Tecnicas Analiticas en Toxicologia

8/19/2019 Tecnicas Analiticas en Toxicologia

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Técnicas analíticas en toxicología

Ana María López Parra

Departamento de Toxicología y Legislación Sanitaria.Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid(UCM)

“Ciencia que estudia las sustancias químicas y losfenómenos físicos en cuanto son capaces deproducir alteraciones patológicas a los seresvivos, a la vez que estudia los mecanismos deproducción de tales alteraciones y los mediosterapéuticos para contrarrestarlas, así como los

procedimientos para detectar, identificar ydeterminar tales agentes y valorar el riesgo querepresentan”

» (M. Repetto 1981/2009)


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Tox. Reguladora

ÁREASBÁSICAS

BiologíaBioquímicaQuímicaFisiología

FarmacologíaPatologíaMedicina Legal

FarmacéuticaForense Alimentaria

ÁREASFUNDAMENTALES

RAMASAPLICADAS

TOXICOLOGÍA

Ambiental

OcupacionalEcotoxicologíaEval.

Riesgo

Mecanística Analítica General

DocenciaInvestigación

Órgano específica Clínica

EvaluaciónToxicol.

HumanaVeterinaria

-Toxicología Analítica

-Química Analítica

! Urgencia en el resultado

! Anamnesis

!

Muestras biológicas

! Concentración del producto

! Determinación del tóxico

! Instalaciones


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! Diagnóstico clínico

! Diagnóstico biológico

! Diagnóstico químico


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! Estudio de las constantes o parámetros biológicos y

bioquímicos

! Biomarcadores de exposición

! Biomarcadores del efecto

! Biomarcadores de susceptibilidad

! Experimentación con animales y vegetales

! Ensayos inmunológicos y radioinmunológicos

El análisis químico-toxicológicoes el conjunto de procesosanalíticos que tienen por objetoel aislamiento, identificación ydeterminación cuantitativa delos tóxicos, tanto en el vivocomo en el cadáver, con el finde permitir el diagnóstico de laintoxicación.

• Modalidad Judicial

• Modalidad Clínica

• Modalidad Ambiental


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• Contenido gástrico

•

Sangre• Orina• Humor vítreo• Hígado• Cerebro• Riñón• Bilis• Pelo• Saliva• Meconio

Contenido gástrico

-Vómito, aspirado gástrico y lavados gástricos.

-En el caso de los lavados gástricos, primer lavado(500 ml).

-Puede ser necesario procedimientos dehomogenización, filtración y/o centrifugación.

-No representa grado de intoxicación (tóxico noabsorbido).

-Se pueden encontrar tabletas o cápsulas, o tóxicosin metabolizar.

Sangre

-Es una de las muestras más útiles para la identificación yespecialmente para el análisis cuantitativo.

-La sangre total y el plasma son las muestras másrepresentativas.

-Recoger la muestra en tubos con fluoruro sódico comoanticoagulante.

-Si se sospecha de intoxicación con plomo, utilizar EDTA.


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Orina-Ensayos preliminares en el screening de tóxicos.

-Para drogas de abuso.

-La concentración de un tóxico puede llegar a ser 100veces mayor que en la sangre.

-Exenta de proteínas.

-Se debe de tomar antes del tratamiento.

-Como mínimo 50 ml.

-No añadir conservantes.

-Desventaja: Tóxicos que se eliminan en su

totalidad como metabolitos comunes.

Humor vítreo.

-Fácil accesibilidad

-Volumen suficiente

(casi 2 ml por ojo)

-No muchas proteínas

-Protegido de circulacióngeneral

-Pocas enzimas

-Resistente a la contaminación bacteriana

-Drogas y alcohol

Hígado

-Niveles de tóxicos superiores

a los de la sangre.

-Especialmente útil cuando no

se puede disponer de sangre.

-Evitar contaminación por bilis.

-Evitar añadir conservantes.


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Otros tejidos y fluidos biológicos

-Cerebro: especialmente casos de inhalación.

-Riñón: especialmente en intoxicaciones pormetales y tóxicos que se acumulan en riñones.

-Bilis: Tóxicos que se eliminan por vía biliar. Ensobredosis por opiáceos se acumulan altasconcentraciones de glucurónidos.

Pelo

-Tóxicos minerales

-Detección de drogas de abuso en consumidores

crónicos.-Exposición prenatal

-Refleja el estado promedio de los elementosminerales del organismo durante su crecimiento.

Saliva.

-Correlación de los análisis

séricos con drogas de abuso y

psicofármacos.

