Técnica de Amplificación Isotérmica de Ácidos Nucleicos Tipo LAM1

8/19/2019 Técnica de Amplificación Isotérmica de Ácidos Nucleicos Tipo LAM1

1/67

Técnica de Amplifcación isotérmica de ácidos nucleicos tipo LAMP

Pd 4 Citado por 7 - Artículos relacionados

Arroyo A María Isabel, Morales L loria Patricia, !osa " Paula Andrea,#armona $onseca %aime, Maestre &uitra'o Amanda (lena)

Amplifcación isotérmica de ácidos nucleicos tipo LAMP para la detección dePlasmodium*

nue+a técnica dia'nóstica

Médicas I! -../0 -123 * 15/6175

8esumen

8ecientemente se introdu9o en el dia'nóstico de malaria una técnicallamada amplifcación isotérmica de ácidos nucleicos, :ue usa el material'enético plasmodial) (ste escrito re+isa la inormación disponible sobreamplifcación isotérmica de ácidos nucleicos, especialmente en el campo delpaludismo)

Metodolo'ía* !e re+isaron las bases electrónicas Lilacs, !cielo, PubMed2Medline y ;+id)

8esultados* !olo se encontraron tres reerencias sobre amplifcaciónisotérmica de ácidos nucleicos y malaria pero


2/67

tolera los componentes de los medios de culti+o y las sustancias bioló'icas)(ntre las des+enta9as están :ue la ba9a concentración de A=> moldedisminuye la efcacia del reconocimiento de los cebadores0 la obser+aciónde la turbide? ue menos sensible :ue la +isuali?ación de los productos en'el de a'arosa te@idos con bromuro de etidio y es crítica la pre+ención de la

contaminación)


3/67

Introduction* isot


4/67

8esumo* 8ecientemente se introdu9o en el dia'nóstico de malaria unatécnica llamada amplifcación isotérmica de ácidos nucleicos, :ue usa elmaterial 'enético plasmodial) (ste escrito re+isa la inormación disponiblesobre amplifcación isotérmica de ácidos nucleicos, especialmente en elcampo del paludismo) Metodolo'ía* se re+isaron las bases electrónicas

Lilacs, !cielo, PubMed 2Medline y ;+id) 8esultados* solo se encontraron tresreerencias sobre amplifcación isotérmica de ácidos nucleicos y malariapero


5/67

reco'nition0 turbidimetry Das less sensiti+e t


6/67

tecnica6dia'nostica)


7/67

de la contaminación)

CDDD)redib)or'CrecursosC8ecordCoaiarticulo1/./136amplifcacion6isotermica6acidos6nucleicos6tipo6lamp6deteccion6plasmodium6tecnica6dia'nostica

Registro completo de metadatos

Campo DC Valor

dc.contributor.advisor Cevallos Falquez, Orly

dc.creator Cedeño Jiménez, Pablo Ramón

dc.date.accessioned 2015-08-06T15:03:49Z

dc.date.available 2015-08-06T15:03:49Z

dc.date.issued 2013

dc.identifier.citation Cedeño Jiménez Pablo Ramón (2013). Determinación de la brucelosis en humanos mediante la técnica de la

municipales de la provincia de Los Ríos. Quevedo. UTEQ. 69 p.

dc.identifier.uri http://repositorio.uteq.edu.ec/handle/43000/566

dc.description This research was conducted in the Laboratory of Biotechnology Quevedo State Technical University. The over

research was to determine the incidence of human brucellosis in slaughterhouses by LAMP technique in the m

province of Los Rios. In this study a comparison was made of the technique of isothermal nucleic acid amplific

serology Rose Bengal (RB) in the diagnosis of human brucellosis. A total of 84 blood samples were collected fr

slaughterhouses in the province of Los Rios with high historical prevalence of brucellosis in animals. An averag

for the analysis of RB, meanwhile that LAMP was 0%, and is also performed with PCR, suggesting that the mo

traditional LAMP is more sensitive RB. The results show that the positive sample detection by LAMP technique

sensitive than the serological test for Rose Bengal, therefore in this paper, we consider the LAMP as a useful t

brucellosis and their use for future programs of prevention and eradication of the disease. Keywords: LAMP, R

abortus, and brucellosis.

dc.description.abstract Esta investigación se la realizó en el Laboratorio de Biotecnología de la Universidad Técnica Estatal de Queve

esta investigación fue: Determinar la incidencia de brucelosis humana, en los camales mediante la técnica de

de la provincia de Los Ríos. En este estudio se hizo la comparación de la técnica de Amplificación isotérmica

(LAMP) versus la prueba serológica Rosa de Bengala (RB) en el diagnóstico de la brucelosis humana. Un tota

sangre fueron recolectadas de tres camales municipales de la provincia de Los Ríos con una alta tasa de prev

brucelosis en animales. Un promedio del 0.84% dio positivo para el análisis de RB, mientras tanto que con LA

también se le realizó con PCR, lo que sugiere que la técnica molecular de LAMP versus la tradicional de RB e

resultados muestran que la detección de la muestra positiva mediante la técnica de LAMP fue más específica

serológica de Rosa de Bengala, por lo tanto en este trabajo se considera a la LAMP como una herramienta mde brucelosis y su uso para futuros programas de prevención y erradicación de la enfermedad. Palabras clave:


8/67

bengala, Brucella abortus, y brucelosis.

dc.format.extent 69 p.

dc.language.iso spa

dc.publisher Quevedo: UTEQ

dc.rights openAccess

dc.rights.uri http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/ec/

dc.subject Brucelosis en humanos

dc.subject Técnica de lamp

dc.title Determinación de la brucelosis en humanos mediante la técnica de lamp en camales municipales de la provin

dc.type bachelorThesis

Aparece en las

colecciones:

Tesis - Ingeniería Agropecuaria - Semipresencial

ribosomal A=>r) !ecuencia de A=> contenida en loscromosomas del ncleolo :ue codifca A8> ribosomal, muy utili?ado enestudios flo'enéticos por su ba9o porlimorfsmo 'enético)

5) MTA#I;>(! M;L(#LA8(! S !ilenciosas S >eutra S #ambio de sentido omissense 2cancer colorectal S !in sentido o non sense 2Talasemia S Adicióndeleción o rame s


9/67

2Lys U Ar' S #A E A 2!er U Leu S AA E !T;P S AA T#T A AA SAA T## TA A ATR S AA TTA AAT

) Pro'ramas para biomodelos S %mol, # S S 6 6 A=> 6 "ector 2plásmido Li'ación 2A=> li'asaInserción 2Transormación o transección) 6 Propa'ación 2selección,miniprep 6 Purifcación

J) AMPLI$I#A#I;> =( A#I=;! >#L(I#;! I> "IT8; S Amplifcación del A=>diana) 8eacción en cadena de la polimerasa 2P#8, la autorreplicación de lasecuencia 23!8 y la amplifcación por despla?amiento de la P#8 anidada A partir de unamplicón se aplican nue+os primes) Aumenta la sensibilidad) P#8 deeEtensión solapada #ambios de secuencia introducidos dentro dera'mentos 2clonados de A=>) 4 primers con productos de A=> mutado

solapados) P#8 in situ (n portaob9etos sobre te9ido o células) !e e es el molde inicial y laen?ima es transcriptasa in+ersa :ue orma cA=>) V 6P#8 #uantifca A=> oA8> en tiempo real) !e detecta basándose en Zuorocromos o sondas) ;trase6P#8, A$LP, #olonia, Asimétrica, (specífca de alelo, Yot start, I!!8,

Touc =(L AMPLI$I#A=; S (lectroorésis de a'arosa) S

!out


10/67

17) =etección por bioluminiscencia

1/) ;T8A! S >A!&A 2>ucleic Acid !e:uence &ased Amplifcation 3!8)

1J) !(#(>#IA#I;> =( A#I=;! >#L(I#;!

-.) !(#(>#IA#I;> S =eterminación de la secuencia de nucleótidos de unamolécula específca) S 6Método :uímico S 6Método en?imático S =etecciónde mutaciones, aplicaciones orenses, A=> ósiles, dia'nóstico deenermedades)

-1) !(#(>#IA#I;> S =i6deoEi6nucleótidos S


11/67

aunque la infección subclínica es común5. En el mundo en desarrollo la vacunación es rara y la aplicación del

fármaco con frecuencia menos informados. Como consecuencia coccidiosis subclínica y clínica es más común y

ejerce un impacto económico significativo3.

El diagnóstico de infección Eimerian ha dependido tradicionalmente de lesión anotando post mortem, aunqueincluso los autores del sistema de puntuación más utilizados comentaron que para algunas especies ", parece

dudoso que tal procedimiento se debe intentar en ningún pero moderadamente graves infecciones"6. Evidencia

complementaria puede ser obtenida a través de detección microscópica de la etapa del ciclo de vida de

ooquistes resistentes al medio ambiente en las muestras fecales o de basura, aunque la morfología de la

superposición puede confundir a todos, pero el experto en6,7. Alternativas moleculares utilizando la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR), amplificatio azarn de ADN polimórfico PCR (RAPD-PCR) y las tecnologías de

PCR cuantitativa han estado disponibles por hasta 20 años8-10, pero hasta la fecha no han llegado a ser

populares. Gasto relativo y el requisito de que el equipo de laboratorio especializado o procesamiento han

limitado su aceptación, a pesar de la naturaleza a menudo subjetiva y técnicamente exigente de la Patología

mayor y microscopía basada aproxima a10,11. Estas limitaciones pueden ser exagerados en muchas de las

regiones más pobres del mundo, como el sudeste de Asia, donde el impacto de la coccidiosis en la pobreza

puede ser proporcionalmente mayor12. En respuesta hay una clara demanda de nuevo, los ensayos de

diagnóstico específicos de las especiesde Eimeria sencillo y sensible, pero rentable.

