]]t DP จําเพาะ และการแยกบริสุทธิÍ ·...

]]t

การศกษาเชอจลนทรยยอยแปงใหไดผลผลตทมคา DP จาเพาะ และการแยกบรสทธ

เอนไซมอะไมเลสจากเชอ

โดย

นายวสต แกวมหา

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต

สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ

ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ปการศกษา 2556

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

สำนกหอ

สมดกลาง

การศกษาเชอจลนทรยยอยแปงใหไดผลผลตทมคา DP จาเพาะ และการแยกบรสทธ

เอนไซมอะไมเลสจากเชอ

โดย

นายวสต แกวมหา

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต


ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ปการศกษา 2556

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

สำนกหอ


STUDY ON STARCH - CONVERTING MICROORGANISMS YIELDING PRODUCTS

OF SPECIFIC DP AND PURIFICATION OF ITS AMYLASE

By

Wisoot Kaewmaha

A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree

Master of Science Program in Biotechnology

Department of Biotechnology

Graduate School, Silpakorn University

Academic Year 2013

Copyright of Graduate School, Silpakorn University

สำนกหอ


บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร อนมตใหวทยานพนธเรอง “การศกษาเชอจลนทรยยอยแปงใหไดผลผลตทมคา DP จาเพาะ และการแยกบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอ” เสนอโดย

นายวสต แกวมหา เปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต


……...........................................................

(ผชวยศาสตราจารย ดร.ปานใจ ธารทศนวงศ)

คณบดบณฑตวทยาลย

วนท..........เดอน.................... พ.ศ...........

อาจารยทปรกษาวทยานพนธ

1. ผชวยศาสตราจารย ดร.เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ

2. ผชวยศาสตราจารย ดร.สวฒนา พฤกษะศร

3. อาจารย ดร.สนธวฒน ฤทธธรรม

คณะกรรมการตรวจสอบวทยานพนธ

.................................................... ประธานกรรมการ

(รองศาสตราจารย ดร.ธนต ผวนม)

............/......................../..............

.................................................... กรรมการ

(อาจารย ดร.อดศกด จตรพรย)

............/......................../..............

.................................................... กรรมการ

(ผชวยศาสตราจารย ดร.สวฒนา พฤกษะศร)

............/......................../..............

.................................................... กรรมการ

(ผชวยศาสตราจารย ดร.เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ)

............/......................../..............

.................................................... กรรมการ

(อาจารย ดร.สนธวฒน ฤทธธรรม)

............/......................../..............

สำนกหอ


ง

53401210: สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ

คาสาคญ: เอนไซมอะไมเลส/การแยกบรสทธเอนไซม/จลนทรยยอยแปง

วสต แกวมหา: การศกษาเชอจลนทรยยอยแปงใหไดผลผลตทมคา DP จาเพาะ และการแยกบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอ. อาจารยทปรกษาวทยานพนธ: ผศ.ดร.เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ,

ผศ.ดร.สวฒนา พฤกษะศร และ ดร.สนธวฒน ฤทธธรรม. 113 หนา.

เอนไซมอลฟาอะไมเลสทหลงออกสภายนอกเซลลจลนทรยจากเชอ W1 ทคดแยกไดจากดนและนา บานสวนดาเนนสะดวก จงหวดราชบร มความสามารถในการยอยแปงใหมคา DP อยในชวงระหวาง – เพอใชในการผลต microcapsule จงมการศกษาลกษณะโดยการยอมแกรมจลนทรย พบวา เปนแบคทเรยแกรมบวก มลกษณะเปนแทง และนามาผลตเอนไซมอลฟาอะไมเลสและแยกบรสทธโดยผานกระบวนการตกตะกอนดวย ethanol, Q Sepharose anion-exchange และ

Sephacryl S-200 gel filtration chromatography ตามลาดบ เอนไซมถกทาให เขมขนขน โดยวธ

ultrafiltration พบวา คณสมบตของเอนไซมบรสทธ มคา specific activity เทากบ 4,428.502 U/mg

protein มความบรสทธเพมขนประมาณ . เทา และ recovery . % นาหนกโมเลกลของเอนไซมทหาโดยวธ SDS-PAGE คอ 38.6 kDa สอดคลองกบวธ gel chromatography คอ 39 kDa

เอนไซมบรสทธนสามารถทางานไดดทสดท pH และอณหภม 60 oC ซงเอนไซมมความเสถยรท pH 7 และชวงอณหภม 30 - 50 oC คา Km และ Vmax ของเอนไซมทไดคอ 0.01 mg/ml และ 51.02

μmol.ml-1min-1 ตามลาดบ เอนไซมอลฟาอะไมเลสของเชอชนดนถกยบยงดวยไอออนของ Cu2+

ในขณะทไอออนของ Co2+, Mn2+, Fe2+, Ca2+, Mg2+ และ K+เปนตวกระตนใหมคากจกรรมเอนไซมสงขน จากการศกษาสารตงตนทง ชนด พบวา สารตงตนทเหมาะสมทสดคอ แปงขาวเหนยว

เมอศกษาสภาวะทเหมาะสมในการยอยแปงของเอนไซมใหไดผลผลตทม DP ในชวง –

(maltotriose และ maltotetraose) ในปรมาณทสงสด พบวา สภาวะทเหมาะสมคอ pH 7 อณหภม

oC และระยะเวลาในการบมอยางนอย นาท ผลตภณฑทไดนสามารถนาไปศกษาการใชประโยชนในการผลต microcapsule ตอไป

______________________________________________________________________________

ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ลายมอชอนกศกษา........................................ ปการศกษา 2556

ลายมอชออาจารยทปรกษาวทยานพนธ 1. .......................... 2. .......................... 3. ..........................

สำนกหอ


จ

53401210: MAJOR: BIOTECHNOLOGY

KEY WORDS: AMYLASE/PURIFICATION/CHARACTERIZATION

WISOOT KAEWMAHA: STUDY ON STARCH-CONVERTING MICROORGANISMS

YIELDING PRODUCTS OF SPECIFIC DP AND PURIFICATION OF ITS AMYLASE. THESIS

ADVISORS: ASST. PROF. JESDAWAN WICHITWECHKARN, Ph.D. ASST. PROF. SUWATTANA

PRUKSASRI, Ph.D. AND SINTHUWAT RITTHITHAM, Ph.D. 113 pp.

An extracellular -amylase was extracted from W1 strain isolated from soil and water samples at

Bansuan Damnoen Saduak, Rachaburi province. W1 strain is capable of converting starch to products having

specific degree of polymerization (DP) between 3 – 6. W1 strain was investigated using Gram’s staining and it

was shown to be a Gram-positive rod bacterium. The -amylase was produced from W1 strain and purified

through 80% ethanol precipitation, Q sepharose anion-exchange, Sephacryl S-200 gel filtration chromatography

and concentrated by an ultrafiltration, respectively. The purified amylase has specific activity of

4,428.502 U/mg protein with the enzyme purity increased 1.38 folds and the recovery yield of . %. The

molecular mass of the purified enzyme as estimated by SDS-PAGE and gel filtration chromatography were

approximately 38.6 and 39 kDa, respectively. The optimum pH and temperature for the -amylase production

were 7 and 60 oC, respectively. This enzyme had pH stability of 7.0 with thermal stability in the range of

30-50 oC. Km and Vmax values for -amylase were 0.01 mg/ml and 51.02 μmol.ml-1min-1, respectively.

The -amylase from W1 strain was inhibited by Cu2+ but various mono- and divalent cations, such as Co2+,

Mn2+, Fe2+, Ca2+, Mg2+ and K+ stimulated the activity of this enzyme. The optimum substrate for the enzyme was

waxy starch. DP production was examined by analysing the hydrolysated soluble starch that were maltotriose

and maltotetraose (between 3 – 4 of DP) using HPAC. The production of DP was optimized with optimum pH,

temperature and time of 7, 60 oC and for a duration at least 60 minutes, respectively. Further studies on the

production of microcapsules and its properties are being investigated.

_________________________________________________________________________________________

Department of Biotechnology Graduate School, Silpakorn University

Student's signature ........................................ Academic Year 2013

Thesis Advisors' signature 1. ............................... 2. ............................... 3. ..............................

สำนกหอ


ฉ

กตตกรรมประกาศ

วทยานพนธฉบบนไดรบทนอดหนนการวจยจากบณฑตวทยาลย ประเภททนอดหนน

การทาวจยสาหรบนกศกษาระดบบณฑตศกษาจากเงนงบประมาณแผนดน และสาเรจไดดวยความกรณาอยางยงของ ผศ.ดร.เจษฎาวรรณ วจตรเวชการ อาจารยทปรกษาวทยานพนธ ทไดใหความร

คาปรกษา ขอแนะนาตางๆ และชวยเหลอทกๆ ปญหาในการทาวจย พรอมทงตรวจทานแกไขวทยานพนธฉบบนใหถกตองจนเสรจสมบรณ และประสบผลสาเรจไดดวยด ผวจยขอกราบขอบพระคณเปนอยางสงไว ณ โอกาสน

ขอกราบขอบพระคณ ผศ.ดร.สวฒนา พฤกษะศร ดร.สนธวฒน ฤทธธรรม รศ.ดร.ธนต

ผวนม และ ดร.อดศกด จตรพรย ทใหความกรณาเปนกรรมการในการสอบ ใหคาปรกษาและขอเสนอแนะเพมเตมในการวจย ตลอดจนแกไขปรบปรงวทยานพนธฉบบนใหถกตองและสมบรณมากยงขน

ขอกราบขอบพระคณคณาจารยประจาภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากรทกทาน ทใหคาปรกษา และขอแนะนาอนเปนประโยชนตอการศกษาวจยในครงนเปนอยางมาก

ขอกราบขอบพระคณ ผศ.ดร.สเชษฐ สมหเสนโต ทใหคาปรกษา สอนการใชเครองมอ

ตลอดจนอานวยความสะดวกในการใชเครองมอของภาควชาเทคโนโลยอาหารตอการศกษาวจยในครงนเปนอยางด

ขอขอบคณนกวทยาศาสตร และเจาหนาทภาควชาเทคโนโลยชวภาพ และภาควชาเทคโนโลยอาหาร วศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรรม มหาวทยาลยศลปากรทกทานทใหความสะดวกและใหความชวยเหลอในดานเครองมอ อปกรณและสารเคมตลอดในการทาวจยครงน

ขอขอบคณบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ทไดใหทนสนบสนนในการทาวจยครงน

ขอกราบขอบพระคณบดา มารดา ผ มพระคณทกทาน และครอาจารยทไดประสทธประสาทวชาความรใหกบผวจยทงในอดตและปจจบน

ขอบคณพ เพอนและนองทกคนทใหความชวยเหลอและคาแนะนาทเปนประโยชนตอ

การทาวจยน

สำนกหอ


ช

สารบญ

หนา บทคดยอภาษาไทย .................................................................................................................... ง

บทคดยอภาษาองกฤษ ............................................................................................................... จ

กตตกรรมประกาศ ..................................................................................................................... ฉ

สารบญตาราง ............................................................................................................................ ฌ

สารบญรปภาพ .......................................................................................................................... ฎ

บทท

1 บทนา ............................................................................................................................. 1

ความเปนมาและความสาคญของปญหา ................................................................ 1

วตถประสงค ..........................................................................................................

ขอบเขตงานวจย ....................................................................................................

ประโยชนทคาดวาจะไดรบ ...................................................................................

2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ ...................................................................................... 5

แปง (Starch) .......................................................................................................... 5

การผลตมอลโตเดกซตรน ......................................................................................

เอนไซมทเกยวของกบการยอยแปง ....................................................................... 16

ชนดของเอนไซมอะไมเลส ...................................................................................

กระบวนการผลตเอนไซมอะไมเลสจากจลนทรย .................................................. 19

โครมาโตกราฟ (Chromatography) ....................................................................... 19

การแยกโปรตนโดยวธเจลอเลคโตรโฟรซส (Gel electrophoresis) ....................... 27

ตรวจเอกสารและงานวจยทเกยวของ ..................................................................... 31

3 อปกรณและวธดาเนนการวจย .......................................................................................

การตรวจสอบเพอยนยนลกษณะและกจกรรมของเอนไซมจากเชอ W1 ...............

การเพาะเลยงเชอ W1 เพอผลตเอนไซมอะไมเลส .................................................

การแยกบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 .....................................................

การวดปรมาณโปรตน ...........................................................................................

การวดคากจกรรมของเอนไซมอะไมเลส ...............................................................

การศกษานาหนกโมเลกลของอะไมเลสโดยเทคนค Sodium dodecyl

sulfate-polyacryamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) .......................

สำนกหอ


ซ

บทท หนา การศกษาคณลกษณะของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W ทแยกบรสทธ ...............

การศกษาผลของสภาวะตางๆ ทมตอคา DP จากการยอยแปงของ

เอนไซมอะไมเลสจากเชอ W ทแยกบรสทธ ..........................................

4 ผลการทดลองและวจารณผลการทดลอง .......................................................................

การตรวจสอบลกษณะและกจกรรมของเอนไซมจากเชอ W1 ............................... 4

การแยกบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอจลนทรยรหส W1 ................................ 4

การประมาณคานาหนกโมเลกลเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ............................. 50

การหาคณลกษณะของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทแยกบรสทธ ....................

การวเคราะหสภาวะตางๆ ทมผลตอการผลต DP จาเพาะ โดยใชเทคนค HPAC ...

5 สรปผลการศกษา ........................................................................................................... 66

รายการอางอง ............................................................................................................................ 68

ภาคผนวก .................................................................................................................................. 72

ภาคผนวก ก อาหารเลยงเชอจลนทรยและการเตรยมสารเคม ................................ 73

ภาคผนวก ข กราฟมาตรฐานและการคานวณ ........................................................ 82

ภาคผนวก ค ขอมลผลการทดลอง ......................................................................... 100

ประวตผวจย .............................................................................................................................. 113

สำนกหอ


ฌ

สารบญตาราง

ตารางท หนา 1 สมบตทแตกตางกนของอะไมโลสและอะไมโลเพคตน .................................... 5

2 ปรมาณของอะไมโลสในแปงชนดตางๆ ............................................................ 6

3 ความสมพนธระหวางความยาวของอะไมโลสและสของสารประกอบเชงซอน

ของอะไมโลสกบไอโอดน ..................................................................... 7

4 แหลงของจลนทรยและคณสมบต ...................................................................... 18

5 หลกการแยกและทาผลตภณฑใหบรสทธ .......................................................... 20

6 ตวอยางไอออนเอกซเชนจเรซน ......................................................................... 21

7 สารทใช เป นตวกลางในการเชอมไขวกนเปนเมดเจล สาหรบเทคนค

เจลฟ ลเตรชนโครมาโตกราฟ ............................................................. 24

8 ความเขมขนของ Acrylamide ทเหมาะสมกบขนาดของโปรตน ........................ 27

9 ขนตอนการแยกบรสทธของเอนไซมอะไมเลสจากเชอรหส W1 ....................... 49

10 อทธพลของไอออนโลหะและรเอเจนตทมตอกจกรรมของเอนไซมอะไมเลส

จากเชอ W1 ทแยกบรสทธ ..................................................................... 59

11 ผลของสารตงตนทมความจาเพาะตอเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1

ทแยกบรสทธ.......................................................................................... 60

12 อตราสวนของสารในการเตรยม Citrate buffer .................................................. 75

13 อตราสวนของสารในการเตรยม Phosphate buffer ............................................ 75

14 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ Glucose กบคาการดดกลนแสง

ทความยาวคลน 550 นาโนเมตร ............................................................. 82

15 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ BSA กบคาการดดกลนแสง

ทความยาวคลนท 595 นาโนเมตร .......................................................... 84

16 ความสมพนธระหวางคา log นาหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานกบคา Rf ... 87

17 ความสมพนธระหวางคา log นาหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐาน

กบปรมาตรทถกชะออกจากคอลมน ....................................................... 88

18 คากจกรรมเอนไซมอะไมเลสหลงจากการแยกบรสทธของแตละขนตอน ......... 100

19 ปรมาณโปรตนของเอนไซมอะไมเลสหลงจากการแยกบรสทธของแตละ

ขนตอน ................................................................................................... 100

20 ผลการแยกบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอรหส W1 ..................................... 101

สำนกหอ


ญ

ตารางท หนา 21 การศกษา pH ทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอะไมเลส ......................... 102

22 การศกษาอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอะไมเลส .................. 102

23 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซมอะไมเลส ............................... 103

24 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซมอะไมเลส......................... 105

25 การศกษาไอออนโลหะและรเอเจนตความเขมขนของ มลลโมลาร ทมผลตอ

กจกรรมของเอนไซมอะไมเลส .............................................................. 107

26 การศกษาไอออนโลหะและรเอเจนตความเขมขนของ 20 มลลโมลาร ทมผลตอ

กจกรรมของเอนไซมอะไมเลส .............................................................. 108

27 การศกษาสารตงตนทมผลตอกจกรรมของเอนไซมอะไมเลส ........................... 109

28 การศกษาคาจลศาสตรของเอนไซมอะไมเลส .................................................... 109

29 การศกษาผลของ pH ทมตอการยอยแปงของเอนไซมอะไมเลสใหไดคา DP จาเพาะ .............................................................................................. 110

30 การศกษาผลของอณหภมทมตอการยอยแปงของเอนไซมอะไมเลสใหไดคา DP จาเพาะ .............................................................................................. 110

31 การศกษาผลของระยะเวลาทมตอการยอยแปงของเอนไซมอะไมเลสใหไดคา DP จาเพาะ .............................................................................................. 111

สำนกหอ


ฎ

สารบญรปภาพ

ภาพท หนา 1 โครงสรางอะไมโลส .......................................................................................... 1

2 โครงสรางอะไมโลเพคตน ................................................................................. 1

3 แสดงบรเวณทเอนไซมอลฟาอะไมเลสสามารถตดสายโมกลของแปง .............. 3

4 ภาพจาลองการจบตวของอะไมโลสกบสารอนทรย ........................................... 7

5 โครงสรางของอะไมโลเพคตน .......................................................................... 8

6 โครงสรางของอะไมโลเพคตนทเสนอโดย (1) Haworth (2) Staudinger

(3) Meyer และ (4) Meyer ...................................................................... 9

7 DP ของโมเลกลผลตภณฑเดกซโทรสและมอลโตส .......................................... 10

8 การแยกสารตามประจดวยวธ ion-exchange chromatography ........................... 22

9 การแยกสารตามขนาดดวยวธ Gel filtration chromatography ........................... 23

10 สวนประกอบหลกของเครอง HPLC ................................................................. 26

11 การเขาจบของ SDS กบโปรตนซงจะทาให โปรตนมรปรางเปนเสน

เหยยดและมประจลบ ............................................................................. 30

12 การวเคราะหโปรตนดวยวธ SDS-PAGE แบบ discontinuous gel .....................

13 การตรวจสอบการผลตเอนไซมยอยแปงและลกษณะของเชอ W1 .....................

14 โครมาโตแกรมของการทาบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอจลนทรย

รหส W1 ผานขนตอน anion-exchange chromatography โดยใช

Q sepharose เปนตวกลาง ....................................................................... 4

15 โครมาโตแกรมของการทาบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอจลนทรย

รหส W1 ผานขนตอน gel filtration chomatography โดยใช

Sephacryl S-200 เปนตวกลาง ................................................................ 48

16 SDS-PAGE ของเอนไซมเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ................................... 50

17 ความสมพนธระหวางคา log ของนาหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐาน

กบคา Rf .................................................................................................. 51

18 ความสมพนธระหวางคา log ของนาหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐาน

ทง 5 ชนดกบเวลาทโปรตนมาตราฐานถกชะออกมา .............................. 52

19 ผลของ pH ทมตอกจกรรมของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทแยกบรสทธ ... 53

สำนกหอ


ฏ

ภาพท หนา 20 ผลของอณหภมทมตอกจกรรมของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1

ทแยกบรสทธ.......................................................................................... 54

21 ผลของ pH ทมตอความเสถยรของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1

ทแยกบรสทธ.......................................................................................... 56

22 ผลของอณหภมทมตอความเสถยรของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1

ทแยกบรสทธ.......................................................................................... 57

23 Michaelis-Menten ของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ...................................... 62

24 Lineweaver Burk plot ของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ................................ 62

25 ผลของ pH ทมตอความเขมขนของ carbohydrates (ppm.U-1ml-1) ..................... 63

26 ผลของอณหภมทมตอความเขมขนของ carbohydrates (ppm.U-1ml-1) ............... 64

27 ผลของระยะเวลาทมตอความเขมขนของ carbohydrates (ppm.U-1ml-1) ............ 65

28 กราฟมาตรฐานของ glucose โดยการวเคราะหดวยวธ DNS method ................. 83

29 กราฟมาตรฐานของ BSA โดยการวเคราะหดวยวธ Bradford method ............... 85

30 โครมาโตแกรมของสารมาตรฐานโปรตน gel filtration chromatography

(Sephacryl S-200) ทง ชนด ................................................................ 88

31 โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน glucose จากการวเคราะหดวยวธ HPAC ............ 89

32 กราฟมาตรฐานของ glucose .............................................................................. 90

33 โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน maltose จากการวเคราะหดวยวธ HPAC ............ 91

34 กราฟมาตรฐานของ maltose .............................................................................. 91

35 โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน maltotriose จากการวเคราะหดวยวธ HPAC ...... 92

36 กราฟมาตรฐานของ maltotriose ........................................................................ 93

37 โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน maltotetraose จากการวเคราะหดวยวธ HPAC ... 94

38 กราฟมาตรฐานของ maltotetraose ..................................................................... 94

39 โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน maltopentaose จากการวเคราะหดวยวธ HPAC . 95

40 กราฟมาตรฐานของ maltopentaose ................................................................... 96

41 โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน maltohexaose จากการวเคราะหดวยวธ HPAC .. 97

42 กราฟมาตรฐานของ maltohexaose .................................................................... 97

สำนกหอ


1

บทท 1

บทนา

1. ความเปนมาและความสาคญของปญหา แปง (starch) เปนคารโบไฮเดรตทสะสมอยในพชชนสง พบในคลอโรพลาสต (ในใบ)

และในสวนทพชใชเปนแหลงสะสมอาหาร เชน เมลดและหว แปงจดเปนแหลงอาหารทใหพลงงานสง นอกจากนแปงยงเปนผลตภณฑหลกจากพชเศรษฐกจทสาคญของประเทศ เชน มนสาปะหลง

มนฝรง ขาวโพด ขาว และขาวสาล (Nigam และ Singh, 1995) โครงสรางของแปงประกอบดวย

พอลเมอรพนฐาน 2 ชนด ไดแก อะไมโลส (amylose) และอะไมโลเพคตน (amylopectin) โดย

อะไมโลสเปนพอลเมอรเชงเสนทประกอบดวยกลโคสประมาณ 2,000 หนวย เชอมตอกนดวยพนธะ -1,4-glucosidic ดงภาพท 1 สวนอะไมโลเพคตนเปนพอลเมอรเชงกงทประกอบดวยกลโคส สวนทเปนเสนตรงเชอมตอกนดวยพนธะ -1,4-glucosidic และสวนทเปนกงสาขาจะเชอมกนดวยพนธะ -1,6-glucosidic ดงภาพท 2 (กลาณรงค และ เกอกล, 2543)

ภาพท 1 โครงสรางอะไมโลส ภาพท 2 โครงสรางอะไมโลเพคตน

(กลาณรงค และ เกอกล, 2543) (กลาณรงค และ เกอกล, 2543)

จากคณสมบตเฉพาะของแปง ไดมการนาแปงมาใชในอตสาหกรรมอาหาร เพอปรบปรงคณสมบตของอาหาร เชน การทาใหเกดเจล ควบคมการคงตวและเนอสมผสของอาหารจาพวกซอส

ซป และนาปรงรส ปองกนเนอสมผสของอาหารเสยรปเนองจากการบวนการแชแขงและคนรปจากการเยอกแขง (freeze-thaw) สภาวะกรด การทาพาสเจอไรเซซน และสเทอรไรเซซน เปนตน

สำนกหอ


2

นอกจากนยงมการนาแปงมาใชประโยชนในอตสาหกรรมอนๆ เชน อตสาหกรรมกระดาษ

อตสาหกรรมสงทอ อตสาหกรรมยา อตสาหกรรมกาว และอตสาหกรรมแปงดดแปร เปนตน

เนองจากโครงสรางของแปงมนาตาลกลโคสเปนหนวยยอย ดงนนแปงจงเปนแหลงนาตาลกลโคส

ซงเปนวตถดบหลกในอตสาหกรรมนาตาล นาเชอม หรออตสาหกรรมการหมกตางๆ อยางไรกตามการนาแปงธรรมชาต (native starches) ไปใชในอตสาหกรรมยงมขอจากดอยมาก ตอมาจงทา การพฒนาแปงดดแปร (modified starches) ทไดจากกระบวนการทางเคมโดยการใชกรด และการใชเอนไซม ซงเปนทตองการของภาคอตสาหกรรมมากกวา

