Tai Lieu Hoa Sinh

KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN

I. Phương pháp tủa bằng các tác nhân gây tủa là dung môi hữu cơ (Ethanol 80%,

Aceton)

Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó

là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử dung môi có hằng số điện

môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử

protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại, các

dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản sự phân tán của các phân

tử protein trong môi trường. Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra kết

tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách

thêm một dung môi hòa tan trong nước như aceton vào dung dịch chứa protein. Sự tủa bằng

aceton hoặc ethanol 80% có nhiều thuận lợi hơn vì nó tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết

với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzym, do nhiệt độ bay hơi của dung môi

thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt

gió.

II. Phương pháp tủa bằng muối

Người ta có thể dùng muối (NH4)2SO4, NaCl… để tủa protein vì các muối này vừa

làm trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại

bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein. Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ

muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của

chúng.

Phần thí nghiệm

1. Dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ

Pipet 5ml, 10ml

Becher 50ml, 100ml, 250ml

Bình tia

Máy ly tâm

Hóa chất

Nguyên liệu thơm (dứa)

Etanol 96%

Muối (NH4)2SO4

2. Thực hành

Cân khoảng 80g đến 100g thơm, giã nát vắt lấy nước rồi ly tâm ở 6000 vòng/phút

trong 15 phút rồi đong xem thể tích của nước thơm là bao nhiêu, ghi nhận thể tích V. Sau đó

chia đôi thể tích V nước thơm vùa thu được thành hai phần bằng nhau rồi tiến hành tủa

protein bắng hai tác nhân tủa khác nhau: Ethanol 80% và muối (NH4)2SO4

1


Quy trình kết tủa enzym Bromelin bằng cồn 80%

Lưu ý: Phối trộn cồn với dịch dứa theo tỉ lệ 4:1 (1 dứa : 4 cồn)

2

Làm sạch

Nghiền ép, xay nhuyễn

Lọc

Ly tâm 6000 v/p, trong 15 phút

Dịch trong

Chồi ngọn, vỏ quả

Bã

Bã

Tủa cồn 4oC / 2 giờ


Thu tủa

Sấy khô

Bromelin

Bỏ dịch trong

cồn 80%, làm lạnh 40C


Quy trình thu nhận enzym Bromelin bằng muối (NH4)2SO4

Lưu ý: Để có muối(NH4)2SO4 bão hòa 70% ta phối trộn với tỷ lệ 47,2g muối trong 100ml

nước thơm.

3

Làm sạch

Nghiền ép, xay nhuyễn

Lọc

Ly tâm 6000 v/p, 15 – 20phút

Bã

Bã

Chồi ngọn, vỏ quả

Hỗn hợp dịch dứa, để ở

nhiệt độ phòng 30 phút


Thu tủaBỏ

dịch trong

Sấy khô

Bromelin

Dịch trongAmmonium sulfate 70%

bão hòa


3. Kết quả: Hãy tính hàm lượng protein có trong 100g nguyên liệu ban đầu.

III. Phương pháp tủa protein bằng điểm đẳng điện.

1. Nguyên tắc

Giá trị pH mà tại đó phân tử protein trung hòa điện gọi là điểm đẳng điện của protein

(pI), ở giá trị pH = pI phân tử protein trung hòa điện sẽ không chuyển dịch trong điện

trường, phân tử protein sẽ kém bền nhất dễ kết tủa.

Người ta lợi dụng tính chất này để kết tủa protein.


Dụng cụ

Máy khuất từ

Máy ly tâm

Cân phân tích

Bercher 100ml, 250ml

Pipet 5ml, 10ml

Hóa chất

Dung dịch NaOH 20%

Dung dịch HCl 10%

Ete

Etanol

Giấy pH

3. Thực hành

Tách chiết protein cá:

Cân 100g cá đã xay nhuyễn trong một bercher rồi cho 4 lần nước. (1 cá : 4 nước, g/l)

Khuấy đều rồi cho từ từ NaOH 20% vừa cho vừa khuấy cho đến pH 11 thử bằng giấy pH,

khuấy khoảng 45 phút rồi ly tâm, giữ lại dịch chiết trong một bercher 250ml, bã còn lại thêm

nước chiết tiếp lần hai rồi ly tâm lấy dịch bỏ bã. Dịch thu được cho vào bercher 250ml gộp

chung với phần dịch chiết bên trên.