Loop mediada amplificación isotérmica (LAMP) es una técnica fácil de preparar polimerasa impulsado ADN que

es capaz de amplificar grandes cantidades de ADN. Lo más importante, LAMP utiliza una Polymera DNABstSE

en lugar de la ADN polimerasaTaq comúnmente utilizado en la PCR, lo que facilita la amplificación de ADN a

una única temperatura constante sin el requisito de ciclos térmicos13,14. Lámpara puede ser susceptible de

aplicación en el laboratorio incluso más rudimentario o en el campo. Caracterizado por resistencia relativa a

muchos inhibidores de la PCR, una alta sensibilidad y especificidad, los ensayos de LAMP se han desarrollado

para una amplia gama de patógenos, incluyendo virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa,Clostridium

perfringens yCryptosporidium 15-17. En respuesta a la demanda de nuevos diagnósticos de cada especiede

Eimeria rentables un panel de ensayos de LAMP específicas para cada una de las siete especiesde Eimeriaque

infectan los pollos se ha desarrollado18. Las solicitudes de los nuevos ensayos incluyen monitoreo aparición de

parásitos, de especial valor dada la asociación de especies comomáximos Eimeria oEimeria necatrix con mala

pe económicarformance3,4. Otras aplicaciones incluyen la evaluación de la eficacia de la estrategia anticoccidial

de una granja, el diagnóstico de la infección subclínica o enfermedad clínica y la evaluación de riesgo planteado

porEimeria a una granja.

Protocol

1. Plantilla Preparación

NOTA: Cualquier plantilla de ADN genómico se sospecha que contiene ADN derivado de una de las siete

especiesde Eimeria que infectan a los pollos puede ser utilizado como plantilla para la identificación de

especiesde Eimeria basados en LAMP. Muestras de tejido intestinal para el análisis de diagnóstico de campodeben recogerse durante la rutina post mortem como se describe aquí.

http://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reactionhttp://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reactionhttp://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reactionhttp://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction


12/67

1. Elige la sección (o secciones) de intestino para ser probado. Ver Tabla 1 para una guía para la

selección del sitio de la muestra y las especies con más probabilidades de estar presenteel 18 y enla

Figura 1 para el rango de distribución y ubicación de los sitios de muestreo específico de la

especiede Eimeria.

NOTA: Esto es de vital importancia ya queEimeria son notablemente sitio host específico. Cada

especie que infecta pollos se define por la región intestinal que se dirige a19. La decisión puede estar

influenciada por la experiencia previa de la finca, el interés en una o more determinadas

especiesde Eimeria u otros indicadores de diagnóstico6.

2. Impuestos Especiales 5 cm o longitudes más largas de la sección (s) intestinal seleccionada para la

prueba deEimeria utilizando tijeras estériles o un escalpelo. Opcionalmente, almacenar las

muestras para su posterior análisis en un fijador tal como, por ejemplo, en RNAlater18 o 95% de

etanol.

NOTA: Si el almacenamiento de etanol en la muestra se debe lavar a fondo en ácido

etilendiaminotetraacético-tris estéril (TE) tampón antes de usar.

3. Cortar la muestra abierto longitudinalmente, eliminar el contenido más intestinales (si está presente)

y raspar las células de la capa de la mucosa libre utilizando el borde de un portaobjetos de

microscopio de vidrio estéril o un cuchilla de tijera etanol / llama esterilizado. Opcionalmente para

una muestra colectiva incluir células de los cuatro sitios intestinales específicas de las especies en

un solo tubo.

4. Ponga el material raspado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con tapa de rosca estéril que

contiene 100 l de tampón TE estéril incluyendo 10% (w / v) Chelex 100 de resina.

5. Agitar cada muestra vigorosamente durante 1 min. Asegúrese de que la parte superior del tornillo

está firmemente cerrada y luego se incuba en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos.

6. Después de hervir permitir que cada muestra se enfríe a la temperatura ambiente durante 1-2 min.

7. Centrifugar cada muestra utilizando una microcentrífuga a velocidad máxima(por ejemplo, ~ 10.000

xg) durante 1 min.

8. Recoger 2 l del sobrenadante resultado es la plantilla en cada ensayo LAMP se vayan a realizarse.

Opcionalmente, agrupar más de un sitio intestinal en un solo tubo para proporcionar un ensayo de

sitio múltiple.

2.Eimeria LÁMPARA Preparación Primer (Pre-ensayo)

1. PrepararEimeria LÁMPARAS stocks de cebadores adecuados para 100 ensayos:

1. Reconstituir cada cebadorEimeria LÁMPARA liofilizada añadiendo agua de grado

molecular a una concentración de 100 mM (según lo especificado por el fabricante). Si


13/67

no se especifica, calcular el volumen de agua requerido usin de grado molecularg los

pesos físicas y moleculares de cada cebador.

2. Pipeta 60 l de agua de grado molecular en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml flip-top

separado para cada especiede Eimeria a ensayar.

3. Añadir cebadores FIP, BIP, F3, B3, LF y LB específica a las especiesde Eimeria de

destino al agua usando las cantidades se muestran en la Tabla 2, la creación de una

serie de mezclas específicas de especies de siete cebadores.

4. Vórtice brevemente mezclar la solución de imprimación, luego pulso microfuge y

congelar hasta que sea necesario.

2. Prepare una mezcla maestra reacción LAMP para cada especiede Eimeria a ensayar. Multiplique

las cantidades se muestran en la Tabla 3 por el número de muestras y añadir tres a un control

positivo, control negativo y repuesto pipeta. Pipetear en un 0,5 o 1,5 ml flip-top de tubo de

microcentrífuga.

3.Eimeria LÁMPARA Ensayo

1. Especies específicas de ADN polimerasaBST / LAMP pipeta 23 lEimeria Mastermix en un 0.5 ml

tubo de microcentrífuga.

2. Añadir plantilla de ADN 2 l (preparado en el apartado 1), por lo que un volumen final de reacción de

25 l.

3. Añadir ADN genómico específico de la especiede Eimeria 2 l de una reacción (control positivo).

Añadir 2 l de agua de grado molecular a la reacción (control negativo).

NOTA: Si el ADN genómico específico de la especie no se encuentra disponible una lámpara

positiva previa o producto de PCR estándar se pueden usar en su lugar.

4. Incubar en un baño de agua o bloque de calor a 62° C durante 30 min. Opcionalmente, de-activar la

ADN polimerasaBst por calentamiento a 80° C durante 10 min si la reacción no va a ser leído

inmediatamente.

4. LÁMPARA Ensayo de lectura

1. Al término de la incubación evaluar el color de cada reacción por debajo de los ojos la luz interior.

Los resultados negativos aparecen de color rosa y violeta, los resultados positivos aparecen cielo

azul20.

2. Opcionalmente, confirmar el resultado LAMP ensayo en un laboratory mezclando 5 l producto LAMPreacción con 1 l de tampón de carga en gel de ADN para la electroforesis en gel de agarosa usando


14/67

un gel de agarosa al 2% en 1 x Borato EDTA tampón Tris / / (TBE), pre-teñidas utilizando un

colorante de ácidos nucleicos (5 l por 50 ml de agarosa). Añadir 5 l de una escalera de ADN de 1 Kb

de tamaño molecular con el carril 1 del gel para permitir el cálculo del tamaño de fragmento.

Representative Results

Validación del ensayo

Durante la validación cada ensayo LAMP-específica de la especieEimeria se ensayó usando un panel de

muestras de ADN puro que representan todas las siete especiesde Eimeria que infectan el pollo, así como ADN

genómico de pollo como un control host. Electroforesis en gel de agarosa se utilizó para resolver cada ensayo y

demostró la especificidad de especie absoluta sin anfitrión reactividad cruzada18. A continuación, una serie de

diez veces la dilución en serie preparó usandotenella purificadoEimeria ADN genómico reveló un límite de

sensibilidad del ensayo de entre uno y diez copias del genoma18. No hay límite superior se determinó con

resultados positivos alcanzados hasta e incluyendo la concentración más alta (100.000 copias del genoma)18.

Aplicación con muestras de campo

Las muestras recogidas para las pruebas deEimeria es probable que se deriva de pollos encontrados muertos,

sacrificados como consecuencia de poor salud o sacrificadas para la vigilancia centinela de la salud, lo que

indica un tamaño de muestra probable de entre uno y tres, cuando parte de una rutina. Prueba de tres aves

recogidas de una granja de pollos de Estados Unidos como parte de un programa de vigilancia produjo tres

series de muestras intestinales. Aplicación de los ensayos de LAMP específicas de la especie objetivo, dar

prioridad a los sitios intestinales preferidos para cada especiede Eimeria (Tabla 1), permitió la identificación

visual de la infección Eimerian en todas las aves a prueba utilizando azul hidroxinaftol como un indicador(Figura

2). El color conseguido con una reacción LAMP negativo al usar azul hidroxinaftol puede oscilar desde el violeta

al rosa, pero siempre es distinto del azul alcanzado por un resultado positivo. Confirmación por electroforesis en

gel de agarosa proporcionó resultados comparables(Figura 2B). Durante la aplicación de campo el usuario

puede optar por aplicar la pantalla completa contra las siete especies, o de destino sólo aquellas especies

priorizadas comoimportante o conocido que circulan en la granja o alrededores.

El fracaso de los enfoques basados en la PCR para establecerse como diagnóstico para la ocurrencia

deEimeria hace hincapié en la necesidad de simplicidad en cualquier nueva prueba. Mientras que la lámpara

ofrece una preparación simple y procesamiento de PCR, la obligación de probar múltiples sitios intestinales por

ave sigue siendo desalentador. Producción de una sola muestra de ADN agrupado por ave, que luego puede ser

probado con uno o más ensayos de LAMP, es probable que sea más atractivo. Procesamiento de una muestra

conjunta por ave, el material recogido de cada uno de los sitios intestinales específicos descritos en la Tabla 1 y

se agruparon antes de la preparación de ADN, para las pruebas con los siete ensayos de LAMP representa

siempre el mismo resultado que cuando cada sitio intestinal se procesó por separado(Figura 2 en comparación

conla Figura 3).