ในชวงทศวรรษทผานมามการนาเอนไซมมาใชในการยอยแปง แทนการใชกรด เนองจากการยอยแปงดวยกรดตองทาปฏกรยารวมกบความรอนทอณหภมสง ซงประสทธภาพในการยอยแปงนนขนอยกบความเขมขนของกรด เวลา และอณหภม ทงยงกอใหเกดผลตภณฑอนทไมตองการ

เชน เกดสารเฟอรฟรอล ดงนนในปจจบนการยอยแปงดวยกรดจงถกแทนทดวยการใชเอนไซม

เพราะใชสภาวะทไม รนแรง การเกดปฏก รยามความจาเพาะตอชนดผลตภณฑ ควบคม

การเกดปฏกรยาไดงาย ไมเกดผลตภณฑขางเคยง รวมทงไมตองใชอปกรณทมความทนทานตอ

การกดกรอนสงเชนเดยวกบการใชกรด (พกตรประไพ, 2546)

เอนไซมทนามาใชในการยอยแปง ไดแก เอนไซมอลฟาอะไมเลส (EC 3.2.1.1) หรอ -D-

(1,4)-glucan-gluconohydrolase เปนเอนไซมในกลม hydrolase สามารถสลายพนธะ -D-(1,4)-

glucosidic linkage เทานน ลกษณะการทางานเปนแบบสมตด ทาใหไดผลตภณฑเปน กลโคส,

มอลโตส, มอลโตไตรโอส, มอลโตเตตระโอส และเดกซตรน เปนตน ดงภาพท 3 แสดงลกษณะการยอยแปงของเอนไซมอลฟาอะไมเลส (Shafiei และ Ziaee, 2010)

ภาพท 3 แสดงบรเวณทเอนไซมอลฟาอะไมเลสสามารถตดสายโมกลของแปง

(ทมา : http://www.science-projects.com/enzymes.htm)

สำนกหอ


3

ในสตวสามารถผลตเอนไซมดงกลาวได ซงพบในสวนประกอบของนาลาย และตบออน

ขณะทในพชพบเอนไซมนในเมลดทกาลงงอก นยมนาไปใชในอตสาหกรรมเครองดม สาหรบแบคทเรยทสามารถยอยแปงไดนน ไดแก Bacillus subtilis, B. licheniformi, B. stearothermophillus, B. amyloliquefaciens และ P. saccharophila (Demirkan และคณะ, 2005) นอกจากนยงพบเชอราทสามารถยอยแปง ไดแก A. oryzae, A. fumigatus และ A. niger ซงคดแยกไดจากแหลงตางๆ

ตามธรรมชาต เชน ในดน และแหลงนาเสย เปนตน โดยเอนไซมทมาจากแหลงตางกนจะมคณสมบตทแตกตางกนไป และนาหนกโมเลกลของเอนไซมจากสตว พช และจลนทรยจงมคาไมเทากน (Whistler และคณะ, 1984)

จากทกลาวมาขางตน จงมผนาเอนไซมอลฟาอะไมเลส มาประยกตใชในทางอตสาหกรรมดานตางๆอยางแพรหลายมากขน ไดแก การใชในอตสาหกรรมอาหาร เชน การทาขนมปง โดยเอนไซมอลฟาอะไมเลส จะทาหนาทยอยแปงโดไปเปนนาตาลเดกซตรน ตอมายสตจะทาการเปลยนนาตาลเดกซตรน ใหเปนกาซคารบอนไดออกไซดและแอลกอฮอล โดยกลเตนจะทาหนาทกกเกบกาซทไดจากยสต ทาใหแปงโดสามารถขนฟไดด (proofing and baking) นอกจากนยงสามารถใชในการแปรรปแปงเปนสารใหความหวานและนาเชอม (syrups) ไดหลายชนด เชน

maltodexrtrins, maltose syrups, glucose syrups แล ะ fructose syrups ซ ง syrups แ ต ล ะ ช น ด มคณสมบตทางกายภาพและปรมาณความหวาน (DE: dextrose equivalent) ทแตกตางกน ซงสามารถนาไปเปนวตถดบในการผลตอาหารไดหลากหลาย ไดแก ขนมหวาน ไอศกรม ซอส รวมทง soft

drinks เปนตน ใชในอตสาหกรรมสงทอ เพอลดขนาดเสนใยของสงทอ ใชในอตสาหกรรมกระดาษ

เพอยอยแปงใหมความหนด (viscosity) ลดลงสาหรบการผลตกระดาษ ใชในการผลตยา โดยนาเอนไซมอะไมเลสมาเปนสวนประกอบในยาชวยยอยตางๆ สาหรบผทมระบบการยอยอาหารในทางเดนอาหารไมสมบรณ หรอไมปกต และใชทา encapsulation ในทางอาหารและทาง การแพทย

อยางไรกตาม เอนไซมทใชยอยแปงในปจจบน ยงขาดคณสมบตบางประการทสาคญสาหรบอตสาหกรรม เชน ผลตภณฑทไดจากการยอยแปงมกเปน maltodextrin ทมขนาดใหญและเลกปะปนกน ทาใหไดผลตภณฑทมคณสมบตทไมตองการปะปนมาดวย ซงหากมจลนทรยสามารถผลตเอนไซมยอยแปงใหได maltodextrin ทมขนาดหรอ degree of polymerization (DP) เหมาะสมอยในชวงทไมกวางจนเกนไปจะทาใหแกไขปญหานได จงมการคดแยกจลนทรยทผลตเอนไซมยอยแปงใหได maltodextrin ทม DP อยในชวงระหวาง 3 – 6 (maltotriose, maltotetraose, maltopentose

และ maltohexose)

จากการศกษาทผานมามการคดแยกเชอจลนทรยทสามารถผลตเอนไซมยอยแปงเพอใหไดผลตภณฑทมคา DP จาเพาะ จากตวอยางดนและนาตามธรรมชาต และจากบอบาบดนาเสยทงหมด

สำนกหอ


4

10 แหง ซงนามาทาการคดแยกเชอจลนทรยไดทงหมด 100 โคโลน โดยพบวาม เชอท มความสามารถในการผลตเอนไซมยอยแปงไดทงหมด 38 โคโลน (วชรวชย และคณะ, 2549) ตอมาไดมการนาจลนทรยทสามารถผลตเอนไซมยอยแปงจากทคดแยกไดจานวน 25 เชอ มาทดสอบการยอยแ ป ง เพ อว เคราะ หห าผลผลต ท ม ค า DP โดย เค รอง high-performance anion-exchange

chromatography (HPAC) พบวาเชอจลนทรยรหส B1BA (W1) และ LTS1A (W2) มความสามารถในการยอยแปงใหไดผลตภณฑทมคา DP อยในชวง 3-6 (ดาวนภา และคณะ, 2550) ดงนน งานวจยนจงผลตเอนไซมอะไมเลสจากเชอจลนทรยรหส W เพอศกษาการแยกบรสทธและคณลกษณะทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม และศกษาผลผลตทเกดจากยอยแปงของเอนไซมอะไมเลสใหได DP อยในชวงระหวาง 3-6 ตามทตองการได ซงหากงานวจยนสาเรจลงไดกจะเปนประโยชนในการนาเอนไซมไปผลต microencapsulation ใหมประสทธภาพสงสดตอไปได หากงานวจยนตอยอดจนสาเรจและสามารถผลตในระดบอตสาหกรรมได จะสงผลใหผลผลตทางการเกษตรมมลคาเพมสงขนอกดวย

2. วตถประสงค

เพอแยกบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอจลนทรยรหส W1 ทสามารถยอยแปงใหไดผลผลตมคา DP ในชวงระหวาง 3-6 และศกษาคณลกษณะทเหมาะสมของเอนไซมอะไมเลสจากเชอได

3. ขอบเขตงานวจย

3.1 ศกษาการแยกบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 โดยวธตกตะกอนดวย ethanol, anion-

exchange และ gel filtration chromatography

3.2 ศกษาคณลกษณะทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอะไมเลสทแยกบรสทธ

3.3 ศกษาผลผลตทมคา DP ในชวงระหวาง 3-6 จากการยอยแปงในสภาวะตางๆ ของเอนไซมอะไมเลสทแยกบรสทธ

4. ประโยชนทคาดวาจะไดรบ

4.1 ไดเอนไซมอะไมเลสบรสทธจากเชอจลนทรยรหส W1

4.2 ไดคณลกษณะทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอะไมเลสบรสทธ

4.3 ไดผลผลตทมคา DP ในชวงระหวาง 3-6 ตามทตองการ

สำนกหอ


5

บทท 2

เอกสารและงานวจยทเกยวของ

. แปง (Starch) (กลาณรงค และ เกอกล, 2543)

แปงเปนโพลเมอรของกลโคสทมขนาดโมเลกลใหญ มสตรทวไปคอ (C6H10O5)n แปงมหนวยพนฐานเปน anhydroglucose unit เชอมตอกนดวยพนธะ α-glycosidic linkage ทคารบอนตาแหนงท 1 ของหนวยกลโคสกบคารบอนตาแหนงท 4 ของหนวยกลโคสทอยถดไปดานปลายของโมเลกลแปงจะม anomeric carbon (C1) ซงวางอยไมไดจบกบโมเลกลอนๆ ดงนนแตละโมเลกลของแปงจะมดานปลายทมคณสมบตรดวซ (reducing end) นนคอ แปงหนงโมเลกลจะมตาแหนง

reducing end 1 ตาแหนงโมเลกลแปงแบงออกเปน 2 ชนดหลกๆ ตามขนาดโมเลกลและลกษณะการจดเรยงตว สวนหนงประมาณ % ละลายไดในนารอน เรยกวา อะไมโลส (amylose) อกสวนหนงประมาณ % ไมละลายในนารอน เรยกวา อะไมโลเพกตน (amylopectin) ซงอะไมโลสและ

อะไมโลเพคตนมคณสมบตทแตกตางกนดงแสดงในตารางท 1

ตารางท 1 สมบตทแตกตางกนของอะไมโลสและอะไมโลเพคตน (Beynum และ Roels, 1985)

อะไมโลส อะไมโลเพคตน

1. ประกอบดวยโมเลกลกลโคสทตอกนเปน

เสนตรงดวยพนธะ α-1,4

1.โมเลกลกลโคสทตอกนดวยพนธะ α-1,4 และมการแตกกงดวยพนธะ α-1,6

2. ประกอบดวยกลโคส 200-6000 หนวย 2. แตละกงมกลโคส 20-25 หนวย

3. ละลายนาไดนอยกวา 3. ละลายนาไดดกวา 4. เมอตมในนาจะมความขนหนดนอย 4. ขนหนดมากและใส

5. ใหสนาเงนกบสารละลายไอโอดน 5. ใหสมวงแดงหรอสนาตาลแดงกบสารละลาย

ไอโอดน

6. ตมแลวทงไวจะจบตวเปนวนและแผนแขงได 6. ไมจบตวเปนวนและแผนแขง

6

. อะไมโลส (amylose) (กลาณรงค และ เกอกล, 2543)

อะไมโลสเปนโพลเมอรเชงเสนทประกอบดวยกลโคสประมาณ 1,000 – 6,000 หนวย

เชอมตอกนดวยพนธะ α-1, 4-glycosidic linkage อาจพบกงกานสาขาในโมเลกลของอะไมโลสไดบางในปรมาณเลกนอย (Hizukuri, 1985)

โดยทวไปแปงจากธญพช เชน แปงขาวโพด แปงสาล แปงขาวฟาง มปรมาณอะไมโลสสงประมาณ 22-30% สวนแปงจากรากและหว เชน แปงมนสาปะหลง แปงมนฝรง แปงสาคจะมปรมาณอะไมโลสตากวาคออยในชวง 18-24% นาหนกโมเลกลอะไมโลสอยในชวง 105 ถง 106

ดาลตน โดยอะไมโลสในแปงแตละชนดจะมนาหนกโมเลกลทแตกตางกนไป เนองจากแปงแตละช น ด ม degree of polymerization (DP) ของอะไมโลสแตก ต างกน แ ป งมน ฝ รงและแ ป ง

มนสาปะหลงม DP ของอะไมโลสอยในชวง 1,000 ถง 6,000 สงกวาแปงขาวโพดและแปงสาล ซงม

DP ของอะไมโลสในชวง 200 ถง 1,200 แปงทมสายของอะไมโลสยาวมากจะมแนวโนมในการเกดรโทรเกรเดชน (retrogradation) ลดลง (Hizukuri, 1985) ปรมาณและสมบตของอะไมโลสในแปงแตละชนดแสดงดงตารางท 2 และ 3

ตารางท 2 ปรมาณของอะไมโลสในแปงชนดตางๆ (กลาณรงค และ เกอกล, 2543)

แปง ปรมาณอะไมโลส (% น.น. แหง)

Apparent

ปรมาณอะไมโลส (% น.น. แหง)

Absolute

ขาวสาล

ขาวโพด

ขาวเจา ขาวบารเลย

มนฝรง

มนสาปะหลง

พทธรกษา ถวเขยว

28.8

29.4

25.0

25.5

36.0

23.5

43.2

37.9

25.8

22.5

20.5

23.6

16.9

17.8

22.7

30.7

อะไมโลสสามารถรวมตวเปนสารประกอบเชงซอนกบไอโอดนและสารประกอบอนทรยอนๆ เชน butanol, fatty acid, surfactant, phenol และ hydrocarbon ดงภาพ ท 4 สารประกอบเชงซอนเหลานจะไมละลายในนา โดยอะไมโลสจะพนเปนเกลยวลอมรอบสารประกอบอนทรย

(Galliard และ Bowler, 1987) อะไมโลสทมความยาวสายโซมากกวา 45 หนวยกลโคสเมอรวมตว

7

กบไอโอดนจะใหสนาเงนมวง ซงใชเปนลกษณะเฉพาะทบงบอกถงแปงทมอะไมโลสเปนองคประกอบ และใชในการตรวจสอบปรมาณอะไมโลสในแปง

ตารางท 3 ความสมพนธระหวางความยาวของอะไมโลสและสของสารประกอบเชงซอนของ

อะไมโลสกบไอโอดน (กลาณรงค และ เกอกล, 2543)

Chain length (glucose unit) Number of helix turns Color

12 2 None

12-15> 2 Brown

20-30 3-5 Red

35-40 6-7 Purple

>45 9 Blue

ภาพท 4 ภาพจาลองการจบตวของอะไมโลสกบสารอนทรย (Buleon และคณะ, 1998)

การตรวจสอบปรมาณอะไมโลส โดยการทาใหเกดสารประกอบเชงซอนกบไอโอดน และวดสทเกดขนเปนวธการทงายและนยมใชกนมาก แตอาจมขอผดพลาดไดจากความไมอยตวของสทเกดขน นอกจากนไขมนทเกดสารเชงซอนกบอะไมโลสอยเดมจะทาใหอะไมโลสโมเลกลนนจบกบไอโอดนไมได ทาใหคาทวเคราะหไดตากวาความเปนจรง ในกรณนตองทาการสกดไขมนออกกอนการวเคราะหปรมาณอะไมโลส อาจใชวธการวดเอนทรลปในการหลอมเหลวของ starch - lipid

complex แตประสทธภาพของวธการนจะขนกบความสามารถในการละลายของอะไมโลสในตวอยางแปงแตละชนด วธการทมความแมนยามากกวาคอการใช gel permeation chromatography

(GPC) (Salomonsson และ Sundberg, 1994) แตวธการนไมเหมาะกบตวอยางทมจานวนมาก

8

1.2 อะไมโลเพคตน (amylopectin) (กลาณรงค และ เกอกล, 2543)

อะไมโลเพคตนเปนโพลเมอรเชงกงของกลโคส สวนทเปนเสนตรงของกลโคสเชอมตอกนดวย พนธะ α-1,4-glycosidic linkage และสวนทเปนกงสาขาทเปนโพลเมอรกลโคสสายสนม DP

อยในชวง 10 ถง 60 หนวย เชอมตอกนดวยพนธะ α-1,6-glycosidic linkage ดงภาพท 5

ภาพท 5 โครงสรางของอะไมโลเพคตน

หนวยกลโคสทมพนธะ glycosidic linkage มอยประมาณ 5% ของปรมาณหนวยกลโคสในอะไมโลเพคตนทงหมด อะไมโลเพคตนมนาหนกโมเลกลประมาณ 1,000 เทาของอะไมโลสคอ

ประมาณ 107 ถง 109 ดาลตน และมการคนตวตาเนองจากอะไมโลเพคตนมลกษณะโครงสรางเปนกงอะไมโลเพคตน ทาหนาทเปนโครงสรางหลกของเมดแปง ดงนนเมอมอะไมโลเพคตนเพยงอยางเดยวจงยงสามารถรวมตวเปนเมดแปงได

โมเดลโครงสรางของอะไมโลเพคตนเปนแบบการแตกกงแบบสม (random branching)

หลงจากนน clustered branching model ถกเสนอเปนตนแบบของโมเดลทยอมรบกนในปจจบนซงเสนอโดย Hizukuri (1986) ลกษณะทสาคญของโมเดลน ดงภาพท 6 กคอจะมการแบงสายโซกงเปนกลมๆ ตามขนาดความยาวของสายโซทมชวงทแนนอน (certain periodicity) อะไมโลเพคตนประกอบดวยสายโซ (chain) 3 ชนด คอ

(1) สาย A (A–chain) เชอมตอกบสายอนทตาแหนงเดยว ไมมกงเชอมตอออกจากสายชนดน (unbranched structure)

(2) สาย B (B-chain) มโครงสรางแบบกงเชอมตอกบสายอนๆ 2 สาย หรอมากกวา สายโซแบบ B นยงแบงเปนกลมยอย B1, B2, B3 และ B4 ซงมความยาวครอมหนง สอง สาม และ

สคลสเตอร (cluster) ตามลาดบ

9

(3) สาย C (C–chain) แบบสายแกนซงประกอบดวยหมรดวซง 1 หมในอะไมโลเพคตน แตละโมเลกลประกอบดวยสาย C หนงสายเทานน ความยาวของสายกงอะไมโลเพคตนมตงแตขนาดเลกซงม DP ประมาณ 15 หนวย ประกอบดวยสาย A และสาย B ขนาดเลก จนถงโมเลกลขนาดใหญซงม DP ประมาณ 45-60 หนวย ประกอบดวยสาย B สายยาว สายโซเหลานอยรวมตวกนเปนกลมกอน (cluster)

ภาพท 6 โครงสรางของอะไมโลเพคตนทเสนอโดย (1) Haworth (2) Staudinger (3) Meyer และ (4)

Meyer (Buleon และคณะ, 1998)

1.3 Degree of Polymerization (DP) (สรพล, )

คา DP ของผลตภณฑ คอการแสดงถงจานวนของหนวย monomer ในโมเลกลของผลตภณฑ ซงในหวขอเรองเกยวกบแปงกสามารถอธบายไดวา DP คอ จานวนโดยเฉลยของ

anhydroglucose units ตอ 1 สายโมเลกล เชน dextrose DP เทากบ 1, maltose DP เทากบ 2 (ภาพท

) หรอ amylose ประกอบดวย 200 anhydroglucose units ดงนน DP = 200

10

dextrose DP = 1

maltose DP = 2

ภาพท 7 DP ของโมเลกลผลตภณฑเดกซโทรสและมอลโตส

(ทมา : http://www.thaitapiocastarch.org/article25_th.asp)

1.4 Dextrose Equivalent (DE) หรอ Reducing Value (สรพล, )

DE คอ การอธบายหรอแสดงคาปรมาณซงจะทาการคานวณเปรยบเทยบออกมาในหนวยของ dextrose และแสดงเปนหนวยเปอรเซนตของนาหนกแหง เชน dextrose มคา DE = 100 แตถาเปน maltose จะมคา DE = 50

ส ว น 1 โ ม เล ก ล ข อ ง hydrolyzed amylose ห ร อ amylopectin ท ป ร ะ ก อ บ ด ว ย

anhydroglucose 100 หนวยซงอาจประกอบดวย 1 reducing end group กจะทาให มคา DE = 1

เชนกน คา DE โดยทวไปจะใชมากกบพวก depolymerized starch หรอ converted starch เชน

dextrins หรอ syrups และนาตาล

Maltodextrin แบงได ตามคา ทมคาสมมลเดกซโทรส (Dextrose Equivalent, DE) มอลโตเดกซตรนทมคา dextrose equivalent ตามคาอยระหวาง 5-20 maltodextrin ทมคา DE สง แสดงวาโมเลกลของสตารซ ถกยอยไดนาตาลกลโคสมาก จะมความหวานมากกวา maltodextrin ทมคา DE

ตา นาตาลรดวส (reducing sugar) คอ นาตาลทมกลมอลดไฮด (aldehyde) หรอคโตน (ketone)

ทเปนอสระ ถกออกซไดส ไดงายดวยตวออกซไดส(oxidizing agent) อยางออน ตวอยางของนาตาลพวกนไดแก นาตาลโมเลกลเดยว (monosaccharide) ทกชนดเชน นาตาลกลโคส (glucose) นาตาลกาแลคโตส (galactose) นาตาลฟรกโตส (fructose) นาตาลโมเลกลค (disaccharide) บางชนด เชน

นาตาลแลกโทส (lactose) นาตาลมอลโตส (maltose) (พมพเพญ และ นธยา, )

11

. การผลตมอลโตเดกซตรน (กลาณรงค และ เกอกล, 2543)

มอลโตเดกซตรนถกตงชอเรยกกอนทจะมการผลตและใชในทางการคาตงแตชวงป

ซงหมายถงกลมโมเลกลใหญๆ ทสามารถถกยอยดวยกลมอะไมเลสแลวใหนาตาลมอลโตสได เชน

maltotriose, maltotetraose, maltopentose และ maltohexose เปนตน (Alexander, 1992) ปจจบนเปนททราบทวๆ กนวา มอลโตเดกซตรนจดเปนผลตภณฑนาเชอมทมคา DE ตากวา การผลต

มอลโตเดกซตรน นนมอย แบบคอ ( ) แบบขนตอนเดยวและ ( ) แบบสองขนตอน

( ) แบบขนตอนเดยว คอ การยอยแปงโดยกรด (อณหภมมากกวา องศาเซลเซยส)

หรอ เอนไซมอะไมเลส (อณหภม - องศาเซลเซยส) แลวหยดปฏกรยาโดยปรบ pH หลงใหความรอน ทาการกรองกบสารชวยกรอง ปรบส กลนโดยคารบอน (ผงถาน) แลวกรองอกครง

จากนนตมระเหยใหมความเขมขนสงขนแลวทาแหงโดยเครองทาแหงแบบพนผง (spray dryer)

( ) แบบสองขนตอน เรมตนดวยการยอยแปงดวยเอนไซมอะไมเลส ทอณหภม องศาเซลเซยส และหยดปฏกรยาโดยความรอน ถง องศาเซลเซยส ขนาดของ DE จะไดประมาณ

- จากนนกใชนายอยอะไมเลสอกครงหนง (หรออกชนดหนง) ท องศาเซลเซยส จนได DE

ประมาณ - จงหยดปฏกรยาโดยการปรบ pH หรอความรอน จากนนกทาการกรองกบสารชวยกรอง ปรบสกลนกบผงคารบอนแลว กรอง ตมระเหยใหมความเขมขนสงขน และทาแหงโดยเครองทาแหงแบบพนฝอย (spray dryer)

อตสาหกรรมมอลโตเดกซตรน ไดขยายตวอยางรวดเรวในชวง ป ทผานมา มการนาไปใชประโยชนในอตสาหกรรมหลายประเภทโดยเฉพาะอยางยงอตสาหกรรมอาหารและยา ดงน

2.1 การผลตผงปรงรส

ผงปรงรสเปนอตสาหกรรมทมการนามอลโตเดกซตรน มาใชประโยชนมากทสด

มอลโตเดกซตรน จะทาหนาทเปนตวจบสารปรงรสทอยในรปนามนและชวยใหการทาแหงมประสทธภาพดขน กระบวนการทาแหงมหลายวธ แตเปนทนยมมากทสดคอ การทาแหงแบบพนผงและเอกซทรชน

. . การทาแหงแบบพนผง (spray dryer)

