios que também podem influenciar a expressão de genes da V-
ATPase e a modificação em nível de proteína. A regulação pela expressão das
diferentes isoformas das subunidades da ATPase do tonoplasto em vários tecidos ou
sob certas condições ambientais exerce influência sobre o desenvolvimento da
morfologia geral da planta (Ratajczak, 2000).
2.3 H+-PPase vacuolar
As H+-PPases são encontradas principalmente em plantas superiores, em
alguns protozoários, e em várias espécies de eubactéria e archeobactéria (Karlsson,
1975; Drozdowicz e Rea, 2001; Mimura et al., 2004; Au et al., 2006). São proteínas
com uma única classe de polipeptídios de 75 KDa, altamente hidrofóbicas, com 14-
17 domínios α-hélices expandidos na membrana, funcionando provavelmente, como
um homodímero na geração de gradientes de prótons através de endomembranas
usando a energia da ligação fosfoanidrida de moléculas de pirofosfato inorgânico
(PPi) como substrato de baixo custo, mas de alta energia (Buchanan et al., 2000,
Maeshima, 2000) (Figura 3). O pH ótimo para sua atividade varia na faixa de 6,5 a
7,5 (Maeshima e Yoshida, 1989). A região catalítica que contém o sítio de ligação do
substrato (Mg-PPi) é formada por 5 alças citoplasmáticas (e, i, K, m e o) com
sequências de aminoácidos relativamente conservadas na região C-terminal
(Mimura et al., 2004).
As H+-PPases são inibidas, especificamente, por bifosfonatos (compostos
contendo ligação P-C-P não hidrolisável ao invés da cadeia P-O-P), por análogos de
11
PPi como o imidodifosfatos (IDP) (contêm grupo P-N-P não hidrolisável), fluoretos
(KF e NaF), e aminometilenodifosfonato (AMDP), um potente inibidor específico de
H+-PPase de plantas (Baykov et al., 1993; Zhen et al. 1997; Baykov et al., 2000;
Szabo e Oldfield, 2001).
Figura 3. Estrutura geral da H+-PPase do tonoplasto, exibindo os domínios
hidrofóbicos e o sítio de ligação do PPi. Fonte: Maeshima, 2000.
Essas enzimas, em alguns casos, podem gerar um gradiente de prótons de
magnitude similar ao gerado por H+-ATPases vacuolares de algumas espécies
vegetais (Lüttge et al.,1995). A quantidade estimada sugere que a H+-PPase K+-
dependente representa entre 1% a 5-10% da proteína total do tonoplasto enquanto
que a H+-ATPase pode constituir mais de 30% (Maeshima e Yoshida, 1989; Klink et
al., 1990). Na maioria dos tecidos a V-ATPase é a bomba de prótons dominante
(Müller et al., 1996).
Experimentos têm sido realizados com a finalidade de esclarecer porque a H+-
PPase coexiste com a H+-ATPase na mesma membrana vacuolar. A existência da
H+-PPase em células de plantas pode estar relacionada à imensa área dos vacúolos
nas plantas (Nakanishi e Maeshima, 1998). Além da H+-PPase ser funcional na
energização dos sistemas de transporte secundários da membrana vacuolar em
sincronismo com a V-ATPase nas plantas sob diversas condições fisiológicas, o PPi
tem sido considerado um substrato alternativo ao ATP, atuando como doador de
energia metabólica da célula sob estresse energético. Os níveis da atividade
Sítio de ligação do PPi Citoplasma
Vacúolo
12
enzimática e dos transcritos da H+-PPase, apresentaram notáveis aumentos em
plântulas de arroz submetidas a condições de estresse (anoxia e baixa temperatura).
De acordo com esses dados, acredita-se que a H+-PPase possa atuar,
principalmente, em condições de estresse (Carystinos et al., 1995).
É proposto que esta enzima facilita a conservação da demanda limitada de
ATP e recicla Pi durante condições de estresse (Palma et al., 2000). Uma vez que
grandes quantidades de PPi inorgânico são produzidas como subproduto da síntese
de macromoléculas, reações que utilizem PPi em vez de ATP consistem em uma
vantagem bioenergética óbvia para plantas sujeitas a balanços desfavoráveis de
energia. Todas as principais vias biossintéticas geram PPi. Como exemplos
podemos citar: a acetilação da CoA na síntese de ácidos graxos; a aminoacilação do
tRNA na síntese de polipeptídeos; a formação de ligações fosfodiéster na síntese de
polinucleotídeos e a ativação de açúcares na síntese de polissacarídeos. Outras
importantes reações que formam PPi são a síntese de nucleosídeos e lipídeos, e a
formação de fosfosulfato de adenosina a partir de ATP e SO42- (Rea e Sanders,
1987).
Essas enzimas podem funcionar como um sistema de fornecimento de
energia em forma de um gradiente de pH através do tonoplasto, que é utilizado para
energizar o transporte ativo secundário, e também podem contribuir juntamente com
a V-ATPase na regulação do pH citossólico (Barkla e Pantoja, 1996; Maeshima,
2001). Em sementes e coleóptilos de milho, o gradiente de H+ gerado pela H+-PPase
e pela V-ATPase pode ser utilizado por essas enzimas para a síntese de ATP e PPi,
respectivamente, mostrando um caráter de reversibilidade dessas bombas de H+
(Façanha e de Meis, 1998). Em condições onde haveria uma limitação no
suprimento de ATP, a H+-PPase teria o papel de gerar e manter o gradiente
eletroquímico de H+ através do tonoplasto.
As H+-PPases têm sido clonadas de diferentes organismos como plantas
terrestres, algas marinhas e verdes, bactérias fotossintéticas, protozoários e
arqueobactérias (Maeshima, 2001). O primeiro cDNA para H+-PPase clonado foi de
Arabidopsis thaliana, apresentando uma isoforma AVP1 (Sarafian et al., 1992) K+
dependente e mais recentemente foi caracterizado o cDNA para uma outra isoforma,
K+ independente, AVP2 (Drozdowicz et al., 2000).
Drozdowicz et al., (2000) verificaram que a AVP2 apresenta algumas
características semelhantes a H+-PPase estimulada por K+ (AVP1). Tanto AVP1
13
quanto AVP2 apresentam cinética de hidrólise de PPi praticamente idênticas e
ambas apresentam um requerimento obrigatório por Mg2+ e a inibição por
aminometilenodifosfonato (AMDP) é semelhante em ambas H+-PPases. Por outro
lado, ao contrário de AVP1, cuja atividade apresentou um aumento de oito vezes
com a inclusão de 50 mM de KCl ao meio de ensaio, AVP2 não apresentou estímulo
por K+ na hidrólise de PPi e no transporte de H+, sendo então considerada K+-
independente. Outra diferença entre essas duas H+-PPases é sua sensibilidade ao
cátion Ca2+. AVP2 é 3 vezes mais sensível ao Ca2+ livre do que AVP1. Além do
mais, AVP2 apresenta somente 36% de identidade de seqüência de aminoácidos
com AVP1, enquanto que AVP1 mostram 80% ou mais de identidade entre si. A
partir desses resultados, Drozdowicz et al. (2000) designaram AVP1 como sendo H+-
PPase do tipo I e AVP2 como H+-PPase do tipo II.
O bombeamento de prótons, pela H+-ATPase e pela H+-PPase, não somente
energiza o tonoplasto para o transporte mediado por carreadores, mas também gera
o baixo pH do vacúolo, onde proteases, glucosidases, fosfatases, e nucleotidases
permanecem e funcionam em pH ácido (Buchanan et al.,2000).
2.4 H+-ATPase mitocondrial e cloroplastídica
Assim como as V-ATPases, as H+-ATPases mitocondrial e cloroplastídica (F-
ATPases) consistem de duas principais porções: uma porção expandida na
membrana (F0), contendo o canal de próton, e uma porção solúvel (F1), contendo os
sítios de ligação nucleotídica (Figura 4) (McCarty et al., 2000).
As H+-ATPases do tipo F são encontradas nas membranas mitocondrial
interna (F1F0-ATPase) e cloroplastídica (CF1CF0-ATPase) das plantas e sintetizam
ATP. Esses dois tipos de membranas contêm cadeias de transporte de elétrons
bombeando prótons impulsionadas pelo potencial redox e pela energia luminosa,
respectivamente. A força próton motora estabelecida pela cadeia de transporte de
elétrons aciona o fluxo de prótons por meio das ATPases tipo F, assim resultando na
síntese de ATP. As enzimas possuem várias subunidades em comum que são
essenciais para catálise e as subunidades adicionais provavelmente executam
funções regulatórias (Buchanan et al., 2000).
14
H+-ATPase mitocondrial
Estudos de cinética enzimática realizados por Paul Boyer, nas décadas de 50
e 60, o levaram a propor o ciclo catalítico das F-ATPases ou ATP sintases que
predizia a existência de três sítios de ligação para nucleotídeos, os quais
apresentariam três conformações distintas. Em um dado instante, um sítio está em
uma conformação aberta, outro está ligando um nucleotídeo de adenina (ADP+Pi /
ATP) e o terceiro está ligando firmemente o nucleotídeo sintetizado (ATP).
Posteriormente, esses estudos foram confirmados através de estudos
cristalográficos do setor F1 de mitocôndria de boi, realizados por Jonh Walker, o qual
apresentou um modelo conformacional para síntese de ATP estruturado como
predito por Paul Boyer, o qual postula que o ATP é sintetizado pelas ATPases tipo F
através de um processo de catálise rotacional, onde os três sítios catalíticos
alternam-se nas atividades de ligação de substratos (ADP e Pi), catálise/sintese e
liberação do produto (ATP) (Boyer, 1997; Grabe et al., 2000; Buchanan et al., 2000).
Estes estudos abriram novas perspectivas na compreensão da catálise enzimática, e
a enorme quantidade de pesquisas que se seguiram têm demonstrado que a
transdução de energia realizada por essas enzimas envolve principalmente discretas
perturbações mecânicas nas subunidades envolvidas na catálise da reação. Parte
da energia que é transformada em síntese de ATP ou em gradiente eletroquímico
(via reversa) provém da própria ligação do substrato á enzima (energia de ligação) e
outra parte advêm de energia cinética (elástica) acumulada na estrutura da
subunidade catalítica (Boyer, 1989).
15
Figura 4. Estrutura geral da H+-ATPase do mitocôndrio mostrando o setor F1,
orientado para a matriz mitocondrial, e o setor F0, integral de membrana com suas
múltiplas subunidades. Fonte: www.abcbodybuilding.com/.../simpleatpase.jpg.
H+-ATPase cloroplastídica
As ATPases do cloroplasto são enzimas multiméricas com pesos moleculares
por volta de 450 KDa, capazes de utilizar a energia do gradiente eletroquímico
gerado na membrana dessa organela para sintetizar ATP a partir de ADP e Pi
(Pedersen e Carafoli, 1987). Esse gradiente eletroquímico é gerado por sistemas
translocadores de prótons localizados nos tilacóides. No cloroplasto, existem
fotorreceptores capazes de captar a energia luminosa elevando seus elétrons a
camadas mais energéticas, desencadeando assim um processo de transporte
eletrônico que, por sua vez, energiza o transporte de prótons através dos tilacóides.
Tem-se, então, a conversão da energia luminosa em energia eletroquímica do
gradiente de prótons, e essa, se converte em energia química, pela ação da ATP-
sintase ao catalisar a síntese de ATP.
É também importante entender que a atividade da ATPase de cloroplasto
(bombeando prótons para dentro) é controlada tanto pela ativação pelo pH do próton
conduzido pelo canal transtilacoidal (CF0, a parte da ATPase ligada a membrana),
bem como pelo estado de redução do resíduo chave de cisteína (SH-HS) da
subunidade γ da porção CF1 da proteína (exposto para o estroma, porção extrínseca
da ATPase que tem a atividade enzimática) (Mills e Mitchell, 1982).
Matriz
Espaço inter membrana
16
2.5 Estímulos e estresses físicos
2.5.1 Estimulação e estresse luminoso
Por não se locomoverem, as plantas desenvolveram estratégias para se
adaptarem a diversas mudanças ambientais, incluindo a luz, otimizando assim, o
crescimento (Chamovitz e Deng, 1996). Dos muitos estímulos afetando o
desenvolvimento das plantas, a luz é o mais importante sinal ambiental. Ela é a fonte
de energia para o processo fotossintético, um sofisticado processo modulado pela
quantidade e qualidade de luz, provendo a energia química na forma de açúcares
necessária para a manutenção e o crescimento da célula, e por isso, as plantas
desenvolveram uma complexa e sofisticada maquinaria que lhes capacita
perceberem a presença, ausência, qualidade, intensidade, direcionalidade e
durabilidade dessa luz incidente e usam isso como um sinal para otimizar o
crescimento e desenvolvimento durante seu ciclo de vida (Batschauer, 1998; Quail,
2002).
A luz está envolvida em todos os aspectos do desenvolvimento, tendo
particularmente intenso efeito na morfogênese de plântulas durante a transição da
forma de vida heterotrófica (sob a terra) para o crescimento fotoautotrófico. Durante
o desenvolvimento da plântula, a luz inibe o crescimento do hipocótilo, estimula a
abertura do gancho, a expansão do cotilédone, induz a diferenciação de folhas e
cloroplastos, e a formação de pigmentos e tricomas, e a expressão de um grande
número de genes codificados pelo núcleo e pelo cloroplasto (Chory, 1997;
Batschauer, 1998). Vários outros aspectos do crescimento e desenvolvimento das
plantas são afetados pela luz, tais como, germinação de sementes, percepção e
resposta de plantas próximas, abertura estomática, fototropismo e indução do
florescimento (Batschauer, 1998; Lin, 2000).
A informação fornecida pelo ambiente de luz pode ser percebida por um
complexo sistema de diferentes fotorreceptores, os quais detectam diferentes
qualidades de luz sobre uma ampla área espectral. Esses receptores são os
fitocromos, que são os fotorreceptores mais bem caracterizados e responsáveis pela
detecção de luz vermelha (600 – 700 nm) e luz vermelha distante (700 – 750 nm), os
criptocromos e as fototropinas são fotorreceptores de luz azul (390 – 500 nm) e luz
UV-A (320 – 390 nm) e os fotorreceptores de luz UV-B. Esses pigmentos traduzem
17
sinais de luz em sinais bioquímicos, subseqüentemente, traduzindo rotas
desconhecidas diretamente em mudanças moleculares e fisiológicas que modulam o
crescimento e o desenvolvimento (Casal et al., 1998). Existem ainda os pigmentos
fotossintéticos que compreendem um grupo adicional de fotorreceptores. Esse grupo
inclui as várias clorofilas e carotenóides envolvidos primariamente na transferência
da energia luminosa para a cadeia transportadora de elétrons na fotossíntese
(Goodwin, 1988).
2.5.1.1 Fotorreceptores em plantas - Fitocromos e C riptocromos
Os fitocromos constituem uma pequena família de proteínas diméricas e são
compostos de dois polipeptídios de, aproximadamente, 125 KDa. A região
fotorreativa (cromóforo) dessas proteínas é formada por uma cadeia aberta
tetrapirrólica fixada a um resíduo conservado de cisteína na região do domínio amino
terminal de cada subunidade, o qual retém a habilidade de fotoconverter o fitocromo
natural entre FV e FVD (ver a explicação abaixo). Por outro lado, o menos bem
conservado domínio C-terminal está envolvido na dimerização dos dois monômeros
e na tradução do sinal luminoso (Chory, 1997; Buchanan et al., 2000).
A atividade fotossensora da molécula de fitocromo é caracterizada pela
capacidade de ser submetida à reversibilidade, interconversão induzida por luz entre
duas conformações: a forma biologicamente inativa, que absorve luz vermelha (FV),
e a forma biologicamente ativa, que absorve luz na faixa do vermelho distante (FVD)
(Smith, 2000). Essa fototransformação envolve uma isomerização cis-trans de uma
das cópias ligadas ao cromóforo, resultando em uma reorientação do cromóforo
relativo ao polipeptídio, e múltiplas mudanças conformacionais na estrutura
tridimensional da proteína (Chamovitz e Deng, 1996). Os fitocromos são sintetizados
na forma FV e é nesta forma, também, que são encontrados no citossol e/ou talvez
associados com a membrana plasmática (Nagy et al., 2000).
A luz, como uma onda eletromagnética, pode facilmente penetrar nos tecidos
das plantas. Luz vermelha (V) e vermelho distante (VD) podem, então, passar
através de múltiplas fileiras de folhas ou órgãos compactos como hastes e ativar os
fotorreceptores fitocromos provavelmente em todas as células de qualquer tecido
exposto diretamente ou indiretamente à luz (Nagy et al., 2000). Estudos fisiológicos
indicaram que o fitocromo está distribuído por toda parte da planta, apesar de certos
18
tipos celulares, dependendo do estádio de desenvolvimento, conterem diferentes
quantidades do fotorreceptor (Clack et al., 1994), entretanto, cada célula da planta
contém, no mínimo, um tipo de fitocromo para algum estádio de desenvolvimento
(Nagy et al., 2000).
Em Arabidopsis thaliana, o componente da apoproteína do fitocromo é
codificado por cinco genes designados phyA - phyE (Clack et al., 1994). O fitocromo
A (PHYA, também referido como fitocromo tipo I) é necessário para percepção de
luz vermelha distante (VD) contínua. É uma molécula solúvel que está
uniformemente distribuída no citoplasma de plantas crescidas no escuro e,
comparado a outros fitocromos, o PHYA é altamente abundante em plântulas
estioladas. A converção da forma FVD pela absorção de luz vermelha origina o PHYA
para, rapidamente, agregar-se ao citoplasma e degradar-se (Vierstra, 1994). O
fitocromo B (PHYB) é necessário para percepção de luz vermelha (V) contínua. Está
presente em baixos níveis nas condições de escuro e luz, sendo estável na forma
FVD (Reed et al., 1994). O PHYA e o PHYB têm diferentes funções fotoperceptoras.
O PHYB parece estar envolvido na percepção de raios V/VD, enquanto que PHYA
percebe transições de escuro/luz, se igualando sobre espessa cobertura ou após
curta exposição à luz (Casal et al., 1997). Em contraste, o ponto final do processo
controlado pelos fitocromos A e B é o mesmo. Em Arabidopsis, ambos os fitocromos
controlam o processo de germinação e as mudanças fotomorfogênicas (Reed et al.,
1994). Pouco se conhece sobre as funções dos PHYC, -D e -E.
Em plântulas estioladas e adaptadas ao escuro, os fitocromos A e B estão
localizados no citossol. O transporte nuclear desses fitocromos é dependente de luz
e cada espécie de fitocromo mostra ser dependente de uma qualidade e quantidade
de luz específica para o transporte ou formação nuclear (Nagy et al., 2000).
Tradicionalmente, três “modos de ação” de fitocromos têm sido descritos:
resposta de muito baixa fluência (RMBF); resposta de baixa fluência (RBF) e
resposta de alta irradiância (RAI) (Casal et al., 1998). Os efeitos de pulsos de luz
seguidos por escuridão são chamados respostas “indutivas” porque o sinal de luz
estabelecido durante o pulso de luz continua operando durante algum tempo no
escuro. Esses efeitos (promoção ou inibição) podem ser classificados como RMBF
ou RBF, dependendo das fluências de vermelho necessárias para estabelecer esses
valores de FVD. Proporções muito baixas de fitocromos como FVD (FVD/F) são
suficientes para induzir RMBF, enquanto altos níveis de FVD/F são necessários para
19
induzir RBF. Em alguns processos, um único pulso de luz não mostra efeito
detectável, mas repetidos pulsos de luz (de hora em hora) são efetivos (Casal et al.,
1998). Os efeitos de luz contínua são chamados RAI, entretanto, alguns efeitos não
requerem especificamente luz contínua e podem ser induzidos (ao menos
parcialmente) com repetidos pulsos do mesmo comprimento de onda, dando, na
mesma fluência total, como luz contínua (Casal et al., 1998).
Os tecidos podem se adaptar ou tornar-se menos sensíveis a contínuos
sinais, e as concentrações dos receptores podem mudar durante o desenvolvimento
da planta. Quando plântulas estioladas são expostas à luz branca ou vermelha,
ocorre uma rápida redução nas concentrações de fitocromo, devido à degradação.
Concentrações de fitocromos em plantas verdes são bem menores (cerca de 100
vezes menor do que em plântulas estioladas) (Buchanan et al., 2000). Isso,
provavelmente, ocorre devido à necessidade das plântulas estioladas de otimizarem
a capacidade de captação de luz, necessitando, com isso, de um número maior de
fotorreceptores, enquanto as plantas verdes, que já estão inseridas em ambientes
iluminados, conseguem captar a luz com facilidade (Buchanan et al., 2000).
Um modelo geral para sinalização requer fotorreceptores extranucleares
iniciando uma cascata de sinalização, onde o resultado final é a modulação da
expressão gênica ou uma mudança nos parâmetros fisiológicos celulares, tais como
potencial de membrana e/ou pH local, para modificar a morfologia e otimizar a
fotossíntese (Chamovitz e Deng, 1996).
A ativação do fitocromo por luz vermelha parece envolver eventos de
fosforilação de proteínas, sugerindo que uma cascata de fosforilação/desfosforilação
talvez exerça um papel importante na rota de sinalização (Singh e Song, 1990;
Harter et al., 1994). As proteínas G heterotriméricas são mediadores que transmitem
sinais externos via moléculas receptoras para moléculas efetoras (Fujisawa et al.,
2001). Elas são proteínas associadas à membrana, com peso molecular de 40 KDa,
que ligam um GTP análogo em uma forma dependente de luz (Warpeha et al.,
1991). Trabalhando com frações enriquecidas com membrana plasmática isolada do
botão apical de ervilha estiolada, Warpeha et al. (1991) demonstraram que a luz azul
excita a atividade de uma GTPase, sendo ADP-ribosilada. Experimentos com
inibidores e ativadores de algumas proteínas G heterotriméricas indicaram que
várias dessas proteínas podem estar envolvidas em respostas celulares e na
20
regulação da expressão gênica mediada por fitocromos (Romero e Lam, 1993;
Assmann, 2002).
De acordo com Schneider-Poetsch et al. (1991) e Thummler et al. (1995) o
domínio catalítico do fitocromo apresenta potenciais similaridades com o domínio
catalítico da proteína quinase. Entretanto, nenhuma atividade quinase tem sido
mostrada pelo fitocromo, e de fato, várias linhas de evidência debatem contra uma
funcional similaridade entre o fitocromo e as proteínas quinases (Quail, 1994).
O cálcio tem muitos importantes papéis estruturais e fisiológicos nas plantas,
atuando como um mensageiro secundário em diversas cascatas intracelulares de
processos bioquímicos nas plantas em resposta a luz (Nayyar, 2003). O cálcio e a
calmodulina ativada por cálcio estão envolvidos na transdução de sinais do
fitocromo, levando à expressão da clorofila a/b (Neuhaus et al., 1993), enquanto que
guanosina monofosfato (GMPc) medeia o sinal de biossíntese de antocianina
induzido pelo fitocromo (Bowler et al., 1994a). Além disso, a GMPc e
Ca2+/calmodulina são necessários para o desenvolvimento dos cloroplastos (Bowler
et al., 1994a; Bowler et al., 1994b), indicando que há ligação na rota entre a GMPc e
Ca2+/calmodulina. A ligação entre os processos dependentes de energia (transporte)
e as mudanças celulares nos níveis de GMPc levaram Suwastika e Gehring (1999) a
investigarem o efeito do segundo mensageiro na regulação da ATPase in vitro. Seus
resultados sugerem que, em células de folha e haste, o segundo mensageiro, o
GMPc, pode modular a atividade da H+-ATPase de membrana plasmática e que,
dependendo das concentrações, induz inibição in vitro.
Apesar dos fitocromos não detectarem somente luz vermelha e vermelha
distante, mas também luz azul e luz UV, várias linhas de evidências indicam a
presença em plantas superiores, de fotorreceptores específicos para região do azul
e UV-A. A espectroscopia de ação tem mostrado que flavinas, pterinas ou
carotenóides podem agir como cromóforos absorvedores de luz UV-A e luz azul dos
receptores de luz azul (Galland e Senger, 1991; Quinones e Zeiger, 1994).
Entretanto, ao contrário dos fitocromos, uma proteína receptora de luz azul nunca foi
purificada de uma planta com sucesso.
Vários estudos têm mostrado evidências da função da zeaxantina na
fotorrecepção de luz azul em células guarda. A zeaxantina é uma xantofila
sintetizada na rota biossintética dos carotenóides (Pogson et al., 1996). Junto com
21
violaxantina e anteraxantina, a zeaxantina é um membro do ciclo das xantofilas, e
está envolvida na fotoproteção do cloroplasto (Demmig-Adams e Adams, 1996a).
A relação entre o conteúdo de zeaxantina e a radiação incidente através do
dia sugere que a função primária da zeaxantina em cloroplastos de células guarda é
a percepção da luz, preferivelmente a fotoproteção (Zeiger e Zhu, 1998).