15/67

Figura 1. sitios de muestreo intestinales para la detección LÁMPARA deEimeria parásitos de especies

que infectan a los pollos. Las regiones intestinales dirigidos por cada especiede Eimeria se destaca por las

líneas de color, con los sitios preferidos de muestreo indicado por el número entre las líneas negras

punteadas(E. acervulina: amarillo / 1,E. Brunetti: rosa / 2,E. maxima: azul / 3,E. mitis: naranja / 4,E.

necatrix:rojo / 5,E. praecox: verde / 6 yE. tenella: gris / 7).Haga clic aquí para ver una versión más grande de

esta figura.

Figura 2. LÁMPARA diagnóstico de infección Eimerian from tres pollos de engorde comerciales. LAMP

reacciones resuelven utilizando(A) hidroxinaftol azul, donde un azul cielo reacción fue positiva y una violeta a la

reacción de color rosa fue negativa, y la electroforesis en gel(B) de agarosa. Los sitios muestreados intestinales

fueron como se muestra en la Tabla 1 para cada especie del parásito. A =E. acervulina, B =E. Brunetti, Ma =E.

maxima, Mi =E. mitis, N =E. necatrix, P =E. praecox y T =E. tenella. El carril 1 contiene la escalera del ADN

1Kb GeneRuler.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig1large.jpghttps://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig1large.jpghttps://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig2large.jpghttps://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig1large.jpghttps://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig1large.jpghttps://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig2large.jpg


16/67

Figura 3. LÁMPARA diagnóstico de infección Eimerian utilizando reac LÁMPARASmuestras agrupados

de tres pollos de engorde comerciales separados.ciones resolver utilizando azul hidroxinaftol, donde un azul

cielo reacción fue positiva y violeta a la reacción de color rosa fue negativo. A =E. acervulina, B =E. Brunetti,Ma

=E. maxima, Mi =E. mitis, N =E. necatrix, P =E. praecox y T =E. tenella. Haga clic aquí para ver una versión

más grande de esta figura.

itio de la

muestra

Ensa!o de especies deEimeria "lo m#s probable$

=uodeno 2= E. acervulina, E. praecox

Xeyuno Cileon ` 2% C I

E. maxima, E. necatrix

#ie'os 2# E. necatrix, E. tenella

leonterminal 2TI

E. Brunetti, E. mitis Muestracon9unta 2P

E. acervulina, E. brunetti, E. maxima,

E. mitis, E. necatrix, E. praecox, E.

tenella

Tabla 1. Intestinal selección específica de la región de ensayos de especiesde Eimeria candidato. La

elección de la región a muestrear varía para cada especiede Eimeria como se ilustra enla Figura 1. Las

https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig3large.jpghttps://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig3large.jpghttps://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig3large.jpghttps://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig3large.jpghttps://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig3large.jpg


17/67

muestras combinadas incluyen material recogido de los cuatro sitios específicos que a continuación se

combinaron para la preparación de ADN.

Primer % toc& concentraci'n "M$ (olumen "l$

A'ua 6 .

=elantero Interior Primer 2$IP 1.. 4.

&acDard Pri Interiormer 2&IP 1.. 4.

=elantero eEterior Primer 2$3 1.. 1.

&acDard ;uter Primer 2&3 1.. 1.

Loop $orDard 2L$ 1.. -.

Loop &acDard 2L& 1.. -.

Total )**

Tabla 2. Preparación de una premezcla de imprimación LAMP. Los componentes y proporciones requeridas

para preparar una premezcla cebador para LAMP. Los volúmenes que se muestran son para 100 LAMP

reacciones. * Primer identidades como se muestra en los Materiales y Barkwayet al (2011)18.

toc& conc n Reacci'n +nal conc n (olumen por reacci'n "l$

== 6 6 1.)1

Tampón T


18/67

d>TPs -5 mM 4.. uM .)4

La betaína 5 M 1 M 5

A?ul de polimerasa &st /... C ml / 1

Total ),

Tabla 3. Preparación de un LAMMastermix reacción P. * Específico de la especiede Eimeria.

Disclosures

Materials

-ame Compan! Catalo.

-umber

Comments

8>Alater Ambion AM7.-4

(t


19/67

() acer+ulina &3 !i'ma6Aldric<

"#...-1 ÀTA#AATAA#A##TT

() acer+ulina $IP !i'ma6Aldric< "#...-1 ÀA#A#AT#AT#6A#AA#A#AT#TTA##T

() acer+ulina &IP !i'ma6Aldric<

"#...-1 ÀAA###T#TAAAA#A6##TT#T#A###TTA##

() acer+ulina L& !i'ma6Aldric<

"#...-1 `TAATTA#A###TA

() acer+ulina L$ !i'ma6Aldric<

"#...-1 `##AT#A#AAA#A#TT

() brunetti $3 !i'ma6Aldric<

"#...-1 `##AT#AATT##ATA#

() brunetti &3 !i'ma6Aldric<

"#...-1 `T#AA##T##TATTTT

() brunetti $IP !i'ma6Aldric<

"#...-1 ÀAAAT##TT#TA#T#T6#TTA#A#T#TT

() brunetti &IP !i'ma6Aldric<

"#...-1 `TA#TT##TAAT##AT##T##6ATTT##T####T#

() brunetti L& !i'ma6Aldric<

"#...-1 ÀAA##T#AA#AT#

() brunetti L$ !i'ma6Aldric<

"#...-1 `#TT#T##A#AA###AAT

() maEima $3 !i'ma6Aldric<

"#...-1 À#TA#AAAAT#TA#T

() maEima &3 !i'ma6

Aldric<

"#...-1 `##TT##T###TT#TAAAA#T


20/67

() maEima $IP !i'ma6Aldric<

"#...-1 ÀT#A#T#TATTA##AAAA6AA#TAT###TTT####T

() maEima &IP !i'ma6Aldric< "#...-1 ÀAAT#ATTTTTA#A#6A#AAT##AATTTTA

() maEima L& !i'ma6Aldric<

"#...-1 `#AA##TA##A#AT#

() maEima L$ !i'ma6Aldric<

"#...-1 `TTAT#A#TT#AA#

() mitis $3 !i'ma6Aldric<

"#...-1 À#ATA##AAA#A#TAA

() mitis &3 !i'ma6Aldric<

"#...-1 `####TATAAATAAA#A

() mitis $IP !i'ma6Aldric<

"#...-1 `##T#TAATTTAAATTAT6AAAT#AA##A#T

() mitis &IP !i'ma6Aldric<

"#...-1 `TTT#ATTATAA#AA#AA6T###T#TAAAT#AAA#

() mitis L& !i'ma6Aldric<

"#...-1 `T##AT#AT####TTTT

() mitis L$ !i'ma6Aldric<

"#...-1 `#T#A#AATTATT#

() necatriE $3 !i'ma6Aldric<

"#...-1 `T#TTT####TA##

() necatriE &3 !i'ma6Aldric<

"#...-1 `####AA#A#AAAA#T

() necatriE $IP !i'ma6

Aldric<

"#...-1 `##TTATTTTAA#TAT#A

#A6A###AA#A#T#A##AA


21/67

() necatriE &IP !i'ma6Aldric<

"#...-1 `###AT##ATT#AATAA#6À#ATA###TTT#

() necatriE L& !i'ma6Aldric< "#...-1 `T#TTAA#TTA#TTT

() necatriE L$ !i'ma6Aldric<

"#...-1 ÀA#A##A##T#T#

() praecoE $3 !i'ma6Aldric<

"#...-1 `###TTTATTT#TTTT#T

() praecoE &3 !i'ma6Aldric<

"#...-1 `##A#AAT#TAAT#A#A#

() praecoE $IP !i'ma6Aldric<

"#...-1 ÀT#T##T#AAAA#TTT##TA6##TT#TATAT##ATA

() praecoE &IP !i'ma6Aldric<

"#...-1 `#T#T#T#ATA#TT#6##AA##A#TATTT

() praecoE L& !i'ma6Aldric<

"#...-1 ÀATA#ATT##AT

() praecoE L$ !i'ma6Aldric<

"#...-1 `T##A#TT#ATTAATATT# T#

() tenella $3 !i'ma6Aldric<

"#...-1 `#TTTAAT#A#T

() tenella &3 !i'ma6Aldric<

"#...-1 `#TAT##ATA#TA#TT##T

() tenella $IP !i'ma6Aldric<

"#...-1 `##A#T#TATAAAT#A#A#6#ATAA#T#AT#AT

() tenella &IP !i'ma6

Aldric<

"#...-1 `TTT###AAATTTAA

A6#T#AAAATT#T###AAT


22/67

() tenella L& !i'ma6Aldric<

"#...-1 `##ATT#ATTAAA#A

() tenella L$ !i'ma6Aldric< "#...-1 `##AAATTAT#T#TATTATA TTAA#AA

1. E TeD (n'land&iolabs

&J..4!

M'!;4 !i'ma6Aldric<

M75.

d>TPs Prome'a 133.

&etaine solution 25 M !i'ma6Aldric<

&.3..

&st polymerase >eD (n'land&iolabs

M.-75!

YydroEynapAloadin' dye 2E

Prome'a 1//1

ene8uler 1^b =>Aladder

T


23/67

Re/erences

1. Chapman, H. D.,et al. A selective review of advances in coccidiosis research. Adv Parasitol.83, 93-

171 (2013).

2. Shirley, M. W., Smith, A. L., Tomley, F. M.The biology of avian Eimeria with an emphasis on their

control by vaccination. Adv Parasitol.60, 285-330 (2005).