Drug Testing in Oral Fluid–Evaluation of Sample Collection Devices

Journal of Analytical Toxicology Vol. 32: 393- 401, (2008)

Drager DrugCheck™

Kit


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Meconio.-Meconio: líquido amniótico,moco, lanugo, bilis y células quese han desprendido de la piel ydel tracto intestinal.

-Identificación de drogas durantela gestación.

Muestras envenenadas, fortificadas o reforzadas

Muestras certificadas o estándares de referencia

B.O.E. DEL 23 DE DICIEMBRE DE 1.996 28654 ORDEN de 8 de

noviembre de 1.996 por la que se aprueban las normas para la

preparación y remisión de muestras objeto de análisis por el

Instituto de Toxicología.


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TOXICOS DESCONOCIDOS

• Un recipiente con estómago y su contenido, y además vómitos y loslavados gástricos que en el tratamiento de urgencia se hicieran conagua sola.

• Un frasco seco con sangre en cantidad de unos 50 ml.• Un frasco de orina; toda cuanta sea posible extraer.• Un recipiente con aproximadamente 100 g de cerebro.• Un recipiente con hígado (aproximadamente 100 g) y vesícula biliar.• Un recipiente con una cuña renal de aproximadamente 100 g.• Un recipiente con aproximadamente 100 g de pulmón.• Si se sospecha de intoxicación por arsénico, plomo, berilio, talio,

estroncio, uranio y fluor, deberán remitirse muestras de uñas,cabellos o huesos.

-Desinfección del instrumental

-Desinfección de la piel

-Cantidad de sangre que se debe extraer

-Frasco para remitir la muestra

-Aditivos conservadores

-Etiquetado-Documentación

-Sangre de cadáveres

• Tapones PTFE(polytetrafluoroethylene)

• Evitar frascos con cámarasde aire en el caso de tóxicosgaseosos o volátiles

• Etiquetas

• No conservantes excepto

– Fluoruro sódico

– Formol


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•

Polvos, nieblas, gases y vaporesrecogibles sobre filtros de soportessólidos

• Gases y vapores recogiblesmediante frascos lavadores

• Vapores orgánicos absorbibles entubos de carbón activo.

• Muestreo de aguas

• Comprimidos• Restos vegetales• Residuos

en una taza,vaso , etc

• Alimento

•

Bebida• Envase de una conserva• Aire urbano• Recinto• Ecosistema

AIRE

AGUA

SUELOALIMENTOS

Factores que intervienen:

Temperatura

Descomposiciónbiológica

Luz

Hidrólisis

Oxidación


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Se sospecha de un determinado tóxico:

1. Separación del medio.

2. Técnicas de identificación directas (sinseparación).

No se sospecha de ningún tóxico concreto:

1. Separación o extracción del tóxico de lamuestra problema.

2.

Fraccionamiento del extracto.3. Purificación de los extractos obtenidos.4. Detección de la sustancia xenobiótica.5. Identificación del tóxico.6. Determinación o valoración cuantitativa.

Extracción: Conceptos

• La extracción es una técnica de separación o aislamiento quese puede aplicar a todo tipo de mezclas, ya sean éstas sólidas,

líquidas o gaseosas.

• La extracción se basa en la diferencia de solubilidad de loscomponentes de una mezcla en un disolvente adecuado.

• La forma más simple de realizar una extracción consiste entratar la mezcla de compuestos con un disolvente de manera

que uno de los componentes se disuelva y los demás no.


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Extracción clásica Líquido-Líquido

• Disolvente polar

• Disolvente apolar

• Partícula apolar

• Partícula polar

• Los componentes de la mezcla se distribuyan entre los dosdisolventes según su coeficiente de reparto, que estádirectamente relacionado con la solubilidad de cada compuesto.

Criterios para elegir método deextracción

• Selectividad

• Rendimento

• Tiempo

• Seguridad

•

Coste• Posibilidad de

automatización

Desde el punto de vista analítico los tóxicos sedividen en: – Tóxicos volátiles – Tóxicos gaseosos – Tóxicos orgánicos fijos o extraíbles – Tóxicos inorgánicos o minerales

Finalidad:

Aislamiento y purificación del tóxicoConcentración del tóxico en el extracto obtenido

Parte de la muestra se reserva íntegra


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• Aquellos que se volatilizan por debajo de los100ºC, por lo cual son arrastrados por elvapor de agua cuando ésta destila (alcoholetílico, alcohol metílico, benceno, fenoles, ...).