Cho từ từ HCl 100% vào dịch chiết vừa cho vừa khuấy đến pH thích hợp là 6 sẽ thấy

kết tủa, ly tâm 4000 vòng/phút trong 30 phút, rồi bỏ dịch thu tủa protein, rửa tủa với ete :

ethanol với tỷ lệ 2:1, tủa protein sạch khi rửa tủa vài lần với ete : ethanol. Cân lượng tủa

protein thu được (mg tủa) để tính ra hiệu suất protein có trong 100g cá.

4


KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYM BROMELIN(Xác định hoạt tính enzym Bromelin bằng phương pháp Anson cải tiến)

1. Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzym Bromelin có

trong dịch nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzym và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng

dung dịch acid trichloracetic. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy

phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của Tyrosin để tính

lượng sản phẩm do enzym xúc tác tạo nên.


Dụng cụ

Ống nghiệm

Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml

Máy quang phổ


Bình tia

Hóa chất

Dung dịch Casein 1%

Dung dịch TCA 5%

Dung dịch NaOH 0,5N

Thuốc thử Folin

Dung dịch HCl 0,2N

Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 mM/l trong

dung dịch HCl 0,2N

3. Chuẩn bị đường chuẩn Tyrosin

Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm

1 2 3 4 5 6

Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Lượng Tyrosin tương ứng (µM) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Dung dịch HCl 0,2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0

Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10

Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3

Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm

Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường

chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN – ODTK).

5


4. Phương pháp tiến hành

Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thử thật, 3 ống thử không

Các bước chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính

Dung dịch hóa chấtỐng nghiệm

Thử thật Thử không

Dung dịch Casein 1% (ml) 5 5

Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10

Dung dịch enzym mẫu (ml) 1 1

Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 20 phút

Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0

Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong

Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử thật và

cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không.

Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau

10 phút đo OD ở bước sóng 660nm. Tính ΔOD = ODTT – ODTK, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn

suy ra được số µM Tyrosin.

5. Tính kết quả

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzym tối thiểu trong điều

kiện thí nghiệm (35,50C: pH 7,6 …) thủy phân Casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa

tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm

tương ứng với 1µM Tyrosin trong đường chuẩn.

Hđ Protease =

Với: Hđ Protease : hoạt độ enzym protease (UI/g)

V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml)

v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)

t : thời gian thủy phân (phút)

m : khối lượng mẫu enzym đem đi xác định hoạt tính (g)

L: độ pha loãng enzym

µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn

6


KHẢO SÁT HOẠT TÍNH INVERTASE

I. Nguyên tắc:

Invertase là một enzym thủy giải saccharose thành glucose và fructose.

Trong bài này ta dùng enzym invertase trích trong men bia để cho thủy giải

saccharose, từ đó tính được hoạt tính của enzym này.

II. Dụng cụ và thuốc thử

Dụng cụ

Becher 100ml – 250ml

Erlen 250ml

Ống nghiệm 50ml

Pipet 5ml – 10ml

Buret 25ml

Phễu lọc

Hóa chất

dung dịch saccharose 10%

dung dịch NaOH N/10

Dung dịch Iod N/10

Dung dịch H2SO4 N

Hồ tinh bột 1%

Dung dịch Na2S2O3 N/20

III. Cách tiến hành

Điều chế dung dịch invertase: cân 0,5g men bia hòa tan trong 50ml nước cất. Khuấy

đều trong 5 phút. Để lắng đem lọc lấy dịch lọc.

Thực hiện ba ống nghiệm như sau:

Số ống 1 2 3

ml dung dịch saccharose 10%

ml nước cất

ml enzym invertase

ml enzym invertase đã đun sôi

10

10

10

10

10

10

Để thủy giải trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Tiếp đó, đem tất cả các ống đun cách

thủy trong 2 phút, làm lạnh dưới vòi nước.

Hút 5 ml của hỗn hợp cho vào một erlen 250ml và định phân đường glucose như sau:

cho thêm vào bình 10ml dung dịch Iod N/10 và 15 ml dung dịch NaOH N/10. Thời gian nhỏ

NaOH phải kéo dài khoảng 2 phút (nhỏ từng giọt). Để yên trong bóng tối 15 -20 phút. Lấy ra

thêm vào 2ml dung dịch H2SO4 N. Định phân lượng iod thêm còn thừa bằng dung dịch

Na2S2O3 N/20 (dùng hồ tinh bột cho thêm vào lúc cuối phản ứng để làm chất chỉ thị màu).