3. Fornace, K. M.,et al. Occurrence of Eimeria species parasites on small-scale commercial chicken

farms in Africa and indication of economic profitability. PLoS ONE.8, (12), e84254 (2013).

4. Schwarz, R. S., Jenkins, M. C., Klopp, S., Miska, K. B. Genomic analysis of Eimeria spp. populations

in relation to performance levels of broiler chicken farms in Arkansas and North Carolina. J

Parasitol.95, (4), 871-880 (2009).

5. Peek, H. W., Landman, W. J.Coccidiosis in poultry: anticoccidial products, vaccines and other

prevention strategies. Vet Q.31, (3), 143-161 (2011).


24/67

"luorescence cur'es in a real-ti#e "or#at /!e sensiti'it& o" ./-LA0 assa& (as 258 "g and

125 "g DA per reaction (it! geno#ic te#plates o" % para!ae#ol&ticus and % 'ulni"icus

strains, (!ic! (as in con"or#it& (it! con'entional LA0detection Co#pared (it! 0C.-$ased

tec!ni)ues, t!e ./-LA0 tec!nolog& (as 188- and 18-"old #ore sensiti'e t!an t!at o" 0C.

and )0C. #et!ods oreo'er, t!e li#it o" detection o" ./-LA0 approac! "or %

para!ae#ol&ticus isolates and % 'ulni"icus isolates detection in arti"iciall&-conta#inated o&stersa#ples (as 62 C9: and ;3 C9: per reaction *n conclusion, t!e ./-LA0 assa&

presented !ere (as a rapid, speci"ic, and sensiti'e tool "or t!e detection o" % para!ae#ol&ticus

and % 'ulni"icus, and could $e adopted "or si#ultaneous screening o" % para!ae#ol&ticus and

% 'ulni"icus in a (ide 'ariet& o" sa#ples

Trad

=etección rápida y sensible de "ibrio parapor reacción con plantillas 'enómicas de ") para


25/67

+ulnifcus, y podría adoptarse para la detección simultánea de ")para


26/67

Lee =1, ^im (%1, ^il'ore P(-, Taaeisseria menin'itidis paraseis de los sero'rupos de menin'ococos más comunes 2A, &, #, , , e X) (lensayo se e+aluó utili?ando un con9unto de 31 LAMP ensayo menin'ocócicapositi+a lí:uido cealorra:uídeo 2L#8 especímenes de 1574 ni@os conmenin'itis sospec) menin'itidis del

sero'rupo LMPA8A detecta eisseria menin'itidis0 Zuido cerebroespinal0 ni@os0 bucle mediadaamplifcación isotérmica0 menin'itis0 identifcación del sero'rupo


27/67

•

Download Article

• Export citation

• -5-TOTA0 (IE1•

View Article Impact

Like1

Comment0

Share0


28/67

SHARE ON

0

0

0

0

New

SUPPLEMENTAL DATA

• Table 1.pdf

ORIGINAL RESEARCH ARTICLE

Front. Microbiol., 12 January 2016 | http://dx.doi.org/10.338/!"icb.201#.01#$8

Keywords: Neisseria meningitidis, %&rogroup id&nti!ication, loop'"&diat&d i%oth&r"al a"pli!ication, "&ningiti%,

c&r&bro%pinal !luid, childr&n

Citation: (&& ), *i" +J, *ilgor& +, -aaha%hi , hni%hi M, -o"ono J, Miya"oto , "agari ), *i" ) and &i

M 20164 5 o7&l (oop'M&diat&d %oth&r"al 5"pli!ication 5%%ay !or &rogroup d&nti!ication o! Neisseria

meningitidis in 9&r&bro%pinal Fluid. Front. Microbiol. 6:1#$8. doi: 10.338/!"icb.201#.01#$8

Received: 0 5ugu%t 201#; Accepted: 21 )&c&"b&r 201#;

Pu!is"ed: 12 January 2016.

Keywords: Neisseria meningitidis, %&rogroup id&nti!ication, loop'"&diat&d i%oth&r"al a"pli!ication, "&ningiti%,

c&r&bro%pinal !luid, childr&n

Citation: (&& ), *i" +J, *ilgor& +, -aaha%hi , hni%hi M, -o"ono J, Miya"oto , "agari ), *i" ) and &i

M 20164 5 o7&l (oop'M&diat&d %oth&r"al 5"pli!ication 5%%ay !or &rogroup d&nti!ication o! Neisseria

meningitidis in 9&r&bro%pinal Fluid. Front. Microbiol. 6:1#$8. doi: 10.338/!"icb.201#.01#$8

Received: 0 5ugu%t 201#; Accepted: 21 )&c&"b&r 201#;

Pu!is"ed: 12 January 2016.

http://


29/67

A Nove! Loop#$ediated Isot"er%a! A%p!i&ication Assay &orSero'roup Identi&ication o& Neisseria meningitidis inCererospina! (!uid

DoKyung Lee1,2†, Eun Jin Kim1,2†, Paul E. Kilgore3, Hideyuki

Takahashi4, ako!o "hnishi4, Jun Tomono#, $higehiko iyamo!o#,

Daisuke "magari%,&, Dong 'ook Kim1,2( and i!suko $eki%,&(

•1)&part"&nt o! har"acy, 9oll&g& o! har"acy, anyang =ni7&r%ity, 5n%an, outh *or&a

•2n%titut& o! har"acological >&%&arch, anyang =ni7&r%ity, 5n%an, outh *or&a

•3)&part"&nt o! har"acy ractic&, +ug&n& 5ppl&bau" 9oll&g& o! har"acy ? &alth ci&nc&%,

ayn& tat& =ni7&r%ity, )&troit, M, =5

•$)&part"&nt o! @act&riology , ational n%titut& o! n!&ctiou% )i%&a%&%, -oyo, Japan

•#*an&a, 9o., (td., %aa, Japan

•6ihon =ni7&r%ity chool o! )&nti%try, -oyo, Japan

•)&ntal >&%&arch 9&nt&r, ihon =ni7&r%ity chool o! )&nti%try, -oyo, Japan

& ha7& d&7&lop&d a no7&l Neisseria meningitidis %&rogroup'%p&ci!ic loop'

"&diat&d i%oth&r"al a"pli!ication (5M4 a%%ay !or %ix o! th& "o%t co""on"&ningococcal %&rogroup% 5, @, 9, , A, and B4. -h& a%%ay Ca% &7aluat&d u%ing

a %&t o! 31 "&ningococcal (5M a%%ay po%iti7& c&r&bro%pinal !luid 9F4

%p&ci"&n% !ro" 1#$ childr&n Cith %u%p&ct&d "&ningiti% id&nti!i&d in

pro%p&cti7& %ur7&illanc& b&tC&&n 18 and 2002 in Di&tna", 9hina, and *or&a.

ri"&r %p&ci!icity Ca% 7alidat&d u%ing 1# N. meningitidis %train% including

%&rogroup% 5, @, 9, +, , A, B, and E4 and 1 non' N. meningitidis %p&ci&%.

-h& N. meningitidis %&rogroup (5M d&t&ct&d doCn to t&n copi&% and 100

colony'!or"ing unit% p&r r&action. -C&nty'nin& 9F had N.meningitidis %&rogroup id&nti!i&d by (5M co"par&d Cith tCo 9F in Chich N.

meningitidis %&rogroup Ca% id&nti!i&d by cultur& and "ulti'locu% %&u&nc&

typing. -hi% i% th& !ir%t r&port o! a %&rogroup'%p&ci!ic id&nti!ication a%%ay !or N.

meningitidis u%ing th& (5M "&thod. ur r&%ult% %ugg&%t that thi% a%%ay Cill b&

a rapid, %&n%iti7&, and uniu&ly %&rogroup'%p&ci!ic a%%ay Cith pot&ntial !or

application in clinical laboratori&% and public h&alth %ur7&illanc& %y%t&"%.

http://frontiersin.org/people/u/302523http://frontiersin.org/people/u/302523http://frontiersin.org/people/u/303326http://frontiersin.org/people/u/303326http://frontiersin.org/people/u/255091http://frontiersin.org/people/u/255091http://frontiersin.org/people/u/257033http://frontiersin.org/people/u/302523http://frontiersin.org/people/u/303326http://frontiersin.org/people/u/303326http://frontiersin.org/people/u/255091http://frontiersin.org/people/u/257033


30/67

Introduction

Neisseria meningitidis i% a gra"'n&gati7& G'prot&obact&riu" and "&"b&r o! th&

bact&rial !a"ily &i%%&riac&a& t&ph&n% &t al., 2004. -h& "&ningococcal

poly%accharid& cap%ul& and out&r "&"bran& prot&in% ha7& b&&n id&nti!i&d a% N.meningitidis 7irul&nc& !actor% t&ph&n%, 2004. N. meningitidis i% principally

%ubdi7id&d into 12 %&rogroup% ba%&d on th& cap%ular poly%accharid& typ& 5, @, 9, +, ,

, *, (, , A, B, and E; arri%on &t al., 20134. Hlobally, th& "a


31/67

t&chniu&% do not p&r"it %&rogroup id&nti!ication 9hant&au &t al., 20064. -h&

diagno%i% o! N. meningitidisin7a%i7& di%&a%& by cultur& t&%ting r&uir&% a C&ll'&uipp&d

laboratory Cith appropriat& bio%a!&ty &uip"&nt and proc&dur&% @orroC &t al., 201$4.

n %o"& %&tting%, rapid i""unochro"atographic antig&n d&t&ction t&%ting ha% b&&n

appli&d !or d&t&ction o! N. meningitidis but th&%& a%%ay% ar& li"it&d by r&lati7&ly loCdiagno%tic %&n%iti7ity 9hant&au &t al., 20064. -raditional diagno%tic a%%ay% al%o ha7&

li"it&d utility in "any population% and h&alth %y%t&"% Ch&r& inappropriat& u%& o!

antibiotic% continu&% d&%pit& global incr&a%&% in antibiotic r&%i%tanc& (&7y and

Mar%hall, 200$4. n %uch %&tting%, d&t&ction o! N. meningitidis "ay b& probl&"atic du&

to inhibition o! bact&rial groCth du& to antibiotic% pr&%&nt in hu"an clinical %a"pl&%

(ax"inarayan &t al., 20134. n %uch ca%&%, i%olation o! bact&ria !ro" pati&nt%

c&r&bro%pinal !luid 9F4 i% ti"&'con%u"ing and "ay yi&ld littl& or no groCth.

