Técnica Básicas para Análises de Células e Visão ... · 3 Microscópio eletrônico-utiliza...
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Técnica Básicas para Análises de Células e Tecidos Algumas grandezas...Algumas grandezas...Algumas grandezas...Algumas grandezas...
1km 1km 1km 1km →→→→ 1.000m1.000m1.000m1.000m
1m 1m 1m 1m →→→→ 100 cm 100 cm 100 cm 100 cm
1cm 1cm 1cm 1cm →→→→ 10 mm10 mm10 mm10 mm
1mm 1mm 1mm 1mm →→→→ 1000 1000 1000 1000 µµµµmmmm
1 1 1 1 µµµµm m m m →→→→ 1000 1000 1000 1000 nmnmnmnm
1111ÅÅÅÅ ((((AngstronAngstronAngstronAngstron)))) →→→→ 10101010----10101010mmmm
Visão panorâmica da célula
Visão panorâmica da célula
Aumento e Poder de Resolução
Resolução: menor distância para que duas partículas apareçam como objetos separados.
O limite de resolução da Microscopia Óptica é de 0,2 µm
Visão panorâmica da célula
Desenvolvimento da Microscopia
-Microscópio Óptico (luz)-Microscópio Eletrônico (elétrons)
Microscópio óptico – utiliza feixes de luz
Desenvolvimento da Microscopia
Sistemas de lentes (condensador, objetiva e ocular)
O limite de resolução do MO é de 0,2 µm e depende essencialmente da objetiva.
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Microscópio óptico
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio óptico de campo claro
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio óptico de fluorescência
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio óptico de fluorescência
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio óptico confocal
Desenvolvimento da Microscopia
Outros tipos de microscópios ópticos
Desenvolvimento da Microscopia
Iluminação direta (sem coloração)
Contraste de fase (refração da luz)
Contraste diferencial de interferência (refração da luz)
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Microscópio eletrônico-utiliza feixes de elétrons-lentes eletromagnéticas
Desenvolvimento da Microscopia
→Alta resolução, abaixo de 0,3 nm.→Material biológico é impregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio
Microscópio eletrônico de transmissão:
Desenvolvimento da Microscopia
Estrutura e funcionamento
→ Alta resolução→ Necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm)→ Material biológico éimpregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio→ Imagem elétron-densa (escura) e elétron-lúcida (clara)
Microscópio eletrônico de transmissão
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio eletrônico de varredura
Desenvolvimento da Microscopia
→ Alta resolução→ Fragmentos maiores ou tecidos inteiros→ Material biológico é recoberto com metais como ouro ou platina→ Estrutura tridimensional (3D)
Microscópio eletrônico de varredura
Desenvolvimento da Microscopia MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Microscópio eletrônico de varredura
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Centro de Microscopia Eletrônica
UNESP - Botucatu
MEVMET
Preparação de material para análise ao microscópio
As células e tecidos precisam estar perfeitamente preservados, apresentando a mesma estrutura e composição química que possuíam quando vivas.
Preparação de material para análise ao microscópio
FixaFixaFixaFixaççççãoãoãoão – Preserva a morfologia e composição do tecido. Fixador mais utilizado → Formaldeído. Para microscopia eletrônica (ME) os tecidos necessitam de tratamentos especiais em soluções de aldeído glutárico e tetróxido de ósmio.
Preparação de material para análise ao microscópio
LavagemLavagemLavagemLavagem
Preparação de material para análise ao microscópio
DesidrataDesidrataDesidrataDesidrataççççãoãoãoão – Retirada da água presente nos tecidos através de sucessivos banhos em uma série de etanol (70%→80%→90%→100%).
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Preparação de material para análise ao microscópio
DiafanizaDiafanizaDiafanizaDiafanizaççççãoãoãoão ou clareamentoou clareamentoou clareamentoou clareamento – Substituição do etanol por líquido miscível (geralmente xilol) com o meio de impregnação e retirada de lipídios.
Preparação de material para análise ao microscópio
Meio de impregnaMeio de impregnaMeio de impregnaMeio de impregnaççççãoãoãoão – Substituição do líquido (xilol) por parafina ou resina sintética. A resina sintética possibilita cortes mais finos (1 a 2 µm). O ME necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm) e por isso utiliza se resinas mais duras. Neste caso os cortes são feitos com navalhas de vidro ou diamante.
Preparação de material para análise ao microscópio
Meio de inclusãoMeio de inclusãoMeio de inclusãoMeio de inclusão – Suporte para o tecido impregnado.
Preparação de material para análise ao microscópio
Tecido preparado para análise ao Microscópio Eletrônico
Preparação de material para análise ao microscópio
MicrMicrMicrMicróóóótomotomotomotomoInstrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura).
Preparação de material para análise ao microscópio
MicrMicrMicrMicróóóótomo automatizado tomo automatizado tomo automatizado tomo automatizado – Permite a obtenção rápida de cortes sem passar pelas etapas descritas antes.
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Preparação de material para análise ao microscópio
MicrMicrMicrMicróóóótomotomotomotomoRealizando cortes do material
Preparação de material para análise ao microscópio
MicrMicrMicrMicróóóótomotomotomotomoInstrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura).
Preparação de material para análise ao microscópio
Estufa 60 Estufa 60 Estufa 60 Estufa 60 ooooCCCCDerreter e eliminar a parafina
Preparação de material para análise ao microscópio
XilolXilolXilolXilolRetirada da parafina
SSSSéééérie alcorie alcorie alcorie alcoóóóólica lica lica lica ---- Rehidratação.
Hidratação completa
Preparação de material para análise ao microscópio
Coloração
Preparação de material para análise ao microscópio
Hematoxilina/Eosina (HHHHEEEE))))Coloração freqüentemente utilizada
ColoraColoraColoraColoraççççãoãoãoão – A maioria dos corantes utilizados se comportam como ácido ou base.
→Estrutura celular basófila, liga-se a corantes básicos.
→Estrutura celular acidófila, liga-se a corantes ácidos.
Corantes básicos: azul-de-tuluidina, azul-de-metileno, hematoxilina...
Corantes ácidos: eosina, orange G, fucsina ácida...
Além destes corantes freqüentemente utilizados, utiliza se também outros
tipos de coloração, como a impregnação com sais de prata e ouro.
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Preparação de material para análise ao microscópio
Além destas colorações frequentemente utilizadas, outros métodos baseados
em reações químicas (citoquímica), imunológicas (imunocitoquímica), entre
outras, também podem ser empregados.
...outras técnicas que podem ser empregadas na Biologia Celular e Molecular
: Radioautografia
: Imunocitoquímica
: Cromatografia
: Eletroforese
: Cristalografia e difração de raio-X
: Hibridação de ácidos nucléicos
Preparação de material para análise ao microscópio
Montagem das lâminas
Preparação de material para análise ao microscópio
Análise do Material
Preparação de material para análise ao microscópio
Resultados
Plano de corte