Las técnicas son:

-Destilación simple.

-Destilación fraccionada.

-Destilación directa al vacío.

-Destilación por arrastre en corriente de vapor.

-Microdifusión.

-Técnica de “espacio en cabeza” ("head space" ).

• Muestra

• problema

• Tóxico

• volátil

• extraído


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• Separación según puntosde ebullición

• Camara

• de

• Conway

1. La muestra se depositaen un vial cerrado contapón perforable, en elque se deja una cámarade aire.

2. Se calienta a 60ºCdurante 30 minutos.

3. Se extrae con una jeringa para gases unamuestra de la partesuperior del frasco parainyectarla en uncromatógrafo de gases.


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• Se denominan tóxicos gaseosos a todasaquellas sustancias que a temperatura ambientese encuentran en estado gaseoso. Por ejemplo:CO, HCN, SH2, AsH3, SbH3 , NH3, Cl2, Br 2.

• Las técnicas son:

-La extracción de gases en sangre se basa en leyesfísicas, según las cuales su solubilidad disminuyeelevando la temperatura o disminuyendo la presión.

-Mediante las mismas técnicas que para los tóxicos

volátiles.

-Cromatografía de gases: técnica de separacióntanto para tóxicos gaseosos como volátiles.

In the animation below the red molecules aremore soluble in the liquid (or less volatile) thanare the green molecules.


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• Cromatografíade gases (GC)

• Técnica de separación.

• Se basa en la diferente velocidad con que semueven los solutos a través de un medio porosoarrastrados por un disolvente en movimiento.

Cromatografía de gases

(GC)


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Ventajas e inconvenientes• Costoso.• Personal especializado.• Técnica muy sensible, fiable y rentable para

determinaciones cualitativas (casi la totalidadde los tóxicos) y cuantitativas (límite desensibilidad 1-5 !g/ml.) .

• Posibilidad de derivatización (obtener uncompuesto intermedio a partir de una sustanciano volátil) hace su aplicación prácticamenteuniversal.


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Sustancias orgánicas y no volátiles.

Se incluyen:

*Tóxicos de origen vegetal (glucósidos,aceites esenciales, alcaloides, etc)

*Productos de síntesis (medicamentos).

Sin o con tratamiento previo de la muestra (desproteinización yliberación de conjugados)

Fase A. Extracción:-con disolvente apolar

-con disolvente polar (etanol): técnica de Stas-Otto.Fase B. Purificación del extracto.Fase C. Fracionamiento del extracto, para grupos:

- ácidos- básicos- neutros

Las técnicas son:

-Método de electrodiálisis: se basa en la propiedad quetiene la corriente eléctrica de descomponer las sales delos tóxicos orgánicos, yendo la base hacia el polonegativo y el resto al polo positivo.

-Columnas con rellenos de resinas: las drogas orgánicasson absorbidas por la resina y luego son eluidos consolventes apropiados.


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Extracción en fase sólida

Estos tóxicos se encuentran en el organismofirmemente unidos a albúmina, lípidos o glúcidos,siendo requisito la destrucción de la materiaorgánica para poder realizar su análisis.


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1. Mineralización: proceso por el cual se produce la destrucciónde la materia orgánica y la consiguiente liberación del tóxico.

a) Destrucción oxidativa por vía húmeda de la materia orgánica empleandoácido nítrico o mezclas de ác. nítrico-agua oxigenada, etc.

b) Destrucción de materia orgánica por vía seca (calcinación).

c) Formación de complejos y posteriormente se separa con disolventesorgánicos.

Se pueden efectuarse combinaciones entre los distintosmétodos, para obtener una muestra más apropiada.

Existen métodos que no precisan la destrucción de lamateria orgánica como:

*Diálisis.

*Ultrafiltración.

*Electrodiálisis.*Desproteinización.

2. Marcha posterior de extracción

Dos etapas:

1. Rastreo o detección rápida:-Técnicas de inmunoensayo-Cromatografía en capa fina

2. Técnicas de confirmación:-Técnicas espectrofotométricas.-Técnicas cromatográficas.


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Fundamento:

Reacciones antígeno-anticuerpo.Se basan en la competencia por un anticuerpo de tóxicomarcado frente al tóxico sin marcar de la muestra problema.Se aplica especialmente para drogas de abuso ypsicofármacos.