เปนกระบวนการทนยมมากทสด กระบวนการมดงน นามนทมกลนรส (flavor oil)

จะถกอมลซไฟดในสารผสมของคารโบไฮเดรตและมอลโตเดกซตรน กอนทอณหภม -

องศาเซลเซยส จากนนนาไปทาใหเยนจนมอณหภม องศาเซลเซยส ใสนามนลงไปใหอมลซไฟดเปนเวลา นาทท - องศาเซลเซยส นาไปทาใหแหงแบบพนผง จะไดผงปรงรสทแหง

12

และสามารถเกบไดนาน คารโบไฮเดรตทใชรวมกบมอลโตเดกซตรนไดแก กมอราบค แปงดดแปรดวยสารทมหม octenyl succinate หรอผลตภณฑทผลตออกมาเปนทางการคา ไดแก capsule และ

N-Loc ของ National Starch, Amiogum 23 ของ American Maize เปนตน มอลโตเดกซตรนจะไปรวมตวกบคารโบไฮเดรตเหลานเกดเปนรางแหจบโมเลกลของสารปรงรสไว ทาใหผลตภณฑทไดมความคงตว ไมดดความชน และไมเกดกลนหน

. . เอกซทรชน (extrution)

กระบวนการผลตมดงน สารละลายของซโครสและมอลโตเดกซตรน จะถกใหความรอนพรอมกบอมลซฟายเออรจนถงอณหภม - องศาเซลเซยส จากนนทาใหเยนถงอณหภม

องศาเซลเซยส ใสนามนสารปรงรสลงไป นาไปผานเครองเอกซทรเดอร (extruder) สารทออกมาจากเครองจะใสลงในตวทาละลายทรางแหของชโครสและมอลโตเดกซตรนทไมละลายนา เชน โอโซโพพานอล (isopopanal) ผงปรงรสจะตกตะกอนออกมา นอกจากนตวทาละลายยงชวยแยกนามนสวนทคงเหลออยทผวของอนภาคปรงรสออกดวย

ปจจบนมผลตภณฑทผลตทางการคาเพอใชในอตสาหกรรมนโดยเฉพาะ เชน Microspore

buds ของ A.E. Staley มอลโตเดกซตรนชนดนมพนทผวกวางและเปนตวทชอบนามนทด, soludex

ไดรบการพฒนาโดย penford Products ผลตภณฑนจะมรพรน มพนทผวมากกวาปกต เทาเพอดดซมนามนสารทชอบนามน

. Bulking agents

มอลโตเดกซตรน ใชในการนมากเปนอนดบ โดยจะใชในผลตภณฑผสมทแหงเนองจากดดความชนนอย ผลตภณฑทใช ไดแก เครองดมผสมผง, ซอสสาเรจรป, gravy mixes, cake และ

cookie mixes เปนตน

. การใชในทางการแพทย

. . อาหารเหลว

มอลโตเดกซตรน ใชเปนคารโบไฮเดรตในอาหารเดกออนทไมมนาตาลแลกโทรสเปนสวนประกอบ มทงในรปของเหลวหรอผงทใชผสมนา ในประเทศเยอรมนจะมมอลโตเดกซตรนทม DE เทากบ ในประเทศบราซลอาหารเดกออนสตรโปรตนถวเหลองใชซโครสและมอลโตเดกซตรนเปนคารโบไฮเดรต

13

การใชประโยชนมอลโตเดกซตรน อกประการคอ ใชเปนอาหารใหกบผปวยทเปนโรคเกยวกบลาไส ซงอยในภาพทสามารถรบประทานไดโดยตรงหรอพนทางหลอดใหอาหาร

Ramsey และคณะ ( ) ไดศกษาถงการใชมอลโตเดกซตรนในอาหารทมแคลลอรสงทใหโดยตรงกบเสนเลอดดารอบนอกหวใจสาหรบผปวยในกรณพเศษ มอลโตเดกซตรนทใชในผลตภณฑนจะตองลดขนาดของ DP ลงใหเหลอ - โดยวธ ultra filtration และ reverse osmosis

นอกจากนย งมงานศกษาของ Smith (1982) ในการผลตอาหารเส รมโพแทสเซยม ซงจะประกอบดวยเกลอโพแทสเซยมหลายชนดและมอลโตเดกซตรนทมคา DE เทากบ จะใชในการรกษาผปวยโรค Hypokalemia

2.3.2 ยาเมด

ไดมสทธบตรและงานวจยมากมายทกลาวถงการใชมอลโตเดกซตรนในยาเมด

Kanig ( ) ไดรายงานวธการในการตอกยาเมดจากเดก ซโทสโดยตรงโดยการใสมอลโท

เดกซตรนอยางนอย % โดยนาสวนผสมของเดกซโทรสผงและมอลโตเดกซตรนผงสเปรยลงในสารละลายมอลโตเดกซตรนทาแหงจนมความชนนอยกวา % และนาไปทาเปนเมด ยงมอกสตรหนงในการผลตเดกซโทรสเมด (Nelson และคณะ, 1977) โดยใชมอลโตเดกซตรนทม DE ตา - %

ผสมกบเดกซโทรสสวนผสมจะเกาะกนเปนกอน

นอกจากนยงมการนามอลโตเดกซตรนมาใชเปนสารชวยยดเกาะ ในการผลตยาเมดทใชเคยวทดานนอกแขงแตนมดานใน (Valentine, 1987)

2.3.3 การใชประโยชนอนๆ

มอลโตเดกซตรนจะใชเปนสวนประกอบในการเคลอบยาเมด ของหวานทเปนเมดและธาตอาหารตางๆ ตวอยางเชนสวนผสมมอลโตเดกซตรน และเกลอโซเดยมคลอไรด ใชเคลอบโพแทสเซยมคลอไรด สวนผสมมอลโตเดกซตรนและกรดฟมารกใชเคลอบเพอลดการการระคายเคองของหลอดอาหารและลาไส เปนตน

. สารทดแทนไขมน

ในชวง - ปทผานมาประชากรในประเทศทพฒนาแลวใหความสนใจเกยวกบการลดนาหนกและสขภาพมากขน ไดมการวจยมากมายเพอหาสารทใชทดแทนไขมน จนกระทงนกวจยจาก Akademie der wissenschaften ger DDR ( ) เยอรมนตะวนออก ไดคนพบมอลโตเดกซตรน

(ทไดจาการยอยแปงมนฝรง) สามารถเกดเจล ซงเจลทเกดขนสามารถนาไปใชทดแทนสวนทไขมนหรอนามนทมผลตภณฑทมไขมนสง เชน ไอศรมหรอนาสลด เจลนจะใหลกษณะเปนครม ใหรส

14

สมผสเหมอนไขมนและลดปรมาณแคลลอรได ปจจบนไดมการผลตภณฑเหลานทางการคาจานวนมากทสาคญไดแก

2.4.1 Paselli SA2 ผลตโดย Avebe ของฮอลแลนด เปนมอลโตเดกซตรน จากแปงมนฝรงและมคา DE เทากบ 2 ผลตภณฑนจะใหเจลททนตอความรอน ใหเนอสมผสเหมอนไขมนและไมมรส ผลตภณฑนจะใชในเบเกอร ใชทดแทนไขมนได 50% นอกจากนยงใชใน certain dips, frosting,

frozen dessert และ spread

2.4.2 Matin MO40 เปนมอลโตเดกซตรน DE ตาทไดจากแปงขาวโพด ขายโดยบรษท

Grain processing corporation (GPC) สหรฐอเมรกา จะใหโครงสรางคลายเจลเมอแขวนลอยในนาใหรสสมผสเหมนไขมน ใชในนาสลด มารการนและ spread

2.4.3 Instand N-0il II เปนผลตภณฑทไดจากแปงมนสาปะหลง จาหนายโดย Nation

starch

ผลตภณฑทง 3 ชนดทกลาวมามคา DE ทตากวา 5 สามารถเกดเจลทเหมาะสมในการแทนทไขมนในไอศกรม มายองเนส นาสลด ของหวานและเครองแตงหนาของหวาน นอกจากน Maltrin

MO40 ยงใหคณสมบตและรสเหมอนไขมน

2.4.4 Oatrim ไดรบการพฒนาจาก Northern regginal research center (1990) โดยการยอยราขาวโอตหรอแปงขาวโอตดวยแอลฟาอะไมเลส จะได maltose และกลตาแคน ซงเมอนามาใชในอาหารจะลดไขมนและคอเรสเตอรอล

2.5 ของหวาน

ไดมการนามอลโตเดกซตรน มาใชในของหวานเหนอจาก frozen dessert ดงน Katt และคณะ (1986) ไดมการนามอลโตเดกซตรน 60% มาใชแทนแปงในการทาพดดง มการนามอลโตเดกซตรน มาใชในของหวานทมเจลลาตนเปนสวนประกอบซง Brown และ Draper (1986) และคณะ (1986a, 1986b) ไดจดสทธบตรแลว โดยสทธบตรหนงไดกลาวถงการนาสวนผสมของนาเชอมขาวโพดผงและมอลโตเดกซตรน ทมขนาดอนภาค 20-200 mesh มาผลตเจลลาตนทสามารถละลายนาเยนได สทธบตรทสอง ใช sorbitan ผสมกบมอลโตเดกซตรน เพมความสามารถในการกระจายผลตภณฑ สทธบตรทสาม สวนผสมของมอลโตเดกซตรน และนาเชอมขาวโพดผงถกควบคมอณหภมใหอยท 42-82 องศาเซลเซยส ทาใหไดผลตภณฑทละลายและแขวนลอยงาย ใหความใส ซงไดมการนามาในของหวานทมเจลลาตนเปนสวนประกอบหลายอยางแลว

15

Steensen และ Weaver (1986) ไดทาการผลตของหวานเจลลาตนทใช aspatame เปนสารใหความหวาน นอกจากนไดเตม manital และมอลโตเดกซตรนลงไปดวย พบวาผลตภณฑสดทายทไดจะมความหวานและรสชาตใกลเคยงทใชชโครสมาก นอกจากน Evans และคณะ (1976) ยงพบวาสวนผสมของอะไมโลเพคตนทไมมกงและมอลโตเดกซตรน DE ตา จะทาใหโปรตนรวมตวในสารละลายเพอใชในการผลตไอศกรมและผลตภณฑทเปนวปครม

2.6 สารเคลอบอาหาร

ไดมการนามอลโตเดกซตรน ไปใชเคลอบอาหารหลายประเภทดงน มการนามอลโตเดกซตรนไปเคลอบเปนกรด เพอปองกนปฎกรยาระหวางกรดกบสวนประกอบอนๆในอาหารทาใหเกบไดนานขน Hurni (1988) ไดใชสวนผสมทประกอบดวยมอลโตเดกซตรน กมและแปงรวมกบสารใหความหวานและเครองปรงตางๆ ผลตสารเคลอบอาหารทนาไปใชกบอาหารทตองนวดและทอด

หรอใชในสตวโดยนาในสตวจะเปลยนสารเคลอบเหลานนนใหกลายเปนรสของสตว นอกจากน

Porter และ Woznicki (1987, 1988) ยงกลาวถงการใชมอลโตเดกซตรนเคลอบในของหวาน

2.7 งานกอสราง

ถงแมจะไมมเอกสารอางอง แตเปนทรจกกนทวไปวามอลโตเดกซตรนจะใชเปนสวนผสมในดนทจะใชอดรอยรวหรอรอยแตกทเกดจากการเจาะ และยงใชเพมสารละลายของแคลเซยมในดนทมปนขาว ซงจะชวยควบคมความหนดของของเหลวขณะทถกปมเขาไปในรอยแตก

2.8 อตสาหกรรมนมและอนๆ

มการนามอลโตเดกซตรน มาใชทดแทนไขมนในนามนสลด บสกต แพนเคก ครมเทยม

icing และ fonant งานวจยในดานนมมากมาย ตวอยางเชน Horn และ Kimball (1971) ไดผลตขนมกมทใชมอลโตเดกซตรน ทดแทนสารใหความหวาน (ซโครสและหรอ นาเชอมขาวโพด)

70% จะชวยลดเวลาในการทาแหงและปรบปรงความยดหยน ความเหนยวและความนมของผลตภณฑ สวนในของหวานพวก marshmallow และ nougat ไดมการใชมอลโตเดกซตรน DE ตาทดแทนโปรตนของวปครม 70% (Horn และคณะ, 1971) มการทดแทนสวนของกลโคสอยางนอย

10% ในลกกวาด (Horn และ Godzicki, 1974) ลกกวาดทไดจะดดความชนไดดกวาเดม แตยงคงความแขงแรงและความใสไวได นอกจากนยงมการนามอลโตเดกซตรนไปใชในการทาหมากฝรง

เปนตน

16

. เอนไซมทเกยวของกบการยอยแปง (พกตรประไพ และ วชย, )

แหลงของเอนไซมสามารถผลตไดจากจลนทรยหลายชนดดวยกน เอนไซมทเกยวของกบการยอยแปงแบงออกได 4 กลม ดงน

3.1 Endoamylase

เปนเอนไซมททางานภายในโมเลกลของแปง ตดพนธะ α- 1, 4 glucosidic ระหวางโมเลกลกลโคสภายในสวนของอะไมเลสและอะไมโลเพคตน เอนไซมในกลมน ไดแก และผลตภณฑทไดจากการทางานของ α-amylase คอ oligosaccharide และ α-limit-dextrins

3.2 Exoamylase

เปนเอนไซมทตดพนธะทจบกนของกลโคสทงพนธะ α-1, 4 และ α-1, 6 glucosidic

เอนไซมในกลมนไดแก glucoamylase, β-amylase และ α-glucosidase ซงการทางานจะตดโมเลกล

กลโคส ทตาแหนงปลายของอะไมเลสและอะไมโลเพคตน ดงนนผลผลตทไดจะเปนกลโคสเพยงอยางเดยว เมอใช glucoamylase และ α-glucosidase หรอได maltose และ α-limit dextrin เมอใช

β-amylase

3.3 Debranching enzyme

เปนเอนไซมทตดพนธะ α- 1, 6 glucosidic เอนไซมในกลมน ไดแก isoamylase และ

pullulanase การทางานของเอนไซมกลมนโดยการยอยพนธะกงของอะไมโลเพคตนหรอการยอยพนธะ α- 1, 6 glucosidic ใน pullulan ผลตภณฑทไดจะเปนโพลแซค-คาไรด

3.4 transferase

เปนเอนไซมททาหนาทตด α- 1, 4 glucosidic ของ donor molecule และเปลยนสวนของ

donor เปน glycosidic accepter ซงเปนการสรางพนธะไกลโคซดกใหม เอนไซมในกลมนไดแก

amylomaltase และ cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) ซงใชในการผลต cyclodextrin

17

4. ชนดของเอนไซมอะไมเลส

4.1 แอลฟาอะไมเลส (α- amylase)

ตดภายในสายโพลเมอรของสตารซ (starch) ทพนธะไกลโคซลทตาแหนง α- 1, 4 แบบสม

ทาใหยอยสตารซ (starch) เปนนาตาลอยางรวดเรวไดเปนนาตาลกลโคส (glucose) มอลโตส

(maltose) และ oligosaccharide เอนไซมแอลฟาอะไมเลส พบทวไปในระบบการยอยอาหาร

(digestive system) ของมนษย และสตว เชน นาลาย ตบออน ในอตสาหกรรมอาหารใชในการยอยแปง (starch hydrolysis) ในขนตอนการทา liquefaction เพอลดความหนดของนาแปง หลงการเกดเจลาตไนซ (gelatinization) เพอผลตนาเชอมกลโคส

4.2 เบตาอะไมเลส (β-amylase)

ตดสตารซ (starch) ทพนธะไกลโคซลทตาแหนง α- 1, 4 เฉพาะสวนปลายสายทไมรดวส

(non reducing end) เขามาทละ 2 หนวย ทาใหไดนาตาลมอลโตส (maltose) ไมพบในนายอยของมนษยแต พบในรา (mold) แบคทเรย (bacteria) เชน Bacillus cereus และพบในผลไมระหวางการสก (ripe) ทงแอลฟาอะไมเลส และเบตาอะไมเลส พบในเมลดธญพช (cereal grain) เชน ขาวสาล

ขาวบารเลย ในการผลตเบยร มการเพาะเมลดธญพชใหงอก (malting) แลวจงเตรยมเวอรต (wort)

ระหวางนเอนไซมอะไมเลสในขาวมอลต จะยอยสตารซ (starch) หากการยอยไดนาตาลมาก เมอนาไปหมกกจะไดแอลกอฮอลสงทอณหภมสงแอลฟาอะไมเลสทางานไดดกวาเบตาอะไมเลสได

เดกตรนสงปรมาณแอลกอฮอลตา ถาอณหภมตา เบตาอะไมเลส ทางานไดด ไดนาตาลมอลโตสมาก

ไดเดกตรนตาเมอนาไปหมกจะไดปรมาณแอลกอฮอลสง

4.3 แกมมาอะไมเลส ( - amylase)

ตดภายในสายโพลเมอรของสตารซ (starch) ไดหลายพนธะทงทพนธะไกลโคซลทตาแหนง α- 1, 4 และ α- 1, 6 จงสามารถยอยอะไมโลเพกตน (amylopectin) ซงมโมเลกลเปนกงกานสาขาโดยจะตดสวนปลายสายทไมรดวส (non reducing end) เขามาทละ 1หนวย ไดนาตาลกลโคส (glucose) ผลตไดโดยรา (mold) แบคทเรย (bacteria)

18

ตารางท แหลงของจลนทรยและคณสมบต (พกตรประไพ และ วเชยร, 2546)

Microbial sources Molecular weight (Da) Optimum temp. (oC)

-amylase

Bacillus subtilis B. amyloliquefaciens B. licheniformis

-amylase

B. cereus B. circulans Psudomonas sp. BQ 6

Glucoamylase

Aspergillus awamori A. niger I A. oryzae I A. oryzae II Penicillium oxalicum I Rhizopus delemar

Pullulanases

Aerobacter aerogenes B. polymyxa Streptomyces sp. no. 280

41,000

49,000

62,000

35,000

53-63,000

37,000

83,700-88,000

99,000

76,000

38,000

84,000

100,000

1,143,000

48,000

70

90

50

60

45-55

60

60

40

55-60

40

50

60

5

19

5. กระบวนการผลตเอนไซมอะไมเลสจากจลนทรย (ดวงพร, 2530)

การผลตอะไมเลสระดบอตสาหกรรมจากจลนทรย มทงราและแบคทเรย สาหรบรา ไดแก

Rhizopus sp., A.oryzae, A. niger แ ล ะ A. candidus ส ว น แ บ ค ท เ ร ย ไ ด แ ก B. subtilis, B.stearothermophilus, B. coagulans, Clostridium sp. และ Ps. Saccharophila ใน ป ค .ศ .1965 ทสหรฐอเมรกามการผลตเอนไซมอะไมเลสเปนอตสาหกรรมโดยใชรา A. oryzae เรยกชอทางการคาของเอนไซมวา taka-amylase วธทใชในการผลตอะไมเลสจากจลนทรยโดยทวไปแบงเปน 2 วธใหญๆ คอ

5.1 กระบวนการหมกในอาหารเหลว

นยมใชในการผลตเอนไซมอะไมเลสจากแบคทเรยและเอนไซมกลโคอะไมเลส จากรา โดยเลยงในถงหมกขนาดใหญ อาหารทใชเลยงจะฆาเชอดวยการใชความรอนทอณหภม 100 – 115

องศาเซลเซยส นาน 15 – 30 นาท ปรมาณตนเชอ 3 - 5% จะตองควบคมการใหอากาศและการกวน

วธนจะใชระยะเวลาสนในการเพมปรมาณการผลตและควบคมสภาพตางๆ ไดงาย แตมขอเสยคอมโอกาสปนเปอนจากจลนทรยอนไดงายและประสทธภาพของจลนทรยลดลงจงจาเปนตองคดเลอกจลนทรยทมประสทธภาพสงๆอยเสมอ

5.2 กระบวนการหมกแบบแหง

วธนนยมใชกบรามากวาแบคทเรย โดยจะเลยงเชอในสภาพทเปน mold bran คอในราขาวทมความชนประมาณ 50% และจะแบงเปนวธยอยตางๆ กน ขนกบภาชนะทใช เชน drum method (ใชทอกระบอก) tray-chamber method (ใชถาด) วธนดทสามารถผลตเอนไซมไดหลายชนด แตมขอเสยคอตองใชแรงงานมากกวาแบบการหมกในอาหารเหลว แตกเหมาะสาหรบประเทศทมคาแรงงานถก มโอกาสในการปนเปอนจากจลนทรยอนงายกวา การเลยงแบบการหมกในอาหารเหลว

. โครมาโตกราฟ (Chromatography)

chromatography เปนเทคนคทนยมใชในการแยกสารชวโมเลกลเนองจากมหลกการประยกตใชไดหลากหลาย สารทแยกไดนนสามารถนามาวเคราะหหรอวดปรมาณไดทนท แลวยงสามารถเตรยมสารในปรมาณมากได หลกการแยกและทาผลตภณฑใหบรสทธแบงออกไดหลายวธขนอยกบคณสมบตเฉพาะตวของสารแตละชนด (รงสร, 2550) ดงตารางท 5

20

ตารางท 5 หลกการแยกและทาผลตภณฑใหบรสทธ (รงสร, 2550)

คณสมบต วธการ ขนาด

ขนาด หรอ มวล - Centrifugation

- Gel filtration

- Dialysis , Ultrafiltration

เลก - ใหญ

เลก

เลก

ประจ - Ion-exchange chromatography

- Electrophoresis

- Isoelectric focusing


เลก

เลก

ความสามารถในการละลาย - Change in pH

- Change in ionic strength

- Decrease in dielectric constant

ใหญ


ใหญ

ความจาเพาะกบสารบางชนด - Affinity chromatography

- Affinity elution

เลก


6.1 Ion-exchange Chromatography

ไอออนเอกซเชนจโครมาโตกราฟ เปนเทคนคทใชแยกโมเลกลชนดตางๆ ออกจากกนโดยอาศยความแตกตางของคาประจ (Net charge) ของโมเลกลเหลานน นนคอสารทจะนามาแยกจะตองมความสามารถในการแตกตวใหประจ ไอออนเอกซเชนจเรซน (ion-exchange resin) เปนวสดทจะใชบรรจลงในคอลมนเพอเปน solid support matrix สาหรบใหสารตวอยางจบเรซนทาจากสารหลายชนด ปรบแตงใหมสมบตจาเพาะของการมประจตางกน จงทาใหโมเลกลทมประจตรงขาม สามารถเขามาจบกบเรซนไดดวยแรงระหวางประจ (ionic force หรอ electrostatic force) ซงสามารถถกไลหรอแทนทไดหากมโมเลกลอนทมความสามารถในการจบกบเรซนไดดกวาเขามาแขงขนแยงจบ จงเรยกเรซนวาเปนตวกลางของการแลกเปลยนประจหรอไอออนเอกซเซนเจอร (ion exchanger) สารทใชเปนเรซนไดแกสารพวกเซลลโลส (cellulose) อะการโรส (agarose) โพลอามน (polyamine)

สารอะครลค (acrylic) หรอโคพอลเมอร (copolymer) ของสตยรนและไดไวนลเบนซนทเรยกวาเปน

“cross-linked styrene divinylbenzene” ลกษณะทสาคญของสารเหลาน คอ มความเปนรพรน

(porosity) ซงมผลดเฉพาะในแงการเพม พนทผวของการแลกเปลยนประจ

ธรรมชาตทางเคมของสารซงเปนเรซนทกลาวมาทงหมดนนไมมประจ อยางมากกมสมบตเปนโพลารเลกนอย เชน จากหมไฮดรอกซล (-OH) ในเซลลโลส ดงนนเพอใหเรซนสามารถทาหนาทแลกเปลยนประจ สารทใชทาเรซนจะถกนามาปรบแตงโครงสรางใหเกดพนธะโควาเลนท

21

ยดแนนกบหมฟงกชน (functional group) ซงเรยกวาเปนลแกนด (ligand) ลแกนดนเองคอสวนของเรซนทแตกตวใหประจ ตวอยางเชน หมคารบอกซลแตกตวใหประจลบ หมไดเอทธลอะมโน-