Movimentos estomáticos e fototropismo de coleóptilos estimulados por luz azul têm
similar espectro de ação, sugerindo que os dois processos fotobiológicos
compartilham passos na tradução sensora (Quiñones et al., 1996). A percepção da
luz azul pela zeaxantina nas células guarda dos cloroplastos e a tradução de sinais
de luz azul em eventos metabólicos, tais como a hidrólise de amido e a biossíntese
de malato (Talbott e Zeiger, 1993) e os eventos elétricos, como a ativação do
bombeamento de prótons, pela ATPase da membrana plasmática de células guarda
(Assmann et al., 1985) mostram o envolvimento de um segundo mensageiro
conduzindo o sinal das células guarda do cloroplasto para o apropriado alvo
extracloroplastídico.
Experimentos genéticos e de biologia molecular com Arabidopsis thaliana têm
levado a um maior aprofundamento na caracterização molecular de receptores de
luz azul. Os criptocromos foram os primeiros receptores de luz azul identificados.
Vários mutantes fotomorfogênicos foram isolados, um dos quais, o hy4, possui
deficiência na inibição do alongamento do hipocótilo dependente de luz azul,
resultando em um hipocótilo longo quando crescido na luz azul. Esses mutantes
tornaram possível o isolamento do gene hy4 (posteriormente renomeado cry1). O
criptocromo 1 tem sido considerado como o maior receptor de luz azul regulando o
processo de desestiolação, o CRY1 é uma flavoproteína de 75 KDa codificada pelo
gene cry1 em Arabidopsis (Lin et al., 1998). O gene CRY2 foi o segundo criptocromo
isolado de Arabidopsis thaliana. O CRY2 também desempenha uma função na
regulação do crescimento do hipocótilo (Lin, 2000). A expressão do Cry2, em
contraste ao Cry1, é rapidamente inibida por luz azul, o que está, provavelmente,
associado a um mecanismo de degradação da proteína. O rápido declínio nos níveis
do Cry2 ocorre sob alta intensidade de luz azul. Assim, ele funciona melhor sob
baixas intensidades (Lin et al., 1998).
Estudos recentes têm mostrado que plântulas crescidas sob luz verde, são
mais longas do que aquelas crescidas sob luz vermelha e azul. Segundo Folta
(2004), a irradiação por luz verde de plântulas de Arabidopsis estioladas causou um
22
rápido aumento no alongamento da haste, indicando que um novo sensor de luz
ativado por luz verde promove esse alongamento, uma resposta que é contrária à
induzida por todas as outras condições de luz estudadas. Esses achados são uma
resposta biologicamente relevante, possivelmente mediada através de um sistema
fotomorfogênico não caracterizado que forma a planta durante a primeira hora de
percepção da luz e estabalacimento da plântula (Folta, 2004).
A tradução do sinal de luz é uma cadeia integrada entre os fitocromos, os
criptocromos e, provavelmente, a luz verde. Essa interconexão é observada pelo
efeito sinergístico ou antagônico que diferentes comprimentos de onda têm na
expressão dos genes (Terzaghi e Cashmore, 1995; Spalding e Folta, 2005).
2.5.1.2 Efeito fotoinibitório em plantas
A incidência de fótons sobre as plantas desencadeia o processo fotossintético
nos cloroplastos, que contêm os pigmentos especializados na absorção de luz,
denominados clorofilas. Esse processo resulta no crescimento da planta e produção
de biomassa (Greer, 1995). Entretanto, a capacidade fotossintética de uma planta
pode ser severamente reduzida quando ela é exposta a níveis de radiação que
excedem à requerida para saturar a fotossíntese (Kyle e Ohad, 1986). O excesso de
energia luminosa pode levar à produção de espécies reativas de oxigênio e danificar
o sistema fotossintético, se essas não forem dissipadas (Horton et al., 1996).
Também, o excesso de luz pode danificar e inativar o centro de reação do
fotossistema II (PSII), resultando em um fenômeno conhecido como fotoinibição
(Barber e Andersson, 1992; Long et al., 1994).
Os danos fotoinibitórios também estão relacionados com alterações nas
propriedades físico-químicas das membranas tilacoidais, no aumento da dissipação
do excesso de energia não fotoquímica e no decréscimo da eficiência carboxilativa,
provavelmente devido à formação de espécies reativas de oxigênio (Gilmore e
Govindjee, 1999). Essas espécies reativas de oxigênio podem causar peroxidação
lipídica, levando a um aumento da permeabilidade da membrana para íons, incluindo
prótons. O tratamento fotoinibitório pode afetar as propriedades da H+-ATPase do
cloroplasto e de canais de íon, induzindo o extravasamento de prótons (Buege e
Aust, 1978; Foyer et al., 1994; Mittler, 2002 ).
23
O fenômeno da fotoinibição inicia-se pela inativação do transporte de elétrons
ocasionando redução no rendimento quântico fotoquímico do PSII. Em seguida,
pode haver dano irreversível na proteína D1, removendo-a da membrana. A proteína
D1, junto com sua análoga proteína D2, encontram-se inseridas aos principais
cromóforos e cofatores de oxido-redução envolvidos no transporte de elétrons, no
PSII (Tang et al., 1990). A inativação do transporte de elétrons pode ser reversível,
dependendo da intensidade do dano provocado. A degradação proteolítica da
proteína D1 leva à desmontagem do PSII, porém, a resíntese dessa proteína
promove o seu restabelecimento após algum tempo. Com isso, a fotoinibição resulta
em decréscimo na fotossíntese líquida quando as folhas são expostas à alta
radiação luminosa por várias horas (Greer, 1998).
A fotoinibição é uma forma de estresse oxidativo, porque está relacionado à
produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Embora as ROS possam operar
como mensageiros secundários envolvidos na transdução de sinais em resposta a
estresses abióticos (Mittler, 2002), elevadas concentrações de ROS são altamente
prejudiciais à integridade celular. Moléculas ativas de oxigênio, como superóxido
(O2¯), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radicais hidroxilas (OH•) são extremamente
reativas e citotóxicas para todos os organismos, inativando enzimas e provocando
importantes danos celulares, como a peroxidação lipídica da membrana (Choudhury
e Behera, 2001). Particularmente, os oxirradicais têm sido associados à destruição
da proteína D1 do centro de reação do PSII (Bowler et al., 1992).
A habilidade das plantas para manter sua integridade de membrana sob
estresse por alta irradiância determina sua capacidade de resistência, e pode ser
usada como um critério para avaliação da resistência ao estresse (Lauriano et al.,
2000). A intensidade do dano fotoinibitório depende de fatores como: a espécie, o
estado fisiológico da planta, o tempo de exposição, entre outros (Krause, 1988). A
magnitude dos efeitos fotoinibitórios também depende da eficiência dos mecanismos
protetores e dos processos que permitem o reparo e reversibilidade do dano (Barber
e Andersson, 1992).
Plantas superiores adaptadas e aclimatadas a níveis de luz em seus
ambientes otimizam e preservam a produtividade fotossintética (Osmond e Grace,
1995; Demmig-Adams e Adams, 1996b; Srivastava e Strasser, 1997). Otimizar a
produtividade fotossintética em um dado ambiente de luz requer o balanço do uso da
luz absorvida pela fotossíntese e a dissipação fotoprotetora do excesso
24
potencialmente prejudicial da energia luminosa (Björkman e Demmig-Adams, 1994;
Horton et al., 1996).
Diversas pesquisas demonstraram que a susceptibilidade a fotoinibição é
significativamente incrementada quando o estresse luminoso se combina com outros
estresses ambientais, tais como baixa temperatura (Powles et al., 1983;
Hetherington et al., 1989), seca (Björkman e Powles, 1984; Ludlow e Powles, 1988;
Masojidek et al., 1991), e salinidade (Masojidek e Hall, 1992), entre outros. De
particular importância é a combinação entre estresse hídrico, luminoso e térmico;
freqüentemente observada em algumas regiões de clima tropical.
2.5.1.3 Fluorescência da clorofila a
A determinação das características da fluorescência da clorofila a é rápida,
precisa e não destrutiva, possibilitando a monitoração da utilização da energia
luminosa em plantas crescidas, tanto em laboratório quanto no campo, detectando o
desequilíbrio energético e metabólico da fotossíntese (Araus et al., 1998). Esse
método é, atualmente, utilizado para determinar os efeitos de diversos estresses
bióticos e abióticos no funcionamento do aparelho fotossintético, possibilitando
avaliar, precocemente, os efeitos de diferentes estresses, antes que os sintomas
relacionados tornem-se evidentes (Smillie e Hetherington, 1990).
A estimativa do desempenho funcional do PSII pode ser monitorada pelas
características da fluorescência, como a fluorescência inicial (F0), a fluorescência
máxima (Fm), a fluorescência variável (Fv), a relação Fv/Fm, os “quenchings”
fotoquímicos (qP) e não – fotoquímico (qN) (Van Kooten e Snel, 1990) e, finalmente,
a taxa relativa de transporte de elétrons (ETR).
A eficiência quântica do PSII (Fv/Fm) pode variar numa faixa de 0,75 a 0,85
em plantas não submetidas a estresses (Bolhar-Nordenkampf et al., 1989). Essa
relação é altamente correlacionada com o rendimento fotossintético das folhas. A
diminuição da relação Fv/Fm é um excelente indicador de efeito fotoinibitório quando
as plantas estão submetidas a qualquer tipo de estresse (Araus e Hogan, 1994;
Angelopoulos et al., 1996). Essa redução em Fv/Fm pode representar tanto uma
regulação fotoprotetora reversível ou uma inativação irreversível do fotossistema II
(PSII) (Long et al., 1994; Araus e Hogan, 1994).
25
Folhas expostas a altos valores de fluxo de fótons sempre exibem um
decréscimo no rendimento quântico fotoquímico do PSII resultado de uma
diminuição na taxa de dissipação fotoquímica (qP) da energia e por um aumento na
taxa de dissipação do excesso de energia de excitação não fotoquímica (qN) (Baker
e Rosenqvist, 2004). A relação entre aumento de qN e acidificação do lúmen do
tilacóide pode fornecer evidências sobre o potencial de dissipação energética de
espécies tolerantes a condições adversas.
2.5.1.4 Efeito da luz na célula vegetal – o papel d as H+-ATPases
Em células vegetais a manutenção do potencial de membrana e a
homeostase do pH citoplasmático dependem intimamente do funcionamento das
bombas de prótons presentes nessas membranas. Já é bem conhecido que a H+-
ATPase de membrana plasmática de células estomáticas é regulada por pulsos de
luz azul e vermelha. Na célula, os pulsos ativam o bombeamento eletrogênico de
prótons em protoplastos de células guarda (Assmann et al., 1985). Kinoshita e
Shimazaki (1999) demonstraram que um pulso de luz azul ativa a H+-ATPase de
membrana plasmática por fosforilação da região C-terminal da enzima.
Estudos posteriores mostraram que a fosforilação do penúltimo resíduo,
treonina, da região C-terminal da H+-ATPase por luz azul, é essencial para a ligação
da proteína 14-3-3 dependente ou independente de fusicoccina nas células-guarda
(Kinoshita e Shimazaki; 2001; 2002; Kinoshita et al., 2003). Essa fosforilação é
mediada por uma proteína quinase, o qual parece estar também envolvida na rota
de sinalização para abertura dos estômatos. O complexo H+-ATPase●14-3-3
formado nas plantas é lábil e somente pode ser estudado na presença de
fusicoccina. Essa toxina fúngica se liga ao complexo formado pelas H+-ATPases e
proteínas 14-3-3, estabilizando-o. O receptor de luz azul envolvido na percepção do
sinal de luz e ativação da bomba, fototropina (Phot 1 e Phot 2), também se liga a 14-
3-3 sob ativação por luz azul (Kinoshita et al., 2003; Ueno et al., 2005).
Parece que as H+-ATPases de membrana plasmática existem em um estado
parcialmente desacoplado, e que a ativação pós-traducional aumenta o acoplamento
entre hidrólise de ATP e bombeamento de prótons (Venema e Palmgren, 1995;
Baunsgaard et al., 1996; Morsomme et al., 1996). Ainda não se sabe porque isso
ocorre, mas a indução pós-traducional do maior acoplamento pode prover um
26
significado para uma resposta mais rápida da bomba ao ambiente. O mecanismo
envolvido nesse desacoplamento ainda é desconhecido, sabe-se que as H+-
ATPases da membrana plasmática geram intermediários fosforilados do ciclo de
reação (não podendo ser confundido com fosforilação regulatória estável)
(Palmgren, 2001). O K+ é ligado a bomba de prótons em um sítio no domínio
citoplasmático que é fosforilado durante a catálise (Buch-Pedersen et al., 2006). A
ligação do K+ a esse sítio induz desfosforilação dos intermediários do ciclo de reação
(Buch-Pedersen et al., 2006). Desfosforilação direta dos intermediários do ciclo de
reação causa a reversão da bomba para um estado não fosforilado sem
concomitante transporte de prótons. Esses dados identificam o K+ como um
desacoplador intrínseco da bomba de prótons.
Pelo fato da P- e da V-ATPases estarem envolvidas em processos similares
nas células, tais como, geração de diferenças de potencial eletroquímico através das
membranas plasmática e vacuolar, respectivamente, estabilização do pH
citoplasmático, controle da pressão de turgor, e expansão das células das plantas,
não é surpreendente que sejam igualmente influenciadas por estímulos externos.
Klychnikov et al. (2007) avaliaram o envolvimento da V-ATPase em resposta a luz
azul. Nesse estudo, esses autores demonstraram que o curto tratamento de
coleóptilos estiolados de cevada com luz azul resulta na ativação da hidrólise de
ATP pela V-ATPase. Os resultados indicam que a parte hidrolítica da V-ATPase, V1,
interage com a proteína regulatória 14-3-3, necessitando para isso de fosforilação da
ATPase por uma quinase, assim como ocorre para a P-ATPase, no processo de
sinalização para abertura dos estômatos O aumento no gradiente eletroquímico
através do tonoplasto, pode então dirigir o transporte ativo secundário de outros íons
e solutos através do tonoplasto, necessário para a apropriada resposta
fotomorfogênica (Klychnikov et al., 2007).
Estudando o efeito de curto tempo de irradiação luminosa no metabolismo do
inositol fosfolipídio em hipocótilos de girassol, Memon e Boss (1990) mostraram que
a atividade quinase dos fosfolipídios da membrana plasmática reduz em resposta a
irradiação luminosa in vivo, e a atividade da ATPase de membrana plasmática
também diminui, como um resultado do tratamento com luz branca. Como o fosfatidil
inositol fosfato (PIP) e o fosfatidil inositol bisfosfato (PIP2) têm mostrado afetar
diretamente a atividade ATPásica em membranas plasmáticas isoladas de plantas
(Memon et al., 1989), mudanças na atividade quinase dos lipídios inositol podem
27
afetar a H+-ATPase de membrana plasmática in vivo. PIP e PIP2 aumentam
diretamente o tipo E1-E2 ou ATPase de membrana plasmática que opera através de
um intermediário fosforilado (Memon et al., 1989), além de regularem a fosforilação
de proteínas (Chauhan e Brockerhoff, 1988).
Alguns trabalhos têm sido realizados em folhas, com o intuito de verificar o
efeito da luz no funcionamento da ATPase de membrana plasmática do mesófilo.
Blom-Zandstra et al. (1997) avaliaram as transientes mudanças induzidas pela luz na
atividade dos canais de ions e das bombas de prótons na membrana plasmática de
protoplastos do mesófilo de tabaco, e demonstraram que, independente da atividade
dos canais, a bomba de prótons parece substancialmente contribuir para mudanças
induzidas pela luz na carga da membrana. Linnemeyer et al. (1990) observaram que
a atividade da ATPase de folhas jovens crescidas na luz vermelha foi menor do que
das folhas crescidas no escuro. Isso parece ser devido a uma redução na
quantidade da proteína na membrana plasmática. Segundo estes autores, a menor
resposta para luz sugere que a luz está inibindo algum passo na síntese da ATPase,
enquanto que a ATPase parece simplesmente ser diluída pela adição de largas
quantidades de outras proteínas na membrana plasmática.
A luz azul induz mudanças no potencial da membrana plasmática nas células
de plantas, participa nas reações redox e no transporte de elétrons, e induz uma
mudança na absorção de luz na membrana plasmática envolvendo uma
fotorredução do citocromo mediada por uma flavina (Buchanan et al., 2000). Em
células de hipocótilos tem sido observado que a luz azul causa uma despolarização
da membrana (Spalding e Cosgrove, 1989).
Em mesocótilos, o alongamento de células é o resultado da extensão celular
direcional e é inibido por exposição à luz (Viereck et al., 1996). Estudos realizados
com hipocótilos de pepino revelaram que a luz azul inibe o alongamento da haste,
reduzindo o crescimento, o qual é precedido por uma despolarização da membrana
plasmática de células do hipocótilo, indicando uma inicial inibição da H+-ATPase de
membrana plasmática, e subseqüente ativação de um ou mais tipos de canais de
ions, contribuindo para essa despolarização induzida por luz azul (Spalding e
Cosgrove, 1989; Spalding e Cosgrove, 1992; Cho e Spalding, 1996).
Padmanaban et al. (2004), avaliando a expressão diferencial dos genes da
subunidade c da H+-ATPase vacuolar em tecidos de plantas observaram que
plântulas crescidas na luz e crescidas no escuro mostraram grandes diferenças na
28
expressão do gene VHA-c1, indicando que os genes da subunidade c da H+-ATPase
são diferencialmente influenciados por luz. Em tecidos em alongamento, houve forte
expressão do gene VHA-c1, em contraste, a expressão do gene VHA-c3 nas
plântulas não foi alterada por luz ou por escuro. Esse aumento na expressão VHA-c1
e no alongamento celular podem indicar um papel para atividade da V-ATPase na
fase de alongamento celular do crescimento.
Em contraste, a expressão do gene VHA-c1 nas raízes não foi alterada por
luz. Esses genes da subunidade c são diferencialmente regulados em diferentes
tipos de células provavelmente dependendo da demanda funcional e do estágio de
desenvolvimento das células. É interessante que um único gene, VHA-c1, possa ser
regulado de forma específica dependendo do órgão. Assim, o promotor VHA-c1 é
diferencialmente regulado por luz ou escuro em uma forma específica para o órgão
ou tecido que provavelmente depende de receptores de luz específico da célula e
vias de sinalização que são acopladas ao crescimento celular (Padmanaban et al.,
2004).
2.5.2 Estimulação mecânica – “Brushing”
2.5.2.1 Perturbação mecânica
A relativa imobilidade das plantas quando comparado aos animais tem
naturalmente provocado uma dependência sob sua habilidade para sentir e
responder a sinais ambientais, se adaptando a um ambiente sempre em mudança
(Jaffe et al., 2002). As plantas podem perceber numerosos estímulos ambientais,
tais como flutuações de temperatura e de luz, e podem ainda perceber o peso
mecânico gerado pelo vento, pela neve, o gelo, o impacto das gotas da chuva, do
granizo, o peso dos frutos, o toque, o som e outros organismos (insetos e pássaros),
os quais induzem uma variedade de respostas fisiológicas em diferentes órgãos e
tecidos (Telewski, 1995; 2006). As células por si podem perceber a gravidade, a
tensão causada pelo próprio peso, o estado de hidratação (pressão de turgor) e o
crescimento interno (Telewski, 2006).
Mark Jaffe, que realizou análises sistemáticas das respostas de crescimento
da planta às perturbações mecânicas sobre os últimos 30 anos, inventou o termo
“tigmomorfogênese” para descrever a resposta desenvolvimental induzida pelo toque
29
nas plantas (Jaffe, 1973). Os estímulos mecânicos têm sido coletivamente
chamados de estímulo de toque ou tigmo e produzem um número de respostas
tigmo nas plantas, incluindo tigmomorfogênese, tigmotropismo, tigmonastia, e as
respostas tigmotáticas (Jaffe et al., 2002; Braam, 2005).
Em contraste às respostas tigmonásticas e tigmotrópicas geralmente rápidas
das plantas ou órgãos especializados para responder ao estresse mecânico aplicado
externamente, alterações morfogenéticas graduais em resposta ao estímulo tal como
o toque e o vento são comuns, se não universais, entre as plantas superiores. As
plantas têm se adaptado a seus ambientes com um elevado grau de plasticidade,
tendo recursos e habilidades para responder às mudanças ambientais. Essas
mudanças morfogenéticas induzidas pelo toque ocorrem lentamente ao longo do
tempo e são conseqüentemente, não prontamente aparente ou apreciada (Braam,
2005). Essas respostas tigmomorfogênicas são definidas como a influência dessas
perturbações no crescimento e desenvolvimento das plantas. Estudos fisiológicos e
moleculares têm mostrado que as alterações no crescimento e desenvolvimento das
plantas envolvem uma cascata de eventos biológicos iniciando com uma transdução
do estímulo mecânico em um sinal biológico e finalizando com uma resposta global
como a modificação do crescimento, o qual tem sido mostrado ser dependente da
intensidade e frequência (Trewavas e Knight, 1994). Isso usualmente resulta em
uma redução no alongamento do caule e uma estimulação do crescimento radial
(Garner e Björkman, 1996; Latimer, 1998; Björkman, 1999).
A tigmomorfogênese parece fortalecer as plantas, tornando-as mais
resistentes a estresses futuros, o que ocorre devido à habilidade das plantas para
responder a esses estímulos mecânicos, alterando a morfologia, a anatomia e as
propriedades biomecânicas. As mudanças morfogênicas induzidas pelo toque são
correlacionadas com a produção aumentada de tecido fortalecido e uma melhora na
resistência a perturbação mecânica induzida pelo dano (Jaffe et al., 1984; Telewski e
Jaffe, 1986; Biddington, 1986). Tecidos mais jovens mostram superior magnitude de
resposta quando comparado aos tecidos mais velhos (Biddington, 1986). A
sinalização a longas distâncias é também provável de ocorrer porque as alterações
do crescimento não são limitadas às regiões que são diretamente estimuladas, mas
são também encontradas nos locais não estimulados diretamente (Biddington, 1986;
Coutand et al., 2000).
30
Mais do que 2,5% dos genes de Arabidopsis thaliana são rapidamente
regulados em plantas estimuladas pelo toque. Com esses genes como ferramentas,
métodos genéticos moleculares podem possibilitar a elucidação de mecanismos de
percepção ao toque, transdução do sinal e resposta de regulação. Provavelmente
todas as plantas sentem e respondem às forças mecânicas. Certamente, as
respostas celulares podem ser críticas para processos fundamentais tal como, a
regulação do turgor, a expansão celular e a morfogênese. As bases mecanísticas da
percepção ao toque e da sinalização inter e intracelular ainda não são bem
entendidas. Não está claro se as respostas amplamente diversas estão relacionadas
ao nível de percepção ou resposta, ou se os mecanismos e a maquinaria usada por
células únicas para responder as perturbações mecânicas tal como, flutuações no
turgor, estão relacionadas aquelas usadas pelo órgão ou tecido para reagir a forças
mecânicas externamente aplicadas (Telewski, 2006).
Uma prática que pode impedir o excessivo alongamento do caule consiste na
estimulação mecânica (“brushing”) das plantas. Alguns estudos têm mostrado a
aplicação dessa prática na produção agrícola, com o intuito de conduzir o
crescimento de mudas, melhorando sua qualidade (Latimer et al., 1991). Esta
técnica consiste em uma estimulação física ou estresse aplicado às plantas com o
auxílio de um anteparo ligeiramente abrasivo, tal como papel (Biddington e
Dearman, 1985), papelão (Latimer, 1990), cano ou tubo de polivinil (Latimer e
Thomas, 1991), ou um pedaço de madeira (Latimer e Baden, 1991). O anteparo
causa uma curvatura nos caules à medida que entra em contato com as plantas.
Esse estresse mecânico normalmente aumenta o teor de celulose no caule, o que
pode conferir uma maior resistência mecânica da parte aérea da planta (Heuchert et
al., 1983). A estimulação mecânica também pode ser obtida expondo as mudas a
efeitos vibratórios, tais como correntes de vento ou de ar forçado.
2.5.2.2 Efeito do toque no crescimento e desenvolvi mento das plantas - o papel
das H+-ATPases
O efeito das perturbações mecânicas no crescimento das plantas tem sido
relatado em muitos estudos e vários esforços têm sido feito para elucidar a fisiologia
dos passos primários da mecanosensibilidade. A relativa contribuição dos diferentes
tecidos da planta para a mecanosensibilidade e a maneira como a sensibilidade
31
local é integrada na planta para produzir a resposta de crescimento ainda não está
claro (Coutand et al., 2000). Tem sido gradualmente reconhecido que a percepção e
resposta a estímulos mecânicos exógenos estão comumente ocorrendo
essencialmente ao nível celular e subcelular.
