TECHNIQUES Principes et applications. Culture de Tetrahymena Données de base Température optimale:...
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TECHNIQUESTECHNIQUES
Principes et applications
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Culture de TetrahymenaDonnées de base
Culture de TetrahymenaDonnées de base
• Température optimale: 28 °C
• Température minimale: environ 12-14 °C
• Température maximale: environ 31-32 °C (choc thermique réversible)
• Temps de génération: 2h30-4h15 (normalement 4h)
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Culture de TetrahymenaMilieux de culture
Culture de TetrahymenaMilieux de culture
• Culture axénique: sans autres micro-organismes
• Milieu semi-défini• Source acides aminés: hydrolysat de protéine• Protéose, peptone, tryptone, lait• Source de vitamines: extrait de levure• Glucose• Sels: peu concentrés, maintien du pH• Na ou K, H2PO3
2-
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Culture de TetrahymenaCulture stock
Culture de TetrahymenaCulture stock
• Température basse: 14°C• Milieu pauvre
• Pas de source de vitamines ou glucose• Peptone peu concentrée=> Doit utiliser beaucoup d’énergie/temps pour
synthétiser vitamines et autres
• Croissance lente• Repiquage moins fréquent
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Culture de TetrahymenaCulture de conditionnement
Culture de TetrahymenaCulture de conditionnement
• Température presque optimale: 25°C
• Milieu riche• source de vitamines ou glucose• hydrolysats plus concentrées et variés
• Réadaptation progressive à des conditions de croissance rapide
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Culture de TetrahymenaCulture de croissance
Culture de TetrahymenaCulture de croissance
• Température optimale: 28°C• Milieu riche
• source de vitamines ou glucose• hydrolysats plus concentrées et variés
• Agitation: meilleure oxygénation• Conditions de croissance rapide• Obtention de grandes quantités de cellules
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Culture de TetrahymenaCulture massive
Culture de TetrahymenaCulture massive
• Température optimale: 28°C
• Milieu très riche• source de vitamines et glucose• lait comme source d'acides aminés
• Agitation: meilleure oxygénation
• Conditions de croissance rapide
• Obtention de très grandes quantités de cellules
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Culture de TetrahymenaCulture en milieu défini
Culture de TetrahymenaCulture en milieu défini
• Milieu défini: [ ] exactes de toutes les composantes individuelles sont connues
• Température optimale: 28°C• Milieu
• Acides aminés• Vitamines• Glucose• Autres éléments (ac. gras, minéraux….)
• => Connaissance et contrôle des conditions
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Culture de TetrahymenaMilieu minimal
Culture de TetrahymenaMilieu minimal
• Tris 10 mM + pH 7.6 + Glucose
• Milieu simple pour incorporation acides aminés marqués
• Pas de croissance
• Court terme
• "choc" => induisant une réponse ????
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TetrahymenaConcentration des cellules
TetrahymenaConcentration des cellules
• Dispositif de concentration• Certaines manipulations requièrent des
concentrations de cellules non obtenues par des cultures de croissance
Si on a besoin de concentrer les cellules
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TetrahymenaConcentration des cellules
TetrahymenaConcentration des cellules
Lang et Gauthier (1993)
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TetrahymenaEnumération à l'hémacymètre
TetrahymenaEnumération à l'hémacymètre
• Détermination du nombre de cellules• Hémacymètre
• Normalement destiné à l'énumération des cellules du sang
2 cotés et 5 zones par coté
10 zones = 1 µL
Lamelle spéciale (coûteuse)
Cellules immobilisées (formaldéhyde)
Cellules cotés: supérieurs et gauches
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http://www.bdbiosciences.com/discovery_labware/technical_resources/labtools/hemarefpf.html
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TetrahymenaTraitements
TetrahymenaTraitements
• Exposition à choc thermique ou toxique• Cellules concentrées/diluées pour obtenir
conc. finale voulue• Tubes contenant le milieu de culture (selon
volume final voulu)+ toxique concentré --> conc. finale voulue
au temps = 0
+ cellules concentrées --> conc. finale voulue
+ N.p.o.: contrôle: volume identique dans chaque tube+ 1 tube sans produit toxique: solvant du toxique
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TraitementsTraitements
• Incuber à T° voulue• Prélever aliquotes aux temps voulus -->
µtubes (1.5 ou 2 mL)• Centrifuger > 10 kRPM x 10 min -->
sédiment = cell.• Extraire les cell. en resuspendant dans soln
voulue§ SDS --> électro.
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Electrophorèse (EGPA)Electrophorèse (EGPA)
• Séparation des protéines par EGPA-SDS• Protéines dénaturées: SDS et ßME + chauffage
• Charge uniforme + géométrie similaire séparation selon masse
Système triphasique• Tampon d'électrode: glycine• Gel de tassement: Cl- pH 6.8 (conc. PA faible)• Gel de séparation: Cl- pH8.8 (conc. PA forte)
==> échantillons volumineux peuvent être compactés pour donner une résolution supérieure
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ElectrophoresePrincipe de la séparation
ElectrophoresePrincipe de la séparation
Gel de tassementGel de séparationIndicateur
de migration(Bleu de
briomophénol)
Directionde
migration
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ElectrophorèseAnalyse des protéines synthétisées
ElectrophorèseAnalyse des protéines synthétisées
• Electrophorèse• Tassement• Séparation
• Fixation et Coloration• Ac. Acétique 10%• Bleu de Comassie (simple et sensible)• Argent (complexe mais très sensible)
• Buvardage ou Séchage + conservation
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Buvardageprincipes
Buvardageprincipes
• Transférer à la surface d'une matrice solide
• Différentes matrices: nitrocellulose… PVDF, nylon.
• Capacité d'adsorption• Buvardage: transfert électrophorétique• Adsorption: forces hydrophobes, ioniques
• Méthanol. porosité de la matrice, durée et puissance du transfert
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Transfert westernmécanisme
Transfert westernmécanisme
Direction demigration
Gel d'acrylamideMatrice solide(nitrocellulose)
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ImmunodétectionImmunodétection
• Identification et détection d'une protéine spécifique
• Anticorps spécifique à la protéine d'intérêt
• Adsorption antigène d'intérêt sur la matrice
• Buvardage électrophorétique• Application directe ("dot blot")
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Immunodétectionprécautions
Immunodétectionprécautions
• Blocage des sites inoccupés • Protéines: lait en poudre, albumine, collagene
(gélatine) => Ne contient pas antigène, anticorps, enzyme indicateur
• Prévention des liaisons non spécifiques• détergent doux: Tween (empêche adsorption Ag-Ab et
Ab-marice non spécifique)
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ImmunodétectionImmunodétection
• Adsorption de l'anticorps sur l'antigène (primaire)
• Adsorption de l'anticorps secondaire conjugué avec enzyme sur l'antigène primaire (autres marqueurs fluorochromes)
• Détection de l'enzyme: Chromogénique
Chemiluminescent
Radioactif, fluorescent, etc.
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Immunodétection: enzymesImmunodétection: enzymes
• Phosphatase alcaline• Sensible• Bon contraste en photo• Stable
• Peroxydase de raifort (HRP)• Assez sensible
• Durée limitée incubation (H2O2)
• Coloration +/- stable (H2O2)
• Contraste moyen
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Electro ou ImmunodétectionComparer des patrons de migration
Electro ou ImmunodétectionComparer des patrons de migration
• Déposer même quantité de protéines ou protéines provenant d'une même quantité de cellules = difficile
• Base de comparaison: étalon interne• Protéine qui reste en quantité stable dans une
cellule• Étalons courants: actine, GAP
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ImmunodétectionImmunodétection
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Marquage métabolique des protéinesMarquage métabolique des protéines
• Souvent on doit être capable de distinguer les protéines dont la synthèse est induite/ralentie par le traitement
• => Marquage métabolique:
• Exposition des cellules a des ac. Aminés marqués
• Extraction et séparation des protéines
• Autoradio- ou fluorographie