เอทธล (diethylaminoethyl) แตกตวใหประจบวก จากสมบตการเปนประจของหมลแกนดทาใหแบง

เรซนออกเปน 2 กลมใหญๆ คอ

(1) แคทไอออนเอกซเชนจเรซน (cation-exchange resin) หรอแคทไอออนเอกซเชนเจอร

เปนเรซนชนดแลกเปลยนประจบวก โดยทลแกนดของเรซนชนดนเปนหมจาพวกกรด เมออยใน

ionized form จะมสมบตเปนประจลบ ประจของแคทไอออนเอกซเชนจเรซนจงเปนประจลบ หมทเปนลแกนดนอาจเรยกวาเปน fixed ions ทาหนาทเสมอนเปน stationary phase ของการแลกเปลยนประจโมเลกลทจะเขาจบกบเรซนหรอทเรยกวา เคานเตอรไอออน (counterion) จงตองเปนประจบวก (cation)

(2) แอนไอออนเอกซเชนจเรซน (anion-exchange resin) หรอแอนไอออนเอกซเชนเจอร

เปนเรซนชนดแลกเปลยนประจลบ สมบตตางๆ กจะเปนลกษณะทตรงกนขามกบแคทไอออนเอกซเชนจเรซนคอลแกนดเปนหมฟงกชนจาพวกเบส สภาพ ionized form มสมบตประจบวก ทสาคญคอ

พวกอนพนธของหมแอมโมเนยม ดงทยกตวอยางไวในตารางท 6 เมอประจของลแกนดเปนบวกโมเลกลทจะเปนเคานเตอรไอออนไดจะตองเปนประจลบ (anion)

ตารางท ตวอยางไอออนเอกซเชนจเรซน (รงสร, 2550)

Ligands Resin type Effective

pH range Applications

Triethylaminoethyl

(TEAE)

(Quaternary ammonium)

R-CH2N+(CH3)3

Tertiary ammonium

R-CH2N+ (CH3)2

anion exchange

strong

intermediate

2-11

2-7

strong acids, e.g.

nucleotides

weak acids, e.g.

organic acids

22

ตารางท ตวอยางไอออนเอกซเชนจเรซน (ตอ)

Ligands Resin type Effective

pH range Applications

Diethylaminoethyl(DEAE)

R-(CH2)2N+-CH2CH3

CH2 CH3

Sulphonated

R-SO-3

Carboxylated

R-CH2-O-CH2-COO-

Carboxymethyl (CM)

R-CH2-COO-

anion exchange

weak

cation exchange

strong

intermediate

weak

3-6

2-11

6-10

7-10

weakly polyanionic,

e.g. proteins

amino acids

weak cations; e.g.

peptides

weakly polycationic

e.g. proteins

ภาพท การแยกสารตามประจดวยวธ ion-exchange chromatography

(ทมา http://biotechniquesden.blogspot.com/2012/12/chromatography.html)

23

6.2 Gel Filtration Chromatography

เทคนค เจลฟ ล เตรชนโครมาโตกรา ฟ (gel filtration chromatography) ห รอ Size

exclution หรอ Molecular sieve chromatography เปนเทคนคการแยกสารโดยอาศยคณสมบตความแตกต างกนของขนาด มวลและรปร างของสารตวอยาง ซงคณสมบตของเมดเจลมลกษณะเปนชองวางภายในทเกดจากการเชอมไขว ของโพลเมอร ทใชในการสรางเจล (gel matrix) โดยภายในเมดเจลแตละเมดมขนาดชองวางทจาเพาะยอมให สารทมขนาดโมเลกลคาหนงผานเขาไปในเมดเจลได สวนสารทมขนาดใหญกว าไมสามารถผานเขาไปไดถกชะออกมากบสารละลายบฟเฟอร ทใช ชะหลดออกจากคอลมน ก อน จากหลกการขางต นเหนไดวาสามารถแยกสารทมขนาดเลกและใหญ ออกจากกนได โครงสรางของเมดเจลและการแยกสารตามขนาดโมเลกลในขณะผานลงมาตามคอลมน แสดงดงภาพท

ภาพท 9 การแยกสารตามขนาดดวยวธ Gel filtration chromatography

(ทมา : http://www.erin.utoronto.ca/~w3bio/JBC372/lecture02_2004/img014.gif)

(a) แสดงดงลกษณะของเมดเจล ประกอบด วยสสวนเมทรกซเกดจากการเชอมไขวของโพลเมอรสายยาว โดยระหวางเสนสายเหล านมช องวางอย จากรปเหนไดว ามสารทม

24

ขนาดโมเลกลเลกผานเขาไปวนอยในช องวางน สวนสารทมขนาดใหญ ไมสามารถเข าไปภายในช องวางดงกลาวได

(b) แสดงการเคลอนทของสารตวอยางขณะเคลอนเข าสชนเจล

(c) โมเลกลทมขนาดเลกแทรกผานเข าไปในช องวางภายในเจล ทาใหวนเวยนอยภายในเมดเจลทาใหใช เวลานานกว าจะหลดออกมาภายนอกเจลได ในขณะทสารทมขนาดใหญ ถกชะผ านลงมาตามคอลมนกอน

(d) สารโมเลกลใหญ เคลอนทผานออกจากคอลมน ในขณะทสารขนาดเลกกาลงถกชะให ไหลผ านลงมาตามคอลมน ดงนนสารทมขนาดเลกย อมหลดออกมาจากคอลมนในภายหลง

(e) แสดง elution diagram ของโครมาโตแกรม (chromatogram) ใชบอกถงลาดบหรอชวงเวลาของการแยกสารทมขนาดต างกนออกจากกน โดยการเพมขนของกราฟในชวงแรกเปนคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 280 นาโนเมตร ของสารละลายโปรตนทมขนาดอนภาคใหญสวนเสนกราฟในชวงหลงเป นของโปรตนทมขนาดเลก

ตารางท สารทใช เป นตวกลางในการเชอมไขวกนเปนเมดเจล สาหรบเทคนคเจลฟ ลเตรช น

โครมาโตกราฟ (Gibthai, 2013)

ชอ ชนดของสารทใช ชวงของนาหนกโมเลกลทยอมให

ผานเขาในเมดเจล ( kD )

Sephadex G-

Sephadex G-

Sephadex G-

Sephadex G-

Sephadex G-

Bio-Gel P-

Bio-Gel P-

Bio-Gel P-

Bio-Gel P-

Bio-Gel P-

Dextran

Dextran

Dextran

Dextran

Dextran

Polyacrylamide

Polyacrylamide

Polyacrylamide

Polyacrylamide

Polyacrylamide

0.05 - 0.7

1 - 5

1 - 30

4 - 150

5 – 600

0.1 - 1.8

1 - 6

1.5 - 20

2.4 - 40

5 - 100

25

Bio-Gel P- Polyacrylamide 60 – 400

ตารางท สารทใช เป นตวกลางในการเชอมไขวกนเปนเมดเจล สาหรบเทคนคเจลฟ ลเตรช น

โครมาโตกราฟ (ตอ)

ชอ ชนดของสารทใช ชวงของนาหนกโมเลกลทยอมให

ผานเขาในเมดเจล ( kD )

Sepharose B

Sepharose B

Sepharose B

Sephacryl S100-HR

Sephacryl S200-HR

Sephacryl S300-HR

Sephacryl S400-HR

Sephacryl S500-HR

Agarose

Agarose

Agarose

Acrylic

Acrylic

Acrylic

Acrylic

Acrylic

10 - 4,000

60 - 20,000

70 - 40,000

1-100

5-250

10-1500

20-8000

40-20,000

6.3 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

HPLC เปนเครองมอใชสาหรบแยกสารประกอบทสนใจทผสมอยในตวอยาง โดยกระบวนการแยกสารประกอบทสนใจจะเกดขนระหวางเฟส 2 เฟส คอ เฟสอยกบท (stationary

phase) หรอ คอลมน (column) กบเฟสเคลอนท (mobile phase) ซงจะถกแยกออกมาในเวลาทตางกน สารผสมทอยในตวอยางสามารถถกแยกออกจากกนไดนนจะขนอยกบความสามารถในการเขากนไดดของสารนนกบเฟสทเคลอนทหรอเฟสทอยกบท โดยสารประกอบตวไหนทสามารถเขากนไดดกบเฟสทเคลอนท สารนนกจะถกแยกออกมากอน สวนสารทเขากนไดไมดกบเฟสทเคลอนท หรอเขากนไดดกบเฟสอยกบท กจะถกแยกออกมาทหลงโดยสารทถกแยกออกมาไดนจะถกตรวจวดสญญาณดวยตวตรวจวดสญญาณ (detector) และสญญาณทบนทกไดจากตวตรวจวดจะมลกษณะเปนพค ซงจะเรยกวา โครมาโตแกรม (chromatogram) จาแนกไดอยางกวางตามกลไกการแยกได 4 ประเภท ไดแก

(1) Adsorption chromatography

(2) Partition chromatography

26

(3) Ion-exchange chromatography

(4) Size exclusion chromatography

ภาพท สวนประกอบหลกของเครอง HPLC

(ทมา : http://www.mfu.ac.th/center/stic/index.php/chemical-analysis-instrument-menu/item/126-

high-performance-liquid-chromatography-hplc.html )

สวนประกอบหลกของเครอง HPLC ประกอบดวย (ภาพท )

(1) Mobile phase / Solvent (Reservoir) ตวทาละลายทใชในการชะหรอแยกตวอยาง เปนเฟสเคลอนทมลกษณะเปนของเหลว ทาหนาทในการนาสารตวอยางและตวทาละลายเขาสเฟสทอยกบททบรรจอยในคอลมนซงกระบวนการแยกจะเกดขนภายในคอลมน

(2) Pump ทาหนาทดงตวทาละลายซงทาหนาทเปนเฟสเคลอนทเขาสระบบ HPLC

(3) Injector / Autosampler ทาหนาทในการฉดสารตวอยางเขาระบบ HPLC

(4) Column ภายในบรรจดวยเฟสทอยกบท มลกษณะเปนของแขงหรอเจล ทาใหเกดกระบวนการแยกองคประกอบของสารทสนใจ โดยกระบวนการแยกเกดขนระหวางเฟสทเคลอนทกบเฟสทอยกบท

(5) Detector เปนตวตรวจวดสญญาณ ทาหนาทในการตรวจวดสญญาณของสารทสนใจทไดจากกระบวนการแยก

ลกษณะตวอยางทเหมาะสมในการทดสอบ ตวอยางตองเปนสารละลายทสะอาด ใส ไมมส

ไมตกตะกอน ไมแขวนลอย ซงผานขนตอนการเตรยมตวอยางทเหมาะสม สามารถแยกหรอสกดสง

27

ทสนใจออกจากสงรบกวนไดเปนอยางด ซงกระบวนการเตรยมตวอยางทด มผลอยางมากกบ

chromatogram ทได

7. การแยกโปรตนโดยวธเจลอเลคโตรโฟรซส (Gel electrophoresis) (Gibthai, 2013)

อเลกโตรโฟรซส เปนวธการแยกโปรตนดวยไฟฟา เพอเปรยบเทยบและวเคราะหรปแบบ

(pattern) ของสาร ตวอยางโปรตนจากเนอเยอหรอเซลลทมาจากแหลงตาง ๆ ตรวจสอบความผดปกตของโปรตนทอาจเกดจากการผาเหลา (mutation) แยกและทาใหบรสทธ ทดสอบคณสมบตของโปรตนทางอมมโนวทยา และตรวจหาขนาดของโปรตน (molecular weight) แลววเคราะหโปรตนทแยกไดดวยเทคนคการยอมส การวด activity หรอการตรวจวดดวยวธอน ทงนจะขอกลาว

เฉพาะวธ ยoly-acrylamide gel electrophoresis (PAGE) ซง เปนวธอเลกโตรโฟรซสทใชในการวเคราะหโปรตน

7.1 Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)

เปนการแยกโปรตนโดยใช polyacrylamide gel โดย polyacrylamide gel นจะเกดจากปฏกรยาการเชอมตอกน ของโมเลกลเดยว monomer ของ acrylamide จนไดเปน สายโซยาวและเชอมกนเปนโครงขายดวยพนธะโคเวเลนต (covalent bond) ซงมหมฟงกชน 2 หม (bi-Functional

compound) เชน N, N’-methylene bisacrylamide มตวเรง ปฏกรยาเปน ammonium persulfate และ

N, N, N’, N’- tetramethylene diamine (TEMED) โดย TEMED จะเรงปฏกรยา การเกดอนมลอสระจาก persulfate ทาใหเกดการโพลเมอรไลซขน ปฏกรยาดงกลาวทาใหไดโครงสรางทมลกษณะเปนรพรน รพรนของ polyacrylamide gel จะแปรผกผนกบความ เขมขนของ acrylamide ในสวนผสมของเจล กลาวคอ ถาความเขมขนของ acrylamide ตา ขนาดของรพรนจะใหญ ซงเหมาะ สาหรบแยกโปรตนทมขนาดใหญ และถาเพมความเขมขนของ acrylamide ใหสงขน ขนาดรพรนจะเลกลง

เหมาะสาหรบแยก โปรตนขนาดเลก การแยกโปรตนสวนใหญใชเจลทมความ เขมขนของ

acrylamide อยในชวงรอยละ 5 - 15 ซงความเขมขนทเหมาะสมกบขนาดของโปรตนแสดงในตารางท ดงน

ตารางท 8 ความเขมขนของ Acrylamide ทเหมาะสมกบขนาดของโปรตน (Walker, )

ความเขมขนของ Acrylamide (%) ขนาดนาหนกโมเลกลของโปรตนทตองการแยก

(kDa)

5 60 – 200

10 15 – 70

28

15 10 – 50

polyacrylamide gel สาหรบการวเคราะหโปรตนท นยมใชมสองชนด คอ ชนดทมความเขมขนของ acrylamide เทากนทงแผนในสวนของ resolving gel (หรอ running gel) และชนดทเปน

gradient gel ซงเปนเจลทมความเขมขนของ acrylamide เปลยนไปอยางตอเนอง ทาใหการแยกโปรตนในเจลชนดนดกวา เนองจากโปรตนจะเคลอนทไปหยดตรงทขนาด ของรพรนเทากบขนาดของโปนตน ทาใหเหนแถบโปรตนชดขน การเตรยมเจลชนดนสามารถทาไดโดยใช gradient mixer

หรอ อาจซอเจลสาเรจรป ซงมใหเลอกหลายชวงความเขมขน เชน 4 – 12% acrylamide gel, 4 –

15% acrylamide gel ตามความเหมาะสมของโปรตนตวอยาง

สงทตองพจารณาในการทดลองคอ (วระศกด, 2544)

(1) ลกษณะทางกายภาพของเจล

(2) ตองการใชบฟเฟอรททาใหโปรตนแตกตวหรอไม (3) ตองการใชระบบบฟเฟอรแบบตอเนองหรอไมตอเนอง

(4) คา pH และความเขมขนไอออนกทใชในการแยก

(5) ความเขมขนของ acrylamide gel ทเหมาะสมกบขนาดของโปรตนตวอยางทใชศกษา (6) ความเขมขนของโปรตนตวอยาง ในการนาตวอยางโปรตนมาใชในวธวเคราะหน ควร

ทราบ ปรมาณโปรตนทงหมดของตวอยางกอน เนองจากถาตวอยางมปรมาณนอยเกนไปอาจจะมองไมเหนแถบโปรตนเกดขน แมยอมดวย Silver strain

7. การแยกโปรตนดวย Polyacrylamide ม 2 ระบบ คอ

7.2.1 ระ บ บ ท ไ ม ท า ให โ ป ร ต น เส ย ส ภ าพ (Non-denaturing gel ห ร อ Native gel

electrophoresis)

วธนโปรตน อยในสภาพธรรมชาต ซงสามารถนาโปรตนทแยกไดนไปตรวจสอบหา activity ได แตไมสามารถแยกความแตกตางของ รปราง ขนาด หรอประจของโปรตนได คอ

โปรตนทมนาหนกโมเลกลตางกนอาจเคลอนทไดเทากนในระบบน ดงนนระบบน จงเหมาะสาหรบใชแยกหรอจาแนกโปรตนชนดตางๆ ออกจากกน แตไมเหมาะสาหรบใชตรวจเพอยนยนความบรสทธ หรอหานาหนกโมเลกลของโปรตน การแยกโปรตนในระบบนไดแก วธ isoelectric

focusing (IEF) ซงจะแยกตามคา pI ของโปรตนแตละชนด

29

7.2.2 ระบบททาใหโปรตนเสยสภาพ (Denature systems)

โปรตนทแยกไดไมสามารถนามาทดสอบหา activity ได แตสามารถบอกขนาดนาหนกโมเลกลของโปรตนทตางกนได ระบบนจงนามาใชตรวจสอบความบรสทธและขนาดของโปรตน รวมทงสามารถนาไปตรวจหาคณสมบตของโปรตนทางอมมโนวทยา โดยวธการทา western blot การแยกโปรตนในระบบนไดแก วธ sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gel

electrophoresis (SDS-PAGE) ซง SDS เปนสาร detergent ทาใหโปรตนเสยสภาพ นอกจากนยงมสาร acid-urea, triton-acid-urea เปนตน และวธ Two-dimension gel electrophoresis ในมตแรกจะใชเทคนค IEF และในมตทสองใชเทคนค SDS-PAGE ซงจะเปนการเพมความไวในการตรวจหาโปรตนปนเปอนในงานวจยนจะใชวธ SDS-PAGE ดงนนจะขอกลาวเฉพาะวธ SDS-PAGE

7. วธ SDS-PAGE

หลกการของ SDS-PAGE คอ SDS ซงเปน detergent ทมประจลบจะไปเกาะกบโปรตน ทาใหโปรตนทงหมดม ประจลบ โดย SDS จะจบกบโปรตนในอตราสวนโดยนาหนกคงท (1.4 กรมของ SDS ตอพอลเพปไทด 1 กรม) ทาใหโปรตนทกชนดมคาความหนาแนนของประจตอนาหนกโปรตนเทากน นอกจากน SDS ยงทาใหโปรตนเสยสภาพ เปลยนสภาพจากทรงกลม (globular) ไปอยในสภาพทเหยยดตรง โปรตนทประกอบดวยหนวยหลายหนวยเกาะกนอยจะแยกออกเปนแตละ

หนวยยอย ดงนนการเคลอนทในสนามไฟฟาของโปรตน จงเปนการเคลอนทโดยอาศยความแตกตางของนาหนกโมเลกลเพยงอยางเดยว โดยจะเปนการเคลอนทจากขวไฟฟาลบไปสขวไฟฟาบวกในอตราสวนผกผนกบคา log ของนาหนกโมเลกล ซงสามารถหานาหนกโมเลกลของโปรตนได จากระยะการเคลอนทของโปรตนทตองการทราบนาหนกโมเลกลกบโปรตนมาตรฐานททราบนาหนกโมเลกลแลว นอกจากนการปรากฏของแถบโปรตนเพยงแถบเดยวใน SDS-PAGE ยงเปนตวบงช ถงความบรสทธของโปรตน

30

ภาพท 11 การเขาจบของ SDS กบโปรตน ซงจะทาให โปรตนมรปรางเปนเสนเหยยดและ

มประจลบ

(ทมา : http://www.gibthai.com/services/technicaldetail. php?ID=20)

ภาพท 12 การวเคราะหโปรตนดวยวธ SDS-PAGE แบบ discontinuous gel

(ทมา : http://www.gibthai.com/services/technicaldetail. php?ID=20)

สาหรบการวเคราะหดวย SDS-PAGE นน ตวอยางโปรตนจะถกทาใหเสยสภาพโดยความรอนทอณหภม 100 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2-5 นาท ในสารละลายทม SDS มากเกนพอและมสารประเภทไทออล (Thiol) เปนองคประกอบ เชน -mercaptoethanol เพอทาลายพนธะไดซลไฟด

31

(disulphide bond) ในโปรตน ภายใตสภาวะดงกลาวนโปรตนสวนใหญจะเกาะกบ SDS ในอตราสวนโดยนาหนกทคงท จากนนนาตวอยางโปรตนแตละตวอยางใสในแตละชองของแผนเจล

และนาไปแยกดวยกระแสไฟฟา ซงทงเจลและบฟเฟอรทใชในการแยกม SDS เปนองคประกอบอย โปรตนมาตรฐานจะใหผลในลกษณะเดยวกบเจลชองอนๆ โดยโปรตนจะเคลอนทไปตามนาหนกโมเลกลของตวเองภายหลงจากการแยกดวยกระแสไฟฟา ตาแหนงของแถบโปรตนทแยกออกจากกนจะปรากฏขนเมอยอมดวยส เชน สคแมซบล (coomassie blue) หรอ silver stain

การแยกโปรตนทเราสนใจบนเจลนทาไดโดยเทยบนาหนกโมเลกลระหวางโปรตนตวอยางกบโปรตนมาตรฐาน ในกรณทเรามนใจวา นาหนกของโปรตนทเราตองการ แตกตางจากโปรตนอนๆ อยางชดเจน เราสามารถแยกโปรตนบนเจลเพอนาไปศกษาองคประกอบได โดยทไมตองเทยบ

กบโปรตนมาตรฐานททราบนาหนกโมเลกลแลว

8. ตรวจเอกสารและงานวจยทเกยวของ

ในป ค.ศ. 1960 ไดมการผลตนาตาลกลโคสโดยใชเอนไซมเพยงอยางเดยว ซงมการนาเอนไซมตางๆ มาใชในขนตอนการผลตนาตาลกลโคส ในขนตอนของ liquefaction และ

dextrinization ใชเอนไซมอลฟาอะไมเลสจากแบคทเรย และในขนตอน saccharification ใชเอนไซมกลโคซเดสทไดจากเชอรา ไดผลตภณฑ คอ เดกซโทรสเขมขน 95%

ในป ค.ศ. 1988 มการเตรยมเอนไซมอลฟาอะไมเลสทเสถยร และละลายได โดยการเตมมอลโตเดกซตรนใน fermentation broth เพอยบยงการจบตวกนของเอนไซม และชวยปรบปรงใหเอนไซมละลายไดดขน นอกจากนยงมการนามอลโตเดกซตรนไปใชเปนสารใหความหวานเทยม

เชน nutrasweet ซงกระจายตวไดงายในนา นม และนาผลไม

ซงเอนไซมอลฟาอะไมเลสทนามาใชในอตสาหกรรมสวนมากผลตไดจากการเพาะเลยงจลนทรยชนดตางๆ เชน รา ยสต และแบคทเรย เปนตน เพราะสามารถผลตเอนไซมไดในปรมาณมากและมตนทนในการผลตตา (ปราณ, 2537)

จากทกลาวมาขางตน จงมผสนใจทาการแยกบรสทธและศกษาคณลกษณะทมผลตอเอนไซมอลฟาอะไมเลส และมรายงานการศกษาไวดงตอไปน

ในป ค.ศ. 2003 Nirmala และคณะ ไดมการศกษาเอนไซมอลฟาอะไมเลส ซงผลตจาก

malted finger millet ทาเอนไซมใหบรสทธ โดยการตกตะกอนดวย acetone, DEAE-Sephacel ion-

exchange และ Sephacryl S-200 gel permeation chromatography พบวามความบรสทธของเอนไซมเพมขนถง 26, 17 และ 31 เทา ตามลาดบ เอนไซมมนาหนกโมเลกลของประมาณ 45 กโลดาลตน

32

โดย pH และอณหภมทเหมาะสมตอการทางานประมาณ 5.0 - 5.5 และ 45 - 50 องศาเซลเซยส

ตามลาดบ สวนไอออนของโลหะทมผลยบยงเอนไซม ไดแก Al3+, Fe2+ และ Hg2+ (5 มลลโมลาร)

ในป ค.ศ. 2004 Konsula และคณะ ไดมการศกษาเอนไซมอลฟาอะไมเลส ซงผลตจากจลนทรย B. subtilis ทคดแยกมาจากนมแกะสด โดยพบวาอณหภมทเหมาะสม 40 องศาเซลเซยส

และ pH 7.0 เปนสภาวะทผลตเอนไซมไดปรมาณมากทสด เมอใชอาหารเลยงเชอทมความเขมขนของแปงตา นอกจากนยงพบวาทอณหภม 135 องศาเซลเซยส และ pH 6.5 ใหคากจกรรมสงสดและมความเสถยรตออณหภมสงเมอม Ca2+ รวมดวย อกทงยงไดทาการศกษาชนดของแปงทมผลตอปฏกรยาการยอยแปง พบวาแปงมนฝรง สามารถเกดปฏกรยากบเอนไซมแลวใหปรมาณนาตาลรดวซมากทสด เมอเปรยบเทยบกบแปงชนดอนๆในทกชวงอณหภม

ในป ค.ศ. 2005 Demirkan และคณะ ไดมการศกษาเอนไซมอลฟาอะไมเลส ซงผลตจากจลนทรย B. amyloliquefaciens ทาเอนไซมใหบรสทธดวย 4 ขนตอน คอ การตกตะกอนดวย 80%

