TCNICAS MOLECULARES QUE USAN DNAPor. Luz Esmeralda Hernndez Jurez

En principio se denomina as a todas las tcnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la Ingeniera gentica), amplificar una regin en una enorme cantidad de molculas (clonacin de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR)

Corte de una determinada regin con enzimas de restriccin para ver si por una mutacin se gana o se pierde un sitio de restriccin (anlisis de mutaciones por RFLP o Restriction fragment lengt polymorphism), que siginifica: diferencias en los tamaos de los fragmentos de restriccin debido a polimorfismos en el ADN entre otras.

Todas estas tcnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el diagnstico de enfermedades hereditarias, bsqueda de alelos mas o menos frecuentes asociados a una caracterstica que nos interesa seleccionar, diagnstico de contaminacin bacteriana, en diagnstico viral o de infeccin viral, seleccin de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento gentico de una especie, test de paternidad, diagnstico de identidad forense.

Extraccin de DNAEl DNA es purificado a partir de cualquier tejido aun que la mayora de las veces es a partir de sangre, pues es mas manejable, se basa en una serie de lavados de la muestra adems se le agregan proteinasas que eliminan las protenas del medio, detergentes para eliminar las membranas plasmticas y luego ir purificando la muestra de DNA de RNA y restos celulares.

Visualizacin del DNA (geles de agarosa)Para poder visualizar el ADN debemos recurrir a los geles de Agarosa. Una vez extrado el ADN o hecha una reaccin de PCR debemos verificar que el ADN est all. Para eso debemos preparar un gel de agarosa, con una serie de pocillos donde colocar las muestras que sumergidas en el gel y este en un buffer conductor, como el ADN tiene carga negativa migrar hacia el polo positivo si le hacemos pasar una corriente elctrica.

Uso de enzimas de restriccinLas Enzimas de restriccin permiten cortar el ADN y de esta manera analizarlo. Nace all la ingeniera gentica. Eso permiti cortar y pegar a la molcula de ADN para estudiarla, analizar patologas en ciertos genes.

PCRLa reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (Polymerase Chain Reaction), es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde.

Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.

DGGEtambin referida como electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente, (en el mbito cientfico comnmente referida por su abreviacin en ingls: DGGE) es una tcnica de huella, rastreo o trazado molecular (vulgarmente conocida en Ingls como molecular fingerprinting) usada en diversas disciplinas de la biologa y la qumica, que consiste en la separacin de cadenas de ADN de doble cadena dependiendo de su punto de desnaturalizacin, siendo dicha desnaturalizacin definida en ste caso como la separacin de cadenas complementarias de ADN.

El punto de desnaturalizacin del fragmento de ADN aumentar con el tamao de la secuencia de nucletidos que lo conforman, y tambin por la composicin de nuclotidos de la secuencia. Secuencias ricas en GC tienen, con sus secuencias de bases complementarias, apareamientos ms espontneos (fenmeno conocido en ingls como Base Stacking) ya que en estos casos, tienen energa de Gibbs ms negativa y por tal motivo aumenta la temperatura mnima de fundicin (Tm) de la secuencia de ADN. Cuando un fragmento de ADN de un determinado tamao y secuencia se encuentra en las condiciones que producen su desnaturalizacin, la migracin de dichas cadenas en una electroforesis en gel se detiene o es considerablemente ms lenta.

Por tal motivo dicha tcnica utiliza un gradiente de desnaturalizacin durante la migracin de fragmentos de ADN en un gel de electroforesis con rangos en los cuales sea posible tener estados de ADN de cadena doble iniciales y estados de cadena sencillas denaturalizadas en algn punto de la migracin para un fragmento de un tamao y una secuencia especfica. Generalmente se utilizan dos mtodos para crear dicho gradiente desnaturalizante en un gel: por incremento de concentraciones de sustancias desnaturalizantes dependiendo de la distancia recorrida en el gel, o por incremento de la temperatura a travs del tiempo en que los fragmentos van migrando a travs del gel(TGGE).

ProcedimientoSe preparan por PCR fragmentos de 200 a 700 pares de bases de la zona de inters. -Los fragmentos generados se corren en un gel con un gradiente creciente desnaturalizante, por ejemplo, del 15% al 90% de agente desnaturalizante. -A medida que migra el ADN de doble cadena, hay un momento en que comienza a desnaturalizarse y a formar zonas de cadena nica que frenan la migracin. Estos bucles hacen cambiar el patrn de migracin y pueden depender del cambio de un par de bases. - Se amplifica la zona de inters por PCR aadiendo al extremo de uno de los cebadores una "grapa" de GC de 40 pb. Esta regin ni termina de separarse y mantiene unidas ambas cadenas durante la electroforesis. Otra estrategia es unir covalentemente los extremos con un psolareno