Hi7&n th& g&ographic and t&"poral 7ariation% in "&ningococcal %train% cau%ing both

&pid&"ic and %poradic di%&a%&, th& %&rogroup id&nti!ication o! N. meningitidis to

id&nti!y circulating %&rogroup% i% i"portant a% a part o! di%&a%& control and %ur7&illanc&

progra"%. +!!ort% to i"pro7& diagno%tic% !or N. meningitidis ha7& includ&d

d&7&lop"&nt o! a rapid i""unochro"atographic a%%ay that u%&% "onoclonal

antibodi&% again%t poly%accharid&% !or id&nti!ication o! %&rogroup% 5, , 9, and B. =%&

o! thi% a%%ay ha% b&&n "o%t pro"in&nt in &nd&"ic r&gion% o! 5!rica 9hant&au &t al.,

20064. 5 nu"b&r o! 9>'ba%&d "&thod% ha7& b&&n d&7&lop&d to id&nti!y "a a%%ay% !or %&rogroup id&nti!ication

o! N. meningitidis ha7& b&&n d&7&lop&d Frai%i&r &t al., 200; Ehu &t al., 2012; )oyl&

and J&nni%on, 20134. oC&7&r, &uip"&nt r&uir&d !or con7&ntional and r&al'ti"&

9> a%%ay% i% r&lati7&ly &xp&n%i7&, and 9> "&thod% ar& co"pl&x to p&r!or" in

r&%ourc&'li"it&d laboratory %&tting% !ound in "any d&7&loping countri&% Ch&r& N.

meningitidis in!&ction% ha7& b&&n r&port&d.

-h& loop'"&diat&d i%oth&r"al a"pli!ication (5M4 "&thod oto"i &t al.,

2000, 201#4 o!!&r% an attracti7& alt&rnati7& to bact&rial culti7ation and 9>. -h& (5M

a%%ay u%&% !our di!!&r&nt pri"&r% to id&nti!y %ix di%tinct r&gion% on th& targ&t g&n&,

r&%ulting in a gr&at&r %p&ci!icity than con7&ntional 9>. 5dditional pri"&r% i.&., th&

loop pri"&r% d&%ignat&d (F and (@4 d&%ign&d to ann&al th& loop %tructur& in (5M can

b& u%&d to incr&a%& %&n%iti7ity and %p&ci!icity o! th& (5M r&action -o"ita &t al.,

20084. )uring th& (5M r&action, a %"all a"ount o! )5 can b& d&t&ct&d du& to th&

high a"pli!ication capacity o! th& a%%ay. n addition, th& (5M a%%ay do&% not r&uir&

th& u%& o! co"plicat&d proc&dur&%, &uip"&nt, or "achin&%. For th&%& r&a%on%, th&

(5M a%%ay i% con%id&r&d "or& rapid, &!!ici&nt, %i"pl&r, and "or& &cono"ical thanoth&r diagno%tic "&thod%.

http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B5http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B3http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B5http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B23http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B23http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B21http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B5http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B5http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B31http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B9http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B9http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B9http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B36http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B8http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B8http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B28http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B28http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B27http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B33http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B33http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B5http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B3http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B5http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B23http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B23http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B21http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B5http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B5http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B31http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B9http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B9http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B9http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B36http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B8http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B8http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B28http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B28http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B27http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B33http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B33


32/67

>&c&ntly, C& d&7&lop&d a (5M'ba%&d a%%ay (&& &t al., 201#4 that d&"on%trat&d high

%&n%iti7ity and %p&ci!icity !or N. meningitidis d&t&ction in 9F. n th& pr&%&nt %tudy, C&

r&port th& d&7&lop"&nt o! a (5M'ba%&d N. meningitidis %&rogroup id&nti!ication

a%%ay and th& &7aluation o! thi% a%%ay% ability to d&t&ct %p&ci!ic N.

meningitidis %&rogroup% in 9F. -hi% i% th& !ir%t r&port o! N. meningitidis %&rogroup'%p&ci!ic id&nti!ication u%ing th& (5M "&thod.

$ateria!s and $et"ods

@act&rial train%

-hi% %tudy u%&d 3# %tandard r&!&r&nc& %train%, including 1# N. meningitidis; %&rogroup%

5 B0001 and )14, @ B0002, $$/6, and )24, 9 B0003 and )34, +

)84, B0006 and )34, A B000$ and )$4, B B000# and )#4,

and E )64: nin& non'"&ningococcal Neisseria %p&ci&%; N. gonorrhoeae), N.

flavescens )10, N. denitrificans )11, N. elongata )12, N. canis )13, N.

cinerea )1$, N. lactamica )8#, N. mucosa )16, and N. sicca )1: and 10

oth&r bact&rial %train%; Streptococcus pneumoniae 5-99 $61, Staphylococcus

aureus 5-99 2212, Klebsiella pneumoniae 5-99 00603, K. oxytoca 5-99

0032$, Pseudomonas aeruginosa 5-99 28#3, Escherichia coli 5-99

2#22, Enterococcus faecalis 5-99 0032$, Mycobacterium tuberculosis 5-99

22$, and aemophilus influen!ae 5-99 00 and )8$ (&& &t al., 201#;

uppl&"&ntal Mat&rial%, -abl& 14.

TABLE 1

TA)LE *+ Loop#%ediated isot"er%a! a%p!i&ication ,LA$P- pri%er sets &or

sero'roup identi&ication o& N. meningitidis.

For th& d&t&ction li"it %tudy; C& u%&d %ix N. meningitidis %train%; %&rogroup% 5

B00014, @ B00024, 9 B00034, B00064, A B000$4, and B B000#4.

@act&rial colony !or"ing unit 9F=4 Ca% d&t&r"in&d a% !olloC%: bact&ria C&r&

inoculat&d on chocolat& agar cultur& plat& @&cton, )icin%on ? 9o., Franlin (a&%,

J, =54 and !urth&r incubat&d in #K 92 at 3L9 !or 2$ h. -h& bact&ria C&r& coll&ct&d

http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T1


33/67

in 1 "l @ and 9F=% C&r& d&t&r"in&d by %&rial dilution% o! cultur& %u%p&n%ion%

inoculat&d on chocolat& agar plat&.

r&paration o! 9hro"o%o"al )5

H&no"ic )5 Ca% &xtract&d !ro" th& 3# %tandard r&!&r&nc& %train% by th& ph&nol'

chloro!or" "&thod (&& &t al., 201#4. For d&t&ction li"it analy%i%, g&no"ic )5%

!ro" N. meningitidis %&rogroup% 5 B00014, @ B00024, 9 B00034, B00064,

A B000$4, and B B000#4 C&r& u%&d, and th& conc&ntration Ca% d&t&r"in&d u%ing

a ano)rop 1000 -h&r"o Fi%h&r ci&nti!ic, nc., altha", M5, =54. 5pproxi"at&ly

2.# !g/2 l o! a )5 t&"plat& Ca% ta&n a% on& copy o! th& N. meningitidis g&no"& p&r

r&action, ba%&d on th& g&no"& o! N. meningitidis %&rogroup @ %train M9#8 Nacc&%%ion

nu"b&r 5+00208; 2223#1 bp -&tt&lin &t al., 20004O. -o a%c&rtain th& d&t&ction li"it

o! th& (5M a%%ay, %&rial 10'!old dilution% o! th& g&no"ic )5 C&r& t&%t&d in &ach(5M r&action, and th& r&%ult% C&r& co"par&d Cith tho%& o! &ach cultur& t&%t a%

d&%crib&d pr&7iou%ly *i" &t al., 2012b4.

For th& d&t&ction li"it %tudy, triplicat& (5M t&%ting Ca% p&r!or"&d u%ing 10'!old

dilution% o! g&no"ic )5. -Co t&chnician% t&%t&d th& %a"& %a"pl&% ind&p&nd&ntly to

con!ir" th& r&producibility o! (5M r&%ult% a% d&%crib&d pr&7iou%ly *i" &t al.,

2012a; (&& &t al., 201#4.

(5M ri"&r )&%ign

=%ing ri"&r+xplor&r D$ %o!tCar&1, C& d&%ign&d %ix %&rogroup id&nti!ication (5M

pri"&r %&t% -abl& 14 targ&ting th& g&no"& %&u&nc& o! &ach %&rogroup'%p&ci!ic g&n&

id&nti!i&d -aha &t al., 200#; Frai%i&r &t al., 2004: sac" H&n@an acc&%%ion nu"b&r

F>$0$84 !or %&rogroup 5, siaD H&n@an acc&%%ion nu"b&r 9002$2$4 !or

%&rogroup @, siaD H&n@an acc&%%ion nu"b&r 5M$218084 !or %&rogroup

9, syn# H&n@an acc&%%ion nu"b&r 5B23$14 !or %&rogroup , ctr$ H&n@an

acc&%%ion nu"b&r 5B28314 !or %&rogroup A, and synF H&n@an acc&%%ion nu"b&r

5B23$2014!or %&rogroup B.