เกลอแอมโมเนยมซลเฟต, dialysis, Q Sepharose column และ SP Sepharose column เอนไซมมนาหนกโมเลกลของประมาณ 52 กโลดาลตน โดยอณหภมและ pH ทเหมาะสมตอการทางาน

เทากบ 6.0 และ 55 องศาเซลเซยส ตามลาดบ ความสามารถในการยอยของเอนไซมอลฟาอะไมเลส

บน starch granules จากการ various ชนดของแปง โดยใชการวเคราะหดวย scanning electron

microscopy และ kinetic assays

ในป ค.ศ. 2006 Noman และคณะ ศกษาการทาบรสทธ เอนไซมอลฟาอะไมเลสจาก post-

harvest Pachyrhizus erosus L. tuber โดยใชวธโครมาโตกราฟ DEAE- และ CM-cellulose columns

พบวามความบรสทธของเอนไซมเพมขนถง 110 เทา จาก crude extract ดวยคา recovery เทากบ

22.8% มนาหนกโมเลกลของประมาณ 40 กโลดาลตน จากการทา SDS-PAGE โดยเอนไซมนเปนชนด α-type โดย EDTA เปนรเอเจนททมผลยบยงเอนไซม ยงพบวาเอนไซมนเปน glycoprotein ทมนาตาลอยประมาณ 2.6 % โดยใช phenol-sulfuric acid method เปนวธวเคราะห สวน pH และอณหภมทเหมาะสมตอการทางาน เทากบ 7.5 และ 37 องศาเซลเซยส ตามลาดบ มคา Km เทากบ

0.29% เมอใชแปงเปนสบสเตรต สวนไอออนของโลหะทมผลยบยงเอนไซมอยางรนแรง ไดแก

Cu2+, Fe2+ และ Zn2+ มผลปานกลาง ไดแก Li2+, Hg+ และ Cd2+ และมผลเพยงเลกนอย ไดแก Ag+,

Mg2+ และ K+ สวน Calcium ion ทาใหกจกรรมของเอนไซมเพมขนเปนสองเทา ในขณะท Fe3+,

Mn2+ และ Na+ ทาใหกจกรรมเพมขนเลกนอย

ในป ค.ศ. 2008 Hmidet และคณะ ไดมการศกษาการแยกบรสทธเอนไซมและคณสมบตของเอนไซมอลฟาอะไมเลสททนความรอนจากเชอแบคทเรย Bacillus licheniformis NH1 ศกษาการโคลนนง ศกษาลาดบนวคลโอไทด และศกษาการแสดงออกของยน amyN ในเชอ E.coli โดย

33

เอนไซมถกทาใหบรสทธโดยการตกตะกอนดวยแอมโมเนยมซลเฟต 40 – 60 % คดกรองโดยใชวธโครมาโตกราฟ Sephadex G-100 และ mono Q Sepharose โดยจากการศกษาพบวาเอนไซมมความบรสทธขน มคา specific activity เพมขน 3.08 เทา และ recovery มคาเทากบ 15.9 % มนาหนกโมเลกล 58 กโลดาลตน มความเสถยรในชวง pH 5.0 - 10.0 และทางานไดดทสดในชวง pH 6.5

อณหภมทเหมาะสมตอการทางานทสดคอ 90 องศาเซลเซยส

ในป ค.ศ. 2010 Hmidet และคณะ ไดมการศกษาเอนไซมอลฟาอะไมเลสจาก Bacillus mojavensis A21 และศกษาการแยกบรสทธเอนไซมและคณสมบตทางชวเคมของเอนไซม โดยการแยกบรสทธเอนไซมอลฟาอะไมเลสดวย ultrafiltration, Sephadex G-75 และ mono Q Sepharose

anion-exchange chromatography ตามลาดบ พบวาไดคา specific activity เพมขนถง 15.3 เทา และ

recovery มคาเทากบ 11% มนาหนกโมเลกลของเอนไซมประมาณ 58 กโลดาลตน ดวยวธ SDS-

PAGE และ gel filtration โดย pH และอณหภมทเหมาะสมตอการทางาน เทากบ 6.5 และ 80

องศาเซลเซยส ตามลาดบ ซงเอนไซมชนดนถกยบยงการทางานของเอนไซมดวย EDTA และ Ca2+

ไมสามารถชวยกระตนการทางานของเอนไซมใหเพมขนได ผลผลตหลกทเกดจากการยอยแปง คอ

maltohexaose, maltopentaose และ maltotriose ลาดบกรดอะมโน 10 ชนดแรกจากทางดานปลายสาย N-terminal ของเอนไซมอลฟาอะไมเลสทผานการแยกบรสทธคอ ASVNGTLMQY เมอเปรยบเทยบกบลาดบกรดอะมโนของเอนไซมอะไมเลสอนๆ พบวา ลาดบกรดอะมโน ในตาแหนงท 3 เปนกรดอะมโน Val ในขณะทอะไมเลสจาก Bacillus licheniformis NH1 และ Bacillus sp. SG-

1 ม Leu และ Thr ในตาแหนงท 3 ตามลาดบ

ในป ค.ศ. 2010 Mollania และคณะ ไดศกษาการแยกบรสทธและคณสมบตของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ Geobacillus sp. LH 8 ซงคดแยกไดจากนาพรอนของ Larijah ทอณหภม 65 องศาเซล เซ ยส โดย เอนไซมอลฟ าอะไม เลส ถกสกดและแยกบ รส ท ธดวยว ธ ion-exchange

chromatography ประมาณคานาหนกโมเลกลของเอนไซมอะไมเลสจากเชอชนดนดวยวธ SDS-

PAGE มคาประมาณ 52 กโลดาลตน โดย pH และอณหภมทเหมาะสมตอการทางาน เทากบชวง

5 - 7 และ 80 องศาเซลเซยส ตามลาดบ เอนไซมชนดนถกกระตนดวย Mn2+, Ca2+, K+, Cr3+ และ

Al3+ ในขณะท Mg2+, Ba2+, Ni2+, Zn2+, Fe3+, Cu2+ และ EDTA เปนตวยบยงการทางานของเอนไซมทาใหคากจกรรมเอนไซมลดลง คา Km และ Vmax มคาเทากบ 3 มลลกรมตอมลลลตร และ 6.5

ไมโครโมลตอนาท ตามลาดบ

34

ในป ค.ศ. 2010 Priya และคณะ ไดศกษาการแยกบรสทธ คณสมบตของเอนไซมและการยบยงเอนไซมอลฟาอะไมเลสจาก Rhyzopertha dominica เอนไซมอลฟาอะไมเลสจากเชอชนดนแยกบรสทธโดยวธตกตะกอนดวยเกลอแอมโมเนยมซลเฟต, Sephadex G-25 และ Sephadex G-100

column นาหนกโมเลกลของเอนไซมเทากบ 52 กโลดาลตน pH และอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมเทากบ 7.0 และ 40 องศาเซลเซยส ตามลาดบ พลงงานการกระตนการทางาน

(Activation energy) มคา 3.9 กโลแคลลอรตอโมล คากจกรรมเอนไซมเมอใชสารตงตนเปน starch,

amylose และ amylopectin ในทางตรงกนขามเมอใช dextrins เปนสารตงตนททาใหคากจกรรมเอนไซมตากวาสารตงตนชนดอน เอนไซมอลฟาอะไมเลสชนดนมคา Km 0.98 มลลกรมตอมลลลตร

เมอใช starch เปนสารตงตน เมอศกษาการยบยงเอนไซม citric acid, oxalic acid, salicylic acid,

HgCl2 , tannic acid และสารยบยงเอนไซมอลฟาอะไมเลสจาก wheat เปนตวยบยงการทางานของเอนไซม แต Ca2+ และ Mg2+ เปนตวกระตนการทางานของเอนไซมชนดน

ในป ค.ศ. 2010 Shafiei และคณะ ไดมการทาบรสทธเอนไซมอลฟาอะไมเลสจากเชอ

Nesterenkonia sp. F โดยการตกตะกอนดวย 80% ethanol, Q Sepharose anion-exchange และ

Sephacryl S-200 gel filtration chromatography ตามลาดบ พบวาไดคา specific activity เพมขนถง

10.8 เทา เอนไซมมนาหนกโมเลกลของประมาณ 100 กโลดาลตน โดย pH และ อณหภมทเหมาะสมตอการทางาน เทากบ 7.5 และ 45 องศาเซลเซยส ตามลาดบ โดยเอนไซมมคากจกรรมสงท 0.5 โมลาร NaCl หรอ 1 โมลาร KCl และมคากจกรรมเสรยรเมอใชความเขมขนของเกลอระหวาง

1 โมลาร และ 4 โมลาร สวนไอออนโลหะทมผลยบยงเอนไซม ไดแก Fe3+, Cu2+, Zn2+ และ Al3+

ในขณะท Ca2+ ชวยกระตนกจกรรมของเอนไซม และ EDTA เปนรเอเจนททมผลยบยงการทางานของเอนไซม แต PMSF และ -mercaptoethanol ไมมผลในการยบยงดวย

ในป ค.ศ. 2010 Michelin และคณะ ไดทาการศกษาเชอรา Paecilomyces variotii โดยทาบ ร ส ท ธดวยว ธ DEAE-cellulose ion exchange chromatography, Sephadex G-100 gel filtration

และ electroelution จากการศกษาพบวาเอนไซมอลฟาอะไมเลสมขนาดนาหนกโมเลกล 75

กโลดาลตน (SDS-PAGE) และมคา pI เทากบ 4.5 อณหภมและ pH ท เหมาะสมคอ 60 องศาเซลเซยส และ 4.0 ตามลาดบ เอนไซมนเสถยรเปนเวลา 1 ชวโมงทอณหภม 55 องศาเซลเซยส และมคาครงชวต (t50) เปนเวลา 53 นาททอณหภม 60 องศาเซลเซยส ซงแปงสามารถชวยปองกนการยบยงการทางานของเอนไซมจากความรอนได พบวาเอนไซมอลฟาอะไมเลสนมความเสถยรเพมมากขนเมออยภายใตสภาวะทเปนดาง เอนไซมถกกระตนการทางานดวยแคลเซยมและโคบอลต

เอนไซมนเปนไกลโคโปรตนทมปรมาณคารโบไฮเดรต % มความสามารถในการยอยแปงเปนหลกและสามารถยอย amylose และ amylopectin ไดในปรมาณทรองลงมาคา Kmของเอนไซม

35

อลฟาอะไมเลสทไดจากการทดลองยอยแปงของ Reagent® และ Sigma® คอ 4.3 และ 6.2 มลลกรมตอมลลลตร ตามลาดบ นอกจากนผลผลตทไดจากการยอยแปงสามารถวเคราะหดวยวธ thin-layer

chromatography (TLC) จากการทดลองพบวา oligosaccharides ทไดเปน maltose และ maltotriose

ลาดบกรดอะมโนบางสวนของเอนไซมนมความเหมอนกบเอนไซมอลฟาอะไมเลสทไดจากเชอ

Bacillus sp. ซงเปนการยนยนวาเอนไซมทศกษานเปนเอนไซมอลฟาอะไมเลส

ในป ค.ศ. 2011 Bozic และคณะ ไดทาการศกษาเอนไซมอลฟาอะไมเลสทมประสทธภาพสงในการยอยแปงผลตไดจากเชอ B. licheniformis ATCC 9945 กระบวนการผลตเอนไซมในถงหมก (bioreactor) แบบ batch เปนเวลา 24 ชวโมงทอณหภม 37 องศาเซลเซยส แลวนาเอนไซมมาทาบรสทธโดย gel filtration พบวาคา specific activity เพมขน 6 เทา ม recovery เทากบ 38% และมนาหนกโมเลกลขนาด 31 กโลดาลตน เมอวเคราะหโดย SDS-PAGE นอกจากนไดทาการศกษาคณสมบตของเอนไซมททาบรสทธแลว จากการศกษาพบวา pH และอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม คอ 6.5 และ 90 องศาเซลเซยส ตามลาดบเมอศกษาผลของ CaCl2 ตอความเสถยรของเอนไซมพบวา CaCl2 สามารถสงวนคากจกรรมเอนไซม (enzyme activity) ได 55%

หลงจากบมเอนไซมท 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา ชวโมง และเมอศกษาผลของไอออนโลหะตอกจกรรมเอนไซม พบวา Co2+, Ni2+ และ Ca2+ มผลกระตนกจกรรมเอนไซมไดเลกนอย ในขณะท

Hg2+ มผลยบยงกจกรรมเอนไซมอยางสมบรณ สาหรบการศกษาอตราการเกดปฏกรยา hydrolysis

ใน starch granules ชนดตางๆ ไดแก triticale, ขาวสาล, มนฝรง, horseradish และแปงขาวโพด ทความเขมขน 1% เมอทาปฏกรยาเปนเวลา 4 ชวโมง พบวาอตราการเกดปฏกรยา hydrolysis มคารอยละ 63, 60, 59, 52 และ 37 ตามลาดบ จากคณสมบตขางตนของเอนไซมบรสทธแสดงวาเอนไซมมประสทธผลสงในการยอยแปงหลากหลายชนดไดทอณหภมตากวาอณหภมทเกดการ gelatinization

เอนไซมอลฟาอะไมเลสนจงมศกยภาพสงในการนาไปใชประโยชนในเชงพาณชยและในอตสาหกรรม

สาหรบในประเทศไทย ไดมการคดแยกเชอจลนทรยทสามารถผลตเอนไซมยอยแปง

พรอมทงไดมการศกษาคณสมบตของเชอดงกลาวไวดงน

ในป พ.ศ. 2549 วชรวทย และคณะ ไดทาการคดแยกเชอจลนทรยทสามารถผลตเอนไซมยอยแปง เพอใหไดผลตภณฑทมคา DP จาเพาะ จากตวอยางดนและนาตามธรรมชาต และบอบาบดนาเสยในโรงงานทผลตแปงทงหมด 10 แหง พบวาไดเชอทสามารถผลตเอนไซมยอยแปงทงหมด

38 สายพนธ และนาผลผลตทไดมาวดคา DP พบวาใหคา DP อยในชวง 2 - 3 ซงเปนนาตาล maltose

และ moltotriose

36

ในป พ.ศ. 2550 ดาวนภา และคณะ ไดศกษารปแบบการยอยแปงของเชอทผลตเอนไซมยอยแปงทงหมด 25 สายพนธ ทคดแยกโดยวชรวทย พงศาวภาวฒนและคณะ เพอวเคราะหหาคา DP

โดยเครอง HPAC พบวา เชอจลนทรยรหส B1BA (W1) และ LTS1A (W2) สามารถผลตเอนไซมทมผลผลตทมคา DP อยในชวง 3 - 6 ซงเปนนาตาล moltotriose, maltotetraose, maltopentaose และ

maltohexaose ในปรมาณสง และม glucose กบ maltose ตา ในป พ .ศ. 2551 ลกษนาวด และศรรตน ไดนาเชอจลนทรยรหส W1 และ W2 ทผลต

เอนไซมยอยแปง ซงคดแยกไดจากตวอยางดนและนา ทใหผลผลตทมคา DP อยในชวงระหวาง

3 - 6 จากการทดลองพบวาเชอรหส W1 ทางานไดดทอณหภม 45 - 60 องศาเซลเซยส ความเขมขนแปง 1.5 - 2.0% คา pH 5.5 - 7.5 และระยะเวลาในการบมท 12 ชวโมงสวนเชอรหส W2 ทางานไดดทอณหภม 55 องศาเซลเซยส ความเขมขนแปง 1.0% คา pH 6.5 และระยะเวลาในการบมท 48

ชวโมง

ในป พ.ศ. 2552 แกวสคนธ และพรชนก ไดนาเชอจลนทรยรหส W1 และ W2 ทผลตเอนไซมยอยแปงใหไดผลผลตทมคา DP อยในชวงระหวาง 3-6 จากการทดลองพบวาเชอรหส W1

สามารถทางานไดดทสดทอณหภม 55 องศาเซลเซยส ความเขมขนแปง 1.0% คา pH 5.5 และเชอรหส W2 สามารถทางานไดดทสดทอณหภม 55 องศาเซลเซยส ความเขมขนแปง 1.0% คา pH 5.5 - 6.0

จากงานวจยทผานมายงไมมการแยกบรสทธเอนไซมอะไมเลสยอยแปงทใหผลผลตมคา DP ในชวงระหวาง 3 - 6 และศกษาคณลกษณะของเอนไซม ดงนนงานวจยนจงสนใจทจะผลตเอนไซมอะไมเลสยอยแปงจากเชอจลนทรยรหส W1 ใหผลผลตมคา DP อยในชวงระหวาง 3 - 6

เพอนามาศกษาการแยกบรสทธและคณลกษณะทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอะไมเลสจากเชอจลนทรยชนดน เพอนาไปใชประโยชนทางดานอตสาหกรรมอาหารและทางการแพทยตอไป

37

บทท 3

อปกรณและวธดาเนนการวจย

1. สารเคมทใชในการทดลอง

สารเคม บรษทผผลต

Absolute ethanol Carlo Erba

Acetic acid LAB-SCAN

Acrylaminde Fluka

Agar Lab M Limited

Beef extract Lab M Limited

Bovin serum albumin Fluka

Bromophenol blue Fluka

Calcium chloride Fluka

Coomassie brilliant blue R-250 Fluka

Dipotassium hydrogen phosphate ahydrous Scharlau

3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) Fluka

EDTA Fluka

95% Ethanol Upmarketting General Supply

Ferrous sulfate haptahydrate Fluka

Glucose Fluka

Glycerol Amresco

Glycine Fluka

Hydrochloric acid LAB-SCAN

Iodine Riedel-deHaen

Mannesium sulfate haptahydrate Fluka

Methanol LAB-SCAN

Peptone Lab M Limited

38

85% Phosphoric acid MERCK

Potassium dihydrogen phosphate MERCK

Potassium iodide Riedel-deHaen

Potassium sodium (+) tartrate LAB-SCAN

Sodium acetate LAB-SCAN

Sodium chloride UNIVAR

Sodium dodecyl sulfate SIGMA

Sodium hydrogen carbonate UNIVAR

Sodium hydroxide MERK

Sodium phosphate monobasic-dihydrate Riedel-deHaen

Soluble starch Fluka

Starch from potatoes Fluka

Tris base Riedel-deHaen

Triton X-100 Amresco

Tryptone Lab M Limited

Yeast extract Lab M Limited

นากลน

นา deionize

2. เครองมอ

เครองมอและอปกรณ บรษทผผลต

Autoclave Tomy Model SX-700

Auto pipette Gilson

Biological safety cabinet class II Type AIB3 NUAIRE

Centrifuge Beckman-Coulter

Fast protein liquid chromatography (FPLC) AKTA

High performance anion-exchange chromatography (HPAC) Dionex

Hot air oven Scientific Promotion

Hot plate FRAMO-GERATETECHNI

D-7821

39

Incubator United Instrument

Incubator shaker New Brunswick Scientific

EDISON

Micro tube BIOLINE

Microcentrifuge Hettich Zentrifugen

Microplate reader TECAN

Mini-PROTEAN 3 cell (SDS-PAGE) BIO-RAD

Nylon syringe filter LUBITECH

pH meter Denver Instrument

Pump ROCKER300

Pump ROCKER300

Sonicate KUDOS

Syringe NIPRO

Water bath Group Digital Heat

Vortex Poly Science Gilson

40

วธดาเนนการวจย

1. การตรวจสอบเพอยนยนลกษณะและกจกรรมของเอนไซมจากเชอ W1

1.1 การยอมสจลนทรยสายพนธ W1

ยอมสเชอ W1 เพอใหเหนรปรางลกษณะการเรยงตว เพอจาแนกแบคทเรยออกเปนกลมๆ

ไดตามคณลกษณะของการตดส ดวยวธ Gram staining (อนนต, 2536) ซงการยอมสเพอจาแนกแบคทเรยแบงออกเปน 2 พวกใหญๆ คอ แกรมบวก (Gram positive) ยอมตดสนาเงนอมมวงซงเปนสของ Crystal violet และแกรมลบ (Gram negative) ยอมตดสแดงซงเปนสของ Safranin พวกทตดส Gram negative จะมปรมาณ lipid ท cell wall มากกวา Gram positive ปกต lipid มคณสมบตคอละลายไดใน alcohol ในการยอมเมอหยด alcohol ลงไป alcohol จงละลาย lipid ออก ทาใหเกดรขนาดกวางท cell wall และ complex ของสทอยภายในเซลลกหลดออกมา เมอยอมทบอกครงดวย

Safranin จงทาใหแบคทเรยนนตดสแดง สวนพวกท cell wall ม lipid นอยกตรงขาม พวกนหลงจากหยด alcohol แลวรเปดท cell wall มขนาดแคบ complex ของสกไมสามารถลอดผานออกมาได

ยงคงตดสเดมของ Crystal violet

2. การเพาะเลยงเชอ W1 เพอผลตเอนไซมอะไมเลส

นาโคโลนเดยวของเชอรหส W1 มาเพาะเลยงในอาหารสตร Luria-Bertani (LB) broth

ปรมาตร 20 มลลลตร ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เขยาดวยความเรวรอบ 200 รอบตอนาท เปนเวลา 24 ชวโมง เพอกระตนใหเชอเจรญเตบโต หลงจากนนถายเชอปรมาตร 20 มลลลตรลงใน

starch broth ปรมาตร 1,000 มลลลตร ซงเปนอาหารสาหรบเลยงเชอเพอผลตเอนไซมยอยสลายแปง

ภายใตสภาวะเดยวกน หลงจากนนทาการปนเหวยงดวยเครองปนเหวยงควบคมอณหภม (AvantiTM

Model J-25, Beckman-Coulter) ท 7,500xg เปนเวลา 20 นาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เพอกาจดตะกอนเซลล สวนใสทไดใชเปน crude extract หลงจากนนวดปรมาณโปรตนและกจกรรมของเอนไซม

. การแยกบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1

นา crude extract ทไดจากขอ ตกตะกอนโปรตนดวยเอทานอลเยน (cold ethanol) ความเขมขน 95% โดยคอยๆ เตมลงใน crude extract ใหเปน 80% saturation แลวทงไวขามคนในหองเยน บนเครองกวนแมเหลก จากนนปนตกตะกอนโปรตนท 12,000xg เปนเวลา 15 นาท ทอณหภม

4 องศาเซลเซยส นาตะกอนโปรตนทไดมาละลายดวยโพแทสเซยมฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน

41

50 มลลโมลาร pH 7 (บฟเฟอร A) หลงจากนนทาใหบรสทธมากขนดวยเครอง fast protein liquid

chromatography (FPLC) (AKTA, GE Healthcare) โดยวธโครมาโตกราฟผาน anion-exchange

chromatography (Q Sepharose Fast Flow, GE Healthcare Bio-Sciences AB ข น า ด 11 x 1.6

เซนตเมตร) โดยใชสารละลายบฟเฟอร A เปนตว equilibrate คอลมน และชะโปรตนดวยสารละลายบฟเฟอร A ทมเกลอโซเดยมคลอไรด (NaCl) ชวงความเขมขน – โมลาร อตราการไหล มลลลตรตอนาท แลวนามากาจดเกลอและเพมความเขมขนดวย ultrafiltration ขนาด

molecular weight cut off (MWCO) 10 ก โลดาลตน (Vivaspin, GE Healthcare) ปน เหวยงดวยความเรวรอบ 3,000xg เปนเวลา 15 นาท ท 4 องศาเซลเซยส และวธโครมาโตกราฟผาน gel

filtration chromatography (Sephacryl S-200, Amersham Pharmacia Biotech AB ขน าด 17 x 1.6

เซนตเมตร)โดยใชสารละลายบฟเฟอร A เปนตว equilibrate คอลมนและชะโปรตนดวยอตราการไหล . มลลลตรตอนาท (ใชสารละลายโปรตนมาตรฐาน (ภาคผนวก ข) ในการเทยบหานาหนกโมเลกลของโปรตนตวอยางในขนตอนนดวย) แลวนามาเพมความเขมขนดวย ultrafiltration ขนาด

MWCO 10 กโลดาลตน อกครงในสภาวะเดยวกน วดปรมาณโปรตนและกจกรรมของเอนไซมเมอผานแตละขนตอนของการแยกบรสทธเอนไซม