O alongamento e o relaxamento da membrana celular em resposta as
mudanças no ambiente mecânico das células como um componente da
mecanosensibilidade encaixa bem com os relatos anteriores do papel dos canais de
membrana ativados por força mecânica nas respostas das plantas aos estresses
mecânicos (Massa, et al., 2003; Dutta e Robinson, 2004; Martinac, 2004; Kung,
2005). A percepção de um sinal mecânico pelas células é um processo rápido com
uma rápida transdução da força mecânica em uma mensagem bioquímica ou
bioelétrica. Significantes progressos têm sido relatados na elucidação da base
molecular da percepção e transdução mecanosensora em sistemas animais,
particularmente o acoplamento físico entre o citoesqueleto e a membrana celular, o
qual provê uma contínua rede estrutural/mecânica através da célula (Telewski,
2006). A membrana celular como um alvo principal das forças mecânicas externas
que agem sobre uma célula, e os canais de íons mecanosensitivos desempenham
um papel crucial na fisiologia da mecanotransdução. Essas forças mecânicas
externas detectam e traduzem em sinais intracelulares elétricos e/ou químicos.
Recentes trabalhos têm aumentado nosso entendimento de seu mecanismo,
funções fisiológicas e origens evolucionárias (Telewski, 2006).
As células eucarióticas tipicamente afastam-se da forma esférica devido a
complexas interações entre os elementos de seu citoesqueleto e a matriz
extracelular. A comunicação entre o citoesqueleto e a matriz extracelular é uma das
características mais destacadas da mecânica celular e permite as células
responderem efetivamente a vários sinais, especificamente ao estímulo mecânico
(Baluška et al., 2003). Células desprovidas de matriz extracelular e/ou citoesqueleto
inevitavelmente perdem sua forma polar, retornando a forma preferencialmente
esférica (Smith, 2001). Essa perda de polarização celular evita que as células
interajam e se comuniquem com outras células. As plantas são organismos
supracelulares com canais citoplásmicos célula a célula chamados plasmodesmata
(Lucas et al., 1993). Conseqüentemente, as células das plantas não são totalmente
separadas, e a membrana plasmática e o retículo endoplasmático cruzam as
fronteiras celulares através dos plasmodesmata. Essas membranas são fisicamente
32
interligadas em sistemas membranosos contínuos essencialmente expandidos na
planta inteira.
O citoesqueleto integrado e sua adesão dinâmica à membrana plasmática
permitem essas complexas interações entre as forças mecânicas e os sinais
químicos (Sheetz, 2001). Entre as moléculas responsáveis por unir o citoesqueleto à
parede celular, propostas por Baluška et al., (2003), estão proteínas quinases
associadas à parede celular, pectinas, proteínas arabinogalactanas, celulose
sintase, forminas, miosinas específicas de plantas, fosfolipase D e calose sintase. A
síntese de calose está associada com um número de respostas a diversos
estresses, incluindo o estresse mecânico (Jaffe et al., 2002). Esses estudos
suportam um papel para a síntese de calose na mecanopercepção.
Uma das novas prioridades na biologia celular é compreender como as forças
mecânicas regulam e integram as atividades celulares (Ingber, 2003a, 2003b). É
bem conhecido que as forças mecânicas são rapidamente, e praticamente sem
perda de informação, traduzidas em mensagens bioquímicas. Além disso, as forças
mecânicas desempenham papéis essenciais no controle do comportamento celular
(Riveline et al., 2001; Ingber, 2003a, 2003b).
Os modelos propostos para explicar como uma força mecânica pode ser
traduzida em um sinal bioquímico não somente sugerem as características espacial
e temporal que nós podemos esperar dos elementos de sinalização ao toque, mas
também enfatizam que uma parede celular rígida e uma substancial pressão de
turgor coloca significante coação em tais sistemas de sinalização nas plantas
(Fasano et al., 2002). A percepção de um sinal mecânico pelas células parece
envolver a parede celular, a membrana plasmática e o citoesqueleto, formando uma
rede mecanosensora (Jaffe et al., 2002). A força exercida na parede pode ser
transmitida através da membrana plasmática para o citoesqueleto, o qual pode
então, amplificar e retransmitir a força para a membrana plasmática; ou talvez, mais
comumente aceito, para uma proteína responsiva tal como um canal de íon
embebido na membrana plasmática (Fasano et al., 2002). Como já foi dito, os canais
de íons parecem ser mecanosensitivos, atuando na sinalização ao estímulo
mecânico (Kung, 2005). Alternativamente, o estímulo mecânico pode passar da
parede, para o citoesqueleto, para endomembranas tais como a membrana do
retículo endoplasmático e o tonoplasto. Tal sítio interno de transdução pode enganar
a coação imposta pela pressão de turgor na membrana plasmática e permitir
33
substancial deformação da membrana, com associado acionamento de canais de
íons. Outro modelo para a mecanopercepção se dá pela ligação do citoesqueleto
(através de ligantes) à membrana plasmática, a endomembranas, transmitindo e
amplificando a força ao citoplasma (Jaffe et al., 2002; Fasano et al., 2002). Os
canais podem ser uma resposta secundária a uma perturbação mecânica em um
regulador global tal como pH citosólico ou potencial de membrana. A ativação da H+-
ATPase da membrana plasmática pode resultar em hiperpolarização da membrana e
alterar o pH citosólico e apoplástico (Fasano et al., 2002).
A primeira resposta detectável para um sinal mecânico é uma mudança nos
potenciais de ação e na resistência elétrica, o qual ocorre dentro de segundos após
a perturbação (Jaffe, 1976), posteriormente o abalo mecânico da haste bloqueia o
transporte do floema (Jaeger et al., 1988). A próxima medida mensurável ocorre com
transientes elevações no Ca2+ intracelular, o qual desencadeia uma cascata de
sinalização que pode variar de acordo com a espécie (Nayyar, 2003), levando a
alterações no crescimento. Tem sido observado o envolvimento de proteínas
regulatórias que se ligam ao Ca2+ na cascata de eventos, tais como a calmodulina,
as quais compreendem um componente da transdução de sinal baseada em Ca2+
em eucariotos (Bourgeade et al., 1991; Fasano et al., 2002). Assim, mudanças na
abundância ou localização de calmodulinas específicas podem pontuar para a
ativação de vias de resposta ao toque altamente específicas mediadas por Ca2+.
Os estímulos externos são capazes de afetar o transporte transmembrana de
Ca2+ dependente de ATP e a distribuição intracelular da proteína calmodulina
(Bourgeade et al., 1991) e da proteína anexina (Thonat et al., 1997), em plantas
superiores. O sinal induz despolarização da membrana, sugerindo mudanças na
compartimentalização de íons. As mudanças ambientais talvez distorçam o equilíbrio
iônico intracelular nas células de plantas, particularmente de íons cálcio (Bourgeade
et al., 1991; Thonat et al., 1997). Alguns trabalhos tem mostrado a participação do
peróxido de hidrogênio e de outras espécies reativas de oxigênio (ROS) na resposta
de defesa das plantas a esses estímulos. A indução de ROS e um aumento no Ca2+
citosólico parecem ser simultâneas, e tem sido sugerido que as ROS regulam os
canais de Ca2+ (Mori e Schroeder, 2004; Braam, 2005).
Tem sido observado também um aumento na biossíntese de etileno (Prasad e
Cline, 1985; Telewski, 1995) e um aumento nas divisões celulares pelo câmbio
vascular (Biro et al., 1980). O papel do etileno em resposta ao estresse mecânico
34
parece afetar o crescimento secundário e subsequentemente o desenvolvimento e
diferenciação do câmbio vascular e não impactar o crescimento primário associado
com os meristemas apicais (Coutand et al., 2000; Braam, 2005). A biossíntese de
etileno tem sido relacionada com as respostas a um número de estresses
ambientais, incluindo estresse mecânico, e vários pesquisadores tem sugerido que o
etileno serve como uma molécula sinalizadora. O toque induz a formação de etileno
em plantas vasculares, e o etileno perece estar envolvido em respostas
gravitrópicas, resultando em curvatura estática em relação à força vetora
gravitacional (Prasad e Cline, 1985; Dolan, 1997).
O rápido acionamento de canais de íons e sua inerente amplificação do sinal
os fazem elementos ideais de transdução de sinal e mudanças na concentração de
íons (por exemplo, Ca2+ e H+) e no potencial de membrana estão freqüentemente
envolvidas em eventos de rápida sinalização nas plantas (Fasano et al., 2002). Nas
células das plantas o íon cálcio é um mensageiro secundário envolvido em
numerosas vias de sinalização, participando de um amplo número de respostas
fisiológicas apropriadas a estímulos ambientais e desenvolvimentais (Nayyar, 2003).
Não surpreendentemente, entretanto, a sinalização iônica tem sido proposta
transduzir a percepção ao toque nas plantas (Lecourieux et al., 2006). A
especificidade de uma resposta celular ao Ca2+ se dá em parte pelo sincronismo,
duração, e magnitude do pulso de Ca2+ eliciado, a tão chamada “assinatura de Ca2+”
do estímulo (Lecourieux et al., 2006). Alternativamente, um ambiente celular ou
subcelular especializado (microdomínio) pode existir onde fatores tal como pH,
interações citoesqueleto, a disponibilidade de proteínas regulatórias dependentes de
Ca2+ ou um número de outros compostos pode também impor especificidade em
sinais de Ca2+ espacialmente distintos. O mesmo sinal induz diferentes assinaturas
de Ca2+, dependendo do órgão, do tecido, ou do tipo de célula dentro de um tecido
(Lecourieux et al., 2006).
O Ca2+ é talvez o mensageiro secundário iônico mais amplamente
reconhecido nas plantas, mas mudanças no pH citoplásmico são também
conhecidas por terem difundido efeitos regulatórios na função celular. Entretanto,
diferentemente do Ca2+, os prótons se difundem rapidamente dentro da célula. Em
função disso, sem alguma significante arquitetura citoplásmica para reduzir seu
movimento, os prótons são improváveis de regular mudanças localizadas nos
microdomínios celulares. Ao invéz disso, mudanças no pH relacionadas ao sinal
35
podem servir como um sistema regulatório global para a célula. Assim como o Ca2+,
alteração no pH talvez seja um significante mensageiro secundário intracelular
agindo para gerar um redirecionamento global do conjunto de vias de transdução de
sinal operando na célula, provendo alusão para um possível mecanismo pelo qual
pH e Ca2+ relacionado a transdução de sinal ao toque possam interagir (Fasano et
al., 2002).
Em adição ao Ca2+ e pH, mudanças no potencial de membrana também tem
sido proposto como eventos na sinalização ao toque (Massa et al., 2003; Kung,
2005). Mudanças no potencial de membrana podem diretamente modular mudanças
na atividade de transporte da membrana por abrir canais acionados por tensão.
Entretanto, o potencial de membrana pode agir como um regulador global dos
componentes da membrana plasmática tal como o pH pode globalmente regular os
componentes citoplásmicos. Em adição, flutuações no potencial de membrana
parecem importantes para transmitir informação na forma de potenciais de ação,
auto-propagando ondas de despolarização induzida pela troca de íons através da
membrana (Massa et al., 2003; Kung, 2005).
A estimulação mecânica de internós jovens de Bryonia dióica inicialmente
reduziram a atividade da H+-ATPase da membrana plasmática seguido por uma
estimulação mais prolongada, o que mostra que a H+-ATPase de membrana
plasmática desempenha um papel chave na transdução do sinal por sua
contribuição no desequilíbrio iônico com cessação da atividade e por sua
subseqüente participação direta na restauração dos balanços iônicos (Bourgeade e
Boyer, 1994).
2.5.3 Estimulação Sonora
2.5.3.1 Som e ultrasom
O som é resultado de um movimento vibratório da matéria transmitido através
de meios materiais e elásticos. É energia que se propaga através de ondas, de
forma circuncêntrica, chamadas de ondas mecânicas porque precisam de um meio
material para se propagar. Este meio pode ser sólido, líquido, ou gasoso. Na maioria
das vezes, ouvimos sons sendo transmitidos através do ar (Halliday et al., 2002).
36
Os meios de propagação são denominados meios elásticos por serem
capazes de se deformarem a passagem das ondas sonoras e restaurarem sua forma
original após a passagem das mesmas. Qualquer meio material que propague uma
onda sonora é considerado elástico (Halliday et al., 2002).
As ondas sonoras são ondas longitudinais e tridimensionais. Por serem
longitudinais, são ondas de pressão, e caminham no meio de propagação através de
sucessivas compressões e rarefações das partículas do meio. As ondas ao se
propagarem através de um meio elástico alcançam o ouvido causando a sensação
sonora (Halliday et al., 2002).
Seres humanos e vários animais percebem sons com o sentido da audição, o
que permite saber a distância e a posição da fonte sonora (audição estereofônica).
As ondas sonoras são ondas periódicas; classificadas em audíveis e inaudíveis,
dependendo do número de períodos que ocorram na unidade de tempo (freqüência).
Ondas sonoras com freqüência entre 20 Hz e 20.000 Hz, são audíveis para os seres
humanos. Acima e abaixo desta faixa estão ultrasom e infra-som, respectivamente,
que são sons inaudíveis para os seres humanos (Halliday et al., 2002).
Os cães conseguem ouvir sons numa “banda de freqüências” mais larga do
que o homem, sendo sensíveis a ondas sonoras compreendidas entre 15 Hz e 50
000 Hz. Os morcegos, as baleias e os golfinhos podem ouvir e emitir ondas sonoras
com freqüências de até 120 000 Hz. Muitos sons de baixa freqüência também
podem ser sentidos por outras partes do corpo e pesquisas revelam que elefantes se
comunicam através de infra-sons (Halliday et al., 2002).
Os sons tem sido usados de várias maneiras, muito especialmente para
comunicação através da fala ou, por exemplo, música. A percepção do som também
pode ser usada para adquirir informações sobre ambientes em propriedades com
características espaciais (forma, topografia) e presença de outros animais ou
objetos. Por exemplo, morcegos, baleias e golfinhos usam a ecolocalização para
voar e nadar por entre obstáculos e caçar suas presas. Navios e submarinos usam o
sonar, um sistema de localização e prospecção de obstáculos por meio de ondas
sonoras, tirando partido da sua reflexão. È conhecido que a vegetação pode
absorver a energia acústica (Price et al., 1988) e tem sido utilizada para amortecer
os barulhos do ambiente urbano (Attenborough, 2002).
O ultrasom é uma forma de energia mecânica, vibracional, que pode ter ação
deletéria ou indutora do desenvolvimento em tecidos vivos, dependendo da
37
intensidade, do tempo de exposição, da freqüência de aplicação e da distância do
transdutor ao alvo (Hebling e da Silva, 1995). Em tecidos vivos de animais, o
ultrasom pode causar a destruição ou a indução do crescimento dependendo,
principalmente, da intensidade utilizada (Duarte, 1983; Alves, 1988; O’Brien Jr.,
2007).
Amplamente usado em tratamentos fisioterápicos, o ultrasom é um auxiliar
eficaz no tratamento de lesões, traumas e processos inflamatórios. A vibração das
moléculas, causada pela emissão de ondas, aumenta a elasticidade em tecidos que
sofreram traumas, enquanto o calor gerado é responsável pela dilatação dos vasos
sangüíneos na região afetada. Esses efeitos aceleram a cura de inflamações, a
cicatrização de lesões e o retorno dos movimentos nas áreas tratadas (Duarte, 1983;
Alves, 1988; Hebling e da Silva, 1995).
O ultrasom também tem sido amplamente usado em diagnóstico médico,
através das ecografias. Com a ecografia podem obter-se imagens do interior do
corpo humano, por exemplo, dos bebes antes de nascerem.
Apesar de muitos avanços terem sido alcançados no que diz respeito à
utilização do ultrasom na medicina, poucos estudos têm revelado os efeitos do
ultrasom nas células de plantas. Nas plantas, o ultrasom tem sido aplicado na
germinação de sementes, aumentando as taxas de germinação (Creath e Schwartz,
2004); e aumenta o metabolismo nas raízes de crisântemo, caracterizado pelo
aumento na atividade amilase, açúcar solúvel, e de proteínas, influenciando o
crescimento das plantas (Yi et al., 2003).
2.5.3.2 Efeito do som e ultrasom na célula vegetal – o papel das H +-ATPases
Recentemente, elevada atenção tem sido dada aos efeitos benéficos e as
potenciais aplicações do ultrasom, particularmente o de baixa intensidade, em
sistemas biológicos e processos biotecnológicos. O ultrasom de alta intensidade é
muito conhecido por destruir materiais biológicos, rompendo as membranas
celulares e desativando moléculas biológicas pela degradação de macromoléculas.
O ultrasom de baixa intensidade, por outro lado, tem mostrado uma extensão de
efeitos biológicos subletais, que são de potencial significância na biotecnologia
(O’Brien Jr., 2007).
38
A irradiação ultrassônica pode causar estresse térmico e mecânico em
materiais biológicos. O estresse mecânico do ultrassom resulta de dois eventos
hidrodinâmicos, a cavitação acústica e a cavitação induzida por microcorrente. A
cavitação acústica é um dos efeitos mais expressivos do ultrasom. Dois fenômenos
de cavitação acústica foram descritos. O primeiro descreve a cavitação transiente ou
de colapso, onde "microbolhas" são formadas e crescem até implodir, gerando
pressão e temperatura altas durante os estágios finais do colapso. A onda de
choque de alta pressão que emana do lugar antes ocupado pela bolha é capaz de
causar danos às células ou macromoléculas circundantes (Joersbo e Brunstedt,
1992).
O outro fenômeno, a cavitação estável, consiste em amplas e rápidas
oscilações no tamanho da bolha. Isso causa um forte fluxo de líquidos no meio que a
circunda. Esse processo é conhecido como "microcorrente". Baixas velocidades
dessa microcorrente resultam na mistura do meio circundante, enquanto altas
velocidades podem ocasionar danos às células (Frizzell, 1988). A microcorrente
acústica nas células em suspensão pode causar estresse e aumento da
transferência de massa, o qual pode estimular as atividades metabólicas dentro das
células. Tem sido observados a rotação de organelas e o movimento em círculos
nos vacúolos de células de plantas em níveis apropriados de intensidade
ultrassônica (Sinisterra, 1992). Esses eventos podem produzir um aumento nas
funções metabólicas das células e promover a proliferação celular.
As ondas sonoras têm grande efeito no crescimento das plantas (Shen e Xi,
1999). Em certa intensidade e freqüência, o estresse por ondas sonoras reduz
significativamente a temperatura de transição de fase, aumenta o conteúdo de
proteínas solúveis nas raízes, o que torna o crescimento e a divisão das células mais
rápido e mais fácil (Keli et al., 1999; Yi et al., 2003). Tao et al. (2001) demonstraram
que a estimulação sonora promoveu a absorção de nutrientes e a síntese de DNA, o
que poderia favorecer o maior crescimento e divisão celular. Liu et al. (2003b)
observaram a promoção do crescimento e a proliferação de células de Oryza sativa
quando estas foram estimuladas com ultrasom (28 KHz) até 5 segundos. Após esse
tempo de exposição, o crescimento e a proliferação das células foram inibidos, o que
pode ter ocorrido devido à destruição da estrutura celular, tal como a membrana
celular, o citoesqueleto e o mitocôndrio onde muitas enzimas e canais de íons são
39
afetados. O aumento da perede celular e da fluidez da membrana podem ter sido os
fatores de promoção do crescimento celular nos tempos mais curtos de exposição.
Um dos resultados imediatos da aplicação do ultrasom de alta intensidade é o
rompimento celular e a desnaturação de enzimas (Joersbo e Brunstedt, 1990). A
aplicação de ultrasom apresenta efeitos químicos, bioquímicos e fisiológicos. Nos
sistemas biológicos, os efeitos químicos do ultrasom envolvem a formação de
radicais livres, que são formados nos estágios finais da cavitação transiente (Makino
et al., 1982). Aparentemente, em estudos com células de mamíferos, os radicais
livres liberados não são os responsáveis pelo rompimento celular, já que o
tratamento das células com um seqüestrador desses radicais; não aumentou a
eficiência de plaqueamento das mesmas. No entanto, os radicais livres podem ter
efeito na capacidade de divisão das células intactas remanescentes, por afetar a
integridade das membranas (Fu et al., 1979).
O ultrasom de baixa intensidade pode modificar o metabolismo celular, induzir
a inibição e a estimulação de atividades enzimáticas, o crescimento celular, a
biossíntese e a alteração das membranas celulares e de outras estruturas das
organelas celulares (Bochu et al., 1998; Liu et al., 2003a; 2003b; Liu et al., 2006;
Chen et al., 2008). Uma das consequências mais amplamente observadas do
ultrasom em células vivas é o aumento na permeabilidade ou na permeabilização da
membrana, aumentando a absorção de substâncias externas, tal como a absorção
de nutrientes e a liberação de produtos intracelular. Os efeitos estimulantes do
ultrasom nas reações biológicas e no crescimento celular não são ainda bem
entendidos, os quais podem ser atribuídos aos efeitos mecânicos do ultrasom, tais
como o aumento de transferência de massa e a combinação nos sistemas de
reação; outros pesquisadores relatam que esses efeitos estimulantes são devido à
estimulação de enzimas ou a atividade metabólica celular. Entretanto, os efeitos
benéficos do ultrasom dependem de sua intensidade, do tempo de exposição e
também das condições fisiológicas dos tecidos das plantas (Bochu et al., 1998; Liu
et al., 2003a; 2003b; Liu et al., 2006; Chen et al., 2008).
A exposição das células ao ultrasom pode causar a degradação de
macromoléculas, tais como, polissacarídeos, proteínas, DNA e, provavelmente,
RNA. Miller et al. (1976) observaram a inibição da síntese de DNA, RNA e proteínas
em meristemas radiculares de Pisum sativum, logo após a exposição a 1 minuto de
ultrasom (1MHz; 30 Watts/cm2). A síntese de RNA e de proteínas foi diminuída em
40
60 a 70%, 1 hora após a exposição, mas foram recuperadas 4 horas mais tarde. De
maneira similar, o índice mitótico foi reduzido depois do tratamento com o ultrasom e
recuperado após 6 a 7 horas. Os efeitos fisiológicos do ultrasom estão relacionados
à parede celular, à membrana plasmática e ao crescimento. Miller et al. (1974)
relataram a ocorrência de ruptura nas paredes celulares na zona de alongamento da
raiz primária de Vicia faba em resposta ao ultrasom. As observações histológicas
demonstraram um grau mais alto de dano na face das células que estava orientada
em direção ao transdutor. Bleaney e Oliver (1972) trataram plântulas de Vicia faba
com ultrasom de 1,5 MHz em intensidade, variando de 1 a 4 Watts/cm2 durante
períodos de 2 a 60 minutos. Foi observado um decréscimo no crescimento em
relação ao aumento do tempo e da intensidade de exposição. O decréscimo foi
máximo no primeiro dia após o tratamento, porém o crescimento foi recuperado ao
longo de oito dias. Esses resultados sugeriram a possibilidade de estar havendo
alterações temporárias nas células em divisão no meristema e nas regiões de
alongamento celular.
Os ácidos nucléicos são materiais hereditários para reserva, transferência e
expressão das informações genéticas, e os efeitos dos fatores físicos sobre esse
material é de grande interesse para as pesquisas genéticas. Xiujuan et al. (2003)
avaliando os efeitos das ondas sonoras na síntese de ácidos nucléicos e de
proteínas observaram que as ondas sonoras não têm influência óbvia no conteúdo
de DNA, mas aceleram a síntese de RNA e proteínas solúveis, aumentando o nível
de transcrição.
O ultrasom tem sido usado para promover a transferência de genes para
células vegetais. Resultados positivos foram obtidos, utilizando protoplastos,
suspensões celulares e pedaços intactos de tecidos. O método emprega os mesmos
princípios básicos, independente da natureza do material vegetal a ser
transformado. Nessa técnica, os tecidos vegetais em suspensão podem ser
submetidos ao tratamento de ultrasom em um tubo de microcentrífuga com baixo
volume de solução (tampão ou meio de cultura), contendo o DNA a ser introduzido
nas células. Joersbo e Brunstedt (1990) obtiveram a introdução de DNA exógeno em
protoplastos de Nicotiana tabacum e Beta vulgaris através da aplicação de pulsos de
ultrasom 20KHz a 0,5-1,5 Watts/cm2 de potência acústica. Para Beta vulgaris, a
freqüência de expressão transiente do gene introduzido foi maior utilizando ultrasom
do que a obtida com eletroporação. Até o presente momento, o mecanismo da
41
permeabilização acústica não está completamente esclarecido. Parece estar
relacionado ao violento colapso das bolhas, gerando pressão e temperatura altas.
Isso poderia causar ruptura localizada do plasmalema e levar à absorção das
substâncias dissolvidas na solução onde as células se encontram, com a posterior
restauração da integridade da membrana (Joersbo e Brunstedt, 1992). Zhang et al.
(1991) obtiveram a integração estável do gene da p-glucuronidase (GUS) em tecidos
foliares de Nicotiana tabacum através do ultrasom. Neste trabalho, foi indispensável
a adição de DNA carregador e os resultados indicaram que a presença de
dimetilsulfóxido (DMSO) na solução tampão para o tratamento de ultrasom
aumentou a expressão transiente do gene repórter.
Já é bem conhecido que as H+-ATPases do tonoplasto e da plasmalema
desempenham papéis centrais na fisiologia e bioquímica da célula vegetal. Muitas
pesquisas têm sido realizadas em células ou tecidos animais para identificar os
efeitos do ultrasom, mas, existem poucos estudos dos efeitos do ultrasom em
células de plantas. Alguns poucos trabalhos tem sido realizados com o intuito de
avaliar os efeitos do som e do ultrasom na célula vegetal e de desvendar como
essas forças mecânicas afetam a atividade dessas enzimas (Bochu et al., 1998;
Bochu et al., 2002; Zhao et al., 2002a; Xiaocheng et al., 2003; Xiujuan et al., 2003;
Liu et al., 2003a; 2003b; Liu et al., 2006; Chen et al., 2008).
