Fábio Luciano Verdi UFSCar, Campus Sorocaba Maurício Ferreira Magalhães FEEC, Unicamp
Tese de Doutorado de Hemerson Yuri Ferreira Magalhães€¦ · HEMERSON IURY FERREIRA MAGALHÃES...
Transcript of Tese de Doutorado de Hemerson Yuri Ferreira Magalhães€¦ · HEMERSON IURY FERREIRA MAGALHÃES...
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
HEMERSON IURY FERREIRA MAGALHÃES
PROPRIEDADES ANTICÂNCER DA FENSTATINA, 4-METOXIFENIL-3,4,5-
TRIMETOXIFENILMETANONA (RR07)
Fortaleza
2009
HEMERSON IURY FERREIRA MAGALHÃES
PROPRIEDADES ANTICÂNCER DA FENSTATINA, 4-METOXIFENIL-3,4,5-
TRIMETOXIFENILMETANONA (RR07)
Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Farmacologia.
Orientadora: Profª. Drª. Cláudia do Ó Pessoa
Fortaleza
2009
M165p Magalhães, Hemerson Iury Ferreira Propriedades anticâncer da fenstatina, 4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona (RR07) / Hemerson Iury Ferreira Magalhães. – Fortaleza, 2009. 184 f. : il. Orientadora: Profª. Drª. Cláudia do Ó Pessoa Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. 1. Estilbenos 2. Tubulina 4. Citotoxicidade 5. Antineoplásicos. I. Pessoa, Claudia do Ó (orient.) II. Título. CDD 615.31
HEMERSON IURY FERREIRA MAGALHÃES
PROPRIEDADES ANTICÂNCER DA FENSTATINA, 4-METOXIFENIL-3,4,5-
TRIMETOXIFENILMETANONA (RR07)
Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em
Farmacologia.
Aprovada em 14 / 08 / 2009
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________
Profa. Dra. Cláudia do Ó Pessoa (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará – UFC
_____________________________________________________
Prof. Dr. Demetrius Antônio Machado de Araújo
Universidade Federal da Paraíba – UFPB
_____________________________________________________
Prof. Dr. Hélio Vitoriano Nobre Júnior
Universidade Federal do Ceará – UFC
___________________________________________________
Prof. Dr. Daniel Pereira Bezerra
Universidade Federal de Sergipe – UFS
___________________________________________________
Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes
Universidade Federal do Ceará – UFC
A meus pais,
por todo ensinamento e dedicação acreditando sempre me ensinando que a educação é a
chave para a abertura de muitas portas
AGRADECIMENTOS
DEUS OBRIGADO POR TUDO E POR TODOS!
À Telma Alves pelo apoio, companherismo e cumplicidade.
À Profª. Drª. Cláudia do Ó Pessoa pelo incentivo, suporte científico, dicas
importantes na realização desse trabalho, pelo incentivo no exercício na docência, pela
amizade e pela dedicação na busca por novos recursos para o Laboratório de Oncologia
Experimental da Universidade Federal do Ceará (obrigado por tudo!).
Ao Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes pelo reconhecimento do meu esforço na
tentativa de desenvolver um bom trabalho, e pela contribuição imensurável à pesquisa e apoio
logístico e científico ao Laboratório de Oncologia Experimental, Universidade Federal do
Ceará.
À Profª. Drª. Letícia Veras Costa-Lotufo, pelo apoio e auxílio no desenvolvimento
desse trabalho, por toda a ajuda fornecida no decorrer dos anos que estive no Laboratório de
Oncologia Experimental da Universidade Federal do Ceará.
Ao Prof. Dr. Rommel Burbano pelo auxílio na execução dos ensaios de
genotoxicidade no Laboratório de Biologia Celular da Universidade Federal do Pará (UFPA)
e por ter repassado todo o conhecimento com simplicidade, contribuindo para o
desenvolvimento esse trabalho.
A Profª. Drª. Ana Paula Negreiro Nunes, do Departamento de Clínica Odontológica
na Universidade Federal do Ceará, pela realização das análises histopatológicas.
Ao amigo Prof. Dr. Hélio Vitoriano Nobre Júnior que muito contribuiu desde o
inicio da minha caminhada na Pós Graduação desde e ainda continua auxiliando agora em seu
laboratório no Departamento de Farmácia da UFC e dessa forma contribuindo para realização
desse e de outros trabalhos que estão em execução.
Ao Prof. Dr. Demetrius Antônio Machado de Araújo da Universidade Federal da
Paraíba (UFPB) por ter aceitado o convite de participação no processo de defesa, bem como
pela inestimável contribuição na etapa de revisão da tese.
Ao amigo Prof. Dr. Daniel Pereira Bezerra no Departamento de Fisiologia da UFS
pelo incentivo em momentos delicados e pela ajuda e ensinamento em metodologias e
experimentos e pela oportunidade de convívio e trabalho no LOE.
A Profª. Drª. Gardênia Carmen Militão, do Departamento de Fisiologia na UFPI,
pelo auxilio em alguns experimentos, pelas dicas, amizade, por todo incentivo. E que ainda
me deve uma xícara de café com torradas às 17:00 horas.
Ao amigo Prof. Michel Pinheiro Ferreira, vulgo “The Limon Man” ou “limãozin" do
Setor de Histologia e Embriologia da UFPI, por sempre me auxiliar com palavras de conforto
e incentivo tipo “vai te lascar!” ou “nunca me viu não!” e por sempre estar disponível nos
momentos que precisei e por toda a colaboração neste trabalho e principalmente pela amizade.
Ao companheiro de Pós Graduação, e agora Dr. Diego Wilke Veras a quem tenho
muito a agradecer pelo auxilio nos ensaios de citometria e por todos os ensinamentos
repassados diariamente durante a convivência no LOE, um ser humano excepcional.
Ao amigo doutorando, Bruno Coelho Cavalcanti “The best researcher” com certeza
passei a ver a pesquisa com outros olhos por todo ensinamento por ele repassado.
Aos amigos da Pós Graduação e do HEMOCE, Marcos Martins “o predador” e
Eunice Bobô pelo incentivo e auxílio em todos os momentos que precisei sanar algumas
dúvidas.
As Profas. do Departamento de Farmácia e Análises Toxicológicas: Alcínia Lima,
Iêda Pereira, Janete Eliza Soares de Lima, Maria Augusta Drago Ferreira, Romélia
Pinheiro Gonçalves e Teresa Maria de Jesus Carvalho pela amizade, atenção, contribuição
e incentivo.
Aos funcionários do Departamento de Farmácia e Análises Toxicológicas: Adalgiza,
Eduardo e Lúcia Queiroga pela amizade e apoio.
Ao Prof. Dênis Pires de Lima pelo fornecimento da molécula que propiciou o
desenvolvimento deste trabalho.
A todos os professores do curso de Pós-Graduação em Farmacologia pela
contribuição na minha formação.
Aos amigos Breno Auad Alves, Danilo Rocha Damasceno, Elthon Góes Ferreira e
Gilberto Ferreira Linhares pela cumplicidade, amizade, paciência e companheirismo
auxiliando-me sempre nos momentos que precisei até mesmo em horários inoportunos.
A José Roberto (o negrinho das Alagoas) pela amizade (apesar de todo mau humor),
pelo auxilio nas atividades do laboratório, e pelos conselhos e incentivo e também ao grande
mestre Washington Barros (Vaston) – o homem MTT – pela amizade e apoio.
Aos amigos do LOE, no primeiro bloco: Arinice Costa, Eveline Alves, Andrew
Nunes, Igor (o boy do LOE), Fernanda de Castro, Gabriella, Germano, Kézia Lacerda,
Miller Barreto, Paula Abreu, Rafael e Vanessa (Dahlits da Adriana), Venúcia Magalhães
pelo agradável convívio e ajuda.
Aos amigos do LOE, bloco das autarquias: Aline Martins (protein microarray) Ana
Jérsia, Cecília Carvalho, Delano Marinho (autarquia federal, estadual e municipal),
Adriana Carvalho, Carla Sombra, Ivana Dantas, Patrícia Marçal e Kristiana Mousinho,
(as popozudas do LOE), Felipe Rocha (o mala), Márcio Roberto, Paula Jimenez (enfim
Doutora!), Patrícia Bonavides, Profa. Marne Vasconcellos, Dra. Raquel Montenegro,
Rômulo Feio, e pelo agradável convívio e ajuda.
A Silvana França (baronesa de Araruna), grande latifundiária do Conjunto Esperança
pela ajuda com as células, cuja dedicação é essencial para o laboratório;
Aos técnicos: Erivanda França, Luciana França, Adriano dos Santos, Maria de
Fátima, Rogéria Monontenegro e Paulo Macgaiver pelo auxílio sempre disponibilizado.
As secretárias Sheyla e a Adelânia Marinho pela paciência, preocupação e disposição
em ajudar em tudo que é possível, além do constante sorriso aberto no rosto;
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia: Francisco
(Chiquinho), Alana, Carlos, Haroldo, Iris, Flávia, Feranando pela ajuda na concretização
deste trabalho.
A Aura Yida Rhanes e Márcia Hermínia P. Borges funcionárias do Departamento
de Fisiologia e Farmacologia, que sempre estiveram dispostas a ajudar e tornar possível a
condução dos trabalhos burocráticos do Departamento de Fisiologia e Farmacologia.
A mente que se abre a uma nova idéia, jamais retorna ao seu tamanho original
(Albert Einstein)
RESUMO
A fenstatina, quimicamente designada de 4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona, denominada RR07, é uma bisarilcetona de esqueleto estilbenóide que pode ser obtida a partir da combretastatina A4, com reconhecida atividade citotóxica, por meio da oxidação de Jacobsen. Dentre as muitas atividades desencadeadas pelos estilbenos destacam-se atividade antiangiogênica, citotóxica e antitumoral. Para avaliar o seu potencial antineoplásico, um estudo farmacológico de suas propriedades anticâncer foi realizado em vários modelos biológicos. Utilizando o ensaio do MTT foi feito um estudo comparativo da citotoxicidade de moléculas estilbenóides com estruturas relacionadas ao composto RR07, onde foi observado que a presença do anel A (3,4,5-trimetoxifenil) é essencial para a atividade citotóxica da molécula. Determinou-se inicialmente a atividade citotóxica, frente a 13 linhagens tumorais pelo ensaio de redução do MTT sendo testados 11 compostos, (RR01, RR02, RR03, RR04, RR05, RR06, RR07, RR08, RR09, RR10, RR11), onde o estilbenóide RR07 destacou-se como um dos mais citotóxicos apresentando valores de CI50 que variaram de 0,009 a 17,49 μM. Posteriormente, os estudos de mecanismo de ação com o RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM, revelaram redução, de forma concentração-dependente, na viabilidade celular pelos métodos do azul de tripan e de BrdU (bromodeoxiuridina). As análises morfológicas feitas por hematoxilina/eosina mostraram núcleos metafásicos, onde no ensaio de incorporação por brometo de etídio/laranja de acridina evidenciou-se morte celular por apoptose nas concentrações de 0,25 e 0,50 μM, com células em necrose nas concentrações de 1,00; 2,00 e 4,00 μM, destacando-se alterações como desintegração membranar e picnose nuclear, nas concentrações de 0,25 μM e 1,00 μM, respectivamente. Nos ensaios por citometria de fluxo foi observado fragmentação do DNA com parada de ciclo na fase G2/M a partir da concentração 0,25 μM. A análise pelo ensaio do cometa, para o RR07 revelou atividade genotóxica do tipo concentração-dependente entre células mononucleadas de sangue periférico (PBMC), principalmente em 2,00 e 4,00 μM. A avaliação do RR07 no ensaio com tubulina isolada revelou inibição na polimerização da mesma em uma concentração de 10 μM. A análise antitumoral evidenciou inibição de 30,9% e 48,19%, respectivamente, para as doses de 20 e 40 mg/kg/dia de RR07 por via intraperitoneal (ip), e 55,68% de inibição para a associação de 10 mg/kg/dia de 5-fluorouracil com 20 mg/kg/dia de RR07 (ip), em camundongos transplantados com Sarcoma 180, onde se verificou redução no crescimento tumoral e alterações renais iniciais e reversíveis. Desta forma, a fenstatina, RR07, apresenta-se como uma proposta de ferramenta farmacológica útil para a pesquisa de novos derivados. Palavras-chave: Estilbenos. Tubulina. Citotoxicidade. Antineoplásicos.
ABSTRACT
The phenstatin, chemically known as 4-methoxyphenyl-3,4,5-trimetoxiphenylmethane, was called in the present study as RR07. This compound is a bisarylketone with stilbenoid skeleton obtained from combretastatin A4, with recognized cytotoxic and antineoplasic activities. Then, a detailed study of RR07 anticancer properties was conducted in several biological models. The cytotoxic activity of eleven compounds (RR01, RR02, RR03, RR04, RR05, RR06, RR07, RR08, RR09, RR10, RR11) was determined against thirteen tumor cell lines by MTT assay. Structure-activity relationship pointed out that the presence of ring A (3,4,5-trimethoxiphenyl) is essential for the cytotoxic potential. The RR07 was one of the most cytotoxic compounds, showing IC50 values ranging from 0.009 to 17.49 µM. Investigations on mechanism of action (0.25, 0.50, 1.00, 2.00 and 4.00 µM) showed a concentration-dependent manner cell viability reduction (trypan blue dye exclusion test) and proliferation decreasing (BrdU assay). Morphological alterations determined by hematoxylin/eosin and acridine orange/ethidium bromide fluorescent double staining methods indicated an increased number of apoptotic cells at lowest concentrations (0.25 and 0.50 µM) and necrotic cells at higher concentrations (1.00, 2.00 and 4.00 µM). Flow cytometry analyses showed that RR07 induced DNA fragmentation and cell cycle arrest at G2/M starting at 0.25 µM. In the comet assay performed with human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), RR07 caused DNA strand breaks only at higher concentrations (2.00 and 4.00 µM). Experiments with isolated tubulin, RR07 also induced tubulin polymerization inhibition in a concentration of 10 μM. In vivo antitumor experiments showed that Sarcoma 180 transplanted-mice treated with RR07 intraperitoneally (ip) presented a tumor growth inhibition ratios of 30.9% and 48.19% (20 mg/kg/day and 40 mg/kg/day, respectively) and inhibition of 55.68% in associated treatment (5-Fluoruracil 10 mg/kg/day + RR07 20 mg/kg/day). Histopathological analyses of kidneys, spleen and livers revealed incipient and reversible alterations. In summary, RR07 can be considered as a pharmacological useful tool as well as a lead molecule to obtain novel compounds with low toxicity and promising antitumor properties. Key words: phenstatin, combretastatin A-4; tubulin; cytotoxic; antitumor activity.
LISTA DE ABREVIATURAS
5-FU 5-fluorouracil
7AAD 7-amino-actinomicina
AIF Apoptosis Inhibition Factor (Fator inibidor de apoptose)
APAF-1 Apoptotic Protease Activating Factor 1 (Fator ativador de apoptose)
Bcl-2 B-cell lymphoma 2
BrdU Bromodeoxiuridina
Caspase Cysteine-dependent aspartate-specific proteases
CI50 Concentração Inibitória Média
COL Colchicina
DMSO Dimetilsulfóxido
EPM Erro Padrão da Média
FADD Fas Associated Death Domain (Domínio de morte ligado ao Fas)
GDP Guanosina difosfato
GTP Guanosina trifosfato
HE Hematoxilina/Eosina
MTT 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-brometo de tetrazolium
NMP Normal Melting Point (Ponto normal de derretimento)
PAMs Proteínas associadas aos microtúbulos
PBMC Células mononucleadas de sangue periférico
PBS Phosphate Buffer Solution (Tampão Fosfato)
PE Ficoeritrina
PHA Fitohemaglutinina
Pi Fosfato inorgânico
PI Iodeto de propídeo
PTX Paclitaxel
RESV Resveratrol ou {5-[2-(4-hidroxifenil)-vinil]-benzeno-1,3-diol}
RPMI Roswell Park Memorial Institute
RR01 Ácido 3-(3,4-dimetoxifenil)-2-fenil acrílico
RR02 Ácido {[3-(4-acetoxi-3-metoxifenil)-2-fenil acrílico]}
RR03 {[(1,2-dimetoxi-4-(Z)-2-fenil-1-etenil) benzeno]}
RR04 {1,2-dimetoxi-4-[(E)-2-fenil-1-etenil] benzeno}
RR05 Ácido 3-(3,4-metoxifenil)-2-fenil acrílico
RR06 Ácido 3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-2-fenil acrílico
RR07 (4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona)-fenstatina
RR09 [4-(1,8-dimetoxi-9H-xantenila-9)-2-metoxifenol]
RR10 Ácido 3-(2-hidroxifenil)-2-fenil acrílico
RR11 [9-(4-hidroxi-3-metoxi)-3,4,5,6,7,9-hexahidro-2H-xantene-1,8-diona]
rTNF Fator de necrose tumoral recombinante
Smac/DIABLO Second mithocondria-derived activator of caspases
VNB Vimblastina
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Ilustração esquemática mostrando as fases do ciclo e divisão celular........... 29
Figura 2 Formação, estrutura e estabilização dos microtúbulos................................... 30
Figura 3 Processo de montagem e estruturação dos microtúbulos em células
eucarióticas de mamíferos.............................................................................. 32
Figura 4 A dinâmica de polimerização e despolimerização dos microtúbulos............. 35
Figura 5 Esquema representando o transporte de elétrons e fosforilação oxidativa..... 37
Figura 6 Vias de morte celular...................................................................................... 39
Figura 7 Vias extrínseca e intrínseca da apoptose........................................................ 44
Figura 8 Diferentes sítios de ligação de drogas antimitóticas em locais diferentes no
heterodímero de tubulina................................................................................ 49
Figura 9 Estrutura da fenstatina.................................................................................... 51
Figura 10 Representação dos tipos de cometa, sendo indicado o escore atribuído a
cada cometa de acordo com o dano ao DNA................................................. 80
Figura 11 Fotomicrografias das células HL-60 tratadas e não tratadas, após 24 h de
incubação com RR07..................................................................................... 103
Figura 12 Morfologia das células da linhagem promielocítica (HL-60) após 24 h de
tratamento, coradas por laranja de acridina/brometo de etídeo e visualizadas
por microscopia de fluorescência..................................................................... 106
Figura 13 Análise histológica dos fígados de camundongos Mus musculus Swiss
transplantados com Sarcoma 180................................................................... 128
Figura 14 Análise histológica dos rins de camundongos Mus musculus Swiss
transplantados com Sarcoma 180................................................................... 129
Figura 15 Análise histológica dos baços de camundongos Mus musculus Swiss
transplantados com Sarcoma 180................................................................... 130
Figura 16 Análise histológica dos tumores de camundongos Mus musculus Swiss
transplantados com Sarcoma 180................................................................... 131
Figura 17 Resumo esquemático do provável mecanismo de ação do estilbenóide
fenstatina (RR07) em estudo com células HL-60 após 24 h de incubação.... 153
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 Efeito da viabilidade em células leucêmicas (HL-60).................................. 100
Gráfico 2 Curva cinética de crescimento celular na linhagem HL-60 (leucemia
promielocítica humana) tratada com o composto RR07 nas concentrações
de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 µM.............................................................. 101
Gráfico 3 Determinação do percentual de síntese do DNA.......................................... 104
Gráfico 4 Determinação dos percentuais sobre os eventos celulares (viabilidade
celular, apoptose e necrose) avaliado em linhagem celular HL-60
(leucemia promielocítica)............................................................................. 107
Gráfico 5 Freqüência de dano ao DNA........................................................................ 108
Gráfico 6 Índice de dano ao DNA................................................................................ 108
Gráfico 7 Avaliação de integridade de membrana plasmática por citometria de fluxo 112
Gráfico 8 Integridade da membrana plasmática das células HL-60 após 24 h de
incubação...................................................................................................... 113
Gráfico 9 Número de células viáveis analisadas por citometria de fluxo..................... 114
Gráfico 10 Efeito no ciclo celular após incubação por 24 h com o RR07...................... 116
Gráfico 11 Determinação da fragmentação do DNA...................................................... 117
Gráfico 12 Análise da variação do potencial transmembrânico da mitocôndria (ΔΨm)
por citometria de fluxo em células HL-60.................................................... 118
Gráfico 13 Análise da externalização da fosfatidilserina por citometria de fluxo em
células HL-60................................................................................................ 119
Gráfico 14 Análise da detecção da ativação de caspases efetoras 3 e 7 por citometria
de fluxo em células HL-60........................................................................... 120
Gráfico 15 Análise da detecção da ativação de caspase iniciadora 8 por citometria de
fluxo em células HL-60................................................................................ 121
Gráfico 16 Ensaio de inibição de polimerizção da tubulina in vitro.............................. 122
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Alguns estabilizadores e desestabilizadores de microtúbulos.......................... 48
Quadro 2 Semelhanças estruturais e funcionais entre alguns estilbenos.......................... 52
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Etapas da Carcinogênese: Principais Características..................................... 24
Tabela 2 Diferenças básicas entre apoptose e necrose.................................................. 41
Tabela 3 Nome químico, sigla utilizada, massa molecular e estrutura química do
resveratrol e derivados estilbenóides............................................................. 63
Tabela 4 Linhagens celulares tumorais utilizadas no ensaio de citotoxicidade in
vitro, através do método do MTT.................................................................. 65
Tabela 5 Protocolo dos tratamentos do RR07 aplicado às culturas temporárias de PBMC.... 82
Tabela 6 Atividade citotóxica de compostos estilbenóides frente às linhagens tumorais.. 95
Tabela 7 Atividade citotóxica de compostos estilbenóides frente às linhagens tumorais.. 96
Tabela 8 Atividade antimitótica do resveratrol e análogos estilbenóides no
desenvolvimento de ovos de ouriço-do-mar Lytechinus variegatus nos
estágios de 1ª divisão, 3ª divisão e blástula................................................... 97
Tabela 9 Avaliação do potencial hemolítico do resveratrol e outros compostos
estilbenódies................................................................................................... 98
Tabela 10 Avaliação citotóxica do composto RR07 na linhagem tumoral estabelecida
(HL-60) e na linhagem normal obtida por cultura primária (PBMC) com
24 horas de incubação.................................................................................... 99
Tabela 11 Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico (IM) em culturas de PBMC
humanos com RR07 na fase G1 (Experimentos 1 e 2) do ciclo celular................. 109
Tabela 12 Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico (IM) em cultura de PBMC
humanos com RR07 na fase G1/S (Experimentos 3 e 4) do ciclo celular.............. 110
Tabela 13 Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico (IM) em cultura de PBMC
humanos com RR07 na fase G2/M (Experimentos 5 e 6) do ciclo celular............ 111
Tabela 14 Avaliação do ciclo celular.............................................................................. 115
Tabela 15 Avaliação do efeito sobre o peso relativo dos tumores e percentual de
inibição tumoral em camundongos (Mus musculus Swiss) transplantados
com Sarcoma 180........................................................................................... 123
Tabela 16 Efeito do RR07 sobre o peso relativo dos órgãos e tumores de camundongos
(Mus musculus Swiss) transplantados com Sarcoma 180.................................. 124
Tabela 17 Resumo dos resultados encontrados no estudo do potencial antitumoral da
fenstatina (4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona)............................... 133
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 23
1.1 O câncer........................................................................................................................ 23
1.2 Epidemiologia do câncer............................................................................................. 25
1.3 O ciclo celular e o câncer............................................................................................ 25
1.4 O processo de divisão celular..................................................................................... 27
1.5 Os microtúbulos – estrutura, função e importância para as células...................... 30
1.6 A dinâmica dos microtúbulos..................................................................................... 32
1.7 As mitocôndrias – importância como alvos terapêuticos......................................... 36
1.8 Os padrões de morte celular....................................................................................... 37
1.9 Vias de ativação da apoptose...................................................................................... 42
1.9.1 Via extrínseca do processo apoptótico....................................................................... 43
1.9.2 Via intrínseca do processo apoptótico....................................................................... 44
1.10 Novos agentes citotóxicos.......................................................................................... 46
1.10.1 Os novos inibidores dos microtúbulos..................................................................... 49
1.10.2 Fenstatina, a molécula desse estudo........................................................................ 50
2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA........................................................................... 53
3 OBJETIVOS................................................................................................................... 54
3.1 Geral............................................................................................................................. 54
3.2 Específicos.................................................................................................................... 54
4 MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................................... 56
4.1 Materiais utilizados..................................................................................................... 56
4.1.1 Equipamentos............................................................................................................ 56
4.1.2 Soluções, Reagentes e Fármacos.............................................................................. 57
4.1.3 Modelos utilizados na pesquisa................................................................................. 62
4.1.3.1 Biológicos................................................................................................................ 62
4.1.3.2 Comitê de Ética....................................................................................................... 62
4.2 Metodologia Experimental......................................................................................... 62
4.2.1 Obtenção do composto RR07 e outros derivados estilbenóides............................... 62
4.2.2 Manutenção das células............................................................................................ 64
4.2.3 Avaliação da atividade citotóxica em células tumorais in vitro pelo método do MTT.... 65
4.2.3.1 Princípio do teste..................................................................................................... 65
4.2.3.2 Procedimento experimental..................................................................................... 65
4.2.3.3 Análise dos dados.................................................................................................... 66
4.2.4 Avaliação da atividade antimitótica – Desenvolvimento embrionário em ovos de
ouriço-do-mar (Lytechinus variegatus)............................................................................. 66
4.2.4.1 Princípio do ensaio.................................................................................................. 66
4.2.4.2 Procedimento experimental..................................................................................... 67
4.2.4.3 Análise dos dados.................................................................................................... 67
4.2.5 Avaliação do dano à membrana plasmática – Atividade Hemolítica em Eritrócitos
de Camundongos Mus musculus Swiss................................................................................ 68
4.2.5.1 Princípio do ensaio.................................................................................................. 68
4.2.5.2 Procedimento experimental..................................................................................... 68
4.2.5.3 Análise dos dados.................................................................................................... 69
4.3 Caracterização da atividade antiproliferativa do composto RR07 em células
HL-60 e em cultura primária de células mononucleadas do sangue periférico
(PBMC) pelo ensaio do MTT............................................................................................ 69
4.3.1 Procedimento experimental........................................................................................ 69
4.3.2 Análise dos dados....................................................................................................... 70
4.4 Estudos de Mecanismo de Ação................................................................................. 70
4.4.1 Viabilidade celular – Teste de exclusão do azul de Tripan...................................... 70
4.4.1.1 Princípio do ensaio.................................................................................................. 70
4.4.1.2 Procedimento experimental..................................................................................... 70
4.4.1.3 Análise dos dados.................................................................................................... 71
4.4.2 Avaliação cinética do crescimento celular em HL-60 pelo método do azul de Tripan....... 71
4.4.2.1 Princípio do ensaio.................................................................................................. 71
4.4.2.2 Procedimento experimental..................................................................................... 71
4.4.2.3 Análise dos dados.................................................................................................... 71
4.4.3 Análise de alterações morfológicas – Coloração com hematoxilina e eosina........ 72
4.4.3.1 Princípio do ensaio.................................................................................................. 72
4.4.3.2 Procedimento experimental..................................................................................... 72
4.4.3.3 Análise dos dados.................................................................................................... 72
4.4.4 Determinação do percentual de inibição de síntese de DNA: incorporação da
bromodeoxiuridina – Ensaio do BrDU.............................................................................. 73
4.4.4.1 Princípio do teste..................................................................................................... 73
4.4.4.2 Procedimento Experimental.................................................................................... 73
4.4.4.3 Análise dos dados.................................................................................................... 73
4.4.5 Avaliação do padrão de morte celular – Coloração diferencial com laranja de
acridina (LA) / brometo de etídeo (BE)............................................................................. 74
4.4.5.1 Princípio do ensaio.................................................................................................. 74
4.4.5.2 Procedimento experimental..................................................................................... 74
4.4.5.3 Análise dos dados.................................................................................................... 75
4.4.6 Avaliação citotóxica em células mononucleadas de sangue periférico humano (PBMC).. 75
4.4.6.1 Aspectos éticos, coleta de sangue e isolamento das células PBMC........................ 75
4.4.7 Avaliação da atividade citotóxica do composto RR07 em células mononucleadas
do sangue periférico (PBMC)............................................................................................ 76
4.4.7.1 Princípio do ensaio.................................................................................................. 76
4.4.7.2 Procedimento experimental..................................................................................... 76
4.4.7.3 Análise dos dados.................................................................................................... 764.4.8 Atividade genotóxica em células mononucleadas do sangue periférico – Teste do Cometa...... 77
4.4.8.1 Seleção de voluntários e obtenção do material para análise.................................. 77
4.4.8.2 Princípio do ensaio.................................................................................................. 78
4.4.8.3 Procedimento experimental..................................................................................... 78
4.4.8.4 Execução do teste do Cometa.................................................................................. 78
4.4.8.4.1 Preparo das lâminas............................................................................................. 78
4.4.8.4.2 Lise celular........................................................................................................... 78
4.4.8.4.3 Neutralização e corrida em eletroforese.............................................................. 79
4.4.8.4.4 Coloração............................................................................................................. 79
4.4.8.4.5 Análise dos dados................................................................................................. 79
4.4.9 Estudo de aberrações cromossômicas induzidas pelo composto RR07 em células
mononucleadas do sangue periférico (PBMC)................................................................. 80
4.4.9.1 Princípio do ensaio.................................................................................................. 80
4.4.9.2 Procedimento experimental..................................................................................... 81
4.4.9.3 Tratamentos............................................................................................................. 81
4.4.9.4 Preparação das lâminas.......................................................................................... 82
4.4.9.5 Análise citogenética................................................................................................. 82
4.4.9.6 Critérios de análise................................................................................................. 83
4.4.9.7 Análise estatística.................................................................................................... 83
4.4.10 Viabilidade celular por citometria de fluxo............................................................ 83
4.4.10.1 Análise da integridade de membrana plasmática por citometria de fluxo........... 83
4.4.10.1.1 Princípio do teste................................................................................................ 83
4.4.10.1.2 Procedimento experimental................................................................................ 84
4.4.10.1.3 Análise dos dados............................................................................................... 84
4.4.11 Analise da morfologia celular por citometria de fluxo.......................................... 84
4.4.11.1 Princípio do teste................................................................................................... 84
4.4.11.2 Procedimento experimental................................................................................... 84
4.4.11.3 Análise dos dados.................................................................................................. 85
4.4.12 Avaliação do ciclo celular e fragmentação de DNA por citometria de fluxo........ 85
4.4.12.1 Princípio do teste................................................................................................... 85
4.4.12.2 Procedimento experimental................................................................................... 86
4.4.12.3 Análise dos dados.................................................................................................. 86
4.4.13 Determinação do Potencial Transmembrânico de Mitocôndria (ΔΨm) – Ensaio
da rodamina 123................................................................................................................. 86
4.4.13.1 Princípio do teste................................................................................................... 86
4.4.13.2 Procedimento experimental................................................................................... 87
4.4.13.3 Análise dos dados.................................................................................................. 87
4.4.14 Detecção da externalização da fosfatidilserina – Teste da Anexina-V................. 87
4.4.14.1 Princípio do teste................................................................................................... 87
4.4.14.2 Procedimento experimental................................................................................... 88
4.4.14.3 Análise dos dados.................................................................................................. 88
4.4.15 Detecção da ativação de caspases........................................................................... 88
4.4.15.1 Princípio do teste................................................................................................... 88
4.4.15.2 Procedimento experimental................................................................................... 89
4.4.15.3 Análise dos dados.................................................................................................. 89
4.4.16 Ensaios de inibição da polimerização da tubulina in vitro.................................... 89
4.4.16.1 Princípio do ensaio................................................................................................ 89
4.4.16.2 Procedimento experimental................................................................................... 90
4.4.16.3 Análise dos dados.................................................................................................. 90
4.4.17 Estudo do potencial antitumoral do composto RR07 em camundongos
transplantados com células tumorais do Sarcoma 180..................................................... 90
4.4.17.1 Princípio do ensaio................................................................................................ 90
4.4.17.2 Procedimento experimental................................................................................... 90
4.4.17.3 Análise dos dados.................................................................................................. 92
4.4.18 Avaliação histopatológica de órgãos de metabolização e da massa tumoral........ 92
4.4.18.1 Princípio do ensaio................................................................................................ 92
4.4.18.2 Procedimento experimental................................................................................... 92
4.4.18.3 Análise de dados.................................................................................................... 93
5 RESULTADOS............................................................................................................... 94
5.1 Estudo da atividade citotóxica de derivados estilbenóides...................................... 94
5.1.1 Estudo da atividade antiproliferativa em linhagens de células tumorais e células
mononucleares do sangue periférico (PBMC) pelo ensaio do MTT................................ 94
5.2 Avaliação da atividade antimitótica – Desenvolvimento embrionário em ovos
de ouriço-do-mar (Lytechinus variegatus)....................................................................... 96
5.3 Avaliação do dano à membrana plasmática – Atividade hemolítica em
eritrócitos de camundongos Mus musculus Swiss.......................................................... 98
5.4 Estudo do mecanismo de ação do RR07 em células HL-60 (leucemia promielocítica)...... 98
5.5 Estudo da atividade antiproliferativa do composto RR07 em cultura de células
HL-60 e PBMC com 24 horas de incubação pelo ensaio do MTT................................ 99
5.6 Estudo de Viabilidade Celular – Exclusão pelo método do Azul de Tripan.......... 99
5.7 Avaliação cinética da atividade antiproliferativa em cultura de células
leucêmicas da linhagem promielicítica HL-60 – exclusão por azul de tripan.............. 100
5.8 Análise morfológica – coloração diferencial com hematoxilina/eosina.................. 102
5.9 Determinação da síntese do DNA: incorporação da bromodeoxiuridina (BrDU) 104
5.10 Estudos para verificação dos padrões de morte celular........................................ 104
5.10.1 Marcação diferencial por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina (BE/LA)....... 104
5.11 Avaliação do potencial genotóxico do RR07 em células mononucleadas do
sangue periférico (PBMC)................................................................................................ 107
5.12 Análise das aberrações cromossômicas em células mononucleares de sangue
periférico (PBMC) após tratamento com o RR07.......................................................... 109
5.13 Avaliação da integridade de membrana celular por citometria de fluxo em
cultura de células HL-60 tratadas com RR07................................................................. 111
5.14 Estudo do ciclo celular e fragmentação nuclear por citometria de fluxo em
cultura de células HL-60 tratadas com RR07................................................................. 114
5.15 Determinação do potencial transmembrânico de mitocôndria – (ΔΨm).............. 117
5.16 Detecção da externalização da fosfatidilserina por citometria de fluxo – Anexina V..... 118
5.17 Detecção da ativação de caspases 3, 7 e 8 por citometria de fluxo........................ 119
5.18 Ensaio de inibição da polimerização da tubulina in vitro...................................... 122
5.19 Estudo da atividade antitumoral do composto RR07 em camundongos
transplantados com Sarcoma 180.................................................................................... 122
5.20 Análise histopatológica dos órgãos de camundongos Mus musculus Swiss
tratados com RR07............................................................................................................ 123
5.21 Resumo dos resultados encontrados........................................................................ 132
6 DISCUSSÃO................................................................................................................... 134
7 PROPOSTA PARA O MECANISMO DE AÇÃO DA FENSTATINA (RR07)....... 153
8 PERSPECTIVAS............................................................................................................ 154
9 CONCLUSÃO................................................................................................................. 155
10 REFERÊNCIAS........................................................................................................... 156
23
1 INTRODUÇÃO
1.1 O câncer
O câncer é definido como um conjunto de enfermidades complexas, de caráter
mutacional, proliferativo, de crescimento celular anormal e descontrolado, em que células
animais, de diferentes tipos presentes em um mesmo microambiente, invadem os tecidos e
órgãos adjacentes, muitas vezes reduzindo os espaços internos, induzindo a compessão entre
os órgãos, quando ocorrem em estruturas sólidas, podendo ainda se propagar para outras
regiões do organismo, pelo processo denominado metastase (SILVA et al., 2007;
KLAUNING; KAMENDULIS, 2008).
Em um aspecto geral, para que uma célula evolua de seu estado normal até assumir as
características de uma célula neoplásica, é necessária a ocorrência de uma série de mutações,
envolvendo genes que expressem proteínas cuja ação esteja relacionada ao controle do ciclo
celular. Caso esta ação seja no sentido de estimular a divisão celular, estes genes são
genericamente denominados como oncogenes e caso tenham por função inibi-la serão
considerados como genes supressores de tumor. Seja por função anormalmente exacerbada
dos oncogenes ou por inibição dos supressores, o resultado será a obtenção de uma célula que
apresentará um ganho proliferativo em relação às demais, tornando-se insensível aos
estímulos apoptóticos (PETTERS et al., 2005; SILVA et al., 2007).
As células mutadas tendem a ser benignas, quando simplesmente, há uma massa
localizada de células que se multiplicam vagarosamente e se assemelham ao seu tecido
original, raramente constituindo um risco de vida para o organismo formado pelas mesmas.
Por outro lado, um tumor maligno ou neoplasma (novo crescimento) caracteriza-se pela
proliferação e acúmulo de células muito agressivas e de crescimento incontrolável, mesmo na
ausência de fatores de crescimento. Porém, o que realmente distingue células benignas de
malignas, é a capacidade destas últimas invadirem outros tecidos, formando as metástases
(GEIGER; PEEPER, 2007; LIOTTA; KOHN, 2001; KUMAR et al., 2005).
Assim, considera-se neoplásica a célula que adquire as seguintes “características
metabólicas” e capacidades biológicas: 1 – perda do controle da proliferação e divisão celular;
2 – “imortalização celular” devido à ativação da enzima telomerase; 3 – alterações
cromossômicas (de estrutura e número); 4 – perda das propriedades adesivas da membrana
plasmática, que permite o reconhecimento célula-célula e a inibição por contato do
movimento e crescimento celular; 5 – perda de função e da capacidade de diferenciação ou
24
especialização; 6 – capacidade para invadir tecidos vizinhos ou distantes e formar metástases;
7 – capacidade de induzir a formação de novos vasos sangüíneos (angiogênese). Dessa forma,
todos os casos de câncer estão envolvidos com as vias de transmissão de sinais biológicos e
no controle positivo e negativo do ciclo celular e da morte celular programada (LIOTTA;
KOHN, 2001; RIBEIRO; SALVADORI; MARQUES, 2003).
No organismo humano, pode-se desenvolver quase 200 tipos de câncer que
correspondem aos vários sistemas celulares (INSTITUTO NACIONAL DO CANCER, 2008,
KLAUNING; KAMENDULIS, 2008). Em geral o processo de carcinogênese é muito lento,
podendo levar vários anos para que uma célula cancerosa origine um tumor detectável. Dessa
forma, os principais estágios desencadeados para a instalação de um câncer são: a iniciação, a
promoção e a progressão, apresentando cada uma das etapas características peculiares
(DONNICI et al., 2005; OGA; CAMARGO; BATISTUZZO, 2008).
A iniciação é o primeiro estágio da carcinogênese. Nessa etapa, considerada
irreversível e crítica, as células sofrem o efeito dos agentes potencialmente carcinogênicos, os
quais provocam modificações em alguns proto-oncogenes ativando-os, porém ainda não
detectável clinicamente, ou seja, as células encontram-se "iniciadas", porém, "latentes" até
que um evento epigenético revele as alterações genéticas (OGA; CAMARGO;
BATISTUZZO, 2008).
Na fase seguinte, denominada promoção, as células “iniciadas” podem sofrer o efeito
de agentes oncopromotores, induzindo a expressão dos proto-oncogenes, sendo necessário,
para isso, um longo e continuado contato com o carcinógeno (Tabela 1). A suspensão do
contato muitas vezes interrompe o processo nesse estágio. Sendo assim, a promoção pode
compreender, pelo menos, dois mecanismos independentes: a ativação gênica e a atividade
mitótica (ESSERS; VERMEULEN; HOUTSMULLER, 2006; KLAUNING; KAMENDULIS,
2008).
Tabela 1 – Etapas da Carcinogênese: Principais Características.
Etapas Características
Iniciação Irreversível Requer fixação (divisão celular)
Promoção Reversível Modulação ambiental
Progressão Irreversível Cariótipo instável
Manifestação Infiltração de tecidos Metástase
. Fonte: Adaptado de DONNICI et al. (2005)
25
Entretanto, aparentemente isto não é suficiente para que esta célula dê origem a um
tumor com volume detectável e capaz de ameaçar a vida do indivíduo. Para que um
determinado grupo de células consiga manter um crescimento sustentado é necessário que
exista uma fonte de suprimento sanguíneo específico e constante. Há muitas décadas foi
percebido que os tumores apresentam uma vascularização bastante proeminente em relação
aos tecidos normais. Estes achados foram sempre considerados como uma conseqüência do
processo inflamatório decorrente das áreas focais de necrose existentes na massa tumoral
(PETTERS et al., 2005; SILVA et al., 2007).
Em última instância, ocorre a progressão tumoral que envolve ciclos sucessivos de
mutação e seleção, caracterizando-se por alterações metabólicas e morfológicas interpretadas
como perda de diferenciação, multiplicação descontrolada e irreversível, e agressividade das
células alteradas. Nesse estágio o câncer já está instalado, evoluindo até o surgimento das
primeiras manifestações clínicas da doença (AHMED; RAHMAN, 2006; ESSERS;
VERMEULEN; HOUTSMULLER, 2006).
1.2 Epidemiologia do câncer
A Sociedade Norte-americana de Câncer contabiliza anualmente mais 1,5 milhões de
óbitos. Nesse país foram esperados para o ano de 2008, cerca de 1.437.180 de novas
ocorrências, com estimativa de 565.650 mortes pela doença (JEMAL et al., 2008).
Há muitos anos, o câncer firmou-se como um importante fator de mortalidade em todo
o planeta, sendo a segunda causa de morte no Brasil, atrás apenas das doenças
cardiovasculares. As últimas estimativas referentes à população brasileira apontam para o
surgimento de 466.730 novos casos de câncer, para o ano de 2009, onde o câncer de pele do
tipo não-melanoma representará cerca de 115 mil novos casos estimados, além deste, outros
tipos mais incidentes serão os cânceres de próstata (49 mil) e de pulmão (27 mil) no sexo
masculino e os cânceres de mama (49 mil) e de colo do útero (19 mil) no sexo feminino. Os
dados acompanham o mesmo perfil da magnitude observada no mundo (DONNICI et al.,
2005; INCA, 2008).
1.3 O ciclo celular e o câncer
O processo dinâmico celular, que ocorre de forma ordenada, pode ser mais bem
compreendido avaliando-se o curso da vida, onde uma célula surge quando ocorre a fusão ou
26
divisão de duas células. Esses eventos se iniciam por ocasião de um programa de replicação, o
qual envolve um período de crescimento seguido pela divisão, sendo denominado ciclo
celular (ALMEIDA et al., 2005).
Howard e Pele (1951) descreveram pela primeira vez o ciclo celular e o dividiram
didaticamente em duas fases distintas respectivamente denominadas de mitose e de interfase.
Com o passar dos anos, cada uma das fases foi mais bem caracterizada e os diferentes
mecanismos envolvidos paulatinamente desvendados. Resumidamente pode-se caracterizar a
mitose como uma fase distributiva e a interfase como uma fase preparatória. Durante a
interfase ocorre a síntese do DNA e este período recebe a denominação de fase S. Aos dois
intervalos de tempo entre a fase M e a fase S atribuíram-se os nomes de fase G1 e G2,
respectivamente (GOLIAS; CHARALABOPOULOS; CHARALABOPOLOS, 2004;
REHEN, 2007).
O ciclo celular é um processo evolutivo-conservativo, utilizado por todas as células
eucariotas para controlar o crescimento e divisão celular. A estimulação para o crescimento
inicia-se com a liberação de fatores, os quais se ligam a receptores na membrana da célula e
desencadeiam uma cascata de proteínas transdutoras de sinal. Essa seqüência de eventos
impulsiona a célula através do ciclo celular, que é constituído de quatro estágios: duas fases
de intervalos denominadas G1 e G2, em que ocorrem à síntese de RNA e de proteínas; uma
fase S, onde acontece a formação e replicação do DNA, e uma fase dita M, onde a célula
executa o processo de divisão em duas células filhas, conhecido por mitose (CRECZYNSKI-
PASA; PEDROSA, 2001; FOSTER, 2008).
Normalmente a proliferação é ordenada finamente por uma série de mecanismos, o
que permite ou inibe a progressão do ciclo em cada fase. Na fase G1 (“gap”: intervalo), as
células monitoram o ambiente interno e externo, produzindo nucleotídeos, enzimas,
descondensando cromossomos e garantindo uniformidade morfológica do núcleo, ou seja,
preparando-se para a síntese de DNA, ou a permanência no estado de quiecência (G0), que é
um estágio de extensão variável, onde a célula executa seu papel normal no organismo (célula
em repouso). Ainda no intervalo G1 (fase de reentrada no ciclo), observa-se a síntese de RNA
e proteínas, geralmente, sendo considerado o período mais longo do ciclo (Figura 1). Antes
de progredir para a fase seguinte, a célula deve vencer um ponto crítico (ponto de restrição)
conhecido por G1/S (FOSTER, 2008; MALUF; POMPEIA, 2005).
Em seguida, a célula progride para a fase S (síntese), que é um processo lento e
irreversível, onde ocorre efetivamente a replicação do conteúdo genético. Nessa etapa, a
enzima topoisomerase é imprescindível para o processo de separação das fitas de DNA-filhas,
27
sendo o momento em que se pode estudar o ciclo celular por meio da incorporação de
timidina tritiada em tecido ou em cultura, pela técnica de BrdU, a qual, permite quantificar o
número de células em proliferação (ALBERT; LEHNINGER; NELSON, 2006; FOSTER,
2008; PELLEGRINI; PINTO; CASTILHO, 2008).
Tão logo se complete a duplicação do DNA, dá-se início a fase G2, na qual, a célula
produz proteínas e RNA, organizando-se para a separação ou duplicação propriamente dita
que ocorrerá na fase M. Juntas, as fases G1 e G2 proporcionam um período adicional para a
célula crescer e duplicar suas organelas citoplasmáticas (KUMAR et al., 2005).
Dentre os sinais, o que aponta a entrada da célula na fase M é a progressiva
condensação dos cromossomos, facilitando assim a separação durante a mitose (PERDIGÃO;
TAVARES, 2001; PINTO; FELZENSZWALB, 2003; REHEN, 2007).
1.4 O processo de divisão celular
Durante o crescimento embrionário e o desenvolvimento posterior, a divisão celular
ocorre, em todo tecido. No organismo adulto, a maior parte dos tecidos torna-se quiescente. A
“decisão” da célula em se dividir ou não é de crucial importância para o organismo. A divisão
celular normal requer uma seqüência precisamente ordenada e eventos bioquímicos que
garantam a cada célula-filha um complemento inteiro das moléculas requeridas para a vida.
Investigações sobre o controle da divisão celular em diversas células eucarióticas têm
revelado mecanismos universais, sendo que as proteínas quinases e os mecanismos de
fosforilação de proteínas são considerados elementos centrais e determinam o tempo de
entrada na divisão celular garantindo a passagem ordenadamente através dos eventos que
formam todo o processo de divisão (ALBERT; LEHNINGER; NELSON, 2006).
A mitose é o mecanismo utilizado para a partilha do genoma, em células eucarióticas,
de forma igualitária. Nesse estágio, surgem dois eventos significativos, componentes da fase
M (mitose), do ciclo celular que correspondem à separação dos cromossomos filhos e à
divisão da célula em duas (citocinese). Notadamente, o aparato mitótico é uma estrutura
temporária que existe apenas durante a mitose para distribuição do material genético, embora
alguns eventos desdobrem-se continuamente, eles se encontram divididos em quatro estágios,
representando fases do movimento cromossômico (MOGILNER et al., 2006; NAKAYAMA;
NAKAYAMA, 2006).
Durante o primeiro subestágio, prófase, os cromossomos replicados, (cada um
abrangendo duas cromátides idênticas), são condensados dentro de arranjos compactos e
28
então liberados para o citoplasma, quando a membrana nuclear é rompida. Além disso, os
nucléolos ficam menos evidenes, ocorre ainda ganho de liquido pelo núcleo com
desorganização da carioteca, enquanto os centríolos começam a organizar o fuso de divisão
(MOGILNER et al., 2006; RUCHAUD; CARMENA; EARNSHAW, 2007).
No passo seguinte, metáfase, os cromossomos atingem o grau máximo de
espiralização, estando dispostos na região equatorial da célula, nesse momento as fibras do
fuso prendem-se aos centrômeros nos cromossomos. Na etapa da anáfase, cada par de
cromátides, move-se para lados opostos devido ao encurtamento das fibras do fuso
(movimento anafásico). Finalmente, os cromossomos já separados iniciam o processo de
desespiralização, ocorrendo também o reaparecimento dos nucléolos e a neoformação de uma
membrana em torno de cada conjunto de cromossomos (carioteca), caracterizando assim a
telófase (Figura 1). A divisão do citoplasma, denominada citocinese, produz, então, duas
células-filhas, cada uma com um complemento 2n do material genético original (SCHOLEY,
2003; REHEN, 2007).
29
Figura 1 – Ilustração esquemática mostrando as fases do ciclo e divisão celular. Evidenciam-se a duplicação do
DNA e segregação cromossômica, as ciclinas e quinases ciclina-dependentes envolvidas na regulação da
transição entre as etapas do ciclo celular. Fonte: Adaptado de RUCHAUD, CARMENA e EARNSHAW (2007);
PERDIGÃO e TAVARES (2001).
A duração de um ciclo celular varia muito de acordo com o tipo celular. Em células de
mamífero em cultivo, por exemplo, apresenta a fase G1 tem duração de 5 horas
aproximadamente, a fase S ocorre em 7 horas, enquanto as fases G2 e M ocorrem em 3 e 1
hora, respectivamente. Os períodos S, G2 e M são relativamente constantes para a maioria dos
tipos celulares, sendo G1 o que mais varia, podendo durar dias, meses ou anos, isso dependerá
da fase de latência, G0 (REHEN, 2007).
30
1.5 Os microtúbulos – estrutura, função e importância para as células
Microtúbulos, juntamente com filamentos intermediários e de actina são os principais
componentes de citoesqueleto em todas as células eucarióticas. Essas estruturas são únicas
para cada célula, estando rearranjadas em forma cilíndrica (Figura 2), contendo, geralmente,
13 protofilamentos e apresentando um diâmetro de 24 nm (MITRA; SEPT, 2008).
Figura 2 – Formação, estrutura e estabilização dos microtúbulos. Fonte: Adaptado de SOUZA (2004); JORDAN
e WILSON (2004).
Os microtúbulos são estruturas tubulares rígidas, que se apresentam em longos
filamentos de actina e intermediários, constituídos por polímeros de proteínas (tubulinas) de
aproximadamente 440 aminoácidos cada uma, com dimensões de 4 nm X 5 nm X 8 nm e
31
massa molecular de aproximadamente 50 kDa (McGROGAN et al., 2008; SCHIMIDT;
BASTIANS, 2007; ZHOU; GIANNAKAKOU, 2005a).
Presente em todas as células eucariotas, a tubulina existe sob a forma heterodimérica
αβ ou microtubular, pertencendo a uma antiga família de GTPases que polimerizam formando
um esqueleto de estrutura cilíndrica oca associado a proteínas denominadas PAMs – proteínas
associadas aos microtúbulos (MOGILNER et al., 2006).
Cada monômero de α e β tubulina consiste de três domínios funcionais: o domínio N-
terminal (constituído de 206 resíduos) o qual forma uma estrutura conhecida como Rossman
ligado a seis lâminas β paralelas e hélices (H1-H6) envolvido no nucleotídeo ligando
(GDP/GTP) (McGROGAN et al., 2008; ORR; VERDIER-PINARD, 2003).
O domínio central (resíduos 207-384) é formado pela mistura de quatro lâminas β (S7-
S10) e três hélices (H8-H10) e são envolvidos na porção longitudinal e lateralmente
contactando os monômeros de α e β tubulina na formação dos protofilamentos. Além disso, o
domínio central mostra ainda duas hélices antiparalelas (H11 e H12) apresentando 385
resíduos, o qual está implicado na ligação de proteínas associadas aos microtúbulos (PAMs)
como: a tau, a PAM2, a estatimina, a CENP-E (conhecida como quinesina 7) e a quinesina
mitótica Eg5 (conhecida como KSP ou quinasina proteína do fuso) (MIYAMOTO et al.,
2003; ORR; VERDIER-PINARD, 2003).
As duas subunidades α e β da tubulina são organizadas entre si por ligação de
hidrogênio pela região –CO2H terminal da subunidade β e a região terminal NH2 da
subunidade α, sendo a formação dos microtúbulos realizada pelo rearranjo regular em
cilindros flexíveis, obtidos em duas etapas: iniciação e elongação (HAMMEL et al., 1996;
JORDAN; WILSON, 2004; FOJO; MENEFEE, 2007).
Todos os protofilamentos num microtúbulo estão polarmente arranjados na forma
cabeça-com-cauda dos dímeros α e β-tubulina, ou seja, têm a mesma orientação, enquanto
uma extremidade está envolvida pela α-tubulina, a outra se encontra envolvida pela β-
tubulina (Figura 3). As subunidades diméricas de α e β tubulina interagem longitudinalmente
para formar os protofilamentos, os quais se associam lentamente em microtúbulos exibindo
polaridade estrutural e funcional (JORDAN; WILSON, 2004; BARTOLINI; GUNDERSEN,
2009; HAWKINS et al., 2009).
32
Figura 3 – Processo de montagem e estruturação dos microtúbulos em células eucarióticas de mamíferos. Fonte:
HAWKINS et al., 2009.
1.6 A dinâmica dos microtúbulos
As interações que mantêm α e β-tubulina num complexo heterodimérico são
suficientemente fortes a ponto de ser rara a dissociação das subunidades das proteínas em
condições normais. Cada subunidade de tubulina liga duas moléculas de GTP. Um sítio de
ligação do GTP localizado na α-tubulina liga-se irreversivelmente ao GTP e não hidrolisa
essa molécula enquanto o segundo sítio, denominado permutável localizado na β-tubulina,
liga-se ao outro GTP reversivelmente, hidrolizando-o em GDP regulando a adição de novas
subunidades de α e β-tubulina aos microtúbulos (MOGILNER et al., 2006; McGROGAN et
al., 2008).
Os centros de organização dos microtúbulos (MTOC), inclusive centrômeros e corpos
basais nucleiam a montagem de microtúbulos do citosol celular que pode oscilar entre as fases
33
de crescimento e encurtamento. Logo que os microtúbulos são montados a estabilidade da
estrutura fica na dependência da temperatura, assim, quando resfriados a temperatura até 4°C,
ocorre a despolimerização dos dímeros estáveis de α e β-tubulina, e, quando aquecidos até
37°C em presença de GTP, os dímeros se polimerizam em microtúbulos (JORDAN;
WILSON, 2004; MOGILNER et al., 2006).
Além disso, a iniciação e elongação dos protofilamentos ocorrem na presença de
proteínas associadas aos microtúbulos (PAM), Mg+2 e trifosfato de guanosina (TFP), sendo o
processo reversível em presença de Ca+2 a baixas temperaturas, em torno de 0°C – Figura 2 –
(SOUZA, 2004; MONGILER et al., 2006; McGROGAN et al., 2008; MITRA; STEP, 2008).
A montagem e desmontagem de microtúbulos depende da concentração critica de
subunidades de α e β-tubulina, sendo um processo especificamente orientado e programado,
assim quando os monômeros estão acima da concentração crítica ocorre a montagem da
estrutura, enquanto em baixas concentrações observa-se o processo de desmontagem
(McGROGAN et al., 2008; PAMPALONI; FLORIN, 2008).
Vale salientar que a polimerização dos microtúbulos é favorecida por uma
proteinoquinase dependente de AMP cíclico que promove a fosforilação dos monômeros de
tubulina. A montagem de monômeros de tubulina é um fenômeno polarizado, isto é, dímeros
se unem a um dos extremos dos microtúbulos enquanto se desprendem um do outro
(BARTOLINI; GUNDERSEN, 2009).
A estruturação polar dos microtúbulos mostra duas extremidades distintas, uma
extremidade (+) de crescimento rápido e uma extremidade (-) de crescimento lento, a
extremidade (+) é cineticamente mais dinâmica que a extremidade (-). Além disso, a
organização da estrutura microtubular ocorre pela adição, às extremidades livres, de
moléculas de tubulina contendo GTP. A hidrólise do GTP em GDP acontece depois da
ligação da tubulina e enfraquece as pontes que mantém os microtúbulos unidos (HADFIELD
et al., 2003; JORDAN; WILSON, 2004).
Os microtúbulos apresentam equilíbrio instável com o pool de dímeros de tubulina
solúveis presentes na célula. Por sua vez, os dímeros polimerizam e despolimerizam
constantemente (há constantemente incorporação de dímeros livres nas estruturas
polimerizadas e libertação de dímeros para o pool de tubulina solúvel) e assim os
microtúbulos podem sofrer ciclos rápidos de formação ou desagregação. Desta forma, as
extremidades dos microtúbulos têm a capacidade de permutar rapidamente entre os estágios
de crescimento e encurtamento, tanto em células in vivo e in vitro, este fenômeno,
denominado de instabilidade dinâmica, constitui uma propriedade essencial dos microtúbulos.
34
A polimerização dos dímeros de tubulina pode ser influenciada por fatores como a guanosina
trifosfato, o ambiente iônico e as PAMs (McGROGAN et al., 2008; MITRA; STEP, 2008).
A primeira fase da formação dos microtúbulos (fase de nucleação) é lenta. Na
presença de Mg+2 e GTP, a tubulina α e β agrega-se formando protofilamentos com as
subunidades α e β alternadas. A segunda fase (fase de elongação) ocorre de forma
relativamente rápida (JORDAN; WILSON, 2004; McGROGAN et al., 2008).
Para a heterodimerização da tubulina e para a associação de tubulinas na formação de
microtúbulos, o GTP tem de estar ligado a ambas as subunidades α e β. O GTP ligado à
tubulina é hidrolisado a GDP durante ou imediatamente após a polimerização, o que
enfraquece a afinidade de ligação da tubulina a moléculas adjacentes e favorece a
despolimerização contribuindo para o comportamento dinâmico dos microtúbulos. Os
heterodímeros podem associar-se ou dissociar-se a ambas as extremidades de um
microtúbulo, no entanto há uma maior tendência para a associação ocorrer na extremidade de
crescimento rápido onde a β-tubulina está exposta (McGROGAN et al., 2008).
Os microtúbulos podem sofrer um processo de formação e desagregação simultâneo,
em que as moléculas de tubulina (ligadas ao GDP) são continuamente libertadas da
extremidade (-), sendo repostas por ligação de moléculas de tubulina (ligadas ao GTP) à
extremidade (+) do mesmo microtúbulo, sendo que, este fenômeno parece ser crítico para o
movimento polar dos cromossomos durante a anáfase (JORDAN; KAMATH, 2007;
McGROGAN et al., 2008).
Durante a formação dos microtúbulos, os ciclos alternados de formação e
desagregação promovem uma instabilidade dinâmica que é critica para direcionar os
microtúbulos para os locais alvos, como por exemplo: os cinetocoros. A instabilidade
dinâmica, um fenômeno altamente regulado, é particularmente crítica na remodelação do
citoesqueleto durante a mitose (JORDAN; WILSON, 2004; McGROGAN et al., 2008).
A adição e a perda de subunidades ocorrem preferencialmente na extremidade (+),
onde o equilíbrio entre o crescimento e o encurtamento depende do GTP permutável ligado a
β-tubulina ou se o GTP foi hidrolisado a GDP + Pi – Figura 4 – (JORDAN; WILSON, 2004;
McGROGAN et al., 2008; HOWKINS et al., 2009).
35
Figura 4 – A dinâmica de polimerização e despolimerização dos microtúbulos. (A) Associação dos
heterodímeros α e β da forma cabeça-cauda. (B) Enlongamento da forma cilíndrica apresentando os 13
protofilamentos com as porções terminais (+) e (-) onde heterodímeros α e β na presença do GTP ligam-se a
porção (+) com a formação de GDP + Pi e formação da porção terminal. (C) Estabilização da porção terminal
dos microtúbulos – efeito dos taxanos. (D) A despolimerização ocorre quando a porção terminal GTP/GDP + Pi
é perdida, o Pi liberado da tubulina promove desestabilização e dissociação dos heterodímeros na porção
terminal (+) – efeito dos alcalóides da vinca. Fonte: Adaptado de JORDAN e WILSON (2004); McGROGAN et
al. (2008).
Os microtúbulos apresentam inúmeras funções incluindo manutenção da arquitetura
celular, organização da estrutura e transporte intracelular, sendo absolutamente necessários ao
processo de divisão celular (mitose), usado para formar uma estrutura estática chamada de
citoesqueleto, o qual dá forma à célula e determina a posição das organelas, além disso, as
propriedades dinâmicas dos microtúbulos são usadas para transmitir sinais celulares,
reorganizar organelas, proporcionar mobilidade às células, intervir no processo de secreção
36
celular e angiogênese (LIEKENS; DE CLERCQ; NEYTS, 2001; HAIT et al., 2007;
MORRIS; FORNIER, 2008; SABBATINI; SPRIGGS, 2009).
Estes papéis tornam os microtúbulos alvos altamente efetivos no tocante à descoberta
de agentes antimitóticos que possam ser utilizados no combate ao câncer incluindo neste rol
os taxanos, os alcalóides da vinca, os novos taxanos como as epotilonas, além da
combretastatina e seus derivados, incluindo as fenstatinas (ÁLVAREZ et al., 2008;
McGROGAN et al., 2008; PASQUIER; HONORE; BRAGUER, 2006).
1.7 As mitocôndrias – importância como alvos terapêuticos
As mitocôndrias ocupam aproximadamente 25% do volume do citoplasma celular,
sendo complexas estruturas que atuam como “casas de força” produzindo ATP durante o
metabolismo aeróbico. Constituídas por duas membranas uma externa (permeável a moléculas
de até 10.000 Daltons), e outra interna (com grande quantidade de invaginações) – formada
pelas cristas mitocondriais (CHAN, 2006).
Essas organelas possuem na membrana externa o CVDA (canal de voltagem
dependente de ânion) que regula a entrada e saída de diferentes componentes na organela, e
atuam no metabolismo energético celular onde os componentes da cadeia respiratória
localizados na membrana interna da mitocôndria sob a forma de quatro complexos proteína-
lípidos, o complexo I (NADHubiquinona oxidoreductase) com mais de 40 polipéptidos, o
complexo II (succinato-ubiquinona oxidoreductase), o complexo III (ubiquinolcitocromo c
oxidoreductase), o complexo IV (citocromo c oxidase), bem como o complexo V, ATP
sintetase (Figura 5), formam o sistema de fosforilação oxidativa, que fornece o ATP
necessário à célula (PATHANIA; MILLARD; NEAMATI, 2009).
37
Figura 5 – Esquema representando o transporte de elétrons e fosforilação oxidativa. Elétrons entre a cadeia
transportadora de elétrons (CTE) nos complexos I e II, sob a forma de NADH e FADH2, respectivamente. No
processo, os complexos I, III e IV bomba de prótons através da membrana mitocondrial interna. Acúmulo de
prótons no espaço intermembranar cria um gradiente de carga que é utilizada no V Complex (ATP sintase) para
conduzir a síntese de ATP em ADP e Pi. Inibidores específicos dos complexos são exibidos em negrito. Fonte:
PATHANIA; MILLARD; NEAMATI, 2009.
1.8 Os padrões de morte celular
Durante muito tempo, a morte celular foi considerada um processo passivo de caráter
degenerativo, que ocorre em situações de lesão celular, infecção e ausência de fatores de
crescimento. Conseqüentemente, a célula altera a integridade da membrana plasmática,
aumenta o seu volume e perde funções metabólicas vitais. No entanto, nem todos os eventos
de morte celular são processos passivos. Os organismos pluricelulares são capazes de induzir
a morte celular programada como resposta a estímulos intracelulares ou extracelulares
(HANGEARTNER, 2000).
38
Os processos de morte celular podem ser classificados de acordo com suas
características morfológicas e bioquímicas em: autofagia, mitose catastrófica, senescência, e
em destaque apoptose e necrose (Figura 6). Vale salientar que alterações na coordenação
desses tipos de morte celular estão implicadas em tumorigênese (CASTEDO et al., 2004;
OKADA; MAK, 2004; RICCI; ZONG, 2006).
A autofagia é um processo adaptativo e conservado evolutivamente, sendo controlado
geneticamente. Ocorre em resposta a quadros de estresse metabólico, resultando na
degradação de componentes celulares (DANIAL; KORSMEYER, 2005). O desencadeamento
do processo ocorre quando porções do citoplasma são encapsuladas pela membrana,
originando os autofagossomos, em seguida estes são fundidos aos lisossomos que os
degradam por ação das hidrolases (KELEKAR, 2005).
O quadro de mitose catastrófica envolve uma mitose aberrante, resultando em
segregação cromossômica errônea. É considerada um tipo de sinalização irreversível para a
morte celular (WEAVER; CLEVELAND, 2005).
39
Figura 6 – Vias de morte celular. As células saudáveis respondem aos estímulos de que conduzem ao
desencadeamento de eventos críticos alcançando o resultado final apropriado ao estímulo recebido. Em destaque
as mortes celulares por apoptose, autofagia, oncose (necrose) e piroptose. Fonte: Adaptado de FINK e
COOKSON (2005).
A senescência é um processo metabólico ativo essencial para o envelhecimento, ocorre
por ocasião de uma programação genética que envolve deterioração dos telômeros e ativação
de genes supressores tumorais. As células que entram em senescência perdem a capacidade
proliferativa após um determinado número de divisões (MOOI; PEEPER, 2006).
A necrose aparece como resultado de uma disfunção celular aguda em resposta a
condições severas de estresse ou depois da exposição a agentes tóxicos. É um processo
40
relativamente passivo, associado com a rápida depleção de ATP celular (SERGEY et al.,
2003). Morfologicamente, a necrose é caracterizada pelo aumento do volume celular e ruptura
da membrana plasmática, em que todo o conteúdo intracelular extravasa para o meio
intercelular (FINK; COOKSON, 2005). Esta saída do conteúdo de células mortas para o
espaço extracelular pode causar dano ao tecido, por afetar as células vizinhas ou por atrair
células pró-inflamatórias à lesão (RICCI; ZONG, 2006).
O conceito de morte celular programada foi proposto pela primeira vez por Lockshin e
Williams (1965), para indicar uma forma não acidental de morte celular, porém Kerr, Wyllie e
Currie (1972) sugeriram o termo apoptose, que é uma palavra de origem grega que quer dizer
“cair fora” ou “folhas caindo das árvores no outono”, para indicar esse tipo de morte, um tipo
de “suicídio celular” (GREEN; KROEMER, 2004; MALUF; POMPEIA, 2005). Além disso,
este é um mecanismo de defesa para remover células infectadas, mutadas, supérfulas ou que
sofreram algum dano, prevenindo processos patológicos como a imunodeficiência, a auto-
reatividade imune e o câncer (GUPTA, 2001; BAETU; HISCOTT, 2002; JOZA; KROEMER;
PENNINGER, 2002).
O fenômeno da apoptose pode ser reconhecido por algumas características
morfológicas marcantes e coordenadas, em pouco tempo, pode ser observado: retração celular
e conseqüente perda de aderência com a matriz extracelular e células vizinhas. As organelas
mantêm a morfologia, porém, em alguns casos as mitocôndrias podem apresentar ruptura na
membrana externa. A cromatina sofre condensação, concentrando-se junto à carioteca, que até
esse ponto se mantém intacta. Além disso, na membrana plasmática, formam-se
prolongamentos (blebs), os quais aumentam de tamanho e rompem, originando estruturas
contendo conteúdo celular (corpos apoptóticos), sendo rapidamente fagocitados por
macrófagos e removidos sem causar processo inflamatório (ZIEGLER; GROSCURTH,
2004). O núcleo se desintegra em fragmentos envoltos pela membrana celular, fragmentação
internucleossômica do DNA, a qual possui um padrão característico, fragmentos sempre
múltiplos de 200 pares de base (SARASTE; PULKKI, 2000; MATTIOLI et al., 2006).
As alterações morfológicas observadas (Tabela 2) são conseqüências de uma cascata
de eventos moleculares e bioquímicos específicos e geneticamente regulados, onde a apoptose
pode ser deflagrada por estímulos externos, por meio de receptores específicos, denominados
receptores de morte ou por estímulos internos de estresse intracelular, tais como, lesão do
DNA, ou perturbações no ciclo celular ou nas vias metabólicas (KUMAR et al., 2005).
41
Tabela 2 – Diferenças básicas entre apoptose e necrose
APOPTOSE VERSUS NECROSE Estímulo
Fisiológico (Ativação de vias bioquímicas, geneticamente reguladas) ou patológico
Patológico (Ambiente hostil ou agressão)
Ocorrência Acomete células individuais, desencadeando a eliminação seletiva de células patológicas
Acomete um grupo de células. Fenômeno degenerativo, conseqüência de lesão celular severa e irreversível
Reversibilidade Fenômeno torna-se irreversível após o “ponto de retorno”, com a deposição de material floculento e amorfo na matriz mitocondrial (liberação do citocromo c)
Irreversível, após ativação de endonucleases
Liberação de enzimas lisossômicas Ausente Presente
Características bioquímicas Processo envolvendo ativações e muitas vias enzimáticas
Perda de regulação iônica com severas alterações homeostáticas
Dependente de energia (ATP) Processo Passivo (sem necessidade de energia)
Fragmentação de DNA definida Digestão do DNA por endonucleases Pré fragmentação de DNA Pós fragmentação de DNA
Características morfológicas Membrana plasmática intacta; a estrutura encontra-se alterada, especialmente a orientação dos lipídios
Membrana plasmática danificada com conseqüente perda de integridade
Agregação da cromatina à membrana celular Floculação da cromatina Condensação celular (encolhimento celular) Inchaço da célula seguido de lise (edema) Formação de vesículas com membrana (corpos apoptóticos)
Lise completa sem formações de vesículas
Sem desintegração das organelas Desintegração das organelas Características fisiológicas
Morte de células individuais induzida por estímulos fisiológicos; (atividade programada)
Morte de grupos celulares evocado por distúrbios não fisiológicos
Fagocitose por células adjacentes ou macrófagos
Fagocitose por macrófagos
Resposta não inflamatória Resposta inflamatória freqüente Adaptado de KUMAR et. al. (2005)
As caspases (cysteine-dependent aspartate-specific proteases) pertencem à família das
cisteínas proteases que tem a capacidade de reconhecer e clivar substratos que possuam
resíduos de aspartato, levando à condensação, fragmentação nuclear e externalização de
fosfolipídios de membrana que irão sinalizar para estas células serem fagocitadas por
macrófagos (BOATRIGHT; SALVESEN, 2003; NICHOLSON; THORNBERRY, 1997).
42
As caspases encontram-se divididas em duas classes: as caspases iniciadoras (2,8,9 e
10) e as caspases efetoras (3,6 e 7), sendo essa classificação baseada na estrutura e
funcionalidade (BOATRIGHT; SALVESEN, 2003). Após um sinal de morte celular as
caspases são ativadas por clivagem proteolítica, onde podem interagir com receptores de
membrana ou moléculas adaptadoras que contenham domínios de morte (death domain).
Além disso, as caspases recebem denominações de acordo com o pró-domínio apresentado e
função no evento apoptótico (DIMRI, 2005). Caspases ditas iniciadoras possuem pró-
domínios longos (envolvidos na iniciação da cascata proteolítica), enquanto as efetoras
apresentam pró-domínios curtos ou inexistentes, os quais são responsáveis pela clivagem de
substratos (RUPNARAIN et al., 2004). Alguns substratos como a proteína p53 ao sofrerem
clivagem pelas caspases, se translocam para o núcleo, ativando a transcrição de genes pró-
apoptóticos como, por exemplo, a proteina Bax (SCHULER; MAURER; GOLDSTEIN,
2003; DEBATIN, 2004).
Embora o câncer exiba características muito heterogêneas, todos os tumores malignos
adquiriram a propriedade de crescer além dos limites impostos às células normais. A
expansão clonal de uma célula transformada depende de um descontrole da sua capacidade
proliferativa e de uma crescente incapacidade de morrer por apoptose.
Portanto, apesar da enorme variabilidade do câncer, evidências demonstram que a
resistência a apoptose é uma das características mais marcantes da maioria dos tumores
malignos (DIMRI, 2005; OKADA; MAK, 2004).
Resultados de diferentes estudos indicam que a survivina é um fator celular envolvido
na quimiorresistência e radiorresistência em tumores humanos, sugerindo que a inibição dessa
proteína pode levar a uma sensibilização aos tratamentos contra o câncer (ZAFFARONI;
PENNATI; DAIDONE, 2006).
1.9 Vias de ativação da apoptose
Dentre os eventos bioquímicos mais frequentemente observados durante a apoptose,
estão: ativação de caspases, permeabilização das membranas mitocondriais com vazamento de
diversas moléculas, ativação de fosfatidilserina e promoção da interligação de proteínas
(crosslinking) (PELLEGRINI; PINTO; CASTILHO, 2008).
Existem muitos fatores que podem desencadear o processo apoptótico, suprimindo
genes antiapoptóticos e ativando genes pro-apoptóticos, entre eles destacam-se: ligação de
moléculas a receptores de membrana, agentes quimioterápicos, radiação ionizante, danos no
43
DNA, choque térmico, privação de fatores de crescimento, baixa quantidade de nutrientes e
níveis aumentados de espécies reativas do oxigênio. A deflagração da apoptose pode ser
iniciada de duas diferentes maneiras: pela via extrínseca (citoplasmática) ou pela via
intrínseca (mitocondrial). Ambas apresentam três fases: a iniciação, a decisão e a degradação
(BAETU; HISCOTT, 2002; HANGEARTNER, 2000).
1.9.1 Via extrínseca do processo apoptótico
A via extrínseca é mais especializada sendo desencadeada pelo acoplamento de
ligantes específicos a um grupo de receptores de membrana pertencentes à duas superfamílias
de proteínas: a família dos receptores de fatores de necrose tumoral (rTNF) e a dos receptores
destes ligando (FULDA; DEBATIN, 2006). Esta ligação é capaz de ativar a cascata das
caspases (BRÖKER; KRUYT; GIACCONE, 2005). Os membros da família rTNF possuem
um subdomínio extracelular rico em cisteína, o qual permite que eles reconheçam seus
ligantes. Isso ocorre devido a trimerização e conseqüente ativação dos receptores de morte
específicos, em seguida, a sinalização é mediada pela porção citoplasmática desses receptores
que contém uma seqüência de 65 aminoácidos, chamada "domínio de morte" sendo, por isso,
conhecidos por "receptores de morte celular" (FULDA; DEBATIN, 2006). Alguns membros
envolvidos na indução de apoptose são: FasL (Fas ligante), fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α), ligante do receptor de TNF indutor de apoptose (HENGARTNER, 2000).
Quando os receptores de morte celular reconhecem um ligante específico, os seus
domínios de morte interagem com moléculas conhecidas como FADD/MORT-1. Essas
moléculas podem recrutar então a caspase-8 que por sua vez poderá ativar pode clivar o Bid,
uma proteína pró-apoptótica da família Bcl-2, convertendo-a para a forma truncada e ativa
(tBid) desencadeando o processo de homo-oligomerização e translocação de proteínas pró-
apoptóticas da família Bcl-2 (Bak e Bax), para a mitocôndria, ativando a via intríseca –
Figura 7 – (LI et al., 1998; JIANG; WANG, 2004; BAETU; HISCOTT, 2002).
44
Figura 7 – Vias extrínseca e intrínseca da apoptose. Fonte: HANGEARTNER (2000).
1.9.2 Via intrínseca do processo apoptótico
A via intrínseca inicia-se na mitocôndria podendo ser representada também pelo
reticulo endopalsmático. Há várias teorias que tentam explicar como os mais variados agentes
podem ativar por estresse intracelular ou extracelular como a ausência de fatores de
crescimento, danos no DNA, hipóxia ou ativação de oncogenes. Os sinais que são
transduzidos em resposta a estes insultos convergem principalmente para a mitocôndria,
disparando a fase de iniciação. Inúmeros estudos sobre apoptose apontam a mitocôndria como
o principal mediador desse tipo de morte. Essa organela integra os estímulos de morte celular,
induzindo ao aumento da permeabilização mitocondrial e conseqüente liberação de moléculas
45
pró-apoptóticas nela presentes, porém o mecanismo de origem ainda permanece controverso
(ELMORE, 2007; WALLACE, 2008).
Quando sinais de morte alcançam à mitocôndria, alteram o potencial da membrana
mitocondrial interna (∆Ψ) devido a formação de megaporos, bem como a uma transição da
permeabilidade mitocondrial (TPM). Ao mesmo tempo, a água do espaço entre membranas
passa para a matriz mitocondrial, levando ao aumento do volume e à ruptura da organela e
conseqüente liberação de componentes internos mitocôndrias, (citocromo c e Smac/Diablo)
proteínas pró-apoptóticas para o citoplasma (KIM et al., 2007). O Smac/Diablo é capaz de
inativar inibidores endógenos da apoptose. (MALUF; POMPEIA, 2005).
Além da liberação de moléculas pela mitocôndria, ocorre o colapso do potencial
transmembrânico de mitocôndria (∆Ψm) e da TPM levam à perda da homeostasia celular,
interrompendo a síntese de ATP (devido à interrupção de forma indireta da cadeia
transportadora de elétrons) e aumentando a produção de espécies reativas do oxigênio
(EROS). O aumento nos níveis de EROS leva à oxidação de lipídios, proteínas e ácidos
nucléicos, causando o colapso do potencial transmembrânico de mitocôndria (∆Ψm) – Figura
7 – (ELMORE, 2007; PELLEGRINI; PINTO; CASTILHO, 2008).
A resposta mitocondrial ao dano oxidativo é uma importante via para o gatilho incial
apoptótico. Além disso, as espécies reativas de oxigênio (EROS) induzem a ativação das
caspases -9 e -3, enquanto, estudos indicam que durante a apoptose ocorre a formação de um
megaporo que contém diversas proteínas e abrange as membranas interna e externa da
mitocôndria (GOTTLIEB, 2001; BRÖKER; KRUYT; GIACCONE, 2005; YAMAGUCHI;
PERKINS, 2009).
Inúmeros sinais indutores de apoptose estimulam a mitocôndria, fazendo com que
ocorra um desacoplamento da cadeia respiratória e conseqüente liberação de citocromo c e
proteínas ativadoras da apoptose para o citosol, o qual forma um complexo com a APAF-1 e a
caspase-9, o chamado apoptossomo, que promove a clivagem da pró-caspase-9, liberando a
caspase-9, que uma vez estimulada ativa a caspase-3 que deflagrará o fenômeno apoptótico
(SCHULER; MAURER; GOLDSTEIN, 2003; RUPNARAIN et al., 2004; KIM et al., 2007;
YAMAGUCHI; PERKINS, 2009).
Mais recentemente, foi descrita a participação, na via mitocondrial, de uma
flavoproteína conhecida por Fator Indutor de Apoptose (AIF). A AIF migra da mitocôndria
para o núcleo após um estímulo de apoptose e induz a condensação da cromatina e
46
fragmentação do DNA (pares de base) em fragmentos de 50 kDa, independente da ativação
das caspases (KIM et al., 2007).
Na verdade, a via responsável pela sinalização entre o rompimento/estabilização dos
microtúbulos e a via mitocondrial permanece em grande parte desconhecida (VITALE et al.,
2009). Neste sentido, foi levantada a hipótese que existem vários fatores que induzem
mudanças na polimerização dos microtúbulos disponíveis para interagir com alvos específicos
(KROEMER; MARTIN, 2005). Agentes estabilizadores de microtúbulos, tais como
paclitaxel, são capazes de ativar a apoptose por via extrínseca em células de câncer de pulmão
(H460), envolvendo ativação de receptores de morte, na fase inicial do tratamento, e caspase-
8 (VITALE et al., 2009).
Outros agentes como os alcalóides da vinca e a colchicina modificam o citoesqueleto
afetando o sistema de tubulina/microtúbulos. Em células cancerosas, ambas as classes
suprimem a dinâmica dos microtúbulos causando instabilidade na formação da tubulina,
ativando o mecanismo de morte celular por via intrínseca ou mitocondrial (ESTEVE;
CARRE; BRAGUER, 2007).
1.10 Novos agentes citotóxicos
Em meados de 1950 foi realizada uma das primeiras pesquisas sistemáticas em larga
escala com rastreamento de drogas anticancer, organizada naquela ocasião pelo Instituto
Nacional do Câncer (NCI) nos Estados Unidos (HOTTA; UEOKA, 2005).
No último século, o desenvolvimento de agentes citotóxicos tem revolucionado a
terapia anticancer, elevando as taxas de sobrevivência e qualidade de vida de pacientes
acometidos por vários tipos de tumores (ISMAEL et al., 2008).
Muitas drogas quimioterápicas utilizadas na clínica atualmente incluem agentes que
atuam sobre o ciclo celular inibindo o estado de hiperproliferação das células tumorais e
conseqüente estimulando a indução de apoptose, que é o resultado esperado da quimioterapia.
Baseando-se no mecanismo de ação, estas drogas podem ser subdivididas nos seguintes
grupos: (I) drogas que interferem na síntese de DNA; (II) drogas que induzem dano ao DNA;
(III) drogas que inibem a função do fuso mitótico (SCHIMIDT et al., 2007). Este último
grupo de drogas tem obtido bons resultados na clínica e são classicamente conhecidos como
venenos do fuso (MOLLINEDO; GAJATE, 2003; JORDAN; WILSON, 2004; ZHOU;
GIANNAKAKOU, 2005a; PASQUIER; HONORE; BRAGUER, 2006).
47
Tradicionalmente, drogas que se ligam aos microtúbulos são classificadas em 2
grupos: os agentes estabilizadores dos microtúbulos onde estão inseridos os vários taxanos e
epotilonas e agentes que desestabilizam os microtúbulos incluindo os vários alcalóides da
vinca, colchicina, combretastatinas com derivados e análogos como as fenstatinas – Quadro 1
– (ÁLVAREZ et al., 2007; SCHIMIDT; BASTIANS, 2007).
48
Quadro 1 – Alguns estabilizadores e desestabilizadores de microtúbulos
Estrutura das substâncias (MM) Classe Ação Estágio de
desenvolvimento Referência
C
NH
N
CH3
H3COOC
OH
C
N
N
CH3
H3OC
CH3 OH
COOCH3COOCH3
CH3
Vinblastina
(816,01)
Alcalóide da vinca(desestabilizador de microtúbulos)
Liga-se ao domínio da
vinca na β tubulina (adjacente ao sítio de
ligação GTP)
Fase clínica GUPTA, 2003;
ATTARD et al., 2006
OOAc OH
O
OHH
OAcOO
ONH
OH
O
O
Palcitaxel (735,81)
Taxanos (estabilizadores
de microtúbulos)
Liga-se ao sítio dos
taxanos na interface
lateral dos microtúbulos
Fase clínica KAVALLARI;
VERRILLS; HILL, 2001
O
OO
O
N
O
H
O
Colchicina
(399,43)
Colchicina (desestabilizador de microtúbulos)
Liga-se à β tubulina
na interface entre os monô-
meros α e β
Fase clínica HADFIELD et al., 2003
CH3
O
CH3
CH3
O
HO
OH O
H3C CH3
CH3 OS
N
CH3
Epotilona B
(493,65)
Epotilonas (estabilizadores
de microtúbulos)
Liga-se ao sítio dos
taxanos na interface
lateral interna dos
microtúbulos
Fase II ATTARD et al., 2006
OH
OCH3
OCH3
H3CO
H3CO
H
Combretastaina A-4
(316,34)
Combretastatinas (desestabilizador de microtúbulos)
Atuam na despolimerização
e em baixas concentrações na supressão da dinâmica
dos microtúbulos
Fase II HADFIELD et al., 2003
H3CO
H3CO OCH3
OCH3
O
Fenstatina
(302,32)
Bisarilcetona (desestabilizador de microtúbulos)
Possivelmente atuam na
despolimerizaçãoe em baixas
concentrações na supressão da dinâmica
dos microtúbulos
Fase pré-clínica HADFIELD et al., 2003
49
1.10.1 Os novos inibidores dos microtúbulos
Muitas drogas utilizadas na terapêutica com propriedade anticâncer ligam-se em pelo
menos 3 locais distintos na subunidade β da tubulina: domínio da colchicina, da vinca e dos
taxanos – Figura 8 – (ÁLVAREZ et al., 2008).
Figura 8 – Diferentes sítios de ligação de drogas antimitóticas em locais diferentes no heterodímero de tubulina.
(a) Vincristina ligando-se ao domínio da vinca no microtúbulo – porção final (+) conduzindo a uma
despolimerização (b) Complexação da colchicina com os dímeros de tubulina no domínio de colchicina
localizado na interface entre a α e a β-tubulina suprimindo a dinâmica do microtúbulo (c) Paclitaxel liga à
superfície interior do microtúbulo no sítio de ligação dos taxanos, suprimindo a dinâmica dos microtúbulos.
Fonte: McGROGAN et al.(2008).
A descoberta de novas moléculas capazes de interferir com a polimerização e
despolimerização dos microtúbulos tem chamado a atenção de muitos grupos de pesquisa, os
quais trabalhando com a tubulina como uma proposta de alvo farmacológico, buscando novas
alternativas na terapêutica do câncer (HADFIELD et al., 2003; ROMAGNOLI et al., 2006).
50
Compostos que possuem em sua arquitetura o esqueleto estilbeno como o resveratrol
(3,4,5’-trihidroxi-trans-estilbeno) e análogos, apresentam semelhanças estruturais e funcionais
com as combretastatinas (cis-estilbeno) e derivados, além disso, podem ser precursores de
vários produtos sintéticos como as fenstatinas (PETTIT et al., 1998; HADFIELD et al., 2003;
ÁLVAREZ et al., 2008; LIMA et al., 2009).
Dentre os muitos agentes ligantes da tubulina, as combretastatinas destacam-se devido
a potente atividade citotóxica frente a células tumorais, bem como ação de maneira seletiva na
diminuição da vasculatura tumoral (ÁLVAREZ et al., 2008).
1.10.2 Fenstatina, a molécula desse estudo
As fenstatinas são bisarilcetonas, onde uma das rotas sintéticas utilizada para sua
obtenção refere-se a oxidação de Jacobsen sofrida pela combretastatina A-4 em meio básico
(PETTIT et al., 1998; HADFIELD et al., 2003). A combretastatina A-4 foi isolada pela
primeira vez em 1982, do arbusto da Combretum caffrum. Sendo que o fostafo de
combretastatina A-4 é uma prodroga, a qual atualmente vem sendo estudada na fase II da
pesquisa clínica nos Estados Unidos e também no Reino Unido, dando espaço para o
desenvolvimento de diversos análogos (ROMAGNOLI et al., 2006; VEGA-ÁVILA;
VELASCO-LEZAMA; JIMÉNEZ-ESTRADA, 2006; MADDIKA et al., 2007; ÁLVAREZ et
al., 2008). Desse modo, para a obtenção da fenstatina – RR07 – (Figura 9) pela reação
conhecida como oxidação de Jacobsen, é necessária a presença de compostos aromáticos,
sendo a reação limitada a anéis de benzeno, apresenta pelo menos 4 substituintes os quais
podem ser combinações de grupos alquil ou halogênios, onde os grupamentos alquis podem
ser metil, etil ou os halogênios: iodo, bromo ou cloro. A reação pode ainda ser utilizada como
meio de rearranjar polialquilbenzenos (PETTIT et al., 1998; HSIEH; LIOU; MAHINDROO,
2005). A molécula para a realização desse trabalho foi cedida pelo Prof. Dênis Pires de Lima,
do Departamento de Química Inorgânica da Universidade Federal do Mato Grosso do Sul.
51
Figura 9 – Estrutura da fenstatina
Uma das estratégias utilizadas para a concepção racional de droga é baseada na
utilização de uma substância conhecida como modelo para novas moléculas com certas
características estruturais que lhes permitam interagir com o mesmo receptor hipotético
(DOUGLAS, 1994; LORENZO; GUZMAN; MARQUEZ, 2002).