. การวดปรมาณโปรตน

หาความเขมขนโปรตนโดยวธของ Bradford (Bradford, 1976) โดยปเปตสารตวอยาง 10

ไมโครลตร ใสลงใน 96 wells plate และเตม Bradford dye reagent ปรมาตร 200 ไมโครลตร บมทอณหภมหอง (28 องศาเซลเซยส) 5 นาท หลงจากนนวดคาการดดกลนแสงดวยเครอง microplate

reader (Sunrise, TECAN) ทความยาวคลน 595 นาโนเมตร คานวณหาปรมาณโปรตนของสารตวอยางโดยนาคาการดดกลนแสงของสารตวอยางทวดไดมาคานวณจากสมการของกราฟมาตรฐานโปรตน โดยใชสารละลาย bovine serum albumin (BSA)

. การวดคากจกรรมของเอนไซมอะไมเลส

วดคากจกรรมของเอนไซม โดยใชว ธ dinitrosalicylic acid method (DNS) (Bernfeld,

1955) ปเปตสารตวอยางปรมาตร 100 ไมโครลตร ลงในสารละลาย 2% soluble starch ปรมาตร 100

ไมโครลตร บมในอางนารอนทอณหภม องศาเซลเซยส เปนเวลา นาท หลงจากนนเตม DNS

reagent ปรมาตร ไมโครลตร และนาไปตมในอางนารอนอณหภม องศาเซลเซยส เปนเวลา นาท แลวแชในนาเยนทนท หลงจากนนนาสารตวอยางปรมาตร ไมโครลตร วดคาการ

42

ดดกลนแสงทความยาวคลน นาโนเมตร ดวยเครอง microplate reader และคานวณหาคากจกรรมเอนไซม เทยบจากกราฟมาตรฐานของสารละลายกลโคส

กาหนดให 1 หนวย (Unit, U) คอ ปรมาณของเอนไซมททาใหเกด 1 ไมโครโมลของ reducing

sugar จากการยอยสารละลาย 1% soluble starch ในเวลา 1 นาท ภายใตสภาวะทกาหนด

. การศกษานาหนกโมเลกลของอะไมเลสโดยเทคนค Sodium dodecyl sulfate-polyacryamide

gel electrophoresis (SDS-PAGE) (Laemmli ,1970)

นาเอนไซมมาวเคราะหหาความบรสทธและนาหนกโมเลกลภายใตสภาวะททาใหเสยสภาพทางธรรมชาต (denaturing conditions) โดยการนาโปรตนตวอยางมาผสมกบ sample loading

dye ในอตราสวน 2 ตอ 1 นาไปตมในอางนารอนทอณหภม 95 องศาเซลเซยส เวลา 5 นาท ใชตวอยางท เตรยมไว 20 ไมโครลตร แยกบนแผนเจลโพลอะครลาไมด 12 เปอรเซนต ดวยกระแสไฟฟา 25 มลลแอมป ใชเวลาประมาณ 1-2 ชวโมง หรอสยอมเคลอนทลงมาจนสดแผนเจล

ยอมแผนเจลโพลอะครลาไมดดวย coomassie brilliant blue R-250 เปนเวลา 1 ชวโมงครง หลงจากนนลางสออกดวย Destain solution I เปนเวลา 1 ชวโมง และ Destain solution II ทงไวขามคน

เทยบตาแหนงของแถบโปรตนทปรากฏกบแถบโปรตนมาตรฐานททราบนาหนกโมเลกล (Protein

Marker Broad Range 2 – 212 kDa, BioLabs)

. การศกษาคณลกษณะของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W ทแยกบรสทธ .1 การศกษาผลของ pH ทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม

ศกษาผลของ pH ทเหมาะสมตอกจกรรมของเอนไซม ทาโดยการบมเอนไซมในบฟเฟอรตางๆ ในชวง pH 3.0 - 10.0 บฟเฟอรทใช คอ glycine-HCl buffer ความเขมขน มลลโมลาร (pH

3.0 – 4.0), acetate buffer ความเขมขน มลลโมลาร (pH 5.0 – 7.0), Tris-HCl buffer ความเขมขน

มลลโมลาร (pH 8.0) และ glycine-NaOH buffer ความเขมขน มลลโมลาร (pH 9.0 – 10.0)

บมเปนเวลา 20 นาท ทอณหภม 60 องศาเซลเซยส จากนนวดคากจกรรมของเอนไซม ภายใตสภาวะทกาหนด

.2 การศกษาผลของ pH ทมผลตอความเสถยรตอการทางานของเอนไซม

ศกษาผลของ pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซม ทาโดยการบมเอนไซมในบฟเฟอรชวง

pH ตางๆ เชนเดยวกบการทดลองในขอ .1 เปนเวลา ชวโมง ทอณหภม 60 องศาเซลเซยส วดคากจกรรมของเอนไซมทเหลออยทก ชวโมง ภายใตสภาวะทกาหนด

43

.3 การศกษาผลของอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม

ศกษาผลของอณหภมทเหมาะสมตอกจกรรมของเอนไซม ทาโดยการบมเอนไซมในบฟเฟอรทเหมาะสมทสดจากการทดลองในขอ .1 คอ pH 7 เปนเวลา 20 นาท ในชวงอณหภม

30 – 80 องศาเซลเซยส วดคากจกรรมของเอนไซม ภายใตสภาวะทกาหนด

7.4 การศกษาผลของอณหภมทมผลตอความเสถยรตอการทางานของเอนไซม

ศกษาผลของอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม ทาโดยการบมเอนไซมในบฟเฟอรทเหมาะสมทสดจากการทดลองในขอ 7.1 คอ pH 7 ในชวงอณหภม 30-80 องศาเซลเซยส

เปนเวลา 1 ชวโมง วดคากจกรรมของเอนไซมทเหลออยทก 15 นาท ภายใตสภาวะทกาหนด

7.5 การศกษาผลของไอออนโลหะและรเอเจนตตอกจกรรมของเอนไซม

ศกษาผลของไอออนโลหะและรเอเจนตตอกจกรรมของเอนไซม ทาโดยการบมเอนไซมในสารละลายบฟเฟอรทมไอออนโลหะและรเอเจนตความเขมขน 5 และ 20 มลลโมลาร ทอณหภม 60

องศาเซลเซยสและ pH 7 เปนเวลา 15 นาท จากนนบมทอณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20

นาท แลววดคากจกรรมของเอนไซมทเหลออยภายใตสภาวะทกาหนด

7.6 การศกษาการทางานของเอนไซมทมความจาเพาะตอสารตงตน

ศกษาการทางานของเอนไซมทมความจาเพาะตอสารตงตนชนดตางๆ ไดแก soluble starch,

แปงขาวโพด (corn starch), แปงสาล (wheat starch), แปงขาวเจา (rice starch), แปงมนสาปะหลง

(casava starch) แปงขาวเหนยว (waxy starch) และแปงมนฝรง (potato starch) ทมความเขมขน 1%

บมทอณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท จากนนวดคากจกรรมของเอนไซมภายใตสภาวะทกาหนด

7.7 การศกษาคณสมบตของคาทางจลศาสตรของเอนไซม

ศกษาคาพารามเตอรทางจลศาสตรโดยใช soluble starch เปนสารตงตนทความเขมขน

ชวง 1.0 - 3.0 มลลกรมตอมลลลตร จากนนหากจกรรมของเอนไซมภายใตสภาวะทกาหนด เขยนกราฟระหวาง

V1

กบ ][

1S

แลวคานวณหาคา Km และ Vmax โดยใช Michaelis-Menten equation

44

. การศกษาผลของสภาวะตางๆ ทมตอคา DP จากการยอยแปงของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W

ทแยกบรสทธ

. การศกษาผลของ pH ทมตอการผลต DP จาเพาะ

ปเปตเอนไซมในบฟเฟอรชวง pH ตางๆ เชนเดยวกบการทดลองในขอ .1 ปรมาตร 100

ไมโครลตรลงใน 2% soluble starch ปรมาตร 100 ไมโครลตร แลวบมในอางนารอนทอณหภม

60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท นาไปใหความรอนประมาณ 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15

นาท เพอหยดการทางานของเอนไซม

.2 การศกษาผลของอณหภมทมตอการผลต DP จาเพาะ

ปเปตเอนไซมในบฟเฟอรท pH เหมาะสมจากการทดลองในขอ .1 คอ pH 7 ปรมาตร 100

ไมโครลตรลงใน 2% soluble starch ปรมาตร 100 ไมโครลตร แลวบมในอางนารอนทอณหภมชวง

- 8 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท นาไปใหความรอนประมาณ 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท เพอหยดการทางานของเอนไซม

.3 การศกษาผลของระยะเวลาทมตอการผลต DP จาเพาะ

ปเปตเอนไซมในบฟเฟอรท pH และอณหภมทเหมาะสมจากการทดลองในขอ .1 และ 8.2

คอ 7 และ 60 องศาเซลเซยส ตามลาดบ ปรมาตร 100 ไมโครลตรลงใน 2% soluble starch ปรมาตร

100 ไมโครลตร แลวบมในอางนารอนอณหภมทเหมาะสมจากการทดลองในขอ 8.2 แลวเกบผลตามระยะเวลา 10, 20, 30, 40, 50 และ 60 นาท นาไปใหความรอนประมาณ 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท เพอหยดการทางานของเอนไซม

หลงจากนนนาตวอยางจากการทดลองในขอ 8. - 8.3 ไปปน เหวยงดวย เค รอง

microcentrifuge (MIKRO, Hettich Zentrifugen) ท 8000xg เปนเวลา 10 นาท นาสวนใสมาเจอจางตวอยางใหลดลง 10 เทา ดวยนาปราศจากไอออน กรองผานตวกรอง cellulose acetate ขนาด 0.2

ไมโครเมตร แลวว ดค า DP โดยใช เค รอง high performance anion-exchange chromatography

(HPAC) กรณทยงไมนาตวอยางมาวดคา DP ทนท ใหเกบตวอยางไวทอณหภม -8 องศาเซลเซยส

8.4 การวเคราะหคา DP ดวยเครอง HPAC

ในการวเคราะหหาคา DP ของตวอยาง ทาโดยการฉดตวอยางเขาไปในเครอง HPAC

(ICS – 3000, Dionex) โดยกาหนดสภาวะตางๆ ดงน

8.4.1 Column ชนด CarboPac 200 Analytical ขนาด 4 X 250 มลลเมตร และ CarboPac

PA–200 Guard ขนาด 4 X 50 มลลเมตร

45

8.4.2 ใช Gradients ประกอบดวยสาร ชนด คอ

(1) Eluent A คอ นาปราศจากไอออน (deionized water)

(2) Eluent B คอ . โมลาร โซเดยมไฮดรอกไซด (sodium hydroxide)

(3) Eluent C คอ . โมลาร โซเดยมอะซเตต (sodium acetate)

โดยสารแตละชนดตองผานการกรองดวย cellulose acetate membrane ขนาด 0.45

ไมโครเมตร และผานการไลกาซดวยเครอง sonicator เปนเวลา 30 นาท

.4.3 ปรบ gradient pump นาปราศจากไอออน โซเดยมไฮดรอกไซดและโซเดยมอะซเตต

เปน 75, 20 และ 5% ตามลาดบ ความดนอยในชวงระหวาง 2000 – 3000 psi และตงอตราการไหลเทากบ . มลลลตรตอนาท เวลาทใชในการฉดสารตวอยางแตละชนดเทากบ 6 นาท

46

บทท 4

ผลการทดลอง

4.1 การตรวจสอบลกษณะและกจกรรมของเอนไซมจากเชอ W1

ภาพท การตรวจสอบการผลตเอนไซมยอยแปงและลกษณะของเชอ W1

(ก) การเกด clear zone บน starch agar plate ของเชอ W1

(ข) ยอมแกรมดลกษณะและการตดสของเชอ W1 ภายใตกลองจลทรรศน

กาลงขยาย 100x

จากการศกษาลกษณะของเชอจลทรยรหส W1 ทคดแยกไดจากดนและนา บานสวนดาเนนสะดวก จงหวดราชบร และเกบไวทอณหภม -80 องศาเซลเซยส นามาเลยงบนอาหารแขงทมสวนประกอบของแปง พบวา มลกษณะโคโลนแผ แบน ขาวขน ขอบหยก หลงจากนนหยดสารละลายไอโอดนรอบๆ โคโลนของเชอ เกดบรเวณใส (clear zone) รอบโคโลน (ภาพท ก)

แสดงวา เชอจลนทรยรหส W1 ทคดแยกได ยงคงมความสามารถในการยอยแปงได หลงจากนนจงตรวจสอบลกษณะและการตดสของเชอดวยวธ Gram’s staining สองภายใตกลองจลทรรศน

(ก)

(ข)

47

กาลงขยาย 100x พบวา มลกษณะเปนแทง ยอมตดสมวง แสดงวาเปนแบคทเรยแกรมบวก (ภาพท

ข) เมอตรวจสอบลกษณะเชอและการผลตเอนไซมยอยแปงแลว จงสามารถนาไปผลตเอนไซมเพอแยกบรสทธและศกษาคณลกษณะทเหมาะสมตอไปได

4.2 การแยกบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอจลนทรยรหส W1

หลงจากตรวจสอบเชอจลนทรยรหส W1 แลว นาเชอมาเลยงในอาหารเหลวทมแปงความเขมขน 1% (w/v) เปนสวนประกอบแลวแยกสวนของตะกอนเซลลออก สวนใสทไดใชเปนเอนไซมสกดหยาบ (crude extract) ในการแยกบรสทธเอนไซม เมอนาไปวดคากจกรรมเอนไซมและปรมาณโปรตน พบวามคาเทากบ 13,405 U และ 55.5 mg protein ตามลาดบ (ตารางท ) นาสวนของ crude

extract ทไดไปแยกบรสทธโดยวธตกตะกอนดวยเอทานอล (80% saturation) ละลายตะกอนดวยสารละลายบฟเฟอร A ตามดวยขนตอนการแยกใหบรสทธดวย anion-exchange chromatography ทมตวกลางเปน Q sepharose ชะคอลมนดวยสารละลายบฟเฟอร A

ภาพท 14 โครมาโตแกรมของการทาบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอจลนทรยรหส W1 ผานขนตอน anion-exchange chromatography โดยใช Q sepharose เปนตวกลาง

โดย คอ คา OD280 (mAU)

คอ คา conductivity (mS/cm)

คอ คากจกรรมของเอนไซมอะไมเลส (U)

0

2

4

6

8

10

0

200

400

600

800

1000

1200

0 50 100 150 200 250

Activ

ity (U

)

OD 28

0 (m

AU)

Time (min)

0

20

40

60

80

100

Cond

uctiv

ity (m

S/cm

)

48

จากผลการทดลองทไดดงแสดงในภาพท 14 พบวา โปรตนทไมสามารถจบกบตวกลางของคอลมนจะถกชะออกมาจากคอลมนในชวง fraction ท 1 - 16 โดยนาโปรตนทถกชะออกมาในชวงดงกลาวไปหาคากจกรรมของเอนไซมอะไมเลส ซงไมพบวามคากจกรรมของเอนไซม โปรตนทจบกบ Q sepharose จะถกชะออกมาจากคอลมนดวยสารละลายบฟเฟอร B (สารละลายบฟเฟอร A

ทม NaCl ความเขมขน 1 โมลาร) โดยทาเปนขนตอน (stepwise) ทมความเขมขนของเกลอชวง

0.2 - 1 โมลาร ซงใน fraction ท 17 - 24 ชวงของเกลอ NaCl ความเขมขน 0.2 โมลาร พบคากจกรรมของเอนไซมอะไมเลส แตเมอความเขมขนของเกลอ NaCl เพมสงขน ไมพบคากจกรรมของเอนไซม จงนา fraction ทพบคากจกรรมเอนไซมอะไมเลสมารวมกน แลวนามากาจดเกลอและเพมความเขมขนดวย ultrafiltration เพอนาไปแยกบรสทธในขนตอนตอไป

ภาพท โครมาโตแกรมของการทาบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอจลนทรยรหส W1 ผาน

ขนตอน gel filtration chomatography โดยใช Sephacryl S-200 เปนตวกลาง

โดย คอ คา OD280 (mAU)

คอ คากจกรรมของเอนไซมอะไมเลส (U)

นาเอนไซมเขมขนทไดมาแยกบรสทธตอโดยใชเทคนค gel filtration chromatography ทมตวกลางเปน Sephacryl S-200 ชะคอลมนดวยสารละลายบฟเฟอร A จากผลการทดลองดงภาพท

ปรากฏวา โปรตนเคลอนทออกจากคอลมนตามขนาดของโมเลกลซงถกแยกออกเปน 2 peaks

(กราฟเสนทบสนาเงน) ซงอยในชวง fraction ท - หลงจากนนนาไปวดคากจกรรมเอนไซม

0

500

1000

1500

2000

2500

0

50

100

150

200

250

0 100 200 300 400 500Ac

tivity

(U)

OD 28

0(m

AU)

Time (min)

49

พบวา fraction ท 5 ใหคากจกรรมของเอนไซมอะไมเลส (กราฟเสนประสแดง) สงทสด จงเลอก

fraction ทมกจกรรมเอนไซมสงทสดไปเพมความเขมขนดวย ultrafiltration เพอนาไปวเคราะหหาขนาดโมเลกลของเอนไซม คณลกษณะทเหมาะสมและคา DP ทเหมาะสมตอไป

ตารางท ขนตอนการแยกบรสทธของเอนไซมอะไมเลสจากเชอรหส W1

Purification

steps

Volume

(ml)

Total

activity (U)

Total

protein

(mg)

Specific

activity

(U/mg)

Recovery

(%)

Purification

(fold)

Crude extract 900 13,405.489 55.466 241.690 100 1

Ethanol, 80% 50 7,593.953 12.326 616.106 56.6 2.5

Q sepharose +

ultrafiltration 2 2,041.944 0.525 3,890.177 15.2 16.1

Sephacryl S-200

+ ultrafiltration 2.5 1,525.459 0.344 4,428.502 11.4 18.3

ขนตอนการแยกบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 โดยวธตกตะกอนดวย ethanol ผานขนตอน anion-exchange chromatography โดยใชคอลมน Q sepharose ผานขนตอน gel filtration

chromatography โดยใชคอลมน Sephacryl S-200 และถกทาใหเขมขนขนดวยวธ ultrafiltration จากตารางท พบวา คากจกรรมของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทผานการแยกบรสทธเพมสงขน แตมปรมาณโปรตนลดลงเมอเทยบกบ crude extract ของแตละขนตอน หลงจากผานขนตอนสดทายของการแยกบรสทธ ปรากฏวา total activity, total protein, specific activity และ purification fold

เทากบ 1,525.459 U , 0.344 mg , 4,428.502 U/mg และ 18.3 เทา ตามลาดบ ซงเมอเปรยบเทยบกบงานวจยของ Shafiei และคณะ ( ) เอนไซมผลตจากเชอ Nesterenkonia sp. F มคา specific

activity และ purification สงกวาโดยใชขนตอนการแยกบรสทธเดยวกน ซงรายงานผลการทดลองทไดคอ U/mg และ . เทา ตามลาดบ แตเอนไซมอลฟาอะไมเลสจากเชอ W1 ยงมคา purification นอยกวาเมอเปรยบเทยบกบงานวจยของ Noman และคณะ (2006) เปนเอนไซมอลฟาอะไมเลสทผลตจากเชอจาก post-harvest Pachyrhizus erosus L. tuber ซงไดรายงานคา purification เพมขน 110 เทา และงานวจยของ Michelin และคณะ (2010) เปนเอนไซมอลฟาอะไมเลสทผลตจากเชอรา Paecilomyces variotii รายงานคา purification เพมขน . เทา

50

. การประมาณคานาหนกโมเลกลเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1

4.3.1 การศกษานาหนกโมเลกลของอะไมเลสโดยใชเทคนค SDS-PAGE

การนาเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทผานการแยกบรสทธของแตละขนตอนมาวเคราะหดวยเทคนค SDS-PAGE เพอหานาหนกโมเลกลในสภาวะททาใหโปรตนเสยสภาพ ดงแสดงในภาพท 16 จากผลการทดลองแสดงใหเหนวา เอนไซมอะไมเลสทผานการแยกบรสทธในขนตอนสดทายทผาน gel filtration chromatography (แถวท ) ปรากฏแถบของโปรตนเดนชดเพยงแถบเดยว เมอเปรยบเทยบกบแถบโปรตนมาตรฐานในแถวท มนาหนกโมเลกลอยระหวางประมาณ . กบ 42.7 กโลดาลตน ดงนนจงคานวณหานาหนกโมเลกลของเอนไซมอะไมเลสดวยวธเปรยบเทยบคา Rf กบโปรตนมาตรฐาน ไดผลดงภาพท ซงเทยบไดจากกราฟความสมพนธระหวางคา log ของนาหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานกบคา Rf พบวา เอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 มนาหนกโมเลกลประมาณ . กโลดาลตน (การคานวณ ในภาคผนวก ข)

ภาพท 6 SDS-PAGE ของเอนไซมเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 โดย แถวท 1 : protein maker ;

แถวท 2 : เอนไซมอะไมเลสสกดหยาบ (rude extract) ; แถวท : เอนไซมอะไมเลสผานการตกตะกอนดวยเอทานอลเยน ; แถวท 4 : เอนไซมอะไมเลสผานการแยกบรสทธโดยใชเทคนค anion-exchange chromatography และ แถวท 5 : เอนไซมอะไมเลสสผานการแยกบรสทธโดยใชเทคนค gel filtration chromatography

1 2 3 4 5 212 158 116

97.2

66.4

55.6

42.7

34.6

27.0

20.0

14.3

38.6 kDa

51

ภาพท ความสมพนธระหวางคา log ของนาหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานกบคา Rf

โดย คอโปรตนมาตรฐาน ไดแก (a) Maltose-binding protein (MW 42.7 kDa),

(b) Thioredoxin reductase (MW 34.6 kDa),

(c) Triosephosphate isomerase (MW 27.0 kDa),

(d) Trypsin inhibitor (MW 20.0 kDa)

คอ Amylase

4.3.2 การศกษานาหนกโมเลกลของอะไมเลสโดยใชเทคนค gel filtration chromatography

การวเคราะหเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทผานการแยกบรสทธดวยเทคนค gel

filtration chromatography เพอหานาหนกโมเลกลในสภาวะทโปรตนไมเสยสภาพ โดยใชคอลมนบรรจตวกลางเปน Sephacryl S-200 เป รยบเทยบกบสารโปรตนมาตรฐาน คอ

Thyroglobulin (MW 670,000 Da), -globulin (MW 158,000 Da), Ovalbumin (MW 44,000

Da), Myoglobin (MW 17,000 Da), Vitamin B12 (MW 1,350 Da) ใชสภาวะเดยวกนในการทดลอง ไดผลดงภาพท

(a) (b)(c)

(d)Amylase

y = -0.7983x + 1.978

R² = 0.9993

0

0.4

0.8

1.2

1.6

2

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

log

Mol

ecul

ar W

eight

Rf

52

ภาพท ความสมพนธระหวางคา log ของนาหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานทง 5 ชนดกบ

เวลาทโปรตนมาตรฐานถกชะออกมา โดย คอโปรตนมาตรฐานทง ชนด คอ Amylase

ผลการทดลองพบวาเมอนาเอนไซมอะไมเลสทผานการแยกบรสทธมาผานคอลมนทมตวกลางเปน sephacryl S-200 โปรตนถกซะออกมาจากคอลมนโดยใชบฟเฟอร A ทเวลา .