7


IV. Kết quả

Hoạt tính của invertase được biểu thị bằng số mol saccharose thủy giải bởi lượng

enzym invertase có trong 1g men bia trong 1 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.

Gọi V1 và V2 là số ml Na2S2O3 N/20 dùng định phân ống số 1 và số 2.

Có nhận xét gì về kết quả định phân trong ống số 3?

Hoạt tính invertase được tính theo công thức sau:

a: thể tích lấy ra trong mỗi ống để định đường glucose (ml)

A: thể tích tổng cộng trong mỗi ống (ml)

b: thể tích dung dịch enzym cho vào mỗi ống (ml)

B: tổng thể tích dung dịch enzym có được từ mg – men (ml)

t: thời gian thủy giải tính bằng phút.

8


XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYM ALPHA – AMYLASE

(THEO PHƯƠNG PHÁP SMITH & ROE)

I. Nguyên tắc:

Hoạt tính α - amylase biểu thị khả năng của enzym amylase xúc tác phản ứng thủy

phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 500C và được thể hiện bằng số đơn vị của enzym

trong 1g mẫu. Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa được thủy

phân hủy sẽ tạo phản ứng màu với iod và được so màu bằng máy so màu quang học ở bước

sóng 620 nm.

II. Dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ

Bình định mức 50ml, 100ml, 250ml

Bếp ổn nhiệt

Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml


Máy quang phổ

Hóa chất

Cồn 960

Dung dịch tinh bột 1% trong đệm pH 5,6

Dung dịch HCl 1N

Dung dịch NaCl 3%

Thuốc thử Lugol

III. Thực hành

1. Ly trích Amylase

Amylase là 1 tạp chất protein không tan trong rượu mạnh. Cân 10g lúa nảy mầm cho

vào cối với 30ml nước cất, giã nát lúa dưới nước. Để yên trong 15 phút, đem lọc. Lấy tất cả

nước qua lọc, thêm 4 lần thể tích cồn 960. Khuấy đều, ta sẽ thấy amylase và các protein khác

tủa dưới dạng nùi lớn.

Để lắng, ly tâm lấy tủa. Hòa tan tủa trong 20ml nước cất. Ta có dung dịch amylase

khá tinh sạch. Đặc biệt dung dịch này không có chất đường khử (thử 1ml dung dịch thuốc

thử Fehling, đun cách thủy 3 phút, ta không có kết tủa đỏ xuất hiện)

9


2. Khảo sát hoạt tính α-amylase

Lấy sáu ống nghiệm chia thành 2 lô, mỗi lô 3 ống nghiệm gồm thử thật và thử không để

lấy trung bình.

Tiến hành thí nghiệm theo bảng sau:

Dung dịch hóa chấtỐng nghiệm

Ống thử thật (t) Ống thử không (o)

Nước cất (ml) 0 1

Dịch chiết α - amylase 1 0

Dung dịch đệm (ml) 1 1

Dung dịch tinh bột 1% (ml) 1 1

Dung dịch NaCl 3% (ml) 0,5 0,5

Dung dịch HCl 1N (ml) 0 1

Đem ủ ở 500C trong 30 phút

Dung dịch HCl 1N (ml) 1 0

Nước cất (ml) 5,5 5,5

Thuốc thử Lugol (ml) 0,5 0,5

Lắc đều hỗn hợp trong ống nghiệm rồi mang đi so màu ở bước sóng 620nm

IV. Kết quả:

Hđ A=

Với OD0: mật độ quang của ống thử không

ODt: mật độ quang của ống thử thật

C: lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (mg)

T: thời gian phản ứng (phút)

L: hệ số pha loãng mẫu enzym.

10


XÁC ĐỊNH ĐẠM TỔNG SỐ THEO PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL

I. Vô cơ hóa:

Nguyên tắc: Sự vô cơ hóa chất đạm là sự biến đổi tất cả các chất đạm dù nằm dưới dạng

nào (hữu cơ, vô cơ, protein) thành hợp chất vô cơ là amonium sulfat (NH4)2SO4 bằng

cách đun sôi với H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác.

Thực hành: hút chính xác 1ml nếu là nguyên liệu lỏng hay cân chính xác 1g nếu là

nguyên liệu khô đã nghiền nhuyễn để cho đồng nhất, cho vào một bình cổ cao có dung

tích từ 60ml đến 100ml (bình kjeldahl). Thêm vào đó 5ml H2SO4 đậm đặc và khoảng

0,5g chất xúc tác. Đun sôi hỗn hợp trong tủ hút khí độc từ 2 đến 3 giờ cho đến khi dung

dịch trở thành trong suốt và có màu xanh do trời nhạt. Để nguội và pha loãng thành

100ml với nước.