Compostos com semelhanças estruturais como colchicina, combretastatina A-4,
fenstatina e resveratrol compartilham semelhanças estruturais e farmacológicas (Quadro 2),
apesar de algumas diferenças no mecanismo de ação (PETTIT et al., 2000; LORENZO;
GUZMAN; MARQUEZ, 2002).
52
Quadro 2 – Semelhanças estruturais e funcionais entre alguns estilbenos.
Estilbeno Estrutura química Atividades Referência
Combretastatina A-4 MM = 316,34
OH
OCH3
OCH3
H3CO
H3CO
H
A B
- Interage com a porção β das tubulinas; - Antiangiogênico; - Citotóxico (CI50 em nM);
PETTIT et al., 1998; HADFIELDet al., 2003;
PETTIT et al., 2005;
Colchicina MM = 399,43
A
OCH3
H3CO
H3CO
NH
CH3
O
OCH3
O
B
C
- Interage com a porção β das tubulinas; - Parada em mitose;
HADFIELDet al., 2003; ÁLVAREZ et al., 2007;
Fenstastina MM = 302,32
H3CO
H3CO OCH3
OCH3
O
A B- Parada em Mitose; - Citotóxico - Não hemolítico;
HADFIELDet al., 2003; ÁLVAREZ et al., 2008;
JIANG et al., 2008;
Resveratrol MM = 228,24
OH
OH
OH
A
B - Citotóxico (CI50 > 10 mM); - Não hemolítico;
PETTIT et al., 2002; ÁLVAREZ et al., 2007;
LIMA et al., 2009;
53
2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
O câncer ou neoplasia maligna é uma patologia multifatorial desencadeada pelo
acúmulo de mutações no material genético, que regula os processos de crescimento e
proliferação celular. Assim, as células adquirem características como: perda dos limites de
replicação, inibição do processo apoptótico (morte celular programada), aquisição de auto-
suficiência no tocante a sinalização dos fatores de crescimento, perda dos limites dos tecidos
de origem e aumento do poder para a formação de novos vasos (angiogênese), sendo capazes
de modificar o ambiente que as cerca, desrespeitando fronteiras e migrando pelos diversos
tecidos do corpo, podendo estabelecer os surgimento de novos tumores (metástases), quando
conseguem se fixar em locais distantes do ponto de origem (SILVA et al., 2007). No Brasil,
em 2008, cerca de 230 mil novos casos de câncer entre homens e o mesmo número entre as
mulheres, acarretou no Sistema Único de Saúde – SUS – demandas hospitalares superiores a
400 milhões de reais, sendo crescente o numero de óbitos, que somente em 2008 vitimou
cerca de 40 mil pessoas (BRASIL, 2009).
A descoberta de novas substâncias naturais ou sintéticas capazes de interferirem em
eventos celulares específicos como na polimerização ou despolimerização dos microtúbulos,
tem proporcionado a busca por moléculas com atividade cada vez mais especifica como, por
exemplo, algumas bisarilcetonas, dentre elas a fenstatina (4-metoxifenil-3,4,5-
trimetoxifenilmetanona) designado no presente estudo por RR07, e que em um futuro
próximo poderá ser utilizada como uma alternativa terapêutica para fármacos já consagrados
como a vincristina, a vimblastina, o paclitaxel, a doxorrubicina, o etoposido, o topotecan,
dentre outros (KAVALLARIS; VERRILLS; HILL, 2001; ROMAGNOLI et al.,2006;
ALVAREZ et al., 2008).
Diante do supracitado, este trabalho foi motivado pelo crescente aumento dos casos de
câncer e por não haver ainda uma droga que seja eficaz neste tratamento sem apresentar
efeitos colaterais importantes.
54
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Estudar as propriedades anticâncer do composto estilbenóide 4-metoxifenil-3,4,5-
trimetoxifenilmetanona, uma fenstatina que neste trabalho foi denominado RR07, em vários
modelos biológicos.
3.2 Específicos
• Estudar a atividade citotóxica do composto RR07 em diferentes linhagens
tumorais, no desenvolvimento embrionário do ouriço do mar Lytechinus
variegatus, bem como a atividade hemolítica em eritrócitos de camundongos;
• Avaliar a seletividade deste composto em relação às células mononucleares do
sangue periférico (PBMC);
• Avaliar o mecanismo de ação citotóxico do composto RR07, utilizando como
modelo a linhagem HL-60 (leucemia promielocítica):
o Avaliar a viabilidade, bem como, a cinética de crescimento de células
leucêmicas (HL-60) tratadas com o composto RR07;
o Investigar as alterações morfológicas (em HL-60) desencadeadas pelo
composto RR07, por meio da coloração hematoxilina/eosina,
o Avaliar o efeito do RR07 sobre a indução de morte celular pelo ensaio de
fluorescência laranja de acridina/brometo de etídio (LA/BE);
o Averiguar a ação antiproliferativa (em HL-60) do RR07 por meio da inibição
de síntese de DNA;
o Estudar, por meio de citometria de fluxo, o efeito do RR07 sobre a viabilidade
celular, o ciclo celular, a atividade das caspases 3, 7 e 8, indução de apoptose
inicial pelo ensaio da Anexina-V, além de investigar o potencial
transmembrânico de mitocôndria (ΔΨm) de células tratadas com o composto
RR07;
• Avaliar o potencial genotóxico do composto RR07 em células PBMC, pelo teste
do cometa;
55
• Comparar a ação do RR07 sobre a indução de aberrações cromossômicas em
células PBMC, comparando ao efeito desencadeado pela colchicina;
• Determinar a interferência do RR07 sobre a polimerização da tubulina (em
microtúbulo isolado);
• Estudar o potencial antitumoral do RR07;
• Analisar as características histopatológicas dos órgãos (rim, fígado e baço) de
camundongos (Mus musculus) Swiss transplantados com o tumor Sarcoma 180,
tratados por 7 dias com RR07.
56
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais utilizados
4.1.1 Equipamentos
• Agitador de placa, MLW Modelo Thys 2®
• Agitador de tubo, Donner AD 8850®
• Banho-maria, DELLTA Modelo 105Di®
• Centrífuga Centimicro, FANEN Modelo 212®
• Centrífuga Excelsa Baby, I FANEN Modelo 206®
• Centrífuga de placas, Eppendorf Modelo Centrifuge 5403®
• Centrífuga de lâminas, Shandon Southern Cytospin®
• Citômetro de fluxo, Guava EasyCyte mini®
• Deonizador de água Milli-Q, Milipore®
• Espectrofotômetro de placa DTX-880, Beckman Coulter®
• Fluxo laminar, VECO®
• Incubadora de células, (CO2 Water-Jacket Incubator) NUAIRE TS Autoflow®
• High Throughput Screening (HTS)/Laboratory Automation Workstation, Biomek
3000, Beckman
• Coulter®
• Máquina fotográfica digital, Olympus C-7070®
• Microondas, Panasonic®
• Microscópio óptico, Metrimpex Hungary/PZO-Labimex Modelo Studar lab®
• Microscópio óptico de inversão, Nikon Diaphot®
• Microscópio de fluorescência, Olympus®
• Micrótomo, Slee Mainz®
• pHmetro, Micronal B474®
• Pipetas automáticas, Gilson®
• Sistema de Eletroforese Horizontal mini Submarine, Amersham Biosciences®
57
4.1.2 Soluções, Reagentes e Fármacos
Ácido Acético Glacial - Vetec®
Ácido Clorídrico - Vetec®
Álcool Etílico - Vetec®
Agarose 1% 0,5 g de agarose
Água deionizada qsp 50 mL
FMC -
Bioproducts®
Agarose LMP 1,5% 1,5 g de agarose
PBS qsp 100 mL Gibco®
Agarose NMP 0,5% 0,5 g de agarose
PBS qsp 100 mL Gibco®
1 µL de anticorpo anti-BrdU Sigma® Anticorpo anti-BrdU
BSA 5% qsp 500 µL de solução Dako®
Anticorpo biotinilidado
anti-imunoglobulina de
camundongo
1 µL de anticorpo anti-imunoglobulina
BSA 5% qsp 100 µL de solução Sigma®
10 mg de azul de tripan Sigma® Azul de tripan 10%
PBS qsp 100 mL de solução -
BrdU 10 mM - Sigma®
1 mg de brometo de etídeo Sigma® Brometo de Etídio
100 μg/mL PBS qsp 10 mL de solução -
Citrato de Sódio - Química®
58
Cloreto de Sódio (NaCl) - Labsynth®
Colchicina 1 g Sigma®
5 µL de DAB Immunotech®
1 mL de Tris-HCl (Tris 0,05 M) pH= 7,6 Proquímios® Diaminobenzidina
(DAB) 2 µL de H2O2 Proquímios®
Dimetilsulfóxido
(DMSO) - Vetec®
Doxorrubicina –
fornecida pelo Instituto
do Câncer do Ceará –
ICC
- Zodiac®
EDTA - Qeel®
0,5 g de Eosina Doles®
80 mL de Álcool etílico
0,5 mL de Ácido acético Eosina 0,5%
20 mL de H2O -
1 µL de Estreptavidina – peroxidase Sigma® Estreptavidina –
peroxidase BSA 5% qsp 100 µL de solução Dako®
Ficoll - Sigma®
Fitohemaglutinina - Sigma®
Formaldeído 10% 100 mL de formaldeído
H2O qsp 1 L Dinâmica®
59
0,5 g de Hematoxilina Doles®
10 mL de Glicerina Labsynth®
25 g de Sulfato de alumínio Labsynth®
0,1 g de Iodeto de potássio Labsynth®
Hematoxilina 0,1%
H2O qsp 500 mL de solução -
Hidróxido de Sódio
(NaOH) - Vetec®
1 mg de iodeto de propídeo Boehringer® Iodeto de propídeo
50 µg/mL PBS qsp 50 mL
1 g de laranja de acridina (100 µg/mL) Fluka® Laranja de Acridina
H2O qsp 10 mL de solução -
Meio de cultura de
células RPMI 1640
Diluído em água deionizada e esterelizada,
filtrado em filtro millipore (0,22 µm) e
complementado com SBF 10%, 1% de
glutamina, 1% de antibióticos, 1% de
bicarbonato de sódio (0,75%) e 25 mM de
HEPES
Cultilab®
20 mg de MTT Sigma® MTT
PBS qsp 100 mL de solução -
N-Lauroylsarcosine - Sigma®
Paclitaxel 25 mg Sigma®
Penicilina 10.000 UI/mL Cultilab® Penicilina –
estreptomicina Estreptomicina 10 mg/mL Cultilab®
60
Ringer-lactato
Cloreto de Sódio = 0,600 g
Cloreto de Potássio = 0,030 g
Cloreto de Cálcio 2H2O = 0,020 g
Lactato de Sódio = 0,30 g
Água qsp 100 mL
Laboratórios
Biosintética®
Sulfato de Gentamicina - Gentamicin
Novafarma®
Solução de Eletroforese EDTA 1 mM, NaOH 300 mM, pH > 13 -
Solução de Lise
NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM
Tris 10 mM, N-Lauroyl sarcosine 1%
pH = 10, Triton X-100 1%, DMSO 10%
-
Solução de
Neutralização Tris 0,4 M, pH = 7,5
Solução desnaturante
(para análise de
incorporação de BrdU)
Formamida 70%
2x SSC (pH entre 6,5 e 7,5 a 70 °C) Vetec®
Soro fetal bovino - Cultilab®
8,5 g de Cloreto de sódio (0,85%) Labsynth®
1,11 g de Cloreto de cálcio (10 mM) Reagen® Solução salina
(para hemólise) H2O qsp 1 L de solução -
SSC 10X
Cloreto de sódio 1,5 M
Citrato de sódio 0,15 M
H2O
-
61
Tampão de corrida
50X (TAE)
242 g de TRIS
57,1 mL de ácido acético glacial
100 mL de EDTA 0,5 M
-
8,766 g de Cloreto de sódio Labsynth®
2,14 g de NaHPO47H2O Labsynth®
0,276 g de NaHPO4H20 Labsynth® Tampão fosfato (PBS)
H20 qsp 1 L de solução (pH = 7,2) -
Cloreto de sódio 1,5 M Labsynth®
Tris 0,5 M (pH= 7,6) Proquímios® Tampão Tris (TBS) 10X
H2O -
Taxol®
fornecido pelo Instituto
do Câncer do Ceará –
ICC
6 mg/mL Bristol-Myers
Squibb®
50 mL de Tripsina 2,5% Cultilab®
0,125 g de EDTA Proquímios® Tripsina 0,25%
450 mL de PBS -
Triton X-100 - Isofar®
Velban®
fornecido pelo Instituto
do Câncer do Ceará –
ICC
10 mg/mL Ely Lilly®
Xilol 10% 100 mL de formaldeído
H2O qsp1 L Dinâmica®
5- Fluorouracil 2,5 mg/1 mL ICN
Farmacêutica®
62
4.1.3. Modelos utilizados na pesquisa
4.1.3.1. Biológicos
Camundongos albinos (Mus musculus) da linhagem Swiss
Linhagens celulares tumorais mantidas em cultura
PBMC humanos isolados de voluntários sadios
Gametas de ouriço do mar da espécie Litechinus varietatus
4.1.3.2 Comitê de Ética
Todos os procedimentos envolvendo a utilização de animais realizados no presente
estudo seguiram as recomendações do Conselho Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA), respeitando a legislação vigente, e sob autorização do Comitê de Ética em
Pesquisa com Animais (CEPA) da Universidade Federal do Ceará (protocolo nº 52/08).
4.2 Metodologia Experimental
4.2.1 Obtenção do composto RR07 e outros derivados estilbenóides
As substâncias utilizadas na execução deste trabalho foram cedidas pelo Prof. Dênis
Pires de Lima do Departamento de Química Inorgânica da Universidade Federal de Mato
Grosso do Sul. Os análogos estilbenóides foram obtidos no Laboratório de Síntese e
Transformações de Moléculas Orgânicas para Emprego Biológico (SINTMOLB) da
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. As moléculas foram sintetizadas a partir da
Reação de Perkin*, a qual possibilitou também a obtenção do estilbeno resveratrol, enquanto a
bisarilcetona fenstatina ou 4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona, neste trabalho
denominada RR07 (Tabela 3) foi obtida pela oxidação de Jacobsen a partir da
Combretastatina A-4 (PETTIT et al., 1998; HADFIELD et al., 2003; HSIEH; LIOU;
MAHINDROO, 2005; LIMA et al., 2009).
* A Reação de Perkin é uma reação orgânica desenvolvida por William Henry Perkin que pode ser usada na produção de ácidos cinâmicos pela condensação aldol de aldeídos aromáticos e anidridos ácidos na presença de um sal alcalino de ácido.
63
Tabela 3 – Nome químico, sigla utilizada, massa molecular e estrutura química do resveratrol
e derivados estilbenóides1
Substância (nome químico) Sigla MM2 Estrutura Química
Ácido 3-(3,4-dimetoxifenil)-2-fenil acrílico RR01 284,30
O
O
OH
OCH3
CH3
Ácido 3-(4-acetoxi-3-metoxifenil)-2-fenil acrílico RR02 314,28
O
OH
O
OCH3
OOH
1,2-dimetoxi-4-[(Z)-2-fenil-1-etenil] benzeno RR03 240,29O
O
CH3
CH3
1,2-dimetoxi-4-[(E)-2-fenil-1-etenil] benzeno RR04 244,32O
CH3
O
CH3
Ácido 3-(3,4-metoxifenil)-2-fenil acrílico RR05 254,28
O
OH
OCH3
Ácido 3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-2-fenil acrílico RR06 270,28
O
OH
OH
OCH3
4-Metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona RR07 302,32H3CO
H3CO OCH3
OCH3
O
4-(1,8-dimetoxi-9H-xantenila-9)-2-metoxifenol RR09 368,42
O
C H 3OO
CH 3
O
O H
C H 3
64
Substância (nome químico) Sigla MM2 Estrutura Química
Ácido 3-(2-hidroxifenil)-2-fenil acrílico RR10 240,25
O
OH
OH
9-(4-hidroxi-3-metoxi)-3,4,5,6,7,9-hexahidro-2H-xantene-1,8-diona RR11 340,37
O
OO
O
O H C H 3
5-[2-(4-hidroxifenil)-vinil]-benzeno-1,3-diol RESV 228,24OH
OH
OH
1Os estilbenos são compostos não flavonóides que contem o grupo funcional 1,2-difeniletileno possuindo ligação
dupla conjugada no sistema. Tais compostos são denominados fitoalexinas, dentre os quais destaca-se o
resveratrol (RIBÉREAU-GAYON, 2002). 2MM = Massa Molecular; RESV = Resveratrol;
4.2.2 Manutenção das células
No presente trabalho, utilizou-se dois tipos de linhagem celular, as linhagens em
suspensão (CEM, HL-60, JUKART e K-562) e as linhagens aderidas (B-16, B-16-F10, HCT-
8, MDA-MB 231 MDA-MB-435, MX-1, PC-3 e SF-295), todas obtidas através de doação do
Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (Bethesda, MD). As linhagens celulares que
foram utilizadas nos experimentos estão em destaque na Tabela 4. As células eram cultivadas
em frascos plásticos para cultura (Corning, 25 cm2, volume de 50 mL para células aderidas e
75 cm2, volume de 250 mL para células em suspensão), utilizando o meio de cultura RPMI
1640 complementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos
(penicilina/estreptomicina). As células foram mantidas em estufa a 37°C com atmosfera de
5% de CO2 e 95% de umidade, seguido da observação do crescimento celular com ajuda de
microscópio de inversão a cada 24 horas. Quando necessário às células eram repicadas em
meio de cultura nova, numa concentração de 0,5-1,0 x 106 céls/mL (BUTLER; DAWSON,
1992).
65
Tabela 4 – Linhagens celulares tumorais utilizadas no ensaio de citotoxicidade in vitro,
através do método do MTT.
Linhagem Celular Tipo Histológico do Câncer / Origem Concentração de
plaqueamento (células/mL)
HL-60 (*) Leucemia promielocítica humana 0,3 x 106 K-562 (*) Leucemia mielocítica crônica humana 0,3 x 106 CEM (*) Leucemia linfocítica humana 0,5 x 106 JUKART (*) Leucemia 0,3 x 106 MDA-MB 231 (**) Carcinoma de mama humano 0,1 x 106 MDA-MB 435 (**) Carcinoma de mama humano 0,1 x 106 MX-1 (**) Carcinoma de mama humano 0,1 x 106 HCT-8 (**) Carcinoma de cólon humano 0,7 x 105 PC-3 (**) Carcinoma de próstata humano 0,1 x 106 SF-295 (**) Glioblastoma 0,7 x 105 B-16-F10 (**) Glioblastoma 0,7 x 105 B-16 (**) Melanoma murino 0,6 x 105 (*) Linhagem de células em suspensão; (**) Linhagem de células aderidas
4.2.3 Avaliação da atividade citotóxica em células tumorais in vitro pelo método do MTT
4.2.3.1 Princípio do teste
A análise de citotoxicidade pelo método de redução do MTT, [3-(4,5-dimetiltiazol-
2yl)-2,5-difeniltetrazolium bromida], vem sendo utilizada no programa de screening do
National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI), sendo testadas mais de 10.000 amostras
a cada ano (SKEHAN et al., 1990), podendo ser utilizado para determinar citotoxicidade,
proliferação e ativação celular. O método baseia-se na redução do sal [3-(4,5-dimetiltiazol-
2yl)-2,5-difeniltetrazolium bromida] ou MTT, um composto de cor amarela, a formazan,
composto de coloração púrpura, pelos substratos celulares NADH, NADPH e succinato,
presentes na mitocôndria de células viáveis, seguida de análise colorimétrica (MOSMANN,
1983; BERRIDGE; TAN, 1993). No presente trabalho, este ensaio foi utilizado para seleção
das substâncias mais ativas.
4.2.3.2 Procedimento experimental
As células foram plaqueadas em concentrações variadas de acordo com a Tabela 4
para células suspensas e aderidas. O resveratrol, o RR07 e os outros compostos análogos
66
(RR01, RR02, RR03, RR04, RR05, RR06, RR09, RR10 e RR11), de esqueleto estilbenóide
foram acrescidos em concentrações, que variaram desde 1,70 até 67,85 μM.
Inicialmente, fez-se a diluição das substâncias em DMSO puro e estéril em uma
concentração estoque de 5 mg/mL, onde foram obtidas as concentrações finais 0,17 a 67,85
μM e adicionadas em placa de 96 poços (100 μL/poço). O quimioterápico doxorrubicina foi
usado como controle positivo. Após um período de incubação de 72 horas, as placas foram
retiradas e centrifugadas a 1500 rpm/15 minutos. O sobrenadante foi aspirado e foi adicionado
200 μL de uma solução contendo RPMI 1640 com 10% de MTT, sendo a placa colocada na
estufa a 5% de CO2 por 3 horas. Em seguida, as placas foram novamente centrifugadas a 3000
rpm/10 minutos, tendo o sobrenadante aspirado e seu precipitado ressuspendido em 150 μL de
DMSO e agitado por cerca de 10 minutos, até completa dissolução dos cristais de formazan.
As placas foram lidas no espectrofotômetro de placas a um comprimento de onda de 595 nm.
4.2.3.3 Análise dos dados
Os experimentos foram analisados segundo suas médias e respectivos EPMs. As
substâncias foram testadas em diluição do tipo seriada, em duplicata ou triplicata, foi montado
o gráfico absorbância versus concentração e determinado as suas CI50 (concentração inibitória
média capaz de provocar 50% do efeito máximo) e seus respectivos intervalos de confiança
(IC 95%) determinados a partir de regressão não-linear no programa GraphPad Prism versão
5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).
4.2.4 Avaliação da atividade antimitótica – Desenvolvimento embrionário em ovos de
ouriço-do-mar (Lytechinus variegatus)
4.2.4.1 Princípio do ensaio
O ouriço-do-mar pertence ao Filo Echinodermata, Classe Echinoidea, Subclasse
Euechinoidea, por (RUPERT; BARNES, 1996). A espécie Litechinus variegatus é facilmente
mantida em laboratório e foi selecionada para a utilização em testes de toxicidade por
apresentar-se fértil o ano todo e possuir ovos pouco pigmentados, viabilizando, assim, a
execução de ensaios com seus gametas. Os óvulos apresentam uma coloração alaranjada
enquanto que os espermatozóides apresentam-se esbranquiçados. A membrana de fecundação
dos ovos é facilmente visualizada, assim como as várias fases da embriogênese.
67
4.2.4.2 Procedimento experimental
A extrusão dos gametas foi induzida pela injeção de KCl 0,5 M na cavidade celômica
dos animais. Após extruídos, os óvulos foram lavados em uma proveta com água do mar
filtrada, por 3 vezes, para remoção da camada gelatinosa. Os espermatozóides concentrados
foram mantidos em baixa temperatura até o momento do uso. Após a última lavagem, os
óvulos foram ressuspendidos em 50 mL de água do mar filtrada e fecundação realizada pela
adição de 1 mL da suspensão de espermatozóides (0,05 mL da suspensão concentrada + 2,45
mL de água do mar filtrada) a 50 mL suspensão de óvulos. Após cerca de dois minutos, a
fecundação foi confirmada pela presença da membrana da fecundação, pela observação de
uma amostra das células ao microscópio. Um volume de 1 mL de ovos foram distribuídos
numa multiplaca com 24 cavidades, cada uma contendo os análogos incubados num volume
final de 2 mL nas concentrações de 10 e 100 µg/mL, mantidos à temperatura ambiente (26 ±
2°C) sob agitação constante. As amostras foram fixadas alíquotas de 0,2 mL em formalina
10%, quando se observou a maioria dos embriões do controle negativo nas fases da primeira e
terceira divisão e blástula. Cem ovos foram contados em cada amostra para obtenção da
porcentagem de células.
Foram testados resveratrol e análogos estilbenóides (RR01, RR02, RR03, RR04,
RR05, RR06, RR07, RR09, RR10 e RR11), os mesmos foram diluídos em DMSO na
concentração estoque de 1 mg/mL. A doxorrubicina, um quimioterápico com indicação para
diversos tipos de tumores, foi utilizado como controle positivo.
4.2.4.3 Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de “n” experimentos no programa
GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).
68
4.2.5 Avaliação do dano à membrana plasmática – Atividade Hemolítica em Eritrócitos de
Camundongos Mus musculus Swiss
4.2.5.1 Princípio do ensaio
Esta metodologia, segundo descrita por Costa-Lotufo et al. (2002); Dresch et al.
(2005), baseia-se em avaliação espectrofotométrica e permite avaliar o potencial das
substâncias teste em causar lesões na membrana plasmática da célula, seja pela formação de
poros ou pela ruptura total.
4.2.5.2 Procedimento experimental
Foi coletado o sangue de três camundongos (Mus musculus Swiss) do plexo orbital,
sendo diluído em 30 volumes de solução salina (NaCl 0,85% + CaCl2 10 mM). Os eritrócitos
foram lavados 2 vezes em solução salina, centrifugados (1500 rpm/3 minutos) para redução
da contaminação plasmática e ressuspensos em solução salina para obtenção de uma
suspensão de eritrócitos (SE) a 2%. Os ensaios foram realizados em multiplacas com 96
cavidades. Cada poço da 1ª fileira vertical recebeu 100 μL da solução salina. Na 2ª fileira
vertical, os poços receberam 50 μL da solução salina e 50 μL do veículo de diluição da
substância teste, neste caso, DMSO 10%. Aos poços da 3ª fileira vertical, foram adicionados
100 μL de solução salina e 100 μL das substâncias teste em solução. Da 4ª fileira vertical em
diante, os poços receberam 100 μL da solução salina, excetuando-se os da última fileira, que
receberam 80 μL de solução salina e 20 μL de Triton X-100 1% (controle positivo). As
diluições foram feitas da 3ª à 11ª cavidades verticais, retirando-se 100 μL da solução da
cavidade anterior e transferindo para a seguinte de modo que as concentrações foram sempre
diluídas pela metade, variando de 17,08 a 542,85 μM. Em seguida, 100 μL da suspensão de
eritrócitos foram plaqueados em todos os poços. Após incubação de 1 hora, sob agitação
constante à temperatura ambiente (26 ± 2°C), as amostras foram centrifugadas (5000 rpm/3
minutos) e o sobrenadante transferido para uma outra placa para a leitura da absorbância no
espectrofotômetro de placas a 540 nm. A atividade dos compostos foi determinada de maneira
relativa ao valor dos controles positivo e negativo.
Foram testados os compostos RR01, RR02, RR03, RR04, RR05, RR06, RR07, RR08,
RR09, RR10, RR11 e Resveratrol, os quais foram diluídos em DMSO na concentração
69
estoque de 5 mg/mL. As amostras foram testadas em curva de diluição seriada em
concentrações crescentes de 17,08 a 542,85 μM.
4.2.5.3 Análise dos dados
Os experimentos foram analisados segundo suas médias e respectivos EPMs. As
substâncias foram testadas em diluição do tipo seriada. Foi montado o gráfico absorbância
versus concentração e determinadas as suas CE50 (concentração efetiva média capaz de
provocar 50% do efeito máximo) e seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%), obtidas
a partir de regressão não-linear no programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software
for Science, San Diego, CA, EUA).
4.3 Caracterização da atividade antiproliferativa do composto RR07 em células HL-60 e
em cultura primária de células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) pelo ensaio
do MTT
4.3.1. Procedimento experimental
As células HL-60 foram plaqueadas na concentração de 0,3 x 106 células/mL
(procedimento anteriormente descrito no tópico 4.2.2) enquanto as células mononucleadas do
sangue periférico (PBMC) foram isoladas a partir de uma amostra de sangue periférico
(procedimento descrito no tópico 4.4.6) e plaqueadas na concentração 1 x 106 células/mL.
O composto RR07 foi então adicionado às células em uma curva de concentração que
variou desde de 1,70 até 67,85 μM. Após um período de incubação de 24 horas, as placas
foram retiradas e centrifugadas a 1500 rpm/15 minutos. O sobrenadante foi aspirado e foi
adicionado 200 μL de solução de MTT 10% em RPMI 1640, sendo a placa colocada na estufa
a 5% de CO2 por 3 horas. Em seguida, as placas foram novamente centrifugadas a 3000
rpm/10 minutos, tendo o sobrenadante aspirado e seu precipitado ressuspendido em 150 μL de
DMSO e agitado por cerca de 10 minutos, até completa dissolução dos cristais de formazan.
As placas foram lidas no espectrofotômetro de placas a um comprimento de onda de 595 nm.
70
4.3.2 Análise dos dados
Os experimentos foram analisados segundo suas médias e respectivos EPMs. As
substâncias foram testadas em diluição do tipo seriada, em duplicata ou triplicata. Foi
montado o gráfico absorbância versus concentração e determinadas as suas CI50 (concentração
inibitória média capaz de provocar 50% do efeito máximo) e seus respectivos intervalos de
confiança (IC 95%) determinados a partir de regressão não-linear no programa GraphPad
Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).
4.4 Estudos de Mecanismo de Ação
4.4.1 Viabilidade celular – Teste de exclusão do azul de Tripan
4.4.1.1 Princípio do ensaio
O teste de exclusão por azul de Tripan permite quantificar as células viáveis das
células mortas pela substância testada. O corante penetra em todas as células, porém somente
as células viáveis conseguem bombear o azul de tripan para fora, sendo possível desta forma,
observar uma coloração azulada nas células mortas, por não poder bombeá-lo (JIMENEZ et
al., 2003; PERES et al., 2005).
4.4.1.2 Procedimento experimental
Células da linhagem HL-60, na concentração de 0,3 x 106 células/mL, foram
incubadas por 24 horas com a substância RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e
4,00 μM e examinadas ao microscópio de inversão. A concentração utilizada foi estimada a
partir do valor da CI50 (0,25 μM) encontrada no método do MTT para esta mesma linhagem
celular. Retirou-se 90 μL da suspensão de células e foi adicionado a 10 μL do azul de tripan
(10%). As células viáveis e as não viáveis foram diferenciadas a partir da contagem em
câmara de Newbauer. A Doxorrubicina (0,5 μM) foi usada como controle positivo (VERAS
et al., 2004).
71
4.4.1.3 Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de “n” experimentos. Para
verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados
foram comparados por análise de variância ANOVA, com nível de significância de p < 0,001
no programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA,
EUA).
4.4.2 Avaliação cinética do crescimento celular em HL-60 pelo método do azul de tripan
4.4.2.1. Principio do ensaio
Baseia-se no principio descrito na seção 4.4.1.1
4.4.2.2 Procedimento experimental
Células das linhagens HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na
concentração de 0,3 x 106 células/mL, e incubadas com o composto RR07 nas concentrações
de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 µM. Após cada período de incubação (3, 6, 12, 18 e 24 horas)
era retirada uma alíquota de 90 µL da suspensão de células e adicionado a 10 μL do azul de
tripan. Em seguida uma alíquota de 10 μL da solução de células foi colocada em uma câmara
de Newbauer e as células diferenciadas e contadas em viáveis e não viáveis.
4.4.2.3 Análise dos dados
O valor obtido para cada contagem foi montado em um gráfico e construído uma
curva com as variáveis: porcentagem de células viáveis versus log da concentração, para cada
tempo analisado, para a observação da cinética de crescimento das células tratadas. Foram
determinados também suas CI50 (concentração inibitória média capaz de provocar 50% do
efeito máximo) e seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%) realizado a partir de
regressão não-linear utilizando o programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for
Science, San Diego, CA, EUA). Para verificação da ocorrência de diferenças significativas
entre os diferentes grupos, os valores das CI50 foram comparados por análise de variância
72
(ANOVA) seguido do teste Student-Newman-Keuls, com nível de significância estatística de
95% (p < 0,05).
4.4.3 Análise de alterações morfológicas – Coloração com hematoxilina e eosina
4.4.3.1 Princípio do ensaio
A técnica de coloração hematoxilina-eosina (HE) permite diferenciar o citoplasma do
núcleo, possibilitando, assim, a análise de estruturas celulares. A hematoxilina é um corante
basofílico que tem maior afinidade pelas proteínas nucleares, dando ao núcleo numa cor lilás.
A eosina, por sua vez, liga-se melhor aos componentes citoplasmáticos conferindo-lhe uma
coloração rósea (BRYNE, 1998).
4.4.3.2 Procedimento experimental
Células da linhagem HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na concentração
de 0,3 x 106 células/mL, e incubadas por 24 horas com o composto RR07 nas concentrações
de 0,25; 0,50 e 1,00 μM. A doxorrubicina (0,50 μM) foi usada como controle positivo. Para
observar a morfologia das células, lâminas foram preparadas, com 50 µL da suspensão de
células, em citocentrífuga (cytospin) e fixadas com metanol 100% por 1 minuto. Em seguida,
as lâminas foram lavadas com água corrente para remoção do fixador e coradas, inicialmente,
com hematoxilina de harris 0,1% por 1 minuto. Após a lavagem com água destilada, as
lâminas foram imersas em eosina 0,5% por mais 1 minuto e visualizadas ao microscópio. Para
garantir a preservação do material, as lâminas foram desidratadas com solução de etanol:xilol,
até xilol 100%. Uma gota de bálsamo do Canadá foi pingada em cada lâmina e virada sobre
uma lamínula. Essa montagem foi deixada 24 horas para secar (VERAS et al., 2004).
4.4.3.3 Análise dos dados
As lâminas com células tratadas e não tratadas foram levadas ao microscópico para a
avaliação qualitativa de suas características morfológicas e comparadas às células do controle
negativo. Posteriormente, as células foram fotografadas para o registro das alterações
observadas.
73
4.4.4 Determinação do percentual de inibição de síntese de DNA: incorporação da
bromodeoxiuridina- Ensaio do BrDU
4.4.4.1 Princípio do teste
A bromodeoxiuridina (BrDU) é uma base nitrogenada análoga à timidina que é
incorporada ao DNA das células em proliferação. A detecção do BrDU é realizada por
técnicas de imuno-citoquímica, onde se ligam anticorpos monoclonais e um cromógeno
específico, a diaminobenzidina (DAB), que vai conferir uma coloração marrom ao núcleo das
células que incorporaram a BrDU (TAKAHASHI, 2003).
4.4.4.2 Procedimento Experimental
Células da linhagem HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na concentração
de 0,3 x 106 células/mL, e incubadas por 24 h com o composto RR07 nas concentrações de
CI50 (0,25; 0,50 e 1,00 μM). As concentrações utilizadas foram calculadas a partir dos valores
de CI50, encontrados no ensaio da curva de crescimento no período de 24 horas de incubação.
A doxorrubicina (0,50 μM) foi usada como controle positivo. Três horas antes do período de
incubação o BrdU (0,01 μM) foi adicionado em cada poço da cultura de células. Após o
período de incubação, lâminas foram preparadas em citocentrífuga (cytospin) e postas para
secar por 2 horas. Após o período de secagem foram fixadas em metanol: ácido acético (7:1,5)
por 5 minutos. As células foram lavadas com tampão Tris (TBS) e incubadas em solução
desnaturante por 90 minutos a 70°C e pH 7,4. Após uma segunda lavagem com TBS, a região
adjacente às células foi circundada com caneta hidrofóbica. Em seguida, o material foi
incubado com anticorpo primário e deixado sob refrigeração durante a noite em câmara
úmida. A seguir, as células foram incubadas com anticorpo secundário biotinilado por 20
minutos e, então, com a solução de estreptavidina-fluoresceína por mais 20 minutos.
Adicionou-se o cromógeno DAB por 1-5 minutos, o qual foi removido com água destilada. A
contra-coloração das células foi realizada com hematoxilina de Harris a 0,1%.
4.4.4.3 Análise dos dados
Duzentas células foram contadas, diferenciando-as entre núcleo marrom
(incorporaram o BrdU) e não-marrom ou núcleo lilás (não incorporam o BrdU). Os dados
74
foram expressos como a média ± EPM de dois experimentos independentes (realizados em
duplicata). Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os grupos, os
dados foram comparados pelo teste χ2, utilizando o programa Prism versão 5.0 (Intuitive
Software for Science, San Diego, CA, EUA). com nível de significância de 5% (p < 0,05).
4.4.5 Avaliação do padrão de morte celular – Coloração diferencial com laranja de
acridina (LA) / brometo de etídeo (BE)
4.4.5.1 Princípio do ensaio
O método de coloração pelo brometo de etídio/laranja de acridina permite diferenciar
células viáveis daquelas em processo de morte por apoptose ou necrose pela coloração
diferencial por fluorescência com base em alterações morfológicas nucleares e
citoplasmáticas (McGAHON et al., 1995). A laranja de acridina (LA) consegue atravessar
membranas celulares intactas e se ligam ao DNA, conferindo uma aparência verde ao núcleo
das células. O brometo de etídio (BE) é incorporado principalmente por células com a
membrana já danificada (não viáveis), ligando-se ao DNA e corando-o de laranja. As células
viáveis com membrana intacta apresentam núcleo uniformemente corado de verde pela laranja
de acridina (LA). As células em apoptose inicial (membrana ainda intacta) apresentam
manchas verdes brilhantes no núcleo (condensação da cromatina) e não são marcadas por
brometo de etídio (BE). Morfologicamente, observam-se alterações da membrana em
decorrência da formação de corpúsculos apoptóticos. As células em necrose (lesão de
membrana) apresentam um padrão de coloração uniforme, laranja-avermelhada e não há
formação de corpos apoptóticos. Possivelmente, as membranas plasmáticas permaneçam
intactas durante o fenômeno apoptótico até os últimos estágios quando se tornam permeáveis
aos solutos normalmente retidos.
4.4.5.2 Procedimento experimental
As células HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na concentração de 0,3 x
106 células/mL, e incubadas por 24 horas com o composto RR07 nas concentrações de 0,25;
0,50 e 1,00; 2,00 e 4,00 μM. As concentrações utilizadas foram estimadas a partir dos valores
de CI50, encontrados no ensaio do MTT para a linhagem HL-60 no período de 24 horas de
75
incubação. A doxorrubicina (0,50 μM) foi usada como controle positivo. Uma alíquota de 1
mL da suspensão de células foi transferida para um tubo eppendorf e centrifugada por 5
minutos a 2000 rpm. O sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em 20 μL de
solução de PBS. Em seguida, 1 μL da solução de LA:BE foi adicionado a cada tubo e uma
alíquota dessas células transferido para uma lâmina, montado com lamínula, e em seguida
levadas ao microscópio de fluorescência para observação dos eventos celulares (GENG;
ZENG; WANG, 2003).
4.4.5.3 Análise dos dados
Para a quantificação percentual de cada evento celular (viáveis, necróticas e
apoptóticas), foram contadas 300 células de cada amostra. Os dados foram expressos como a
média ± EPM de três experimentos independentes. Para verificação da ocorrência de
diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de
variância (ANOVA) seguido pelo teste de Dunnet, utilizando o programa GraphPad Prism
versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA), com nível de significância
de 5% (p < 0,05).
4.4.6 Avaliação citotóxica em células mononuceladas de sangue periférico humano (PBMC)
4.4.6.1 Aspectos éticos, coleta de sangue e isolamento das células PBMC
Esse protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da
Universidade Federal do Ceará, estando registrado com o número 281/09, e foi conduzido de
acordo com a resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde.
A coleta do sangue periférico foi realizada por profissionais capacitados, utilizando-se
seringas esterilizadas e descartáveis de 10 mL. Para tanto, foram escolhidos 3 voluntários
adultos saudáveis, na faixa etária de 20 a 30 anos, sem histórico de doenças recentes, não
fumantes, sem exposição recente a radiações, a medicamentos ou álcool (BURIM et al.,
2001).
As células PBMC foram isoladas a partir de uma amostra de 3 mL de sangue
periférico acrescida de 5 mL de PBS. Essa mistura foi adicionada a um tubo Falcon com 2 mL
de Ficoll e submetida à centrifugação por 30 minutos a 2000 rpm. Em seguida, a região
intermediária entre as hemácias e o soro, chamada de nuvem de células PBMC foi aspirada e
76
adicionada a um terceiro tubo. Posteriormente, completou-se com PBS até o volume de 11
mL e centrifugou-se o tubo a 108 g por 20 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet
de PBMC foi ressuspendido em 2 mL de PBS.
4.4.7 Avaliação da atividade citotóxica do composto RR07 em células mononucleadas do
sangue periférico (PBMC)
4.4.7.1 Principio do ensaio
As células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) de mamíferos são ideais para
se testar uma substância quanto a sua capacidade em produzir aberrações cromossômicas
(NATARAJAN; OBE, 1980). Supondo-se que haja uma correlação entre o dano induzido no
sangue e em outras células somáticas, as células tipo PBMC serviriam como um sistema
sentinela para grupos de alto risco (NORDENSON et al., 1984).
4.4.7.2 Procedimento experimental
As células mononucleadas foram obtidas do sangue periférico de voluntários sadios
após centrifugação em gradiente de Ficoll. As células foram removidas, lavadas com tampão
fosfato e ressuspendidas em meio RPMI 1640 suplementado com 20% de soro fetal bovino
fetal, 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina para uma concentração final de final 3
x 105 células/mL. Fitohemaglutinina (3%) foi adicionada para induzir a proliferação das
células periféricas mononucleadas. As células foram incubadas em estufa a 37°C com
atmosfera de 5% de CO2 durante 48 horas antes da adição do RR07 nas concentrações finais
de 0,12 a 82,6 μM.
A atividade citotóxica do composto RR07 e doxorrubicina foi avaliada pela contagem
das células que excluíram o corante azul de tripan após um períodos de incubação de 24
horas.
4.4.7.3 Análise dos dados
O composto RR07 foi testado em diluição seriada, em triplicata. A concentração
necessária para inibir 50% das células – CI50 – e o intervalo de confiança foi calculado a partir
de regressão não-linear utilizando o programa Prism versão 5.0 (Intuitive Software for
77
Science, San Diego, CA, EUA). Para verificação da ocorrência de diferença significativa
entre a citotoxicidade em células de HL-60 e em PBMC periféricos, os dados foram
comparados por teste t de Student não-pareado com nível de significância de 5% (p < 0,05).
4.4.8 Atividade genotóxica em células mononucleadas do sangue periférico – Teste do Cometa
4.4.8.1 Seleção de voluntários e obtenção do material para análise
Para o estudo com PBMC humano, foi utilizado sangue periférico de quatro doadores
voluntários, obedecendo aos seguintes critérios:
Ter entre 18 e 25 anos;
Estar em bom estado clínico de saúde;
Não fumante e não etilista;
Não estar fazendo uso de algum medicamento.
A coleta do material (sangue periférico retirado da veia cefálica ou basílica) foi
realizada por profissionais capacitados, nas dependências da UNIFAC (Unidade de
Farmacologia Clínica da Universidade Federal do Ceará – UFC), utilizando seringa
esterilizada e descartável.
A versão alcalina do Ensaio do Cometa, mais especificamente conhecido pela sigla
inglesa SCGE, (Single Cell Gel Electrophoresis), tem sido usada para avaliar a
genotoxicidade in vitro de muitos compostos em células normais e transformadas, humanas
ou animais (DAUER et al., 2003).
O teste do cometa é um método simples, rápido, econômico e sensível que permite a
detecção de dano em DNA em células individualizadas. Ao expor a célula ao composto para
avaliação do possível efeito genotóxico, o dano pode ser visualizado pela realização de uma
eletroforese em lâmina, onde, fragmentos das fitas de DNA carregadas negativamente
começam a migrar afastando-se do núcleo, em direção ao anodo. Quando corados com
brometo de etídeo, cada núcleo e sua “cauda” de fragmentos associada remetem a alusão de
um cometa. O tamanho da cabeça e o comprimento da cauda são os padrões avaliados para
determinar a intensidade do dano (SINGH et al., 1988; HARTMANN; SPEIT, 1997).
78
4.4.8.2 Principio do ensaio
Este ensaio se baseia no processo de migração do DNA sobre o gel de eletroforese
devido à influência exercida por uma corrente elétrica.
4.4.8.3 Procedimento experimental
As células mononucleadas do sangue periférico (PBMC – 0,5 x 105 células/mL), assim
como a linhagem HL-60 (0,3 x 106 células/mL) foram cultivadas em RPMI 1640
suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico, e plaqueadas em placas de
24 poços, sendo incubadas por 24 horas com o composto RR07 nas concentrações de 0,25;
0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM respectivamente. A doxorrubicina (0,50 μM) foi usada como
controle positivo.