)u& to a high l&7&l o! %&u&nc& id&ntity b&tC&&n synF and syn# g&n&% Ehu &t al.,

2012; )oyl& and J&nni%on, 20134, C& u%&d th& (5M "&thod along Cith an

a"pli!ication r&!ractory "utation %y%t&" 5>M; &Cton &t al., 18; &da &t al.,

2004 to d&t&ct th& %p&ci!ic %&u&nc&% o! synF -abl& 14. -h& 5>M u%&% uniu&ly

d&%ign&d pri"&r% that &nabl& d&t&ction o! "utation% &Cton &t al., 184. 5% a targ&t

o! th& pr&%&nt in7&%tigation, C& cho%& tCo %p&ci!ic %&u&nc&% o! th& %&rogroup

B synF g&n&. @a%&d on th& principl& o! 5>M, on& o! th& tCo %p&ci!ic %&u&nc&% Ca%

d&%ign&d in th& #P &nd o! th& @ pri"&r, and th& oth&r Ca% d&%ign&d in th& %&cond%&u&nc& o! th& #P &nd o! th& F pri"&r -abl& 14. & th&n add&d on& "utation in th&

http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B32http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B16http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B15http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B15http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#note1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B31http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B9http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B9http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B36http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B36http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B8http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B26http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B12http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B12http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B12http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B26http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B32http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B16http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B15http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B15http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#note1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B31http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B9http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B36http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B36http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B8http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B26http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B12http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B12http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B26http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T1


34/67

third %&u&nc& o! th& #P &nd o! th& @ pri"&r !ro" H to 94, and an additional

"utation in th& !ourth %&u&nc& o! th& #P &nd o! th& F pri"&r !ro" 9 to H4.

(5M and 9> >&action%

-h& (5M r&action Ca% p&r!or"&d Cith 2# l o! a "ixtur& containing 1.6 M &ach o!

pri"&r% F and @, 0.2 M o! pri"&r% F3 and @3, 0.$ M o! pri"&r% (F and (@, 8 =

o! th& "st )5 poly"&ra%& larg& !rag"&nt &C +ngland @iolab%, p%Cich, M5, =54,

1.$ "M &ach o! th& !our d&oxynucl&o%id& tripho%phat&%, 0.8 M b&tain&, 20 "M -ri%'

9l p 8.84, 10 "M *9l, 10 "M $42$, 8 "M Mg$, 0.1K -C&&n 20, and 2 l o!

t&"plat&. -h& high'p&r!or"anc& liuid chro"atography'puri!i&d pri"&r% C&r&

di%%ol7&d in -ri%'+)-5 bu!!&r. -h& "ixtur& Ca% incubat&d at 63Q6#L9 -abl& 14 !or 60

"in and th&n h&at&d at 80L9 !or 2 "in to t&r"inat& th& r&action. For th& d&t&ction

li"it %tudy, 9> Ca% p&r!or"&d a% d&%crib&d pr&7iou%ly Frai%i&r &t al., 2004.

5naly%i% o! (5M roduct%

Neisseria meningitidis %&rogroup d&t&ction Ca% ob%&r7&d by th& 7i%ual in%p&ction

ba%&d on it% g&n&ration o! turbidity proportional to th& a"ount o! a"pli!i&d )5 Mori

&t al., 200$; (&& &t al., 201#4. 5 (oopa"p r&al'ti"& turbidi"&t&r (5'200 r&al'ti"&

turbidi"&t&r; +i&n 9h&"ical, 9o., (td., -oyo, Japan4 Ca% u%&d to "onitor th&

turbidity in th& r&action tub& in r&al'ti"& by r&ading th& )6#0 &7&ry 6 %. 5ccording to

th& "anu!actur&r% protocol Mori &t al., 200$4, C& u%&d th& application %o!tCar& !or

th& turbidi"&t&r to obtain th& a"pli!ication ti"& r&uir&d to &xc&&d a turbidity l&7&l o!

0.1 %t 4. For th& d&t&ction li"it and %p&ci!icity %tudy, C& al%o u%&d &l&ctrophor&tic

analy%i% and a colori"&tric 7i%ual in%p&ction dy&, (&uco 9ry%tal Diol&t (9D; )'Ruic;

*an&a, 9o., (td., %aa, Japan; Miya"oto &t al., 201#4. (9D Ca% dri&d doCn in th&

cap% o! th& r&action tub&%. 5!t&r r&action% C&r& co"pl&t&d, th& (5M a"plicon% C&r&

"ix&d by in7&rting th& tub&%, and chang&% in color C&r& ob%&r7&d to obtain t&%t r&%ult%

n&gati7&, r&"ain&d colorl&%%; po%iti7&, color chang& to blu&: Figur& 14.

FIGURE 1

(IG.RE *+ /isua! inspection o& dye#%ediated %onitorin' o& t"e N.

meningitidis sero'roup#speci&ic !oop#%ediated isot"er%a! a%p!i&ication

,LA$P- assay+ -h& original colorl&%% app&aranc& o! th& 7i%ual in%p&ction dy&

http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B9http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B25http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B25http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B25http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B24http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B24http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#F1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#F1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B9http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B25http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B25http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B25http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B24http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#F1


35/67

*an&a, 9o., (td., %aa, Japan4 chang&d to blu& i! th& r&action Ca% po%iti7&; i!

r&action Ca% n&gati7&, th& dy& r&"ain&d colorl&%%. 54, >&%ult% o! N.

meningitidis %&rogroup 5'(5M a%%ay. @4, >&%ult% o! N. meningitidis %&rogroup @'

(5M a%%ay. 94, >&%ult% o! N. meningitidis %&rogroup 9'(5M a%%ay. 4, >&%ult%

o! N. meningitidis %&rogroup '(5M a%%ay. A4, >&%ult% o! N. meningitidis %&rogroupA'(5M a%%ay. B4, >&%ult% o! N. meningitidis %&rogroup B'(5M a%%ay. 9, n&gati7&

control.

-o 7&ri!y th& %tructur& o! (5M a"pli!i&d product%, th& a"pli!i&d (5M product% C&r&

%&u&nc&d u%ing a @ig)y& -&r"inator 7. 3.1 cycl& %&u&ncing it 5ppli&d @io%y%t&"%,

Fo%t&r 9ity, 95, =54 and an 5@ >M 3 )5 %&u&nc&r 5ppli&d @io%y%t&"%4

according to th& "anu!actur&r% in%truction% *i" &t al., 2012a; (&& &t al., 201#4. -h&

targ&t r&gion Ca% b&tC&&n F2 and @2, and th& pri"&r %&u&nc&% C&r& !ro" th& F2 and

@2 r&gion%.

9linical 9F p&ci"&n%

9hildr&n Cith %u%p&ct&d "&ningiti% Cho C&r& l&%% than # y&ar% o! ag& C&r&

pro%p&cti7&ly &nroll&d at th& participating ho%pital% b&tC&&n 18 and 2002 *i" &t al.,

2012b4. 9F Ca% %tr&a&d on co""&rcial blood agar cultur& "&diu" @&cton,

)icin%on ? 9o., Franlin (a&%, J, =54, incubat&d in #K 92 at 3L9 !or 3 day%, and

ch&c&d daily !or bact&rial groCth *i" &t al., 2012b4. %olat&% C&r& id&nti!i&d u%ing

%tandard "icrobiological crit&ria %&nb&rg, 184. -h& &%tabli%h&d "ulti'locu%%&u&nc& typing M(-4 %ch&"&2 !or Neisseria %p. Ca% u%&d !or !urth&r g&notyp&

id&nti!ication.

5% d&%crib&d pr&7iou%ly *i" &t al., 2012a; (&& &t al., 201#4, to &xtract bact&rial )5,

9F %p&ci"&n% C&r& h&at&d at #L9 !or 3 "in and c&ntri!ug&d at 13,000 S g !or # "in.

-h& %a"pl&% C&r& %tor&d at '80L9. -Co "icrolit&r% o! th& %up&rnatant C&r& u%&d !or

(5M a%%ay%. n th& pr&7iou% %tudy (&& &t al., 201#4, C& had t&%t&d 1,#$ rando"ly

%&l&ct&d 9F %p&ci"&n% in *or&a n T $04, 9hina n T #364, and Di&tna" n T #684

u%ing th& "'(5M a%%ay targ&ting %p&ci!ic %&u&nc&% o! N. meningitidis ctr$ g&n&. nthi% %tudy, C& &7aluat&d th& %&rogroup id&nti!ication (5M a%%ay u%ing th& %&t o! 31

"'(5M po%iti7& 9F %p&ci"&n%.

+thic% tat&"&nt

& utiliI&d 9F %p&ci"&n% pr&%&r7&d !ro" our pr&7iou% %ur7&illanc& %tudy *&nn&dy &t

al., 2004. 5ll 9F %p&ci"&n% utiliI&d in thi% %tudy C&r& d&'id&nti!i&d prior to

laboratory proc&%%ing and analy%i%. +thical appro7al% !or pati&nt %p&ci"&n coll&ction

during %ur7&illanc& C&r& obtain&d !ro" th& !olloCing &thic% r&7i&C co""itt&&%: th&n%titutional >&7i&C @oard o! nt&rnational Daccin& n%titut&, &oul, *or&a; th&

http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B15http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B16http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B16http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B16http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B13http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#note2http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B15http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B14http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B14http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B15http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B16http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B16http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B16http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B13http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#note2http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B15http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B14http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B14


36/67


37/67

(5M 5ppli&d to 5naly%i% o! 9linical 9F p&ci"&n%

5 group o! 31 noCn "'(5M'po%iti7& %p&ci"&n% (&& &t al., 201#4 C&r& al%o

analyI&d by N. meningitidis%&rogroup'%p&ci!ic (5M t&%t%. -h& (5M a%%ay

id&nti!i&d N. meningitidis %&rogroup !or 2 o! th& 31 N. meningitidis'po%iti7& 9F%p&ci"&n% -abl& 34. =%ing a no7&l (5M a%%ay ba%&d on th& 5>M principl&, C&

%ucc&&d&d in di!!&r&ntiating N. meningitidis %&rogroup B !ro" N.

meningitidis %&rogroup Figur& 14. Fi7& %&rogroup 5 #/31, 16.1K4, !i7& %&rogroup @

#/31, 16.1K4, thr&& %&rogroup 9 3/31, .K4, !i7& %&rogroup A #/31, 16.1K4, !i7&

%&rogroup B #/31, 16.1K4, and %ix %&rogroup 6/31, 1.$K4 %p&ci"&n% C&r&

id&nti!i&d. -Co %a"pl&% C&r& non'typabl& !or N. meningitidis 2/31, 6.#K4. +ach

%&rogroup'%p&ci!ic (5M'a"pli!i&d product Ca% con!ir"&d by %&u&ncing, and th&

%&u&nc& r&%ult% C&r& id&ntical to th& r&!&r&nc& %&u&nc&%.