A estimulação sonora em calos de Chrysanthemum aumenta a atividade H+-
ATPase de membrana plasmática. Esse aumento de atividade é dependente de um
processo de fosforilação reversível da H+-ATPase da membrana plasmática, por
uma proteína quinase dependente de Ca2+, o qual está envolvida na transmissão do
sinal. As ondas sonoras aumentaram a concentração de Ca2+ intracelular (Bochu et
al., 2002), e este foi redistribuído nas organelas em decorrência ao estresse,
aumentando sua concentração no vacúolo e no citoplasma (Liu et al., 2001). A
atividade H+-ATPase foi parcialmente reduzida quando Ca2+ foi quelado, o que
evidenciou o envolvimento do Ca2+, provavelmente desempenhando um importante
papel como mensageiro secundário na estimulação sonora (Zhao et al., 2002a; Yi et
al., 2003). Zhao et al. (2002a) demonstraram, que, em contrapartida, a calmodulina
não está envolvida na promoção da atividade da H+-ATPase da plasmalema. Os
canais de K+ também parecem estar relacionados ao crescimento dos calos
estimulados pelo som, uma vez que o som ativa a abertura desses canais Zhao et al.
(2002b). Ao aplicar a estimulação sonora em vesículas isoladas de crisântemo a
42
resposta foi contrária à observada quando a estimulação foi dada in vivo, sugerindo
que as mudanças na atividade das H+-ATPases de membrana plasmática talvez
sejam devido a uma série de reações fisiológicas e bioquímicas (Zhao et al., 2002).
A atividade de transporte de prótons e de hidrólise de ATP pela V-ATPase
isolada de células de babosa aumentou quando as células foram submetidas a
ultrasom de baixa intensidade. O que pode ter sido o fator principal para o aumento
no crescimento observado nessas células (Liu et al., 2003a). Em estudos mais
recentes Liu et al. (2006), observaram uma promoção na atividade da Ca2+-ATPase
de células de babosa submetidas a ultrasom de baixa intensidade, o que provê boa
condição fisiológica para as células se adaptarem as condições ambientais, uma vez
que o Ca2+ funciona como um mensageiro secundário em muitos vias de sinalização.
Quando as células foram submetidas a ultrasom de alta intensidade, houve uma
inibição dessas enzimas (Liu et al., 2006).
Foi observado um aumento da atividade das enzimas superóxido dismutase
(SOD), peroxidase (POD) e catalase (CAT) em Chrysanthemum estimulados por
ondas sonoras, até determinado tempo de exposição. Essas enzimas ajudam as
células a manter os níveis de radicais livres baixos, decompondo o peróxido de
hidrogênio (H2O2), que pode gerar mais espécies reativas de oxigênio e eliminando o
radical superóxido (O2¯) (Xiujuan et al., 2003). Em pesquisas mais recentes, Chen et
al. (2008) avaliando o sistema de defesa antioxidante de células de algas sonicadas,
também observaram um aumento na atividade das enzimas SOD e CAT, quando
comparado ao controle, bem como na atividade ATPásica de membrana plasmática,
no nível de glutationa e no conteúdo de carotenóides. O ultrasom aumentou também
o conteúdo de malondialdeído (MDA), indicando um aumento na peroxidação lipídica
das células tratadas.
43
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar as respostas, quanto à eficiência fotoquímica e a peroxidação lipídica,
em folhas de dois cultivares de Phaseolus vulgaris L. (Carioca e Negro Huasteco) e
um cultivar de Vigna unguiculata (L.) Walp. (Epace 10) expostas à alta irradiância.
Verificar se as bombas de prótons presentes na membrana plasmática e no
tonoplasto de Vigna unguiculata (L.) Walp. (Epace 10), de células de tabaco
(Nicotiana tabacum) - linhagem By2 e de mamoeiro (Carica papaya L.) – grupo
“Solo” – cv. Golden são sensíveis a estímulos físicos (luminosos, sonoros e
estimulados mecanicamente, respectivamente) atuando como perceptores e/ou
mediadores desses estímulos na célula vegetal e estudar sua participação nas
respostas morfogênicas.
3.2 Objetivos específicos
a. Determinar a fluorescência da clorofila a e a peroxidação lipídica em folhas de
dois cultivares de feijão comum Phaseolus vulgaris L. (Carioca e Negro
Huasteco) e um cultivar de caupi Vigna unguiculata (L.) Walp. (Epace 10)
expostas à alta irradiância;
b. Estudar o efeito da luz na atividade das enzimas H+-ATPase e H+-PPase do
tonoplasto e da H+-ATPase da plasmalema isoladas de hipocótilos de caupi
Vigna unguiculata (L.) Walp. (Epace 10);
c. Verificar os efeitos da perturbação mecânica (“brushing”) sobre a atividade
das enzimas H+-ATPase do tonoplasto e da H+-ATPase da plasmalema
44
isoladas do caule de mamoeiros (Carica papaya L.) – grupo “Solo” – cv.
Golden, estimulados mecanicamente;
d. Estabelecer a relação entre as respostas morfogênicas ao nível celular e
tecidual com os efeitos encontrados nas bombas de prótons das membranas
plasmática e vacuolar isoladas do caule de mamoeiros (Carica papaya L.)
submetidos à perturbação mecânica;
e. Avaliar os efeitos do ultrasom na atividade das enzimas H+-ATPase e H+-
PPase do tonoplasto e da H+-ATPase da plasmalema isoladas de células de
tabaco (Nicotiana tabacum) - linhagem By2 estimuladas por ondas
ultrassônicas;
f. Verificar a relação entre as respostas morfogênicas a nível celular e tecidual
com os efeitos encontrados nas bombas de prótons das membranas
plasmática e vacuolar isoladas de células de tabaco (Nicotiana tabacum)
submetidas a ondas ultrassônicas.
45
4. TRABALHOS
46
4.1. RÁPIDAS RESPOSTAS DOS LIPÍDIOS DE MEMBRANA E D A EFICIÊNCIA
FOTOQUÍMICA EM PLANTAS DE FEIJÃO COMUM E CAUPI ( Phaseolus vulgaris
e Vigna unguiculata ) SUBMETIDAS A ALTA IRRADIÂNCIA
47
4.1.1 RESUMO
Neste trabalho, nós investigamos as respostas em curto prazo da eficiência
fotoquímica e dos lipídios da membrana em plantas de feijão comum e caupi
submetidas a estresse por alta irradiância. Folhas primárias de plantas jovens de
feijão comum [Phaseolus vulgaris (“Carioca” e “Negro Huasteco”)] e de caupi [Vigna
unguiculata Walp (“Epace 10“)] foram expostas a 2000 µmol m-2 s-1 por 10, 20 e 30
minutos. A fluorescência inicial (F0) foi quase constante para os genótipos em
resposta a alta irradiância exceto para o genótipo Carioca. Uma distinta redução da
fluorescência máxima (Fm) foi claramente observada nos genótipos de feijão
estressados em 20 minutos, seguidos por uma leve recuperação. Em feijão comum,
o rendimento quântico máximo (Fv/Fm), foi reduzido lentamente de 10 a 30 minutos
de exposição à alta irradiância. Em caupi, somente uma ligeira redução de Fv/Fm foi
observada em 20 minutos seguida pela recuperação para os valores normais em 30
min. Em adição, a peroxidação lipídica mudou significativamente nos genótipos de
feijão comum com um evidente aumento em 20 min. Nossos resultados sugerem
que o aparelho fotossintético de caupi é mais tolerante à alta irradiância do que o de
feijão comum e a integridade das membranas celulares de caupi foram
aparentemente mantidas sob condições de alta irradiância.
48
4.1.2 ABSTRACT
In this work, we investigated the short-term responses of the photochemical
efficiency and membrane lipids in common bean and cowpea plants submitted to
high light stress. Primary leaves of young plants of common bean [Phaseolus
vulgaris (“Carioca” e “Negro Huasteco”)] and cowpea [Vigna unguiculata Walp
(“Epace 10”)] were exposed to 2000 µmol m-2 s-1 for 10, 20 and 30 minutes. Initial
fluorescence (Fo) was nearly constant in response to high light genotype except for
Carioca genotype. A distinct reduction of maximum fluorescence (Fm) was clearly
observed in bean stressed genotypes at 20 min followed by a slight recovery. In
common bean, the maximum quantum yield (Fv/Fm), was reduced slowly from 10 to
30 min of high light. In cowpea, only a slight reduction of Fv/Fm was observed at 20
min followed by recovery to normal values at 30 min. In addition, the lipid
peroxidation changed significantly in common bean genotypes with an evident
increase at 20 min. Our findings suggest that the photosynthetic apparatus of
cowpea is more tolerant to high light than common bean and the integrity of cowpea
cell membranes was apparently maintained under high light conditions.
49
4.1.3 INTRODUÇÃO
A energia luminosa é essencial para as plantas, mas em excesso pode ser
prejudicial ao aparelho fotossintético. A fotoinibição ocorre quando a energia do
fóton absorvido excede a capacidade do uso de energia pelo transporte de elétrons
fotossintético (Gilmore e Govindjee, 1999). Sob essa condição, algumas mudanças
ocorrem nas propriedades físico-químicas dos tilacóides levando a uma diminuição,
ou mesmo inativação, do transporte de elétrons fotossintético (Schansker e van
Rensen, 1999) e ao dano oxidativo do fotossistema II, FSII (Longe et al., 1994).
Como resultado, observa-se uma redução na eficiência quântica do FSII (Aro et al.,
1993).
O excesso de energia pode ser dissipado através de processos não
fotoquímicos como calor e fluorescência, não prejudiciais à integridade do aparelho
fotossintético. Porém, outra forma de utilização da energia excedente pode se dar
através da formação de espécies reativas de oxigênio (EROs). Embora as EROs
possam operar como mensageiros secundários envolvidos na transdução do sinal
em resposta a estresses abióticos (Mittler, 2002), altas concentrações dessas EROs
são altamente prejudiciais para o funcionamento e integridade celular (Wise e
Naylor, 1987 a,b), causando peroxidação lipídica na membrana (Choudhury e
Behera, 2001). Conseqüentemente, a habilidade das plantas para manter sua
integridade de membrana sob estresse por alta irradiância determina sua
capacidade de resistência, e pode ser usada como um critério para avaliar a
resistência ao estresse (Lauriano et al., 2000).
Como uma defesa, vários mecanismos fotoprotetores são ativados pelas
plantas para manter a função do cloroplasto, tais como a de-epoxidação das
xantofilas, o desvio do fluxo de elétrons do fotossistema I (FSI) para o oxigênio
50
molecular, e o aumento do pH dependente da dissipação pela ATP sintase (Hideg e
Murata, 1997; Gilmore e Govindjee, 1999). A inativação do transporte de elétrons
pode ser reversível, mas isso depende da intensidade do dano provocado. Segundo
Barber e Andersson (1992), o dano fotoinibitório atinge a estrutura e função do FSII.
Em folhas intactas, o dano do FSII é reparado pela síntese de novo da proteína D1,
a qual é responsável pela manutenção da funcionalidade do centro de reação do
FSII. A degradação proteolítica da proteína D1 resulta na desmontagem do FSII,
entretanto, a ressíntese dessa proteína promove o seu restabelecimento após
algum tempo. O grau do dano do FSII é o resultado do desbalanço entre a
inativação induzida pela luz e o subseqüente reparo (Greer et al., 1986).
Os efeitos da fotoinibição são usualmente monitorados pelo rendimento
quântico máximo (Fv/Fm), o qual está associado à eficiência fotoquímica máxima do
aparato fotossintético sob saturação de luz. Para respostas em longo prazo, pouco é
conhecido sob as conseqüências da alta irradiância na produtividade de biomassa
(Laing et al., 1995), especialmente em termos de análise da fluorescência da
clorofila a. Powles et al. (1983) demonstraram que a recuperação do estresse por
irradiância ocorreu entre 4 e 8 horas de baixa irradiância em Phaseolus vulgaris. Em
adição, as plantas de P. vulgaris crescidas em baixa irradiância usaram mais
eficientemente o sistema protetor, isto é as xantofilas, com aumentada atividade do
estado de de-epoxidação, suficiente para eliminar as EROs quando a irradiação foi
estimulada por luz direta a baixa temperatura (Tsonev et al., 2003). Entretanto,
pouco é conhecido sobre a relação entre a integridade da membrana, a capacidade
de resistência, e a eficiência fotoquímica, o qual pode representar um critério de
seleção para estresse abiótico.
No presente estudo, a integridade da membrana foi usada para acessar a
resistência à alta irradiância em P. vulgaris e V. unguiculata, as quais diferem
significativamente em suas respostas a alta temperatura (Costa et al., 2002). O
resultado é contrastado com análises dos parâmetros de fluorescência do FSII, o
qual foi medido quando a severidade do tratamento fotoinibitório aumentou. Essas
avaliações provêem alguns indícios para distinguir capacidade de tolerância ao
estresse por alta irradiância entre as duas espécies.
51
4.1.4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1.4.1 Material vegetal
Utilizou-se sementes de dois cultivares de Phaseolus vulgaris L. (Carioca e
Negro Huasteco) e um cultivar de Vigna unguiculata (L.) Walp. (Epace 10) oriundas
do Banco Ativo de Germoplasma da UENF.
4.1.4 2 Condições de crescimento
As sementes foram semeadas em recipientes plásticos com capacidade de
300 cm3 contendo substrato orgânico e crescidas em uma câmara Biotronette IV
(Lab-Line Instruments, USA) durante 10 ou 11 dias. Esse tempo foi considerado
ótimo para as folhas primárias alcançarem o tamanho máximo. A câmara de
crescimento permitiu um fluxo de fótons fotossintético (FFF) de 200 µmol m-2 s-1 com
fotoperíodo de 12 horas, temperatura de 24 - 26±1 °C, e 48,0 / 72,5 % de umidade
relativa (dia/noite), respectivamente. O FFF foi medido por meio de um fotômetro/
quantômetro/ radiâmetro modelo LI-159 (Licor, USA). A temperatura e a umidade
relativa do ar foram registradas por meio de sensores automáticos (modelo 250,
Spectrum Technologies, USA) acoplado a um data logger (WatchDog Data Logger,
Spectrum Technologies, USA).
4.1.4.3 Tratamento por alta irradiância
As folhas primárias expandidas foram usadas para os experimentos. Uma
folha foi exposta à alta irradiância (HI) de 2000 µmol m-2 s-1 durante 10, 20 e 30 min,
52
e a segunda folha foi coberta com papel alumínio a fim de evitar a irradiação. Essa
folha foi considerada como o controle. Para a indução do estresse, foi utilizada uma
fonte de luz cujo feixe foi passado por um filtro de água a fim de evitar o calor sob as
folhas fotoinibidas durante a irradiação e para concentrar os feixes de luz (Figura 1).
O FFF foi quantificado após o filtro de água. Foram realizados cinco experimentos
para cada tratamento usando plantas distintas.
Figura 1. Esquema montado para submeter as plantas ao estresse luminoso.
Projetor de slide como fonte luminosa, balão com água para reduzir o calor e
concentrar os feixes de luz.
4.1.4.4 Fluorescência da clorofila a
A fluorescência da clorofila a (Chl a) foi medida por meio de um fluorímetro de
luz modulada MINI-PAM (Walz, Germany) em temperatura ambiente (25±2 °C)
(Figura 2). Após o tratamento por HI, as folhas utilizadas nos experimentos foram
adaptadas ao escuro por 30 minutos garantindo o estado oxidado da quinona A. Os
parâmetros de fluorescência avaliados foram os seguintes: a fluorescência inicial
(F0) obtida com luz modulada de baixa intensidade (< 0,1 µmol m-2 s-1), a
fluorescência máxima (Fm) determinada com um pulso de luz saturante (~ 6000 µmol
m-2 s-1) com duração de 0,3 s, e o rendimento quântico máximo do FSII: Fv/Fm = (Fm
53
– F0)/Fm. Consequentemente, esses parâmetros foram usados para obtenção da
dissipação (quenching) fotoquímica: qP = (F’m – F)/(F’m – F0), e da dissipação
(quenching) não-fotoquímica: qN = (Fm – F’m)/(Fm – F0). Esses coeficientes de
dissipação foram automaticamente calculados pelo MINI-PAM. A taxa de transporte
de elétrons foi estimada com ETR = ∆F/F’m × PAR × 0,5 × fator ETR, onde ∆F/F’m é
o rendimento quântico efetivo das amostras irradiadas (fluorescência
variável/fluorescência máxima efetiva), PAR é a radiação fotossinteticamente ativa, e
o fator ETR corresponde a fração de radiação incidente absorvida pelas folhas
verdes (valor de 0,84) (Schreiber et al., 1994). qP, qN, e ETR foram medidos em
resposta a diferentes fluxos de fótons fotossintéticos constituindo de oito períodos
consecutivos de “luz actinica” (0, 190, 285, 432, 598, 894, 1213, e 2000 µmol m-2 s-
1). Cada período de FFF durou por volta de 10 segundos seguido por um pulso de
radiação saturante (6000 µmol m-2 s-1) de 0,3 segundo de duração. Antes da
seqüência de medições com radiação actinica, uma medição foi realizada no escuro.
Figura 2. Medição da fluorescência da clorofila a por meio de um fluorímetro de luz
modulada MINI-PAM, mostrando a pinça onde o emissor de luz é inserido.
54
4.1.4.5 Integridade das membranas - peroxidação lip ídica
As folhas fotoinibidas foram ensaiadas para determinação da peroxidação
lipídica imediatamente após as medições da fluorescência da Chl a. Primeiramente,
os tecidos foliares foram pesados e macerados usando-se gral e pistilo com 5 mL de
ácido tricloroacético (TCA) 0,1% na presença de polivinil polipirrolidona (PVPP). O
uso de PVPP é necessário para proteção contra a formação de complexos fenólicos,
que poderiam interferir nas leituras de absorvância mascarando os resultados. O
homogenato foi então centrifugado a 8000×g por 5 min, e do sobrenadante retirou-se
uma alíquota de 1 mL e adicionou-a a 4 mL de TCA 20%, contendo TBA (ácido
tiobarbitúrico) 0,5%. Essa mistura foi mantida a 95oC por 30 min, seguindo-se por
um rápido resfriamento em gelo. Após centrifugação a 8000×g por 10 min, a
densidade óptica foi determinada a 535 e a 600 nm em espectrofotômetro, (Modelo
6405 UV/Vis, Jenway, UK). A peroxidação lipídica foi estimada através da formação
de malondialdeído (MDA) nos extratos das folhas. A concentração de MDA foi
calculada utilizando um coeficiente de extinção de 155 mM cm-1, de acordo com
Dhindsa et al. (1981).
55
4.1.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os genótipos testados [Phaseolus vulgaris (‘Carioca e ‘Negro Huasteco’)] e
[Vigna unguiculata Walp (‘Epace 10’)] em 3 períodos (10, 20, e 30 min) exibiram
distintas respostas de fluorescência a alta intensidade luminosa (2000 µmol m-2 s-1),
como observado na Figura 3.
56
Figura 3 - Fluorescência inicial (Fo), fluorescência máxima (Fm) e eficiência quântica
(Fv/Fm) medida em folhas de Phaseolus vulgaris L. (Carioca e Negro Huasteco) e de
Vigna unguiculata (L.) Walp. (Epace 10) expostas a FFF de 2000 µmol m-2 s-1 por
10, 20 e 30 minutos. As medidas com o MINI-PAM foram feitas a 25°C, 30 min após
adaptação ao escuro. Fonte: Ferreira et al. (2007).
100
150
200
250
300
350
400
Fo (
a.u.
)
Carioca Negro Huasteco Epace 10
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Fm (
a.u.
)
Carioca Negro Huasteco Epace 10
Control 10 20 300,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
Fv/F
m (
a.u.
)
Duration of high light (min)
Carioca Negro Huasteco Epace 10
Tempo de exposição a irradiância
57
Os resultados da Figura 3 mostram que os genótipos mais sensíveis
pareceram ser N. Huasteco e Carioca, cujos valores para a eficiência fotoquímica do
FSII (Fv/Fm) diminuiram quando o tempo de exposição à alta intensidade luminosa
aumentou. Diferentemente dos outros, os valores de Fv/Fm para Epace 10
demonstraram somente pequenas variações com o tempo, decaindo levemente em
20 min, e recuperando em 30 min. Esses parâmetros, os quais caracterizam o
rendimento quântico máximo das reações fotoquímicas iniciais em folhas adaptadas
ao escuro, é o mais adequado para indicar estresse ambiental pelo excesso de
irradiação (Maxwell e Johnson, 2000) e isso foi confirmado em nossa investigação.
Quando os diferentes genótipos foram comparados em relação a F0, um
aumento em N. Huasteco foi inicialmente observado (10 min) seguido por uma
aparente manutenção (20 e 30 min) (Figura 3). O aumento de F0 sob condições
desfavoráveis é usualmente devido à redução do pool de plastoquinona e então
quinona A, a qual nessas condições deixa de ser completamente oxidada por causa
de uma limitação do fluxo de elétrons através do FSII (Krause e Weis, 1984; Krause,
1988). O Cv. Carioca exibiu um comportamento diferente com valores decrescentes
em 10 min seguidos por uma aparente recuperação em 20 e 30 min. Essa queda
em F0 tem sido associada com a destruição do centro de reação do FSII (Bolhàr-
Nordenkampf et al., 1989), mas essa não é provavelmente a situação em Carioca
por causa da rápida recuperação dos valores entre 20-30 min. Em Epace 10,
nenhuma diferença foi detectada nos valores de F0 sob condições fotoinibitórias.
Em relação a Fm, todos os genótipos mostraram redução nos valores com o
aumento da exposição à alta irradiância, mas houve uma tendência de recuperação
em Epace 10 após 30 min (Figura 3). Essa redução em Fm é bem caracterizada visto
que é devido a uma degradação proteolítica da proteína D1 danificada (Aro et al.,
1993). A pequena recuperação de Fm observada para Epace 10 em 30 min pode
sugerir um reparo dos centros de reação dos PSII via síntese de novo da proteína
D1 e remontagem dos centros de reação funcionais do PSII (Mishra e Ghanotakis,
1994). Essa situação provavelmente não ocorre nos outros genótipos, porque o PAR
continua a atingir o complexo FSII danificado e outras proteínas além da D1, talvez a
D2 (Schuster et al., 1988), CP43 e CP47 (Nedbal et al., 1990), e talvez resulte em
perda irreversível do transporte de elétrons do FSII.
De acordo com Ohad et al. (1984), a baixa irradiância é necessária para o
processo de recuperação da fotoinibição. Entretanto, é imperativo aceitar que
58
situações de alta irradiância não são convenientes para o processo de recuperação,
quando ocorreu a transição de 20 para 30 min, especialmente em Carioca e N.
Huasteco. Nesses cultivares, um desbalanço entre inativação e subseqüente reparo
induzido por PAR pode ter levado a uma forte perda do rendimento quântico (Greer
et al., 1986). Essa situação está relacionada com os baixos valores observados de
Fv/Fm (Figura 3). Então, um dano fotoinduzido ocorre no complexo do FSII em todos
os três genótipos, com uma evidência de fotoinibição irreversível (Hideg e Murata,
1997) em Carioca e N. Huasteco, e um rápido processo de reparo somente em
Epace 10.
Tabela 1 – Peroxidação lipídica, medida pelo conteúdo de malondialdeído (MDA)
em plantas dos cultivares Carioca, Negro Huasteco (Phaseolus vulgaris L.) e Epace
10 (Vigna unguiculata (L.) Walp.) expostas a 2000 µmol m-2 s-1 por 10, 20 e 30
minutos. Os valores representam a porcentagem do controle da média de cinco
plantas para cada tratamento.
MDA (% do controle) Duração da luz (minutos)
Cultivares
10 20 30 Carioca 1,20 69,48 16,32 Negro Huasteco 32,81 41,64 -20,75 Epace-10 13,11 19,35 -3,56
Fonte: Ferreira et al. (2007).
Foram encontrados importantes indícios de que o aparelho fotossintético de
Carioca e N. Huasteco demonstraram limitações impostas pelo tempo de exposição
sob alta irradiância. Essa situação é noticiável porque a eficiência fotoquímica foi
quase constante em Epace 10. A exposição das plantas a irradiância normal
usualmente levou a produção de espécies reativas de oxigênio devido às limitações
no “pool” de ATP e NADP+ (Macpherson et al., 1993) e essas moléculas deletérias
são minimizadas por um intricado sistema de defesa que envolve várias enzimas
antioxidantes (Scandalios, 1993). Com uma disponibilidade inadequada do “pool” de
ATP e de NADP+, a energia de excitação está sujeita a transferir moléculas de O2 e
isso pode promover a formação de perigosas espécies de O2¯ ou 1O2. Uma completa
investigação foi conduzida para prover os níveis de peroxidação lipídica em tecidos
59
foliares expostos à alta irradiância (Tabela 1). Esse protocolo foi baseado no fato de
que a inabilidade para transportar elétrons via reações fotoquímicas resulta em um
aumento no conteúdo de MDA (Buege e Aust, 1978; Foyer et al., 1994). A evidência
mostra um maior conteúdo de MDA em Carioca e N. Huasteco sem considerar o
tempo de exposição para alta irradiância. A despeito do aumento de MDA em 20 e
30 min para Epace 10, uma substancial redução posterior para valores do controle
foi observada em 30 min, indicando uma possível re-adaptação do aparelho
fotossintético.