4.4.8.4 Execução do teste do Cometa
4.4.8.4.1 Preparo das lâminas
Após o período de incubação de 24 horas foi retirada uma alíquota de 20 μL de
células, a qual foi adicionada a 110 μL de agarose de baixo ponto de fusão 0,5% para preparo
das lâminas. As lâminas foram previamente cobertas por solução de agarose de ponto de fusão
normal 1,5% a 60°C e mantidas a temperatura ambiente por 24 horas até a solidificação da
agarose. Esta camada foi utilizada para promover a adesão da segunda camada de agarose de
baixo ponto de fusão, a qual foi preparada previamente. Em seguida, foram cobertas com
lamínulas (24 mm X 60 mm) para uniformizar a distribuição das células e mantidas a 4°C
para solidificação da agarose.
4.4.8.4.2 Lise celular
Após solidificação da agarose, a lamínula foi gentilmente removida e a lâmina
mergulhada em solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA and 10 mM Tris, pH 10, Triton
X-100 (0,1%) e DMSO (10%) a 4°C e protegida da luz, por no mínimo 1 hora antes da
corrida de eletroforese.
79
4.4.8.4.3 Neutralização e corrida em eletroforese
Depois de removidas da solução de lise, as lâminas foram colocadas em uma solução
de neutralização (300 mM de NaOH e 1 mM de EDTA, pH > 13; 4°C) por 15 minutos e
dispostas horizontalmente na cuba de eletroforese. A cuba foi mantida em banho de gelo para
a manutenção da temperatura em torno de 4°C, tendo sido acrescentada a solução de
eletroforese até completa imersão das lâminas.
Antes de iniciar a corrida de eletroforese, as lâminas ficaram em repouso por 20
minutos para permitir o desenrolamento do DNA, o afrouxamento de suas ligações e a
exposição dos sítios álcali-lábeis. Posteriormente, a eletroforese foi conduzida em baixa
luminosidade, usando 25 volts e corrente de 300 mA por 20 minutos. Após a eletroforese, as
lâminas foram retiradas da cuba e mergulhadas na solução de neutralização por 5 minutos, a
fim de neutralizar a alcalinidade. A fixação foi realizada com etanol 100%.
4.4.8.4.4 Coloração
Posteriormente, as lâminas foram coradas com 50 μl de solução de brometo de etídio
(20 µg/mL) e analisadas em microscópio de fluorescência.
4.4.8.4.5. Análise dos dados
A análise foi realizada de acordo com o padrão de escores previamente determinados
pelo tamanho e intensidade da cauda do cometa (Figura 10). Foram contados 100 cometas
por lâmina (n = 4) e classificados dentre as cinco categorias (0, 1, 2, 3 e 4), que representam a
percentagem de DNA na cauda do cometa, indicando o grau de dano sofrido pela célula
(LOVELL; THOMAS; DUBROW, 1999):
0 = sem danos ao DNA, portanto, sem cauda (< 5%)
1 = baixo nível de danos, com a cauda menor que o diâmetro da cabeça (5-20%)
2 = médio nível de danos, com a cauda representando 1-2x o diâmetro da cabeça (20-40%)
3 = alto nível de danos, com a cauda representando mais de 2x o diâmetro da cabeça (40-95%)
4 = dano total (> 95%)
80
O índice de dano (ID) foi obtido pela seguinte fórmula: ID = ini
i ×∑=
4
0
, onde in é o
número de células com nível de dano i (0, 1, 2, 3 ou 4). A freqüência de dano (FD) representa
a porcentagem de células que sofreram danos no DNA.
Os dados foram expressos como da média ± EPM de experimentos independentes (n =
2). Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os
dados serão comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste Student
Newman Keuls, com nível de significância estatística de 95% (p < 0,05) usando o programa
GraphPad (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).
Figura 10 – Representação dos tipos de cometa, sendo indicado o escore atribuído a cada cometa de acordo com
o dano ao DNA. Classificação por categoria de dano: (0) sem dano (< 5%); (1) Baixo nível de dano (5-20%); (2)
médio nível de dano (20-40%); (3) alto nível de dano (40-95%); (4) dano máximo (> 95%). Fonte: Collins
(2004b)
4.4.9 Estudo de aberrações cromossômicas induzidas pelo composto RR07 em células
mononucleadas do sangue periférico (PBMC)
4.4.9.1 Principio do ensaio
Os estudos de aberração se baseiam em alterações citológicas, as quais são
identificadas por corantes específicos e visualizadas por microscopia óptica.
81
4.4.9.2 Procedimento experimental
As células PBMC (0,5 x 105 células/mL) foram cultivadas em frascos de cultura
contendo RPMI 1640 suplementado com 20% de soro fetal bovino, 1% de antibióticos e 3%
de fitohemaglutinina durante 72 horas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 de acordo com o
protocolo de Preston, San Sebastian e McFee (1987). Duas horas antes do término do tempo
de incubação, foi adicionada em todas as culturas uma solução de colchicina (4 µM) para a
obtenção de metáfases. Posterior ao tempo de cultivo, as culturas foram fixadas com uma
solução fixadora (metanol/ácido acético, 3:1) mantida previamente gelada (4°C).
A capacidade do RR07 em induzir aberrações cromossômicas foi avaliada em
diferentes fases do ciclo celular (G1, S e G2) de acordo com PESSOA e colaboradores (2003).
4.4.9.3 Tratamentos
Para a análise citogenética, foram utilizadas 5 concentrações do composto RR07 (0,25;
0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM). Para avaliar a ação do RR07 nas diferentes fases do ciclo celular
(G1, S, G1/S e G2), foi utilizado o protocolo de tratamentos de acordo com Mitelman (1995).
Para a realização dos ensaios os experimentos foram divididos em seis, onde nos
experimentos 1, 3 e 5 as células foram tratadas com fitohemaglutinina, colchicina (controle
positivo – 4 μM), enquanto nos experimentos 2, 4 e 6 os PBMCs foram tratados inicialmente
com a fitohemaglutinina, com a finalidade de induzir a proliferação dos PBMCs, e em seguida
as células foram tratadas com a substância teste RR07, para observar o efeito da substância na
ausência da colchicina. A doxorrubicina foi utilizada como controle positivo nos seis
experimentos realizados na concentração de 0,50 μM.
1) Para avaliar o efeito do RR07 na fase G1 do ciclo celular, RR07 foi adicionado no
início da cultura (tempo zero) e após 50 horas foi adicionado colchicina que ficou incubada
junto com a droga teste por 2 horas (Experimento 1). O mesmo procedimento foi realizado
com o mesmo tempo de incubação, porém sem o acréscimo da colchicina (Experimento 2).
2) Para avaliar a fase de transição G1-S, o RR07 foi adicionado a cultura 24 horas após
o início de cultivo. Ao completar 50 horas do inicio da cultura, foi adicionado colchicina e
após 2 horas de incubação (52 horas), o material foi fixados em lâminas (Experimento 3). O
mesmo procedimento foi realizado adicionando-se RR07, porém na ausência de colchicina
(Experimento 4).
82
3) Para avaliar o efeito do composto RR07 na fase G2 do ciclo celular, as culturas
foram preparadas e após 69 horas do início da cultura, adicionou-se o composto teste RR07 e
após 1 hora (70 horas após o início da cultura) foi acrescentada a colchicina (4 µM). Com 72
horas após o início da cultura, o material foi fixado em lâminas (Experimento 5). O mesmo
procedimento foi realizado, porém sem o acréscimo de colchicina (Experimento 6), com
apresentado na Tabela 5.
Tabela 5 – Protocolo dos tratamentos do RR07 aplicado às culturas temporárias de PBMC.
Experimento Tratamento PHA RR07 COL Fixação
1 G1 0 h 0 h 50 h 52 h 2 G1 0 h 0 h __ 52 h 3 G1/S 0 h 24 h 50 h 52 h 4 G1/S 0 h 24 h __ 52 h 5 G2 0 h 69 h 70 h 72 h 6 G2 0 h 69 h ___ 72 h
PHA: fitohemaglutinina; COL: colchicina; RR07. Nota: Nos experimentos 2, 4 e 6 não foi adicionada a
colchicina para observar o possível efeito bloqueador do RR07 na fase de Metáfase.
4.4.9.4 Preparação das lâminas
Duas a quatro gotas (dependendo da quantidade do material) da suspensão celular
foram transferidas para lâminas limpa e seca. Após a montagem das lâminas, estas foram
coradas com uma solução de Giemsa (5%) por 7 minutos. Foram montadas cinco lâminas para
cada cultura.
4.4.9.5 Análise citogenética
A análise das lâminas foi realizada em microscópio óptico, com a finalidade de se
detectar possíveis alterações cromossômicas estruturais ou numéricas nas metáfases dos
PBMCs. Os cromossomos foram analisados com a objetiva de imersão (100X), em lâminas
codificadas, observando-se a posição do centrômero, alterações no grau de ploidia e
aberrações estruturais segundo Rabello-Gay, Rodrigues e Nonteleone-Neto (1991).
83
4.4.9.6 Critérios de análise
Os parâmetros analisados foram a frequência de células com aberrações
cromossômicas em 100 metáfases/cultura e o índice mitótico (IM), determinado pela
contagem do número de metáfases em 2000 linfoblastos/cultura (MOORHEAD et al., 1960).
O IM foi calculado usando-se a seguinte fórmula:
IM = 100oslinfoblastde totalNúmero
metáfases de Número×
4.4.9.7 Análise estatística
Para análise estatística do índice mitótico foram utilizados os testes ANOVA e o teste t
de Student para comparar as freqüências de células aberrantes em relação aos controles, no
software Prism® versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA), sendo os
resultados considerados significantes quando p < 0,05.
4.4.10 Viabilidade celular por citometria de fluxo
A viabilidade celular foi avaliada por citometria de fluxo analisando-se a integridade
da membrana plasmática e pela contagem de células com morfologia normal.
4.4.10.1 Análise da integridade de membrana plasmática por citometria de fluxo
4.4.10.1.1 Princípio do teste
As células em apoptose mantêm suas membranas íntegras durante quase todo o
processo até a sua morte, diferentemente daquelas necróticas. Este ensaio se baseia na
capacidade de o iodeto de propídeo (PI), hidrofílico, penetrar apenas nas células cuja
membrana plasmática (MP) esteja rompida e emitir alta fluorescência vermelha somente
quando excitado pelo laser de argônio (488 nm) e estiver ligado ao DNA. As células cuja
membrana permanece íntegra emitem menor fluorescência (DARZYNKIEWICZ et al., 1992).
84
4.4.10.1.2 Procedimento experimental
Células da linhagem HL-60, na concentração de 0,3 x 106 células/mL, foram
incubadas por 24 h com a substância RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00
μM. Uma alíquota de 100 µL de suspensão de células tratadas e não tratadas foi incubada com
100 µL de uma solução de PI a 50 µg/mL (diluído em tampão fosfato). Após 5 minutos, as
amostras foram analisadas por citometria de fluxo (EasyCyte, Guava Tecnologies, EUA).
Foram obtidas informações integridade de membrana utilizando-se o filtro para o espectro do
vermelho.
4.4.10.1.3 Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de um número de experimentos.
Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados
foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com
nível de significância estatística de 95% (p < 0,05) no programa GraphPad Prism versão 5.0
(Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).
4.4.11 Analise da morfologia celular por citometria de fluxo
4.4.11.1 Princípio do teste
O citômetro de fluxo (EasyCyte, Guava Tecnologies, EUA) é capaz de comparar
populações de células quanto às características de tamanho e de granulosidade (relativo a
organelas, vacúolos etc). A partir desta ferramenta, pode-se delimitar a região (por meio de
um gate) que compreende a população de células normais realizando a contagem da
população de interesse.
4.4.11.2 Procedimento experimental
Células da linhagem HL-60, na concentração de 0,3 x 106 células/mL, foram
incubadas por 24 horas com a substância RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e
4,00 μM. Uma alíquota de 100 µL de suspensão de células tratadas e não tratadas foi incubada
com 100 µL de uma solução de PI a 50 µg/mL (diluído em tampão fosfato). Após 5 minutos,
85
as amostras foram analisadas por citometria de fluxo (EasyCyte, Guava Tecnologies, EUA).
Foram obtidas informações sobre morfologia celular a partir do espalhamento frontal
(tamanho relativo entre as células) e espalhamento lateral (granulosidade relativa entre as
células).
4.4.11.3 Análise dos dados
Foi realizada a contagem separada das células que se encontravam dentro do gate
permitindo assim, analisar o efeito do RR07 sobre a redução da concentração de células
normais. Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de um número de experimentos.
4.4.12 Avaliação do ciclo celular e fragmentação de DNA por citometria de fluxo.
4.4.12.1 Princípio do teste
Esse método consiste na capacidade do iodeto de propídeo se ligar ao DNA de células,
cuja membrana plasmática foi primeiramente lisada por um detergente para permitir a entrada
do corante no núcleo. O ciclo celular é constituído pelas seguintes fases: G1, S, G2 e M.
Durante o período de crescimento celular (fase G1) uma célula diplóide apresenta um
conteúdo 2n (n – conteúdo de um conjunto haplóide de cromossomos) em DNA nuclear, isto
é, possui duas cópias de cada gene. Durante a fase S ocorre a duplicação do genoma nuclear
(2-4n) e na fase seguinte (fase G2) ocorre o segundo período de crescimento celular, durante o
qual o conteúdo em DNA nuclear é mantido no nível 4n. Em seguida ocorre a mitose (fase M,
4n) durante a qual a célula se divide, formando-se duas células filhas, cada uma com um
conteúdo 2n em DNA. As células que não se encontram em divisão celular (G0) apresentam
um conteúdo 2n em DNA. Assim, as diferentes fases do ciclo celular podem ser determinadas
a partir do conteúdo de DNA que elas apresentam.
Quando as células se apresentam com a cromatina condensada e/ou DNA
fragmentado, a quantidade de PI incorporada é menor, e, portanto emitem uma fluorescência
mais baixa (GORMAN et al., 1997).
86
4.4.12.2 Procedimento experimental
Células da linhagem HL-60, na concentração de 0,3 x 106 células/mL, foram
incubadas por 24 horas com a substância RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e
4,00 μM. A doxorrubicina (0,50 μM) foi usada como controle positivo. Uma alíquota de 100
µL de suspensão de células tratadas e não tratadas foi adicionado 100 µL de uma solução de
PI (50 µg/mL) diluído em tampão fosfato, contendo Triton X-100 a 0,2% e citrato de sódio
(0,1%). Após 30 minutos de incubação, no escuro, as amostras foram analisadas por
citometria de fluxo (EasyCyte, Guava Tecnologies, EUA) no filtro vermelho, onde foram
obtidos histogramas representando a quantidade de células em cada fase do ciclo celular (G1,
S e G2/M) e a quantidade de células com DNA fragmentado.
4.4.12.3 Análise dos dados
Os histogramas de ciclo celular montados como intensidade de fluorescência vermelha
(eixo x) versus números de células (eixo y) foram analisados no programa ModFit LT 3.1 com
a ferramenta syncronization wizard. Em seguida, de cada experimento realizado foram
contados 5000 eventos. Os dados foram expressos como a média ± EPM de três experimentos
independentes. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes
grupos, os dados serão comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de
Dunnet, com nível de significância estatística de 95% (p < 0,05), no programa GraphPad
Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).
4.4.13 Determinação do Potencial Transmembrânico de Mitocôndria (ΔΨm) – Ensaio da
rodamina 123
4.4.13.1 Princípio do teste
A mitocôndria é responsável pela iniciação da via intrínseca da apoptose. Quando o
Bcl-2/xl desprendem-se da membrana externa da mitocôndria, permitindo a abertura de poros
e a saída de H+ – causando a desestabilização do potencial transmembrânico de mitocôndria
(ΔΨm) – bem como a saída de citocromo c e Smac/DIABLO. O Bcl-2, citocromo c e
Smac/DIABLO livres no citoplasma são sinais para ativação da via intrínseca. A rodamina
123, um corante fluorescente liposolúvel e nucleofílico, é seqüestrada para dentro da
87
mitocôndria quando esta apresenta variação de potencial transmembrânico de mitocôndria
(ΔΨm) inalterado. Assim, as células viáveis emitirão alta fluorescência verde devido à maior
quantidade de rodamina 123 ligada às cargas positivas internas enquanto que as mitocôndrias
com polarização alterada terão menos afinidade pelo corante, gerando eventos que emitirão
menor fluorescência (GORMAN et al., 1997; QIAO; WONG, 2009).
4.4.13.2 Procedimento experimental
Células da linhagem HL-60, na concentração de 0,3 x 106 células/mL, foram
incubadas por 24 horas com a substância RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e
4,00 μM. A uma alíquota de 100 µL de suspensão de células tratadas e não tratadas foi
adicionado 200 µL de uma solução de rodamina 123 diluída na concentração de 1 µg/mL
(diluído em tampão fosfato). Após 15 minutos de incubação, a 37°C no escuro, as amostras
foram lavadas com PBS, reincubadas por 30 minutos e então analisadas por citometria de
fluxo (EasyCyte, Guava Tecnologies, EUA) no filtro verde.
4.4.13.3 Análise dos dados
Em cada experimento foram contados 5000 eventos. Os dados foram expressos como
a média ± EPM de três experimentos independentes. Para verificação da ocorrência de
diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de
variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível de significância estatística de
95% (p < 0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San
Diego, CA, EUA).
4.4.14 Detecção da externalização da fosfatidilserina – Teste da anexina-V
4.4.14.1 Princípio do teste
A externalização do fosfolipídeo de membrana, fosfatidilserina é, frequentemente, um
dos primeiros eventos a ocorrer quando a célula entra em apoptose. Este ensaio permite
diferenciar células viáveis, apoptóticas e necróticas pela coloração diferencial por
fluorescência. Neste ensaio, a detecção das células apoptóticas é feita pela ligação da anexina-
V conjugada a PE com a fosfatidilserina externalizada (fluorescência amarela). Células
88
necróticas são coradas pelo corante 7AAD (7-amino-actinomicina), que emitem fluorescência
vermelha, e penetra nas membranas celulares desintegradas e se ligam ao núcleo. Células sem
marcação pelos corantes são viáveis, verdes são consideradas apoptóticas e positivas para os
dois corantes são consideradas necróticas (VERMES et al., 1995; FREIKMAN et al., 2009).
4.4.14.2 Procedimento experimental
Células da linhagem HL-60, na concentração de 0,3 x 106 células/mL, foram
incubadas por 24 horas com a substância RR07 nas concentrações de 1,00; 2,50 e 5,00 μM.
Incubaram-se 135 µL da suspensão de células com 5 µL de 7AAD e 10 µL de Annexin-V-PE
do kit Guavanexin. Após 20 minutos de incubação, em gelo picado e no escuro, as amostras
serão analisadas por citômetria de fluxo (EasyCyte, Guava Tecnologies, EUA) com os filtros
vermelho e amarelo.
4.4.14.3 Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média ± EPM dos experimentos. Para
verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados
foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com
nível de significância estatística de 95% (p < 0,05) no programa GraphPad Prism versão 5.0
(Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).
4.4.15 Detecção da ativação de caspases
4.4.15.1 Princípio do teste
As caspases formam uma família de proteases intimamente relacionadas ao processo
de morte por apoptose. As diferentes caspases podem desempenhar suas funções tanto na
ativação quanto na deflagração de todas as vias apoptóticas (WANG et al., 2005).
Para detecção de caspases ativadas serão utilizados os kits Guava® EasyCyte Caspase
3/7 Kit e Guava® EasyCyte Caspase 8 Kit. A realização da detecção se dá pela alta
fluorescência verde emitida, que ocorre na ligação covalente do FLICA™ (Fluorescent-
Labeled Inhibitor of CAspases) que atravessa facilmente a membrana plasmática. As células
em apoptose inicial serão marcadas exclusivamente pelo FLICA. A contra coloração para
89
detecção de células em apoptose tardia e necrose será feita com iodeto de propídeo (PI), o
qual é bastante hidrofílico e só é capaz de se ligar ao DNA das células que tiverem danos na
membrana plasmática emitindo então alta fluorescência vermelha quando excitado pelo laser
argônio (488 nm).
4.4.15.2 Procedimento experimental
Células da linhagem HL-60, na concentração de 0,3 x 106 células/mL, foram
incubadas por 24 horas com a substância RR07 nas concentrações de 1,00; 2,50 e 5,00 μM.
Adicionou-se 10 µL de FLICA 10X às células controle e tratadas sendo incubadas por 1 h a
37°C, 5% de CO2, homogeneizando as amostras a cada 20 minutos. Após a incubação as
células foram lavadas com solução tampão de lavagem e adicionados 150 µL de PI diluído em
ST (75 µL de PI em 15 mL). Foi então realizada a aquisição no citômetro.
4.4.15.3 Análise dos dados
Através do programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San
Diego, CA, EUA), os dados foram analisados segundo análise de variância ANOVA seguida
de Dunnet com nível de significância estatística de 95% (p < 0,05) das médias do percentual
dos experimentos realizados em triplicata de células viáveis, em apoptose inicial, apoptose
tardia e necróticas.
4.4.16 Ensaios de inibição da polimerização da tubulina in vitro
4.4.16.1 Principio do ensaio
A realização deste ensaio está baseada na capacidade de um determinado agente inibir
a polimerização da tubulina, atividade esta que pode ser quantificada por espectrofotometria
em comprimento de onda de 340 nm (WALKER; SALMON; ENDOW, 1990; HYMAN et
al., 1993).
90
4.4.16.2 Procedimento experimental
Todo o experimento foi realizado sob resfriamento em gelo. Em placa multiwell de 96
poços, foi acrescentando 35 µL da solução Tampão A, contendo 80 mmol/LPIPES (pH 6,8), 1
mmol/L MgCl2 1 mmol/L EDTA. Em seguida, foi adicionado ao tampão 5 µL de uma solução
contendo 10 mg/mL de tubulina de cérebro bovino (com grau de pureza > 99%, TI238,
Cytoskeleton, InC, Denver, CO, EUA) e 5 µL glicerol a 10%. Posteriormente, adicionou-se
10 µL/poço do composto teste RR07 (na concentração de 10 µM). Após a adição das
amostras foi acrescentado à solução tampão A (já plaquada), 5 µL de GTP a 10 mmol. Logo
em seguida a placa já preparada foi então lida em leitor de ELISA a cada minuto durante um
tempo máximo de incubação de 30 minutos. A absorbância usada foi de 340 nm a 32°C.
Utilizou-se como controle positivo o agente citotóxico nocodazole (na concentração de 10
µM), o qual inibe a despolimerização dos microtúbulos in vitro. Foi utilizado também DMSO
(1,6%) como controle negativo e solução tampão sem tubulina como branco.
4.4.16.3 Análise dos dados
Através do programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San
Diego, CA, EUA), os dados foram analisados segundo análise de variância ANOVA seguida
de Dunnet com nível de significância estatística de 95% (p < 0,05).
4.4.17 Estudo do potencial antitumoral do composto RR07 em camundongos transplantados
com células tumorais do Sarcoma 180
4.4.17.1 Principio do ensaio
Este ensaio baseia-se na capacidade de células (Sarcoma 180) adquirirem a forma
sarcomatosa sólida com o desenvolvimento de massa tumoral após inoculação em
camundongos (SCHABEL; GRISWOLD; LASTER, 1977).
4.4.17.2 Procedimento experimental
A regressão total de tumores nos animais, a redução no crescimento dos tumores
sensíveis ao composto e/ou ao aumento da expectativa de vida durante o tratamento,
91
comparado com os animais não tratados são fatores diretamente relacionados à atividade
antitumoral. Schabel, Griswold e Laster (1977) demonstraram que o melhor resultado desses
fatores depende do procedimento do tratamento, que deverá ser começado até 48 horas após o
transplante. Neste período, as células tumorais já teriam iniciado a formação do nódulo
tumoral. O tumor utilizado foi o Sarcoma 180, o qual foi descoberto em 1914 no “Crocker
Laboratory (Columbia University, New York)”, sendo originalmente um tumor sólido, surgido
espontaneamente na região axilar de camundongos. Foi um tumor inicialmente classificado
como carcinoma mamário. Porém, após vários transplantes subcutâneos, assumiu a forma
sarcomatosa por volta de 1919 e, desde então, mantém-se inalterado até os dias de hoje.
Para averiguar o potencial antitumoral do RR07 foram utilizados camundongos
albinos da espécie Mus musculus Swiss machos adultos e sadios provenientes do Biotério
Central da Universidade Federal do Ceará (BIOCEN – UFC). Esses animais foram divididos
aleatoriamente em 6 grupos (n = 10 para cada grupo) com pesos variando entre 22 e 25 g (p <
0,05).
O modelo tumoral utilizado foi o tumor sólido do tipo Sarcoma 180. As células foram
implantadas na região axilar esquerda da pata dianteira. O animal doador, ou da manutenção,
foi sacrificado por deslocamento cervical, sendo realizado assepsia com álcool iodado. Em
seguida, foi retirado o líquido ascítico da cavidade abdominal e preparado uma suspensão de
células com 5,0 mL de Ringer lactato, 0,2 mL de gentamicina (5 mg/mL) e 0,5 mL do líquido
ascítico, para posterior contagem de células. Nos animais receptores, foram injetadas 2 x 106
células/0,5 mL na região axilar esquerda dos camundongos. Após 24 horas de inoculação, o
tratamento foi iniciado e realizado durante 8 dias consecutivos, utilizando como controle
negativo, o veiculo de diluição (DMSO 10%) e como controles positivos, os quimioterápicos
5-Fluorouracil – 5-FU – (10 mg/kg/dia), Vinblastina – VNB – (7 mg/kg/dia). Para o RR07,
foram estabelecidas as doses de 20 e 40 mg/kg/dia, além de um grupo o qual foi tratado com a
associação entre o quimioterápico 5-FU (10 mg/kg/dia) e o composto teste RR07 (20
mg/kg/dia). Todas as doses foram administradas via intraperitoneal (ip).
Todos os grupos foram mantidos sob as mesmas condições e sob regime de ingestão
ad libitum de ração comercial (Purina, São Paulo) e água clorada durante todo o período do
experimento.
Os animais foram pesados a cada 2 dias e observados quanto ao aparecimento de
qualquer sinal de toxicidade, como diarréia, letargia e convulsões. No final do experimento,
os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, sendo seus órgãos (rins, baço,
92
fígado e estômago) e tumores dissecados para avaliação do peso relativo e da atividade
antitumoral, respectivamente.
O percentual de inibição do crescimento tumoral (IT) foi calculado pela fórmula:
IT (%) = [(A-B)/A] x 100
Onde:
A = média dos pesos dos tumores no grupo controle.
B = média dos pesos dos tumores nos animais tratados.
4.4.17.3 Análise dos dados
Os resultados (peso relativo dos órgãos e tumores) foram expressos como média ±
EPM. A diferença entre os grupos foi analisada por análise de variância (ANOVA) seguida de
Student Newman Keuls usando o programa GraphPad (Intuitive Software for Science, San
Diego, CA, EUA) e considerada estatisticamente significante quando p < 0,05.
4.4.18 Avaliação histopatológica de órgãos de metabolização e da massa tumoral
4.4.18.1 Principio do ensaio
Este método está baseado nos princípios de preparo, coloração e fixação de tecidos,
além do auxilio da microscopia óptica para análise do material estudado.
4.4.18.2 Procedimento experimental
Após o sacrifício e dissecação dos animais, os órgãos e os tumores foram armazenados
em formol 10% para posterior análise macroscópica em relação à cor, tamanho e presença de
focos hemorrágicos.
Posteriormente, os tecidos foram processados, embebidos em parafina e secções de 3-
5 μm de espessura foram preparadas em lâminas. Depois de fixadas em formol 10%,
desparafinizadas em xilol por 15 minutos e desidratadas em álcool em crescentes
concentrações, as lâminas foram lavadas em água destilada, coradas com hematoxilina/eosina,
e examinadas em microscópio óptico (x 400).
93
4.4.18.3 Análise de dados
A análise do material foi realizada pela patologista Profa. Dra. Ana Paula Nunes
Negreiros do Laboratório de Patologia Bucal da UFC. O material foi previamente preparado
foi analisado em microscópio óptico em aumento de 400 vezes.
94
5 RESULTADOS
5.1 Estudo da atividade citotóxica de derivados estilbenóides
5.1.1 Estudo da atividade antiproliferativa em linhagens de células tumorais e células
mononucleares do sangue periférico (PBMC) pelo ensaio do MTT
Os ensaios realizados inicialmente com o resveratrol e compostos com base
estilbenóide (RR01, RR02, RR03, RR04, RR05, RR06, RR07, RR08, RR09, RR10, RR11)
foram realizados em um painel com 12 linhagens tumorais que revelaram o estilbeno
fenstatina, uma 4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona, no presente trabalho denominada
(RR07), com elevado potencial citotóxico cujos valores variaram entre 0,009 a 17,49 μM
entre as linhagens testadas. Vindo em seguida o composto RR11, o qual foi citotóxico apenas
para as linhagens B-16 F10, CEM, Jukart e MDA-MB 435 cujos valores de CI50 foram de
4,31; 8,96; 30,95 e 37,13 µM, respectivamente. O composto RR01 apresentou citotoxicidade
para as linhagens testadas (Jukart, MDA-MB 231 e MX-1) com CI50 de 15,26; 19,24 e 40,48
µM, respectivamente. Já o composto RR03 foi citotóxico para as linhagens (HL-60, Jukart, K-
562 e MDA-MB 435) mostrando CI50 de 26,71; 19,64; 26,55 e 25,30 µM, respectivamente.
Para o composto RR06 observou-se citotoxicidade apenas para as linhagens Jukart e MDA
MB-435 com CI50 de 6,54 e 62,46 µM, respectivamente (Tabelas 6 e 7). As amostras RR02,
RR04, RR05, RR09 e RR10, não apresentaram potencial citotóxico, cujas CI50 foram maiores
do que 104 µM em todas as linhagens testadas. Já o resveratrol, molécula referencia para o
estudo do grupo estilbenóide apresentou citotoxicidade moderada, cuja CI50 foi 10,74 µM
para a linhagem HL-60 e para as demais linhagens foi de 22,52 µM a 62,87 µM.
95
Tabela 6 – Atividade citotóxica de compostos estilbenóides frente às linhagens tumorais.
Células humanas de leucemia (CEM, HL-60, JUKART, K-562), carcinoma de cólon (HCT-8)
e melanoma murino (B-16 e B16-F10). B-16 B-16-F10 CEM HCT-8 HL-60 JUKART K-562 Amostra
CI50 [μg/mL (μM)
Doxorubicina 0,03 (0,05) 0,02 – 0,04
0,04 (0,07) 0,03 – 0,05
0,02 (0,03) 0,01 – 0,02
0,04 (0,07) 0,03 – 0,05
0,02 (0,03) 0,01 – 0,02 NT 0,14 (0,24)
0,09 – 0,23
Resveratrol 14,35 (62,91) 11,97 – 17,21
5,82 (25,51) 5,14 – 6,59
5,91 (25,91) 4,39 – 7,97
5,82 (25,51) 5,14 – 6,59
2,45 (10,74) 1,95 – 3,09 NT 9,62 (42,18)
3,48 – 2,65
RR01 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 4,34 (15,26) 1,49-12,57 > 25
RR02 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25
RR03 > 25 > 25 > 25 > 25 6,42 (26,71) 5,35 – 7,28
4,72 (19,64) 2,49 – 8,96
6,38 (26,55) 3,13 – 13,01
RR04 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 RR05 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25
RR06 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 1,86 (6,54) 0,71 – 4,87 > 25
Doxorrubicina 0,03 (0,05) 0,02 – 0,04
0,04 (0,07) 0,03 – 0,05
0,02 (0,03) 0,01 – 0,02
0,04 (0,07) 0,03 – 0,05
0,02 (0,03) 0,01 – 0,02 NT 0,14 (0,24)
0,09 – 0,23
Resveratrol 14,35 (62,91) 11,97 – 17,21
5,82 (25,51) 5,14 – 6,59
5,91 (25,91) 4,39 – 7,97
5,82 (25,51) 5,14 – 6,59
2,45 (10,74) 1,95 – 3,09 NT 9,62 (42,18)
3,48 – 2,65
RR07 0,22 (0,72) 0,12 – 0,42
4,06 (0,40) 2,58 – 6,39
0,06 (0,19) 0,04 – 0,08
0,12 (0,40) 0,07 – 0,19
0,04 (0,13) 0,03 – 0,05
0,67 (2,21) 0,55 – 0,08
0,07 (0,26) 0,06 – 0,08
RR09 > 25 NT 14,31 (39,27) 5,52 – 37,03 > 25 > 25 > 25 > 25
RR10 > 25 NT > 25 > 25 > 25 > 25 > 25
RR11 > 25 1,46 (4,31) 0,78 – 2,75
3,05 (8,96) 0,63 – 14,5 > 25 > 25 10,53 (30,95)
7,52 – 14,72 > 25
* Valores de CI50 em μg/mL e (μM) originados de experimentos independentes (n=3) de análogos do resveratrol
obtidos pelo ensaio do MTT em um painel de linhagens celulares após 72 h de incubação. Os dados foram
obtidos por regressão não linear com intervalo de confiança de 95% através do programa GraphPad Prisma
versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA). NT: não testado
96
Tabela 7 – Atividade citotóxica de compostos estilbenóides frente às linhagens tumorais.
Carcinoma de mama (MDA-MB 231, MDA-MB 435, MX-1), carcinoma de próstata (PC-3) e
glioblastoma (SF-295). MDA MB 231 MDA MB 435 MX-1 PC-3 SF-295 Amostra
CI50 [μg/mL (μM)
Doxorrubicina 0,33 (0,38) 0,18 – 0,26
0,48 (0,83) 0,34 – 0,66
0,076 (0,13) 0,17 – 0,24
0,24 (0,41) 0,21 – 0,27
0,23 (0,40) 0,19 – 0,25
Resveratrol NT 13,81 (60,55) 10,44 – 18,25 NT 3,51 (15,39)
2,99 – 2,45 NT
R01RR01 5,47 (19,24) (4,31- 6,95) > 25 11,51 (40,48)
(5,80 – 22,86) > 25 >25
RR02 > 25 > 25 > 25 > 25 >25
RR03 > 25 6,08 (25,30) 2,22 – 16,70 > 25 > 25 >25
RR04 > 25 >25 > 25 > 25 >25 RR05 > 25 >25 > 25 > 25 >25
RR06 > 25 17,76 (62,46) 16,36 – 19,30 > 25 > 25 >25
Doxorrubicina 0,33 (0,38) 0,18 – 0,26
0,48 (0,83) 0,34 – 0,66
0,07 (0,13) 0,17 – 0,24
0,24 (0,41) 0,21 – 0,27
0,23 (0,40) 0,19 – 0,25
Resveratrol NT 13,81 (60,55) 10,44 – 18,25 NT 3,51 (15,39)
2,99 – 2,45 NT
RR07 5,29 (17,49) 2,86 – 9,79
0,06 (0,21) 0,05 – 0,06
0,91 (3,01) 0,40 – 2,05
0,812 (2,68) 0,44 – 1,52
0,003 (0,009) 0,0009 – 0,001
RR09 >25 >25 >25 >25 >25 RR10 >25 >25 >25 >25 >25
RR11 NT 12,63 (37,13) 11,40 – 14,00 NT >25 >25
* Valores de CI50 em μg/mL e (μM) originados de experimentos independentes (n=3) de análogos do resveratrol
obtidos pelo ensaio do MTT em um painel de linhagens celulares após 72 h de incubação. Os dados foram
obtidos por regressão não linear com intervalo de confiança de 95% através do programa GraphPad Prisma
versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA). NT: não testado
5.2 Avaliação da atividade antimitótica – Desenvolvimento embrionário em ovos de
ouriço-do-mar (Lytechinus variegatus)
Após avaliação da citotoxicidade pelo ensaio do MTT, os análogos estilbenóides
foram submetidos ao ensaio de desenvolvimento embrionário em ovos de ouriço do mar, com
o intuito de avaliar a atividade antimitótica.
Foi observado que todos os análogos RR07, RR11 e o resveratrol inibiram de maneira
completa o desenvolvimento embrionário dos ovos de ouriço-do-mar a partir da na primeira
divisão. Assim, os compostos RR07, RR11 e o resveratrol apresentaram atividade
antimitótica, semelhante a doxorrubicina, a partir da 1ª divisão celular, na menor concentração
testada de 33,07 e 27,37 µM para o RR07 e RR11 respectivamente (Tabela 8).
O composto RR10 causou moderada inibição na primeira divisão 44,5 ± 1,6, com a
maior concentração testada 416,23 µM, porém nos estágios posteriores a inibição foi de 100%
± 0 na fase de 3 divisão e 95,4 ± 2 na fase de blástula. Observou-se também que o análogo
97
RR02, RR03 e RR04 induziram total inibição do desenvolvimento nos três estágios
observados, apenas nas respectivas concentrações de 318,18; 416,16 e 409,29 µM. Enquanto
os compostos RR01, RR05, RR06, RR09 não inibiram o processo mitótico nas 1ª e 3ª
divisões, mesmo nas duas concentrações testadas, neste caso, o composto RR06 na
concentração máxima de 369,68 µM inibiu a fase de blástula (Tabela 8).
Tabela 8 – Atividade antimitótica do resveratrol e análogos estilbenóides no desenvolvimento
de ovos de ouriço-do-mar Lytechinus variegatus nos estágios de 1ª divisão, 3ª divisão e
blástula.
Substâncias Concentraçãoμg/mL (μM)
1a DivisãoInibição ±EPM (%)
3a DivisãoInibição ±EPM (%)
Blástula Inibição ± EPM (%)
10 (18,88) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 Doxorrubicina 100 (188,84) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 10 (35,17) 4,3 ± 1,5 0 ± 0 0,7 ± 0,7 RR01 100 (351,74) 3 ± 2,1 0 ± 0 0,7 ± 0,7 10 (31,18) 0 ± 0 2,3 ± 1,2 5 ± 2,5 RR02 100 (318,18) 100 ± 0 100± 0 100 ± 0 10 (41,61) 0 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 RR03 100 (416,16) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 10 (40,92) 0 ± 0 6 ± (2,3) 83 ± 5,5 RR04 100 (409,29) 0 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 10 (39,32) 0 ± 0 3,6 ± 3,2 0,3 ± 0,3 RR05 100 (393,26) 0 ± 0 9,3 ± 5,5 68,7 ± 3 10 (36,98) 0 ± 0 7,6 ± 3,8 5,3 ± 2,7 RR06 100 (369,98) 0 ± 0 7,3 ± 1,6 99,7 ± 0,3 10 (33,07) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 RR07 100 (330,77) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 10 (27,14) 2,3 ± 2,3 0,6 ± 0,6 3,7 ± 2,7 RR09 100 (271,42) 1 ± 0,6 1,6 ± 1,6 10,7 ± 6,4 10 (41,62) 12,3 ± 3,6 96,3 ± 1,6 97,3 ± 2,7 RR10 100 (416,23) 44,5 ± 1,6 100 ± 0 95,4 ± 2 10 (29,79) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 RR11 100 (293,79) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 10 (43,81) 97,9 ± 1,1 100 ± 0 100 ± 0 Resveratrol 100 (438,13) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0
A tabela apresenta os valores de CI50 e o intervalo de confiança de 95% de dois experimentos independentes
realizados em triplicata para a primeira e terceira divisões e blástula. Dados obtidos por regressão não linear
através do programa GraphPad Prisma 5.0.a, (p < 0,05) comparado entre as substâncias por ANOVA seguido por
Student Newman Keuls.
98
5.3 Avaliação do dano à membrana plasmática – Atividade hemolítica em eritrócitos de
camundongos Mus musculus Swiss
Os estudos realizados para a determinação da atividade hemolítica por meio do dano
em membrana de eritrócitos indicaram que todas as amostras apresentaram CE50 > 200
µg/mL, não tendo apresentado atividade hemolítica na membrana dos eritrócitos (Tabela 9).
Tabela 9 – Avaliação do potencial hemolítico do Resveratrol e outros compostos
estilbenódies.
Substância-Teste EC50 μg/mL (μM) RR 01 (Ácido 3-(3,4-dimetoxifenil)-2-fenil acrílico) > 200 μg/mL (703,4 μM) RR 02 (Ácido 3-(4-acetóxi-3-metoxifenil)-2-fenil acrílico) > 200 μg/mL (636,3 μM) RR 03 (1,2-dimetoxi-4-[(Z)-2-fenil-1-etenil] benzeno) > 200 μg/mL (832,3 μM) RR 04 (1,2-dimetoxi-4-[(E)-2-fenil-1-etenil] benzeno) > 200 μg/mL (818,5 μM) RR 05 (Ácido 3-(3,4-metoxifenil)-2-fenil acrílico) > 200 μg/mL (786,5 μM) RR 06 (Ácido 3-(4-hidróxi-3-metoxifenil)-2-fenil acrílico) > 200 μg/mL (738,9 μM) RR 07 (4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona) – fenstatina > 200 μg/mL (661,5 μM) RR 09 (4-(1,8-dimetóxi-9H-xantenila-9)-2-metoxifenol) > 200 μg/mL (542,8 μM) RR 10 (Ácido 3-(2-hidroxifenil)-2-fenil acrílico) > 200 μg/mL (661,5 μM) RR 11 (9-(4-hidroxi-3-metoxi)-3,4,5,6,7,9-hexahidro-2H-xantene-1,8-diona)
> 200 μg/mL (832,4 μM)
Resveratrol (5-[2-(4-hidroxifenil)-vinil]-benzeno-1,3-diol) > 200 μg/mL (876,2 μM) EC50: concentração efetiva em que a substância-teste causa hemólise em 50% dos eritrócitos).
5.4 Estudo do mecanismo de ação do RR07 em células HL-60 (leucemia promielocítica).
Os compostos RR07 e RR11 foram previamente selecionados para dar continuidade
aos estudos, uma vez que, foram os mais citotóxicos e apresentaram atividade antimitótica no
desenvolvimento embrionário do ouriço do mar na menor concentração testada. Porém, a
disponibilidade de material para teste foi apenas para o RR07, sendo o estudo prosseguido. Os
estudos foram realizados na linhagem HL-60, após 24 h de incubação com as amostras.
99
5.5 Estudo da atividade antiproliferativa do composto RR07 em cultura de células HL-
60 e PBMC com 24 horas de incubação pelo ensaio do MTT
No ensaio de citotoxicidade em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) o
composto RR07 mostrou elevada citotoxicidade, com CI50 de 5,68 μM após 24 horas
incubação. Na linhagem tumoral HL-60 a sua CI50 foi de 0,50 μM. Desse modo, na relação
comparativa dos PBMCs com a linhagem tumoral HL-60 (CI50 em PBMCs/CI50 em HL-60)
foi observado uma ação citotóxica da substância de aproximadamente 11 vezes mais ativa
para a linhagem tumoral quando comparada a atividade em PBMCs (Tabela 10).
Tabela 10 – Avaliação citotóxica do composto RR07 na linhagem tumoral estabelecida (HL-
60) e na linhagem normal obtida por cultura primária (PBMC) com 24 horas de incubação.
Linhagem CI50 [μg/mL (μM)]* Amostra HL-60 PBMC
RR07 (4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona) 0,15 (0,49) 0,11 – 0,18
1,77 (5,68) 1,30 – 2,27
Índice de seletividade 11 *A tabela apresenta os valores de CI50 originados de experimentos independentes (n=3) obtidos por regressão
não linear, através do programa GraphPad Prisma versão 5.0, com intervalo de confiança de 95% pelo método
do MTT após 24 horas de exposição. O índice foi calculado tomando como base a linhagem HL-60 (leucemia
promielocítica).
5.6 Estudo de Viabilidade Celular – Exclusão pelo método do Azul de Tripan
O ensaio de viabilidade celular por exclusão do azul de tripan em células HL-60
(leucemia promielocítica) permitiu diferenciar células viáveis (transparente) de células não-
viáveis (azul).
Na análise realizada após as 24 horas de incubação com o composto fenstatina (4-
metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona) – RR07 foi observada acentuada redução no
percentual de células viáveis correspondente a 26,66 ± 1,45; 20,66 ± 1,66; 16,33 ± 1,66; 12,66
± 1,45 e 8,00 ± 0,57% de acordo com as concentrações testadas de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e
4,00 μΜ, respectivamente.