นาท มคากจกรรมเอนไซมอะไมเลส และนาคาเวลาทโปรตนตวอยางถกชะออกจากคอลมนไปคานวณหาคานาหนกโมเลกล โดยเปรยบเทยบกบกราฟความสมพนธระหวางคา log ของนาหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานทง 5 ชนดกบเวลาทโปรตนมาตรฐานถกชะออกมา (ภาพท ) พบวาเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 มนาหนกโมเลกลประมาณ กโลดาลตน (การคานวณ ในภาคผนวก ข) จากการประมาณคานาหนกโมเลกลของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ดวยเทคนค

SDS-PAGE และ gel filtration chromatography นนใหคานาหนกโมเลกลทมความสอดคลองกน

คอประมาณ . และ กโลดาลตน ตามลาดบ

เมอเปรยบเทยบกบการศกษานาหนกโมเลกลของเอนไซมอะไมเลสจากเชอแบคทเรย เชน

B. amyloliquefaciens, Geobacillus sp. LH 8 และ Rhyzopertha dominica พบวามนาหนกโมเลกลประมาณ 52 กโลดาลตน (Demirkan และคณะ, 2005; Mollania และคณะ, 2010 และ Priya และคณะ , 2010 ตามลาดบ ) จากเชอ post-harvest Pachyrhizus erosus L. tuber มนาหนกโมเลกลประมาณ 40 กโลดาลตน (Noman และคณะ, 2006) จากเชอ B. mojavensis A21 มนาหนกโมเลกลประมาณ 58 กโลดาลตน (Hmidet และคณะ , 2010) จากเชอ B. licheniformis NH1 มนาหนกโมเลกลประมาณ 100 กโลดาลตน (Shafiei และคณะ, 2010) จากเชอ B. licheniformis ATCC 9945

Thyroglobulin γ-globulinOvalbumin

Myoglobin

Vitamin B12

Amylase

y = -0.014x + 7.2869

R² = 0.973

0

1

2

3

4

5

6

7

50 100 150 200 250 300 350

log

Mol

ecul

ar W

eight

Time (min)

53

มนาหนกโมเลกลประมาณ 31 กโลดาลตน (Bozic และคณะ, 2011) สวนนาหนกโมเลกลของเอนไซมอะไมเลส ทผลตไดจากเชอ Paecilomyces variotii มนาหนกโมเลกลประมาณ 75

กโลดาลตน (Michelin และคณะ, 2010) งานวจยนพบวาการประมาณคานาหนกโมเลกลของเอนไซมอลฟาอะไมเลสจากเชอ W1 นนมคาทใกลเคยงกบนาหนกโมเลกลของเอนไซมอลฟา อะไมเลสจากเชอแบคทเรยและราในหลายๆ งานวจยทผานมา

. การหาคณลกษณะของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทแยกบรสทธ

4.4.1 การศกษาผล pH ทมตอการทางานของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทแยกบรสทธ

การศกษากจกรรมของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ท pH ตางๆ (สารละลาย Citrate

buffer, pH 3.0 - 5.0 ; สารละลาย potassium phosphate buffer, pH 6.0 - 7.0 ; สารละลาย Tris-

HCl buffer, pH 8.0 และสารละลาย glycine-NaOH buffer, pH 9.0 - 10.0) พบวา pH ทตางกนมผลตอการทางานของเอนไซมอะไมเลส ดงแสดงในภาพท 19 ซงคา pH ทเหมาะสมและมคากจกรรมเอนไซมสงทสดคอ pH 7 มคากจกรรมเอนไซมทวดไดเทากบ 53.893 U/ml และคากจกรรมของเอนไซมท pH 6 ยงคงมมากกวา % เมอเปรยบเทยบกบคากจกรรมเอนไซมสงสดในการทดลองน

โดยคากจกรรมทวดไดเทากบ 49.132 U/ml ซง pH 6 และ เปนชวงของสารละลาย potassium

phosphate buffer ทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอะไมเลส ทชวง pH 5 – 9 ยงคงมกจกรรมของเอนไซมอะไมเลสมากกวา % และท pH 3, 4 และ เหลอกจกรรมของเอนไซมอะไมเลสนอยกวา % เมอเปรยบเทยบกบคากจกรรมเอนไซมสงสด

ภาพท 1 ผลของ pH ทมตอกจกรรมของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทแยกบรสทธ

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5 6 7 8 9 10

Rela

tive a

ctiv

ity (%

)

pH

54

เมอเปรยบเทยบอทธพลของ pH ทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอลฟาอะไมเลสจากเชอ W1 กบงานวจยอนๆ ทผานมา โดยมคา pH ทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอะไมเลสทผลตจากเชอแบคทเรยอยในชวงกรดออนจนถงดางออน (pH 5 – 7.5) สวนจากเอนไซมอะไมเลสทผลตจากเชอรา Paecilomyces variotii มคา pH ทเหมาะสมเปนกรด (Michelin และคณะ, 2010) ซงสามารถอธบายไดวา pH ทสงหรอตามากมผลทาใหประจของเอนไซมหรอสารตงตนเปลยนแปลงไปจนไมเหมาะสมทจะทาปฎกรยากนได หรออาจทาใหโครงสรางของเอนไซมเสยสภาพไดตลอดจนโครงสรางเปลยนแปลงไปดวย เพราะ pH มผลโดยตรงตอโครงสรางของโปรตน ซงเหลานเปนสาเหตหลกของการลดลงของกจกรรมของเอนไซม (สนนทา, 2547)

4.4.2 การศกษาผลของอณหภมทมตอการทางานของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทแยกบรสทธ

จากการศกษากจกรรมของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทอณหภมตางๆ คอ 30, 40,

50, 60, 70 และ 80 องศาเซลเซยส ในสารละลาย potassium phosphate buffer pH พบวา เอนไซม

อะไมเลสทางานไดดทสดทอณหภม องศาเซลเซยส มคากจกรรมทวดไดเทากบ 50.253 U/ml

(ภาพท 20) ทอณหภม 50 และ องศาเซลเซยส ยงคงมคากจกรรมเอนไซมทมากกวา % เมอเทยบกบคากจกรรมเอนไซมทสงทสด ซงวดคากจกรรมเอนไซมไดเทากบ 45.661 และ 45.117

U/ml ตามลาดบ

ภาพท 0 ผลของอณหภมทมตอกจกรรมของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทแยกบรสทธ

0

20

40

60

80

100

120

20 30 40 50 60 70 80

Rela

tive a

ctiv

ity (%

)

Temperature (oC)

55

อณหภมทเหมาะสมทไดจากการทดลองมคาเหมอนกบอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอลฟาอะไมเลสทผลตไดจากเชอรา Paecilomyces variotii (Michelin และคณะ, 2010)

สวนอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอลฟาอะไมเลสแบคทเรยชนดอนๆ อยในชวงอณหภม 37 - 55 องศาเซลเซยส และยงมงานวจยอกหลายงานวจยทเอนไซมอลฟาอะไมเลสจากแบคทเรยสามารถทนตออณหภมสงไดในชวง 80 - 90 องศาเซลเซยส (Hmidet และคณะ, 2008 และ

2010; Mollania และคณะ, 2010; Bozic และคณะ, 2011) หากเอนไซมอลฟาอะไมเลสสามารถทนตออณหภมสงไดจะทาเหมาะสมตอการนาไปใชประโยชนในอตสาหกรรมไดมากยงขน เพราะลดการถกทาลายจากอณหภมของเอนไซมทเกดขนจากกระบวนการผลตในโรงงานอตสาหกรรมได

4.4.3 การศกษาผล pH ทมตอความเสถยรของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทแยกบรสทธ

การศกษาผลของ pH ทมตอความเสถยรของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ท pH ตางๆ

(สารละลาย Citrate buffer, pH 3.0 - 5.0 ; สารละลาย potassium phosphate buffer, pH 6.0 - 7.0 ;

สารละลาย Tris-HCl buffer, pH 8.0 และสารละลาย glycine-NaOH buffer, pH 9.0 - 10.0) เปนเวลา ชวโมง ทอณหภม 60 องศาเซลเซยส โดยวดคากจกรรมของเอนไซมทก ชวโมง ไดผลการทดลองดงแสดงในภาพท พบวา เอนไซมมความเสถยรท pH 7 ซงเมอเวลาผานไป ชวโมง

เอนไซมยงคงมคากจกรรมเอนไซมเหลอมากกวา % ซงมคากจกรรมเอนไซมเทากบ 17.487 U/ml

ท pH เมอเวลาผานไป ชวโมง คากจกรรมเอนไซมยงคงเหลออยประมาณ % แตเมอเวลาผานไป ชวโมง คากจกรรมเอนไซมเหลอนอยกวา % คอ 12.852 U/ml ท pH 8 หลงจากเวลาผานไป

ชวโมงพบวา คากจกรรมเอนไซมลดลงเหลอนอยกวา % สวน pH อนๆ เปนชวงทมความเปนกรดและดางคอนขางสงจงมผลทาใหคากจกรรมของเอนไซมลดลงเหลอนอยกวา % ตงแตชวโมงแรก ดงนนชวง pH ทเหมาะสมตอการเกบรกษาเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 คอ pH 7 (สารละลาย

potassium phosphate buffer) จากการทดลองจะเหนไดวาท pH ทเหมาะสมทสด เมอเวลาผานไปเพยง ชวโมง กสามารถทาใหกจกรรมของเอนไซมลดลงถง % ดงนนเพอใหประสทธภาพของเอนไซมยงคงสงอยและสามารถทางานไดด จงควรบมท pH ในระยะเวลาไมควรเกนกวา

ชวโมง

จากการทดลองของ Hmidet และคณะ (2008) รายงานไววา เอนไซมอลฟาอะไมเลสจากเชอ B. licheniformis NH1 เอนไซมมความเสถยรอยในบฟเฟอรชวง pH ท – ซงเปนชวงทเปนชวงทกวางในบฟเฟอรทเปนกรด – เบส สวนเอนไซมอลฟาอะไมเลสจากเชอ B. mojavensis A21

(Hmidet และคณะ, 20 ) และ Nesterenkonia sp. F (Shafiei และคณะ, ) พบวา เอนไซมม

ความเสถยรอยในบฟเฟอรท pH . ซงเปนชวงของกรดออน ซงเอนไซมสวนใหญมความเสถยร

56

เมออยในบฟเฟอรทเปนกลาง กรดออนหรอเบสออน เพราะเมอเอนไซมอยในบฟเฟอรท pH เปนกรดแกหรอเบสแก จะทาใหโปรตนมประจเปลยนแปลงไป บางครงอาจทาใหโปรตนเสยสภาพและตกตะกอนลงมา จนไมสามารถเกด renaturation ได ดงนน การศกษาผลของ pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซมสามารถนามาใชในขนตอนการสกดแยกและการทาโปรตนใหบรสทธ โดย pH

ของสารละลายทใชในการสกดแยกโปรตนนนตองมความเหมาะสมตอโปรตน เพอใหโปรตนอยในสภาพเดม (อาภสสรา, 2537)

ภาพท 1 ผลของ pH ทมตอความเสถยรของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทแยกบรสทธ โดยท

( ) pH 3; ( ) pH 4; ( ) pH 5; ( ) pH 6; ( ) pH 7; ( ) pH 8; ( ) pH 9 แล ะ

( ) pH 10

4.4.4 การศกษาผลของอณหภมทมตอความเสถยรของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทแยกบรสทธ

การศกษาผลของอณหภมทมตอความเสถยรของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทอณหภมตางๆ คอ 30, 40, 50, 60, 70 และ 80 องศาเซลเซยส ในสารละลาย potassium phosphate

buffer pH เปนเวลา นาท โดยวดคากจกรรมเอนไซมทก นาท ไดผลการทดลองดงแสดงในภาพท พบวา ชวงอณหภม 30 – 50 องศาเซลเซยส เมอเวลาผานไป นาท ยงคงมคากจกรรมเอนไซมมากกวา % ซงเปนชวงอณหภมทไมสงมากนก แตเมอใชอณหภมสงขนเปน องศาเซลเซยส เมอเวลาผานไป นาท คากจกรรมเอนไซมยงคงเหลอมากกวา % แตเมอเวลาผานไป

นาท ทาใหคากจกรรมเอนไซมลดลงเหลอประมาณ % เมอใชอณหภมสงขนเปน องศา

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4

Rela

tive a

ctiv

ity (%

)

Time (h)

57

เซลเซยส ทาใหคากจกรรมเอนไซมลดลงเหลอประมาณ % เมอเวลาผานไปเพยง นาท ซงคากจกรรมเอนไซมลดลงจนนอยกวา % เมอเวลาผานไป นาท และเมอใชอณหภมสงขนเปน

องศาเซลเซยส คากจกรรมเอนไซมคงเหลอนอยกวา % เมอเวลาผานไปเพยง นาท เทานน

ดงนนการเกบรกษาเอนไซมจงควรเกบในชวงอณหภมทตากวา องศาเซลเซยส ความสามารถในการทางานของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 จงจะเสถยร จากการทดลองวดคากจกรรมเอนไซมโดยใชอณหภม องศาเซลเซยส ซงเปนอณหภมทเหมาะตอการทางานของเอนไซมทสด จะเหนไดวาจากภาพท เมอเวลาผานไปเพยง นาท ทาใหคากจกรรมเอนไซมลดลงถง % ดงนนเพอใหเอนไซมยงคงมประสทธภาพสงและทางานไดด จงควรบมทอณภม องศาเซลเซยส ในระยะเวลาไมเกน นาท

จากการทดลองของ Hmidet และคณะ (20 ) รายงานไววา เอนไซมอลฟาอะไมเลสจากเชอ B. mojavensis A21 มความเสถยรอยในชวงอณหมท – องศาเซลเซยส อลฟาอะไมเลสทผลตจากเชอรา Paecilomyces variotii (Michelin และคณะ, ) พบวา เอนไซมมความเสถยรทชวงอณหภมท –

ภาพท ผลของอณหภมทมตอความเสถยรของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทแยกบรสทธ

โดยท ( ) 30 oC; ( ) 40 oC; ( ) 50 oC; ( ) 60 oC; ( ) 70 oC และ ( ) 80 oC

0

20

40

60

80

100

0 15 30 45 60

Rela

tive a

ctiv

ity (%

)

Time (min)

58

. . การศกษาผลของไออนโลหะและชนดของรเอเจนตตอกจกรรมของเอนไซมอะไมเลส

จากเชอ W1 ทแยกบรสทธ

ผลการศกษาผลของไอออนโลหะและรเอเจนตทงหมด ชนด ตอกจกรรมของเอนไซมอะไมเลส ไดผลดงตารางท 10 โดย CoCl2 , MnCl2 และ FeSO4 ความเขมขน mM มความสามารถกระตนใหเอนไซมมคากจรรมสงขน เปน 280.4 , 215.7 และ157.0% เมอเทยบกบหลอดควบคม และเมอความเขมขนของ CoCl2 , MnCl2 และ FeSO4 เพมขนเปน mM จะทาใหคากจกรรมเอนไซมเพมสงขนเปน 457.9 , 596.6 และ 294.7% ตามลาดบ CaCl2 , MgCl2 และ KCl

สามารถกระตนคากจกรรมเอนไซมใหเพมขนเลกนอยและเมอเพมความเขมขนของไอออนโลหะเปน mM กยงคงมคากจกรรมเอนไซมใกลเคยงเดม สวน BaCl2 , NaCl และ ZnSO4 ความเขมขน

mM สามารถกระตนคากจกรรมเอนไซมไดเลกนอยคอ 125.0 , 110.2 และ 136.3% ตามลาดบ แตเมอเพมความเขนขนของ BaCl2 , NaCl และ ZnSO4 เปน mM แลวจะมผลยบยงการทางานของเอนไซมใหลดลงเหลอ 67.8 , 97.9 และ 78.6% ตามลาดบ แตไอออนของโลหะ CuCl2 ทความเขมขน mM และ 20 mM มผลยบยงการทางานของเอนไซมซงทาใหมคากจกรรมเอนไซมลดลงเหลอเพยง 83.8 และ 73.9% ตามลาดบ ทงนกเปนเพราะวา เกลอของโลหะสามารถจบกบประจลบของโปรตน (ionic interaction) ทาใหโปรตนตกตะกอนลงมา สงผลใหเกดการเสยสภาพธรรมชาตของโปรตน ซง Noman และคณะ ( ) รายงานวา Cu +, Fe2+ และ Zn2+ มผลยบยงเอนไซมอลฟาอะไมเลสจาก post-harvest Pachyrhizus erosus L. tuber อยางรนแรง Mg2+ และ K+ มผลเพยงเลกนอย สวน Ca + มผลทาใหกจกรรมเอนไซมมคาเพมขนเปนสองเทา ในขณะท Mn2+ และ Na+ ทาใหกจกรรมเพมขนเลกนอย ยงมรายงานอกวา Cu2+ และ Zn2+ มผลยบยงการทางานของเอนไซมอลฟาอะไมเลสจากเชอ Nesterenkonia sp. F (Shafiei และคณะ, 2010) และจากเชอ Geobacillus sp.

LH 8 (Mollania และคณะ, 2010) เชนกน ซงเอนไซมนถกกระตนดวย Mn2+, Ca2+, K+ สวนรเอเจนต

EDTA อาจไมมผลตอการทางานของเอนไซมเนองจากกระตนใหเอนไซมมคากจกรรมตางจากหลอดควบคมเพยงเลกนอย ซงรายงานวา EDTA ความเขมขนเพยงแค 1 mM กมผลยบยงการทางานของเอนไซมทไดจากเชอ Bacillus mojavensis A21 (Hmidet และคณะ, 2010), Geobacillus sp. LH 8 (Mollania และคณะ, 2010) และ Nesterenkonia sp. F (Shafiei และคณะ, 010) เนองจาก

EDTA จะไปแยงจบกบ metal ion ทจบอยกบเอนไซมและตกตะกอน ทาใหเอนไซมนนขาดตวเรงปฏกรยา ทาใหกจกรรมของเอนไซมมคาลดลง แตอยางไรกตามเอนไซมชนดน EDTA ไมมผลยบยงเอนไซม เนองจากเปนเอนไซมทผานการแยกบรสทธจงทาใหไมมไอออนโลหะ เกลอหรอ

cofactor เจอปนอย

59

ตารางท อทธพลของไอออนโลหะและรเอเจนตทมตอกจกรรมของเอนไซมอะไมเลส

จากเชอ W1 ทแยกบรสทธ

Metal ion Relative activity (%)

5 mM 20 mM

Control 100 100

CaCl2·2H2O 161.5 144.1

MgCl2·7H2O 139.1 136.5

BaCl2·2H2O 125.0 67.8

CoCl2·6H2O 280.4 457.9

MnCl2·4H2O 215.7 596.6

CuCl2·2H2O 83.8 73.9

KCl 131.1 123.2

FeSO4·7H2O 157.0 294.7

NaCl 110.2 97.9

ZnSO4·7H2O 136.3 78.6

EDTA 96.4 105.5

. . การศกษาผลของสารตงตนทมความจาเพาะตอเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W ทแยกบรสทธ

จากตารางท เมอเปลยนสารตงตนทง 7 ชนด ซงเปนแปงชนดตางๆ และเปรยบเทยบคากจกรรมเอนไซมของ Soluble starch โดยมความเขมขน 1% ของแปงเทากน ผลปรากฏวา เมอใชแปงขาวเหนยวเปนสารตงตนทาใหคากจกรรมเอนไซมมคาสงขนเปน . % เมอเปรยบเทยบกบ

Soluble starch สวนแปงขาวเจา แปงขาวโพด แปงมนฝรง แปงมนสาปะหลง และ แปงสาล

เอนไซมมคากจกรรมตากวาของ Soluble starch คอ 96.9, 85.1, 83.6, 80.6 และ 73.9% ตามลาดบ ซงเมอเปรยบเทยบคากจกรรมเอนไซมของแปงทง 7 ชนดนแลว แปงขาวเหนยวมคากจกรรมเอนไซม

60

สงทสด แตลกษณะของการทางานของเอนไซมอะไมเลสทผลตจากแบคทเรยแตละชนดอาจทางานไดแตกตางกน ถงแมวาสารตงตนบางชนดทมอะไมโลสสงกวา แตเอนไซมอาจจะทางานไดไมด

และมคากจกรรมเอนไซมนอยกวาได ขนอยกบความสามารถในการจบกนของเอนไซมกบ

สารตงตน หากเปนสารตงตนจบกบสวน active site ของเอนไซมไดแนนและรวดเรวกจะสามารถทาใหเกดปฏกรยาไดอยางรวดเรวและมคากจกรรมเอนไซมสง ดงนนแปงขาวเหนยวจงเปนสารตงตนทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1 ทแยกบรสทธ โดยงานวจยตางๆ มรายงานของ Konsula และคณะ (2004) โดยศกษาชนดของแปงทมผลตอปฏกรยาการยอยแปง พบวาแปงมนฝรง สามารถเกดปฏกรยากบเอนไซมอลฟาอะไมเลสทผลตจาก B. subtilis แลวมคากจกรรมเอนไซมสงทสด สวน Hmidet และคณะ (2010) รายงานไววา เชอ B. mojavensis A21 ผลตเอนไซมอฟาอะไมเลสยอยอะไมโลสทเปนสารตงตนไดดทสด

ตารางท 11 ผลของสารตงตนทมความจาเพาะตอเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1

ทแยกบรสทธ

Substrate Relative activity (%)

Soluble starch 100

แปงมนฝรง 83.6

แปงขาวโพด 85.1

แปงมนสาปะหลง 80.6

แปงขาวเจา 96.9

แปงขาวเหนยว 120.3

แปงสาล 73.9

61

. . การศกษาคาทางจลนพลศาสตรของเอนไซม

จากการหาคาพาราม เตอรทางจลนพลศาสตรของเอนไซม โดยการหาปรมาณcarbohydratesรดวซทเกดขนจากการยอย soluble starch ภายใตสภาวะการทดลองทอณหภม 60

องศาเซลเซยส และ pH 7 และประมาณคาพารามเตอรทางจลศาสตร ดงแสดงในภาพท 3 และ 24

พบวา คาคงท Michaelis-Menten Constant (Km) เทากบ 0. มลลกรมตอมลลลตร และอตราเรวสงสดของปฎกรยา (Vmax) เทากบ 51.02 ไมโครโมลตอมลลลตรตอนาท แสดงใหเหนวา เมอม คา Km ตา ทาใหความเรวในการรวมตวของเอนไซมและสารเรมตนสง โดยบอกถงความสามารถในการจบ (affinity) หรอใชในการกาหนดคาความแขงแรงของพนธะระหวางเอนไซมและสารตงตนได

ถาจบกนไดแขงแรงจะมคา Km ทตาคอ การแตกตว (dissociation) ของเอนไซมกบสารตงตนจะตา แตถาจบกนไดไมแขงแรงจะมคา Km ทสง ทาใหการแตกตวระหวางเอนไซมกบสารตงตนจะเกดขนไดงาย และมผลทาใหอตราการยอยแปงเพมสงขนดวย

ในการทดลองของ Noman และคณะ (2006) เอนไซมอลฟาอะไมเลสทผลตจากเชอ post-

harvest Pachyrhizus erosus L. tuber รายงานคา Km เทากบ 0.29% การทดลองของ Mollania และคณะ (2010) เอนไซมทผลตจากเชอ post-harvest Pachyrhizus erosus L. tuber พบวาคา Km เทากบ

3 มลลกรมตอมลลลตร สวนการทดลองของ Priya และคณะ (2010) เอนไซมทผลตจากเชอ

Rhyzopertha dominica รายงานคา Km เทากบ 0.98 มลลกรมตอมลลลตร การทดลองของ Shafiei

และคณะ ( ) เอนไซมทผลตจากเชอ Nesterenkonia sp. พบวาคา Km เทากบ . มลลกรมตอมลลลตร ในการทดลองของ Michelin และคณะ ( ) เปนเอนไซมทผลตจากเชอรา Paecilomyces variotii ซงคา Kmของเอนไซมอลฟาอะไมเลสทไดจากการทดลองยอยแปงของ Reagent® และ

Sigma® คอ 4.3 และ 6.2 มลลกรมตอมลลลตร ตามลาดบ เมอเปรยบเทยบคาทไดจากจลนทรย

ชนดอนกบเอนไซมอลฟาอะไมเลสจากเชอ W1 นนมคา Km ทแตกตางกนไปและเอนไซม

อลฟาอะไมเลสทผลตไดนนมคาตากวาคา Km ทรายงานไว ซงแสดงใหเหนถงความเรวของเอนไซมในการรวมตวกบสารตงตนทาใหเกดปฏกรยาไดเรวขนและมคากจกรรมเอนไซมสงขนดวย

62

ภาพท 23 Michaelis-Menten ของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1

ภาพท 4 Lineweaver Burk plot ของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W1

0

10

20

30

40

50

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035

V (μm

ol/m

in/m

l)

[S] (mg starch/ml)

y = 0.0002x + 0.0196

R² = 0.9974

-0.01

0

0.01

0.02

0.03

0.04

-200 -150 -100 -50 0 50 100 150

1/V

(ml.m

in/μm

ol)

1/[S] (ml/mg starch)