Nessa investigação, tornou-se claro que o aparelho fotossintético de V.
unguiculata (Epace 10) é distinguido dos outros genótipos de P. vulgaris (Carioca e
N. Huasteco) em termos de usar os mecanismos fotoprotetores contra alta
irradiância sob indução de curto tempo. Diferentemente de V. unguiculata, os
genotipos estão expostos a irradiâncias inferiores a ∼ 2000 µmol m-2s-1 ou maiores
em períodos quentes e isso pode resultar em perda de eficiência fotossintética e
conseqüentemente redução de produção de biomassa. Em adição, a alta irradiância
está comumente associada com alta temperatura nos trópicos, constituindo
condições otimizadas para o crescimento e produtividade para V. unguiculata, mas
deletério para P. vulgaris (Silva, 2001; Costa et al., 2002). Nós mostramos que
Carioca e N. Huasteco são menos tolerantes e provavelmente essas cultivares
sofrem fotoinibição irreversível sob alta irradiância diária em condições de campo,
como demonstrado para alta temperatura (Silva, 2001). Os dados de fluorescência
podem prover excelentes achados sob a eficiência da atividade fotoquímica sob alta
irradiância. Novos estudos precisam ser realizados permitindo detectar os
mecanismos bioquímicos de tolerância à alta irradiância como a capacidade de
regeneração da proteína D1, o mecanismo de dissipação do ciclo das xantofilas, o
gradiente de prótons transtilacoidal, e as reações de Mehler tão bem como os efeitos
da fotoinibição crônica na eficiência fotossintética e produtividade.
60
4.1.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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endogenous antioxidants. Plant Physiology, 83 : 278-282.
65
4.2. MODULAÇÃO DA V-ATPase E DA P-ATPase DE HIPOCÓT ILOS
ESTIOLADOS DE CAUPI ( Vigna unguiculata (L.) Walp.)
PELA LUZ
66
4.2.1 RESUMO
As bombas de prótons do tonoplasto e da plasmalema são essenciais para os
eventos de absorção de nutrientes e exclusão de íons tóxicos da célula das plantas.
Variações no crescimento celular sejam elas, reguladas por sinais internos ou
externos, podem ter forte associação com alterações observadas no funcionamento
dessas bombas eletrogênicas. Dos muitos estímulos que afetam o desenvolvimento
vegetal, a luz é um dos mais importantes sinais ambientais. Neste trabalho, foi
investigada a modulação das bombas de H+ do tonoplasto e da plasmalema em
hipocótilos de Vigna unguiculata (L.) Walp. pela luz em plântulas crescidas no escuro
por 7 dias a 25+1oC. Após esse período, as vesículas de tonoplasto e plasmalema
foram isoladas dos hipocótilos por meio de centrifugação diferencial e as
preparações foram expostas à luz branca. As atividades das bombas eletrogênicas
foram determinadas colorimetricamente e o transporte de prótons medido em
espectrofluorímetro. As atividades H+-ATPásicas em vesículas do tonoplasto (V-
ATPase) foram estimuladas quando expostas à luz branca, exibindo uma atividade
30 % maior que o controle (escuro), enquanto a ATPase de membrana plasmática
mostrou apenas uma pequena diferença quando comparada ao controle. Quando as
vesículas foram submetidas a fluxos de fótons fotossintéticos (FFF) crescentes, a
ATPase do tonoplasto mostrou, inicialmente, um incremento de atividade. Em outro
ensaio, hipocótilos foram submetidos a 14 horas de luz branca e, logo após, as
vesículas de tonoplasto e de plasmalema foram isoladas. A atividade ATPásica foi
menor nos hipocótilos tratados, quando comparado com o controle (hipocótilos
estiolados). Em relação a velocidade inicial (Vo) e a amplitude máxima (∆Fmáx) do
transporte de prótons, observou-se que houve um aumento do transporte de H+
67
dependente de ATP na ATPase do tonoplasto e uma redução no transporte de H+
dependente de ATP na ATPase de membrana plasmática.
68
4.2.2 ABSTRACT
The proton pumps of the tonoplast and of the plasmalemma are essential for events
of nutrient absorption and exclusion of toxic ions of the plant cell. Variations in the
cellular growth, regulated by either internal or external signals, can be strongly
associated with changes observed in the functioning of these eletrogenic pumps.
Among various stimulatons that affect the plant development, the light is one of the
foremost environmental signals. In this work, the modulation of the tonoplast and
plasmalemma H+ pumps by light was investigated in hypocotyls of Vigna unguiculata
(L.) Walp. in 7-days-old seedlings grown in the dark at 25+1oC. Afterward, the
tonoplast and plasmalemma vesicles were isolated from hypocotyls using differential
centrifugation and the obtained preparations were exposed to the white light. The
activities of the eletrogenic pumps were determined colorimetrically and the H+
transport measured in fluorimeter. The H+-ATPasic activity of tonoplast vesicles were
stimulated in response to the white light exposition, exhibiting an average activity 30
% greater than that of the control (dark), while the plasma membrane H+-ATPase
showed little difference when compared to the control. When the vesicles were
submitted to increasing photossintetic photon fluxes (FFF), the tonoplastic ATPase
showed an enhanced activity. In another assay, hypocotyls were submitted to 14
hours of white light and, straight after, the vesicles of tonoplast and plasmalemma
were isolated. The ATPase activities of treated hypocotyls were lesser than that of
the control (dark-grown hypocotyls). In relation to the initial rate (Vo) and maximal
amplitude (∆Fmáx) of the proton transport, it was observed an increase of the ATP-
dependent H+-transport related to the tonoplast and a reduction in the activity of
transport of the plasma membrane ATPase.
69
4.2.3 INTRODUÇÃO
As bombas de prótons das membranas vacuolar e plasmática exercem um
papel fundamental no controle do pH citoplasmático e na manutenção da
homeostase celular, bem como no transporte de moléculas e íons e na extensão do
crescimento celular (Taiz e Zeiger, 1998).
A H+-ATPase e H+-PPase vacuolar, geram um gradiente eletroquímico de
prótons através do tonoplasto, acidificando o vacúolo e fornecendo energia para o
transporte de íons e outros metabólitos. Isso possibilita a incorporação de solutos e
de água no vacúolo, induzindo à expansão da célula devido à pressão de
turgescência gerada pelo vacúolo central (Frey e Randall, 1998). A H+-ATPase de
membrana plasmática bombeia prótons através da membrana plasmática do
citoplasma para o exterior celular, acidificando o apoplasto, o que ativa as
expansinas (proteínas que promovem a quebra e reorganização dos polímeros de
celulose da parede celular), possibilitando também, o crescimento celular (Buchanan
et al., 2000). Além disso, o gradiente eletroquímico de prótons que se desenvolve
através da membrana plasmática impulsiona o transporte secundário possibilitando a
absorção de nutrientes, tais como, K+, nitrato, sulfato, sacarose e aminoácidos
(Serrano, 1989, Serrano, 1990). Devido à essencialidade das bombas eletrogênicas
para os eventos de absorção de nutrientes e de crescimento, quaisquer variações
detectadas no crescimento celular, sejam elas reguladas por fitohormônios, sinais
químicos ou luz, podem ter forte associação com alterações no funcionamento
dessas bombas (Serrano, 1989, Serrano 1990).
Dos muitos estímulos que afetam o desenvolvimento vegetal, a luz é o mais
importante sinal ambiental, cujos principais papéis são: (1) a luz como a principal
fonte de energia para a fotossíntese, um sofisticado processo modulado pela
70
quantidade e qualidade de luz, provendo a energia química na forma de açúcares
necessária para a manutenção e o crescimento da célula; (2) a luz atua como um
sinal que é percebido por um sistema de fotorreceptores singular, possibilitando à
planta utilizar um amplo espectro energético, desde o ultra-violeta (UV) até o
vermelho distante, para controlar a morfogênese em todas as etapas do
desenvolvimento (Chamovitz e Deng, 1996).
A luz influencia diretamente a morfogênese da plântula no período pós-
germinativo, durante a transição do crescimento heterotrófico para o crescimento
fotoautotrófico. Durante o desenvolvimento das plântulas, inicialmente, ocorre
inibição do crescimento do hipocótilo por luz, estimulação da abertura do gancho,
expansão e enverdecimento do cotilédone, diferenciação de folhas e cloroplastos e
formação de diversos pigmentos. Além disso, outros eventos fisiológicos como
germinação de sementes, fototropismo, modulação da abertura estomática e
indução do florescimento também são afetados pela luz (Mcnellis e Deng, 1995;
Chory, 1997).
Esses eventos fisiológicos são mediados por um complexo sistema de
fotorreceptores, incluindo os fitocromos, os receptores de luz azul, UV-A e UV-B e,
por fim, as clorofilas e carotenóides. A percepção da luz pelos fotorreceptores inicia
uma cascata de sinalização cujas respostas levam à modulação da expressão
gênica ou a variações em diversos eventos fisiológicos das plantas, tal como
potencial de membrana ou pH local, levando a ativação de enzimas por mecanismos
de fosforilação/desfosforilação (Terzaghi e Cashmore, 1995; Batschauer, 1998). O
que dirige as várias respostas de crescimento e desenvolvimento celular e tecidual
nas plantas (Chamovitz e Deng, 1996; Terzaghi e Cashmore, 1995; Batschauer,
1998; Quail, 2002).
A fotopercepção pelos receptores inicia uma cascata de sinalização
intracelular específica, que induz mudanças na expressão gênica que proporciona
as várias respostas de crescimento e desenvolvimento pelo sinal de luz, modificando
a morfologia e otimizando a fotossíntese (Chamovitz e Deng, 1996; Quail, 2002). Os
sinais de luz azul e UV-A são percebidos primariamente por fototropina (NPH1 e
NPH2) e criptocromo (CRY1 e CRY2), enquanto que sinais de luz vermelha e
vermelha-distante são percebidos pelo fitocromo (PHYA-E), com o PHYA
responsável por sinais de vermelho distante contínuo e PHYB-E primariamente
responsável por sinais de vermelho contínuo. O PHYA também responde a sinais de
71
luz azul e UV-A, bem como para vermelho contínuo. As fototropinas controlam o
fototropismo e os movimentos do cloroplasto. Os outros fotorreceptores controlam
vários outros aspectos da fotomorfogênese e o relógio circadiano através de rotas de
sinalização que convergem em um processo mecanisticamente indefinido de
integração de sinais. Vários intermediários da sinalização e genes regulados por luz
parecem estar envolvidos.
Em células vegetais a manutenção do potencial de membrana e a
homeostase do pH citoplasmático dependem intimamente do funcionamento das
bombas de prótons presentes nessas membranas. A H+-ATPase de membrana
plasmática de células estomáticas é regulada por pulsos de luz azul e vermelha. Na
célula, os pulsos ativam o bombeamento eletrogênico de prótons em protoplastos de
células guarda através de fosforilação da H+-ATPase de membrana plasmática
(Assmann et al., 1985; Kinoshita e Shimazaki, 1999). Enquanto que a luz azul inibe o
alongamento da haste, reduzindo o crescimento do hipocótilo. Há uma inicial inibição
da H+-ATPase da membrana plasmática e subsequente ativação de um ou mais
tipos de canais de ions que contribuem para despolarizar a membrana plasmática
induzido por luz azul (Spalding e Cosgrove, 1989; Spalding e Cosgrove, 1992; Cho e
Spalding, 1996).
Pouco é conhecido sobre o papel da luz na ativação das bombas
eletrogênicas, principalmente das ATPases e PPases do tonoplasto. Assim, o
objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da luz branca (in vitro) na atividade
hidrolítica das enzimas H+-ATPase e H+-PPase do tonoplasto e da H+-ATPase da
plasmalema isoladas de hipocótilos estiolados de plântulas de Vigna unguiculata
Walp, estabelecer o efeito da quantidade de luz na enzima (in vitro). Foram também
analisados o efeito da luz branca na atividade hidrolítica e no transporte de prótons
dessas enzimas em hipocótilos submetidos a 14 horas de luz (in vivo), provendo um
melhor entendimento dos papéis reguladores dessas enzimas no desenvolvimento
das plantas.
72
4.2.4 MATERIAL E MÉTODOS
4.2.4.1 Material vegetal
Utilizou-se uma cultivar de feijão de corda (Epace 10) de Vigna unguiculata
(L.) Walp oriunda do Banco Ativo de Germoplasma da UENF.
4.2.4.2 Condições de crescimento
Sementes selecionadas foram lavadas com hipoclorito de sódio e água
deionizada, e germinadas em papel Germitest. As sementes foram enroladas em
folhas de papel umedecidas com água desionizada, dispostas em duas fileiras, com
um espaçamento de, aproximadamente, dois centímetros entre as sementes, sendo
os rolos acondicionados em um recipiente contendo água suficiente para mantê-los
umedecidos durante o tempo de crescimento. O recipiente foi, então, armazenado
em germinador, sendo o material submetido à temperatura de 28°C e escuro total
por sete dias.
Para os ensaios onde a incidência de luz foi dada diretamente nos hipocótilos,
utilizou-se o mesmo processo descrito acima, porém, após seis dias, os hipocótilos
estiolados foram divididos em dois grupos: um grupo permaneceu no escuro até
completarem os sete dias, os quais consistiram no material controle e o outro grupo
foi transferido para o germinador, sendo o material submetido a 28°C e 14 horas de
luz branca, quando então completaram sete dias.
73
4.2.4.3 Tratamentos de luz
O primeiro ensaio realizado buscou determinar a atividade das H+-ATPases e
H+-PPases vacuolares e das H+-ATPases da plasmalema no escuro e na luz branca
in vitro (600 µmol m-2 s-1 de luz incidindo nas vesículas isoladas), de acordo com o
tempo, objetivando-se verificar se há efeito da luz na ativação das enzimas. Foi
retirada uma alíquota do tubo de reação a cada 10 minutos, iniciando-se com o
tempo zero e finalizando-se com 60 minutos. O ensaio seguinte foi determinar a
atividade das enzimas em diversas quantidades de luz branca in vitro, iniciando-se
com zero (escuro) e seguindo com as quantidades 20, 60, 100, 400, 600, 800, 1100,
1500 e 2000 µmol m-2 s-1 para estabelecer qual quantidade de luz seria utilizada nos
experimentos seguintes. Caso houvesse diferença de atividade entre os tratamentos,
utilizar-se-ia a quantidade de luz na qual as enzimas apresentassem maior atividade.
Também foi determinada a atividade hidrolítica das H+-ATPases e H+-PPases
vacuolares e das H+-ATPases da plasmalema isoladas de hipocótilos submetidos a
14 horas de luz branca, in vivo, sendo o experimento realizado na bancada sob luz
ambiente. Foi retirada uma alíquota do tubo de reação a cada 5 minutos, iniciando-
se com o tempo zero e finalizando-se com 30 minutos.
A quantidade de luz foi monitorada por meio de um fotômetro/ quantômetro/
radiâmetro modelo LI 189 (Li-cor Inc., Nebraska, USA). Foi utilizada uma fonte de
luz, cujo feixe passou por um filtro de água que reduziu a temperatura e concentrou
o foco dos feixes de luz. Foram realizados três experimentos usando preparações
diferentes para cada ensaio, sendo estes realizados com três repetições.
4.2.4.4 Preparação da fração microssomal
As frações microssomais contendo vesículas de membrana plasmática e de
tonoplasto foram isoladas de hipocótilos de Vigna unguiculata Walp. crescidos no
escuro ou submetidos a 14 horas de luz, através de centrifugação diferencial, como
descrito por Giannini e Briskin (1987), com algumas modificações.
Os primórdios foliares e radiculares dos hipocótilos foram removidos com uma
tesoura. Após serem pesados, os hipocótilos foram homogeneizados, usando-se gral
e pistilo em meio tamponado, gelado, sendo o volume de tampão proporcional à
quantidade de matéria fresca, na proporção de 1:2. O tampão de extração foi
74
composto de 250 mM sacarose, 10% glicerol, 100mM Tris-base, 5mM EDTA, 5mM
DTT, 1mM PMSF, 0,4% PVP-40T, 0,3% BSA, 100mM KCl e 10mM glicerol-P. O
homogenato foi filtrado em duas camadas de gaze e, em seguida, o extrato foi
centrifugado a 3.000×g por 10 minutos a 4°C para a remoção de células não
rompidas, núcleos e mitocôndrios, que foram depositados no “pellet”. O
sobrenadante foi, então, centrifugado em ultracentrífuga (modelo CP 75 β, HITACHI,
Japan) a 100.000×g por 30 minutos a 4°C. O precipitado dessa segunda
centrifugação foi ressuspendido em solução tampão contendo: 15% glicerol, 70mM
Tris-HCl (pH 7,6), 1mM EDTA, 1mM DTT e 1mM PMSF.
4.2.4.5 Purificação das vesículas de membrana plasm ática e de
tonoplasto
A fração microssomal foi aplicada sobre um gradiente de sacarose nas
concentrações de 25% e 45%, contendo ainda: 70mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 1mM
DTT e 1mM PMSF. O gradiente com a fração microssomal foi submetido a uma
centrifugação de 100.000×g, em ultracentrífuga (modelo CP 75 β, HITACHI, Japan),
durante 2 horas a 4°C. Após a centrifugação, a band a contendo as vesículas de
membrana plasmática purificadas foi localizada na face inferior (entre as
concentrações de sacarose de 25% e 45%), enquanto as vesículas de tonoplasto
estavam situadas na face superior dos tubos de centrifugação. As bandas foram
coletadas com pipetas “Pasteur” e diluídas com meio de ressuspensão, na
proporção de 1:1. O material foi então congelado em nitrogênio líquido e
armazenado a –70°C até o uso.
4.2.4.6 Determinação de proteínas
As dosagens das proteínas foram realizadas segundo o método descrito por
Bradford (1976).
75
4.2.4.7 Determinação da atividade ATPásica do tonop lasto e da
plasmalema e da atividade PPásica do tonoplasto
As atividades ATPásica e PPásica foram determinadas colorimetricamente,
consistindo na determinação do Pi liberado durante a hidrólise do ATP e do PPi,
respectivamente, segundo o método descrito por Fiske e Subbarrow (1925), com
modificações propostas por Façanha e de Meis (1998).
As reações foram iniciadas com a adição da proteína e finalizadas através da
adição de ácido tricloroacético (gelado) para uma concentração final de 20% (p/V),
sendo os tubos colocados imediatamente no gelo. O material das reações foi
colorido com a mistura de uma solução de 0,5% molibdato de amônio mais 2% ácido
sulfúrico com uma solução de 10% ácido ascórbico, na proporção de 10:1, a qual foi
preparada na hora do uso. Passado 20 minutos fez-se a leitura em
espectrofotômetro (modelo 6405 UV-Vis, JENWAY, England) com comprimento de
onda de 750 nm, obtendo-se a densidade ótica. Quanto maior a atividade hidrolítica
das bombas, maior a liberação de Pi e, conseqüentemente, mais azulada a
coloração do material. O meio reacional foi composto de 50 mM Tris-HCl (pH 7,0) –
tonoplasto ou 50 mM HEPES-KOH (pH 6,5) – membrana plasmática, 100 mM KCl, 5
mM MgSO4, 0,2 mM Na2MoO4, 0,2 mM H2VO4- e 1mM de ATP para as reações de
atividade da H+-ATPase, e 1 mM de PPi para as reações de atividade da PPase e,
ainda, 30 µg de proteína/mL e H2O.
4.2.4.8 Monitoramento do gradiente de prótons
O gradiente de prótons foi medido como descrito por Michelis e Spanswick
(1986), com algumas modificações propostas por Façanha e de Meis (1998),
monitorando a taxa de decréscimo da fluorescência (∆F/min) da sonda fluorescente
metacromática, 9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina (ACMA), excitada com um feixe de
comprimento de onda de 415 nm e a emissão captada a 485 nm, utilizando-se um
espectrofluorímetro (modelo F 4500, HITACHI, Japan).
O ACMA contém um grupo amina que funciona como uma base fraca,
pressupondo que não protonado tem a capacidade de atravessar livremente a
bicamada lipídica das membranas. A protonação da base do grupo amina limita essa
capacidade de movimento transmembranar e, assim, a sonda distribui-se através da
76
membrana conforme a diferença de pH entre o interior e o exterior das vesículas. O
meio reacional foi composto de 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) – tonoplasto ou 10 mM
HEPES-KOH (pH 6,5) – membrana plasmática, 100 mM KCl, 5 mM MgSO4, 250 mM
sacarose, 2 µM ACMA, 1 mM de ATP ou PPi e 30 µg de proteína/mL. Após atingir o
equilíbrio entre efluxo e influxo de prótons, utilizou-se 20 µL de NH4Cl para dissipar o
gradiente formado. Essa dissipação ocorre devido à capacidade da amônia de
atravessar livremente a membrana, passando a forma NH3+, a qual se liga aos
prótons localizados no interior das vesículas, e transporta-os para o exterior.
A partir dos dados obtidos da curva de variação de pH (∆pH) determinou-se a
velocidade inicial (V0) e a variação da fluorescência máxima (∆Fmáx), conforme
mostra a Figura 1.
F 0
F Máx.
F F
F eq
T
PPi
ATP
NH 4 Cl
Seg
Figura 1. Determinação do transporte de H+ para quantificação da velocidade inicial
de transporte de H+ (V0) e da amplitude máxima de transporte de H+ (Fmáx). A queda
da fluorescência do ACMA reflete o transporte de H+ para dentro das vesículas de
membranas.
77
4.2.4.9 Determinação da velocidade inicial (V 0) e da variação da
fluorescência máxima ( ∆∆∆∆Fmáx) do transporte de prótons
Os cálculos da velocidade inicial de formação do ∆pH (V0) e da variação da
fluorescência máxima (∆Fmáx.) foram realizados da seguinte forma:
V0 = [F0 / (Fmáx * T)] * 100, onde:
F0 = fluorescência dependente de V0 em um tempo T qualquer, determinada pela
extrapolação de uma reta tangente à maior inclinação inicial da curva para o eixo do
tempo;
Fmáx = fluorescência máxima;
T = tempo em minutos.
∆∆∆∆Fmáx = Feq / Fmáx * 100, onde:
Feq = fluorescência de equilíbrio, determinada como fluorescência que reflete o
equilíbrio entre o influxo e o efluxo de H+ nas vesículas, sendo calculada da seguinte
forma:
Feq = Fmáx – FF, onde:
Fmáx = fluorescência máxima;
FF = fluorescência final.
Com os gráficos obtidos no espectrofluorímetro, determinaram-se os
parâmetros definidos na Figura 1, com o auxílio de um esquadro e respeitando a
escala dada pelo espectrofluorímetro em relação à fluorescência e ao tempo.
78
4.2.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Com os resultados do trabalho anterior, foi verificado que o aparelho
fotossintético de V. unguiculata (Epace 10) é distinto dos outros genótipos de P.
vulgaris (Carioca e N. Huasteco), sendo mais tolerante a alta irradiância. Em função
disso, selecionou-se esse genótipo para dar continuidade aos experimentos com luz.
Nessa etapa de nossa pesquisa, foi avaliado o efeito da luz sobre a modulação das
bombas de prótons do tonoplasto e da plasmalema isoladas de hipocótilos
estiolados.
Inicialmente, verificou-se a atividade das H+-ATPases do tonoplasto e da
plasmalema submetidas a luz e escuro (Tabela 1). A análise comparativa desses
resultados revelou um aumento da atividade da V-ATPase, enquanto que a P-
ATPase mostrou uma pequena resposta ao estímulo luminoso.
Tabela 1. Hidrólise de ATP e PPi in vitro por vesículas de tonoplasto e de membrana
plasmática de hipocótilos estiolados. Uma reação foi conduzida no escuro e a outra
recebeu 600 µmol m-2 s-1 de luz branca. Os valores representam a média de seis
repetições.
Atividade específica (µmol Pi mg -1 min -1)
Enzimas Escuro Luz branca
(600 µµµµmol m -2 s-1)
V-ATPase 89,10 ± 57,94 ∗ 108,93 ± 71,12 ∗
V-PPase 34,31 ± 6,02 ns 29,18 ± 8,69 ns
P-ATPase 83,42 ± 35,09 ∗ 95,70 ± 41,06 ∗ ∗ (P < 0,05) entre escuro e luz
79
A Tabela 1 exibe os resultados do efeito da luz sobre a atividade das
enzimas. Houve aumento da hidrólise do ATP pela V e P-ATPases por efeito
luminoso. A partir desses resultados, as H+-ATPases da plasmalema e do tonoplasto
surgem como elementos ativos do sistema de percepção/transdução destes sinais
físicos. Contudo, a PPase não revelou resposta ao estímulo.