Vale ressaltar que, na maior concentração (4,00 μM), o composto RR07 causou 92% de
redução significativa (p < 0,001) no número de células viáveis, sendo indicativo de alto
potencial citotóxico dessa substância (Gráfico 1).
100
C D 0,25 0,50 1,00 2,00 4,000
102030405060708090
100ViáveisNão Viáveis
(μM)RR07
* **
* **
* *** **
Cél
ulas
HL
- 60
(%)
Gráfico 1 – Efeito da viabilidade em células leucêmicas (HL-60). A viabilidade de células leucêmicas foi
determinada por exclusão de azul de tripan após 24 horas de incubação com o RR07. O controle negativo (C) foi
tratado apenas com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). O controle positivo, doxorrubicina
0,5 μM (D). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=3). p < 0,001
comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.
5.7 Avaliação cinética da atividade antiproliferativa em cultura de células leucêmicas da
linhagem promielicítica HL-60 – exclusão por azul de tripan
A curva de crescimento celular foi usada para determinar a cinética de crescimento de
células leucêmicas (HL-60) sob ação do composto RR07, nos intervalos de tempo de 3 h, 6 h,
12 h, 18 h e 24 h. O composto foi testado em cinco concentrações diferentes de 0,25; 0,50;
1,00; 2,00 e 4,00 µM, as quais induziram uma redução no número de células viáveis, de modo
concentração-dependente.
A partir de 6 horas de tratamento foi observado uma redução número de células
viáveis de 61,5% ± 0,64% e 68,25% ± 1,18% nas concentrações testadas de 2,00 e 4,00 µM
respectivamente.
Enquanto que no período de 12 horas de incubação foi observado uma redução de 54%
(± 0,70%) no número de células viáveis a partir da menor concentração testada 0,25 µM. Já
no período de 24 horas foi detectada diminuição de 56,75% ± 1,10% para 0,25 µM e de
81,5% ± 1,32% para a concentração de 4,00 µM. Os controles positivos doxorrubicina (0,50
µM) e paclitaxel (0,05 µM) em 24 h de incubação, reduziram o numero de células viáveis em
101
63,5% ± 1,19% e 65,5% ± 0,64%, respectivamente, onde foi observada uma redução causada
pelo RR07 significativa em relação ao controle com valor de p<0,05 em 24 horas (Gráfico 2).
Gráfico 2 – Curva cinética de crescimento celular na linhagem HL-60 (leucemia promielocitica humana) tratada com o composto RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 µM. A viabilidade celular foi determinada por exclusão de azul de tripan nos tempos de 3, 6, 12, 18 e 24 horas de incubação. Os dados correspondem à média ± EPM de três experimentos independentes realizado em duplicata, (*p < 0,001) comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls. Doxorrubicina (0,50 µM) e Paclitaxel (0,05 µM) foram utilizados como controles positivos
3 horas
C -
DOX 0,5
PTX 0,05
0,2
50,5
01,0
02,0
04,0
00
10
20
30
40
50
60
70ViáveisNão Viáveis
RR 07
μM
Nº d
e cé
lula
s
6 horas
C -
DOX 0,5
PTX 0,05
0,2
50,5
01,0
02,0
04,0
00
10
20
30
40
50
60
70ViáveisNão Viáveis
μM
**
RR07
Nº d
e cé
lula
s12 horas
C -
DOX 0,5
PTX 0,05
0,2
50,5
01,0
02,0
04,0
00
10
20
30
40
50
60
70ViáveisNão Viáveis
μM
* * **
*
Nº d
e cé
lula
s
18 horas
C -
DOX 0,5
PTX 0,05
0,2
50,5
01,0
02,0
04,0
00
10
20
30
40
50
60
70ViáveisNão Viáveis
μM
** *
**
RR07
Nº d
e cé
lula
s
24 horas
C -
DOX 0,5
PTX 0,05
0,2
50,5
01,0
02,0
04,0
00
10
20
30
40
50
60
70ViáveisNão Viáveis
μM
* **
**
RR07
Nº d
e cé
lula
s
102
5.8 Análise morfológica – coloração diferencial com hematoxilina/eosina
No ensaio de avaliação da morfologia celular, após 24 horas de tratamento, foi
observado que as células não-tratadas apresentavam núcleos volumosos e homogêneos,
citoplasma com vacúolos pequenos e escuros (Figura 11A). Enquanto nas células tratadas
com a doxorrubicina a 0,50 µM foi identificada uma intensa destruição da membrana
plasmática, caracterizando células em necrose, além de fragmentação nuclear com alguns
núcleos picnóticos (Figura 11B).
Considerando as células tratadas com RR07 (0,25 µM) foi visto condensação
periférica regular da cromatina e fragmentação de DNA, características típicas de apoptose.
Alem disso, pôde-se observar células com inibição da metáfase (Figura 11C). Na
concentração de 0,50 µM foi verificado rompimento de membrana plasmática com liberação
de corpos apoptóticos, fragmentação nuclear e núcleo picnótico (Figura 11D). A análise das
células na concentração de 1,00 µM permitiu mostrar inibição de metáfase, fragmentação de
DNA e a presença predominante de vacuolização do núcleo, sugerindo morte celular por
apoptose, (Figura 11E). De modo menos freqüente, foi visualizado danos em membrana
plasmática e restos celulares, indicando necrose nas células tratadas com 2,00 µM (Figura
11F).
103
Figura 11 – Fotomicrografias das células HL-60 tratadas e não tratadas, após 24 h de incubação com RR07.
Aumento 400X (A,B,C,D e E). Aumento 1000X (F). A, controle negativo; B, doxorrubicina a 0,56 µM; C, D, E
e F, RR07 a 0,25; 0,50 e 1,00 µM respectivamente. Setas: pretas indicam exemplos de fragmentação nuclear;
vermelhas indicam membrana plasmática rompida; azuis indicam exemplos de redução do volume celular;
laranjas indicam blebing; verdes indicam inibição de mitose/presença de cromossomos metafásicos; amarelas
mostram núcleos picnóticos.
A
E
C D
B A
F
104
5.9 Determinação da síntese do DNA: incorporação da bromodeoxiuridina (BrDU)
A incorporação do nucleotídeo BrdU frente as células da linhagem HL-60 (leucemia
promielocítica) foi realizada após 24 horas de incubação com RR07, onde nas concentrações
de 0,25; 0,50 e 1,00 µM ocorreu a incorporação do BrdU correspondentes a 36,5 ± 2,55%;
17,63 ± 2,03% e 12,13 ± 1,49%, respectivamente. A redução foi significativa em todas as
concentrações testadas, com p < 0,001. A doxorrubicina 0,50 µM e o paclitaxel 0,05 µM
incorporaram BrdU em 15,75 ± 0,86 e 12,88 ± 0,85%, respectivamente (Gráfico 3).
C D P 0,25 0,50 1,000
20
40
60
80
100
**
*
* *
R R 0 7
(μ M )
87,50 ± 4,34
15,75 ± 0,8612,88 ± 0,85
36,5 ± 2,55
17,63 ± 2,0512,13 ± 1,49C
élul
as B
rdU
Pos
itiva
s (%
)
Gráfico 3 – Determinação do percentual de síntese do DNA. Foi avaliado pela incorporação de
bromodeoxiuridina (BrdU) nas células HL-60, após 24 h de incubação. O controle negativo (C) foi tratado
apenas com o veículo utilizado para diluição da substância (DMSO 1,6%). Os quimioterápicos doxorrubicina 0,5
μM e paclitaxel 0,05 μM foram utilizados como controle positivo (D e P, respectivamente). Os dados
correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=2). *p < 0,001 comparado com o controle pela
análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Student Newman-Keuls.
5.10 Estudos para verificação dos padrões de morte celular
5.10.1 Marcação diferencial por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina (BE/LA)
As substâncias testadas, doxorrubicina 0,50 μM (controle positivo) e o RR07 nas
concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM, reduziram o número de células viáveis de
forma concentração dependente, sendo essa diminuição acompanhada pelo aumento de
105
células apoptóticas 57,78 ± 0,88%; 67,67 ± 2,16%, nas duas primeiras concentrações de 0,25
e 0,50 μM, respectivamente. Enquanto nas demais concentrações, foram observadas
diminuições no número de células apoptóticas 53,77 ± 3,85%; 53,00 ± 0,77%; 44,88 ± 0,96%,
correspondentes, respectivamente, às concentrações de 1,00; 2,00 e 4,00 μM, em detrimento
ao aumento no número das células necróticas cujos percentuais foram de 17,55 ± 1,23%;
22,11 ± 2,27%; 36,22 ± 1,49%; 41,22 ± 1,05% e 53,66 ± 0,83% para as respectivas
concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μΜ do RR07 (Figura 12 e Gráfico 4).
Foi evidenciado ainda que as células HL-60 tratadas por 24 horas com o composto
RR07, a partir da concentração de 0,25 μΜ, sendo mais intenso na concentração de 0,50 μM,
apresentaram modificações morfológicas como condensação e fragmentação da cromatina,
diminuição do volume celular, sendo estas alterações constatadas por células apresentando
intensidade verde brilhante, característica de apoptose (Figura 12C e 9D).
A coloração alaranjada ou vermelha nas células foi visualizada desde a menor
concentração testada de 0,25 μM até a concentração máxima de 4,00 μM, onde foi visto um
maior número de células em estado de necrose correspondente a 17,55% ± 1,23% a 53,66 ±
0,83%, respectivamente, (*p < 0,001).
106
Figura 12 – Morfologia das células da linhagem promielocítica (HL-60) após 24 h de tratamento, coradas por
laranja de acridina/brometo de etídeo e visualizadas por microscopia de fluorescência. O controle negativo (A)
foi o DMSO (400X). O controle positivo (B) foi a doxorrubicina – 0,50 μM – (100X). Os quadros C, D, E, F, G
e H correspondem ao tratamento com o composto RR07 nas respectivas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00
e 4,00 μM em aumento de 400X. Setas: Brancas exibem exemplos de células viáveis com integridade nuclear e
de membrana; Amarelas apontam células com e surgimento dos corpos apoptóticos e fragmentação nuclear;
Laranjas indicam exemplos de aumento do volume celular e rompimento da membrana plasmática.
A
E
D
F
G H
C
B
107
C D 0,25 0,50 1,00 2,00 4,000
102030405060708090
100ViáveisApoptoseNecrose
(μM)
RR07
* **
* **
** *
**
**
* ** *
Cél
ulas
(%)
Gráfico 4 – Determinação dos percentuais sobre os eventos celulares (viabilidade celular, apoptose e necrose)
avaliado em linhagem celular HL-60 (leucemia promielocítica). A análise foi realizada após 24 horas de
incubação com o composto RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM. O controle negativo
(C) foi tratado apenas com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMS0 1,6%). A doxorrubicina –
0,50 μM – foi utilizada como controle positivo (D). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos
independentes (n=3). *p < 0,001 comparado com o controle por ANOVA seguido por Student Newman-Keuls.
5.11 Avaliação do potencial genotóxico do RR07 em células mononucleadas do sangue
periférico (PBMC)
A avaliação do potencial genotóxico induzido pelo RR07 foi realizada através do teste
do cometa, em PBMCs, após 24 horas de incubação. As concentrações utilizadas neste ensaio
foram baseadas aos valores de CI50 encontrados no ensaio de citotoxicidade pelo MTT em
PBMC, a partir da menor concentração utilizada para a avaliação do potencial citotóxico em
24 horas de incubação (0,25 μM).
Foi observado que até a concentração de 1,00 μM não houve diferenças significativas
em relação ao padrão de migração do DNA quando comparadas ao grupo controle. Somente a
partir da concentração 2,00 μM foi observado um aumento na migração do DNA, de forma
concentração dependente e observou-se ainda a prevalência de cometas 3 e 4 (altos níveis de
dano), sendo característico de citotoxicidade (Gráficos 5 e 6). A analise de dados foi
estatisticamente significativa com *p < 0,05.
108
C 0,25 0,50 1,00 2,00 4,000
25
50
75
10001234
(μM)
RR07
**
Grau de DanoFr
equê
ncia
de
dano
(%)
Gráfico 5 – Freqüência de dano ao DNA. O composto RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM sobre PBMC, analisado pelo teste do cometa após 24 horas de incubação. C: controle negativo. Os dados correspondem à média ± EPM de dois experimentos independentes (*p < 0,05) comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnet.
C 0,25 0,50 1,00 2,00 4,000
100
200
300
400
RR07
μM
*
*
Índi
ce d
e da
no
Gráfico 6 – Índice de dano ao DNA. O composto RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM sobre células da linhagem PBMC (A e B), analisado pelo teste do cometa após 24 horas de incubação. C: controle negativo. Os dados correspondem à média ± EPM de dois experimentos independentes (*p < 0,05) comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnet.
109
5.12 Análise das aberrações cromossômicas em células mononucleares de sangue
periférico (PBMC) após tratamento com o RR07
As célilas PBMC foram inicialmente tratadas com colchicina (40 μM) e com o
composto teste RR07, nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM, sendo
observado que um aumento na concentração levou à diminuição no percentual do índice
mitótico – IM, situação mais evidente para a concentração 4,00 μM, correspondente a 2,8%
no experimento 1 (na presença de colchicina). No experimento 2 (na ausência da colchicina)
em uma mesma concentração foi observado um índice mitótico 0,6% (Tabela 11). As células
que foram tratadas apenas com RR07 (na concentração de 4,00 μM) na ausência de
colchicina, o percentual encontrado para o índice mitótico foi de 0,6; 0,8 e 2,5%,
respectivamente para as fases G1, G1/S e G2 (Tabelas 11, 12 e 13).
Vale salientar que as células, na fase G1, tratadas com o composto RR07 tiveram a
fase do ciclo bloqueada em metáfase, de forma semelhante ao bloqueio realizado pela
colchicina, com intensa condensação em um período de incubação de 52 horas. Foi observada
intensa condensação dos cromossomos em que em alguns casos assemelhou-se à condensação
causada pelo controle positivo – colchicina (Tabela 11 – Experimento 1).
Tabela 11 – Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico (IM) em culturas de PBMC
humanos com RR07 na fase G1 (Experimentos 1 e 2) do ciclo celular
ACs Experimento Tratamento (µM) IM (%)Gaps quebras Total
Pol Endo
- 4,6 1 0 1 1 0 0,25 4,0 3 1 4 2 0 0,50 3,8 3 1 4 2 0 1,00 3,0 2 2 4 1 1 2,00 2,9 3 2 5 2 0 4,00 2,8 4 4 8 2 0
Dox 0,5 2,0 4 7 11 3 0
1
- 0,2 0 0 0 0 0 0,25 1,0 3 1 4 0 0 0,50 2,2 4 2 6 0 1 1,00 2,3 3 2 5 2 0 2,00 1,8 2 2 4 0 0 4,00 0,6 3 3 6 1 2
2
Dox 0,5 0 0 0 0 0 0 Pol: Células Poliplóides; Endo: Endoreduplicação; COL: (Controle positivo, 4 µM); DOX: Doxorrubicina
(Controle positivo, 0,50 µM). Experimento 1: RR07 + Colchicina; Experimento 2: RR07 sem colchicina
110
Os experimentos 2, 4 e 6 (Tabelas 11, 12 e 13) mostram que as células tratadas com o
composto teste RR07, na ausência da colchicina, indicavam acúmulo em metáfase, sendo este
efeito mais proeminente na fase G2 (Tabela 13 – Experimento 6). Vale destacar, que foram
observados eventos semelhantes no tocante à condensação dos cromossomos, porém em
menor intensidade e de significância estatística (p < 0,01). Para a análise da fase G2, as células
foram tratadas e incubadas por apenas 3 horas, onde os cromossomos apresentaram
interrupção da mitose (em metáfase) para o RR07, de modo semelhante ao apresentado pela
colchicina, quando no tratamento das células sob as mesmas concentrações.
Tabela 12 – Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico (IM) em cultura de PBMC
humanos com RR07 na fase G1/S (Experimentos 3 e 4) do ciclo celular.
ACs Experimento Tratamento (µM) IM (%)Gaps quebras Total
Pol Endo
- 4,4 2 0 2 0 0 0,25 4,2 2 0 2 2 0 0,50 4,0 2 1 3 1 1 1,00 3,4 4 2 6 1 1 2,00 3,2 3 2 9 1 0 4,00 3,0 4 3 7 2 1
3
Doxo 0,5 2,5 10 5 15 2 1 - 0,2 0 0 0 0 0
0,25 1,6 1 0 1 1 0 0,50 2,8 1 0 1 0 0 1,00 2,7 1 3 4 1 0 2,00 1,9 2 3 5 0 1 4,00 0,8 1 4 5 1 0
4
Doxo 0,5 0 0 0 0 0 0 Pol: Células poliplóides; Endo: Endoreduplicação; COL: Colchicina (Controle positivo, 4 µM); DOX:
Doxorrubicina (Controle positivo, 0,50 µM). Experimento 3: RR07 + Colchicina; Experimento 4: RR07 sem
colchicina
Para a análise da fase G1/S do ciclo celular, as células foram tratadas em condições
semelhantes as do experimento 1 e 2, porém em um tempo de cultura de apenas 28 horas.
Após análise das células pode-se constatar a repetição do fenômeno (Tabela 12 –
Experimento 3) com o controle negativo – colchicina (40 μM) e sem o controle negativo
(Tabela 12 – Experimento 4), havendo diminuição do tempo de exposição foi observado
menor numero dos cromossomos, facilitando a visualização das mitoses, constatando também
diminuição da citotoxicidade.
111
Tabela 13 – Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico (IM) em cultura de PBMC
humanos com RR07 na fase G2/M (Experimentos 5 e 6) do ciclo celular.
ACs Experimento Tratamento (µM) IM (%)Gaps quebras Total
Pol Endo
- 5,0 2 0 2 1 0 0,25 4,9 2 1 3 1 0 0,50 4,7 1 1 2 0 0 1,00 4,5 0 1 1 1 1 2,00 4,2 2 2 4 1 0 4,00 4,0 4 4 8 2 0
5
Doxo 0,5 4,0 13 7 20 4 4 - 0,2 0 0 0 0 0
0,25 1,9 2 0 2 0 0 0,50 3,2 2 0 2 0 0 1,00 3,5 1 1 0 0 0 2,00 3,0 1 3 4 0 0 4,00 2,5 5 5 10 0 0
6
Doxo (+) 0 0 0 0 0 0 Pol: Células poliplóides; Endo: Endoreduplicação; COL: Colchicina (Controle positivo, 4 µM) DOX:
Doxorrubicina (Controle positivo, 0,5 μM). Experimento 5: RR07 + Colchicina; Experimento 6: RR07 sem
colchicina
Vale ressaltar o registro de quebras cromatídicas e cromossômicas (parciais e totais –
Experimento 6), indicaram o efeito clastrogênico do RR07 em todos os seis experimentos
realizados. Foi observado ausência de endoduplicação, porém com presença de poliploidia
(Tabela 13).
5.13 Avaliação da integridade de membrana celular por citometria de fluxo em cultura
de células HL-60 tratadas com RR07
A viabilidade celular serviu como parâmetro para avaliar por citometria de fluxo a
integridade da membrana plasmática de células com morfologia normal. Foram observadas
redução da viabilidade das células quando comparadas ao controle negativo (98,26% de
células viáveis) e também ao controle positivo doxorrubicina a 0,50 μM (89,96% células
viáveis).
A viabilidade das células HL-60 tratadas com RR07 foi reduzida de forma não
significativa, sendo a maior redução na concentração de 4,00 μM correspondente a 87,69%
das células viáveis (Gráficos 7 e 8). Apesar de não terem sido observadas alterações no
tocante ao percentual da integridade de membrana, o número total de células viáveis foi
112
sempre reduzido no grupo das células tratadas, isso quando comparadas ao número de células
no controle negativo (Gráfico 9).
C D 0,23 0,49 0,99 1,98 3,960
25
50
75
100
RR07
(μM)
Inte
grid
ade
de m
embr
ana
(%)
Gráfico 7 – Avaliação de integridade de membrana plasmática por citometria de fluxo. Células HL-60 incubadas
com o RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM e com controle doxorrubicina a 0,50 μM. Os
dados foram analisados a partir da média ± EPM de 3 experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças
significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida
por Teste de Dunnet, com nível de significância estatística de 95% (p < 0,05) no programa GraphPad Prism
versão 5.0.
113
Gráfico 8 – Integridade da membrana plasmática das células HL-60 após 24 h de incubação. Histogramas do
Plot intensidade de fluorescência vermelha (eixo x) versus número de células (eixo y). A, células não tratadas; B,
doxorrubicina a 0,50 μM; C, D, E, F e G, RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM,
respectivamente. Marcador 1 (esquerda): percentagem de células viáveis. Marcador 2 (direita): percentagem de
células não viáveis. Foram analisados 5 mil eventos por amostra.
G 98,26% 1,74%
89,46%
10,54%
95,39%
4,61%
95,66%
4,34%
A D C B
95,13% 4,87%
94,14% 5,86%
87,69% 12,31%
E F G
114
C D0,2
50,5
01,0
02,0
04,0
00
250000
500000
750000
1000000
1250000
** ** ** ** ** **
RR07
(μM)
Nº d
e cé
lula
s (x
106 )/m
L
Gráfico 9 – Numero de células viáveis analisadas por citometria de fluxo. Incubação com o composto RR07 nas
concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 µM sobre o número total de células leucêmicas de HL-60,
analisado por citometria de fluxo, utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação. (C) representa o
controle negativo; (D) controle positivo Doxorrubicina (0,50 µM). Os dados foram analisados a partir da média
± EPM de “n” experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes
grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível
de significância estatística de 95% (*p < 0,05) no programa GraphPad Prism versão 5.0.
5.14 Estudo do ciclo celular e fragmentação nuclear por citometria de fluxo em cultura
de células HL-60 tratadas com RR07
No tratamento com doxorrubicina a 0,50 µM foi observada intensa fragmentação de
DNA (82,69%) sem nenhuma alteração no perfil do ciclo celular. As células tratadas com
RR07 revelaram diminuição significativa no número de células na fase G0/G1 onde todas as
células tratadas apresentaram percentuais baixos em ralação ao controle negativo. Foi
observado que, com o aumento da concentração do composto RR07 ocorria elevação do
numero de células na fase S, porém não foi diferente em relação aos controles. Além disso, foi
visto o pronunciado acúmulo na fase G2/M desde a menor concentração testada de 0,25 µM
com 57,27%. Com o aumento da concentração (0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 µM), ocorreu
115
respectivamente, uma diminuição no percentual de células em G2/M correspondente a 51,54;
51,31; 50,54 e 26,32% de células concentradas nesta fase (Tabela 14 e Gráfico 10).
Vale ressaltar, que as análises dos dados apontaram intensa fragmentação do DNA em
todas as concentrações testadas, sendo observado que na menor concentração (0,25 µM) o
índice foi de 59,4%, enquanto nas concentrações subseqüentes (0,50; 1,00 e 2,00 µM) os
percentuais de fragmentação foram, respectivamente, 60,51; 62,22 e 67,08%, comparadas ao
controle negativo.
Porém, a maior concentração testada do composto RR07 (4,00 µM) foi capaz de
aumentar em 60 vezes a fragmentação do DNA celular, apresentando percentual de 67,54%,
quando comparado ao controle negativo (p < 0,05) (Tabela 14 e Gráfico 11).
Tabela 14 – Avaliação do ciclo celular. Efeito do composto RR07 sobre a distribuição do
ciclo celular em células leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de fluxo utilizando
iodeto de propideo, após 24 horas de incubação. C: controle negativo; D: Doxorrubicina 0,3
µg/mL (0,50 μM) usada como controle positivo.
Fase do ciclo celular (%) Substâncias Concentração (µM)
G0/G1 S G2/M C - 33,10 57,21 9,69
D 0,50 32,2 65,93 1,87
0,25 9,67* 33,05 57,28* 0,50 10,67* 37,79 51,54* 1,00 9,33* 39,4 51,27* 2,00 7,55* 41,91 50,54*
RR07
4,00 10,47* 63,21 26,32 Os dados correspondem à media ± EPM de três experimentos independentes. Cinco mil eventos foram contados
em cada experimento (*p < 0,05) comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de
Dunnett.
116
Gráfco 10 – Efeito no ciclo celular após incubação por 24 h com o RR07. Os histogramas de ciclo celular foram
analisados no ModFit LT 3.1. Eixo x: intensidade de fluorescência e eixo y: números de células HL-60,
determinadas por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo. A – controle negativo; B – Doxorrubicina
(0,50 μM); C, D, E, F e G RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM, respectivamente.
E D
G0/G1 A
Channels (RED-HLin-Red Fluorescence (RED-HLin))0 40 80 120 160
Num
ber
060
120
180
240
S G2/M
Debris Fase G0/G1 Fase G2/M Fase S
Channels (RED-HLin-Ciclo celular (RED-HLin))0 40 80 120 160
Num
ber
020
4060
80
B G0/G1
S G2/M
Debris Fase G0/G1 Fase G2/M Fase S
Channels (RED-HLin-Red Fluorescence (RED-HLin))0 40 80 120 160
Num
ber
020
4060
C
G0/G1
S
G2/M Debris Fase G0/G1 Fase G2/M Fase S
Channels (RED-HLin-Ciclo celular (RED-HLin))0 40 80 120 160
Num
ber
020
4060 G0/G1
S
G2/M Debris Fase G0/G1 Fase G2/M Fase S
Channels (RED-HLin-Ciclo celular (RED-HLin))0 40 80 120 160
Num
ber
020
4060
8010
0
G0/G1
S
G2/M Debris Fase G0/G1 Fase G2/M Fase S
Channels (RED-HLin-Ciclo celular (RED-HLin))0 40 80 120 160
Num
ber
020
4060
F
G0/G1
S
G2/M Debris Fase G0/G1 Fase G2/M Fase S
G
Channels (RED-HLin-Ciclo celular (RED-HLin))0 40 80 120 160
Num
ber
020
4060
80 G0/G1
S
G2/M Debris Fase G0/G1 Fase G2/M Fase S
117
C D 0,25 0,50 1,00 2,00 4,000
25
50
75
100
RR07
* * * * **
(μM)
Frag
men
taçã
o do
DN
A (%
)
Gráfico 11 – Determinação da fragmentação do DNA. Efeito do composto RR07 nas concentrações de 0,25;
0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 µM sobre a fragmentação do DNA nas células leucêmicas de HL-60, analisado por
citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação. (C) representa o controle
negativo; (D) controle positivo Doxorrubicina (0,50 µM). Os dados foram analisados a partir da média ± EPM
de “n” experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os
dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível de
significância estatística de 95% (*p < 0,05) no programa GraphPad Prism versão 5.0.
5.15 Determinação do potencial transmembrânico de mitocôndria – (ΔΨm)
Ensaio da rodamina 123 – por citometria de fluxo em cultura de células HL-60
tratadas com RR07. Os resultados obtidos demonstraram aumento no percentual de células
com alteração do potencial transmembrânico de mitocôndria (ΔΨm) nas células HL-60
tratadas com o composto RR07 (0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 µM), sendo estatisticamente
significante nas concentrações de 0,50; 1,00 e 2,00 µM (p < 0,05) (Gráfico 12).
Na menor concentração avaliada (0,25 µM) foi possível observar que 38,61 ± 7,53%
das células apresentavam despolarização na membrana mitocondrial, enquanto no controle
negativo o índice foi de apenas 7,83%. Na concentração de 0,50 µM foi constatado o máximo
de despolarização correspondente a 53,18 ± 19,46% (p < 0,01), seguido de uma diminuição
118
do percentual destas células, onde na maior concentração 4,00 µM o percentual observado foi
de 31,32 ± 13,03% (* p < 0,05; **p < 0,01) (Gráfico 12).
C D 0,25 0,50 1,00 2,00 4,000
25
50
75
100
RR07
*** *
(μM)% d
e cé
lula
s de
spol
ariz
adas
Gráfico 12 – Análise da variação do potencial transmembrânico da mitocôndria (ΔΨm) por citometria de fluxo
em células HL-60. Após 24 h de incubação do RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM. A
doxorrubicina a 0,50 μM foi utilizada como controle positivo. Os dados foram comparados por análise de
variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível de significância estatística de 95% (* p < 0,05; **p
< 0,01) no programa GraphPad Prism versão 5.0.
5.16 Detecção da externalização da fosfatidilserina por citometria de fluxo – Anexina V
Após o tratamento das células HL-60 com o composto RR07 nas concentrações de
1,00; 2,50 e 5,00 μM, foi observado à indução da externalização de fosfatidilserina de forma
concentração dependente, porém de modo não significativo segundo a análise estatística
realizada com os resultados adquiridos. Na maior concentração (5,00 µM) o percentual de
células em apoptose inicial foi de 10,05% (Gráfico 13).
119
Gráfico 13 – Análise da externalização da fosfatidilserina por citometria de fluxo em células HL-60. Controle
negativo (A) e tratadas com doxorrubicina 0,50 µΜ – controle positivo (B) e RR07 nas concentrações de 1,00;
2,50 e 5,00 μM (respectivamente C, D e E) com 24 h de incubação. Percentagem de células em: Verde –
quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul – quadrante inferior direito – apoptose inicial; Róseo – quadrante
superior direito – apoptose tardia; e Lilás – quadrante superior esquerdo – necrose. Os dados foram comparados
por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, (*p < 0,05; **p < 0,01) no programa GraphPad
Prism versão 5.0.
5.17 Detecção da ativação de caspases 3, 7 e 8 por citometria de fluxo.
As células (HL-60) foram incubadas por 24 horas com a substância RR07 nas
concentrações de 1,00; 2,50 e 5,00 μM.
O RR07 reduziu o número de células viáveis de maneira concentração dependente,
sendo significativo (*p < 0,01), em todas as concentrações testadas de 1,00; 2,50 e 5,00 μM,
enquanto aumentou o percentual de células em estágio de apoptose inicial nas concentrações
de 2,50 e 5,00 µM, indicando ativação para das caspases 3 e 7 (Gráficos 14 e 15).
Pode-se constatar também aumento do percentual de células em apoptose tardia na
concentração de 5,00 µM, correspondente a 29,97% (Gráficos 14 e 15) nos dois ensaios das
caspases. Entretanto, foi observado apenas no ensaio da caspase 8 um aumento do percentual
C
88,81% 6,31%
0,98% 3,89%
90,86% 6,87%
1,83% 0,43%
A
90,08% 5,91%
0,76% 3,23%
D E
84,87% 10,05%
0,77% 4,30%
71,46% 20,12%
7,04% 1,37%
B
* *
120
de 7,61; 9,68 e 12,72% de células em necrose nas três concentrações testadas 1,00; 2,50 e
5,00 µM.
Gráfico 14 – Análise da detecção da ativação de caspases efetoras 3 e 7 por citometria de fluxo em células HL-
60. (A) percentual de células viáveis. (B) percentual de células em apoptose inicial. (C) percentual de células em
apoptose tardia. (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (D) 0,5 µΜ foi utilizada como controle
positivo. O composto RR07 foi testado nas concentrações de 1,25; 2,5 e 5,0 μM com 24 h de incubação. Os
dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por teste de Dunnet com (*p < 0,05 e **p <
0,01) utilizado o programa GraphPad Prims versão 5.0.
30 ± 9,2 %
45,4 ± 0,0%
66,4 ± 6,7% 69,5 ± 3,2%
CDox
1,25 2,5 5,0
0
25
50
75
100
*
RR07
% d
e cé
lula
s em
nec
rose
CDox
1,25 2,5 5,0
0
25
50
75
100
RR07
*
% d
e cé
lula
s em
apo
ptos
e ta
rdia
CDox
1,25 2,5 5,0
0
25
50
75
100
* *
*
RR07
% d
e cé
lula
s vi
ávei
s
CDox
1,25 2,5 5,0
0
25
50
75
100
** *
RR07%
de
célu
las
em a
popt
ose
inic
ial
D
BA
C
7,7 ± 1,9%
9,7 ± 0,8%
8,3 ± 2,7%
A B
C D
121
Gráfico 15 – Análise da detecção da ativação de caspase iniciadora 8 por citometria de fluxo em células HL-60.
(A) percentual de células viáveis. (B) percentual de células em apoptose inicial. (C) percentual de células em
apoptose tardia. (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (D) 0,5 µΜ foi utilizada como controle
positivo. O composto RR07 foi testado nas concentrações de 1,25; 2,5 e 5,0 μM com 24 h de incubação. Os
dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por teste de Dunnet com (*p < 0,05 e **p <
0,01) utilizado o programa GraphPad Prims versão 5.0.
CDox
1,25 2,5 5,0
0
25
50
75
100
* **
RR07
% d
e cé
lula
s vi
ávei
s
CDox
1,25 2,5 5,0
0
25
50
75
100
RR07
*
% d
e cé
lula
s em
apo
ptos
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icia
l
CDox
1,25 2,5 5,0
0
25
50
75
100
RR07
*
% d
e cé
lula
s em
apo
ptos
e ta
rdia
CDox
1,25 2,5 5,0
0
25
50
75
100
*
RR07
% d
e cé
lula
s em
nec
rose
C D
B A
22,0 ± 7,0%
7,7 ± 1,2%
57,0 ± 6,3% 73,5 ± 0,8% 69,1 ± 4,4%
8,3 ± 2,6%
A
D C
B
122
5.18 Ensaio de inibição da polimerização da tubulina in vitro.
Neste ensaio realizado com tubulina isolada a fenstatina (RR07) na concentração de 10
µM foi capaz de inibir a polimerização da tubulina de forma muito semelhante ao controle
positivo nocodazole, que é uma droga já consagrada como um agente despolimerizante de
microtúbulos devido a ligação com o dímero α-β da tubulina.
Desta forma, o RR07 apresentou-se como um potente inibidor da polimerização da
tubulina (Gráfico 16).
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 300.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
TAMPAO DMSO N 10 RR07 10
Tempo (min)
Den
sida
de ó
ptic
a (3
40nm
)
Gráfico 16 – Ensaio de inibição de polimerizção da tubulina in vitro. Linha pontilhada verde – Branco
representado pelo tampão. Linha pontilhada laranja (o controle negavito representado pelo DMSO). Linha
pontilhada em vermelho (controle positivo Nocodazole – 10 µM). Linhas em azul (RR07 10 µM).
5.19 Estudo da atividade antitumoral do composto RR07 em camundongos transplantados
com Sarcoma 180
Na análise dos grupos, após a realização do ensaio, foi observado que o composto teste
RR07 nas doses de 20 e 40 mg/kg/dia foi capaz de diminuir o crescimento da massa tumoral
em 30,9 ± 6,99 g (1,54 ± 0,16 g) e 48,19 ± 2,57 g (1,16 ± 0,06 g) respectivamente, sendo
considerado significativo (b,c,d, p < 0,05) quando comparado ao controle negativo (DMSO
10%) (2,23 ± 0,14 g) (Tabela 15).
123
Tabela 15 – Avaliação do efeito sobre o peso relativo dos tumores e percentual de inibição
tumoral em camundongos (Mus musculus Swiss) transplantados com Sarcoma 180.
Tratamento Dose (mg/kg/dia)
Ganho de pesocorporal (g) Tumor (g) Inibição
tumoral (%)C - 6,63± 0,10 2,23 ± 0,14 -
5-FU 20 5,20± 0,68c,d 1,11 ± 0,03a 50,36 ± 1,18 VBN 7 -1,70 ± 0,76a,b 0,81 ± 0,23a 63,86 ± 10,1 PTX 5 -2,60 ± 0,81a,b 1,02 ± 0,18a 54,27 ± 8,00 RR07 20 9,20 ± 1,39b,c,d 1,54 ± 0,16a 30,90 ± 6,99 RR07 40 7,29 ± 0,52c,d 1,16 ± 0,06a 48,19 ± 2,57
RR07 + 5-FU 20 + 10 5,56 ± 0,80c,d 0,99 ± 0,06a,b 55,68 ± 2,72 Nota: Os dados estão apresentados como média ± EPM de dez animais. a, quando comparado com o grupo
controle (DMSO 10%); b, quando comparado somente com o grupo 5-fluorouracil (5-FU); c, quando comparado
somente com o grupo vinblastina (VNB), d, quando comparado somente com o grupo paclitaxel (PTX) por
ANOVA seguido de Student-Newman-Keuls. a, b, c e d (p < 0,05).
Nos animais tratados tanto com 5-FU (20 mg/kg/dia) como com a vinblastina (7
mg/kg/dia) ocorreu uma redução no volume do crescimento do tumor correspondente a 1,11 ±
0,03 g e 0,81 ± 0,23 g, cujos percentuais de inibição foram de 50,36 ± 1,18% e 63,86 ±
10,1%, respectivamente (a,b,c,d, p < 0,05). Já o outro controle positivo, utilizado nesta etapa
do trabalho, paclitaxel (5 mg/kg/dia) propiciou a redução da massa tumoral referente a 1,02 ±
0,18 g, onde o percentual de inibição foi de 54,27 ± 8,00% (a, p < 0,05).
Além disso, a associação entre RR07 (20 mg/kg/dia) e o quimioterápico 5-FU (10
mg/kg/dia), revelou redução significativa (a, p < 0,05) da massa tumoral (0,99 ± 9,3 g) cuja
inibição foi de 55,98%, comparado ao controle negativo – DMSO 10% (Tabela 15).
5.20 Análise histopatológica dos órgãos de camundongos Mus musculus Swiss tratados
com RR07
Após o tratamento dos animais, de acordo com os grupos anteriormente citados, os
órgãos foram retirados e pesados, onde após análise, o peso relativo úmido mostrou diferença
estatisticamente significante, a (p < 0,05). Em relação ao baço dos grupos tratados com RR07
nas doses de 20 e 40 mg/kg/dia intraperitoneal (ip) houve redução de peso (0,79 ± 0,09 e 0,81
± 0,08 g, respectivamente para 20 e 40 mg/kg/dia) em relação ao controle negativo – DMSO
10% (0,93 ±0,10 g), porém a redução com significância ocorreu somente quanto ao peso dos
baços dos animais tratados com os controles positivos 5-FU (0,58 ± 0,10 g); vinblastina (0,38
± 0,06 g) e paclitaxel (0,34 ± 0,02 g) nas respectivas doses de 20; 7 e 5 mg/kg/dia (ip).
124
Quando analisada massa corpórea dos animais ao final do experimento foi observado
relativo ganho de peso dos grupos RR07 nas doses de 20 (9,20 ± 1,39 g), 40 mg/kg/dia (7,29
± 0,52 g) (ip) e associado RR07 20 + 5-FU 10 mg/kg/dia (5,56 ± 0,80 g) (ip), sendo
considerado significativo, b, c e d (p < 0,05) após análise estatística. Por outro lado, os
animais relacionados aos grupos dos controles positivos vinblastina e paclitaxel nas
respectivas doses de 7 e 5 mg/kg/dia (ip) revelaram diminuição significativa (p < 0,05) da
massa corpórea quando comparado ao grupo controle e os outros grupos (-1,70 ± 0,76 g) e (-
2,60 ± 0,81 g), respectivamente, para a vinblastina e paclitaxel 7 e 5 mg/kg/dia (Tabela 16).
Tabela 16 – Efeito do RR07 sobre o peso relativo dos órgãos e tumores de camundongos
(Mus musculus Swiss) transplantados com Sarcoma 180. Os animais foram sacrificados após
7 dias de tratamento com RR07 nas doses de 20 e 40 mg/kg/dia; associação entre RR07 20
mg/kg/dia com o quimioterápico 5-fluorouracil (5-FU) 20 mg/kg/dia. O controle negativo foi
tratado com o veículo de diluição da substância (DMSO 10%). Foram utilizados como
controles positivos os quimioterápicos: 5-fluororuracil (5-FU); vinblastina (VBN) e paclitaxel
(PTX) nas respectivas doses de 20, 7 e 5 mg/kg/dia
Fígado Baço Rins Tratamento Dose (mg/kg/dia)
Ganho de pesocorporal (g) g/100g de massa copórea
Tumor
C - 6,63± 0,10 5,63 ± 0,18 0,93 ±0,10 1,28 ± 0,05 2,23 ± 0,14 5-FU 20 5,20± 0,68 4,77 ± 0,04 0,58 ± 0,10a 1,23 ± 0,06 1,10 ± 0,03a VBN 7 -1,70 ± 0,76a,b 4,66 ± 0,33 0,38 ± 0,06a 1,16 ± 0,04 0,81 ± 0,23a PTX 5 -2,60 ± 0,81a,b 5,29 ± 0,14 0,34 ± 0,02a 1,19 ± 0,07 1,02 ± 0,18a RR07 20 9,20 ± 1,39b,c,d 5,87 ± 0,39 0,79 ± 0,09 1,24 ± 0,08 1,54 ± 0,16a RR07 40 7,29 ± 0,52c,d 5,56 ± 0,54 0,81 ± 0,08 1,14 ± 0,12 1,16 ± 0,06a RR07
+ 5-FU 20 + 10 5,56 ± 0,80c,d 5,39 ± 0,38 0,69 ± 0,07 1,27 ± 0,06 0,99 ± 0,06a,b,c
Nota: Os dados estão apresentados como média ± EPM de dez animais. a, quando comparado com o grupo
controle (DMSO 10%); b, quando comparado somente com o grupo 5-fluorouracil (5-FU); c, quando comparado
somente com o grupo vinblastina (VNB), d, quando comparado somente com o grupo paclitaxel (PTX) por
ANOVA seguido de Student-Newman-Keuls. a, b, c e d (p < 0,05).
Na análise histológica dos órgãos para o grupo controle negativo (DMSO 10%), os
fígados estudados mostraram-se escurecidos e elásticos macroscopicamente, enquanto a
análise microscópica indicou tumefação turva dos hepatócitos, congestão portal e da veia
centrolobular. Os rins dos animais do grupo controle negativo mostraram-se homogêneo e
pardo acinzentados por análise macroscópica, enquanto o estudo microscópico apontou
tumefação turva do epitélio tubular, presença de cilindros hialinos, com glomérulos
preservados. A avaliação macroscópica dos baços denunciou aumento de volume, sem
125
alterações visíveis, enquanto na análise microscópica foram visualizados folículos linfóides
evidentes e definidos, com presença de megacariócitos distribuídos ao longo das amostras.
Além disso, a análise macroscópica da massa tumoral dos animais do controle negativo
(DMSO 10%) revelou-se em tamanho homogêneo, com material ligeiramente rosado,
enquanto a análise microscópica mostrou neoplasia maligna constituída por células poligonais
e fusiformes, com pleomorfismo celular e nuclear, mitoses típicas e atípicas, além de células
tumorais gigantes, com invasão muscular e áreas de necrose de coagulação (Figuras 13A,
14A, 15A e 16A).
Os animais tratados com o controle positivo 5-FU (20 mg/kg/dia) apresentaram
fígados macroscopicamente escurecidos com áreas de necrose coagulativa, enquanto a
microscopia mostrou intensa tumefação turva de hepatócitos e congestão portal e da veia
centrolobular. Sendo observada ainda por análise microscópica, a presença de
hemossiderófagos por entre os sinusóides, hiperplasia das células de Kupffer e focos de
esteatose microvesicular. Os baços dos animais desse grupo apresentaram-se pequenos,
enquanto a microscopia revelou a presença de folículos linfóides pequenos e circunscritos,
ampla polpa vermelha, hemossiderófagos, pigmentos de hemossiderina, raríssimos
megacariócitos. Enquanto os rins apresentaram-se brancacentos e pequenos na análise
macroscópica. Na microscopia do conteúdo renal foi observada intensa tumefação turva do
epitélio tubular, seguida de hemorragia glomerular e tubular. A análise macroscópica dos
tumores do grupo controle positivo 5-FU (20 mg/kg/dia) mostrou material em tamanho
reduzido, enquanto a microscopia apontou para presença de neoplasia maligna constituída por
células poligonais rarefeitas, pleomórficas, com anisocariose e áreas de necrose de coagulação
(Figuras 13B, 14B, 15B e 16B).