Chất xúc tác dùng ở đây là hỗn hợp đã xay nhuyễn của: K2SO4 và CuSO4 có tỷ lệ theo

trọng lượng là 9: 1

Thực hiện 3 sự thử thật (có chất đạm) và 3 sự thử không có chất đạm (thay chất đạm

bằng nước cất)

II. Phương pháp kjeldahl:

Nguyên tắc: Chất đạm đã được vô cơ hóa nằm dưới dạng Amonium sulfat đem cho tác

dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac

Sau đó lượng amoniac được hơi nước nôi cuốn bằng một dụng cụ máy Parnas – Wargner

và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thừa H2SO4. Từ đây cho phép chúng

ta xác định được lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa là xác định được lượng đạm có

trong mẫu nguyên liệu.

11

Chất đạm (NH4)2SO4

H2SO4 đậm đặc

Xúc tác, t0

(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH4OH + Na2SO4


Dụng cụ và hóa chất:

Dụng cụ:

- Máy cất đạm Parnas – Wargner

- Bình kjeldahl

- Bếp đun

- Bình xịt nước cất

- Becher 250 ml, 100ml, 50ml

- Erlen 250ml

- Bình định mức 100ml, 50ml

- Buret 25ml

- Pipet 1ml, 5ml, 10ml, 20ml.

- ống đong 25ml

Hóa chất:

- Dung dịch NaOH đậm đặc (10N)

- Dung dịch H2SO4 N/100

- Dung dịch NaOH N/100 (dung dịch

này sau khi pha xong dùng ngày thì

đúng nồng độ, nhưng để lâu sẽ bị

carbonat hóa nên nồng độ không còn

đúng như ban đầu, vì thế phải xác

định lại hệ số chỉnh lý x bằng cách

định phân nó với dung dịch acid

chuẩn (acid oxalic, acid phtalic…)

- Dung dịch đỏ metil 0,5% pha trong

rượu etylic.

Cách thực hành:

Đun sôi bình nước máy Parnas – Wargner. Đặt erlen có chứa 25ml H 2SO4N/100 và vài

giọt đỏ metil vào phần đuôi của máy sao cho phần nhọn nhúng chìm vào dung dịch. Hút

10ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng thành 100ml, đem đổ vào máy Parnas – Wargner;

thêm vào đó 10ml NaOH đậm đặc ( ghi nhó là khi cho mẫu cũng như NaOH đậm đặc vào

máy, phải cho xuống từ từ bằng kẹp Mohr, nếu cho chảy xuống quá nhanh thì dung dịch sẽ

bị máy hút ra ngoài). Tiếp tục đun sôi bình nước và để cho hơi nước lôi cuốn amoniac sang

erlen trong 3 phút, hạ erlen xuống và tiếp tục đun thêm 2 phút nữa, tráng vòi của máy bằng

một tia nước cất, tất cả đều cho chảy vào erlen đựng H2SO4 N/100. Lấy erlen ra và định phân

H2SO4 thừa bằng dung dịch NaOH có chuẩn độ là x N/100 cho đều. Khi dung dịch đổi màu

(từ màu hồng nhạt sang màu da cam): thực hiện 3 sự thử thuật và 3 sự thử không để lấy trị số

trung bình.

Cách tính:

Nếu nguyên liệu là chất lỏng, thông thường lượng đạm được tính bằng số gam đạm trong

1 lít, nếu nguyên liệu là chất rắn, thì trước hết phải tính độ ẩm, sau đó lượng đạm đươc tính

bằng phần trăm (số gam đạm có trong 100g nguyên chất liệu) theo độ khô tuyệt đối)

Giả sử nguyên liệu là chất lỏng. Lấy 1ml nguyên liệu đem vô cơ hóa và pha loãng thành

100ml, sau đó hút 10ml đem chưng cất bằng máy Parnas – Wargner.

Gọi V0 là thể tích dung dịch NaOH x N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử không).

Gọi Vt thể tích dụng dịch NaOH x N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử thật).

12


Vậy:

là lượng NaOH tương đương với lượng amoniac phóng thích bởi 10ml dung dịch vô cơ hóa

đã pha loãng.

1mol amoniac tương đương với 1mol NaOH.