Devido ao seu papel na regulação da homeostase de íons citoplasmáticos e
na pressão de turgor, não é surpreendente que a atividade da bomba mude em
resposta a estímulos/estresses ambientais tais como: salinidade e seca, baixas e
altas temperaturas e luz (Dietz et al., 2001). As H+-ATPases do tonoplasto e da
plasmalema são enzimas chaves que controlam o gradiente eletroquímico de
prótons nas membranas e endomembranas das células, por essa razão, é de se
esperar que essas enzimas sejam sensíveis a estímulos físicos.
A H+-ATPase tipo V é uma bomba de próton altamente regulada em vários
diferentes caminhos envolvendo mecanismos distintos de regulação, com suas
subunidades regulatórias influenciando a atividade da enzima. Eventos como:
fosforilação das subunidades da V-ATPase, modificações do estado redox da
enzima por oxidação e redução de grupos sulfidrila, presentes nas subunidades A e
B da V-ATPase, proteínas regulatórias que inibem ou ativam a bomba, mudanças na
disponibilidade do substrato, variações no pH citoplasmático e vacuolar e também,
os lipídios da bicamada lipídica onde a enzima está inserida são cruciais para a
atividade da bomba (Ratajczak, 2000). O controle da dissociação e remontagem do
subcomplexo V1 da enzima também está envolvido na regulação (Sze et al., 1999).
A existência de evidências de que distintas isoformas da V-ATPase podem
diferir quanto à composição da subunidade, quanto às propriedades de
bombeamento e regulação (Sze et al., 1999), mostram a diversidade existente entre
as V-ATPases. Dessa forma, em diferentes espécies e em diferentes tipos celulares
dentro de uma mesma planta poder-se-ia observar respostas distintas quanto à
regulação dessas enzimas. Padmanaban et al. (2004), observaram que os genes da
subunidade c da H+-ATPase vacuolar em tecidos de plantas são diferencialmente
influenciados por luz em diferentes tipos de células provavelmente dependendo da
demanda funcional e do estágio de desenvolvimento das células.
A análise da atividade da H+-ATPase tipo P na luz e no escuro, apesar de
mostrar significância, evidenciou um estímulo pela luz de 6%, enquanto que o
estímulo da V-ATPase foi de 30% (Tabela 1).
80
Muitos estudos envolvendo bombas de prótons e luz tem sido conduzidos em
células guarda do estômato, os quais têm demonstrado que a fosforilação do
domínio autoinibitório localizado na região C-terminal da H+-ATPase tipo P, ativa a
enzima, o que parece ser desencadeado por pulsos de luz azul (Assmann, 1985;
Kinoshita e Shimazaki, 1999; 2001; 2002). Em contraste, algumas linhas de
evidências indicam que a desfosforilação ativa a H+-ATPase de membrana
plasmática e que a fosforilação inibe a atividade. Desfosforilação induzida por
patógenos fúngicos da H+-ATPase in vivo em cultura de células de tomate (Xing et
al., 1996) e a desfosforilação mediada por fosfatase alcalina da H+-ATPase in vitro
em células de tabaco (Desbrosses et al., 1998) resultam em um aumento na
atividade da H+-ATPase. Essa controvérsia parece ser devido a diferenças no sítio e
resíduo de fosforilação na H+-ATPase; tipos celulares diferentes podem apresentar
mecanismos de ativação e inibição diferenciados.
A observação de que a H+-ATPase de membrana plasmática de plantas
contém uma região C-terminal autoinibitória implica em vários caminhos possíveis de
regulação da enzima. A proteólise pode simplesmente remover a região inibidora. A
introdução de carga negativa pela fosforilação mediada por uma proteína quinase ou
uma modificação nos lipídios do ambiente por lisofosfolipídios pode resultar em
mudanças conformacionais do domínio inibitório da H+-ATPase tipo P, resultando em
ativação da bomba (Palmgren et al., 1991).
Tem sido mostrado também, o envolvimento da V-ATPase em resposta a
sinalização por luz azul em coleóptilos estiolados (Klychnikov et al., 2007). Nesse
estudo, foi demonstrado que a parte hidrolítica da V-ATPase, V1, interage com a
proteína regulatória 14-3-3, sendo necessário para essa interação a fosforilação da
ATPase por uma quinase, assim como ocorre para a P-ATPase, no processo de
sinalização para abertura dos estômatos (Kinoshita e Shimazaki; 2001; 2002;
Kinoshita et al., 2003).
Os genes da subunidade c da H+-ATPase vacuolar de plântulas crescidas na
luz e crescidas no escuro mostraram grandes diferenças na expressão. Esses genes
da subunidade c são diferencialmente regulados por luz ou escuro em uma forma
específica para o órgão ou tecido que provavelmente depende de receptores de luz
específico da célula e vias de sinalização que são acopladas ao crescimento celular
(Padmanaban et al., 2004).
81
Pelos trabalhos descritos podemos observar que existem mudanças de
expressão de genes de ATPases via estímulo dos tecidos por luz vermelha e azul
(Assmann, 1985; Kinoshita e Shimazaki, 1999; 2001; 2002; Padmanaban et al.,
2004; Klychnikov et al., 2007), entretanto, o aumento na atividade da H+-ATPase
vacuolar em decorrência da luz branca in vitro, isto é, quando esta é aplicada
diretamente nas vesículas isoladas, reflete respostas a mudanças conformacionais
da própria enzima e/ou do microambiente que a circunda.
Os mecanismos de transdução de sinais para essa resposta são ainda pouco
conhecidos, mas, algumas hipóteses podem ser discutidas. O aumento pela luz na
atividade das bombas de prótons leva a mudanças nos parâmetros fisiológicos
celulares, tais como, potencial de membrana ou pH local, que ocorrem quase que
instantaneamente após o estímulo físico atingir a célula. As bombas de prótons do
tonoplasto e da plasmalema estariam atuando como sistemas primários para o
desencadeamento do processo de transdução de sinais na célula vegetal.
A atividade da H+-PPase, ao contrário da H+-ATPase tipo V e tipo P, não foi
estimulada pela luz (Tabela 1). Este resultado sugere papéis fisiológicos distintos
para as duas enzimas no tonoplasto e evidencia que as mudanças de atividade da
V-ATPase não correspondem a simples artefatos provocados pelo tratamento
imposto as vesículas, uma vez que a H+-PPase do tonoplasto foi relativamente
insensível ao estímulo.
Avaliou-se também a atividade da V-ATPase em reposta a quantidades
crescentes de luz (Figura 2). Os dados mostram que houve aumento de atividade
até 400 µmol m-2 s-1 e em 2000 µmol m-2 s-1. Isso mostra que grandes quantidades
de luz não favorecem ao aumento da atividade da V-ATPase. Possivelmente, a
ativação estaria ligada apenas a um efeito de liga/desliga (ausência/presença de
luz).
82
0
20
40
60
80
100
120
140
0 20 60 100 400 600 800 1100 1500 2000
Fluxo de fótons fotossintéticos (µmol m-2 s-1)
A E
(µm
ol P
i mg-1
30
min
-1)
Figura 2. Hidrólise de ATP in vitro por vesículas de tonoplasto de hipocótilos
estiolados. Foram aplicadas diferentes quantidades crescentes de luz branca. Os
valores representam média de três repetições.
Ao aplicar o tratamento de luz diretamente no hipocótilo (in vivo), observou-se
uma inibição da H+-ATPase tipo V e tipo P comparado ao escuro (Figura 3 e 5),
sendo que a inibição foi mais forte na V-ATPase (Figura 3). A PPase não exibiu
diferença entre o controle e o tratamento (Figura 4).
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Escuro
Luz branca
A.E
. ( µ
mol
P i m
g -1 )
Figura 3. Hidrólise de ATP in vivo por vesículas de tonoplasto de hipocótilos
estiolados (controle) e hipocótilos submetidos à 14hs de luz branca (tratamento).
83
A.E
. ( µ
mol
P i m
g -1 )
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Escuro
Luz branca
Figura 4. Hidrólise de PPi in vivo por vesículas de tonoplasto de hipocótilos
estiolados (controle) e hipocótilos submetidos à 14hs de luz branca (tratamento).
A.E
. ( µ
mol
P i m
g -1 )
0
200
400
600
800
1000
1200
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Escuro
Luz branca
Figura 5. Hidrólise de ATP por vesículas de membrana plasmática de hipocótilos
estiolados (controle) e hipocótilos submetidos à 14hs de luz branca (tratamento).
É possível que a luz esteja afetando os lipídios da membrana onde estão
inseridas as bombas de prótons, causando uma redução na atividade da P-ATPase
isolada de hipocótilos submetidos a 14 horas de luz branca. Memon e Boss (1990),
ao avaliarem o efeito de curto tempo de radiação luminosa em hipocótilos de
girassol, evidenciaram que a luz causou uma redução da atividade quinase do
fosfatidilinositol monofosfato (PIP), reduzindo, conseqüentemente, as quantidades
de fosfatidilinositol bisfosfato (PIP2). No mesmo trabalho, foi demonstrado que a
84
adição de PIP ou PIP2 em membranas isoladas aumentou a atividade da bomba.
Talvez o PIP2 possa agir diretamente na enzima, associando-se a ela e ativando-a.
Embora a presente pesquisa não tenha sido avaliada nessa instância, os resultados
de Memon e Boss (1990) dão suporte aos presentes dados (Figura 5).
Uma redução no transporte de prótons pela ATPase tipo P também foi
observada (Figura 8), o que pode ter sido causado por uma modificação pela luz na
região responsável pelo acoplamento entre os domínios de transporte de H+ e de
hidrólise de ATP, alterando a estequiometria de 1/1, ou seja, 1 H+ bombeado para 1
ATP hidrolisado. As H+-ATPases tipo V isoladas de hipocótilos que receberam luz
exibiram uma menor atividade hidrolítica quando comparadas ao controle (Figura 3),
isso mostra que a V-ATPase parece responder de forma diferenciada ao estímulo
luminoso fornecido in vitro e in vivo, uma vez que observou-se ativação da enzima
pela luz in vitro e inibição pela luz in vivo. Em contrapartida, um aumento no
bombeamento de prótons pela V-ATPase foi observado (Figura 6) o que talvez tenha
ocorrido por uma mudança conformacional da enzima pela luz, tornando-a mais
eficiente no transporte de H+, com menor gasto de ATP. A H+-PPase também não
respondeu ao estímulo luminoso in vivo (Figura 4), não mostrando diferença de
atividade entre controle e tratamento e, em compensação exibiu um aumento no
transporte de prótons quando os hipocótilos foram tratados com luz (Figura 7).
85
Figura 6. Transporte de prótons pela V-ATPase em vesículas de tonoplasto de
hipocótilos estiolados e hipocótilos estiolados submetidos a tratamento de 14hs de
luz branca, seguido pela queda da fluorescência de uma sonda sensível a diferenças
de pH nas membranas, ACMA.
Figura 7. Transporte de prótons pela V-PPase em vesículas de tonoplasto de
hipocótilos estiolados e hipocótilos estiolados submetidos a tratamento de 14hs de
luz branca, seguido pela queda da fluorescência de uma sonda sensível a diferenças
de pH nas membranas, ACMA.
0
20
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Tempo (seg)
Flu
ores
cênc
ia (
%)
hipocótilos estioladoshipocótilos submetidos a luz branca
Controle: V0 = 14,08 ∆Fmáx = 76,81 Tratam.: V0 = 22,24 ∆Fmáx = 75,00
0
20
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500
Tempo (seg)
Flu
ores
cênc
ia (
%)
hipocótilos estioladoshipocótilos submetidos a luz branca
Controle: V0 = 42,00 ∆Fmáx = 72,00 Tratam.: V0 = 64,71 ∆Fmáx = 78,74
86
Figura 8. Transporte de prótons pela P-ATPase em vesículas de membrana
plasmática de hipocótilos estiolados e hipocótilos estiolados submetidos a
tratamento de 14hs de luz branca, seguido pela queda da fluorescência de uma
sonda sensível a diferenças de pH nas membranas, ACMA.
As alterações na atividade das H+-ATPases em decorrência ao estímulo
luminoso imposto sobre as membranas isoladas, nos permitem sugerir que essas
mudanças estão relacionadas a modulações pós-transcripcionais, não podendo ser
atribuídas ou confundidas com respostas secundárias oriundas da regulação da
expressão gênica, já relatadas na literatura. Acredita-se que as H+-ATPases estejam
no topo da sinalização para esse estímulo, onde as oscilações do pH e do Ca2+
intracelular, amplificariam o sinal, atuando como mensageiros secundários.
0
20
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Tempo (seg)
Flu
ores
cênc
ia (
%)
hipocótilos estioladoshipocótilos submetidos a luz branca
Controle: V0 = 27,77 ∆Fmáx = 47,29 Tratam.: V0 = 20,60 ∆Fmáx = 43,23
87
4.2.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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91
4.3. ATIVIDADE DAS H +-ATPases DO TONOPLASTO E DA PLASMALEMA
EM RESPOSTA A ESTIMULAÇÃO MECÂNICA DE MAMOEIROS
(Carica papaya L.)
92
4.3.1 RESUMO
As bombas de prótons do tonoplasto e da plasmalema são essenciais para os
eventos de absorção de nutrientes e exclusão de íons tóxicos da célula das plantas.
Variações no crescimento celular sejam elas, reguladas por sinais internos ou
externos, podem ter forte associação com alterações observadas no funcionamento
dessas bombas eletrogênicas. Neste trabalho, foi investigada a modulação das
bombas de H+ do tonoplasto e da plasmalema em caules de mudas de mamoeiro do
cultivar “Golden” (Carica papaya L.) submetidas à perturbação mecânica, usando
para isso a técnica do “brushing”. Foram também investigados cortes estruturais do
caule, provendo um melhor entendimento dos papéis reguladores dessas enzimas
no desenvolvimento das plantas. As sementes foram semeadas em tubetes com
capacidade de 53 cm3, contendo como substrato o ‘Plantmax-hortaliças’ + osmocot®
NPK 14-14-14 (660g / 20kg). Os tratamentos de estímulo mecânico corresponderam
a 0, 20 e 40 passadas, com início aos 7 dias após a germinação das sementes, pela
manhã, por 1 dia. Após um dia da indução ao estímulo mecânico, as vesículas de
tonoplasto e plasmalema foram isoladas do caule por meio de centrifugação
diferencial. As atividades das bombas eletrogênicas foram determinadas
colorimetricamente e o transporte de prótons medido em espectrofluorímetro. As
atividades H+-ATPásicas em vesículas do tonoplasto e plasmalema isoladas de
mamoeiros submetidos a 20 EM (estímulos mecânicos) apresentaram um maior
estimulo, quando comparado ao controle; quando dobrou-se o estímulo (40 EM),
observou-se inibição da atividade dessas enzimas. A atividade de hidrólise de ATP
azida sensível pela ATPase do mitocôndrio mostrou redução tanto para 20 EM
quanto para 40 EM. Em relação à velocidade inicial (Vo) e a amplitude máxima
(∆Fmáx) do transporte de prótons, observou-se que houve um aumento do transporte
93
de H+ dependente de ATP na ATPase do tonoplasto e da plasmalema em 20 EM e
uma redução no transporte de H+ dependente de ATP quando aumentou-se o
estímulo para 40 EM.
94
4.3.2 ABSTRACT
The proton pumps of the tonoplast and of the plasmalemma are essential for events
of nutrient absorption and exclusion of toxic ions of the plant cell. Variations in the
cellular growth, regulated by either internal or external signals, can be strongly
associated with changes observed in the functioning of these eletrogenic pumps. In
this work, the modulation of the tonoplast and plasmalemma H+ pumps by
mechanical conditioning was investigated in plants of Carica papaya L. (cv. “Golden”)
using for this the technique of “brushing”. It was also investigated the structure by
microscopy. The seeds were sowed in tubetes with capacity of 53 cm3, containing as
substratum the Plantmax-vegetables + osmocot 14-14-14 (660 g/ 20 kg). The
treatments of mechanical conditioning of 0, 20, and 40 times, they start at 07 days
after the germination of the seeds, daily in the period of the morning, for a period of 1
day. After one day of the induction to the mechanical stimulation (MS), the
tonoplast and plasmalemma vesicles were isolated using differential centrifugation.
The activities of the eletrogenic pumps were determined colorimetrically and the H+
transport measured in fluorimeter. The H+-ATPase activities in tonoplast and
plasmalemma vesicles isolated from papaya plants with 20 MS were stimulated when
compared to the control. In 40 MS the inhibition of the activity of these enzymes was
observed. The hydrolysis activity in ATPase mitochondrial, showed reduction both in
20 MS with as for 40 MS. In relation to the initial rate (Vo) and maximal amplitude
(∆Fmáx) of the proton transport, it was observed an increase of the ATP-dependent
H+-transport related to the tonoplast and plasmalemma in 20 MS and a reduction in
the activity of transport in the 40 MS.
95
4.3.3 INTRODUÇÃO
A habilidade das plantas para perceber e reagir a estímulos mecânicos é
crucial para seu crescimento e sua sobrevivência. As plantas podem perceber o
peso mecânico gerado pelo vento, pela neve, o gelo, o impacto das gotas da chuva,
do granizo, o peso dos frutos, o toque, o som e outros organismos (insetos e
pássaros), os quais induzem uma variedade de respostas fisiológicas em diferentes
órgãos e tecidos (Telewski, 1995; 2006). As células por si podem perceber a
gravidade, a tensão causada pelo próprio peso, o estado de hidratação (pressão de
turgor) e o crescimento interno (Telewski, 2006).
As respostas tigmomorfogênicas pelo qual as plantas reagem ao peso
mecânico envolvem uma série de eventos. Estudos fisiológicos e moleculares têm
mostrado que a perturbação mecânica causa inicialmente uma transdução do
estímulo mecânico em um sinal biológico, finalizando com uma resposta global como
a modificação do crescimento, alterando a morfologia, a anatomia e as propriedades
biomecânicas (Trewavas e Knight, 1994). Isso usualmente resulta em uma redução
no alongamento do caule e uma estimulação do crescimento radial (Garner e
Björkman, 1996; Latimer, 1998; Björkman, 1999). Essas modificações induzidas pela
perturbação mecânica são relevantes por tornar as plantas mais endurecidas e
resistentes às condições ambientais diversas, tornando-as mais resistentes a
estresses futuros (Jaffe et al., 1984; Telewski e Jaffe, 1986b; Biddington, 1986).
Provavelmente todas as plantas sentem e respondem às forças mecânicas. A
relativa contribuição dos diferentes tecidos da planta para a mecanosensibilidade e a
maneira como a sensibilidade local é integrada na planta para produzir a resposta de
crescimento ainda não está claro (Coutand et al., 2000). Tem sido gradualmente
reconhecido que a percepção e resposta a estímulos mecânicos exógenos estão
96
comumente ocorrendo ao nível celular e subcelular. As bases mecanísticas da
percepção ao toque e da sinalização inter e intracelular ainda não são bem
entendidas. Não está claro se as respostas amplamente diversas estão relacionadas
ao nível de percepção ou resposta, ou se os mecanismos e a maquinaria usada por
células únicas para responder as perturbações mecânicas tal como, flutuações no
turgor, estão relacionadas aquelas usadas pelo órgão ou tecido para reagir a forças
mecânicas externamente aplicadas (Telewski, 2006).
A percepção de um sinal mecânico pelas células parece envolver a parede
celular, a membrana plasmática e o citoesqueleto, formando uma rede
mecanosensora (Jaffe et al., 2002). Fasano et al. (2002) propuseram alguns
modelos para explicar como uma força mecânica pode ser traduzida em um sinal
bioquímico. Um desses modelos para a mecanopercepção se dá pela ligação do
citoesqueleto (através de ligantes) à membrana plasmática, a endomembranas,
transmitindo e amplificando a força ao citoplasma (Jaffe et al., 2002; Fasano et al.,
2002). A primeira resposta detectável para um sinal mecânico é uma mudança nos
potenciais de ação e na resistência elétrica, o qual ocorre dentro de segundos após
a perturbação (Jaffe, 1976). A perturbação mecânica levaria a ativação de canais e
bombas de prótons localizados na membrana plasmática e em endomembranas, os
quais atuariam como uma resposta secundária à perturbação em um regulador
global tal como pH citosólico ou potencial de membrana. A ativação da H+-ATPase
da membrana plasmática pode resultar em hiperpolarização da membrana e alterar
o pH citosólico e apoplástico (Fasano et al., 2002).
As bombas de prótons das membranas vacuolar e plasmática exercem um
papel fundamental no controle do pH citoplasmático e na manutenção da
homeostase celular, bem como no transporte de moléculas e íons e no crescimento
celular (Taiz e Zeiger, 1998). Devido à essencialidade dessas bombas eletrogênicas
para os eventos de absorção de moléculas e íons, quaisquer variações detectadas
no crescimento celular reguladas por estímulos mecânicos, podem ter forte
associação com alterações no funcionamento dessas bombas (Serrano, 1989;
1990). Apesar disso, pouco se conhece sobre os efeitos da estimulação mecânica
sobre a atividade destes sistemas, principalmente das bombas de H+ do tonoplasto.
Alguns trabalhos mostram que a estimulação mecânica de internós jovens de
Bryonia dióica inicialmente reduziu a atividade da H+-ATPase da membrana
plasmática e posteriormente promoveu uma estimulação da enzima, o que mostra
97
que a H+-ATPase de membrana plasmática desempenha um papel chave na
transdução de sinal por sua contribuição no desequilíbrio iônico com cessação da
atividade e por sua subseqüente participação direta na restauração dos balanços
iônicos (Bourgeade e Boyer, 1994). Com isto, o objetivo desse estudo foi avaliar o
efeito da perturbação mecânica, usando para isso a técnica do “brushing”, na
atividade de hidrólise e de transporte de H+ das enzimas H+-ATPase e H+-PPase do
tonoplasto e da H+-ATPase da plasmalema isoladas de caules de mamoeiros. Foram
também analisados cortes estruturais do caule, provendo um melhor entendimento
dos papéis reguladores dessas enzimas no desenvolvimento das plantas.
98
4.3.4 MATERIAL E MÉTODOS
4.3.4.1 Material vegetal
Nessa pesquisa foram utilizadas sementes do genótipo de mamão (Carica
papaya L.), do grupo ‘Solo’ (cv. Golden) extraídas de frutos fornecidos pela Empresa
Caliman Agrícola S/A, localizada no município de Linhares - ES.
4.3.4.2 Condições de crescimento
As sementes foram semeadas em tubetes de modelo cônico com capacidade
de 53cm3, tendo como substrato o “Plantimax-hortaliças” + osmocot® NPK 14-14-14
NPK (660g /20kg).
As bandejas de tubetes foram mantidas em casa de vegetação, sobre
bancadas, a 90 cm de altura da superfície do solo, sendo realizadas regas diárias,
controladas por meio de micro-aspersores. Aos cinco dias após a germinação das
sementes, foi realizado um desbaste mantendo-se apenas a muda mais vigorosa.
4.3.4.3 Tratamento mecânico
O tratamento de estimulação mecânica (“brushing”), o qual consiste em uma
estimulação física ou estresse aplicado às plantas com o auxílio de um anteparo
ligeiramente abrasivo, foi realizado sete dias após o desbaste. Foi utilizado como
anteparo, uma folha de isopor com as seguintes dimensões: 3cm de espessura x
20cm de largura x 30cm de comprimento. As plantas foram submetidas ao impacto
de 0, 20 e 40 vezes com o auxílio do isopor que foi passado ao longo da fileira das
99
bandejas no sentido ida e volta. As plantas foram submetidas a estimulação
mecânica por um dia, no período da manhã (8:00 - 9:00 horas).
4.3.4.4 Preparação da fração microssomal
As frações microssomais contendo vesículas de membrana plasmática e de
tonoplasto foram isoladas do caule de mamoeiros (Carica papaya L.), do grupo ‘Solo’
(cv. Golden), através de centrifugação diferencial, como descrito por Giannini e
Briskin (1987), com algumas modificações.
Após um dia da indução ao estímulo mecânico, as folhas e as raízes das
plantas de mamoeiro foram removidas com uma tesoura. Após serem pesados, os
caules dos mamoeiros foram homogeneizados, usando-se gral e pistilo em meio
tamponado, gelado, sendo o volume de tampão proporcional à quantidade de
matéria fresca, na proporção de 1:2. O tampão de extração foi composto de 250 mM
sacarose, 10% glicerol, 100mM Tris-base, 5mM EDTA, 5mM DTT, 1mM PMSF, 0,4%
PVP-40T, 0,3% BSA, 100mM KCl e 10mM glicerol-P. O homogenato foi filtrado em
duas camadas de gaze e, em seguida, o extrato foi centrifugado a 3.000×g por 10
minutos a 4°C para a remoção de células não rompida s, núcleos e mitocôndrios, que
foram depositados no “pellet”. O sobrenadante foi, então, centrifugado em
ultracentrífuga (modelo CP 75 β, HITACHI, Japan) a 100.000×g por 30 minutos a
4°C. O precipitado dessa segunda centrifugação, o q ual se constitui na fração
microssomal, foi ressuspendido em solução tampão contendo: 15% glicerol, 70mM
Tris-HCl (pH 7,6), 1mM EDTA, 1mM DTT e 1mM PMSF. A fração microssomal foi
então congelada em nitrogênio líquido e armazenada a –70°C até o uso.