Um segundo controle positivo (Paclitaxel 5 mg/kg/dia) foi utilizado onde a análise
macroscópica do tecido hepático indicou coloração cinza-amarelada dos fígados em análise
macroscópica, enquanto a microscopia indicou desorganização dos cordões de hepatócitos,
esteatose microvesicular, apresentando ainda, necrose focal de hepatócitos, fragmentação
nuclear, congestão portal e da veia centrolobular com hemorragia sinusoidal. As alterações
nos rins, baço e massa tumoral foram semelhantes às encontradas no grupo controle 5-FU –
20 mg/kg/dia – (Figuras 13C, 14C, 15C e 16C).
A utilização de um segundo controle positivo (Vinblastina 7 mg/kg/dia) possibilitou a
verificação microscópica de alterações hepáticas importantes como: congestão portal e da veia
centrolobular, hiperplasia das células de Kupffer, intensa tumefação celular de hepatócitos,
degeneração hidrópica de hepatócitos, diversos focos inflamatórios, além da visualização de
126
algumas células de metástase tumoral. A avaliação microscópica do tecido renal, em um dos
fragemtos analisados, apresentou glomérulos preservados, discreta e moderada tumefação do
epitélio tubular (túbulos proximais e distais) e também a presença de cilindros hialinos
dispersos. Em relação à avaliação microscópica da ação do quimioterápico sobre o baço
foram observados a presença de folículos linfóides circunscritos e evidentes, limites de polpa
branca e de vermelha nítidos, ninhos de megacariócitos. Além disso, a pesquisa microscópica
da massa tumoral revelou neoplasia maligna composta por células poligonais exibindo
pleomorfismo celular e nuclear, hipercromatismo, presença de células gigantes malignas,
mitoses típicas e atípicas, extensas áreas de necrose de coagulação, invasão muscular
(Figuras 13D, 14D, 15D e 16D).
O tratamento dos animais com o composto teste RR07 permitiu avaliar alterações
ocorridas no tecido de metabolização hepático, onde na dose de 20 mg/kg/dia a macroscopia
apresentou órgãos escurecidos com aspecto semelhante ao controle, enquanto a microscopia
mostrou intensa degeneração hidrópica dos hepatócitos, congestão portal e da veia
centrolobular, hemorragia sinusoidal, pigmentos de hemossiderina, desorganização dos
cordões de hepatócitos, semelhante ao controle positivo com vinblastina (7 mg/kg/dia) e
paclitaxel (5 mg/kg/dia) algumas células com fragmentação nuclear. Na dose de 40
mg/kg/dia, o composto RR07 possibilitou a constatação de eventos como: congestão portal e
da veia centrolobular, hiperplasia das células de Kupffer, focos inflamatórios, intensa
tumefação celular de hepatócitos, pigmentos armazenados e grosseiros, provavelmente
consistentes com bilirrubina, alterações semelhantes ao controle positivo paclitaxel – 5
mg/kg/dia – (Figuras 13E, 14E, 15E e 16E e F).
Ao se analisar os tecidos relacionados com a excreção, neste caso os rins, observou-se
que o composto RR07 apresentou alterações microscópicas semelhantes tanto na dose de 20
como na dose de 40 mg/kg/dia, tais alterações evidenciadas foram intensa tumefação turva do
epitélio tubular, presença de muitos cilindros hialinos, glomérulos preservados, porém, alguns
glomérulos com rarefação celular, hemorragia glomerular e tubular, enquanto as
características macroscópicas foram semelhantes aos rins analisados no grupo controle. As
alterações no tecido esplênico causadas pelo RR07 tanto na dose de 20 como 40 mg/kg/dia
mostram alterações microscópicas semelhantes como: presença de folículos linfóides
definidos e circunscritos, raros megacariócitos distribuídos ao longo da amostra em ninhos,
pigmentos de hemossiderina, e evidente limite entra as polpas branca e vermelha.
Macroscopicamente, os baços mostraram-se aumentados em volume, semelhante ao controle.
Quanto a análise do conteúdo tumoral pode-se verificar que o composto RR07 testado nas
127
doses de 20 e 40 mg/kg/dia causaram decréscimo no tamanho da massa tumoral, quando
analisado macroscopicamente, enquanto a análise microscópica indicou que em ambas as
doses de 20 e 40 mg/kg/dia as células tumorais não mostraram alterações em sua morfologia,
porém na amostra havia extensas áreas de necrose de coagulação (Figuras 13E, 14E, 15E e
16E e F).
Outro grupo avaliado foi a associação entre 5-FU na dose de 10 mg/kg/dia com o
composto teste RR07 na dose de 20 mg/kg/dia, onde a análise do órgão de metabolização,
possibilitou visualizar alterações como: discreta congestão portal e da veia centrolobular,
hiperplasia das células de Kupffer, intensa tumefação celular de hepatócitos, esteatose
microvesicular, células inflamatórias de permeio, semelhante às alterações encontradas no
grupo tratado apenas com o 5-FU 20 mg/kg/dia. Já na análise dos rins, foram observadas
características como: glomérulos preservados, discreta tumefação do epitélio tubular (túbulos
proximais e distais), presença de diversos cilindros hialinos, semelhante ao observado com o
grupo tratado com o controle positivo vinblastina (7 mg/kg/dia). Avaliando a ação do
associação das substâncias sobre o baço foi possível constatar a presença de folículos
linfóides circunscritos e evidentes, ninhos de megacariócitos, pigmentos de hemossiderina,
semelhante às alterações encontradas nos grupos tratados com o composto RR07 na dose de
40 mg/kg/dia. Além disso, a análise do conteúdo tumoral indicou alterações semelhantes à
detectada quando no tratamento com o quimioterápico já consagrado, paclitaxel (5 mg/kg/dia)
e o composto teste RR07 nas duas doses testadas 20 e 40 mg/kg/dia (Figuras 13G, 14G, 15G
e 16G).
128
Figura 13 – Análise histológica dos fígados de camundongos Mus musculus Swiss transplantados com Sarcoma
180. Os animais foram sacrificados após 7 dias de tratamento por via intraperitoneal (ip). (A) Controle negativo
(DMSO 10%); (B) Controle positivo 5-fluorouracil (5-FU 20 mg/kg/dia); (C) Controle positivo paclitaxel (PTX
5 mg/kg/dia); (D) Controle positivo vinblastina (VNB 7 mg/kg/dia); (E) RR07 20 mg/kg/dia; (F) RR07 40
mg/kg/dia; (G) Associação entre RR07 20 mg/kg/dia + 5-FU 20 mg/kg/dia. Coloração realizada com
hematoxilina/eosina e análise em microscopia óptica com aumento de 400X
5 FU 20
Esteatose microvesicular
Hiperplasia das células de Kupffer
B
Tumeração celular
PTX 5
Esteatose microvesicular
Fragmentação nuclear
Desorganização dos cordões de hepatócitos
C
VNB 7
Necrose focal
D
RR07 20
Degeneração hidrópica
E
DMSO 10%
Congestão portal
A
Congestão da VCL
RR07 40
Hiperplasia das células de Kupffer
Hemossiderófagos
F
Hiperplasia das células de Kupffer
Associado
Estreatose microvesicular
G
129
Figura 14 – Análise histológica dos rins de camundongos Mus musculus Swiss transplantados com Sarcoma
180. Os animais foram sacrificados após 7 dias de tratamento por via intraperitoneal (ip). (A) Controle negativo
(DMSO 10%); (B) Controle positivo 5-fluorouracil (5-FU 20 mg/kg/dia); (C) Controle positivo paclitaxel (PTX
5 mg/kg/dia); (D) Controle positivo vinblastina (VNB 7 mg/kg/dia); (E) RR07 20 mg/kg/dia; (F) RR07 40
mg/kg/dia; (G) Associação entre RR07 20 mg/kg/dia + 5-FU 20 mg/kg/dia. Coloração realizada com
hematoxilina/eosina e análise em microscopia óptica com aumento de 400X
VNB 7
D
DMSO 10%
Cilindro hialino
A
5 FU 20
Hemorragia
Tumefação celular
B
PXT 5
Tumefação turva
C
RR07 20
Tumefação turva
E
RR07 40
Cilindro hialino
F
Tumefação celular
Cilindro hialino
Associado
G
130
Figura 15 – Análise histológica dos baços de camundongos Mus musculus Swiss transplantados com Sarcoma
180. Os animais foram sacrificados após 7 dias de tratamento por via intraperitoneal (ip). (A) Controle negativo
(DMSO 10%); (B) Controle positivo 5-fluorouracil (5-FU 20 mg/kg/dia); (C) Controle positivo paclitaxel (PTX
5 mg/kg/dia); (D) Controle positivo vinblastina (VNB 7 mg/kg/dia); (E) RR07 20 mg/kg/dia; (F) RR07 40
mg/kg/dia; (G) Associação entre RR07 20 mg/kg/dia + 5-FU 20 mg/kg/dia. Coloração realizada com
hematoxilina/eosina e análise em microscopia óptica com aumento de 400X (A, C e D) 100X (B, E. F e G)
Megacariócitos
DMSO 10%
A
5 FU 20
Polpa vermelha
B
PTX 5
Pigmentos de hemossiderina
C
Megacariócitos
VNB 7
D
Megacariócitos
Associado
G
RR07 40
Megacariócitos
F Polpa branca
Polpa vermelha
RR 07 20
E
131
Figura 16 – Análise histológica dos tumores de camundongos Mus musculus Swiss transplantados com Sarcoma
180. Os animais foram sacrificados após 7 dias de tratamento por via intraperitoneal (ip). (A) Controle negativo
(DMSO 10%); (B) Controle positivo 5-fluorouracil (5-FU 20 mg/kg/dia); (C) Controle positivo paclitaxel (PTX
5 mg/kg/dia); (D) Controle positivo vinblastina (VNB 7 mg/kg/dia); (E) RR07 20 mg/kg/dia; (F) RR07 40
mg/kg/dia; (G) Associação entre RR07 20 mg/kg/dia + 5-FU 20 mg/kg/dia. Coloração realizada com
hematoxilina/eosina e análise em microscopia óptica com aumento de 400X.
5 FU 20
Rarefação celular
B
N d
DMSO 10%
A
RR07 20
Necrose de coagulação
E F
RR07 40
Necrose
Células normais
Mitose
PTX 5
C
Necrose celular
Necrose
VNB 7
Invasão Muscular
D
Necrose
Mitose
Associado
G
132
5.21 Resumo dos resultados encontrados
O estudo realizado com 10 análogos estilbenóides e o resveratrol possibilitou avaliar a
atividade citotóxica e antitumoral, onde mereceu destaque o composto fenstatina (4
metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona) – RR07
• O análogo RR07 apresentou maior citotoxicidade dentre os compostos para 12
linhagens tumorais testadas apresentando com valore mínimo de 0,01 µM.
• O composto RR07 foi um dos compostos que apresentou maior potencial
antimitótico em ovos de ouriço-do-mar Lytechinus variegatus, inibindo 100% da
divisão celular na 1ª e 2ª divisões, bem como no estágio de blástula.
• A citotoxicidade observada pelo análogo RR07 não está relacionada com dano à
membrana plasmática, visto que o composto não induziu hemólise em eritrócitos
de camundongos em concentração até 661,5 µM.
• A ação citotóxica exibida pelo RR07 foi cerca de onze (11) vezes maior para a
linhagem de células leucêmicas HL-60 quando comparado a atividade sobre
células mononucleadas do sangue periférico.
• O RR07 causou inibição de 36,5 ± 2,55% na síntese de DNA e de 57,78 ± 0,88%
morte celular por apoptose em células HL-60, quando testado na menor
concentração (0,25 µM) nos ensaios do BrDU e da acridina laranja/brometo de
etídio, respectivamente.
• O composto RR07 causou bloqueio de mitótico na fase de metáfase em células
HL-60, podendo também ser observado um acúmulo de células na fase G2 do ciclo
celular, alteração do potencial transmembrânico da mitocôndria avaliados através
de citometria de fluxo.
• Observou-se indução de apoptose em células HL-60 relacionada com a via
intrínseca principalmente (caspases efetoras 3 e 7) com 8,3 ± 2,6% de ativação,
bem como envolvimento da via extrínseca caspase 8 (ativadora).
• O RR07 mostrou um padrão de atividade semelhante ao descrito para outros
compostos relacionados os quais também possuem um anel benzeno trimetoxilado
(colchicina e combretastatina) que se sabe inibirem a mitose ligando-se a tubulina.
• O RR07 tem um perfil de atividade distinto do resveratrol, e parece atuar
semelhantemente as combrestatinas, compostos inibidores da divisão celular que
agem ligando-se as tubulinas.
133
• No ensaio de tubulina isolada in vitro, o estilbenóide RR07, na concentração de 10
µM, inibiu a polimerização da tubulina.
• O composto RR07 foi capaz de inibir 48,19 ± 2,57% do crescimento tumoral em
modelo de Sarcoma 180, na dose de 40 mg/kg.
Em um panorama mais abrangente, os resultados explandos anteriormente forma
condensados na Tabela 17.
Tabela 17 – Resumo dos resultados encontrados no estudo do potencial antitumoral da
fenstatina (4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona) – RR07
Estudo Resultados Atividade citotóxica
Em células tumorais +++ Em células normais (PBMCs) +++
Estudo do mecanismo de ação citotóxico Inibição da síntese de DNA +++ Morfologia diferencial por Laranja de acridina/Brometo de etídeo (LA/BE) Apoptose/Necrose Morfologia diferencial por Hematoxilina/Eosina (HE) Inibição em MetáfaseIntegridade de membrana - Análise do ciclo celular Parada em G2/M Indução de fragmentação do DNA +++ Potencial trasmembrânico de mitocôndria + Indução de caspases 3, 7 e 8 ++ Inibição da polimerização de microtúbulos +++
Genotoxicidade Estudo de aberração em PBMC +++
Atividade antitumoral Antitumoral em Sarcoma 180 +++ Toxicidade em órgãos e sistemas ++
(-) Sem efeito relevante; (+) Efeito Fraco; (++) Efeito Moderado; (+++) Efeito Forte.
134
6 DISCUSSÃO
Nos últimos anos a aplicação da quimioterapia tem conseguido êxitos notáveis na cura
de algumas formas de cânceres disseminados como a leucemia aguda infantil, distintos tipos
de linfomas, e alguns tipos de tumores sólidos. Ao contrário, a melhora no tratamento
sistêmico de tumores sólidos mais freqüentes em adultos (pulmão, mama cólon e pâncreas)
não sofreu grandes avanços, resultando em altos índices de mortalidade dentre os pacientes.
Há, portanto, uma clara e urgente necessidade de identificar, avaliar e desenvolver novos e
mais eficientes fármacos para o tratamento do câncer (LENZ, 2003; PETIT et al., 2008).
Dessa forma, o atual interesse na busca de novos agentes antimitóticos, por exemplo, é
conseqüência de sua importância para o tratamento de diferentes formas de tumores malignos.
Todo o sucesso na utilização de taxanos e dos alcalóides da vinca na terapia anticâncer tem
estimulado intensamente a busca por novos agentes com potencial antimitótico (RISINGER et
al., 2009). Outros compostos têm sido estudados por interromper a divisão celular sendo
efetivo no tratamento de tumores a exemplo da podofilotoxina, resveratrol e combretastatina,
as quais foram inicialmente obtidas por fontes naturais (PINNEY et al., 2005). Derivados
estilbenos a exemplo de microcomponentes como o resveratrol (3,4,5-trihidroxi-trans-
estilbeno) e combretastatina exibem uma gama de atividades biológicas incluindo
antineoplásico, quimiopreventivo, antioxidante e antiestrogênico (AGGARWAL et al., 2004).
A combretastatina A4 é o mais potente agente antimitótico isolado da Combretum
caffirum. O gênero do Combretum possui 250 espécies originadas das árvores tropicais.
Algumas dessas 24 espécies do gênero Combretum são bem conhecidas na medicina popular
da África, sendo usada para problemas cardíacos, tratamento de verrugas, doenças mentais e
envenenamento por escorpião (PINNEY et al., 2005; TY et al., 2009). Vale lembrar que
somente na índia a espécie Combretum latifolium parece ter sido usada na medicina popular
para o tratamento do câncer (PINNEY et al., 2005).
O resveratrol e um composto polifenólico produzido por várias espécies e encontrado
especialmente nas raízes e sementes de uma planta medicinal oriental chamada Polygonum
cupsidatum (kojo-kon), e na casca das uvas como metabólito secundário, para defesa
antifúngica. Além disso, está presente no vinho tinto, o qual tem sido documentado com
efeitos cardioprotetor e quimiopreventivo do câncer (BAUR; SINCLAIR, 2006); Muitos
desses efeitos fisiológicos decorrem da sua supressão na proliferação celular via inibição de
caminhos importantes na transdução do sinal e quinase ciclina dependente, promovendo a
diferenciação celular e a retirada de espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelular e todas
135
essas respostas podem levar a indução de apoptose através da ativação mitocondrial
dependente e independente (PERVAIZ, 2004; CHEN et al.,2005).
Há mais de 30 anos atrás o Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos vem
explorando largamente o screening da atividade anticâncer utilizando plantas terrestres dentre
elas tem sido identificadas à potencialidade anticâncer do Combretatum molle e Combretatum
caffirum (YEUNG et al., 2007). Os estudos foram iniciados em 1973 levando a identificação
da Combretastatina na C. caffirum, originaria do continente africano. Esses estudos
avançaram a partir de 1979 no qual foram isolados outros constituintes da C. caffirum, dentre
eles podem ser citados: estilbenos, bibenzil, dihidrofenentrenos e fenantrenos (PINNEY et al.,
2005). Essa descoberta levou ao isolamento e caracterização do (-) combretastatina a qual
apresentou potente inibição do crescimento celular em bioensaios de linhagens de
astrocitomas. Atualmente a combretastatina sódica A4 fosfatase vem sendo estudadas em
ensaios clínicos para o tratamento do câncer (LIN et al., 2007).
A combretastatina tem se destacado por apresentar uma estrutura quimicamente
simples, pela sua elevada atividade biológica como inibidor da polimerização da tubulina,
bem como um inibidor in vitro em linhagens celulares humanas, além de apresentar eficácia
in vitro como agente antiangiogênico (KIRWAN et al., 2004; MOUSSET et al., 2008). Desse
modo, pesquisas vêm sendo realizadas no desenvolvimento de novos análogos, inspirados na
combretastatina e no resveratrol, os quais vêm gerando publicações de patentes. As
combretastatinas A1 e A4 apresentam baixa solubilidade, o que levou a um impulso para o
desenvolvimento de novos compostos sintéticos, a partir da combretastatina, a qual está
dividida em 4 grupos majoritários de base estrutural dentre eles destacam-se: o da série A
(cis-estilbenos), série B (diariletileno), série C (quinona) e série D (lactonas macrocíticas)
(PINNEY et al., 2005).
É apropriado enfatizar que o potencial do resveratrol e da combretastatina tem sido
largamente estudado (LI et al., 2009), porém é importante contribuir no estudo para a
determinação da atividade biológica de novos análogos.
Esse trabalho estudou a atividade biológica dos análogos estilbenóides baseados no
resveratrol a exemplo dos: RR01, RR02, RR03, RR04, RR05, RR06, RR09, RR10, RR11 e o
análogo da combretastatina, à fenstatina, neste estudo denominado de RR07. A primeira etapa
do presente estudo consistiu na avaliação do potencial citotóxico dos análogos estilbenóides
baseados no resveratrol e na combretastatina, o RR07 foi testado em 11 linhagens de células
tumorais humanas, 2 murinas e em PBMCs humanas, através do método do MTT. Em
seguida foram realizados estudos para avaliar a atividade antimitótica em ovos de ouriço do
136
mar (Lytotechinuns variegatus), seguida pela investigação de atividade hemolítica buscando
caracterizar o mecanismo citotóxico direto sobre a membrana plasmática das células. Em
seguida, foi investigado o potencial mutagênico através dos ensaios do cometa e aberrações
cromossômicas. Posteriormente, com o intuito de elucidar o mecanismo de ação e a atividade
antitumoral in vivo, o composto mais ativo foi submetido a ensaios de citometria de fluxo para
caracterização da morte celular, bem como, avaliação do ciclo celular, ensaio de inibição da
polimerização da tubulina e determinação da atividade antitumoral em modelo de Sarcoma
180.
Há algum tempo, estudos de “screening” utilizando o ensaio do MTT tem sido uma
ferramenta essencial e eficaz para avaliar o potencial citotóxico de inúmeras substâncias
(POHLIT et al., 2007; MESQUITA et al., 2009). A determinação da citotoxicidade in vitro
tem se mostrado eficaz na descoberta de novos agentes antitumorais. A maneira mais rápida,
fácil e sensível é o screening com modelos in vitro (CRAGG; NEWMANN, 2000, FOUCHE
et al., 2008). Os testes em linhagens celulares humanas in vitro foram escolhidos, pois,
segundo VENDITI (1983), os ensaios com células leucêmicas murinas in vivo apresentavam
muitas vezes resultados falso-negativos para atividade antitumoral de novos compostos.
Enquanto que os mesmos compostos quando testados em células tumorais humanas
apresentavam resultados positivos na inibição da formação de colônias, esta constatação
sugeriu que o screening usando células tumorais humanas in vitro era preferencial no
desenvolvimento de novas drogas antitumorais (SHOEMAKER et al., 1984). Pelo fato dos
modelos celulares para o estudo da toxicidade serem mais econômicos, rápidos e fornecerem
resultados mais facilmente quantificáveis e com maior reprodutibilidade que os in vivo, o
interesse por inovações neste campo aumenta tanto quanto as necessidades das limitações já
existentes (FORNELLI et al., 2004).
No ensaio de citotoxicidade em diferentes linhagens de células tumorais humanas e
murina foram testados 12 diferentes análogos estilbenóides e o resveratrol. O resveratrol
inibiu a proliferação em todas as linhagens testadas com CI50 variando entre 10,74 para HL-60
e 2,91 µM em células B-16. Esses achados corroboram com muitos estudos previamente
realizados que demonstram o potencial do resveratrol como potente agente quimioterápico em
decorrência da sua ação na indução da apoptose (DORRIE et al., 2003; KANG et al., 2003;
MURIAS et al., 2005). Estudos prévios realizados por MURIAS e colaboradores em 2005,
usando a linhagem de células leucêmicas HL-60 obtiveram um valor de CI50 para o
resveratrol de aproximadamente 10 µM, possuindo a mesma magnitude dos achados obtidos
nesse trabalho.
137
Dentre os análogos estudados no presente estudo, os compostos RR03 e RR06
apresentaram moderada citotoxicidade. O composto RR06 inibiu a proliferação da linhagem
MDA-MB-435 e a Jukart com CI50 correspondente a 62,46 e 6,54 µM, enquanto composto
RR03 foi ativo nas linhagens HL-60, K-562 e MDA-MB-435, com valores de CI50 em 26,71;
26,55 e 25,30 µM, respectivamente. Essa moderada atividade segundo KANG e
colaboradores (2003), decorre da formação de dímeros e trímeros do resveratrol. Além disso,
CAI e colaboradores (2003), descreveram que os grupos 3,4-dihidroxil são importantes para
elevar a atividade anticâncer dos análogos de trans-resveratrol, confirmando as pesquisas de
MURIAS e colaboradores em 2005, demonstrando que a hidroxilação do resveratrol nas
posições 3,4’ e 5 eleva a atividade citotóxica em células HL-60 superior a ação observada
com o resveratrol. Essa afirmação reforça a não atividade citotóxica encontrada em nossas
moléculas.
Entretanto, vários grupos de pesquisa descrevem a importância da inserção dos grupos
de metoxil na estrutura do resveratrol, como observado no trans-3,4,5,4’-tetrametoxiestilbeno,
os quais elevam os efeitos de antiproliferativos em várias linhagens celulares e interferem na
polimerização dos microtúbulos (MA et al., 2008; LI et al., 2009). É importante ressaltar que
a adição do grupo hidroxil no anel B parece diminuir a atividade citotóxica do resveratrol e da
combretastatina A4, levando a uma fraca atividade citotóxica.
Dos estilbenóides avaliados a fenstatina foi o mais citotóxico, por apresentar CI50
menor que 18 µM em todas as linhagens testadas. Essa molécula pertence ao grupo da série
(A) das combretastatinas, sendo caracterizada como uma bisarilcetona que apresenta
esqueleto básico estilbenóide, em que o anel A (3,4,5–trimetoxifenil) é responsável por
algumas ações biológicas como: elevada citotoxicidade e atividade antiangiogência (WU et
al., 2007). Além disso, o anel B presente nas moléculas de fenstatinas e combretastatinas
possui uma hidroxila na posição 3 que quando substituída, por grupamentos como o anel 2
naftil promove variações na atividade e propicia a formação de compostos mais potentes sob a
ação citotóxica (PETTIT et al., 2002; ALVAREZ et al., 2007; 2008).
A fim de reforçar os resultados citotóxicos obtidos anteriormente, foi realizado o teste
do ouriço-do-mar, o qual é amplamente utilizado no estudo de drogas com efeitos citotóxicos
e teratogênicos (JACOBS; WILSON, 1986). Os ovos de ouriço apresentam extrema
sensibilidade a agentes tóxicos e uma série de peculiaridades no seu ciclo de
desenvolvimento, tornando-o bastante elucidativo no estudo de drogas com potencial
antiproliferativo. A inibição da divisão celular pode estar relacionada a vários eventos
envolvidos nesse processo, como a síntese de DNA e RNA, síntese protéica e polimerização
138
de microtúbulos. No ensaio dos ovos do ouriço-do-mar, esses processos podem, muitas vezes,
ser analisados individualmente (BRANDHORST, 1985; FUSETANI, 1987). O ciclo celular
das células embrionárias de ouriço-do-mar é bastante abreviado. É destituído da fase G1, que
antecede a fase S e a fase G2 encontra-se bastante reduzida. Desta maneira, drogas que atuam
durante a fase G1 não apresentam atividades neste bioensaio.
O resveratrol e o RR07 inibiram o desenvolvimento dos ovos de ouriço a partir de 43,8
µM e 33 µM respectivamente (Tabela 8), desde o primeiro estágio de divisão, demonstrando
que esse efeito é inespecífico, pois poderá ser devido a interação com DNA ou a síntese de
proteínas, bem como interferindo na formação do fuso mitótico. Por outro lado, os compostos
RR03 e RR04 na concentração ao redor de 40 µM inibiram o desenvolvimento dos ovos de
ouriço do mar a partir da terceira divisão celular. Desse modo, de acordo com JACOBS et al.,
(1981), se uma substância pura promove 100% de inibição neste ensaio na concentração de 16
µg/mL ou menos, esta pode ser considerada muito ativa. Assim a fenstatina e o resveratrol
podem ser considerados muito ativos, pois, inibiram completamente a mitose dos ovos em
concentração aproximada de 40 µM, o que reforça os resultados obtidos na citotoxicidade
com as linhagens celulares. Assim, a inespecificidade da atividade antimitótica da fenstatina
sugere que compostos com capacidade de inibir a mitose, a partir da primeira clivagem,
podem atuar interferindo na polimerização dos microfilamentos e induzindo o aparecimento
de embriões unicelulares polinucleados (FUSETANI, 1987).
A fim de verificar se a citotoxicidade às células tumorais estava envolvida com a lise
da membrana plasmática, foi realizado o ensaio de atividade hemolítica com eritrócitos de
camundongos, os quais possuem grande semelhança com os eritrócitos humanos,
principalmente quanto à sensibilidade (COSTA-LOTUFO et al., 2002; DRESCH et al.,
2005). Além disso, a estabilidade mecânica característica da membrana eritrocitária confere a
este método um ótimo indicador para averiguar agressões in vitro, sendo uma das etapas para
o screening de compostos citotóxicos (SHARMA; SHARMA, 2001).
A ausência de atividade hemolítica foi observada para todas as moléculas
estilbenóides testadas, na concentração máxima de até 876,2 µM, sugerindo possivelmente
que o mecanismo de atividade citotóxica desempenhado por estas substâncias, não esteja
relacionado à indução de dano a nível de membrana plasmática, mais sim devido a possível
interferência com o mecanismos intracelulares como interferência na molécula DNA, na
formação do fuso mitótico ou atuando em proteínas envolvidas no ciclo celular.
Dentre os vários problemas que podem ser identificados com o uso de fármacos
quimioterápicos, os efeitos colaterais se destacam, por conta da baixa seletividade encontrada
139
nestes compostos. Assim, células com elevado índice proliferativo como células presentes em
mucosas (trato gastrintestinal – TGI), epiteliais, células da medula óssea, incluindo células do
sistema hematopoiético como eritrócitos, trombócitos e células da linhagem branca (PBMC),
são afetadas durante o tratamento com os quimioterápicos, sendo considerado um desfio para
a terapêutica encontrar um composto capaz preservar as células saudáveis eliminando
preferencialmente as células tumorais (ANAZETTI et al., 2003).
Buscando demonstrar uma possível seletividade do RR07 para células saudáveis ou
tumorais, pelo ensaio do MTT, observou-se elevada citotoxicidade do composto frente a
linhagem tumoral leucêmica (HL-60) apresentando CI50 de 0,50 µM, enquanto para o mesmo
ensaio com PBMC, a CI50 foi de 5,68 µM que em análise comparativa não indicou
seletividade, apenas a linhagem HL-60 mostrou-se 11 vezes mais sensível que as células
PBMC.
A utilização de várias metodologias tendo como foco os modelos celulares é
considerada ferramenta de grande valia e importantes para estudos de toxicidade de
compostos, sendo a linhagem HL-60 (leucemia humana), de origem mielóide, uma das mais
amplamente utilizadas para o estudo de indução de apoptose, diferenciação e ciclo celular,
caracterizada pela predominância de neutrófilos promielocíticos, apresentando relação
núcleo/citoplasma assincrônica, com 10% de diferenciação espontânea para o estágio
monocítico, caracterizado por atividade quimiotática e fagocitária (GALLAGHER et al.,
1979; COLLINS, 1987a; MILITÃO et al., 2006; BEZERRA et al., 2007).
Com o intuito de confirmar e entender melhor os efeitos antiproliferativos
desencadeados pelo RR07 observados pelo ensaio do MTT, outros testes antiproliferativos,
foram realizados utilizando células leucêmicas da linhagem HL-60 em 24 horas de incubação,
onde observação da diminuição da proliferação celular, confirmou-se pela avaliação da
cinética de crescimento celular (em HL-60), teste de exclusão do azul de tripan, aliado ao
ensaio de inibição da síntese de DNA através da incorporação do BrdU, além da análise
morfológica com hematoxilina/eosina (HE) e laranja de acridina/brometo de etídeo (LA/BE).
A avaliação do perfil da curva de crescimento traduziu uma redução induzida pelo
RR07 sobre a proliferação da linhagem HL-60, corroborando com os resultados obtidos pelo
ensaio do MTT, sendo observado que a partir das 6 horas nas duas maiores concentrações
2,00 e 4,00 µM ocorre diminuição no número de células, porém é no período de 12 horas de
tratamento que pode ser vista redução acentuada no número total de células em todas as
concentrações testadas.
140
O teste de exclusão do azul de tripan foi realizado inicialmente para determinar a
viabilidade celular, tendo os resultados sido confirmados posteriormente por citometria de
fluxo. O ensaio permitiu distinguir as células capazes de drenar o corante ácido azul de tripan
para fora da célula em contraposição àquelas que não possuem essa capacidade. A absorção
desse corante é um forte indicativo de dano na membrana plasmática que culmina na morte
celular (HYNES et al., 2003; MINERVINI et al., 2004). O estilbeno RR07 reduziu o
percentual de células viáveis de maneira concentração-dependente, correspondente a uma
redução máxima de 92,00 ± 0,43% para a concentração de máxima testada de 4,00 μΜ
respectivamente, reforçando os estudos prévios de citotoxicidade por MTT após 24 h de
incubação, cuja CI50 foi de 0,50 µM. BOEHLE e colaboradores (2001) mostraram que o a
combretastatina A4, um estilbenóide de estrutura semelhante ao RR07, reduziu em 59% a
viabilidade de células KNS-62 (carcinoma e pulmão) na concentração de 0,01 µM em 24
horas de incubação.
Após a confirmação da citotoxicidade pelo MTT e posterior verificação de indícios de
atividade antiproliferativa através do ensaio de exclusão pelo azul de tripan e também a
análise da curva de crescimento outros modelos foram utilizados com o intuito de esclarecer
esta atividade.
O modelo proposto para investigação acerca do mecanismo de ação do RR07, foi
avaliação do efeito antiproliferativo através da incorporação do BrdU na síntese do DNA. A
incorporação da bromodeoxiuridina (BrdU), um análogo da timidina, em DNA recém
sintetizado, pode ser mensurada com o intuito de avaliar a taxa de proliferação por meio do
percentual de células que incorporam o BrdU (DOLBEARE et al., 1983). Na cinética celular,
o ciclo das células em proliferação apresenta-se nas fases G1, S, G2 e M, enquanto na fase G0
refere-se às células quiescentes ou não proliferantes (RAZA et al., 1991; MOGILNER et al.,
2006). As células presentes na fase S, de síntese, estão sintetizando novo material genético e,
portanto, utilizando os nucleotídeos presentes no meio (HOLM et al., 1998; SCHOLEY,
2003). Estas células obrigatoriamente irão incorporar BrdU em seu DNA que, por sua vez,
pode ser detectado com o uso de anticorpos conjugados anti-BrdU e técnicas de imuno-
histoquímica para sua marcação.
A incorporação do nucleotídeo BrdU pelas células da linhagem HL-60 foi inibida pelo
tratamento com o RR07, na menor concentração de 0,25 µM em 63,5 (± 2,55%). Nas
concentrações de 0,50 e 1,00 µM, respectivamente, ocorreu inibição na incorporação do BrdU
de 84,25 ± 0,86 e 87,12 ± 0,85%, respectivamente. Do total de 300 células contadas foi
observada redução na incorporação do BrdU, estando o resultado de acordo com os achados
141
obtidos com os ensaios do MTT e de viabilidade celular pela exclusão do azul de tripan.
Valendo salientar que concentrações acima de 1,00 µM não puderam ser aplicadas neste
ensaio, devido a alta citotoxicidade do RR07. Desta forma, esses dados são indicativos de um
possível mecanismo sobre a divisão celular. De forma semelhante, a combretastatina A4,
estilbeno de estrutura análoga ao RR07, inibiu a proliferação celular sendo possível visualizar
este achado pelo ensaio do BrdU (CHIANG et al., 2009).
Os dados obtidos até essa etapa da pesquisa conduziram os estudos para ensaios onde
as colorações do tipo hematoxilina-eosina e também, a coloração diferencial de laranja de
acridina e brometo de etídio (LA/BE), que permitem investigar as características morfológicas
das células, assim estas são úteis para sugerir o tipo de morte celular, seja por necrose ou
apoptose.
A análise citológica, em células da linhagem HL-60, revelou condensação periférica
regular da cromatina e fragmentação de DNA, com presença de vacuolização características
típicas de células em morte por apoptose. O bloqueio do ciclo celular em metáfase foi
observada desde a menor concentração testada de 0,50 µM. O efeito do RR07, desencadeado
sobre as células foi semelhante à ação descrita para o alcalóide colchicina (MUELLER et al.,
1979; ZHOU et al., 2005b; TERKELTAUB; ROBERT, 2008). Outros compostos
estilbenóides como a combretastatina A4 atuam inibindo a divisão celular com parada em
metáfase (BOEHLE et al., 2001).
A morte celular é um fenômeno essencial na homeostase do organismo e sua
ocorrência tem sido documentada durante o desenvolvimento embrionário e pós-embrionário.
Esta não é apenas importante para o desenvolvimento normal, mas também para a vida adulta
de muitos organismos vivos (GERCHENSON; ROTELLO, 1992; ELMORE, 2007). Dois
processos distintos comandam a morte celular, nomeados apoptose e necrose (MAJNO;
JORIS, 1995).
Apoptose é termo inicialmente utilizado por KERR (1972) para caracterizar alterações
morfológicas incluindo condensação da cromatina, expulsão de vesículas, fragmentação
nucelar e formação de corpos apoptóticos (FINK; COOKSON, 2005). As vias de sinalização
responsáveis pela iniciação e progressão da apoptose foram identificados, onde de maneira
geral, ocorrem através da ativação de uma família de enzimas de pelo menos 14 proteases
diferentes chamadas de caspases. As cisteíno-proteases também denominadas caspases são
sintetizadas como precursores inativos chamados procaspases (FULDA; DEBATIN, 2006). A
clivagem e ativação das procaspases podem ocorrer devido a uma série de estimulações
142
incluindo ativação de receptores de morte e danos no DNA (HERR; DEBATIN, 2001;
STRASSER et al., 2000; JOZA et al., 2002).
O evento apotótico é importante durante o desenvolvimento embrionário,
metamorfose, atrofia dependente de hormônio e inibição tumoral, seja regulando o número de
células ou eliminando células danificadas. O processo de apoptose induz a morte celular de
forma altamente regulada que elimina células ou tecidos indesejados protegendo o organismo
contra a formação de neoplasmas. Desarranjos no mecanismo apoptótico podem ocasionar
diversas patologias, inclusive o câncer (MAJNO; JORIS, 1995; OPALKA et al., 2002).
As duas principais vias do processo apoptótico são a via extrínseca, que é uma via
mediada por receptores de morte, tipo TNFr-1(receptor de fator de necrose tumoral do tipo 1)
e Fas (CD95), tendo como principal iniciadora a caspase-8 (GUPTA, 2003). E a via
intrínseca, a qual e desencadeada pelo aumento da permeabilidade mitocondrial, com
liberação de moléculas pró-apoptóticas (Mcl-1S, Bad e Bax) e citocromo c no citoplasma,
ativando a caspase-9, responsável pela iniciação desta via (STRASSER et al., 2000;
PAPADOPOULOS, 2006).
A morte celular por necrose pode ocorrer no desenvolvimento de várias doenças
incluindo câncer, doenças neurodegenerativas e doenças autoimune (FULDA; PERVAIZ,
2009). Esta pode ser causada por estímulos tóxicos, bem como depleção de O2 e stress
oxidativo (EDINGER; THOMPSON, 2004). Em contraste à apoptose, a morte por necrose é,
freqüentemente, atribuída simplesmente a perturbações metabólicas ou injúrias mecânicas,
resultando em uma rápida desestabilização da membrana plasmática, desnaturação das
proteínas intracelulares, digestão enzimática, catástrofe bioenergética por depleção de ATP a
níveis incompatíveis com a sobrevivência, sendo relacionada com a resposta inflamatória.
Muitos estímulos indutores de apoptose (por exemplo: citocinas, isquemia, calor, irradiação
e patógenos) fazem com que células da mesma população morram por necrose
(DARZYNKIEWICZ et al., 1992; SERGEY et al., 2003; KUMAR et al., 2005).
As avaliações morfológicas realizadas pelo ensaio da LA/BE mostraram que após o
tratamento com o RR07 (fenstatina), nas concentrações de 0,25 e 0,50 µM evidenciou-se
aumento na população de células apoptóticas com 57,78 ± 0,88%; 67,67 ± 2,16%, onde as
células apresentavam cromatina condensada, fragmentada e de um verde brilhante intenso
quando excitadas por luz azul (BRIGGS; JONES, 2005). Vale ressaltar que o achado de
células em apoptose condiz com os resultados obtidos por JIANG e colaboradores (2008),
ocasião em que o autor demonstra a indução de apoptose causada por alguns estilbenóides,
dentre eles a fenstatina.
143
Foi visto que com o aumento da concentração do RR07 (1,00; 2,00 e 4,00 µM)
ocorreu redução no número de células em apoptose com aumento de células necróticas,
chegando a 53,66% (± 0,83%), para a maior concentração testada (4,00 µM). As células em
necrose, ou seja, com lesão de membrana, apresentaram um padrão de coloração uniforme,
laranja-avermelhada e sem formação de corpos apoptóticos. Provavelmente, a ocorrência
desse fato, possa ser explicada devido às membranas plasmáticas permanecem intactas
durante as fases iniciais do fenômeno apoptótico, até os últimos estágios, quando ocorre então
aumento da permeabilidade da membrana aos solutos normalmente retidos (KUMAR et al.,
2005).
Os achados que evidenciaram sinais de necrose nas células foram detectados também
nos testes de exclusão por azul de tripan, que mostrou maior porcentagem de células não
viáveis, sendo confirmado também pelo ensaio de coloração por H/E.
Como a apoptose pode ser induzida também a partir de lesões no DNA, o passo
seguinte na pesquisa foi avaliar a ação genotóxica do RR07 através do teste do cometa, além
disso, verificar o potencial mutagênico do composto através dos ensaios de aberração
cromossômica.
O teste do cometa tem sido muito utilizado na avaliação da segurança de novos
fármacos (HARTMANN et al., 2003), visto que é considerado um método com sensibilidade
adequada no tocante à detecção da quebra de fitas simples ou dupla do DNA (GONTIJO;
TICE, 2003). Apesar da existência de uma gama de metodologias in vitro aplicadas à
determinação da toxicidade genética, o uso de células PBMC, obtidas do sangue periférico
como células-modelo para avaliar a genotoxicidade deve-se principalmente à revelação de tais
células como indicadores sensíveis aos agentes genotóxicos, pois há correlação entre os danos
induzidos nas células periféricas do sistema hematopoiético (sangue) e outras células
somáticas, além de apresentarem uma vida considerada relativamente longa, circularem por
todos os tecidos e serem de fácil obtenção (ALBERTINI et al., 2000).
O ensaio do cometa mostrou que o RR07 induziu dano em células PBMC de forma
concentração dependente, onde nas maiores concentrações, foram detectados os maiores graus
de dano ao DNA. A avaliação genotóxica do RR07 correlaciona-se aos dados obtidos pela
análise de outros estilbenos como a combretastatina A-4, ocasião em que PETIT e
colaboradores (2008) demonstraram que estas moléculas estilbenóides são capazes de induzir
dano na estrutura do DNA.
Compostos que também possuem anel trimetoxilado em sua estrutura como é o caso
da colchicina, mostram-se genotóxicos, em concentrações elevadas entre 1251,7 a 2503,5 µM,
144
devido sobretudo a danos cromossômicos induzidos por mecanismos secundários (KIFFE et
al., 2003).
Em relação à citotoxicidade, HARTMANN; SPEIT (1997) reportaram que a
ocorrência de cometas sem cabeça e com quase todo o DNA presente na cauda (cometas da
classe 4) após a eletroforese é uma provável indicação de efeito citotóxico. A ocorrência de
cometas da classe 4 tem sido descrita como o aspecto mais indicativo de células apoptóticas
dentro dos parâmetros do teste do cometa.
A ação de drogas citotóxicas pauta-se basicamente no alvo destas substâncias, onde
alterações no processo de transcrição e a replicação de células tumorais em estágio
proliferativo podem ser evidenciadas, entretanto a baixa seletividade destes compostos induz
a efeitos indesejáveis sobre as células sadias. Em análise comparativa do potencial citotóxico
do RR07, frente aos mononucleares do sangue periférico (PBMC) e a linhagem estabelecida
de HL-60, revelaram sensibilidade 11 vezes maior sobre as células leucêmicas em relação aos
PBMCs, apesar disso, a indução dos efeitos indesejáveis em tecidos normais é inevitável
(NEIDLE; THURSTON, 2005).
Já foi constatado que quimioterápicos como: antimetabólitos, alquilantes de DNA,
ciclo-específicos e os inibidores de fuso mitótico são drogas pouco seletivas, atuando sobre os
eventos da divisão em todas as células em processo mitótico (DONNICI et al., 2005;
SRIDHAR.; SYMONDS, 2008), dessa forma inúmeros ensaios citogenéticos tem sido
bastante úteis para identificação de agentes mutagênicos, que podem surgir em populações
expostas a estes agentes (AU et al., 2001).
As aberrações cromossômicas expressam alterações resultantes das tentativas de
reparação da quebras ocorridas nas cadeias do DNA, as quais podem ocorrer por lesões
primárias (induzidas) ou por ocorrência espontânea levando na maioria das vezes a reunião
não homóloga do DNA lesado, culminando com as aberrações cromossômicas, as quais se
correlacionam positivamente com aberrações em PBMCs e desenvolvimento de carcinomas
(PFEIFFER et al., 2000; NATARAJAN, 2002; OBE et al., 2002).