Do đó số mol amoniac phóng thích bởi 10ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng là:

Số gam đạm có trong 10ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng là:

Số gam đạm có trong 1000gl dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng hay trong 1ml nguyên liệu

Số gam đạm có trong 1 lít nguyên liệu:

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH CHẤT ĐƯỜNG

13


I. Phản ứng màu tổng quát (phản ứng Molish)

Tất cả các chất đường đều cho màu tím đối với dung dịch α – Naphthol trong H2SO4

đậm đặc. Đổ trong ống nghiệm 1 ml dung dịch đường 1% và 2 giọt dung dịch α – Naphthol

15% trong rượu. Lắc đều, nghiêng ống và cho H2SO4 đậm đặc từ từ theo thành ống. Có sự

tạo thành một lớp màu tím hiện ra ở mặt ngăn cách 2 chất lỏng.

II. Phân biệt giữa monosaccharid và disaccharid (phản ứng Barfoed)

Khả năng khử của những monosaccharid có thể lớn hơn nhiều khả năng khử của

disaccharid cho nên, thay vì sử khử ở môi trường base, sự khử ở môi trường acid yếu có thể

giúp ta phân biệt được monosaccharid và disaccharid.

Trong ống nghiệm đựng 2ml thuốc thử Barfoed, ta thêm vào 1ml dung dịch đường

muốn khảo sát.

Ta thực hiện đồng thời ba sự thử chứng với các dung dịch glucose 1% , lactose 1% và

nước cất. Đun sôi cách thủy trong 5 phút. Làm lạnh, quan sát ống có trầm hiện đỏ. Đun tiếp

tục 8 phút, quan sát ống có trầm hiện đỏ.

Giải thích hiện tượng.

III. Phản ứng với thuốc khử Fehling

Thuốc khử này là dung dịch CuSO4 với dung dịch soude đậm đặc và tartrat kép

natrium và kalium. Tác dụng của dung dịch soude đậm đặc lên CuSO4 cho hydroxyd đồng

(CuO, H2O) tan trong dung dịch nhờ sự hiện diện của tartrat.

Trong một ống nghiệm, đổ 1ml thuốc thử Fehling và 1ml dung dịch glucose. Đun sôi

cách thủy trong 5 phút có trầm hiện đỏ gạch Cu2O nhờ sự khử đồng nhị thành đồng nhất bởi

glucose.

KHẢO SÁT LIPID

14


I. Khảo sát tính hòa tan của lipid

1. Nguyên tắc:

Lipid không hòa tan trong nước do có sức căng bề mặt rất cao. Nếu dùng lực cơ học

tác động vào hỗn hợp lipid nước thì chúng phân tán thành từng hạt nhỏ, nhưng ngưng tác

dụng chúng lại phân thành 2 lớp: lipid ở trên và nước ở dưới. Nếu ta thêm vào hỗn hợp các

chất muối kiềm, xà phòng, mật.. sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của các hạt lipid

do đó việc trở lại hai lớp khó hơn và dung dịch lúc này sẽ có màu trắng đục như sữa (nhũ

tương), lipid ở dưới dạng các hạt nhỏ liti các micell đấy là hiện tượng nhũ hóa mỡ. Nếu thay

nước bằng các dung môi hữu cơ: acetone, ether, chloroform, benzen thì lipid sẽ hòa tan vào

các dung môi nói trên.

2. Hóa chất

Dầu thực vật hay mỡ động vật

Dung môi hữu cơ: alcohol, acetone, bezen

3. Cách làm

Cho vào ba ống nghiệm:

Ống 1: 2ml alcohol

Ống 2: 2ml acetone

Ống 3: 2ml benzen

Nhỏ thêm vào mỗi ống 1 giọt dầu hoặc mỡ, lắc nhẹ, quan sát sự hòa tan của lipid

trong ba dung môi hữu cơ.

II. Khảo sát một số chỉ số đặc trưng của chất béo

1. Chỉ số acid:

Là số mg KOH dùng trung hòa các acid béo tự do trong 1g chất béo.

Nguyên tắc

Dùng KOH 0,1N trong rượu để trung hòa các chất béo tự do trong 1g nguyên liệu,

chất chỉ thị màu là phenolphtalein.

Dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ

Erlen 100ml

Pipet 10ml

Becher 100ml

Bình tia

Hóa chất

KOH 0,1N

Ether ethylic

Phenolphtalein 0,5% trong alcohol

Dầu để khảo sát

Cách làm

15


Cân 1g (1ml) chất béo cho vào erlen, thêm 10ml ether ethylic, lắc đều cho tan chất

béo. Cho 1 giọt phenolphtalein và chuẩn độ bằng KOH 0.1N cho đến khi xuất hiện màu

hồng bền trong 30 giây.