4.3.4.5 Determinação de proteínas
As dosagens das proteínas foram realizadas segundo o método descrito por
Bradford (1976).
4.3.4.6 Determinação da atividade ATPásica do tonop lasto e da plasmalema
As atividades ATPásicas foram determinadas colorimetricamente, consistindo
na determinação do Pi liberado durante a hidrólise do ATP, segundo o método
100
descrito por Fiske e Subbarrow (1925), com modificações propostas por Façanha e
de Meis (1998).
As reações foram iniciadas com a adição da proteína e finalizadas através da
adição de ácido tricloroacético (gelado) para uma concentração final de 20% (p/V),
sendo os tubos colocados imediatamente no gelo. O material das reações foi
colorido com a mistura de uma solução de 0,5% molibdato de amônio mais 2% ácido
sulfúrico com uma solução de 10% ácido ascórbico, na proporção de 10:1, a qual foi
preparada na hora do uso. Passado 20 minutos fez-se a leitura em
espectrofotômetro (modelo 6405 UV-Vis, JENWAY, England) com comprimento de
onda de 750 nm, obtendo-se a densidade ótica. Quanto maior a atividade hidrolítica
das bombas, maior a liberação de Pi e, conseqüentemente, mais azulada a
coloração do material. Foram utilizados inibidores específicos das enzimas para
diferenciá-las. O meio reacional foi composto de 50 mM Tris-HCl (pH 7,0) –
tonoplasto ou 50 mM HEPES-KOH (pH 6,5) – membrana plasmática, 100 mM KCl, 5
mM MgSO4, 0,2 mM Na2MoO4, 0,2 mM H2VO4-, 1mM de ATP e, ainda, 30 µg de
proteína/mL e H2O.
4.3.4.7 Monitoramento do gradiente de prótons
O gradiente de prótons foi medido como descrito por Michelis e Spanswick
(1986), com algumas modificações propostas por Façanha e de Meis (1998),
monitorando a taxa de decréscimo da fluorescência (∆F/min) da sonda fluorescente
metacromática, 9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina (ACMA), excitada com um feixe de
comprimento de onda de 415 nm e a emissão captada a 485 nm, utilizando-se um
espectrofluorímetro (modelo F 4500, HITACHI, Japan).
O ACMA contém um grupo amina que funciona como uma base fraca,
pressupondo que não protonado tem a capacidade de atravessar livremente a
bicamada lipídica das membranas. A protonação da base do grupo amina limita essa
capacidade de movimento transmembranar e, assim, a sonda distribui-se através da
membrana conforme a diferença de pH entre o interior e o exterior das vesículas. O
meio reacional foi composto de 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) – tonoplasto ou 10 mM
HEPES-KOH (pH 6,5) – membrana plasmática, 100 mM KCl, 5 mM MgSO4, 250 mM
sacarose, 2 µM ACMA, 1 mM de ATP ou PPi e 30 µg de proteína/mL. Foram
utilizados inibidores específicos das enzimas para diferenciá-las. Após atingir o
101
equilíbrio entre efluxo e influxo de prótons, utilizou-se 20 µL de NH4Cl para dissipar o
gradiente formado. Essa dissipação ocorre devido à capacidade da amônia de
atravessar livremente a membrana, passando a forma NH3+, a qual se liga aos
prótons localizados no interior das vesículas, e transporta-os para o exterior.
A partir dos dados obtidos da curva de variação de pH (∆pH) determinou-se a
velocidade inicial (V0) e a variação da fluorescência máxima (∆Fmáx), conforme
mostra a Figura 1.
F 0
F Máx.
F F
F eq
T
PPi
ATP
NH 4 Cl
Seg
Figura 1. Determinação do transporte de H+ para quantificação da velocidade inicial
de transporte de H+ (V0) e da amplitude máxima de transporte de H+ (Fmáx). A queda
da fluorescência do ACMA reflete o transporte de H+ para dentro das vesículas de
membranas.
4.3.4.8 Determinação da velocidade inicial (V 0) e da variação da fluorescência
máxima ( ∆∆∆∆Fmáx) do transporte de prótons
Os cálculos da velocidade inicial de formação do ∆pH (V0) e da variação da
fluorescência máxima (∆Fmáx.) foram realizados da seguinte forma:
102
V0 = [F0 / (Fmáx * T)] * 100, onde:
F0 = fluorescência dependente de V0 em um tempo T qualquer, determinada pela
extrapolação de uma reta tangente à maior inclinação inicial da curva para o eixo do
tempo;
Fmáx = fluorescência máxima;
T = tempo em minutos.
∆∆∆∆Fmáx = Feq / Fmáx * 100, onde:
Feq = fluorescência de equilíbrio, determinada como fluorescência que reflete o
equilíbrio entre o influxo e o efluxo de H+ nas vesículas, sendo calculada da seguinte
forma:
Feq = Fmáx – FF, onde:
Fmáx = fluorescência máxima;
FF = fluorescência final.
Com os gráficos obtidos no espectrofluorímetro, determinaram-se os
parâmetros definidos na Figura 1, com o auxílio de um esquadro e respeitando a
escala dada pelo espectrofluorímetro em relação à fluorescência e ao tempo.
4.3.4.9 Microscopia Ótica Convencional
Os caules dos mamoeiros submetidos aos tratamentos mecânicos foram
embebidos em solução aquosa de 5% de sacarose, para preservação da
osmolaridade. Foi então, realizado cortes a mão livre desses caules, com o auxílio
de uma base de isopor e uma gilete. Posteriormente, os cortes foram corados com
Safranina, observados e fotografados em um microscópio ótico Axioplan ZEISS
acoplado a um sistema digital de análise de imagem.
103
4.3.4.10 Microscopia Eletrônica de Varredura
As amostras foram fixadas por imersão em uma solução de glutaraldeído 2,5
% e paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1M a temperatura ambiente. Após três
lavagens em tampão fosfato 0,1M para remoção do glutaraldeído residual, as
amostras foram pós-fixadas em solução de tetróxido de ósmio (OsO4) 1% em
tampão fosfato 0,1M, por 2 horas, no escuro e em temperatura ambiente.
Posteriormente, as amostras foram lavadas por três vezes em tampão fosfato 0,1M e
desidratadas em série acetônica crescente (30, 50, 70, 90, 100%).
Em seguida, as amostras selecionadas foram tratadas com a técnica de
secagem pelo ponto crítico do dióxido de carbono em um aparelho Critical Point
Drying Apparatus (Mod CPD 030, Bal-tec), e após secagem, foram metalizadas
utilizando o Automatic Sputter Coater SCD 050, Bal-tec. Finalizado este processo, as
amostras foram observadas em microscópio eletrônico de varredura DSEM 962
(Zeiss).
104
4.3.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Tabela 1 mostra a velocidade inicial do transporte de prótons das bombas
do tonoplasto e da plasmalema e a variação da fluorescência máxima quando o
gradiente foi dissipado.
Tabela 1. Velocidade inicial (V0) e amplitude máxima (∆Fmáx) do transporte de
prótons por membranas microssomais isoladas do caule de plantas de mamoeiros
controle e submetidas ao brushing por 20 vezes e 40 vezes (1 dia de tratamento).
Controle Tratamento 20 X Tratamento 40 X
V0 (%/min.) ∆∆∆∆F Max. (%) V0 (%/min.) ∆∆∆∆F Max. (%) V0 (%/min.) ∆∆∆∆FMax. (%)
V-ATPase 4,99 14,07 5,21 16,20 3,10 9,23
P-ATPase 12,99 50,69 15,66 52,05 9,46 46,5
As velocidades iniciais de formação do gradiente de H+, assim como os
valores da variação da fluorescência máxima deste são apresentadas em unidades
arbitrárias.
Nas Figuras 2 e 3 vemos o efeito do estímulo mecânico na atividade da
ATPase tipo P (vanadato sensível) em frações microssomais isoladas de mamoeiros
submetidos a 20 e 40 estímulos mecânicos. Podemos observar um aumento na
atividade da enzima da fração isolada das plantas estimuladas com brushing de 20
EM e uma redução na atividade da enzima de frações isoladas das plantas
estimuladas com brushing de 40 EM, quando comparado ao controle.
Podemos observar na Tabela 1 que houve um pequeno aumento no
transporte de prótons em frações microssomais isoladas de mamoeiros submetidos
ao brushing de 20 EM e uma pequena redução quando estimuladas com brushing
105
de 40 EM quando comparado ao controle, tanto para a V-ATPase quanto para a P-
ATPase. O estímulo mecânico mais brando brushing (20 EM) nas plantas de
mamoeiro não causou danos ao funcionamento dessas enzimas, ao contrário,
aparentemente esse estímulo tornou-as mais eficientes ao verificarmos que o
transporte de H+ ocorreu com menor gasto de ATP. Em contrapartida, após dobrar o
estímulo de brushing (40 EM), observou-se uma certa inibição da atividade de
transporte, indicando uma inibição destas enzimas. Esses resultados são
condizentes com os encontrados para a atividade de hidrólise de ATP, vanadato
sensível (um inibidor da ATPase de membrana plasmática) (Figuras 2 e 3) e
concanamicina sensível (um inibidor da ATPase do tonoplasto) (Figura 5), em
frações microssomais isoladas do caule de plantas de mamoeiro; onde podemos
observar que com brushing de 20 EM, houve um aumento de atividade em relação
ao controle e com 40 EM houve uma redução desta atividade.
R2 = 0,9867
R2 = 0,9965
R2 = 0,8516
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
A E
(um
ol P
i mg-1
ptn
)
Linear (Controle) Linear (20X) Linear (40X)
Figura 2. Hidrólise de ATP (vanadato sensível) pela P-ATPase em frações
microssomais de plantas de mamoeiro controle, submetidas a 20 e 40 passadas (ida
e volta) de tratamento por brushing.
Nas Figuras 2 e 3 vemos o efeito do estímulo mecânico na atividade da
ATPase tipo P (vanadato sensível) em frações microssomais isoladas de mamoeiros
submetidos a 20 e 40 estímulos mecânicos. Podemos observar um aumento na
atividade da enzima da fração isolada das plantas submetidas a tratamento com 20
estímulos mecânicos e uma redução na atividade da enzima de frações isoladas das
plantas submetidas a tratamento com 40 estímulos mecânicos, quando comparado
ao controle. Assim como os resultados encontrados nessa pesquisa, Bourgeade e
106
Boyer (1994) avaliando a estimulação mecânica de internós jovens de Bryonia dióica
observaram que, inicialmente, a atividade da H+-ATPase da membrana plasmática
sofreu uma redução, seguida por uma estimulação prolongada, mostrando que a H+-
ATPase de membrana plasmática desempenha um papel chave na transdução de
sinal por sua contribuição no desequilíbrio iônico com cessação da atividade e por
sua subseqüente participação direta na restauração dos balanços iônicos. A Figura 4
exibe a porcentagem de estímulo em relação ao controle, o qual foi de
aproximadamente 28%.
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
Controle 20X 40X
A E
(um
ol P
i mg-1
ptn
min
-1)
Figura 3. Hidrólise de ATP (vanadato sensível) pela P-ATPase em frações
microssomais de plantas de mamoeiro controle, submetidas a 20 e 40 passadas (ida
e volta) de tratamento por brushing.
107
28,66
-61,68-70,00
-60,00
-50,00
-40,00
-30,00
-20,00
-10,00
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
20X 40X%
estí
mul
o/in
ibiç
ão
Figura 4. Porcentagem de estímulo/inibição da hidrólise de ATP (vanadato sensível)
pela P-ATPase em frações microssomais de mudas de mamoeiro submetidas a 20 e
40 passadas (ida e volta) de tratamento por brushing em relação ao controle.
A percepção de um sinal mecânico pelas células é um processo rápido com
uma rápida transdução (Baluška et al., 2003) que parece envolver a parede celular,
a membrana plasmática e o citoesqueleto, formando uma rede mecanosensora
(Jaffe et al., 2002). Existem alguns modelos propostos para explicar como uma força
mecânica é traduzida em um sinal bioquímico (Fasano et al., 2002). Um desses
modelos propõe que o citoesqueleto transmite a força para proteínas de membrana
que alteram a “estabilidade” da célula, afetando indiretamente a atividade de canais
(Fasano et al., 2002). Fasano et al., (2002) especulam que a ativação da H+-ATPase
da membrana plasmática poderia resultar em hiperpolarização da membrana e
alteração do pH citosólico e apoplástico, levando a uma cascata de sinalização.
Assim, segundo esses autores, o pH citosólico e o potencial de membrana estariam
atuando como reguladores globais. Esse modelo proposto vai de encontro aos
nossos resultados, onde observamos um aumento na atividade das H+-ATPases
(Figuras 2 e 5) em decorrência ao estímulo mecânico imposto em plantas de
mamoeiro para o brushing de 20 EM.
40X
108
R2 = 0,8812
R2 = 0,9788
R2 = 0,9706
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0 10 20 30 40 50 60
Tempo (minuto)
A.E
.
(um
ol P
i mg-1
ptn
)
Polinômio (controle) Polinômio (20X) Polinômio (40X)
Figura 5. Hidrólise de ATP (concanamicina sensível) pela V-ATPase em frações
microssomais de mudas de mamoeiro controle, submetidas a 20 e 40 passadas (ida
e volta) de tratamento por brushing.
Então a mecanopercepção se dá pela ligação do citoesqueleto (através de
ligantes) à membrana plasmática, a endomembranas, transmitindo e amplificando o
estímulo recebido ao citoplasma (Jaffe et al., 2002; Fasano et al., 2002). Os canais
podem ser uma resposta secundária a uma perturbação mecânica em um regulador
global tal como pH citosólico ou potencial de membrana. A ativação da H+-ATPase
na membrana plasmática pode resultar em hiperpolarização da membrana e alterar
o pH citosólico e apoplástico.
O cálcio é talvez o mensageiro secundário iônico mais amplamente
reconhecido nas plantas, mas mudanças no pH citoplásmico são também
conhecidas por terem difundido efeitos regulatórios na função celular. Entretanto,
diferentemente do Ca2+, os prótons se difundem rapidamente dentro da célula. Em
função disso, sem alguma significante arquitetura citoplásmica para reduzir seu
movimento, os prótons são improváveis de regular mudanças localizadas nos
microdomínios celulares. Ao invez disso, mudanças no pH relacionadas ao sinal
podem servir como um sistema regulatório global para a célula. Assim como o Ca2+,
alteração no pH talvez seja um significante mensageiro secundário intracelular
agindo para gerar um redirecionamento global do conjunto de vias de transdução de
sinal operando na célula, provendo alusão para um possível mecanismo pelo qual
pH e Ca2+ relacionado a transdução de sinal ao toque possam interagir (Fasano et
al., 2002).
109
Apesar de Fasano et al. (2002) não terem estudado o comportamento das H+-
ATPases em função do estímulo mecânico, pelo aumento de atividade de hidrólise
de ATP e também de transporte de prótons observados em relação ao controle para
brushing de 20 EM em nossa pesquisa, podemos sugerir que essas bombas de
prótons estão envolvidas na resposta de sinalização ao estímulo mecânico,
participando na percepção/transdução destes sinais na célula vegetal, levando a
modulações no potencial de membrana e no pH interno e externo.
Em adição ao Ca2+ e pH, mudanças no potencial de membrana também tem
sido proposta como eventos na sinalização ao toque (Fasano et al., 2002).
Mudanças no potencial de membrana podem diretamente modular mudanças na
atividade de transporte da membrana por abrir canais acionados por tensão.
Entretanto, o potencial de membrana pode agir como um regulador global dos
componentes da membrana plasmática tal como o pH pode globalmente regular os
componentes citoplásmicos. Em adição, flutuações no potencial de membrana
parecem importantes para transmitir informação na forma de potenciais de ação,
auto-propagando ondas de despolarização induzida pela troca de íons através da
membrana (Fasano et al., 2002). Maiores estudos precisam ser realizados com o
intuito de evidenciar a caracterização do envolvimento de íons H+ em parceria com
íons Ca2+ como mensageiros celulares de estímulos mecânicos.
R2 = 0,9186
R2 = 0,9424
R2 = 0,8291
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30 40 50
Tempo (min)
AE
(um
ol P
i mg-1
ptn
)
Linear (controle) Linear (20X) Linear (40X)
Figura 6. Hidrólise de ATP (azida sensível) pela F-ATPase em frações mitocondriais
isoladas de mudas de mamoeiro controle, submetidas a 20 e 40 passadas (ida e
volta) de tratamento por brushing.
Em relação à atividade de hidrólise de ATP, azida sensível (um inibidor da
ATPase mitocondrial), em frações microssomais isoladas do caule de plantas de
110
mamoeiro; podemos observar que houve uma redução de atividade em relação ao
controle, tanto para o estímulo de 20 EM quanto para o estímulo de 40 EM (Figura
6), o que mostra que o estímulo mecânico pode ter causado danos ao
funcionamento dessas enzimas.
A Figura 7 mostra cortes transversais da região mediana do caule de
mamoeiros controle e submetidos ao brushing de 20 e 40 EM, observados em
microscópio ótico.
Figura 7. Microscopia ótica do caule de mamoeiros submetidos ao brushing. A -
controle, B - 20 passadas e C - 40 passadas. Aumento de 2,5X.
Podemos observar na Figura 7 um aumento no diâmetro do caule quando
esses foram submetidos ao estímulo mais brando (B) em relação ao controle (A) e
ao tratamento mais forte (C). O que pode ser devido a um aumento no número de
células e/ou a um aumento no tamanho das células do cilindro central e/ou também,
das células do parênquima cortical. Bem como a uma expansão/reestruturação dos
feixes vasculares.
A Figura 8 exibe cortes transversais da região mediana do caule de
mamoeiros controle e submetidos ao brushing de 20 e 40 EM, observados em
microscópio eletrônico de varredura (1A, 2A e 3A, respectivamente) e detalhe
exibindo as células do parênquima cortical (1B, 2B e 3B, respectivamente).
A B C
111
Figura 8. Microscopia eletrônica de varredura do caule de plantas de mamoeiro
submetidas ao brushing. 1A/1B – controle, 2A/2B - 20 estímulos mecânicos, 3A/3B -
40 estímulos mecânicos, 4 – longitudinal.
Foi observada uma melhor distribuição dos elementos de vaso do xilema,
associados a uma uniformidade de distribuição dos espessamentos de parede dos
mesmos elementos em função da maior estimulação mecânica, essas observações
estão de acordo com as propostas por Christensen-Dalsgaard et al. (2007), porém
esses autores propuseram uma descontinuidade do floema pelo estimulo mecânico,
que não foram observadas nesse estudo (Figuras 7 e 8).
112
4.3.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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115
4.4. EFEITO DO ULTRASOM NA ATIVIDADE DAS BOMBAS DE PRÓTONS
DO TONOPLASTO E DA PLASMALEMA DE CÉLULAS DE TABACO (Nicotiana
tabacum L.) EM SUSPENSÃO
116
4.4.1 RESUMO
O ultrasom é uma forma de energia mecânica que quando aplicado em baixas
intensidades pode induzir o crescimento em plantas. Variações no crescimento
celular sejam elas, reguladas por sinais internos ou externos, podem ter forte
associação com alterações observadas no funcionamento das bombas de prótons
do tonoplasto e da plasmalema, uma vez que essas bombas eletrogênicas são
essenciais para os eventos de absorção de nutrientes e exclusão de íons tóxicos
das células das plantas. Neste trabalho, foi investigado o efeito do ultrasom na
atividade das bombas de prótons do tonoplasto e da plasmalema em células de
tabaco (Nicotiana tabacum L.) em suspensão submetidas à sonicação. As culturas
de tabaco foram acondicionadas em meio MS e mantidas no escuro, sendo
repicadas a cada 15 dias. Os calos de tabaco foram então transferidos para frascos
Erlenmeyer contendo meio MS suplementado com hormônio 2,4D (2,4-ácido
diclorofenoxiacético). Após um período de 15 dias obteve-se o estabelecimento da
cultura em suspensão. Os frascos foram mantidos sob agitação constante com
rotação de 120 rpm, no escuro, a temperatura de aproximadamente 28°C. As células
foram estimuladas recebendo 6 pulsos de ondas ultrassônicas aplicadas com o
auxílio de uma sonda de um aparelho de ultrasom que forneceu intensidade de 2W
durante 5 minutos/pulso. Após um dia da indução ao estímulo ultrassônico, as
vesículas de tonoplasto e plasmalema foram isoladas das células por meio de
centrifugação diferencial. As atividades das bombas eletrogênicas foram
determinadas colorimetricamente. Uma parte das células (controle e tratamento) foi
fixada para posteriormente serem observadas em microscópio ótico, com o intuito de
determinar a integridade dessas células antes e após o tratamento. Verificou-se
também a expressão da V-ATPase através de eletroforese e “imunoblotting” de
117
proteínas, sendo a imunoresposta quantificada densitometricamente. A atividade H+-
ATPásica e H+-PPásica em vesículas do tonoplasto e a atividade H+-ATPásica em
vesículas da plasmalema isoladas de células sonicadas foram estimuladas em
relação ao controle. Em relação às imagens de microscopia, podemos observar uma
manutenção da integridade celular quando as células sofreram sonicação, o que
mostra que o estímulo não causou danos a essas células. No resultado relativo a
expressão da V-ATPase, observamos um aumento significativo de expressão dessa
enzima em relação ao controle, o que confirma nossos resultados de aumento de
atividade.
118
4.4.2 ABSTRACT
Ultrasound is a mechanical energy form that when has been applied in low intensities
can induce the plants growth. Variations in the cellular growth, regulated by either
internal or external signals, can be strongly associated with changes observed in the
functioning of the protons pumps of tonoplast and plasmalemma. These eletrogenic
pumps are essential for events of nutrient absorption and exclusion of toxic ions of
the plant cell. In this work, was investigated the effect of ultrasound in the activity of
protons pumps of the tonoplast and plasmalemma in tobacco cells (Nicotiana
tabacum L.) in suspension culture submitted the sonication. The tobacco cultures
cells were led in MS media and maintained in the darkness and passage culture
conducted each 15 days. The tobacco callus were then transferred to Erlenmeyer
flasks contend MS media, supplemented with hormone 2,4D (2,4-acid
diclorofenoxiacético). After 15 day period was obtained the culture suspension. The
flasks were maintained under constant agitation with rotation gives 120 rpm, in the
darkness, at 28°C temperature approximately. The ce lls were stimulated receiving 6
ultrasonic pulses applied with a probe. Ultrasound pulse measurement had intensity
of 2W for 5 minutes/pulse. After one day of the induction to the ultrasound, the
tonoplast and plasmalemma vesicles were isolated using differential centrifugation.
The activities of the eletrogenic pumps were determined colorimetrically. One faction
of cells (control and treatment) was fixed for posteriori observation in optical
microscopy, with aim of evaluates cell integrity, before and after the treatment. Were
verified the proteins expression of the V-ATPase through electrophoresis and
“imunoblotting”, techniques and immune response quantified densitometrical
methods. The H+-ATPase and H+-PPase activities in tonoplast vesicles and the H+-
ATPase activities in plasmalemma vesicles isolated from sonicated cells were
119
stimulated when compared to the control. The microscopy images reveal cellular
integrity of cells that had ultrasound stimulations. The stimulus did not cause
damages to these cells. Expression results from V-ATPase, showed a significant
increase itself expression in comparation from control cells, what confirms our results
for its activity increase.
120
4.4.3 INTRODUÇÃO
O ultrasom é uma forma de energia mecânica, vibracional, que pode ter ação
deletéria ou indutora do desenvolvimento em tecidos vivos, dependendo da
intensidade, do tempo de exposição, da freqüência de aplicação e da distância do
transdutor ao alvo (Hebling e da Silva, 1995). Recentemente, elevada atenção tem
sido dada aos efeitos benéficos e as potenciais aplicações do ultrasom,
particularmente o de baixa intensidade, em sistemas biológicos e processos
biotecnológicos. Apesar de muitos avanços terem sido alcançados no que diz
respeito à utilização do ultrasom na medicina, poucos estudos têm revelado os
efeitos do ultrasom nas células de plantas (Chen et al., 2008).
A irradiação ultrassônica pode causar estresse térmico e mecânico em
materiais biológicos. O estresse mecânico resulta de dois eventos hidrodinâmicos, a
cavitação acústica e a cavitação induzida por microcorrente. A cavitação acústica
consiste na formação de "microbolhas" que crescem até implodir, gerando pressão e
temperatura altas durante os estágios finais do colapso, podendo causar danos às
células ou macromoléculas circundantes (Joersbo e Brunstedt, 1992). O outro
fenômeno, a cavitação induzida por microcorrente, consiste em amplas e rápidas
oscilações no tamanho da bolha, o que causa um forte fluxo de líquidos no meio que
a circunda (microcorrente). Baixas velocidades dessa microcorrente resultam na
mistura do meio circundante, enquanto altas velocidades podem ocasionar danos às
células (Frizzell, 1988).