Tóxico libre

Tóxico marcado

+ AC Tóxico libre-AC

Tóxico marcado

1. Radioinmunoensayo (RIA): isótopo radioactivo.

2. Enzimoinmunoensayo: enzima.-ELISA: ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas-EMIT: inmunoensayo multiplicado por enzimas

3. Fluorescencia polarizada (FPIA): fluoróforo.

4. Inmunoanálisis por interacción cinética de partículas(KIMS): competencia por unirse al Ab y evitar formaragregados de micropartículas.


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Reacciones cruzadas

Cromatografía en capa fina (CCF)

Cromatografía en capa fina (CCF)


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2. Técnicas de confirmación:

-Técnicas espectrofotométricas.

-Técnicas cromatográficas.

Fundamento: capacidad que tienen las moléculas y losátomos de absorber radiaciones de diferente longitud de ondautilizando la energía de dichas radiaciones para producir cambiosenergéticos en su estructura (en los átomos transicioneselectrónicas y en las moléculas movimientos electrónicos)


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Absorción

Emisión

1

2

3

41.

Al aplicar energía, el átomo absorbe

2. El electrón exterior es inducido amoverse a un orbital menos estable,estado excitado = estado provocado.

3. Retorno a su estado fundamental.

4. El electrón emitirá energía radianteequivalente a la cantidad de energíainicialmente absorbida = estadoespontáneo

La longitud de onda de la energíaradiante emitida esta directamenterelacionada a la transiciónelectrónica producida y esespecífica.

Los procesos de: 1 excitación = absorción4 Decaimiento= emisiónPueden ser medidos

E*

E

LuzincidenteFluorescencia

emitida

Sistemadetector

Lámpara decátodo hueco Sistema

atomizadorSistema

monocromadorSistemadetector

La emisión de una energía electromagnética de longitud de onda determinada,se hace incidir sobre un átomo libre en estado fundamental, este átomoabsorbe la energía y con lo que pasa a un estado excitado.


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La lámpara produce líneas específicas delcátodo con el que se la diseña.

El cátodo debe de ser buen conductor de la corriente

Lámpara de cátodo hueco

Siempre se precisa atomizar la muestra.Hay dos procedimientos:

Atomización con llama

Muestras líquidas y gases

Atomización sin llama Horno con cámara de grafito

Muestras sólidas y líquidas

Atomización con llama

nebulizador

Cámara

de mezclado

El atomizador consiste en unmechero con cabeza larga yestrecha que sirve de pasoóptico para la muestra (b)

La muestra se aspiradentro de la llama.

El nebulizador controla elflujo de muestra y lanebuliza.

La cámara de mezclado, aseguraque la muestra se mezcla con elfuel y el oxidante, antes de entrar

en el interior de la llama


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purga de gas

agua de refrigeración

tubo grafito

Paso óptico

inyector-muestra

HORNO DE CÁMARA DE GRAFITO

Horno de grafito

Atomización sin llama

E*

E

Luz emitida


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Técnica cualitativa y cuantitativa.Separa partículas moleculares o atómicas según su masa.

Volatilización

Ionización

2.Aceleración

iones

3. Separación

4. Detección

Técnica cualitativa y cuantitativa. Análisis de fragmentos moleculares. Determinación de la estructuramolecular.Su principal aplicación es la identificación de sustancias desconocidas

Cromatografía de gases: espectrómetro de masas (CG-EM).


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ICP: Plasma de

acoplamiento inducido

Cromatografía de líquidos

Cromatografía de gases


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Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

fase móvil v/s fase estacionaria


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• Electroforesis capilar

• Anodo • Catodo

• Laser Argon• Capilar con polimero

• 50-100 µm x 27 cm

• 5-20 kV

• -• + • Ventana delcapilar

•

Datos pasan al equipo

•

Separación de moléculas

cIEF Methodology (Sample Loading)


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cIEF Methodology (Focusing)

1. Momento de la toma de la muestra

2. Estabilidad del compuesto en la muestray homogeneidad de ésta

3.

Amplitud y reproducibilidad del métodoanalítico

4. Interferencias en el método analítico

No se detecte el tóxico

• Defectos operatorios

• Desaparición del tóxico del cuerpo delintoxicado


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Factores que intervienen:

SensibilidadExactitud

Metabolitosactivos einactivos

Soporteestadístico

Confusiónvalores

Diferenciasindividuales

• http://www.chem.wits.ac.za/chem212-213-280/0%20Introduction%20-%20Lecture.ppt

1. Capacitación del personal del laboratorio

2. Cadena de custodia

3. Métodos Normalizados

4. Sustancias certificadas

5. Programas de control y de garantía decalidad internos


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