TEMA 14 Métodos inmunológicos para la identificación...
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Tema 14. Métodos inmunológicos para la identificación microbiana
1. Introducción2. Detección de antígenos
2.1. Obtención de anticuerpos2.2. Marcado de las inmunoglobulinas2.3. Técnicas de detección
2.3.1. Aglutinación indirecta2.3.2. Inmunofluorescencia2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)
3. Detección de anticuerpos3.1. Clases de antígenos3.2. Muestras de suero3.3. Pruebas serológicas
3.3.1. Aglutinación directa3.3.2. Inmunofluorescencia3.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)
1. Introducción
Antígenos y anticuerpos son complementarios
• antígeno posible detectar anticuerpo específico (suero)
• anticuerpo posible detectar antígeno específico (muestra)
Pruebas para detección de anticuerpos: pruebas serológicas (suero)
Reacciones inmunológicas
• portaobjetos
• tubos convencionales (plásticoo vidrio) 12 x 100 mm
• placas de microtitulación(micropocillos 8 mm ø y 12mm alto)
2. Detección de antígenos
Algunas de estas técnicas son muy útiles para el diagnóstico
• rápidas (confirmadas por otras)
• técnicas de referencia (elevada eficacia)
Muy útiles para identificación de virus y clamidias (más rápidas, sencillas, económicas y sensibles que el cultivo) (algunas automatizadas)
Se investiga un único microorganismo en cada prueba (caro y laborioso)
• establecer cuidadosa evaluación clínica del paciente
• solicitar la prueba para detectar microorganismo responsable (mayorprobabilidad)
AnticuerpoSitio deunión
Antígeno
Fragmento o región Fc
2.1. Obtención de anticuerpos
Anticuerpos
• policlonales (animales inmunizados)
• monoclonales (producidos in vitro)
Todos los anticuerpos pueden fijarse a través de su fragmento Fc a:
• base de un pocillo de plástico
• superficie de una membrana
• partículas inertes (látex, gelatina, oro coloidal)
2.2. Marcado de las inmunoglobulinas
Inmunoglobulinas marcadas sirven para detectar antígenos y otros anticuerpos
Marcado del fragmento Fc con:
• Enzimas (β-galactosidasa, fosfatasaalcalina, peroxidasa de rábano)
- actúan sobre sustrato
- transformación en producto coloreado (o diferente color)
• Sustancias fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína, rodamina,umbeliferona, lantánidos)
- producen luz cuando son excitadas por radiación incidente
• Sustancias lumínicas (luminol, isoluminol, ésteres de acridina, adamantildioxietano)
- producen luz (reacción química, oxidación, quimioluminiscencia)
2.3. Técnicas de detección
Si el microorganismo buscado no está en la muestra
• los anticuerpos no se unen a él
• no se produce señal
Si el microorganismo está presente en la muestra
• los anticuerpos se unen a él
• se producirá el efecto o la señal correspondiente
- aglutinación
- cambio de color del sustrato
- fluorescencia
- luz
2.3.1. Aglutinación indirecta
Anticuerpos adheridos porregión Fc a:
• partículas grandes de látex (poliestireno, 1-5 µm)
• otras partículas inertes
Facilita la observación de la aglutinación:
• formación de grumos (degran tamaño)
Permite detección de antígenos solubles (polisacárido)
Realizable sobre portaobjetos
2.3.1. Aglutinación indirecta
Rápida (minutos)
Generalmente menos sensible que enzimoinmunoanálisis
Salvo excepciones no muy adecuada para detectar antígenos víricos (menorcantidad que bacterianos)
2.3.2. Inmunofluorescencia
Directa (IFD)
Anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes
• se fijan a los microorganismos
Microscopio de fluorescencia
• microorganismo brillantesobre fondo oscuro
Virus
• no pueden ser observados(pequeño tamaño)
• se pueden detectar proteínas víricas (producidas durante multiplicación)
- anticuerpos específicos para esas proteínas
2.3.2. Inmunofluorescencia
Indirecta (IFI)
Utiliza dos anticuerpos:
- Primero
• no marcado
• se une al antígeno
- Segundo
• dirigido contra el primero(anti-anticuerpo)
• está marcado
• permite revelar diferentesanticuerpos específicos no marcados
2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)
ELISA: enzyme linked immunosorbent assay
Método directo
Anticuerpos fijados en base de pocillo de placa de microtitulación o membrana de nitrocelulosa (específicos del antígeno buscado).
Se añade muestra al pocillo: antígeno presente reacción Ag - Ac
Se añade segundo anticuerpo
• dirigido contra el antígeno
• marcado con enzima
Antígeno diana
Anticuerpo de fijación(o de captura)
Anticuerpode detección
Anticuerpo anti-Igunido a enzima
Productocoloreado
Sustratoincoloro
2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)
Método indirecto (“sandwich”)
Anticuerpos (generalmente monoclonales) fijados en base de pocillo de placa demicrotitulación o membrana de nitrocelulosa (específicos del antígeno buscado).
Se añade muestra al pocillo
• antígeno presente reacción Ag - Ac
Se añade un segundo anticuerpo
• generalmente policlonal
• dirigido contra el antígeno
Se añade un tercer anticuerpo
• dirigido contra el segundo anticuerpo
• marcado con enzima
Sustratosin color
Productocoloreado
Segundoanticuerpo(o tercero)
Enzima
2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)
Se añade sustrato (incoloro)
Actúa enzima sobre sustrato
Aparece color
• se puede medir intensidad(colorímetro)
Si no existe antígeno buscado
• no es retenido en el pocillo
• es eliminado mediante lavado
• al añadir sustrato no seproduce color
3. Detección de anticuerpos
Método de diagnóstico indirecto
Detectan anticuerpos formados frente al microorganismo (en suero del paciente)
Técnicas semejantes a las descritas para la detección de antígenos
La mayoría permiten cuantificar los anticuerpos del suero
3.1. Clases de antígenos
Naturales
• microorganismos íntegros
• extractos antigénicos (más o menos purificados) obtenidos de ellos
Recombinantes
• se obtienen por ingeniería genética
3.2. Muestras de suero
Extraer sangre (5-10 mL)
Dejarla coagular (temperatura ambiente, 20 minutos)
Centrifugar 1.000-1.200 g, 10 minutos (separar el suero)
Guardar suero 4-6ºC (una semana; -20ºC (años, si se evita descongelar y congelarrepetidamente)
3.3. Pruebas serológicas
Todos los resultados se refieren a anticuerpos totales
Aglutinación directa, inmunofluorescencia y enzimoinmunoanálisis (másutilizadas)
3.3.1. Aglutinación directa
Portaobjetos, tubos de ensayo o placas de microtitulación
Antígeno (suspensión del microorganismo); si hay anticuerpos en el suero, se produce aglutinación
3.3.1. Aglutinación directa
Patrón característico
• Tubo
- sobrenadante transparente
- formación de muchosgrumos (al resuspenderel sedimento)
• Pocillos
- sedimento amplio y granulado(reacción positiva)
- botón puntiforme central (reacciónnegativa)
Permite la cuantificación de anticuerposmediante el cálculo del título de anticuerpos