O ultrasom de baixa intensidade pode modificar o metabolismo celular, induzir
a inibição e a estimulação de atividades enzimáticas, o crescimento celular, a
biossíntese e a alteração das membranas celulares e de outras estruturas das
organelas celulares (Bochu et al., 1998; Liu et al., 2003a; 2003b; Liu et al., 2006;
121
Chen et al., 2008). Uma das consequências mais amplamente observadas do
ultrasom em células vivas é o aumento na permeabilidade ou na permeabilização da
membrana, aumentando a absorção de substâncias externas, tal como a absorção
de nutrientes e a liberação de produtos intracelular.
Os efeitos estimulantes do ultrasom nas reações biológicas e no crescimento
celular não são ainda bem entendidos, os quais podem ser atribuídos aos efeitos
mecânicos do ultrasom, tais como o aumento da transferência de massa e a
combinação nos sistemas de reação; ou ainda podem ser devido à estimulação de
enzimas ou da atividade metabólica celular. Entretanto, os efeitos benéficos do
ultrasom dependem de sua intensidade, do tempo de exposição e também das
condições fisiológicas dos tecidos das plantas (Bochu et al., 1998; Liu et al., 2003a;
2003b; Liu et al., 2006; Chen et al., 2008).
Já é bem conhecido que as H+-ATPases do tonoplasto e da plasmalema
desempenham papéis centrais na fisiologia e bioquímica da célula vegetal, mas
alguns poucos trabalhos tem sido realizados com o intuito de avaliar o
comportamento dessas enzimas em relação aos efeitos do som e do ultrasom na
célula vegetal, desvendando como essas forças mecânicas afetam a atividade
dessas enzimas (Bochu et al., 1998; Bochu et al., 2002; Zhao et al., 2002a;
Xiaocheng et al., 2003; Xiujuan et al., 2003; Liu et al., 2003a; 2003b; Liu et al., 2006;
Chen et al., 2008).
Alguns trabalhos têm mostrado que o som e o ultrasom afetam a atividade
das bombas de prótons. Tem sido mostrado um aumento de atividade da H+-ATPase
de membrana plasmática em calos de crisântemo, após serem submetidos a ondas
sonoras (Bochu et al., 2002), sendo essa atividade parcialmente reduzida quando
Ca2+ foi quelado, o que evidenciou o envolvimento do Ca2+, provavelmente
desempenhando um importante papel como mensageiro secundário na estimulação
sonora (Liu et al., 2001; Zhao et al., 2002a; Yi et al., 2003). Ao aplicar a estimulação
sonora em vesículas isoladas de crisântemo, a resposta foi contrária à observada
quando a estimulação foi dada in vivo, sugerindo que as mudanças na atividade das
H+-ATPases de membrana plasmática talvez sejam devido a uma série de reações
fisiológicas e bioquímicas (Zhao et al., 2002a). Para a V-ATPase, também tem sido
observado um aumento na atividade de transporte de prótons e na hidrólise de ATP
de células de babosa submetidas ao ultrasom de baixa intensidade (Liu et al.,
122
2003a). Em pesquisas mais recentes, Chen et al. (2008) também observaram um
aumento na atividade da ATPase de membrana plasmática.
Dado à essencialidade das bombas eletrogênicas para os eventos de
absorção de moléculas e íons, quaisquer variações detectadas no crescimento
celular, sejam elas reguladas por fitohormônios, sinais químicos, luz, ou estímulos
mecânicos podem ter forte associação com alterações no funcionamento dessas
bombas (Serrano, 1989; 1990). Apesar disso, pouco se conhece sobre os efeitos do
som e ultrasom sobre a atividade destes sistemas, principalmente das bombas de H+
do tonoplasto. Nesse estudo, objetivou-se avaliar o efeito do ultrasom sobre a
atividade das enzimas H+-ATPase e H+-PPase do tonoplasto e da H+-ATPase da
plasmalema.
123
4.4.4 MATERIAL E MÉTODOS
4.4.4.1 Material vegetal
Para este estudo foram utilizados calos de tabaco (Nicotiana tabacum L.),
linhagem By2, cedidos pela USP, mantidos e multiplicados em nosso laboratório.
4.4.4.2 Condições de crescimento
As culturas de tabaco foram acondicionadas em meio MS (Murashige e
Skoog, 1962) de indução de calos, contendo 3% de sacarose, previamente
distribuído em placas de Petri e mantidas no escuro (Figura 1A), sendo repicadas a
cada 15 dias em meio novo, retirando-se uma porção do estoque com auxílio de
uma espátula de metal estéril. Após as etapas anteriores de propagação, os calos
de tabaco foram transferidos para frascos Erlenmeyer com capacidade de 1000 mL
devidamente esterilizados, contendo 300 mL de meio MS suplementado com
hormônio 2,4D (2,4-ácido diclorofenoxiacético). Os frascos foram mantidos sob
agitação constante e no abrigo de luz. Após um período de 15 dias obteve-se o
estabelecimento da cultura em suspensão, quando a densidade celular foi apreciável
(Figura 1B). Foram realizados repiques periódicos a cada sete dias retirando
alíquotas de 30 mL com pipeta para propagação das culturas.
124
Figura 1: Aspecto de calos de tabaco (A) e células de tabaco em suspensão
(B).
4.4.4.3 Preparo do pré-inóculo para isolamento de m embranas
Foram inoculados 30 mL de inóculo da cultura líquida em 8 frascos
Erlenmeyers de 1000 mL contendo 300 mL de meio MS novo, previamente
distribuídos e autoclavados, onde foram mantidos no escuro, a temperatura de
aproximadamente 28°C, em shaker com rotação de 120 rpm durante 5 dias, visando
a obtenção de massa celular suficiente para o isolamento das enzimas.
4.4.4.4 Tratamento sonoro
As células em suspensão foram centrifugadas a 3.000×g, durante 10 minutos,
para separá-las do meio de cultura. Retirou-se então grande parte do meio de
cultura, deixando no tubo falcon apenas uma pequena lâmina de meio sobre as
células. As células foram estimuladas recebendo 6 pulsos de ondas ultrassônicas
aplicadas com o auxílio de uma sonda de um aparelho de ultrasom que forneceu
intensidade de 2W durante 5 minutos/pulso. A sonda foi posicionada no meio de
cultura restante no tubo falcon, sem entrar em contato direto com as células. O
material foi dividido em dois grupos, um foi o controle e o outro recebeu o tratamento
sônico. Todo esse procedimento foi realizado em capela de fluxo laminar
previamente limpa e desinfetada, utilizando-se material estéril. As células receberam
então novo meio de cultura e permaneceram nas mesmas condições de
crescimento. Passado um dia após o tratamento, foi realizado o isolamento da fração
microssomal.
125
4.4.4.5 Preparação da fração microssomal
As frações microssomais contendo vesículas de membrana plasmática e de
tonoplasto foram isoladas de células de tabaco (Nicotiana tabacum L.) através de
centrifugação diferencial, como descrito por Giannini e Briskin (1987), com algumas
modificações propostas.
Primeiramente, as células em suspensão foram centrifugadas a 3.000xg,
durante 10 minutos, para precipitá-las, separando-as do meio de cultura, o qual foi
descartado. Após a retirada do meio, as células foram pesadas e incubadas com
uma pectinase [Polygalacturonase solution from aspergillus niger, poly-(1,4-α-D-
galacturonide) glycanohydrolase], durante 40 minutos, para facilitar o processo de
rompimento da parede celular, em temperatura ambiente. Após esse período,
acrescentou-se o tampão de extração gelado, composto de 250 mM sacarose, 10%
glicerol, 100mM Tris-base, 5mM EDTA, 5mM DTT, 1mM PMSF, 0,4% PVP-40T,
0,3% BSA, 100mM KCl e 10mM glicerol-P, sendo o volume de tampão utilizado
proporcional à quantidade de matéria fresca, na proporção de 1:1. Aplicou-se então,
6 pulsos curtos do tipo liga/desliga com um “mixer” (Turratec TE 102-TECNAL) no
tubo falcon contendo as células e o meio de extração, no gelo, para o rompimento e
homogeneização das mesmas. O homogenato foi centrifugado a 3.000×g por 10
minutos a 4°C para a remoção de células não rompida s, núcleos e mitocôndrios, que
foram depositados no “pellet”. O sobrenadante foi, então, centrifugado em
ultracentrífuga (modelo CP 75 β, HITACHI, Japan) a 100.000×g por 30 minutos a
4°C. O precipitado dessa segunda centrifugação foi ressuspendido em solução
tampão contendo: 15% glicerol, 70mM Tris-HCl (pH 7,6), 1mM EDTA, 1mM DTT e
1mM PMSF. A fração microssomal foi então congelada em nitrogênio líquido e
armazenada a –70°C até o uso.
4.4.4.6 Determinação de proteínas
As dosagens das proteínas foram realizadas segundo o método descrito por
Bradford (1976).
126
4.4.4.7 Determinação da atividade ATPásica do tonop lasto e da
plasmalema e da atividade PPásica do tonoplasto
As atividades ATPásica e PPásica foram determinadas colorimetricamente,
consistindo na determinação do Pi liberado durante a hidrólise do ATP e do PPi,
respectivamente, segundo o método descrito por Fiske e Subbarrow (1925), com
modificações propostas por Façanha e de Meis (1998).
As reações foram iniciadas com a adição da proteína e finalizadas através da
adição de ácido tricloroacético (gelado) para uma concentração final de 20% (p/V),
sendo os tubos colocados imediatamente no gelo. O material das reações foi
colorido com a mistura de uma solução de 0,5% molibdato de amônio mais 2% ácido
sulfúrico com uma solução de 10% ácido ascórbico, na proporção de 10:1, a qual foi
preparada na hora do uso. Passado 20 minutos fez-se a leitura em
espectrofotômetro (modelo 6405 UV-Vis, JENWAY, England) com comprimento de
onda de 750 nm, obtendo-se a densidade ótica. Quanto maior a atividade hidrolítica
das bombas, maior a liberação de Pi e, conseqüentemente, mais azulada a
coloração do material. Foram utilizados inibidores específicos das enzimas para
diferenciá-las. O meio reacional foi composto de 50 mM Tris-HCl (pH 7,0) –
tonoplasto ou 50 mM HEPES-KOH (pH 6,5) – membrana plasmática, 100 mM KCl, 5
mM MgSO4, 0,2 mM Na2MoO4, 0,2 mM H2VO4- e 1mM de ATP para as reações de
atividade da H+-ATPase, e 1 mM de PPi para as reações de atividade da PPase e,
ainda, 30 µg de proteína/mL e H2O.
4.4.4.8 Microscopia Ótica Convencional
As células foram fixadas em solução de glutaraldeído 2,5 % em tampão
fosfato por 24 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, foram coradas com
Azul de toluidina, observadas e fotografadas em um microscópio ótico Axioplan
ZEISS acoplado a um sistema digital de análise de imagem.
4.4.4.9 Eletroforese e “imunoblotting” de proteínas
As análises de SDS-PAGE e “western blotting” foram realizadas como
descrito em Sambrook et al. (2001) com modificações para avaliação do
comportamento da V-ATPase nas amostras controle e tratadas com ultrasom. As
127
amostras foram aquecidas com β-mercaptoetanol 5% a 100 ºC durante dois minutos
e após terem sido resfriadas, foram aplicadas em SDS-PAGE constituído de gel de
separação (Tris-HCl 187,5 mM pH 8,7, SDS 0,1%, acrilamida 10%, persulfato de
amônio 0,08%, TEMED 0,17%) e gel de concentração (Tris-HCl 125 mM pH 6,8,
SDS 0,1%, acrilamida 3%, persulfato de amônio 0,08%, TEMED 0,17%). A
eletroforese foi realizada em tampão de corrida contendo Glicina 192 mM, Tris 25
mM e SDS 0,1% sob voltagem de 50-100 V. Após a eletroforese, o gel foi imerso em
tampão de transferência (glicina 182 mM, Tris 25 mM e metanol 20%) por 15
minutos para retirada do SDS. Em seguida, as proteínas separadas no gel foram
transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Amersham) no sistema semi-seco
utilizando para isso, uma célula comercial “trans-blot” semi-seco (Amersham
Pharmacia Biotec). Membranas de nitrocelulose cortadas nas mesmas dimensões
do gel foram imersas em tampão de transferência por aproximadamente 5 minutos.
Na célula de transferência, foi montado um sistema onde, para cada gel, foram
colocadas duas folhas de papel de filtro Whatman embebidas em tampão de
transferência. Sobre estas folhas foi colocada a membrana de nitrocelulose e em
seguida o gel e mais duas folhas de papel de filtro embebidas em tampão de
transferência, formando um “sanduíche”. Após este procedimento, a célula de
transferência foi fechada e a transferência de proteínas foi realizada sob uma
corrente contínua de 150 mA durante duas horas no sentido gel-membrana.
Após a transferência, a membrana de nitrocelulose foi corada com uma
solução de Ponceau S (0,1%) para verificação da qualidade da transferência. Em
seguida, a membrana foi descorada em solução PBS (NaCl 150 mM, NaH2PO4 9,1
mM e Na2HPO4 1,7 mM, pH 7,4).
A membrana descorada foi embebida em PBS contendo leite em pó
desnatado 5% durante uma hora a temperatura ambiente sob agitação contínua.
Após o bloqueio, a membrana de nitrocelulose foi imersa em PBS contendo leite em
pó 5% e anti-corpo primário contra subunidade A ou B da V-ATPase (diluição
1:1000), durante 16 horas a 4ºC. Passado este período, a membrana foi lavada em
PBS + leite por 4 vezes com intervalos de 15 minutos (total 1 hora) e após a
lavagem, a membrana foi incubada com anticorpo secundário conjugado com
peroxidase alcalina (anti IgG de coelho, diluição 1:2000) durante 1 hora sob
agitação. Após a incubação com anticorpo secundário a membrana foi novamente
128
lavada em PBS + leite por 4 vezes durante 60 minutos e em seguida lavada por 3
vezes em PBS.
A revelação da reação imunológica foi feita utilizando-se o kit Sigma Fast
(3,3'Diaminobenzidine-DAB peroxidase substrate) seguindo instruções do fabricante.
Após o surgimento das bandas, a membrana foi lavada em água destilada e seca
com o auxílio de papel de filtro. As bandas na membrana de nitrocelulose foram
quantificadas densitometricamente como descrito por Retamal et al. (1999).
129
4.4.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Figura 2 exibe a atividade de hidrólise de ATP pela P-ATPase em frações
microssomais isoladas de células de tabaco controle e submetidas a ondas
ultrassônicas. Houve aumento da hidrólise do ATP pela P-ATPase por efeito
ultrassônico.
R2 = 0,8855
R2 = 0,9788
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 10 20 30 40Tempo (min)
A E
(u
mol
Pi m
g-1 p
tn)
Linear (controle) Linear (ultrassom)
Figura 2. Hidrólise de ATP pela P-ATPase em frações microssomais isoladas de
células de tabaco controle e submetidas a ondas ultrassonicas.
Nas Figuras 3 e 4 podemos observar a atividade de hidrólise de ATP e PPi
pela V-ATPase e V-PPase, respectivamente, em frações microssomais isoladas de
células de tabaco controle e submetidas a ondas ultrassônicas. Ambas as enzimas
também mostram um aumento da atividade hidrolítica por efeito ultrassônico.
130
R2 = 0,8106
R2 = 0,9113
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 10 20 30 40
Tempo (min)
A E
(um
ol P
i mg-1
de
ptn)
Polinômio (controle) Polinômio (ultrassom)
Figura 3. Hidrólise de ATP pela V-ATPase em frações microssomais isoladas de
células de tabaco controle e submetidas a ondas ultrassonicas.
R2 = 0,8299
R2 = 0,911
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 10 20 30 40
Tempo (min)
A E
(um
ol P
i mg
-1 p
tn)
Polinômio (controle) Polinômio (ultrassom)
Figura 4. Hidrólise de PPi pela V-PPase em frações microssomais isoladas de
células de tabaco controle e submetidas a ondas ultrassonicas.
O ultrasom influenciou a atividade das H+-ATPases da plasmalema e do
tonoplasto (Figura 2 e 3, respectivamente) e também da H+-PPase do tonoplasto
(Figura 4) isoladas de células de tabaco. Os dados mostram que a atividade de
hidrólise de ATP e PPi aumentou em decorrência ao estímulo. Acredita-se que a
intensidade e o tempo de exposição não tenham causado danos às células, mas sim
uma alteração no metabolismo celular, levando a ativação das enzimas. Assim como
na presente pesquisa, tem sido observado um aumento na atividade de hidrólise e
de transporte de prótons para a V-ATPase em cultura de calos de babosa expostas
a ultrasom de baixa intensidade e um aumento no crescimento desses calos, o que
131
acredita-se ser decorrente do aumento na atividade de transporte de prótons dessa
enzima (Liu et al., 2003a). Tem sido demonstrado também um aumento de atividade
da Ca2+-ATPase de membrana plasmática em calos de babosa submetidos a
ultrasom de baixa intensidade. Parece que o aumento na atividade dessas enzimas
e a maior taxa de crescimento observados nessas pesquisas são decorrentes de
mudanças na fluidez da membrana dessas células, o qual pode acelerar a absorção
de nutrientes (Liu et al., 2006).
Figura 5: Microscopia ótica de células de tabaco em suspensão controle (A e B) e
sonicadas (C e D) em aumento de 10X.
Na Figura 5 podemos observar células de tabaco controle e submetidas à
estimulação ultrassônica, em suspensão. Percebe-se um maior intumescimento nas
células de tabaco controle (Figuras 5, A e B) quando comparadas às células
sonicadas (Figuras 5, C e D). A sonicação pode ter afetado o balanço hídrico celular.
132
Figura 6: Microscopia ótica em células de tabaco controle e submetidas em
suspensão controle (A e B) e sonicadas (C e D) em aumento de 20X.
Na Figura 6 podemos observar células de tabaco controle e submetidas à
estimulação ultrassônica, em suspensão, em um maior aumento. Pode-se observar
com mais detalhe em maior aumento, um maior intumescimento nas células do
controle (Figura 6, A e B), quando comparadas às células sonicadas (Figura 6, C e
D).
Evidências têm mostrado que o ultrasom aumenta significativamente o
conteúdo de MDA, indicando aumento na peroxidação lipídica e também na
formação de espécies reativas de oxigênio. Por gerar mudanças nos ácidos graxos
insaturados que afetam a estrutura e as propriedades da membrana, esse aumento
na formação de radicais livres e na peroxidação lipídica sob irradiação ultrassônica
pode ter trazido um aumento na permeabilidade da membrana ou perda de
integridade de membrana (Chen et al., 2008). O aumento na permeabilidade da
membrana e a perda de integridade que podem ser gerados pelo ultrassom podem
estar acontecendo em nossa pesquisa (Figuras 5 e 6 – C e D), proporcionando
dessa forma perda de água pela célula e acúmulo de conteúdo celular.
40µµµµm 40µµµµm
40µµµµm
A
C
B
D
40µµµµm
133
Figura 7: “Imunoblotting” da V-ATPase em frações microssomais isoladas de células
de tabaco controle (1) e sonicadas (2). A imunoresposta foi quantificada
densitometricamente como descrito nos “Materiais e métodos”.
A Figura 7 exibe a expressão da V-ATPase por análise de “western blotting”
em frações microssomais isoladas de células de tabaco controle e submetidas a
ondas ultrassonicas (1 e 2, respectivamente). Esses resultados confirmam os dados
de atividade de hidrólise de ATP pela V-ATPase. Podemos observar o aumento na
expressão dessas enzimas em função do tratamento ultrassônico em relação ao
controle, esse aumento pela quantificação densitométrica foi aproximadamente de
474%.
As bombas de prótons do tonoplasto e da plasmalema se mostraram
sensíveis aos estímulos ultrassônicos, atuando para o desencadeamento do
processo de transdução de sinais ambientais na célula vegetal.
100%
1 2
474%
70 KDa
134
4.4.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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137
5. CONCLUSÕES
Estudos sobre a percepção das plantas a estímulos e estresses físicos vem
progredindo rapidamente, mas vários aspectos dos efeitos da estimulação das
plantas por esses fatores ambientais permanecem desconhecidos. Mesmo com esse
rápido avanço nas pesquisas, ainda estamos longe de elucidar os mecanismos de
percepção das plantas, principalmente no que tange a descrição das bases
bioquímicas e moleculares deste fenômeno. Todavia, várias evidências sugerem que
oscilações finamente controladas de fluxos iônicos, nas membranas biológicas,
representam eventos fundamentais aos processos de percepção e transdução de
sinais físicos provenientes do ambiente. Aqui apresentamos um conjunto de
evidências que fornecem suporte a tese de que as bombas de prótons das
membranas da célula vegetal sejam sistemas sensíveis e atuantes na sinalização
desencadeada por estímulos luminosos e mecânicos. A partir dos resultados
obtidos, especificamente as H+-ATPases da plasmalema e do tonoplasto emergem
como elementos ativos do sistema de percepção/transdução destes tipos de sinais
físicos. A estimulação ou a inibição da atividade destas enzimas em função de um
determinado estímulo ou estresse, quando este é imposto diretamente sobre as
membranas isoladas, reflete respostas a mudanças conformacionais da própria
enzima e/ou do microambiente que a circunda. Isto implica em modulações no
potencial de membrana e do pH interno e externo, que ocorrem quase que
instantaneamente após o estímulo físico atingir a célula. As bombas de prótons do
tonoplasto e da plasmalema se mostraram sensíveis a alguns desses estímulos,
atuando como sistemas primários não só para a transdução de energia, como são
usualmente reconhecidos, mas também para o desencadeamento do processo de
transdução de sinais ambientais na célula vegetal.
138
A relativa insensibilidade da H+-PPase do tonoplasto aos estímulos luminosos
que induziram respostas na V-ATPase presente na mesma membrana, nos permite
concluir que as mudanças de atividade da ATPase não correspondem a simples
artefatos provocados pelo tratamento imposto as vesículas.
Os eventos de transdução de sinais nas células vegetais têm sido descritos
em várias fases, se iniciando com a percepção do estímulo, que desencadearia a
ativação de canais iônicos e de outras proteínas transportadoras, gerando
oscilações do pH e do Ca2+ intracelular, as quais induziriam cascatas de
fosforilação/desfosforilação e por fim regulação da expressão gênica, culminando em
uma resposta fisiológica específica. Os dados relatados nesta tese colocam as H+-
ATPases no início deste processo ao demonstrar, pela primeira vez, mudanças de
atividade das bombas provocadas por estímulos luminosos impostos diretamente
sobre as membranas isoladas. Ou seja, os dados necessariamente estão
relacionados a modulações pós-transcripcionais das bombas e não podem ser
atribuídas ou confundidas com respostas secundárias oriundas de regulação da
expressão gênica, já relatadas na literatura. No caso dos estímulos mecânicos
(brushing e ultrasom) onde os estímulos foram feitos nas plantas ou células vivas,
não se pode falar somente na possibilidade de mudanças conformacionais. De fato,
o bloting da V-ATPase de células sob ultrasom demonstra uma clara regulação em
nível de expressão da enzima, mas ainda não existem evidencias fortes na literatura
que tais estímulos poderiam modular as bombas, quer seja via expressão e/ou
atividade.
Entretanto, o relacionamento inequívoco das oscilações do gradiente
eletroquímico gerado por tais modulações das H+-ATPases com as oscilações do pH
e do Ca2+ intra- e extracelular, necessitam a aplicação de outras técnicas capazes
de medir a atividade das bombas e o fluxo de íons em células vivas. Futuros estudos
eletrofisiológicos aplicando técnicas de patch clamp e sondas vibráteis 3D, e o uso
de sondas fluorescentes sensíveis a diferentes íons podem vir a desvendar as
variações nos potenciais de membrana, e seus reflexos sobre a modulação de
canais iônicos específicos. A caracterização do envolvimento de íons H+ como
mensageiros celulares de estímulos ambientais, tal qual já descrito para os íons
Ca2+, é uma possibilidade que surge da presente tese. A partir dos dados torna-se
possível especular que mudanças de ativação e/ou de localização das H+-ATPases
nas membranas, constituam a base de oscilações transientes espaço-temporais de
139
pH que consolidem estáveis assinaturas de prótons da célula vegetal, específicas
para cada tipo de estímulo ambiental. Para testar tal hipótese a utilização de
técnicas de microscopia óptica e eletrônica para a imunolocalização das H+-
ATPases; paralelamente com técnicas de biologia molecular, como PCR em tempo
real para a quantificação dos transcriptos serão muito úteis.
A ativação das bombas de H+ presentes nas membranas e endomembranas
das células vegetais, em respostas aos estímulos sonoros, luminosos e mecânicos,
identificam as H+-ATPases da plasmalema e do tonoplasto como marcadores
bioquímicos em potencial para prospecção da magnitude e qualidade de estímulos
mais efetivos à produção vegetal. Esses resultados consistem em dados
absolutamente originais e devem contribuir significativamente para a determinação
fisiológica mais precisa das condições de estresse, evitando condições ambientais
adversas em áreas agrícolas, maximizando condições que promovam a
produtividade.
140
6. BIBLIOGRAFIA GERAL
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