Terapia genica -malattie infettive -tumori -malattie ereditarie -malattie del sistema immunitario...
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Terapia genica
-malattie infettive-tumori-malattie ereditarie-malattie del sistema immunitario
Terapia genica classica:A)Produrre la sostanza che manca al pazienteB)Eliminare direttamente le cellule malateC)Attivare le cellule del sistema immunitario favorendo così l’uccisione dellecellule malate
Terapia genica non convenzionale: inibire l’espressione dei geni coinvoltinella patogenesi, o di correggere un difetto genetico e quindi restaurarela normale espressione genica.
Non e` utilizzabile nellaSperimentazione Clinica
TERAPIA GENICATecnica terapeutica in cui un gene funzionale viene inserito nelle cellule somatiche di un paziente
Scopo:• Correggere un difetto genetico• Fornire una nuova funzione alla cellula
Applicabilità:1. Malattie genetiche classiche(un solo gene coinvolto, ereditarietà mendeliana)2. Malattie multigeniche (cancro)3. Malattie genetiche acquisite (AIDS)4. Malattie non genetiche80% dei protocolli coinvolge malattie delle categorie 2-4
Terapia genica in vivo ed ex vivo
Trapianto di cellule geneticamente modificate:• Estrazione/preparazione delle cellule primarie o di linea• Trasferimento del gene in vitro• Reimpianto delle cellule
Problemi:• Cellule autologhe ingegnerizzate: laboriosa, vita limitata• Cellule eterologhe ingegnerizzate: reperibilità, compatibilità
Terapia genica EX VIVO
Somministrazione diretta del gene terapeuticoin vivo alle cellule:• iniezione diretta (ad es. nel muscolo scheletrico distrofico)• somministrazione in prossimità del tessuto (ad es. vie respiratorie nella fibrosi cistica)Problemi:• Trasferimento quantitativamente limitato• Rischio di inserimento in cellule sane• Reazione immunitaria
TERAPIA GENICA IN VIVO
Geni integrati nei cromosomi (retrovirus)Geni non integrati (necessità di trattamenti ripetuti) (adenovirus)
VETTORI VIRALI
Vantaggi dei vettori non virali
• Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni• Riduzione del rischio di reazione immunitaria• Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono
di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi• Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo
Svantaggi dei vettori non virali
• Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione • Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale
Vantaggi dei vettori virali
Svantaggi dei vettori virali• Alta efficienza di trasduzione
• Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite
• Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma)
• Molecole di DNA di dimensioni limitate• Reazioni immunitarie• Costi elevati
Gli adenovirus penetrano nelle cellule con un meccanismo di endocitosi mediatadai recettori
Recapito di geni mediato dai liposomi in vivo
Il trasferimento genico che utilizzal’endocitosi mediata da recettori
Inibizione mirata dell’espressione genica in vivo
PROBLEMI DELLA TERAPIA GENICA
1.Stabilità d’espressione del transgene nel tempo
2. Mutagenesi inserzionale
3. Regolazione dell’espressione del transgene (promotori inducibili)
4. Cell targeting
5. Pericolosità, Etica
TERAPIA GENICA NELLE MALATTIE GENETICHE CLASSICHE
E’ importante stabilire se il processo citopatico risulta da:
Loss of function del gene mutato, cioè la mutazione nel gene provoca perdita della funzione genicaintroduzione del gene normale OK
Gain of function cioè la mutazione nel gene produce una proteina con funzioni diverse da quelle della proteina normale introduzione del gene normale INEFFICACE
Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA
• Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato).• Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteinaterapeutica (a livelli adeguati).• Capace di incorporare DNA di varie dimensioni.• Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale opost-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico• Non dovrebbe essere patogeno.• Amministrabile direttamente nel paziente.• In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio.• Ben tollerato.• Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune.• Facile da produrre in maniera riproducibile.
IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. IL VETTORE PIU’ UTILIZZATO OGGI E’ IL VETTORE RETROVIRALE
Vettori Retrovirali:
• Pro situazione attuale e prospettive future– efficiente trasduzione di cellule in attiva replicazione (linee tumorali)• linfociti e precursori delle linee ematopoietiche– notevole esperienza clinica ex vivo
• Contro– integrazione random• attivazione di oncogeni• shut-off trascrizionale dipendente dal sito di integrazione– capacità di impaccamento limitate (max. 7 kb)- Incapacità di infettare cellule in quiescenza (cellule nervose)
ADA (adenosina deaminasi): enzima coinvolto nel salvataggio delle purine nel percorso di degradazione degli acidi nucleici, indispensabile in molti tipi cellulari. La sua carenza causa una patologia recessiva molto rara che ha effetti molto seri sui linfociti T, una delle principali classi di cellule del sistema immunitario: GRAVE E COMPLESSA IMMUNODEFICIENZA
ADA e TERAPIA GENICA:
1)Il gene ADA è piccolo e clonato nel 19902)Le cellule bersaglio sono i Linfociti T, cellule facilmente ottenibili dal paziente e facilmente coltivabili TERAPIA GENICA EX-VIVO3)Livello di espressione puo’ variare senza conseguenze (range 10-5000&)
TERAPIA GENICA per deficit dell’ADA
Struttura genomica ed espressione genica dei
retrovirus
• Il genoma tipico contiene 3 “geni”
– Gag (componenti del core nucleoproteico)
– Pol (replicazione e ricombinazione)
– Env (componente della membrana esterna)
Lunga sequenza terminale ripetuta
Psi + non codificante. Per confezionamento nel capside
Proteina strutturale capside
Trascrittasi inversa e integrasi
Proteina per involucro
Genoma retrovirale
Vettore retrovirale
Lunghezza massima: 8Kb
Inserito nelle cellule eucariotiche
con bassissima efficienzatramite
trasfezione/elettroporazioneCon alta efficienza
Mediante INFEZIONE
Packaging cell lines
Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del capside (late genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni.
La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina l’impacchettamento del costrutto nel virione.
Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo.
Dr. Sara Caldarola
Dr. Sara Caldarola
Dr. Sara Caldarola
Terapia con incremento delle copie geniche ex vivo per la deficienza di adenosina deaminasi (ADA) 1990
La modificazione genetica dei linfociti che infiltrano il tumore coltivati in vitroPuò essere utilizzata per far esprimere geni “terapeutici” in un tumore solido
Terapia genica in vivo per i tumori cerebrali