Teknologi Biologi Molekuler.pdf
-
Upload
putri-justicarici-n -
Category
Documents
-
view
15 -
download
2
Transcript of Teknologi Biologi Molekuler.pdf
Mirfat
BAGIAN BIOLOGI-ANATOMI FKUY
1
Perkembangan biomolekuler
Penemuan rangkaian DNA sebagai dasar dari
gen
Sebelumnya, dunia kedokteran tidak mengetahui
persis wujud gen yang sebenarnya
Seseorang dengan kelainan tertentu hanya
dimengerti sebabnya sebagai bawaan dari nenek
moyangnya, tanpa diketahui bagaimana
penjelasan rasional dan ilmiah. Apalagi
kemungkinan mencari jalan keluarnya.
2
Perkembangan biomolekuler
Di Indonesia, perkembangan penelitian
biomolekuler menunjukkan kemajuan
Berbagai penelitian biomolekuler LIPI
produksi rekombinan erythroepoetin (hEPO),
semacam protein yang dimurnikan yang
bermanfaat meningkatkan jumlah sel darah
merah secara signifikan.
3
Perkembangan biomolekuler
Penelitian ini untuk menghasilkan obat anemia.
Percobaan sudah ditempuh dengan
menyuntikkan protein terekspresi pada sel
mencit atau sejenis tikus. Hasilnya,
menunjukkan kenaikan sel darah merah secara
signifikan.
Program penelitian obat anemia ini sudah
dipaparkan ke beberapa perusahaan farmasi.
4
Teknologi DNA
revolusi dalam bioteknologi
manipulasi organisme /
komponen organisme untuk
menghasilkan produk yang bermanfaat
5
PCR
Polymerase Chain Reaction: disusun 1983
oleh Kary Mullis Hadiah Nobel 1993
Reaksi Rantai Polimerase
Suatu teknik untuk memperbanyak
segmen DNA tertentu
Setiap fragmen DNA dpt diperkuat
(diamplifikasi/disalin bbrp kali ) dengan cepat
tanpa menggunakan sel 6
PCR
DNA diinkubasi tabung reaksi DNA polimerase, suatu pasokan nukleotida & potongan pendek DNA untai tunggal sintetik (primer sintesis DNA)
DNA polimerase membutuhkan primer
polimerase ini dapat menambahkan nukleotida hanya pada rantai nukleotida yang telah ada sebelumnya
7
PCR
Secara otomatis PCR dpt membuat
miliaran salinan segmen DNA target dlm
beberapa jam
Lebih cepat drpd pengklonan sepotong
DNA yg butuh berhari-hari dg membuat
plasmid rekombinan & membiarkannya
bereplikasi di dlm bakteri
8
PCR
Penguatan (amplifikasi) sampel DNA kecil
bermiliar kali beberapa keperluan
Penyidikjarian DNA dlm percobaan
pembunuhan
9
Dalam kasus-kasus kejahatan pembunuhan, pemerkosaan, teror pengeboman,
untuk memastikan benar tidaknya tersangka sebagai pelaku.
Jika tersangka masih hidup pengujian dilakukan dengan membandingkan DNA tersangka dengan DNA objek yang tertinggal di tempat kejadian, misalnya rambut atau sperma.
Jika tersangka mati dan tubuhnya hancur, maka DNA dari bagian-bagian tubuh tersangka dicocokkan pola restriksinya dengan DNA kedua orang tuanya atau saudara-saudaranya yang masih hidup.
10
Manfaat
Prosedur PCR
DNA dipanasi sec singkat utk memisahkan untainya
Didinginkan utk membiarkan primer berikatan dg ujung2 urutan target melalui ikatan hidrogen, satu primer pada setiap untai
11
Prosedur PCR
DNA polimerase menambahkan nukleotida pada ujung 3’ primer, dg menggunakan untai DNA yg lebih panjang sbg cetakannya
Dlm wkt + 5 menit urutan DNA target yg panjangnya mencapai 100 pasangan basa telah digandakan
Larutan ini kemudian dipanaskan lagi, memulai siklus pemisahan untai yg lain, pengikatan primer & sintesis DNA
12
Reproduced from http://allserv.rug.ac.be/~avierstr/principles/pcr.html
Because both strands are copied during PCR, there is an exponential
increase of the number of copies of the gene.
e.g. if there is only one copy of the wanted gene before the cycling starts,
after one cycle, there will be 2 copies, after two cycles, there will be 4 copies,
three cycles will result in 8 copies and so on.
13
PCR Reaction Tubes
http://www.molecularstation.com/molecular-biology-images/509-pcr-pictures/74-pcr-reaction-tubes.html
PCR Machine Thermal Cycler
14
http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.gif
15
PCR
Digunakan u/ memperkuat DNA dr berbagai
sumber:
DNA dr sedikit darah, jaringan, / air mani yg ditemukan di tempat kejadian perkara kriminal
DNA dr sel embrionik tunggal u/ diagnosis kelainan genetik sblm kelahiran
DNA gen virus dr sel yg diinfeksi o/ virus yg sulit terdeteksi spt HIV
16
The HIV PCR test
salah satu alat diagnostik paling akurat
mendeteksi keberadaan virus immunodeficiency dalam darah manusia, lebih dikenal sebagai HIV.
