Dr. Carlos Díaz Olachea 2005 Pruebas Inmunológicas en Enfermedades infecciosas.
TECNICAS INMUNOLÓGICAS CELULARES Prof. Caroline Weinstein.
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TECNICAS INMUNOLÓGICAS CELULARES
Prof. Caroline Weinstein
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AISLAMIENTO DE LINFOCITOS
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AISLAMIENTO DE LINFOCITOS
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ENSAYO INCORPORACIÓN TIMIDINA TRITIADA (FUNCIONAL)
INCORPORACIÓN DE TIMIDINA TRITIADA
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ENSAYO DE CITOTOXICIDAD (FUNCIONALIDAD)
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ENSAYO MTT:ENSAYO MTT:
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ALTERNATIVAS AL ENSAYO DE INCORPORACIÓN DE TIMIDINA TRITIADA:
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CITOMETRIA DE FLUJO: UNA POTENTE HERRAMIENTA EN INMUNOLOGÍA
CITOMETRIA DE FLUJO: UNA POTENTE HERRAMIENTA EN INMUNOLOGÍA
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Forward Angle Light Scatter
FALS Sensor
Laser
Purdue University Cytometry Laboratories
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Flow Cell
Injector Tip
FluorescenceFluorescencesignalssignals
Focused laserFocused laserbeambeam
Sheath fluid
Purdue University Cytometry Laboratories
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Forward Angle Light Scatter
FALS Sensor
Laser
Purdue University Cytometry Laboratories
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90 Degree Light Scatter
FALS Sensor
90LS Sensor
Laser
Purdue University Cytometry Laboratories
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Laser
Fluorescence Detectors
Fre
q
Fluorescence
FALS Sensor
Fluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)
Purdue University Cytometry Laboratories
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PMT
PMT
PMT
PMT
DichroicFilters
BandpassFilters
Example Channel Layoutfor Laser-based FlowCytometry
Laser
1
2
3
4
Flow cell
original from Purdue University Cytometry Laboratories;modified by R.F. Murphy
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CELLULAR ANTIGENS
Sensory AdhesionMetabolic
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Log FITC
1000 100 10 1
11
0
.1
Co
un
t
3
0 7
0
0
1
5
0
ImmunophenotypingImmunophenotyping
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Log FITC Fluorescence (CD8).1 1 10 100 1000
Lo
g P
E F
luo
resce
nce
(C
D4
)
.1 1
1
0 1
00
1 2
3 4
45% 2%
26%
CD4/CD8 Quadstats
27%
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Otras aplicaciones citometria de flujo
• Evaluación funcional de la capacidad oxidasas (NADPH dependiente) de los neutrófilos
dihidrorodaminaneutrófiloneutrófilo
PMA
DIHIDRORODAMINA OXIDADA
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Control- Unstim(Top),
Stimulated(Bottom)
Twin #1 (AD)Unstim(Top), Stimulated(Bottom)
Twin #2 (JD)Unstim(Top), Stimulated(Bottom)
Neutrophil oxidative index (NOI) = 1,614
NOI=1
NOI=2
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HEMOGLOBINURIA PAROXÍSTICA NOCTURNA
CD59 CD55
Healthy Control
Patient
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PROLIFERACIÓN DE LINFOCITOS POR CITOMETRÍA DE FLUJOPROLIFERACIÓN DE LINFOCITOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO:
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Ejemplo: inmunohistoquímica para HER-2
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SEPARACIÓN MAGNÉTICA DE CÉLULAS
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EJERCICIOS:
La figura anterior representa un resultado de un ensayo de citotoxicidad para linfocitos CD8. Al respecto explique:
Fundamento del método.
Identifique que curva representa una menor actividad citotóxica
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EJERCICIOS:
Dibuje una nube de puntos en el siguiente gráfico que represente los resultados de citometría de flujo de un paciente que no posee linfocitos CD8
CD8
CD4
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EJERCICIOS:
Con respecto a la prueba de incorporación de timidina tritiada:a. Explique el fundamento del método b. Métodos alternativos. c. Cómo espera encontrarla en un individuo cuyo informe de citometría de flujo es
el siguiente. Fundamente su respuesta.
CD8
CD4
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Un científico japonés sostiene que el cáncer se produce por una inmunodepresión. Describa un ensayo que le permita detectar una respuesta inmune deprimida ante tumores.
EJERCICIOS:
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Usted ha sido contratado para ser el jefe del laboratorio de seguimiento de pacientes HIV positivos. Debe implementar una técnica para analizar las subpoblaciones linfocitarias. Describa la técnica escogida, haciendo un análisis crítico (ventajas y desventajas)
EJERCICIOS: