TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE
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TECHNIQUES DE
CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE :
DE LA FISH AUX PUCES A ADN
KARINE CORDIER-COUREL
XXème colloque ATC
Aix-en-Provence - 2010 Prolonger votre offre de soins, jour après jour
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LA CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE
Cytogénétique conventionnelle
Biologie moléculaire
Cytogénétique moléculaire
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DE LA FISH AUX PUCES A ADN
v FISH (Hybridation In Situ en Fluorescence)
• Principe
• Différents types de sondes
• Applications
• Avantages et inconvénients
v CGH (Hybridation Génomique Comparative)
• Principe
• Sensibilité
v FISH et CGH : Limites des techniques
v Puces à ADN
• Définitions
• Différents types de puces
• CGH-array
• Puces à SNP
• Intérêts, applications, inconvénients
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FISH : Principe
FISH = Fluorescence In Situ Hybridization
v Hybridation de séquences spécifiques marquées sur un
génome entier : centromères, régions sub-télomériques, loci
spécifiques et peintures
v Détection de délétions, identification de translocations ou
d’autres réarrangements chromosomiques
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FISH : Principe
CIBLESONDE
ADN double brin (mitoses
ou noyaux interphasiques)
ADN double brin marqué
T A A G G A T A A T T C C T A T
Dénaturation thermique
Hybridation complémentaire
37°C O/N
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FISH : Principe
LavagesElimination des
sondes non spécifiquement fixées
La sonde moléculaire se fixe sur sa cible
Pas de sonde fixée = délétion
Analyse au microscope en épifluorescence (filtres adaptés aux différents fluorochromes)
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FISH : Différents types de sondes
Peintures chromosomiques
M-FISHSondes centromériques
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FISH : Différents types de sondes
Sondes télomériques
Loci spécifiques (Tuple1 / N85A3)
Sondes de BACs
RP11-335E8 2p12
RP11-356H17 2p13.3
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FISH : Sondes de BAC
v Bacterial Artificial Chromosome = ADN circulaire bactérien
dans lequel un fragment d’ADN (du génome humain) a été inséré
v Sonde de BAC = sonde fabriquée à partir d’une
séquence d’ ADN connue insérée dans un vecteur de clonage
bactérien
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FISH : Choix des BACs
v Sélection des BACs selon leur localisation chromosomique (en
fonction du réarrangement à étudier) ou la séquence d’un gène
d’intérêt
v Séquençage du génome humain
=> Cartographie des chromosomes
=> bases de données
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FISH : Choix des BACs
National Center for Biotechnology Information
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=9606
University of California Santa Cruz http://genome.cse.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway
Ensembl Genome Browserhttp://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html
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NCBIFISH : Choix des BACs
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NCBIFISH : Choix des BACs
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FISH : Fabrication de sondes de BAC
Sonde prête à l’emploi pour
la FISH
BAC
Culture bactérienne
Extraction de l’ADN bactérien
Marquage par nick-translation (DNaseI, ADN pol,
dNTP, dUTP*)
Technique « lourde » 6 à 8 jours
Amplification par PCR (dNTP, amorces,
ADN pol)
Extraction et fragmentation
de l’ADN bactérien
Marquage par nick-translation (DNaseI, ADN pol,
dNTP, dUTP*)
Technique rapide 3 à 5 jours
cot 1, AcNa, EtOH
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FISH : Applications
v Confirmation d’anomalies suspectées par le caryotype
v Précision de points de cassure
v Origine des marqueurs, dm, hsr
v Détection des aneuploïdies
v Détermination du sexe
v Microdélétions
v Suivi de traitements, recherche de maladie résiduelle
v Suivi d’allogreffe (avec sexe opposé) de moelle
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FISH : Avantages et Inconvénients
Avantages
v Technique sensible (noyaux et
métaphases)
v Grand choix de sondes
(commerciales ou « maison »)
Inconvénients
v Technique lourde nécessitant des traitements différents selon la nature de l’échantillon à analyser (métaphases, noyaux, tissus)
v Analyse ciblée : Nécessité d’avoir une idée préalable de la région chromosomique ou du gène à étudier
v 3 cibles maximum par test
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CGH : Principe
ADN à tester
Co-hybridation
ADN de référence
nb copies ADN test > nb copies ADN de référence
=> amplification
nb copies ADN de référence > nb copies ADN test
=> délétion
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FISH et CGH : Limites des techniques
FISH
Etude ciblée
Résolution = 100-300Kb
Caryotype
CGH
Analyse globale du génome
Résolution = 5-10 Mb
Comment réaliser une analyse globale du génome et augmenter la résolution?
⇒ Hybrider de nombreuses sondes sur un échantillon?
⇒ Hybrider un échantillon sur de nombreuses sondes?
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PUCES A ADN : Définitions
v Petites surfaces solides sur lesquelles un grand nombre de
sondes ont été fixées
v Puces à ADN = DNA arrays, DNA chips, DNA micro-arrays ou micro-
arrays
v BAC-array = sondes de BACs
v DNA-array = faible densité (quelques centaines à quelques milliers
de sondes)
v DNA micro-array = haute densité (plusieurs milliers de sondes)
v puces « pangénomiques » = ensemble du génome
v puces « à façon » = ciblant une fonction biologique ou une
pathologie
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PUCES A ADN : Différents types de puces
Il existe trois types de technologies :
v CGH-array proprement dite ( hybridation génomique comparative par rapport à un ADN de référence)
Ø Bac-array (Array 300 Abbott, Cyto Chip Blue Gnome, …) : résolution limitée (50-200Kb)
Ø Puces à oligo (Agilent) : meilleure résolution (oligonucléotides de 60-mer)
v Puces à SNP ne nécessitant pas d’ADN de référence ( Illumina, Affymetrix) : haute résolution (oligonucléotides de 25 à 80-mer) + recherche de régions de perte d’hétérozygotie
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v Extraction de l’ADN => quantification (A260nm)
=> pureté (A260nm / A280nm)
=> intégrité (migration sur gel d’agarose)
v Digestion par des enzymes de restriction / Amplification par PCR
v Marquage et Fragmentation
v Hybridation
v Lavages
v Quantification du signal d’hybridation pour chaque sonde (lecture par
un scanner)
v Numérisation par un logiciel spécifique
PUCES A ADN : Etapes techniques
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CGH-array : Principe
v Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN
(ou ARN/ARN)
v Co-Hybridation compétitive de séquences d’ADN (ou ARN) test et
témoin marqués par fluorescence sur un grand nombre de loci
spécifiques présents sur un support solide (lame de verre)
v Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau de loci
spécifiques et connus sur un génome entier
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ADN test marqué en CYA3
ADN de référence marqué en CYA5
Dénaturation et hybridation sur puce à ADN
Loci spécifiques (BAC / PAC / oligonucléotides de synthèse)
SCANNER
Défaut d’ADN test
Excès d’ADN test
Lame de verre
CGH-array : Principe
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CGH-array : Capture et Analyse des résultats
Ex : BAC-array / Array-300 Abbott®
DAPI IV (sondes) Cy3 (ADN Test) Cy5 (ADN Référence)
ratio T/R calculé
3 spots / clone
• 0.8 < T/R < 1.2 => pas de déséquilibre
• T/R < 0,8 => délétion
• T/R > 1,2 => amplification
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CGH-array: Exemple d’application
v Dysmorphie faciale => caryotype t(5;9) + dup(9)(q?)
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v Confirmation par FISH (peintures des chromosomes 5 et 9)
Peinture du chromosome 5Peinture du chromosome 9
CGH-array: Exemple d’application
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v Résultats analyse sur puce Array-300 Abbott®
9p21 - CDKN2A(p16),MTAP 1,13 9p11.2 - AFM137XA11 1,35 9q21 - D9S166 1,51 9q22.3 - PTCH 1,41 9q33.2 - DBCCR1 1,08
CGH-array: Exemple d’application
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v Résultats analyse sur puce IntegraGen®
CGH-array: Exemple d’application
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Puces à SNP: Principe
v Les oligonucléotides spécifiques sont synthétisés directement sur la
puce
v Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN
(ou ARN/ARN)
v L’ADN à tester s’hybride avec sa séquence complémentaire
fixée sur la puce
v Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau des
marqueurs spécifiques et connus sur un génome entier
v Identification de pertes d’hétérozygotie (LOH)
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Puces à SNP: Analyse des résultats
Puce SNP6.0 / Affymetrix ®
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Puces à SNP: Analyse des résultats
Puce SNP6.0 / Genotyping Console / Affymetrix ®
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Puces à SNP: Analyse des résultats
Allèle Différence
Copy Number state
Segments
Fishclones (BACs)
Genomic variants (polymorphismes)
Refseq (gènes)
Idéogramme / règle
Log2Ratio
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Puces à SNP: Analyse des résultats
FISH CLONES (BAC)
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Puces à SNP : Résolution
SNP6.0 (Affymetrix)Cytogenetics Array
(Affymetrix)
Copy Number Marker 1 878 785 2 761 979
SNP 945 806 400 103
RefSeq genes 12 093 (64,7%) 18 270 (97,7%)
Cancer genes 233 (73,3%) 318 (100%)
OMIM genes 8 068 (43,1%) 12 046 (97,6%)
Average marker spacing (bp) 1,629 1,086
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Puces à ADN : Intérêts
v Pas de mise en culture des cellules à analyser
v Analyse l’ADN de tout type de tissus
v Technique hautement résolutive (< 150 Kb)
v Analyse pangénomique qui ne nécessite pas d’avoir une idée
préalable de chromosomes impliqués (# FISH)
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Puces à ADN : Applications
v Corrélations nombre de copies / conséquences biologiques
v Compréhension de maladies (Couplée à une puce à ARN )
v Comparaison tumeur/tissu sain
v Etude du génome des patients atteints d’une même pathologie et
compréhension des mécanismes géniques
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Puces à ADN : Inconvénients
v Anomalies chromosomiques équilibrées non détectables
v Polymorphismes (encore beaucoup d’interrogations à ce sujet)
v Seuil de sensibilité, mosaïques faibles?
v Plateau technique onéreux
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CONCLUSION
C I B L E S S U P P O R T I N T E R E T S L I M I T E S
CARYOTYPE
5-10 Mb Génome entier Métaphases
Recherche d’
Anomalies chromosomiques
Technique longue
Peu sensible pour les anomalies cryptiques (mais technique de référence en cytogénétique)
FISH
5 Mb à
100-300 Kb
Chromosomes entiers
Régions spécifiques
(sub-télomèriques, centromériques, loci,…)
Métaphases
Noyaux interphasiques
Coupes de tissus
Micro-remaniements
Points de cassures
Marqueurs
Aneuploïdie
Sexe
Suivi de maladie
TK lourde et peu automatisable
3 cibles / test
Recherche ciblée
CGH-ARRAY /
PUCES ADN
10-300 Kb
Loci spécifiques
(BACs ou oligonucléotides de synthèse)
Génome entier
ADN ou ARN
Analyse de
tout type d’échantillon
(sang, moelle, tissu sain, tumeur)
Détection de déséquilibres cryptiques non détectable par les autres techniques
Ne détecte pas les anomalies chromosomiques équilibrées
Polymorphismes
Mosaïques faibles