Salah satu prosedur screening
dapat digunakan untuk deteksi dini.
Bahkan, tes ini berhasil dapat menunjukkan virus dalam waktu tiga minggu setelah infeksi terjadi.
http://www.wisegeek.com/what-is-a-hiv-pcr-test.htm
17
http://www.google.co.id/imgres?imgurl=http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/Gel_electrophores
is_apparatus.JPG/288px-Gel_electrophoresis_apparatus.JPG&imgrefurl=http://hdtv2008.blogspot.com/2008/06/gel-
electrophoresis-
1.html&h=368&w=288&sz=20&tbnid=QjuyI6M1cwcJ::&tbnh=122&tbnw=95&prev=/images%3Fq%3Delectrophoresis%2B
pictures&hl=en&usg=__nUHyJ5-XZaVlUcVRahSwaZaFV7o=&sa=X&oi=image_result&resnum=3&ct=image&cd=1
18
Elektroforesis Gel
Memisahkan makromolekul-as nukleat atau prot- berdasarkan ukuran, muatan listrik & sifat2 fisis lainnya
U/ molekul DNA linear, pemisahan yg dilakukan terutama tergantung pd ukurannya
Memisahkan campuran molekul DNA mjd pita2 yg msg2 tdd molekul DNA dg pj yg sama
19
Elektroforesis
•Proses bergeraknya molekul bermuatan pada
suatu medan listrik.
•Kecepatan molekul yang bergerak pada medan
listrik tergantung pada muatan, bentuk dan
ukuran.
•Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat
dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi,
ataupun dilakukan kuantifikasi dengan
densitometer.
20
Elektroforesis
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.
Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = poly-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.
21
Elektroforesis
Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut.
Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya.
22
http://www.molecularstation.com/images/protein-gel-electrophoresis.jpg 23
Manfaat elektroforesis
Diagnosis kelainan genetik
Diagnosis thalassemia dibuat berdasarkan
anamnesis mengenai gejala klinis, riwayat
keluarga/pola herediter, pemeriksaan fisik dan
pemeriksaan laboratorium.
Pemeriksaan laboratorium yang diperlukan adalah
untuk analisa hemoglobin yaitu hematologi rutin,
hapusan darah tepi, dan elektroforesis.
pemeriksaan Hb elektroforesis
Elektroforesis hemoglobin
mengidentifikasi hemoglobin abnormal
dan mengukur kadar hemoglobin normal
Hull.D & Johnston,D.I 2008.Dasar dasar pediatri ed.3
Southern Blotting
Suatu metode untuk memindahkan
fragmen-fragmen DNA yang telah
didenaturasi dan yang telah dipisahkan
dengan eletrophoresis, dari gel ke suatu
lembar penyerap
Mendeteksi & menganalisis urutan DNA
tertentu
Membandingkan DNA dr individu / spesies
yg berbeda 26
Southern Blotting: Gel Transfer
Legend: Detection of specific DNA fragments by gel-transfer hybridization (Southern blotting). (A) The mixture of double-stranded DNA fragments generated by restriction nuclease treatment of DNA is separated according to length by electrophoresis. (B) A sheet of either nitrocellulose paper or nylon paper is laid over the gel, and the separated DNA fragments are transferred to the sheet by blotting. The gel is supported on a layer of sponge in a bath of alkali solution, and the buffer is sucked through the gel and the nitrocellulose paper by paper towels stacked on top of the nitrocellulose. As the buffer is sucked through, it denatures the DNA and transfers the single-stranded fragments from the gel to the surface of the nitrocellulose sheet, where they adhere firmly. This transfer is necessary to keep the DNA firmly in place while the hybridization procedure (D) is carrried out. (C) The nitrocellulose sheet is carefully peeled off the gel. (D) The sheet containing the bound single-stranded DNA fragments is placed in a sealed plastic bag together with buffer containing a radioactively labeled DNA probe specific for the required DNA sequence. The sheet is exposed for a prolonged period to the probe under conditions favoring hybridization. (E) The sheet is removed from the bag and washed thoroughly, so that only probe molecules that have hybridized to the DNA on the paper remain attached. After autoradiography, the DNA that has hybridized to the labeled probe will show up as bands on the autoradiograph. An adaptation of this technique to detect specific sequences in RNA is called Northern blotting. In this case mRNA molecules are electrophoresed through the gel and the probe is usually a single-stranded DNA molecule.
http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/southBlotg.html 27
Southern, Northern, Westerns Blotting
Southern,
Northern, Westerns
Ekstrak DNA
dr sel
Ekstrak RNA dr
sel
Ekstrak Protein
dr sel
28
DNA microarray
Merupakan suatu teknik untuk
menentukan gen-gen mana yang aktif dan
gen-gen mana yang ter-represi/tidak aktif
pada keadaan fisiologis tertentu
29
30