Na condução de testes de genotoxicidade ou mutagênese (aberrações cromossômicas),
a toxicidade induzida pelo tratamento é muito importante, sendo que o monitoramento do
índice mitótico (IM) é um bom indicador representativo da proporção de células em divisão,
desta forma, o tratamento de células com substâncias muito citotóxicas, causam aumento nos
valores de IM, induzindo algum tipo de impedimento na progressão do ciclo celular e/ou na
capacidade proliferativa. Durante os testes de aberrações cromossômicas, sejam eles in vivo
145
e/ou in vitro, o IM mostra-se como uma importante ferramenta para o monitoramento da
toxicidade celular (BRITO et al., 1996; AMORIM et al., 2000).
O composto RR07 foi capaz de induzir aberrações em todas as fases do ciclo, com o
composto sozinho ou associado à colchicina. As moléculas estilbenóides como o RR07
(fenstatina), combretastatina e análogos compartilham similaridade com a colchicina,
principalmente pela presença do anel A (trimetoxifenil), desta forma, tanto os estilbenos como
a colchicina induzem aberrações cromossômicas nas células (GAJATE; MOLLINEDO, 2003;
KIFFE et al., 2003).
Para aprofundar os estudos dos efeitos celulares do RR07, foram realizados
experimentos em HL-60 utilizando citometria de fluxo. Nesses experimentos foram avaliados
os seguintes parâmetros: integridade de membrana, número de células, ciclo celular,
fragmentação de DNA, despolarização mitocondrial, anexina V e caspases 3,7 e 8.
A citometria de fluxo é uma ferramenta bastante valiosa para estudos estrutural e
funcional das células, sendo considerada rápida e precisa, tendo boa aplicação para
investigação de compostos com atividade antitumoral. Dentre uma série de possibilidades,
pode ser utilizada na pesquisa básica em biologia molecular e bioquímica da apoptose, bem
como na clínica para monitoramento de sinais iniciais de apoptose em tumor de pacientes
conseqüente de alguns protocolos de tratamento (A utilização de fluorocromos que possuem a
capacidade de intercalação com o DNA (iodeto de propideo) permite identificar a viabilidade
celular e fragmentação do material nuclear. As características inerentes à morfologia das
células apoptóticas como condensação da cromatina e a redução do volume celular são
detectadas por meio do desvio da luz incidida sobre a célula para frente e para o lado
(DARZYNKIEWICZ et al., 1992; RAMANATHAN, 1997, LIMA, 2005; FREIKMAN et al.,
2009).
Os estudos realizados com citometria de fluxo mostraram diminuição significativa no
número de células a partir a menor concentração (0,25 µM), contudo não foi observada perda
de integridade da membrana celular para as concentrações testadas de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e
4,00 μM. Muitos trabalhos procuram diferenciar os estágios de apoptose e necrose, todavia a
distinção, em termos morfológicos, entre apoptose e necrose está pautada, principalmente, na
perda da integridade de membrana, onde as células em apoptose permanecem com suas
membranas íntegras, até atingir o estágio de apoptose tardia, em que se verifica o início da
instabilidade da membrana plasmática. Esses dados corroboram com os resultados obtidos
pelo método de exclusão por iodeto de propideo avaliado por citometria de fluxo (VAN
CRUCHTEN; VAN DEN BROECK, 2002; MASQUELIER et al., 2004).
146
Sendo assim, foi possível avaliar que a diminuição verificada na taxa de proliferação
celular e um aumento no número de células que incorporaram o iodeto de propideo
caracterizando o processo apoptótico (eventos iniciais e tardios), das células tratadas com o
RR07, correlacionando-se com os dados obtidos na literatura que mostram que o 3,4,5-
trimetoxi-4-bromo-cis-stilbeno induziu a redução da proliferação celular de células mamárias
MCF-7 na concentração de 50 µM (SANGJUN et al., 2009).
A anexina V é um representante de uma família de proteínas ligadas a fosfolipídios
dependentes de cálcio, e possuem alta afinidade por bicamadas fosfolipídicas de membrana,
ricas em fosfatidilserina. Os fluorocromos conjugados podem ser uma ferramenta
fundamental para monitorar mudanças na assimetria de membranas celulares fosfolipídicas,
sendo, portanto um excelente método para determinar a presença de células apoptóticas
(THIAGARAJAN; TAIT, 1990; KOOPMAN et al., 1994). Dessa forma, o ensaio da anexina
V foi realizado para detectar a externalização da fosfatidilserina (evento ocorrido na fase
inicial da apoptose), o qual é um fosfolipídio interno da estrutura da membrana, e que ao ser
externalizado, sinaliza para os macrófagos induzindo a fagocitose da célula, evitando a
liberação do conteúdo celular para o meio extracelular (VERMES et al., 1995;
ZIMMERMANN et al., 2001; FREIKMAN et al., 2009).
Após 24 horas de exposição ao RR07 observou-se um aumento, de modo
concentração não dependente, no número de células, anexina positiva (apoptose inicial e
tardia). Não houve aumento no numero de células em necrose (Gráfico 8). Vale salientar que
o evento de externalização da fosfatidilserina ocorre por conta da liberação de citocromo c
devido à perda de integridade da membrana mitocondrial (GOLDSTEIN et al., 2000;
FREIKMAN et al., 2009).
A mitocôndria desempenha papel chave na deflagração da apoptose em certas
condições. Muitas proteínas intracelulares participam da ativação dessa via de morte celular,
onde as proteínas pró-apototicas, da família Bcl-2, Bax e Bak se ligam a receptores na
membrana externa da mitocôndria causando o aumento ainda maior da sua permeabilidade.
Algumas proteínas pró-apoptóticas como a Bid, Bad, (da família Bcl-2), atuam de forma
inibitória sobre o efeito das proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 ou Bcl-XL) ou ativado de forma
direta (às proteínas Bax-simili). Muitos estímulos podem causar a formação de poros na
membrana interna da mitocôndria, o que acarreta uma maior passagem de água e de algumas
moléculas para o espaço intermembrana e conseqüentemente ruptura da membrana externa
mitocondrial (BÖKER et al., 2005; OLTERSDORF et al., 2005; HUERTA et al., 2007).
147
A alteração no potencial transmembrânico de mitocôndria (ΔΨm) pode ser mensurada
com o uso da rodamina 123, o que permite distinguir a possível via de ativação da apoptose –
via intrínseca e extrínseca – (GORMAN et al., 1997). Vale também lembrar que agentes
conhecidos como desacopladores, podem aletrar o potencial de transmembrancio mitocondrial
corrompendo o fino acomplamento existente entre o transporte de elétrons e a enzima ATP
sintase, causando a dissipação do gradiente de prótons através da membrana mitocondrial
interna criado pelo sistema de transporte de elétrons, levando à morte celular (BRENNER;
MAK, 2009).
O RR07 aumentou o percentual de células com baixo potencial transmembrânico de
mitocôndria (ΔΨm), desde a menor concentração avaliada (0,25 µM) indicando o
envolvimento da ativação da via intrínseca da apoptose. É válido ressaltar que além da
diminuição do potencial transmembrânico a fragmentação do DNA também é um processo
intrinsicamente relacionado à ativação da apoptose (ZONG; THOMPSON, 2006). Segundo os
experimentos de citometria de fluxo o composto RR07 foi capaz de induzir fragmentação de
DNA em todas as concentrações avaliadas, como observado por KASIBHATLA e
colaboradores (2004) em estudos com o a combretastatina A4.
Durante a apoptose pode-se observar a ativação de enzimas proteolíticas (cistenil
aspartato-específico proteases), as caspases, sendo estas agrupadas em dois tipos: iniciadoras
(2,8,9 e 10) e efetoras (3, 6 e 7) (WANG et al., 2005). O RR07 foi capaz de ativar as caspases
3 e 7 nas concentrações de 2,50 e 5,00 µM e também ativou a caspase 8 na maior
concentração avaliada (5,00 µM). A caspase 8 tem função iniciadora da via extrínseca,
enquanto as caspases 3 e 7 correlacionam-se com a via intrínseca, dessa forma pode-se
atribuir o envolvimento destas duas vias relacionados à iniciação da apoptose pelo RR07,
principalemente a via intrínseca. Apesar da ativação da caspase 8 ter sido detectada apenas na
maior concentração, os processos compatíveis com apoptose em estágios posteriores ao da
iniciação como, por exemplo, a fragmentação de DNA já foram detectados em concentrações
bem mais baixas 0,25 µM. Outro dado importante é que a ativação da via intrínseca
(despolarização de mitocôndria) ocorreu desde a 0,25 µM. Em estágios mais adiantados,
observa-se a ativação de virtualmente todas as vias apoptóticas. As caspases são enzimas
essenciais para o processo de apoptose e até então não foram evidenciadas em células
necróticas (NICHOLSON; THORNBERRY, 1997; ZONG; THOMPSON, 2006).
O estilbenóide combretastatina A4, também apresentou atividade antimitótica,
ligando-se no sítio de ligação da colchicina à tubulina, provocando a inibição da
polimerização da tubulina com interrupção da mitose e indução do desacoplamento
148
mitocondrial, colapso da membrana mitocondrial (SABZEVARI et al.,2004; YEUNG et al.,
2009).
O resveratrol foi capaz de ativar a caspase-8, seguido por clivagem do tBid, o que leva
a translocação de Bax e liberação de citocromo c pelas mitocôndrias. Secundariamente, o
resveratrol tem como alvo as mitocôndrias, levando a dissipação do potencial de membrana e
indução de apoptose, indicando que, além da ativação da apoptose por via extrínseca, a
participação da via intrínseca pode estar envolvida devido a despolarização da membrana
mitocondrial (LIN et al., 2009).
Experimentos realizados por VITALE e colaboradores (2007) mostraram que a
combretastatina não ativou a apoptose por via extrínseca, já que não se observou a clivagem
da pró-caspase-8 e ativação da caspase-8. Embora a combretastatina tenha afetado fortemente
a morfologia e funcionalidade das mitocôndrias, como mostrado pelo ensaio de
permeabilidade da membrana mitocondrial e liberação do citocromo c, o tratamento
concomitante com o inibidor específico da caspase-2, foi incapaz de reverter alterações
mitocondriais, indicando que a caspase-2 desempenha um papel de menor importância na
morte celular desencadeada pela interferência nos microtúbulos (BORREL et al., 2005;
LEBLANC et al., 2005). Estas observações apontam para diferentes causas nos mecanismos
que conduzem à citotoxicidade, não só entre as drogas que agem nos microtúbulos a partir da
estabilização ou despolimerização da tubulina, mas também entre os agentes desencadeantes
da morte celular.
Os dados obtidos por citometro de fluxo corroboram com outros achados, os quais
descrevem a capacidade de compostos estilbenóides como a combretastatina A4 (0,03 µM) e
a fenstatina (0,01 µM) em induzirem morte celular por apoptose após 24 horas de exposição
(PETTIT et al., 1998; ROMAGNOLI et al., 2006).
O desnecadeamento do processo apoptótico observado por citometria de fluxo, em
células HL-60 após tratamento com o RR07, pode estar também envolvido com o acúmulo de
células na fase G2/M, do ciclo celular, oberservado a partir da menor concentração testada
(0,25 µM). Neste caso, os dados obitidos após a análise do ciclo corroboram com os achados
descritos na literatura, onde o estilbeno, marchantina C, induziu parada do ciclo,
principalmente na fase G2/M na concentração de 16 µM (SHI et al., 2009).
Já há algumas décadas a tubulina tem sido um alvo molecular atraente e estratégico
para o desenvolvimento de novas drogas anticâncer, como os alcalóides da vinca, o taxus, a
colchicina e derivados, bem como os estilbenóides como o resveratrol, a combretastatina A4 e
a fenstatina (PETTIT et al., 2005; MOREAU et al., 2008). Drogas que agem em microtúbulos
149
geralmente pode se ligar a uma das 3 classes de sítios existentes na tubulina: sítio da
colchicina, dos alcalóides da vinca ou do paclitaxel (BECKERS; MAHBOOBI, 2003;
CRAGG; NEWMANN, 2005; JORDAN, WILSON, 2004).
De forma mais especifica os compostos estilbenóides possuem características
estequiométricas essenciais para inibição na formação dos microtúbulos que promovem a
ligação no mesmo local da colchicina, o anel A trimetoxilado aumenta a afinidade pela
tubulina, inibindo a polimerização da tubulina (MOLLINEDO; GAJATE, 2003; ALVAREZ
et al., 2008).
O composto nocodazole é outro inibidor dos microtúbulos, tendo ação reversível, inibe
a tubulina ligando-se a porção β da tubulina, próximo ao sítio de interação da colchicina,
conduzindo ao rompimento reversível de formação dos microtúbulos e de fuso mitótico
causando parada do ciclo celular na fase M (MOLLINEDO; GAJATE, 2003).
Os ensaios de inibição da polimerização da tubulina revelaram a capacidade da
fenstatina (RR07) em inibir a polimerização da tubulina para a concentração de 10 µM de
forma semelhante ao controle positivo nocodazole testado na mesma concentração (10 µM).
Alguns estudos mostraram que os compostos estilbenóides como a combretastatina A4 (AC-
7700) foram capazes de inibir a polimerização da tubulina já na concentração de 3,57 µM
(MONK et al., 2006). Outros resultados mostraram que a colchicina é capaz de inibir a
polimerização dos microtúbulos em aproximadamente 50% na concentração de 5 µM
(CHIANG et al., 2009).
É válido destacar que os trabalhos relacionados relatam o anel (A) trimetoxifenil
presente na combretastatina, colchicina e também na fenstatina como o grupamento químico
responsável pela ligação na estrutura da tubulina impedindo sua polimerização, interferindo
na formação do citoesqueleto (PETTIT et al., 1998; JIANG et al., 2008; CHIANG et al.,
2009).
Estudos in sílico de ancoramento (docking) mostraram que estilbenos como a
combretastatina A4 e a fenstatina se ligam entre a porção α-β da tubulina, sendo o mesmo
sítio de ligação da colchicina. Nesse estudo foi observado que quando as moléculas estão
ligadas ao sitio da tubulina as energias de repulsão são mínimas. Isto pode explicar os
mecanismos de citotoxicidade e atividade antitumoral desempenhados por alguns
estilbenóides como é o caso da fenstatina (BELLINA et al., 2006).
Além disso, vale salientar que a despolimerização induzida por colchicina ativa
pequenas proteínas guanosina nucleotídeo trifosfato, denominadas (RhoA), – isto pode ser
estendido para os demais compostos que agem no sítio da colchicina – as quais são
150
coordenadoras do rearranjo de microtúbulos e actina do citoesqueleto. O exato mecanismo
ainda não está totalmente esclarecido, mas a proteína RhoA é ativada por fatores
denominados trocadores de nucleotídeos guanidínicos (GEFs) que, normalmente, estão
ligados aos microtúbulos (como por exemplo a GEF-H1). As GEFs dissociadas ativam a
RhoA que, por sua vez, ativa RhoA quinases, causando fosforialção da miosina, actina e
provocando diversos efeitos celulares incluindo apoptose (MONK et al., 2006).
Drogas que interferem na dinâmica dos microtúbulos podem interferir na distribuição
cromossômica durante a mitose (BOEHLE et al., 2001). De acordo com a coloração
diferencial por hematoxilina eosina (HE), células HL-60 tratadas com o RR07 pode-se
observar acumulo de células em metáfase, de modo semelhante à colchicina. Esses dados
sugerem que o RR07 possa estar agindo no mesmo sítio de ligação da colchicina.
As pesquisas envolvendo animais de laboratório são atribuídas de grande importância
no tocante ao sistema experimental para a compreensão dos processos antitumorais de
compostos em animais. Muitos modelos experimentais utilizando camundongos são aceitos
na pesquisa contra o câncer devido a alguns aspectos importantes como: a semelhança
fisiológica de genes, células, tecidos, órgãos e sistemas, os quais se correlacionam muito bem
aos do homem (CHABNER et al., 2001; KAMB, 2005).
Buscando consolidar os resultados obtidos com os estudos in vitro a atividade
antitumoral (in vivo) da fenstatina (4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona) – RR07 foi
avaliada utilizando camundongos Mus musculus Swiss transplantados com o Sarcoma 180.
O Sarcoma 180 é um tumor originário de camundongo e uma linhagem celular bstante
utilizada na pesquisa de atividade antitumoral in vivo (LEE et al., 2003; MAGALHÃES et al.,
2006). Dentre as doses estudadas, foi verificado que os animais tratados com RR07 nas doses
de 20 e 40 mg/kg/dia aplicados via intraperitoneal (ip), durante 7 dias, apresentaram redução
no volume do tumor em 30,90 ± 6,99 e 48,19 ± 2,57%, respectivamente para as doses
supracitadas, quando comparado ao controle negativo (DMSO 10%). Estudos anteriores,
mostraram que moléculas estilbenóides de estrutura semelhante ao RR07 como a
combretastatina A4 e análogos apresentaram relevante atividade antitumoral. Além disso, o
composto AC-7700 (análogo da combretastatina) na dose de 43 mg/kg/dia, (subcutâneo por
25 dias) em camundongos transplantados com Sarcoma 180, induziu a inibição de 64% do
crescimento tumoral (NIHEI et al., 1999a).
Outro estudo mostrou que a combretastatina A4 na dose de 100 mg/kg/dia,
(subcutânea por 14 dias) conseguiu inibir o crescimento do Sarcoma de Ewing’s de rma
significativa com p < 0,001 (DALAL; BURCHILL, 2009).
151
Vale salientar que outras moléculas que atuam sobre a tubulina induzindo a efeitos
antimitóticos como a colchicina (1 mg/kg/dia intravenosa) e vinblastina (5 mg/kg/dia
subcutânea), ambas por 10 dias de tratamento, foram capazes de suprimir o crescimento
tumoral do adenocarcinoma (c-26) mostrando dessa forma, que compostos que atuam se
ligando a tubulina (antimitóticos) são potentes agentes antitumorais, induzindo parada no
ciclo celular e causando morte, na maioria das vezes, por apoptose e reduzindo a perfusão
sanguínea em tumores sólidos (NIHEI et al., 1999b).
As semelhanças estruturais, no que diz respeito ao anel (A) 3,4,5 trimetóxifenil,
presente em estilbenóides (combretastatina A4 e RR07) bem como na colchicina pode
explicar a ação citotóxica e antitumoral de tais compostos (GROSIOS et al., 1999; JIANG et
al., 2008).
Muitas drogas anti-câncer são administradas por via intraperitoneal (ip). A via
intraperitoneal é considerada uma rápida e direta, uma vez que propicia elevada
biodisponibilidade e não está sujeito ao metabolismo de primeira passagem ou inativação pelo
suco gástrico (UNDEVIA et al., 2005).
A perda ou ganho de peso corpóreo de animais submetidos a algum tipo de tratamento
é considerado um dos aspectos mais fáceis e lógicos de serem visualizados e avaliados. O
peso dos camundongos tratados com RR07 na dose de 20 mg/kg/dia (ip) causou ganho de
peso (7,66 ± 1,23 g) em ralação ao controle negativo, enquanto a dose de 40 mg/kg/dia (ip),
diminuiu o peso dos animais (6,13 ± 0,46 g), indicando indiretamente redução sobre a massa
tumoral e com isso, interferência no peso dos animais. Evidências que também apontam a
toxicidade in vivo de substâncias relacionam-se a aumento ou diminuição no peso relativo dos
órgãos pós-tratamento (BARDOCZ et al., 1996). Após a extração dos órgãos, foi observado
que apenas o baço dos grupos relacionados aos controles positivos 5-FU (20 mg/kg ip),
Vinblastina (7 mg/kg ip) e Paclitaxel (5 mg/kg ip) apresentaram redução no peso de
importância estatística (p < 0,05).
Os achados histopatológicos referentes à análise da massa tumoral dos animais
tratados com o RR07 nas doses de 20 e 40 mg/kg/dia (ip), mostrou aumento de áreas de
necrose de coagulação, acompanhado de rarefação celular, sendo indicativo de ação tóxica
sobre as células tumorais. A combretastatina A4 (100 mg/kg/dia sc) em avaliação para
determinação de atividade antitumoral induziu redução da massa tumoral com surgimento de
quadro necrótico e hemorrágico (GROSIOS et al., 1999).
Os estudos histopatológicos dos fígados dos animais tratados com o RR07 nas doses
de 20 e 40 mg/kg/dia (ip), levou a uma intensa degeneração hidrópica dos hepatócitos,
152
hemorragia sinusoidal, acúmulo de pigmentos de hemossiderina (degradação eritrocitária),
desorganização dos cordões de hepatócitos (alteração da arquitetura celular) e hiperplasia das
células de Kupffer (apenas da dose de 40 mg/kg/dia), que pode ser explicada pela ativação de
células mononucleadas envolvidas na degradação eritrocitária, na fagocitose de detritos
celulares, absorção de ferro ou por focos hemorrágicos devido à congestão vascular. Quando
os macrófagos teciduais são ativados, liberam citocinas pró-inflamatórias que estão
diretamente relacionadas à toxicidade tecidual local ou sistêmica, focos inflamatórios e
congestão venosa portal, embora esses achados não evidenciem toxicidade importante na dose
utilizada. As alterações de necrose hemorrágica causadas pelos estilbenóides como a
combretastatina A4, provavelmente estão relacionadas a ação inibitória sobre a formação e
perfusão tumoral (GROSIOS et al., 1999; YEUNG et al., 2007).
Vale destacar que algumas células apresentavam núcleos fragmentados, como foi
observado com o controle positivo (Paclitaxel 5 mg/kg/dia – ip). A degeneração gordurosa em
microgotas encontrada no fígado dos animais tratados com 5-FU certamente resulta de
defeitos no metabolismo dos ácidos graxos (KUMAR et al., 2005).
Muitos achados em biópsias sugerem que os fármacos devem ser considerados como
possíveis causadores de qualquer lesão hepática in vivo (SCHEUER; LEFKOWITCH, 2000).
O fígado apresenta-se como o principal órgão metabolizador e detoxificador do corpo,
estando sujeito a danos por uma enorme variedade de substâncias químicas farmacêuticas e
ambientais, porém algumas lesões hepáticas ocorridas na presença de xenobióticos (como o 5-
FU) são potencialmente reversíveis desde que a arquitetura do tecido conjuntivo se mantenha
íntegra e capaz de favorecer a regeneração hepatocelular, ao ponto que mesmo após a morte
de 50% dos hepatócitos por lesão aguda, caso a matriz extracelular e seus componentes
estejam intactos, ainda sim pode haver regeneração de lóbulos hepáticos inteiros (KUMAR et
al., 2005; LIEBLER; GUENGERICH, 2005).
As alterações renais induzidas pelo RR07 intraperitoneal se deve à hemorragia
glomerular e tubular com intensa tumefação do epitélio tubular e ao acúmulo de cilindros
hialinos no lúmen tubular. Hemorragias e cilindros hialinos também foram vistos nos grupos
controle negativo e nos animais tratados com os controles positivos: 5-FU (20 mg/kg/dia ip),
Vinblastina (7 mg/kg/dia ip) e Paclitaxel (5 mg/kg/dia ip). A intensa tumefação do epitélio
tubular indica leve toxicidade caracterizada por alterações incipientes e reversíveis (TISHER;
BRENNER, 1994).
153
7 PROPOSTA PARA O MECANISMO DE AÇÃO DA FENSTATINA (RR07)
De acordo com os resultados obtidos em ensaios in vitro e in vivo presume-se que o
composto RR07 atua inibindo a polimerização da tubulina, em seguida ocorre a
desestabilização da membrana e alteração do potencial transmembrânico mitocodrial (ΔΨm),
liberação de citocromo c e ativação de caspases 3 e 7 (via intrínseca) e também da caspase 8
(via extrínseca) induzindo a fragmentação do DNA cuasando a morte celular principalmente
por apoptose.
Figura 17 – Resumo esquemático do provável mecanismo de ação do estilbenóide fenstatina (RR07) em estudo
com células HL-60 após 24 h de incubação.
154
8 PERSPECTIVAS
Atualmente se vivencia uma era promissora, no combate mais efetivo ao câncer. No
desenvolvimento de grande potencial na busca racional de terapêuticas baseadas no
mecanismo molecular do câncer. Ainda existem muitos desafios, mas estes podem ser
superados pelo auxilio de poderosas técnicas relacionadas à genômica, à biologia molecular e
ao domínio da bioquímica, ao desenvolvimento de sondas químicas a fim de alcançar alvos
moleculares (proteínas oncogênicas codificadas), ou pelo menos para elucidar as vias
moleculares envolvidas na doença. Há prospectos excelentes por prolongar vida e curar as
pessoas até mesmo com câncer. Um avanço progressivo para o desenvolvimento de
medicamentos anticâncer verdadeiramente personalizados podem surgir durante os próximos
cinco a dez anos (COLLINS; WORKMAN, 2006).
O sucesso comercial e clínico de inibidores mitóticos como taxanos e alcalóides da
vinca alavancaram os estudos para melhora nas suas formulações e descoberta de novos
compostos antitumorais que atuem em microtúbulos. As principais razões para o
desenvolvimento de novas drogas ligantes de tubulina são impulsionadas pela expectativa de
melhorias no tocante à atividade antitumoral, à redução da toxicidade, aos melhores efeitos
farmacológicos e à tecnologia farmacêutica (formulação da droga) (ATTARD et al. 2006).
Desta forma, o maior entendimento da química medicinal e síntese química, aliadas a
tecnologia farmacêutica vem direcionando para a descoberta de compostos com atividades
farmacológicas mais específicas, otimizando os efeitos terapêuticos e minimizando os efeitos
adversos
155
9 CONCLUSÃO
A fenstatina (4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona), neste trabalho denominada
RR07 é um estilbenóide com potencial antimitótico, capaz de inibir a polimerização da
tubulina, alterando o potencial transmembrânico da mitocôndria e ativando o processo de
morte celular por apoptose, podendo ser considerado um protótipo de molécula anticâncer.
156
10 REFERÊNCIAS
AGGARWAL, B. B.; BHARDWAJ, A.; AGGARWAL, R. S.; SEERAM, N. P.;
SHISHODIA, S.; TAKADA, Y. Role of Resveratrol in Prevention and Therapy of Cancer:
Preclinical and Clinical Studies. Anticancer Res., v. 24, n. 5A, p. 2783-2840, 2004.
AHMED, M.; RAHMAN, N. ATM and breast cancer susceptibility. Oncogene, v. 25, n. 43,
p. 5906-5911, 2006.
ALBERT, L.; LEHNINGER, D. L.; NELSON, M. M. Biossinalização. In: NELSON, D. L.;
COX, M. Lehninger: princípios de bioquímica. 4. ed. São Paulo: Sarvier, 2006.
ALBERTINI, R. J.; ANDERSON, D.; DOUGLAS, G. R.; HAGMAR, L.; HEMMINKI, K.;
MERLO, F.; NATARAJAN, A. T.; NORPPA, H.; SHUKER, D. E.; TICE, R.; WATERS, M.
D.; AITIO, A. IPCS guidelines for the monitoring of genotoxic effects of carcinogens in
humans. Mutat. Res., v. 463, n. 2, p.111-172, 2000.
ALMEIDA, D. C. G. Ciclo celular. In: PERES, C. M.; CURI, R. (Ed.). Como cultivar
células. 1ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. p. 26-29.
ÁLVAREZ, C.; ÁLVAREZ, R.; CORCHETE, P.; LÓPEZ, J.L.; PÉREZ-MELERO, C.;
PELÁEZ, R.; MEDARDE, M. Diarylmethyloxime and hydrazone derivatives with 5-indolyl
moieties as potent inhibitors of tubulin polymerization. Bioorg. Med. Chem Lett., v. 16, n.
11, p. 5952-5961, 2008.
ÁLVAREZ, C.; ÁLVAREZ, R.; CORCHETE, P.; PÉREZ-MELERO, C.; PELÁEZ, R.;
MEDARDE, M. Synthesis and biological activity of naphthalene analogues of phenstatins:
Naphthylphenstatins. Bioorg. Med. Chem Lett., v. 17, n. 12, p. 3417-3420, 2007.
AMORIM, M. I. M.; MERGLER, D.; BAHIA, M. O.; DUBEAU, H.M.; MIRANDA, D. C.;
LEVEL, J.; BURBANO, R. R.; LUCOTTE, M. Cytogenetic damage related to low levels of
157
methyl-mercury contamination in the Brazilian Amazon. An. Acad. Bras. Ciênc., v. 72, n. 4,
p. 487-507, 2000.
ANAZETTI, M. C.; MELO, P. S.; DURAN, N.; HAUN, M. Comparative cytotoxicity of
dimethylamide-crotonin in the promyelocytic leukemia cell line (HL-60) and human
peripheral blood mononuclear cells. Toxicology, v. 188, n. 2/3, p. 261-274, 2003.
ATTARD, G.; GREYSTOKE, A.; KAYE, S.; DE BONO, J. Update on tubulina-binding
agents. Patologie Biologie, v. 54, p. 72-84, 2006.
AU, W.W.; BADARY, O. A.; HEO, M. Y. Cytogenetic assays for monitoring populations
exposed to environmental mutagens. Occup. Med., v. 16, n. 2, p. 345-357, 2001.
BAETU, T. M.; HISCOTT, J. On the TRAIL to apoptosis. Cytokine Growth Factor Rev., v.
13, n. 3, p. 199-207, 2002.
BARDOCZ, S.; GRANT, G.; PUSZTAI, A. The effect of phytohaemagglutinin on the
growth, body composition, and plasma insulin of the rat at different dietary concentrations.
Br. J. Nutr., v. 76, n. 4, p. 613-626, 1996.
BARTOLINI, F.; GUNDERSEN, G.G. Formins and microtubules. Biochimica et Biophysica
Acta. IN PRESS. 2009.
BAUR, J. A.; SINCLAIR, D. A. Therapeutic potential of resveratrol the in vivo evidence.
Nat. Rev. Drug. Disc., v. 5, p. 493-503, 2006.
BELLINA, F.; CAUTERUCCIO, S.; MONTI, S.; ROSSI, R. Novel imidazole-based
combretastatin A-4 analogues: Evaluation of their in vitro antitumor activity and molecular
modeling study of their binding to the colchicine site of tubulina. Bioorg. Med. Chem. Lett.,
v. 16, n. 22, p. 5757–5762, 2006.
158
BERRIDGE, M. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays. That use
tetrazolium salts. Biochemical, v. 4, p. 14-19, 1996.
BEZERRA, P. D.; MILITÃO, G. C. G.; CASTRO, F. O.; PESSOA, C.; MORAES, M. O.;
SILVEIRA, E. R.; LIMA, M. A. S.; ELMIRO, F. J. M.; COSTA-LOTUFO, L. V. Piplartine
induces inhibition of leukemia cell proliferation triggering both apoptosis and necrosis
pathways. Toxicol. In Vitro, v. 21, n. 1, p.1-8, 2007.
BOATRIGHT, K. M.; SALVESEN, G. S. Mechanism of caspase activation. Curr. Opin.
Cell Biol., v. 15, n. 6, p. 725-731, 2003.
BOEHLE, A. S.; SIPOS, M. D. B.; KLICHE, M. D. U.; KALTHOFF, H.; DOHRMANN, P.
Combretastatin A-4 prodrug inhibits growth of human non–small cell lung cancer in a murine
xenotransplant model. Ann. Thorac. Surg., v. 71, n. 5, p.1657–1665, 2001.
BORREL, C.; THORET, S.; CACHET, X.; GUE´NARD, D.; TILLEQUIN, F.; KOCH, M.;
MICHEL, S. New antitubulin derivatives in the combretastatina A4 series: synthesis and
biological evaluation. Bioorg. Med. Chem. Nº13, p.3853–3864, 2005.
BRANDHORST, P. B. Informational content of the echinoderm egg. In: BROWDER, L.W.
(Ed.). Developmental biology a comprehensive synthesis: oogenesis. New York: Plenum
Press, 1985. p. 525-576.
BRASIL. Ministério da Saúde. DATASUS. Disponível em: < http://tabnet.datasus.gov.br/>.
Acesso em: 13 jul. 2009.
BRENNER, D.; MAK, T.W. Mitochondrial cell death effectors. Current Opinion in Cell
Biology. nº21, p.871–877, 2009.
BRIGGS, C.; JONES, M. S. Green I-induced fluorescence in cultured immune cells: A
comparison with Acridine Orange. Acta Histochem., v. 107, n. 4, p. 301-312, 2005.
159
BRITO, A. R. How to study the pharmacology of medicinal plants in underdeveloped
countries? J. Ethnopharmacol., v. 54, n. 2/3, p. 131-138, 1996.
BRÖKER, L. E.; KRUYT, F. A. E.; GIACCONE, G. Cell death independent of caspases: a
review. Clin. Cancer Res., v. 11, n. 9, p. 3155-3162, 2005.
BRYNE, M. Is the invasive front of an oral carcinoma the most important area for
prognostication? Oral Dis., v. 4, n. 2, p.70-77, 1998.
BURIM, R. V.; CANALLE, R.; LOPES, J. L.; VICHNEWSKI, W.; TAKAHASHI, C. S.
Genotoxic action of the sesquiterpene lactone centratherin on mammalian cells in vitro and in
vivo. Teratog. Carcinog. Mutagen., v. 21, n. 6, p. 383-393, 2001.
BUTLER, M.; DAWSON, M. Cell culture labfax. [S.l.]: Blackwell Scientific Publications,
1992.
CAI, Y. J.; FANG, J. G.; MA, L. P. L.; LIU, Y. Z. L. Inhibition of free radical-induced
peroxidation of rat liver microsomes by resveratrol and its analogues. Biochim. Biophys.
Acta. v. 1637, n. 1, p. 31-38, 2003.
CASTEDO, M.; PERFETTINI, J.L.; ROUMIER, T.; ANDREAU, K.; MEDEMA, R.;
KROEMER, G. Cell death by mitotic catastrophe: a molecular definition. Oncogene, v. 23, n.
16, p. 2825-2837, 2004.
CHABNER, B. A.; RYAN, D. P.; PAZ-ARES, L.; GARCIA-CHABONERO, R.;
CALABRESI, P. Antineoplastic agents. In: HARDMAN, J. G.; LIMBIRD, L. E. (Ed.).
Goodman & Gilman`s: The Pharmacological Basis of Therapeutics. New York: McGraw-
Hill, 2001. p.1389-1459.
CHAN, D.C. Mitochondria: dynamic organelles in disease, aging, and development, Cell
nº125, p.1241–1252, 2006.
160
CHEN, Z. H.; HURH, Y. J.; NA, H. K.; KIM, J. H.; CHUN, Y. J.; KIM, D. H.; KANG, K. S.;
CHO, M. H.; SURH, Y. J. Resveratrol inhibits TCDD-induced expression of CYP1A1 and
CYP1B1 and catecol estrogen-mediated oxidative DNA damage in cultured human mammary
epithelial cells. Carcinogenesis, v. 25, n. 10, p. 2005-2013, 2004.
CHIANG, Y. K.; KUO, C. C.; WU, Y. S.; CHEN, C. T.; COUMAR, M. S.; WU, J. S.;
HSIEH, H. P.; CHANG, C. Y.; JSENG, H.Y.; WU, M. H.; LEOU, J. S.; SONG, J. S.;
CHANG, J. Y.; LYU, P. C.; CHAO, Y. S.; WU, S. Y. Generation of Ligand-Based
Pharmacophore Model and Virtual Screening for Identification of Novel Tubulin Inhibitors
with Potent Anticancer Activity. J. Med. Chem., 2009. in press.
COLLINS, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Mol. Biotechnol., v. 26, n. 3,
p.249-261, 2004b.
COLLINS, I.; WORKMAN, P. New approaches to molecular cancer therapeutics. Nat.
Chem. Biol., v. 2, n. 12, p. 689-700, 2006.
COLLINS, S. J. The HL-60 promyelocytic leukemia cell line: proliferation, differentiation,
and cellular oncogene expression. Blood, v. 70, n. 5, p. 1233-1244, 1987a.
COSTA-LOTUFO, L. V.; CUNHA, G. M. A.; FARIAS, P. A. M.; VIANA, G. S. B.;
CUNHA, K. M. A.; PESSOA, C.; MORAES, M. O.; SILVEIRA, E. R.; GRAMOSA, N. V.;
RAO, V. S. N. The Cytotoxic and embryotoxic effects of kaurenoic acid, a diterpene isolated
from Copaifera langsdorffi oleo-resin. Toxicon, v. 40, n. 8, p. 1231-1234, 2002.
CRAGG, G. M.; NEWMAN, D. J. Antineoplasic agents from natural sources: achievements
and future directions. Exp. Opin. Invest. Drugs, v. 9, p.1-15, 2000.
CRAGG, M. G.;NEWMAN, D. J. Plants as a source of anti-cancer agents. J.
Ethnopharmacol., v. 100, n. ½, p.72-79, 2005.
161
CRECZYNSKI-PASA, T. B.; PEDROSA, R. C. Alvos moleculares na pesquisa de
fitofármacos e fitoterápicos. In: YUNES, R.A.; CALIXTO, J. B. (Ed.). Plantas medicinais
sob a ótica da química medicinal moderna. Chapecó, SC: Argos Editora Universitária,
2001. p.195-229.
DALAL, S.; BURCHILL, S. A. Preclinical evaluation of vascular-disrupting agents in
Ewing’s sarcoma family of tumours. Eur. J. Canc., v. 45, n. 4, p.713-722, 2009.
DANIAL, N. N.; KORSMEYER, S. J. Cell death: critical control points. Cell, v. 116, n. 2, p.
205-219, 2004.
DARZYNKIEWICZ, Z.; BRUNO, S.; DEL BINO, G.; GORCZYCA, W.; HOTZ, M. A.;
LASSOTA, P.; TRAGANOS, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.
Cytometry, v.13, n. 8, p.795-808, 1992.
DAUER, A.; HENSEL, A.; LHOSTE, E.; KNASMULLER, S.; MERSCH-SUNDERMANN,
V. Genotoxic and antigenotoxic effects of catechin and tannins from the bark of Hamamelis
virginiana L. in metabolically competent, human hepatoma cells (HepG2) using single-cell
gel electrophoresis. Phytochemistry, v. 63, n. 2, p.199-207, 2003.
DEBATIN, K. M. Apoptosis pathways in cancer and cancer therapy. Cancer Immunol.
Immunother., v. 53, n. 3, p. 153-159, 2004.
DIMRI, G. P. What has senescence got to do with cancer? Cancer Cell, v. 7, n. 6, p. 505-512,
2005.
DOLBEARE, F.; GRATZNER, H.; PALLAVICINI, M. G.; GRAY, J. W. Flow cytometric
measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, v. 80, n. 18, p. 5573-5577, 1983.
DONNICI, C. L.; ALMEIDA, V. L.; LEITÃO, A.; REINA, L. C. B.; MONTANARI, C. A.;
PAZ, M. T. L. Câncer e Agentes Antineoplásicos Ciclo-Celular Específicos e Ciclo-Celular
162
Não Específicos que interagem com o DNA: Uma Introdução. Quim. Nova, v.1, n. 28, p.118-
129, 2005.
DORRIE, J.; GERAUER, H.; WACHTER,Y.; ZUNINO, S. J. Resveratrol induces extensive
apoptosis by depolarizing mitochondrial membranes and activating caspase-9 in acute
lymphoblastic leukemia cells. Cancer Res., v. 61, n. 12, p. 4731-4739, 2001.
DOUGLAS, K. T. Rational Drug Design in Parasitology. Parasitol. Today, v. 10, n. 10, p.
389-392, 1994.
DRESCH, R. R.; HAESER, A. S.; LERNER, C.; MOTHES, B.; VOZÁRI-HAMPE, M. M.;
HENRIQUES, A. T. Detecção de atividade lectínica e atividade hemolítica em extratos de
esponjas (Porífera) nativas da costa atlântica do Brasil. Rev. Bras. Farmacognosia, v. 15,
p.16-22, 2005.
EDINGER, A. L.; THOMPSON, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy.
Curr. Opin. Cell Biol., v. 16, n. 6, p. 663-669, 2004.
ELMORE, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol. Pathol., v. 35, n. 4,
p. 495–516, 2007.
ESSERS, J.; VERMEULEN, W.; HOUTSMULLER, A. B. DNA damage repair: anytime,
anywhere? Curr. Opin. Cell Biol., v. 18, n. 3, p. 240-246, 2006.
ESTEVE, M.A.; CARRE, M.; BRAGUER, D. Microtubules in apoptosis induction: are they
necessary? Curr Cancer Drug Targets. nº7, v.8, p.713-729, 2007.
FINK, S. L.; COOKSON, B. T. Apoptosis, Pyroptosis, and Necrosis: Mechanistic Description
of Dead and Dying Eukaryotic Cells. Infect. Imumun., v. 73, n. 4, p.1907–1916, 2005.
163
FORNELLI, F.; MINERVINI, F.; LOGRIECO, A. Cytotoxicity of fungal metabolites to
lepidopteran (Spodoptera frugiperda) cell line (SF-9). J. Inverteb. Pathol., v. 85, n. 2, p.74 –
79, 2004.
FOSTER, I. Cancer: a cell cycle defect. Radiography. v. 14, n. 2, p.144-149, 2008.
FOUCHE, G.; CRAGG, G.M.; PILLAY, P.; KOLESNIKOVA, N.; MAHARAJ, V.J.; A,
SENABE, J. In vitro anticancer screening of South African plants. J. Ethnopharmacol., v.
119, n. 3, p. 455–461, 2008.
FULDA, S.; DEBATIN, K. M. Extrinsic versus intrinsic apoptosis pathways in anticancer
chemotherapy. Oncogene, v. 25, n. 34, p. 4798-4811, 2006.
FUSETANI, N. Marine metabolites wich inhibit development of echinoderm embryos. In:
SCHEUR, P. J. (Ed.). Biorganic marine chemistry. Berlin: Springer-Verlarg, 1987. p.175.
GAJATE, C.; MOLLINEDO, F. Microtubules, microtubule-interfering agents and apoptosis.
Apoptosis, v. 8, n. 5, p. 413–450, 2003.
GALLAGHER, R.; COLLINS, S.; TRUJILLO, J.; MCCREDIE, K. AHEARN, M.; TSAI, S.;
METZGAR, R.; AULAKH, G.; TING, R.; RUSCETTI, F.; GALLO, R. Characterization of
the continuous, differentiating myeloid cell line (HL-60) from a patient with acute
promyelocytic leukemia. Blood, v. 54, n. 3, p. 713-733, 1979.
GEIGER, T. R.; PEEPER, D. S. Critical Role for TrkB Kinase Function in Anoikis
Suppression, tumorigenesis, and metastasis. Cancer Res., v. 67, n. 13, p. 6221-6229, 2007.
GENG, C. X.; ZENG, Z. C.; WANG, J. Y. Docetaxel inhibits SMMC-7721 human
hepatocellular carcinoma cells growth and induces apoptosis. World J. Gastroenterol., v. 9,
n. 4, p. 696-700, 2003.
164
GERCHENSON, M. A.; ROTELLO, R. J. Apoptosis: a different type of cell death. FASEB
J., v. 6, n. 7, p. 2450 – 2455, 1992.
GOLDSTEIN, J. C.; WATERHOUSE, N. J.; JUIN, P.; EVAN, G. I.; GREEN, D. R. The
coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically
invariant. Nat. Cell Biol., v. 2, n. 3, p. 156-162, 2000.
GOLIAS, C. H.; CHARALABOPOULOS, A.; CHARALABOPOLOS, K. Cell proliferation
and cell cycle control: a mini review. Int. J. Clin. Pract., v. 58, n. 12, p. 1134-1141, 2004.
GONTIJO, A. M. M. C.; TICE, R. Teste do cometa para a detecção de dano no DNA e reparo
em células individualizadas. In: RIBEIRO, L. R.; SALVADORI, D. M. F.; MARQUES, E. K.
(Ed.). Mutagênese ambiental. Canoas, RS: ULBRA, 2003. p. 247-275.
GORMAN, A. M.; SAMALI, A.; McGOWAN, A. J.; COTTER, T. G. Use of flow cytometry
techniques in studying mechanisms of apoptosis in leukemic cells. Cytometry, v. 29, p. 97-
105, 1997.
GOTTLIEB, R. A. Mitochondrial and apoptosis. Biol. Signals Recept., v. 10, n. 3/4., p.147-
161, 2001.
GREEN, D. R.; KROEMER, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science, v.
305, n. 5684, p. 629-629, 2004.