TABLE 3

TA)LE 2+ Resu!ts o& t"e sero'roup#speci&ic LA$P assay o& 2* CS( sa%p!es

o& N. meningitidisctrA positive+

n th& pr&7iou% %tudy *&nn&dy &t al., 2004, thr&& N. meningitidis cultur&'po%iti7&

3/31, .K4 C&r& con!ir"&d and tCo o! th& thr&& %p&ci"&n% C&r& %&rogroup @ po%iti7&

u%ing M(- -abl& 34. -h& M(- %ch&"& and databa%& o! Neisseria %p. ar& C&ll'

&%tabli%h&d and publically a7ailabl& at http://pub"l%t.org/n&i%%&ria/. -h& M(-

%ch&"& and "&thod% pr&7iou%ly d&%crib&d C&r& appli&d to th& N. meningitidis i%olat&%.

&7&n M(- loci C&r& a"pli!i&d by u%ing 9> pri"&r% and th& )5 %&u&nc&% o! &ach

locu% C&r& co"par&d to th& %a"& locu% !ro" th& databa%&. -Co %&rogroup @ N.

meningitidis i%olat&% contain&d an all&l& typ& 1$0, #, , 13, 1#, 3$, 16# in th&

ord&r abc&' ad(' aroE' fum)' gdh' pdh) , and pgm4, Chich ha% b&&n d&%ignat&d a%

%&u&nc& typ& 1#6 -1#64.

9o"par&d to th& cultur& "&thod, th& %&n%iti7ity and %p&ci!icity o! th& N.

meningitidis %&rogroup @ (5M a%%ay C&r& 100K 2/24 and 8.K 26/24.

1iscussion

-h& no7&l N. meningitidis %&rogroup'%p&ci!ic (5M a%%ay r&port&d h&r& d&"on%trat&d

high d&t&ction rat&% a% C&ll a% high t&%t %p&ci!icity and %&n%iti7ity. -h&%& high&r

d&t&ction rat&% !ound Cith th& (5M a%%ay co"par&d Cith con7&ntional 9> i%

con%i%t&nt Cith pr&7iou% %tudi&% o! (5M a%%ay% *i" &t al., 2011, 2012a4. -h& robu%t

p&r!or"anc& o! th& (5M a%%ay i% "ad& po%%ibl& by th& u%& o! !our di!!&r&nt pri"&r% to

http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T3http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T3http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#F1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#F1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B14http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T3http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T3http://pubmlst.org/neisseria/http://pubmlst.org/neisseria/http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B17http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B15http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B15http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B22http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T3http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#F1http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B14http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#T3http://pubmlst.org/neisseria/http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B17http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B15


38/67

id&nti!y %ix di%tinct r&gion% on th& targ&t g&n&. -h& d&%ign o! our pri"&r% !or th& a%%ay

d&%crib&d h&r& ar& uniu& and &nabl& cl&ar di!!&r&ntiation b&tC&&n %ix "a


39/67

meningitidis %&rogroup'%p&ci!ic (5M 10 or 100 copi&%4 a%%ay%. th&r po%%ibl&

&xplanation% !or th& ob%&r7ation o! non'typabl& %train% includ& th& d&gradation o! )5

"at&rial in %tor&d %p&ci"&n% a% C&ll a% th& pr&%&nc& o! N. meningitidis %&rogroup% not

co7&r&d by d&%ign&d (5M a%%ay%.

n %&tting% o! "any d&7&loping countri&% Ch&r& &"piric u%& o! broad'%p&ctru"

antibiotic% i% co""on, con7&ntional bact&rial cultur& "&thod% ha7& loC yi&ld and ar&

li&ly to und&r&%ti"at& th& tru& burd&n o! N. meningitidis %&rogroup%. )uring th&

original pro%p&cti7& %ur7&illanc& %tudi&%, !i&ld %ur7&y% %hoC&d that o7&r'th&'count&r

u%& o! antibiotic% Cithout a pr&%cription Ca% co""on in &ach country *i" &t al.,

2012b4. -hu%, to b&tt&r und&r%tand th& &pid&"iology bact&rial "&ningiti% pathog&n%

%uch a% N. meningitidis, th& "&ningococcal %&rogroup'%p&ci!ic (5M o!!&r% an accurat&

alt&rnati7& diagno%tic t&%t. ur r&%ult% %ugg&%t that th& "&ningococcal %&rogroup (5M

"ay pro7id& a u%&!ul tool in ar&a% Ch&r& public h&alth ag&nci&% Ci%h to "&a%ur& th&

burd&n o! N. meningitidis !olloCing introduction o! "&ningococcal 7accin&%.

@a%&d on our &xp&ri&nc& in thi% %tudy, th& N. meningitidis %&rogroup'%p&ci!ic (5M

a%%ay Ca% &a%y to %&t'up and r&uir&d no %p&cial &uip"&nt. n addition, thi% (5M

a%%ay pro7id&% high'uality t&%t r&%ult% Cithin 2 h that "a& it !&a%ibl& and co%t'

&!!&cti7& !or u%&. Hi7&n th& %i"pl& !or"at !or th& (5M a%%ay, thi% t&%t al%o ha%

pot&ntial !or p&r!or"anc& in di%trict'l&7&l h&alth !aciliti&% in d&7&loping countri&%. -o

con!ir" th& (5M a%%ay p&r!or"anc& charact&ri%tic% co"par&d Cith bact&rial cultur&,

antig&n d&t&ction and 9>, !urth&r &7aluation o! th& N. meningitidis %&rogroup

id&nti!ication (5M in pro%p&cti7& %tudi&% ar& noC plann&d.

Aut"or Contriutions

*, -, M, )*, M, contribut&d th& conc&ption o! thi% %tudy; M, J-, )*, M

d&%ign&d th& &xp&ri"&nt%; )(, +*, M, )*, M, ) p&r!or"&d th& &xp&ri"&nt%; *,

-, M acuir&d %a"pl&%; )(, +*, J-, M, ), *, )*, M analyI&d data; )(, +*,

J-, M, ), *, )*, M int&rpr&t&d data; )(, +*, *, -, )*, M dra!t&d th&

"anu%cript; and ), M, M, J- appro7&d th& "anu%cript.

(undin'

-hi% Cor Ca% %upport&d by Japan oci&ty !or th& ro"otion o! ci&nc& J4

*5*+ Hrant u"b&r 1020100$, th& grant 201#>15252501002 !ro" ational

>&%&arch Foundation >F4 o! *or&a, and th& J and >F und&r th& Japan Q *or&a

@a%ic ci&nti!ic 9oop&ration rogra" >F'201$*2525$001$804.

http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B16http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B16http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B16http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01548/full#B16


40/67

Con&!ict o& Interest State%ent

Mit%uo &i ha% r&c&i7&d r&%&arch grant !unding !ro" *an&a, 9o., (td. Jun -o"ono

and hig&hio Miya"oto ar& &"ploy&&% o! *an&a, 9o., (td. aul +. *ilgor& %&r7&% on

"&ningococcal 7accin& %p&a&r% bur&au !or !iI&r, nc. -h& !olloCing author% ha7& nocon!lict o! int&r&%t% or !inancial di%clo%ur&% to d&clar&: )o*yung (&&, +un Jin *i",

id&yui -aaha%hi, Maoto hni%hi, and )ongoo *i". -h&%& %tat&"&nt% do not

alt&r our adh&r&nc& to th&


41/67

ubM&d 5b%tract | 9ro%%>&! Full -&xt | Hoogl& cholar

9hant&au, ., )art&7&ll&, ., Maha"an&, 5. +., )., +dCard%'Jon&%, D., Fox, 5. J., and *acI"ar%i,

+. @. 20014. i"ultan&ou% d&t&ction o! Neisseria meningitidis, aemophilus

influen!ae, and Streptococcus pneumoniae in %u%p&ct&d ca%&% o! "&ningiti% and

%&ptic&"ia u%ing r&al'ti"& 9>. ,. )lin. Microbiol. 3, 1##3Q1##8. doi:

10.1128/J9M.3.$.1##3'1##8.2001


)oyl&, 9. J., and J&nni%on, 5. D. 20134. o7&l r&al'ti"& poly"&ra%& chain r&action% !or

%&rogroup %p&ci!ic g&n& d&t&ction o! Neisseria meningitidis %&rogroup% @, 9, '13# and

B. ,. Microbiol. Methods $, 83Q8#. doi: 10.1016/&! Full -&xt | Hoogl& cholar

Frai%i&r, 9., tor, >., -&n&bray, @., an%on, B., and icola%, . 2004. =%& o! a n&C

%ingl& "ultipl&x 9>'ba%&d a%%ay !or dir&ct %i"ultan&ou% charact&riIation o!

%ix Neisseria meningitidis %&rogroup%. ,. )lin. Microbiol. $, 2662Q2666. doi:

10.1128/J9M.02$1#'08


arri%on, (. ., -rott&r, 9. (., and >a"%ay, M. +. 2004. Hlobal &pid&"iology o!