Tính toán kết quả:

Chỉ số acid = 5.61 * V/m

5,61 là số mg KOH tương ứng 1ml KOH 0.1N

V là số ml KOH

m là trọng lượng lipid đã cân (gram)

2. Chỉ số savon

Là số mg KOH cần thiết để savon hóa các ester chứa trong 1g chất béo.

Nguyên tắc:

Cho nguyên liệu kết hợp với 1 lượng thừa KOH để savon hóa chất béo. Định lượng

KOH thừa bằng HCl giúp suy ra chỉ số savon.

Dụng cụ và hóa chất:

Dụng cụ

Erlen

Pipet 10ml

Becher 100ml

Bộ chưng cất hoàn lưu

Hóa chất

KOH 0.5N trong rượu

HCl 0.5N

Ethanol tuyệt đối

Phenolphtalein 0,5% trong alcohol

Chất béo để khảo sát

Cách làm:

Cân chính xác 500mg chất béo cho vào erlen, thêm 10ml KOH 0.5N. Đun sôi hoàn

lưu 45’, định phân KOH bằng HCl 0.5N với chất chỉ thị màu là phenolphtalein. Thực hiện

một bình đối chứng thay 500mg chất béo bằng 500mg nước.

Tính toán kết quả:

Chỉ số savon = 28.05 * (V0 – V1)/m

28.05 là số mg KOH tương ứng 1ml HCl 0.5N

V0 là thể tích dung dịch HCl 0.5N của bình đối chứng

V1 là thể tích dung dịch HCl 0.5N của bình thí nghiệm

m là trọng lượng chất béo đã cân (gram)

ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C

16


(Phương pháp định lượng vitamin C bằng IOD)

1. Nguyên tắc

Để xác định nhanh chóng hàm lượng vitamin C trong nguyên liệu khi có chất màu

người ta thường dùng phương pháp chuẩn độ iod. Tất cả acid ascorbic bị oxi hóa bởi iod.

Phần iod thừa sẽ cho màu xanh với dung dịch tinh bột. Điều đó nói lên là phản ứng đã kết

thúc.


Dụng cụ

- Erlen 100ml

- Pipet 5ml, 10ml

- Buret

- Bình định mức 50ml

- Becher

- Cối chày sứ

- Phễu thủy tinh

Hóa chất

- Dung dịch HCl 5%

- Dung dịch Na2S2O3 0,01N

- Dung dịch tinh bột 1%

- Dung dịch iod 0,01N

3. Cách thực hành

a. Chuẩn bị mẫu vật:

Cân N (g) mẫu vật và nghiền nhanh chóng trong cối sứ với 5ml HCl 5%. Vitamin C

rất dễ bị oxi hóa trong không khí nhất là khi có sự hiện diện của các ion kim loại (Fe, Cu).

Vì vậy trong khi chuẩn bị mẫu phải cắt hoặc nghiền bằng dao không rỉ và làm nhanh.

Dịch chiết thu được cho vào bình định mức 50ml và thêm nước cất (rửa cối chày và

bã vài lần bằng nước cất rồi đổ vào bình), khuấy đều rồi lọc.

b. Định phân:

- Định chuẩn lại dung dịch iod N/100 với dung dịch Na2S2O3 0,01N để tính hệ số hiệu

chỉnh T của dung dịch iod.

- Chuẩn bị hai erlen. Hút vào mỗi bình 20ml dịch chiết có chứa vitamin C, 5 -10 giọt

dung dịch hồ tinh bột 1% và chuẩn độ ngay bằng dung dịch iod 0,01N đến khi có màu xanh

4. Kết quả

17


Số mg vitamin C trong 1g mẫu vật được tính như sau:

a: thể tích (ml) dung dịch iod 0,01N dùng khi chuẩn độ.

T: hệ số hiệu chỉnh dung dịch iod 0,01N với dung dịch Na2S2O3 0,01N

V: thể tích chung của dịch chiết (50ml)

v: thể tích dịch chiết lấy để chuẩn độ (20ml)

N: trọng lượng mẫu phân tích

0,00088: số gram vitamin C tương ứng với 1ml dung dịch iod 0,01N

18

Tai Lieu Hoa Sinh

Documents

Transcript of Tai Lieu Hoa Sinh