GROSIOS, K.; HOLWELL, S. E.; MCGOWN, A. T.; PETTIT, G. R.; BIBBY, M. C. In vivo
and in vitro evaluation of combretastatin A-4 and its sodium phosphate prodrug. Br. J.
Cancer, v. 81, n. 8, p.1318–1327, 1999.
GUPTA, S. Molecular steps of death receptor and mitochondrial pathways of apoptosis. Life
Sci., v. 69, n. 25/26, p. 2957-2964, 2003.
165
HADFIELD, J. A.; DUCKI, S.; HIRST, N.; McGOWN, A.T. Tubulin and microtubules as
targets for anticancer drugs. Prog. Cell Cycle Res., v. 5, p.309-325, 2003.
HAIT, W. N.; RUBIN, E.; ALLI, E.; GOODIN, S. Tubulin Targeting Agents. Update on
Cancer Ther., v. 2, n. 1, p. 1-18, 2007.
HAMMEL, E. Antimitotic natural products and their interactions with tubulin. Med. Res.
Rev., v. 16, n. 2, p.207-231, 1996.
HANGARTNER, M. O. The biochemistry of apoptosis. Nature, v. 407, n. 6805, p.770-776,
2000.
HARTMANN, A.; SPEIT, G. The contribution of cytotoxicity to DNA effects in the single
cell gel test (comet assay). Toxicol. Lett., v. 90, n. 2/3, p.183-188, 1997.
HARTMANN, A.; AGURELL, E.; BEEVERS, C.; BRENDLER-SCHWAAB, S.;
BURLINSON, B.; CLAY, P.; COLLINS, A.; SMITH, A.; SPEIT, G.; THYBAUD, V.;
TICE, R. R. Recommendations for conducting the in vivo alkaline comet assay. Mutagenesis,
v. 18, n. 1, p. 45-51, 2003.
HAWKINS T.; MIRIGIAN, M.; YASAR, M.S.; ROSS, J.R L..; Mechanics of microtubules.
Journal of Biomechanics. IN PRESS. 2009.
HERR, I.; DEBATIN, K. M. Cellular stress response and apoptosis in cancer therapy. Blood,
v. 98, n. 9, p. 2603–2614, 2001.
HOLM, M.; THOMSEN, M.; HOYER, M.; HOKALAND, P. Optimization of a flow
cytometric method for the simultaneous measuremente of cell suface antigen, DNA content,
and in vitro BrdU incorporation into normal and malignant hematopoietic cells. Cytometry,
v. 32, p. 28-36, 1998.
166
HOTTA, K.; UEOKA, H. New cytotoxic agents: a review of the literature. Clin. Rev. Onc.
Hemat., v.35, p.45-65, 2005.
HOWARD, A.; PELE, S. R. Synthesis of nucleoprotein in bean root cells. Nature, v. 167, n.
4250, p.599-600, 1951.
HSIEH, N. P.; LIOU, J. P.; MAHINDROO, N. Pharmaceutical design of antimitotic agents
based in combretastatins. Curr. Pharm. Des., v.11, n. 13, p.1655-1677, 2005.
HUERTA, S.; GOULET, E. J.; HUERTA-YEPEZ, S.; LIVINGSTON, E.H. Screening and
detection of apoptosis – Research review. J. Surg. Res., v. 139, n. 1, p.143-156, 2007.
HYMAN, A. A.; MIDDLETON, K. M.; CENTOLA, M.; MITCHISON, T. J.; CARBON, J.
Microtubule-motor activity of a yeast centromere-binding protein complex. Nature, v. 359, n.
6395, p. 533-536, 1993.
HYNES, J.; FLOYD, S.; SOINI, A. E.; O’CONNOR, R.; PAPKOVSKY, D. B. Fluorescence-
based cell viability screening assays using water-soluble oxygen probes. J. Biomolec.
Screen., v. 8, n. 3, p. 264-272, 2003.
INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER (INCA). Estimativa 2008-2009: Incidência de
câncer no Brasil. Rio de Janeiro, 2008.
ISMAEL, G.F.V.; ROSA, D. D.; MANO, M. S.; AWADA, A. Novel cytotoxic drugs: Old
challenges, new solutions. Cancer Treat. Rev., v. 34, n. 1, p.81-91, 2008.
JACOBS, R. S.; WHITE, S.; WILSON, L. Selective compounds derived from marine
organisms: effects on cell division in fertilized sea urchin eggs. Fed. Proc., v. 40, n. 1, p. 26–
29, 1981.
167
JACOBS, R. S.; WILSON, L. Fertized sea urchin egg as a model for detecting cell division
inhibitors. In: ASZALOR, A. (Ed.). Modern analysis of antibiotics. New York: Marcel
Dekker, 1986. p. 481-493.
JEMAL, A.; SIEGEL, R.; WARD, E.; HAO, Y.; XU, J.; MURRAY, T.; THUN, M. J. Cancer
Statistics, 2008. CA Cancer J. Clin., v. 58, n. 2, p.71–96, 2008.
JIANG, S.; CROGAN-GRUNDY, C.; DREWE, J.; TSENG, B.; CAI, S. X. Discovery of
(naphthalen-4-yl)(phenyl)methanones and N-methyl-N-phenylnaphthalen-1-amines as new
apoptosis inducers using a cell- and caspase-based HTS assay. Bioorg. Med. Chem. Lett.,
v.18, n. 21, p. 5725–5728, 2008.
JIANG, X.; WANG, X. Cytochrome C-mediated apoptosis. Annu. Rev. Biochem., v. 73, p.
87–106, 2004.
JIMENEZ, P. C.; FORTIER, S. C.; LOTUFO, T. M. C.; PESSOA, C.; MORAES, M. E. A.;
MORAES, M.O.; COSTA-LOTUFO, L.V. Biological activity in extracts of ascidians
(Tunicata, Ascidiacea) from the northeastern Brazilian coast. J. Exp. Marine Biol. Ecol., v.
287, n. 1, p. 93-101, 2003.
JORDAN, M. A.; WILSON, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat. Rev.
Cancer, v. 4, n. 4, p.253–265, 2004.
JORDAN, M.A.; KAMATH, K. How do microtubule-targeted drugs work? An overview.
Curr Cancer Drug Targets. v.7, nº8, p.730–742, 2007.
JOZA, N.; KROEMER, G.; PENNINGER, J. M. Genetic analysis of the mammalian cell
death machinery. Trends Genet., v. 18, n. 3, p.142-149, 2002.
KAMB, A. What’s wrong with our cancer models? Nat. Rev. Drug Discov., v. 4, n. 2, p.
161-165, 2005.
168
KANG, J. H.; PARK, Y. H.; CHOI, S. W.; YANG, E. K.; LEE, W. J. Resveratrol derivatives
potently induce apoptosis in human promyelocytic leukemia cells. Exp. Mol. Med., v. 35, n.
6, p. 467-474, 2003.
KASIBHATLA, S.; GOURDEAU, H; EEROVITCH, K.; DREWE, J.; REDDY, S.; QIU, L.;
ZHANG, H.; ERGERON, F.; BOUFFARD, D.;YANG, Q.; HERICH, J.; LAMOTHE, S.;
CAI, S. X.; TSENG,B. Discovery and mechanism of action of a novel series of apoptosis
inducers with potential vascular targeting activity. Mol. Cancer Ther., v. 3, n.11, p.1365-
1373, 2004.
KAVALLARIS, M.; VERRILLS, N.M.; HILL, B. T. Anticâncer therapy with novel tubulin-
interacting drugs. Drug Resist. Updat, v. 4, n. 6, p. 392-401, 2001.
KELEKAR, A. Autophagy. Ann. NY Acad. Sci., v. 1066, p.259-271, 2005.
KERR, J. F.; WYLLIE, A. H.; CURRIE, A. R. Apoptosis: a basic morphological
phenomenon with wide range implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer, v. 26, n. 4, p.
239-257, 1972.
KIFFE, M.; CHRISTEN P.; ARNI, P. Characterization of cytotoxic and genotoxic effects of
different compounds in CHO K5 cells with the comet assay (single-cell gel electrophoresis
assay). Mutat. Res., v. 537, n. 2, p.151–168, 2003.
KIM, R.; EMI, M.; MATSUURA, K.; TANABE, K. Antisense and nonantisense effects of
antisense Bcl-2 on multiple roles of Bcl-2 as a chemosensitizer in cancer therapy. Cancer
Gene Ther., v. 14, n. 1, p.1-11, 2007.
KIRWAN, I. G.; LOADMAN, P. M.; SWAINE, D. J.; ANTHONEY, D. A. PETTIT, G. R.;
LIPPERT III, J. W.; SHNYDER, S. D.; COOPER, P. A.; BIBBY, M. C. Comparative
Preclinical Pharmacokinetic and Metabolic Studies of the Combretastatin Prodrugs
Combretastatin A4 Phosphate and A1 Phosphate. Clin. Cancer Res., v. 10, p.1446–1453,
2004.
169
KLAUNING, J. E.; KAMENDULIS, L.M. Chemical carcinogenesis. In: KLAASSEN, C. D.
(Ed.). Casarett and Doull's Toxicology: The basic science of poisons. 7th ed. [S.l.]:
McGraw-Hill, 2008. p. 329-380.
KOOPMAN, G.; REUTELINGSPERGER, C. P.; KUIJTEN, G. A.; KEEHNEN, R. M.;
PALS, S. T.; VAN OERS, M. H. Annexin V for flow cytometric detection of
phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood, v. 84, n. 5, p.1415-
1420, 1994.
KROEMER G.; MARTIN, S.J. Caspase-independent cell death. Nat Med nº11, p.725–730,
2005.
KUMAR, V.; ABBAS, A. K.; FAUSTO, N.; ROBBINS, S. L.; COTRAN, R. S. Pathology
basis of disease. 7th ed. [S.l]: WB Saunders, 2004.
LEBLANC, R., DICKSON, J. BROWN, T.; STEWART, M.; PATI, H.N.; VANDERVEER,
D.; ARMAN, H.; HARRIS, J.; PENNINGTON, W.; HOLT, H.L. LEE, M. Synthesis and
cytotoxicity of epoxide and pyrazole analogs of the combretastatins. Bioorg Med Chem,
13(21): 6025-34, 2005.
LEE, Y. L.; KIM, H. J.; LEE, M. S.; KIM, J. M.; HAN, J. S.; HONG, E. K.; KWON, M. S.;
LEE, M. J. Oral administration of Agaricus blazei (H1 strain) inhibited tumor growth in a
sarcoma 180 inoculation model. Exp. Anim., v. 52, n. 5, p.371-375, 2003.
LENZ, H. J. Clinical update: proteasome inhibitors in solid tumors. Cancer Treat. Rev., v.
29, suppl. 1, p. 41–48, 2003.
LI, H.; WU, W.K.K.; ZHENG, Z.; YU, L.; LI, Z.J.; WU, Y.C.; CHENG, K.W.; CHO, C.H.;
WANG, M. 2,3’,4,4’,5’-Pentamethoxy-trans-stilbene, a Resveratrol Derivative, is a Potent
Inducer of Apoptosis in Colon Cancer Cells via Targeting Microtubules. Bio. Pharm., 2009.
In Press.
170
LI, H.; ZHU, H.; XU, C. J.; YUAN, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the
mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell, v. 94, n. 4, p.491-501, 1998.
LIEBLER, D. C., GUENGERICH, F. P. Elucidating Mechanisms of Drug-induced Toxicity.
Nat. Rev. Drug Discov., v. 4, p. 410-420, 2005.
LIEKENS, S.; DE CLERCQ, E.; NEYTS, J. Angiogenesis: regulators and clinical
applications. Biochem.Pharmacol., v. 61, n. 3, p. 253-270, 2001.
LIMA, D. P.; ROTTA, R.; BEATRIZ, A.; MARQUES, M.R.; MONTENEGRO, R.C.;
VASCONCELLOS, M.C.; PESSOA, C.; MORAES, M.O.; COSTA-LOTUFO, L.V.;
SAWAYA, A.C.H.F.; EBERLIN, M.N. Synthesis and biological evaluation of cytotoxic
properties of stilbene-based resveratrol analogs. Eur. J. Med. Chem., v. 44, p.701-707, 2009.
LIMA, T. M. Citometria de fluxo. In: PERES, C. M.; CURI, R. Como cultivar células. 1. ed.
Rio de Janeiro, RJ: Guanabara Koogan, 2005. p.227-253.
LIN, H. L.; CHIOU, S. H.; WU, C.W.; LIN, W. B.; CHEN, L. H.; YANG, Y. P.; TSAI, M.
L.; UEN, Y. H.; LIOU, J. P.; CHI, C.W. Combretastatin A4-Induced Differential Cytotoxicity
and Reduced Metastatic Ability by Inhibition of AKT Function in Human. Gast. Cancer
Cells, v. 323, n. 1, p. 365-373, 2007a.
LIN, K.H.; HSIAO, G.; SHIH, C.M.; CHOU, D.S.; SHEU, J.R.Mechanisms of resveratrol-
induced platelet apoptosis. Cardiovascular Research nº83, p.575–585, 2009b.
LIOTTA, L. A.; KOHN, E. C. ‘The microenvironment of the tumourhost interface’, in
Nature, v. 411, p.375-379, 2001.
LOCKSHIN, R. A.; WILLIAMS, C.M. Progammed cell death. I. The cytology of
degeneration in the intersegmental muscles of the pernyi silkmoth. J. Insect Physiol., v. 11,
p.123-133, 1965.
171
LORENZO, M. A; GUZMAN, W.; MARQUEZ, C. J. Potenciales antimitoticos: 2. sintesis de
1-bencil-3-carboetoxi-2-quinolonas. Acta Cient. Venez., v. 53, n. 2, p.119-123, 2002.
LOVELL, D. P.; THOMAS, G.; DUBROW, R. Issue related to the experimental design and
subsequent statistical analysis of in vivo and in vitro comet assay. Teratog. Carcinog.
Mutagen., v. 19, p. 109-119, 1999.
MA, Z.; MOLAVI, O.; HADDADI, A.; LAI, R.; GOSSAGE, R.A.; LAVASANIFAR, A.
Resveratrol analog trans 3,4,5,4_-tetramethoxystilbene (DMU-212) mediates anti-tumor
eVects via mechanism different from that of resveratrol. Cancer Chemother. Pharmacol., v.
63, p. 27–35, 2008.
MADDIKA, S. A.; ANDEA, S. R.; PANIGRAHI, S.; PARANJOTHY, T.; WEGLARCZYK,
K.; ZUSE, A.; ESHRAGHI, M.; MANDA, K.D.; WIECHEC, E.; LOS, M. Cell survival, cell
death and cell cycle pathways are interconnected: Implications for cancer therapy. Drug
Resist. Updat, v.10, n. ½, p.13–29, 2007.
MAGALHÃES, H. I. F.; VERAS, M. L.; TORRES, M. R.; ALVES, A. P. N. N.; PESSOA,
O. D. L.; SILVEIRA, E. R.; COSTA-LOTUFO, L. V.; MORAES, M. O.; PESSOA, C. In
vitro and in vivo antitumor activity of physalins B and D from Physalis angulata. J. Pharm.
Pharmacol., v. 58, p.235-241, 2006.
MAJNO, G.; JORIS, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis: an overview of cell death. Am. J.
Pathol., v. 146, p. 3-15, 1995.
MALUF, L. M. P.; POMPÉIA, C. Morte Celular: Apoptose e Necrose. In: PERES, C.M.;
CURI, R. (Ed.). Como cultivar células. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. p.
200-226.
MASQUELIER, M.; ZHOU, Q. F.; GRUBER, A.; VITOLS, S. Relationship between
daunorubicin concentration and apoptosis induction in leukemic cells. Biochem. Pharmac.,
v. 67, p.1047-1056, 2004.
172
MATTIOLI, F.; MARTELLI, A.; GOSMARA, M.; GARBERO, C.; MANFREDI, V.;
VARALDO, E.; TORRE, G. C.; BRAMBILLA, G. DNA fragmentation and DNA repair
synthesis induced in rat and human thyroid cells by chemicals carcinogenic to the rat thyroid.
Mutation Res., v. 609, p.146–153, 2006.
McGAHON, A. J.; MARTIN, S. M.; BISSONNETTE, R. P.; MAHBOUBI, A.; SHI, Y.;
MOGIL, R. J.; NISHIOKA, W. K.; GREEN, D. R. The end of the (cell) line: methods for the
study of apoptosis in vitro. Methods Cell Biol., v. 46, p. 153–185, 1995.
McGROGAN, B. T.; GILMARTIN, B.; CARNEY, D. N.; McCANN, A. Taxanes,
microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim. Biophys. Acta, v. 1785, n. 2, p. 96–
132, 2008.
MESQUITA, M. L.; PAULA, J. E.; PESSOA, C.; MORAES, M. O.; COSTA-LOTUFO, L.
V.; GROUGNET, R.; MICHEL, S.; TILLEQUIN, F.; ESPINOLA, L. S. Cytotoxic activity of
Brazilian Cerrado plants used in traditional medicine against cancer cell lines J.
Ethnopharmacol., v. 123, p. 439–445, 2009.
MILITÃO, G. C. G.; DANTAS, I. N. F.; PESSOA, C.; FALCÃO, M. J. C.; SILVEIRA, E.
R.; LIMA, M. A. S.; CURI, R.; LIMA, T.; MORAES, M. O.; COSTA-LOTUFO, L. V.
Induction of apoptosis by pterocarpans from Plastymiscium foribundum in HL-60 human
leukemia cells. Life Sci., v. 78, n. 20, p. 2409-2417, 2006.
MINERVINI, F.; FORNELLI, F.; FLYNN, K. M. Toxicity and apoptosis induced by the
mycotoxins nivalenol, depxynivalenol, and fumonisin B1 in a human erythroleukemia cell
line. Toxicol. In Vitro. v. 18, n. 1, p.21-28, 2004.
MITELMAN, F. (Ed.). ISCN 1995: International System for Human Cytogenetic
Nomenclature. Basel: Karger, 1995.
MITRA, A.; SEPT, D. Taxol allosterically alters the dynamics of the tubulin dimer and
increases the flexibility of microtubules. Biophys. J., v. 95, n. 7, p. 3252-3258, 2008.
173
MOGILNER, A.; WOLLMAN, R.; SCHOLEY-CIVELEKOGLU, G.; SCHOLEY, J.
Modeling mitosis. Trends in Cell Biology. v.16, nº2, p.88-96, 2006.
MOLLINEDO, F.; GAJATE, C. Microtubules, microtubule-interfering agents and apoptosis.
Apoptosis, v. 8, n. 5, p. 413–450, 2003.
MONK, K. A.; SILES, R.; HADIMANI, M. B.; MUGABE, B. E.; ACKLEY, J. F.;
STUDERUS, S.W.; EDVARDSEN, K.; TRAWICK, M. L.; GARNER, C. M.; RHODES, M.
R.; PETTIT, G. R.; PINNEY, K. G. Design, synthesis, and biological evaluation of
combretastatin nitrogen-containing derivates as inhibitors of tubulina assembly and vascular
disrupting agents. Bioorg. Med. Chem., v. 14, p.3231-3244, 2006.
MOOI, W. J.; PEEPER, D. S. Oncogene-induced cell senescence-halting on the road to
cancer. N. Engl. J. Med., v. 355, n. 10, p. 1037-1046, 2006.
MOORHEAD, P. S.; NOWELL, P. C.; MELLMAN, W. J.; BATTIPS, D. M.;
HUNGERFORD, D. A. Chromosome preparations of leukocytes cultures from human
peripheral blood. Exp. Cell Res., v. 20, p. 613-616, 1960.
MOREAU, E.; FORTIN, S.; LACROIX. J.; PATENAUDE, A.; ROUSSEAU, J.L.C.;
GAUDREAULT, R. C. N-phenyl-N’-(2-chloroethyl)ureas (CEUs) as potential antineoplastic
agents. Part 3: Role of carbonyl groups in the covalent binding to the colchicine-binding site.
Bioorg. Med. Chem., v. 16, n. 3, p.1206-1217, 2008.
MORRIS, P. G.; FORNIER, M. N. Microtubule active agents: Beyond the taxane frontier.
Clin. Cancer. Res., v. 14, n. 22, p.7167-7172, 2008.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to
proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods, v. 65, n. ½, p. 55-63, 1983.
MOUSSET, C.; GIRAUD, A.; PROVOT, O.; HAMZE, A.; BIGNON, J.; LIU, J. M.;
THORET, S.; DUBOIS, J.; BRION, J. D.; ALAMI, M. Synthesis and antitumor activity of
174
benzils related to combretastatin A-4. Bioorg. Med. Chem. Lett., v. 18, n. 11, p. 3266–3271,
2008.
MUELLER, G. A.; GAULDEN, M. E.; DRANE, W. The effects of varying concentrations of
colchicine on the progression of grasshopper neuroblasts into metaphase. J. Cell Biol., v. 48,
n. 2, p. 253-265, 1979.
MURIAS, M.; JAGER, W.; HANDLER, N.; ERKER, T.; HORVATH, Z.; SZEKERES, T.;
NOHL, H.; GILLE, L. Antioxidant, prooxidant and cytotoxic activity of hydroxylated
resveratrol analogues: structure–activity relationship. Biochem. Pharmacol., v. 69, n. 6, p.
903-912, 2005.
NAKAYAMA, K. N.; NAKAYAMA, K. Ubiquitin ligases: cell cycle control and cancer.
Nat. Rev. Cancer, v. 6, n. 5, p. 369-381, 2006.
NATARJAN, A. T.; OBE, G. Screening of human populations for mutations induced by
environmental pollutants: use of human lymphocyte system. Ecotoxicol. Environ. Saf., v. 4,
n. 4, p. 468-481, 1980.
NEIDLE, S.; THURSTON, D. E. Chemical approaches to the discovery and development of
cancer therapies. Nat. Rev. Cancer, v. 5, n. 4, p. 285-296, 2005.
NICHOLSON, D. W.; THORNBERRY, N. A. Caspases: killer proteases. Trends Biochem.
Sci., v. 22, n. 8, p. 299-306, 1997.
NIHEI, Y.; SUGA, Y.; MORINAGA, Y.; OHISHI, K.; OKANO, A.; OHSUMI, K.;
HATANAKA, T.; NAKAGAWA, R.; TSUJI, T.; AKIYAMA, Y.; SAITO, S.; HORI, K.;
SATO, Y.; TSURUO, T. A Novel Combretastatin A-4 Derivative, AC-7700, Shows Marked
Antitumor Activity against Advanced Solid Tumors and Orthotopically Transplanted Tumors.
Jpn. J. Cancer Res., v. 90, n. 9, p.1016–1025, 1999b.
175
NIHEI, Y.; SUZUKI, M.; OKANO, A.; TSUJI, T.; AKIYAMA, Y.; TSURO, T.; SATIO,
SACHIKO, S.; HORI, K.; SATO, Y. Evaluation of antivascular and antimitotic effects of
tubulina binding agents in solid tumor therapy. Jpn. J. Cancer Res., v. 90, n. 12, p.1387-
1395, 1999a.
NORDENSON, I.; BECKMAN, L.; LIDÉN, S.; STJERNBERG, N. Chromosomal
aberrations and cancer risk. Hum. Hered., v. 34, n. 2, p. 76-81, 1984.
OBE, G.; PFEIFFER, P.; SAVAGE, J. R.; JOHANNES, C.; GOEDECKE, W.; JEPPESEN,
P.; NATARAJAN, A. T.; MARTINEZ-LOPEZ, W.; FOLLE, G. A.; DRETS, M. E.
Chromosomal aberrations: formation, identification and distribution. Mutat. Res., v. 504, n.
½, p.17-36, 2002.
OGA, S.; CAMARGO, M. M. A.; BATISTUZZO, J. A. O. Bases da Toxicologia –
Mutagênese e Carcinogênese. In: ______. Fundamentos de toxicologia. 3. ed. São Paulo:
Atheneu, 2008. p. 83-99.
OKADA H.; MAK, T.W. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells.
Nat. Rev. Cancer, v. 4, n. 8, p. 592-603, 2004.
OLTERSDORF, T.; ELMORE, S. W.; SHOEMAKER, A. R.; ARMSTRONG, R. C.;
AUGERI, D. J.; BELLI, B. A. et al. An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression
of solid tumours. Nature, v. 435, n. 7042, p. 677-681, 2005.
OPALKA, B.; DICKOPP, A.; KIRCH, H. C. Apoptotic genes in cancer therapy. Cells
Tissues Organs, v. 172, n. 2, p.126-132, 2002.
ORR, G.; VERDIER-PINARD, P. Mechanisms of taxol resistance related to microtubules.
Oncogene, v. 22, n. 47, p.7280-7295, 2003.
176
PAMPALONI, F.; FLORIN, ERNST-LUDWIG. Microtubule architecture: inspiration for
novel carbon nanotube-based biomimetic materials. Trends in Biotechnology. v.26, nº.6,
2008.
PAPADOPOULOS, K. Targeting the Bcl-2 family in cancer therapy. Semin. Oncol., v. 33, n.
4, p. 449-456, 2006.
PASQUIER, E.; HONORE, S.; BRAGUER, D. Microtubule-targeting agents in angiogenesis:
where do we stand? Drug Resist. Updat., v. 9, n. ½, p.74–86, 2006.
PATHANIA, D.; MILLARD, M.; NEAMATI, N. Opportunities in discovery and delivery of
anticancer drugs targeting mitochondria and cancer cell metabolism. Advanced Drug Delivery
Reviews nº61, p.1250–1275, 2009.
PELLEGRINI, M. P.; PINTO, R. C. V.; CASTILHO, L. R. Mecanismo de crescimento e
morte de células animais cultivadas in vitro. In: MORAES, A. M.; AUGUSTO, E. F. P.;
CASTILHO, L. R. (Ed.). Tecnologia do cultivo de células animais de biofármacos a
terapia gênica. 1. ed. São Paulo: [s.n.], 2008. p.138-169.
PERDIGÃO, J.; TAVARES, A. Ciclo celular e novas terapias contra o câncer (o ano do
Nobel). Bol. Biotecnol., v. 70, p. 7-14, 2001.
PERES, C. M.; CURI, R. Como cultivar células. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005.
PERVAIZ, S. Chemotherapeutic potential of the chemopreventive phytoalexin resveratrol.
Drug Resist. Updat., v. 7, n. 6, p. 333–344, 2004.
PESSOA, C.; VIEIRA, F. M. A. C.; LEMOS, T. G.; MORAES, M. O.; LIMA, P. D. L.;
RABENHORST, S. H. B.; LEYVA, A.; BURBANO, R. R. Oncocalyxone A from Auxema
oncocalyx lacks genotoxic activity in phytohemagglutinin-stimulated lymphocytes. Teratog.
Carcinog. Mutagen., suppl. 1, p. 215-220, 2003.
177
PETIT, I.; KARAJANNIS, M. A.; VINCENT, L.; YOUNG, L.; BUTLER, J.; HOOPER, A.
T.; SHIDO, K.; STELLER, H.; CHAPLIN, D. J.; FELDMAN, E.; RAFII, S. The
microtubule-targeting agent CA4P regresses leukemic xenografts by disrupting interaction
with vascular cells and mitochondrial-dependent cell death. Blood, v.111, n. 4, p.1951-1961,
2008.
PETTERS, C. F.; DE GEUS, L. F.; WESTPHAL, J. R.; DE WAAL, R. M.; RUITER, D. J.;
WOBBES, T.; OYEN, W. J.; RUERS, T. J. Decrease in circulating anti-angiogenic factors
(angiostatin and endostatin) after surgical removal of primary colorectal carcinoma coincides
with increased metabolic activity of liver metastases. Surgery, v. 137, n. 2, p. 246-249, 2005.
PETTIT, G. R.; GREALISH, M. P.; HERALD, D. L.; BOYD, M. R.; HAMEL, E.; PETTIT,
R. K. Antineoplastic Agents. 443. Synthesis of the Cancer cell growth inhibitor
hydroxyphenstatin and its Sodium diphosphate prodrug. J. Med. Chem., v. 43, n. 14, p.2731-
2737, 2000.
PETTIT, G. R.; GREALISH, M. P.; JUNG, M. K.; HAMEL, E.; PETTIT, R.K.; CHAPUIS,
J.C.; SCHMIDT, J.M. Antineoplastic Agents. 465. Structural modification of resveratrol:
Sodium reverastatin phosphate. J. Med. Chem., v. 45, n. 12, p. 2534-2542, 2002.
PETTIT, G. R.; RHODES, M. R.; HERALD, D. L.; HAMEL, E.; SCHMIDT, J.M.; PETTIT,
R. K. Antineoplastic Agents. 445. Synthesis and Evaluation of Structural Modifications of
(Z)- and (E)- Combretastatin A41. J. Med. Chem., v. 48, n. 12, p. 4087-4099, 2005.
PETTIT, G. R.; TOKI, B.; HERALD, D. L.; VERDIER-PINARD, P.; BOYD, M. R.;
HAMEL, E.; PETTIT, R. K. Antineoplastic Agents. 379. Synthesis of phenstain phosphate. J.
Med. Chem., v. 41, n. 10, p.1688-1695, 1998.
PFEIFFER, P.; GOEDECKE, W.; OBE, G. Mechanisms of DNA double-strand break repair
and their potencial to induce chromosomal aberrations. Mutagen, v. 4, n. 5, p. 289-302, 2000.
178
PINNEY, G. K.; JELINEK, C.; EDVARDSEN, K.; CHAPLIN, D. J.; PETIT, G. R. The
discovery and development of the Combretastatin. In: CRAGG, G. M.; KINGSTON, D. G. I.;
NEWMAN, D. J. (Ed.). Anticancer agents from natural products. [S.l.]: CRC Press, 2005.
p. 23-46.
PINTO, L. F. R.; FELZENSZWALB, I. Genética do câncer humano. In: RIBEIRO, L. R.;
SALVADORI, D. M. F.; MARQUES, E. K. (Ed.). Mutagênese ambiental. 1. ed. Canoas,
RS: ULBRA, 2003. p. 29-44.
POHLIT, A. M.; TIGRE, R. F.; CAVALCANTI, B. C.; MORAES, M. O.; COSTA-
LOTUFO, L. V.; MORAES, M. E. A.; SANTOS, E. V. M.; MORAIS, S. K. R.;
NUNOMURA, S. M.; PESSOA, C. Cytotoxic Fractions from the Leaves of Tachia
grandiflora. Pharm. Biol., v. 45, n. 5, p. 429–433, 2007.
PRESTON, R. J.; SAN SEBASTIAN, J. R.; McFEE, A. F. The in vitro human lmphocte
assay for assessing the clastogenicity of chemical agents. Mutat. Res., v. 189, n. 2, p.175-
183, 1987.
PROSKURYAKOV, S. Y.; KONOPLYANNIKOV, A. G.; GABAI, V. L. Necrosis: a specific
form of programmed cell death? Exp. Cell Res., v. 283, n. 1, p. 1-16, 2003.
QIAO, L.; WONG, B. C. Targeting apoptosis as an approach for gastrointestinal cancer
therapy. Drugs Res. Updat., v. 12, n. 3, p. 55–64, 2009.
RABELLO-GAY, M. N.; RODRIGUES, M.; NONTELEONE-NETO, R. Teste do
micronúcleo em medula óssea. In: ______. Mutagênese, carcinogênese e teratogênese:
métodos e critérios de avaliação. Ribeirão Preto, SP: FCA, 1991. p. 241.
RAMANATHAN, M. Flow cytometry application in pharmacodynamics and drug delivery.
Pharm. Res., v. 14, n. 9, p.1106-1114, 1997.
179
RAZA, A.; BOKHARI, J.; YOUSUF, N.; MEHDI, A.; MAZEWSKI, C.; KHAN, S.;
BAKER, V.; LAMPKIN, B. Cell cycle kinetic studies in human cancers. Arch. Pathol. Lab.
Med., v. 115, n. 9, p. 873-879, 1991.
REHEN, S. K. Ciclo Celular. In: CARVALHO, H. F.; RECCO-PIMENTEL, S. M. (Ed.). A
célula. 2. ed. Barueri, SP: Manole, 2007. p. 304-308.
RIBEIRO, L. R.; SALVADORI, D. M. F.; MARQUES, E. K. Genética do câncer humano.
In: ______. Mutagênese ambiental. 1. ed. Canoas, RS: ULBRA, 2003. p. 29-44.
RIBÉREAU-GAYON, P. Tratado de enologia – química del vino estabilización y
tratamientos. Buenos Aires: Hemisfério Sur, 2002.
RICCI, M. S.; ZONG, W. X. Chemotherapeutic approaches for targeting cell death pathways.
Oncologist, v. 11, n. 4, p. 342-357, 2006.
RISINGER, A. L.; GILES, F. J.; MOOBERRY, S. L. Microtubule dynamics as a target in
oncology. Cancer Treat. Rev., v. 35, n. 3, p. 255–261, 2009.
ROMAGNOLI, R.; BARALDI, P. G.; PAVANI, M. G.; TABRIZI, A.; PRETI, D.;
FRUTTAROLO, F.; PICCAGLI, L.; JUNG, M. K.; HAMEL, E.; BORGATTI, M.;
GAMBARI, R. Synthesis and biological evaluation of 2-amino-3-(3’,4’5’-
trimethoxybenzoyl)-5-aryl thiophenes as a new class of potent anti-tubulin agents. J. Med.
Chem., v. 49, n. 13, p. 3906-3915, 2006.
RUCHAUD, S.; CARMENA, M.; EARNSHAW, W. C. Chromosomal passengers:
conducting cell division. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., v. 8, n. 10, p. 799-812, 2007.
RUPNARAIN, C.; DLAMINI, Z.; NAICKER, S.; BHOOLA, K. Colon cancer: genetics and
apoptotic events. Biol. Chem., v. 385, n. 6, p. 449-464, 2004.
180
RUPPERT, E. E.; BARNES, R. B. Zoologia dos invertebrados. 6. ed. São Paulo: Rocca,
1996.
SABBATINI P.; SPRIGGS, D. R. Epothilones: Better or more of the same? J. Clin. Oncol.,
v.27, n. 19, p. 3079-3081, 2009.
SABZEVARI, O., GALATI, G. et al. Molecular cytotoxic mechanisms of anticancer
hydroxychalcones. Chem Biol Interact, nº148, v.1-2, p:57-67, 2004.
SANGJUN, S.; JONG, E.; NIJMEIJER, S.; MUTARAPAT, T.; RUCHIRAWAT, S.; BERG,
M. V. D.; DUURSEN, M. B. Induction of cell cycle arrest in human MCF-7 breast cancer
cells by cis-stilbene derivatives related to VIOXX®. Toxicol. Lett., v. 186, n. 2, p.115-122,
2009.
SARASTE, A.; PULKKI, K. Morphological and biochemical hallmarks of apoptosis.
Cardiovasc. Res., v. 45, n. 3, p. 528-537, 2000.
SCHABEL, F.; GRISWOLD, D. P.; LASTER, W. R. Quantitative evaluation of anticancer
agent activity in experimental animals. Pharmacol. Ther. Part A: Chemotherapy Toxicology
and Metabolic Inhibitors, v. 1, n. 4, p. 411-435, 1977.
SCHEUER, P. J.; LEFKOWITCH, J. H. Drugs and toxins. In: SCHEUER, P. J.;
LEFKOWITCH, J. H. (Ed.). Liver biopsy interpretation. 6th ed. London: WB Saunders,
2000. p. 134–150.
SCHIMIDT, M.; BASTIANS, H. Mitotic drug targets and the development of noveol anti-
mitotic anticancer drugs. Drug Resist. Updat., v. 10, n. 4/5, p.162-181, 2007.
SCHOLEY, J.M. Cell division. Nature. nº422, p.746-752, 2003.
181
SCHULER, M.; MAURER, U.; GOLDSTEIN, J. C. p53 triggers apoptosis in oncogene-
expressing fibroblasts by the induction of Noxa and mitochondrial Bax translocation. Cell
Death Differ., v. 10, n. 4, p. 451-460, 2003.
SERGEY Y A. P, ANATOLI G. K, GABAI V.L. Necrosis: a specific form of programmed
cell death? Experimental Cell Research. v.283 p. 1-16, 2003.
SHARMA, P.; SHARMA, J. D. In vitro hemolysis of human erythrocytes by plant extracts
with antiplasmodial activity. J. Ethnopharmacol., v. 74, n. 3, p. 239-243, 2001.
SHI, Y. Q.; ZHU, C. J.; YUAN, H. Q.; LI, B. Q.; GAO, J.; QUA, X. J.; SUN, B.; CHENG, Y.
N.; LI, S.; LI, X.; LOU, H. X. Marchantin C, a novel microtubule inhibitor from liverwort
with anti-tumor activity both in vivo and in vitro. Cancer Lett., v. 276, n. 2, p.160–170,
2009.
SHOEMAKER, R. Antitumor drug screening with a human tumor colony forming assay
(HTCFA). Proc. Am. Assoc. Cancer Res., v. 25, p. 1292, 1984.
SILVA, T. H.A.; BUTERA, A. P.; LEAL, D. H. S.; ALVES, R. J. Agentes antitumorais
inibidores da angiogênese – Modelos farmacofóricos para inibidores da integrina ανβ3.
RBCF Rev. bras. ciênc. farm. (Impr.), 43, n. 1, p. 1-17, 2007.
SINGH, N. P.; McCOY, M. T.; TICE, R. R.; SCHNEIDER, E. L. A simple technique for
quantitation of low levels of DNA in individual cells. Exp. Cell Res., v. 175, n. 1, p. 184-191,
1988.
SOUZA, M. V. N. Novos produtos naturais capazes de atuar na estabilização de
microtúbulos, um importante alvo no combate ao câncer. Quim. Nova, v. 27, n. 2, p. 308-
312, 2004.
SRIDHAR, T.; SYMONDS, R. P. Principles of chemotherapy and radiotherapy. Obstet.
Gynaecol. Reprod. Med., v. 19, n. 3, p. 61-67, 2009.
182
STRASSER, A.; O’CONNOR, L.; DIXIT, V. M. Apoptosis signaling. Annu. Rev. Biochem.,
v. 69, p. 217-245, 2000.
TAKAHASHI, C. S. Testes citogenéticos in vitro e aneuploidia. In: RIBEIRO, L. R.;
SALVADORI, D. M. F.; MARQUES, E. K. (Ed.). Mutagênese ambiental. Canoas, RS:
ULBRA, 2003. p.151-172.
TERKELTAUB, R. A. Colchicine Update: 2008. Semin. Arthritis Rheum., v. 38, n. 6, p.
411-419, 2008.
THIAGARAJAN, P.; TAIT, J. F. Binding of Annexin V/placental anticoagulant protein I to
platelets. Evidence for phosphatidylserine exposure in the procoagulant response of activated
platelets. J. Biol. Chem., v. 265, n. 29, p. 17420-17423, 1990.
TISHER, C. C.; BRENNER, B. M. Renal pathology: with clinical and functional
correlations. Philadelphia: JB Lippincott Company, 1994.
TY, N.; KAFFY, J.; ARRAULT, A.; THORET, S.; PONTIKIS, R.; JOELLE, D.; MORIN-
ALLORY, L.; FLORENT, J. C. Synthesis and biological evaluation of cis-locked vinylogous
combretastatin-A4 analogues: Derivatives with a cyclopropyl-vinyl or a cyclopropyl-amide
bridge. Bioorg. Med. Chem. Lett., v. 19, n. 5, p.1318–1322, 2009.
UNDEVIA, S. D.; GOMES-ABUIN, G.; RATAIN, M. J. Pharmacokinetic variability of
Anticancer Agentes. Nat. Rev. Cancer, v. 5, n. 6, p. 447-458, 2005.
VAN CRUCHTEN, S.; VAN DEN BROECK, W. Morphological and Biochemical Aspects
of Apoptosis, Oncosis and Necrosis. Anat. Histol. Embryol., v. 31, n. 4, p.214-223, 2002.
VEGA-ÁVILA, E.; VELASCO-LEZAMA, R.; JIMÉNEZ-ESTRADA, M. Lãs plantas como
fuente de compuestos antineoplásicos. Revisión. Bioquimia, v. 31, n. 3, p. 97-111, 2006.
183
VENDITI, J. M. The National Cancer Institute antitumor drug discovery program, current and
future perspective: a commentary. Cancer Treat. Rep., v. 67, n. 9, p.767-772, 1983.
VERAS, M. L.; BEZERRA, M. Z.; BRAZ-FILHO, R.; PESSOA, O. D.; MONTENEGRO, R.
C.; PESSOA, C.; MORAES, M. O.; COSTA-LUTUFO, L. V. Cytotoxic epimeric
withaphysalins from leaves of Acnistus arborescens. Planta Med., v. 70, n. 6, p. 551-555,
2004.
VERMES, I.; HAANEN, C.; STEFFENS-NAKKEN, H.; REUTELINGSPERGER, C. A
novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on
early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Methods, v. 184, n.
1, p. 39-51, 1995.
VITALE, I.; ANTOCCIA, A.; CENCIARELLI, C.; CRATERI, P.; MESCHINI, S.;
ARANCIA, G.; PISANO, C.; TANZARELLA, C. Combretastatin CA-4 and combretastatin
derivative induce mitotic catastrophe dependent on spindle checkpoint and caspase-3
activation in non-small cell lung cancer cells. Apoptosis. nº12, p.155–166, 2007.
WALKER, R.A.; SALMON, E.D.; ENDOW, S.A. The Drosophila claret segregation protein
is a minus-end directed motor molecule. Nature, v. 347, n. 6295, p.780-782, 1990.
WALLACE, K. B. Mitochondrial off targets of drug therapy. Trends in Pharmacological
Sciences. v.29, nº.7, 2008.
WANG, L.; SHI, G. G.; YAO, J. C.; GONG,W.; WEI, D.; WU, T. T.; AJANI, J. A.;
HUANG, S.; XIE, K. Expression of endothelial nitric oxide synthase correlates with the
angiogenic phenotype of and predicts poor prognosis in human gastric cancer. Gastric
Cancer, v. 8, n.1, p.18-28, 2005.
WEAVER, B. A.; CLEVELAND, D.W. Decoding the links between mitosis, cancer, and
chemotherapy: the mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell, v. 8, n. 1, p.7-
12, 2005.
184
WU, M.; SUN, Q.; YANG, C.; CHEN, D.; DING, C.J.; CHEN, Y.; LIN, L.; XIE, Y.
Synthesis and activity of Combretastatin A-4 analogues 1,2,3-thiadiazoles as potent antitumor
agents. Bioorg. Med. Chem. Lett., v. 17, n. 4, p. 869-873, 2007.
YAMAGUCHI, R.; PERKINS, G. Dynamics of mitochondrial structure during apoptosis and
the enigma of Opa1. Biochim. Biophys. Acta, v. 1787, n. 8, p. 963–972, 2009.
YEUNG, S.C.J.; SHE, M.; YANG, H.; PAN, J.; SUN, L.; CHAPLIN, D. Combination
Chemotherapy Including Combretastatin A4 Phosphate and Paclitaxel Is Effective against
Anaplastic Thyroid Cancer in a Nude Mouse Xenograft Model. J. Clin. Endocrinol. Metab.,
v. 92, n. 8, p. 2902–2909, 2007.
ZAFFARONI, N.; PENNATI, M.; DAIDONE, M. G. Survivin as a target for new anticancer
interventions. J. Cell Mol. Med., v. 9, n. 2, p.360-372, 2005.
ZHOU, J.; CHAU, C. M.; DENG, Z.; SHIEKHATTAR, R.; SPINDLER, M. P.; SCHEPERS,
A.; LIEBERMAN, P. M. Cell cycle regulation of chromatin at an origin of DNA replication.
EMBO J., v. 24, n. 7, p.1406-1417, 2005b.
ZHOU, J.; GIANNAKAKOU, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Curr.
Med. Chem. Anticancer Agents, v. 5, n. 1, p. 65–71, 2005a.
ZIEGLER, U.; GROSCURTH, O. Morphological fetures of cell death. News Physiol. Sci., v.
19, p.124-128, 2004.
ZIMMERMANN, K. C.; BONZON, C.; GREEN, D. R. The machinery of programmed cell
death. Pharmacol. Ther., v. 92, n. 1, p.57-70, 2001.
ZONG, W. X.; THOMPSON, C. B. Necrotic death as a cell fate. Review. Genes Dev., v. 20, n. 1, p.1-15, 2006.s