"&ningococcal di%&a%&. *accine 2uppl. 24, @#1Q@63. doi:

10.1016/&! Full -&xt | Hoogl& cholar

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=19477053http://dx.doi.org/10.1016/j.vaccine.2009.04.067http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=Meningococcal+C+conjugate+vaccine%3A+the+experience+in+England+and+Wales.&journal=Vaccine&author=Campbell+H.&author=Borrow+R.&author=Salisbury+D.&author=and+Miller+E.&publication_year=2009&pages=B20-B29http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=16953658http://dx.doi.org/10.1371/journal.pmed.0030337http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=New+rapid+diagnostic+tests+for+Neisseria+meningitidis+serogroups+A%2C+W135%2C+C%2C+and+Y.&journal=PLoS+Med.&author=Chanteau+S.&author=Dartevelle+S.&author=Mahamane+A.++E.&author=Djibo+S.&author=Boisier+P.&author=and+Nato+F.&publication_year=2006http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=17585655http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=%5BSurveillance+of+Neisseria+meningitidis+in+Argentina%2C+1993-2005%3A+distribution+of+serogroups%2C+serotypes+and+serosubtypes+isolated+from+invasive+disease%5D.&journal=Rev.++Argent.+Microbiol.&author=Chiavetta+L.&author=Chavez+E.&author=Ruzic+A.&author=Mollerach+M.&author=and+Regueira+M.&publication_year=2007&volume=39&pages=21-27http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=11283086http://dx.doi.org/10.1128/JCM.39.4.1553-1558.2001http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=Simultaneous+detection+of+Neisseria+meningitidis%2C+Haemophilus+influenzae%2C+and+Streptococcus+pneumoniae+in+suspected+cases+of+meningitis+and+septicemia+using+real-time+PCR.&journal=J.+Clin.+Microbiol.&author=Corless+C.+E.&author=Guiver+M.&author=Borrow+R.&author=Edwards-Jones+V.&author=Fox+A.+J.&author=and+Kaczmarski+E.+B.&publication_year=2001&volume=39&pages=1553-1558http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=23657053http://dx.doi.org/10.1016/j.mimet.2013.04.011http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=Novel+real-time+polymerase+chain+reactions+for+serogroup+specific+gene+detection+of+Neisseria+meningitidis+serogroups+B%2C+C%2C+W-135+and+Y.&journal=J.++Microbiol.++Methods&author=Doyle+C.++J.&author=and+Jennison+A.++V.&publication_year=2013&volume=94&pages=83-85http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=19553584http://dx.doi.org/10.1128/JCM.02415-08http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=Use+of+a+new+single+multiplex+PCR-based+assay+for+direct+simultaneous+characterization+of+six+Neisseria+meningitidis+serogroups.&journal=J.+Clin.+Microbiol.&author=Fraisier+C.&author=Stor+R.&author=Tenebray+B.&author=Sanson+Y.&author=and+Nicolas+P.&publication_year=2009&volume=47&pages=2662-2666http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=19477562http://dx.doi.org/10.1016/j.vaccine.2009.04.063http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=Global+epidemiology+of+meningococcal+disease.&journal=Vaccine&author=Harrison+L.++H.&author=Trotter+C.++L.&author=and+Ramsay+M.++E.&publication_year=2009&pages=B51-B63http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=19477053http://dx.doi.org/10.1016/j.vaccine.2009.04.067http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=Meningococcal+C+conjugate+vaccine%3A+the+experience+in+England+and+Wales.&journal=Vaccine&author=Campbell+H.&author=Borrow+R.&author=Salisbury+D.&author=and+Miller+E.&publication_year=2009&pages=B20-B29http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=16953658http://dx.doi.org/10.1371/journal.pmed.0030337http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=New+rapid+diagnostic+tests+for+Neisseria+meningitidis+serogroups+A%2C+W135%2C+C%2C+and+Y.&journal=PLoS+Med.&author=Chanteau+S.&author=Dartevelle+S.&author=Mahamane+A.++E.&author=Djibo+S.&author=Boisier+P.&author=and+Nato+F.&publication_year=2006http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=17585655http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=%5BSurveillance+of+Neisseria+meningitidis+in+Argentina%2C+1993-2005%3A+distribution+of+serogroups%2C+serotypes+and+serosubtypes+isolated+from+invasive+disease%5D.&journal=Rev.++Argent.+Microbiol.&author=Chiavetta+L.&author=Chavez+E.&author=Ruzic+A.&author=Mollerach+M.&author=and+Regueira+M.&publication_year=2007&volume=39&pages=21-27http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=11283086http://dx.doi.org/10.1128/JCM.39.4.1553-1558.2001http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=Simultaneous+detection+of+Neisseria+meningitidis%2C+Haemophilus+influenzae%2C+and+Streptococcus+pneumoniae+in+suspected+cases+of+meningitis+and+septicemia+using+real-time+PCR.&journal=J.+Clin.+Microbiol.&author=Corless+C.+E.&author=Guiver+M.&author=Borrow+R.&author=Edwards-Jones+V.&author=Fox+A.+J.&author=and+Kaczmarski+E.+B.&publication_year=2001&volume=39&pages=1553-1558http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=23657053http://dx.doi.org/10.1016/j.mimet.2013.04.011http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=Novel+real-time+polymerase+chain+reactions+for+serogroup+specific+gene+detection+of+Neisseria+meningitidis+serogroups+B%2C+C%2C+W-135+and+Y.&journal=J.++Microbiol.++Methods&author=Doyle+C.++J.&author=and+Jennison+A.++V.&publication_year=2013&volume=94&pages=83-85http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=19553584http://dx.doi.org/10.1128/JCM.02415-08http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=Use+of+a+new+single+multiplex+PCR-based+assay+for+direct+simultaneous+characterization+of+six+Neisseria+meningitidis+serogroups.&journal=J.+Clin.+Microbiol.&author=Fraisier+C.&author=Stor+R.&author=Tenebray+B.&author=Sanson+Y.&author=and+Nicolas+P.&publication_year=2009&volume=47&pages=2662-2666http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=19477562http://dx.doi.org/10.1016/j.vaccine.2009.04.063http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=Global+epidemiology+of+meningococcal+disease.&journal=Vaccine&author=Harrison+L.++H.&author=Trotter+C.++L.&author=and+Ramsay+M.++E.&publication_year=2009&pages=B51-B63


42/67

arri%on, . @., 9lau%, ., Jiang, B., @&nn&tt, J. ., @ratch&r, . @., Joll&y, *. 5., &t al.

20134. )&%cription and no"&nclatur& o! Neisseria meningitidis cap%ul& locu%. Emerg.

+nfect. Dis. 1, #66Q#3. doi: 10.3201/&id10$.111


&da, ., -aab&, *., nagai, M., Funao%hi, ., and uIui, *. 2004. )&t&ction o!

g&n& point "utation in para!!in %&ction% u%ing in %itu loop'"&diat&d i%oth&r"al

a"pli!ication. Pathol. +nt. #, #$Q#. doi: 10.1111/&! Full -&xt | Hoogl& cholar

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=23628376http://dx.doi.org/10.3201/eid1904.111799http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=Description+and+nomenclature+of+Neisseria+meningitidis+capsule+locus.&journal=Emerg.+Infect.+Dis.&author=Harrison+O.+B.&author=Claus+H.&author=Jiang+Y.&author=Bennett+J.+S.&author=Bratcher+H.+B.&author=Jolley+K.+A.&publication_year=2013&volume=19&pages=566-573http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=17685931http://dx.doi.org/10.1111/j.1440-1827.2007.02144.xhttp://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=Detection+of+gene+point+mutation+in+paraffin+sections+using+in+situ+loop-mediated+isothermal+amplification.&journal=Pathol.++Int.&author=Ikeda+S.&author=Takabe+K.&author=Inagaki+M.&author=Funakoshi+N.&author=and+Suzuki+K.&publication_year=2007&volume=57&pages=594-599http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=Essential+Procedures+for+Clinical+Microbiology.&author=Isenberg+H.++D.&publication_year=1998http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=17274856http://dx.doi.org/10.1017/S0950268806007734http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=Incidence+of+bacterial+meningitis+in+Asia+using+enhanced+CSF+testing%3A+polymerase+chain+reaction%2C+latex+agglutination+and+culture.&journal=Epidemiol.++Infect.&author=Kennedy+W.+A.&author=Chang+S.+J.&author=Purdy+K.&author=Le+T.&author=Kilgore+P.+E.&author=Kim+J.++S.&publication_year=2007&volume=135&pages=1217-1226http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=22900070http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0042954http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=The+enhanced+pneumococcal+LAMP+assay%3A+a+clinical+tool+for+the+diagnosis+of+meningitis+due+to+Streptococcus+pneumoniae.&journal=PLoS+ONE&author=Kim+D.+W.&author=Kilgore+P.+E.&author=Kim+E.+J.&author=Kim+S.+A.&author=Anh+D.+D.&author=Dong+B.++Q.&publication_year=2012ahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=23164061http://dx.doi.org/10.1186/1471-2334-12-310http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=An+expanded+age+range+for+meningococcal+meningitis%3A+molecular+diagnostic+evidence+from+population-based+surveillance+in+Asia.&journal=BMC+Infect.++Dis.&author=Kim+S.+A.&author=Kim+D.+W.&author=Dong+B.+Q.&author=Kim+J.+S.&author=Anh+D.+D.&author=and+Kilgore+P.++E.&publication_year=2012bhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=21832019http://dx.doi.org/10.1128/JCM.00515-11http://scholar.google.com/scholar_lookup?&title=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+to+detect+Haemophilus+influenzae+type+b+in+cerebrospinal+fluid.&journal=J.+Clin.+Microbiol.&author=Kim+D.+W.&author=Kilgore+P.+E.&author=Kim+E.+J.&author=Kim+S.+A.&author=Anh+D.+D.&author=and+Seki+M.&publication_year=2011&volume=49&pages=3621-3626http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=236

Técnica de Amplificación Isotérmica de Ácidos Nucleicos Tipo LAM1

Documents

Transcript of Técnica de Amplificación Isotérmica de Ácidos Nucleicos Tipo LAM1