63

. การวเคราะหสภาวะตางๆ ทมผลตอการผลต DP จาเพาะ โดยใชเทคนค HPAC

. . การศกษาผล pH ทมตอการผลต DP จาเพาะ

ภาพท 25 ผลของ pH ทมตอการผลต carbohydrates (ppm.U-1ml-1) โดยท

จากการศกษาผลของ pH ทมตอการผลต DP จาเพาะ จากการยอยแปงของเอนไซม

อะไมเลสจากเชอ W1 ทแยกบรสทธ โดยวเคราะหคา DP ทเกดขนจากการบมสารตงตนกบเอนไซม

ในชวงบฟเฟอร pH – เปนเวลา นาท ทอณหภม องศาเซลเซยส ไดผลปรากฏดงภาพท

พบวาบฟเฟอร pH 7 มคา DP ชวง - คอ maltotriose และ maltotetraose สงทสด มคาเทากบ

5.9993 และ 3.8976 ppm.U-1ml-1 ตามลาดบ ซงเปนชวง DP ทตองการในการนาไปผลตเปน

microcapsulation สวนบฟเฟอร pH 5 – 6 มคาของ DP 3 – 4 แตยงคงมในปรมาณนอย ชวงบฟเฟอร

pH 8 – 10 เปนชวง pH ททาใหเอนไซมเกดการยอยใหไดผลผลตเปน glucose และ maltose ในปรมาณทสงมาก ซงเปนชวงของ DP ทไมตองการ จงเปนชวง pH ทไมเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมเพอยอยสารตงตนใหไดผลตภณฑเพอนาไปผลตเปน microcapulation ตอไป ดงนนบฟเฟอร pH 7 จงเปนบฟเฟอรทเหมาะสมทสด เพอใชในการผลต maltotriose และ maltotetraose

ในการทดลองตอไป

23.0861

0

1

2

3

4

5

6

7

3 4 5 6 7 8 9 10

carb

ohyd

rate

s (pp

m.U

-1m

l-1)

pH

64

. . การศกษาผลของอณหภมทมตอการผลต DP จาเพาะ

ภาพท 26 ผลของอณหภมทมตอการผลต carbohydrates (ppm.U-1ml-1) โดยท

จากการศกษาผลของอณหภมทมตอการผลต DP จาเพาะ จากการยอยแปงของเอนไซม


ในชวงอณหภม – องศาเซลเซยส และใชบฟเฟอร pH ซงเปน pH ทเหมาะสมทสดตอการผลต DP ในชวง – ซงบมเปนระยะเวลา นาท ปรากฏดงภาพท พบวาอณหภม องศาเซลเซยส มคา DP ชวง – คอ maltotriose และ maltotetraose สงทสด มคาเทากบ 3.0002 และ2.705 ppm.U-1ml-1 ตามลาดบ ท อณ ห ภ ม และ องศาเซ ล เซ ยส ม maltotriose และ

maltotetraose คอนขางสงเชนกน แตยงคงม glucose, maltose, maltopentaose และ maltohexaose

ปะปนอย ดงนนอณหภม องศาเซลเซยส จงเปนอณหภมทเหมาะสมทสดตอการผลต maltotriose

และ maltotetraose ในการทดลองตอไป

0

1

2

3

4

5

6

7

30 40 50 60 70 80

carb

ohyd

rate

s(pp

m.U

-1m

l-1)

Temperature (oC)

65

. . การศกษาผลของระยะเวลาทมตอการผลต DP จาเพาะ

ภาพท 27 ผลของระยะเวลาทมตอการผลต carbohydrates (ppm.U-1ml-1) โดยท

จากการศกษาผลของระยะเวลาทมตอการผลต DP จาเพาะ จากการยอยแปงของเอนไซม


ทบฟเฟอร pH และอณหภม องศาเซลเซยส ซงเปนสภาวะทเหมาะสมทสดตอการผลต DP ทตองการ โดยวดคา DP ในชวงเวลาตางๆ คอชวงวลา – นาท ปรากฏดงภาพท พบวา เมอบมเวลานานขนทาใหเอนไซมมความสามารถทางานในการยอยสารตงตนได maltotriose และ

maltotetraose เพมสงขนเรอยๆ สวน glucose, maltose, maltopentaose และ maltohexaose มค าเพมขนเชนกน แตเพมในปรมาณนอย เนองจากคาของ maltotriose และ maltotetraose มคาเพมสงขนเรอยๆ และยงไมคงทแสดงวา เมอเวลาผานอยางนอย นาท เอนไซมอะไมเลสยงคงสามารถทางานได ดงนนจงตองมการศกษาระยะเวลาในการบมเพมขนเพอนาไปใชในการผลต

maltotriose และ maltotetraose ใหไดสงทสดตอไป

อยางไรกตาม จากการศกษาสภาวะทเหมาะสมตอการผลต DP จาเพาะ มความสอดคลองกน ซงสภาวะทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม คอ pH 7 และ อณหภม องศาเซลเซยส และในสภาวะเดยวกนนเปนสภาวะทสามารถผลต maltotriose และ maltotetraose ไดสงสดเชนกน

0

1

2

3

4

5

6

7

10 20 30 40 50 60

carb

ohyd

rate

s (pp

m.U

-1m

l-1)

Time (min)

66

บทท 5

สรปผลการศกษา

ในงานวจยน ไดศกษาการแยกบรสทธและคณลกษณะของเอนไซมอลฟาอะไมเลสจากเชอ

W1 ทคดแยกจากดนและนา บรเวณบานสวนดาเนนสะดวก จงหวดราชบร(วชรวชย และคณะ,

2549) อกทงยงวเคราะหผลตภณฑทเกดจากการทางานของเอนไซมเพอใหไดผลตภณฑทเหมาะสมตอการนาไปผลตเปน microcapsule จากการทดลองพบวา เชอจลนทรยรหส W1 ทผานการยอมแกรมดวยวธ Gram’s staining และสองภายใตกลองจลทรรศน เชอจลนทรยนมลกษณะเปนแทง ยอมตดสมวงแสดงวา เปนแบคทเรยแกรมบวก หลงจากนนนาไปเลยงในอาหารเหลวทมองคประกอบของแปงเพอผลตเอนไซมยอยแปง และผานขนตอนการแยกบรสทธโดยวธตกตะกอนดวย ethanol,

Q Sepharose anion-exchange แ ล ะ Sephacryl S-200 gel filtration chromatography ต าม ล า ด บ

เอนไซมถกทาใหเขมขนขน โดยวธ ultrafiltration พบวา จะทาใหคากจกรรมของเอนไซมเพมขนและปรมาณโปรตนลดลงเมอเทยบกบ crude extract คณสมบตของเอนไซมบรสทธ มคา specific

activity เทากบ 4,428. U/mg protein มความบรสทธเพมขน . เทา และ recovery . %

หลงจากนนหานาหนกโมเลกลของเอนไซมโดยวธ SDS-PAGE เมอเทยบกบกราฟโปรตนมาตรฐานสามารถคานวณนาหนกโมเลกลของเอนไซมชนดนไดเทากบ 38.6 kDa และหานาหนกโมเลกลดวยวธ gel filtration chromatography โดยเทยบกบกราฟโปรตนมาตรฐานเชนกน คานวณนาหนกโมเลกลของเอนไซมนไดเทากบ 39 kDa ซงมนาหนกโมเลกลทสอดคลองกนทงสองวธ

เอนไซมอลฟาอะไมเลสบรสทธสามารถทางานไดดท pH และอณหภม 60 oC ซงเอนไซมยงเสถยรท pH 7 และชวงอณหภม 30 - 50 องศาเซลเซยส คาทางจลนพลศาสตรของเอนไซมมคา Km

และ Vmax ทไดคอ 0.01 mg/ml และ 51.02 μmol.ml-1min-1 ตามสาดบ เอนไซมอลฟาอะไมเลสของเชอชนดนถกยบยงดวยไอออนของ Cu2+ ความเขมขน 5 mM ในขณะทไอออนของ Co2+, Mn2+,

Fe2+, Ca2+, Mg2+ และ K+ เปนตวกระตนการทางานของเอนไซมชนดนใหมคากจกรรมเอนไซมสงขน แต Ba2+, Na+ และ Zn2+ สามารถกระตนการทางานของเอนไซมใหมคากจกรรมสงขนไดเมอมความเขมขน 5 mM แตยบยงการทางานของเอนไซมเมอมความเขมขน 20 mM สารตงตนทเหมาะสมทสดคอ แปงขาวเหนยว เมอศกษาสภาวะทเหมาะสมในการยอยแปงของเอนไซมใหไดผลผลตทม DP ในชวง – (maltotriose และ maltotetraose) ในปรมาณทสงสด คอสภาวะท pH 7

67

และอณหภม oC ระยะเวลาอยางนอย นาท แตยงคงมผลตภณฑชนดอนคอ glucose, maltose,

maltopentaose และ maltohexaose ปะปนอยเลกนอย สภาวะทเหมาะสมตอการผลต maltotriose

และ maltotetraose ใหมปรมาณสงสด เปนสภาวะทสอดคลองกบสภาวะทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมจากเชอ W1 ดงนนจงเลอกสภาวะทเหมาะสมไปผลต maltotriose และ maltotetraose

ใหมปรมาณสงและผลตภณฑทไดนสามารถนาไปศกษาการใชประโยชนในการผลต microcapsule

ตอไป

68

รายการอางอง

กลาณรงค ศรรอต และเกอกล ปยะจอมขวญ, 2543. เทคโนโลยแปง. พมพครงท 2. กรงเทพฯ:

สานกพมพมหาวทยาลยเกษตรศาสตร.

แกวสคนธ วงศพฤตคณ และพรชนก ถาวร, 2552. การศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเลยงเชอเพอผลต Maltodextrin ทมคา Degree of Polymerization (DP) จาเพาะจากเชอจลนทรยยอยแปง.

จลนพนธ ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม

มหาวทยาลยศลปากร, นครปฐม.

ดาวนภา ฉงล, ธนาภรณ สรวสสานะ และปยภม ปยวาทการ, 2550. การหาสภาวะทเหมาะในการเล ยงเชอ จ ลนท รยท ส าม ารถผ ลต เอนไซมยอยแ ป งท ให ผลผ ลตท มค า Degree of

Polymerization (DP) ทจาเพาะ. จลนพนธ ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร, นครปฐม.

ปราณ อานเปรอง, . เอนไซมทางการคา. สานกพมพจฬาลงกรณมหาวทยาลย, กรงเทพฯ.

พกประไพ ประจาเมอง, 2546. การผลตกลโคสไซรปจากการยอยกากมนสาปะหลงดวยเอนไซมในถงปฏกรณชวภาพ ระดบโรงงานตนแบบ. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยขอนแกน.

ลกษนาวด ใจสข และศรรตน ปรชา, 2551. การศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเลยงเชอจลนทรยทสามารถผลตเอนไซมยอยแปงเพอใหไดค า Degree of Polymerization (DP) ทจาเพาะ .

จลนพนธ ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม

มหาวทยาลยศลปากร, นครปฐม.

วชรวทย พงศาวภาวฒน , สายปาน กลากลอมจตร และอภชาต โชตชศร, 2549. การคดเลอกเชอจลนทรยทสามารถผลตเอนไซมยอยแปงทใหผลผลตทมคา degree of polymerization

(DP) ทจาเพาะ. จลนพนธ ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร, นครปฐม.

พ มพ เพญ พรเฉ ลมพงศ และ น ธยา รตนาปนนท . maltodextrin [ออนไลน ]. สบคน เมอ

21 เมษ ายน 2 . เข า ถ งไดจาก http://www.foodnetworksolution.com/wiki/word/1914

/maltodextrin

ส รพล ผล เพ ม . Degree of polymerization (DP) [ออนไลน ]. สบคน เมอ 21 เมษ ายน 2 .

เขาถงไดจาก http://www.thaitapiocastarch.org/article25_th.asp

สนนทา ภญณาวธน, 2547. ชวเคม 2. พมพครงท 7. กรงเทพฯ: สานกพมพมหาวทยาลยรามคาแหง.

หนา 376-380

69

วระศกด สหชยเสร, 2544. โปรตนเทคโนโลย. โครงการตาราและเอกสารประกอบการเรยนเคม

ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม. รงสร โชตปฏเวชกล, 2550. กระบวนการวชาเทคนคทางหองปฏบตการชนสตร 2. คณะเทคนค

การแพทย, มหาวทยาวยเชยงใหม. หนา 1 - 8.

ดวงพร คนธโชต, 2530. จลชววทยาอตสาหกรรม ผลตภณฑจลนทรย. สานกพมพโอเดยนสโตร,

กรงเทพฯ.

อนนต ลอขจร, 2536. กลองจลทรรศนและเทคนคการถายภาพทางชววทยา. สานกพมพโอเดยน

สโตร, กรงเทพฯ.

อาภสสรา ชมดท, 2537. ชวเคม. พมพครงท 2. กรงเทพฯ: โรงพมพสหมตรออฟเซท. หนา 13-59

Alexander, R.J., 1992. Maltodextrins: Production, Properties and Applications. In Schenck, F.W.

and Hebeda, R.E. (Eds), Starch Hydrolysis Products: Worldwide Technology, Production

and Applications. VCH Publishers, New York. 233–275.

Bernfeld, P., 1955. Amylases, α and β. methods in enzymology: Academic Press. 149-158.

Beynum, G.M.A. and Roels, J.A. 1985. Starch conversion technology. Marcel Dekker, Inc., New

York. 361.

Bozic, N., Ruiz, J., Santin, J. L. and Vujcic, Z., 2011. Production and properties of the highly

efficient raw starch digesting α-amylase from a Bacillus licheniformis ATCC 9945a.

Biochemical Engineering Journal. 53: 203-209.

Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities

of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72(1-

2):248-254.

Brow, J. and Draper, M.J., 1986. US Patent 4,588,602. Nabisco Brands, Inc.

Buleon, A., Colonna, P., Planchot, V. and Ball, S., 1998. Starch granules:structure and

Biosynthesis. International Journal of Biological Macromolecules. 23:85–112.

Demirkan, E.S., Mikami, B., Adachi, M., Higasa, T. and Utsumi, S., 2005. α-Amylase from B. amyloliquefaciens: purification, characterization, raw starch degradation and expression in

E. coli. Process Biochemistry. 40(8):2629-2636.

Evans, M.T.A.,Jones, M.G.D. and Jones, N., 1976. US Patent 3,956,519. Thomas J. Lipton, Inc.

Galliard, T. and Bowler, P., 1987. Morphology and composition of starch. In T. Galliard (Ed.).

Starch: Properties and Potential. John Wiley and Son., New York.

70

Gibthai. Gel electrophoresis of protein [Online]. Accessed 12 April 2013. Available from

http://www.gibthai.com/services/technical_detail.php?ID=20

Hizukuri, S., 1985. Relationship between the distribution of the chain length of amylopectin and

the crystalline structure of starch granules. Carbohydrate Research. 141:295.

Hizukuri, S., 1986. Polymodal distribution of the chain lengths of amylopectins and its

significance. Carbohydrate Research. 147:342-347.

Hmidet, N., Bayoudh, A., Berrin, J.G., Kanoun, S., Juge, N. and Nasri, M., 2008. Purification and

biochemical characterization of a novel α-amylase from Bacillus licheniformis NH1:

Cloning, nucleotide sequence and expression of amyN gene in Escherichia coli. Process

Biochemistry. 43(5):499-510.

Hmidet, N., Maalej, H., Haddar, A. and Nasri, M., 2010. A novel α-amylase from Bacillus mojavensis A21: Purification and biochemical characterization. Applied Biochemistry and

Biotechnology. 162(4):1018-1030.

Horn, H.E. and Kimball, B.A., 1971. US Patent 3,582,359. CPC International.

Horn, H.E. and Godzicki, M.M., 1974. US Patent 3,826,857. CPC International.

Hurni, R.J., 1988. European Patent 258,959. DCA Industries, Inc.

Katt, J.L., Moore, C.O. and Eastman, J.E., 1986. US Patent 4,623,549. A.E. Staley Manufacturing

Company.

Konsula, Z. and Liakopoulou-Kyriakides, M., 2004. Hydrolysis of starches by the action of an α-

amylase from Bacillus subtilis. Process Biochemistry. 39(11):1745-1749.

Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of

Bacteriophage T4. Nature. 227(5259):680-685.

Michelin, M., Silva, T.M., Benassi, V.M., Peixoto-Nogueira, S.C., Moraes, L.A.B., Leao, J.M.,

Jorge, J.A., Terenzi, H.F. and Polizeli, M.L.T.M., 2010. Purification and characterization of

a thermostable α-amylase produced by the fungus Paecilomyces variotii. Carbohydrate

Research 345:2348-2353.

Mollania, N., Khajeh, K., Hosseinkhani, S. and Dabirmanesh B., 2010. Purification and

characterization of a thermostable phytate resistant α-amylase from Geobacillus sp. LH8.

International Journal of Biological Macromolecules. 46(1):27-36.

Nelson, A.L., Skrabacz, D.J. and Young, B., 1977. US Patent 4,013,775. CPC International.

71

Nigam, P. and Singh, D., 1995. Enzyme and microbial systems involved in starch processing.

Enzyme and Microbial Technology. 17(9):770-778.

Nirmala, M. and Muralikrishna, G., 2003. Three α-amylases from malted finger millet (Ragi,

Eleusine coracana, Indaf-15)--purification and partial characterization. Phytochemistry.

62(1):21-30.

Noman, ASM., Hoque, M.A., Sen, P.K. and Karim, M.R., 2006. Purification and some properties

of α-amylase from post-harvest Pachyrhizus erosus L. tuber. Food Chemistry. 99(3):444-

449.

Porter, S.C., and Woznicki, E.J., 1987. US Patent 4,643,894. Colorcon, Inc.

Priya, S., Kaur, N. and Gupta, A.K., 2010. Purification, characterization and inhibition studies

of α-amylase of Rhyzopertha dominica. Pesticide Biochemistry and Physiology. 98(2):

231-237

Ramsey, A.B., Luebke, D.R., Guzek, D.T., Hsieh,C.L., Roteman, R. and Leathern, W.D., 1980.

US Patent 4,182,756. Abbott Laboratories.

Salomonsson, A.C. and Sundberg, B., 1994. Amylose content and chain profile of amylopectin

from normal, high amylose and waxy barleys. Starch/Starke. Journal of Cereal Science.

46(9):325-328.

Shafiei, M., Ziaee, A-A. and Amoozegar, M.A., 2010. Purification and biochemical

characterization of a novel SDS and surfactant stable, raw starch digesting, and halophilic

α-amylase from a moderately halophilic bacterium, Nesterenkonia sp. strain F. Process

Biochemistry. 45(5):694-699.

Smith, W.J., 1982. British Patent 2,080,664.

Steensen, W.L. and Weaver, R.C., 1986. US Patent 4,574,091. Nabisco Brands, Inc.

Valentine, W., 1987. US Patent 4,684,534. Dynagram Corporation of America.

Walker, J.M., 2002. The Protein Protocols Handbook, 2nd ed. Humana Press Inc., Totowa : New

Jersey.

Whistler, R.L., Bemille, J.N. and Paschll, Eugene, F., 1984. Starch: Chemitry and Technology. 2nd

ed. London : Academic Press. 254:292-293.

ภาคผนวก ก

73

ภาคผนวก ก

อาหารเลยงเชอจลทรยและการเตรยมสารเคม

1. อาหารเลยงเชอ

1.1 LB broth

Tryptone 10 กรม

Yeast extract 5 กรม

NaCl 10 กรม

ละลายสวนประกอบทงหมดในนากลน ลตร จากนนนาไปทาใหปลอดเชอดวยหมอนงความดนไอ ทอณหภม องศาเซลเซยส ความดน ปอนดตอตารางนว นาน นาท

1.2 Starch broth


Peptone 10 กรม

Beef extract 5 กรม

MgSO4.7H2O 0.5 กรม

KH2PO4 0.05 กรม

MnSO4 0.01 กรม

CaCl2 0.1 กรม

FeSO4.7H2O 0.1 กรม

Starch from potato 10 กรม

ละลายแปงในนากลน 400 มลลลตร ตมแปงจนสก และละลายสวนประกอบทเหลอทงหมดในนากลน 400 ลตร ตมดวยไฟออนๆ จนสารละลายหมด แลวนามาผสมกนปรบปรมาตรดวยนากลนเปน 1 ลตร จากนนนาไปทาใหปลอดเชอดวยหมอนงความดนไอ ทอณหภม 1

องศาเซลเซยส ความดน ปอนดตอตารางนว นาน นาท

74

1.3 Starch agar


Peptone 5 กรม

MgSO4.7H2O 0.5 กรม

KH2PO4 0.5 กรม

NaCl 1.5 กรม

CaCl2 0.1 กรม

Starch from potato 10 กรม

Agar 15 กรม

ละลายแปงในนากลน 400 มลลลตร ตมแปงจนสก และละลายสวนประกอบทเหลอทงหมดในนากลน 400 ลตร แลวนามาผสมกนปรบปรมาตรดวยนากลนเปน 1 ลตร จากนนนาไปทาใหปลอดเชอดวยหมอนงความดนไอ ทอณหภม องศาเซลเซยส ความดน ปอนดตอตารางนว นาน นาท

2. สารเคม 2.1 DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) Reagent

ชง DNS 10 กรม ละลายนากลน 500 มลลลตร ผสมใหเขากนบน hot plate คอยๆ เตมสารละลาย Sodium hydroxide (Sodium hydroxide 16 กรม ละลายในนากลน 200 มลลลตร) ผสมใหเขากนแลวเตม Sodium potassium tartrate จานวน 300 กรม จากนนเตมนากลนใหไดประมาณ

900 มลลลตร ตมดวยไฟออนๆ จนสารละลายหมด ตงทงไวใหเยน ปรบปรมาตรใหเปน 1 ลตร เกบไวในขวดสชาอณหภมหอง

2.2 Bradford Dye Reagent

เจอจาง Bradford dye reagent (BIO-RAD) เขมขน 1 สวน ดวยนากลน 4 สวน นาไปกรองผานกระดาษกรอง whatman no. 1 เกบในขวดสชา

2.3 2% Soluble Starch

ละลาย Soluble starch 2 กรม ในนากลน 70 มลลลตรโดยการตมในอางนาเดอดจน Soluble

starch สก เหนเปนสารละลายใส ทงไวใหเยน หลงจากนนเตม 1 M CaCl2 1 มลลลตร แลวปรบปรมาตรดวยนากลนใน volumetric flask ขนาด 100 มลลลตร

75

2.4 การเตรยมบฟเฟอรสาหรบวเคราะหหาคณลกษณะทเหมาะสมของเอนไซม

2.4.1 50 mM Citrate buffer (pH 3 – 5)

( ) ชง Citric acid (MW 210.14) 3.1521 กรม ละลายในนากลนปรมาตร

มลลลตร

(2) ชง Sodium citrate (MW 291.4) 4.4115 กรม ละลายในนากลนปรมาตร

มลลลตร

ตารางท อตราสวนของสารในการเตรยม Citrate buffer

pH Citric acid (ml) Sodium citrate (ml) Total volume (ml)

3 93 7 100

4 66 34 100

5 41 59 100

2.4.2 50 mM Phosphate buffer (pH 6 – 7)

( ) ชง dibasic sodium phosphate (MW 174.18) 1.7418 กรม ละลายในนากลนปรมาตร มลลลตร

( ) ชง monobasic sodium phosphate (MW 136.09) 1.3609 กรม ละลายในนากลนปรมาตร มลลลตร

ตารางท อตราสวนของสารในการเตรยม Phosphate buffer

pH K2HPO4 (ml) KH2PO4 (ml) Total volume (ml)

. . 100

61 39 100

2.4.3 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8)

ชง Tris base (MW 121.14) 0.6057 กรม ละลายในนากลนปรมาตร มลลลตร ปรบ

pH ดวย 50 mM HCl ใหได 8 ปรบปรมาตรดวยนากลนเปน 100 มลลลตร

76

2.4.4 50 mM Glycine-NaOH buffer (pH 9 – 10)

ชง glycine (MW 75.07) 0.37535 กรม ละลายในนากลนปรมาตร มลลลตร ปรบ

pH ดวย 50 mM NaOH ใหได และ ปรบปรมาตรดวยนากลนเปน 100 มลลลตร

2.5 การเตรยมสารละลายไอออนของโลหะและรเอเจนต

2. .1 50 mM CaCl2·2H2O (MW 147.01)

ชง CaCl2·2H2O . กรม ละลายในนาปราศจากไอออน ปรบปรมาตรดวยขวดปรบปรมาตรขนาด มลลลตร

2. .2 50 mM MgCl2·7H2O (MW 203.3)

ชง MgCl2·7H2O . กรม ละลายในนาปราศจากไอออน ปรบปรมาตรดวยขวดปรบปรมาตรขนาด มลลลตร

2. .3 50 mM BaCl2·2H2O (MW 244.28)

ชง BaCl2·2H2O . กรม ละลายในนาปราศจากไอออน ปรบปรมาตรดวยขวดปรบปรมาตรขนาด มลลลตร

2. .4 50 mM CoCl2·6H2O (MW 237.93)

ชง CoCl2·6H2O . กรม ละลายในนาปราศจากไอออน ปรบปรมาตรดวยขวดปรบปรมาตรขนาด มลลลตร

2. .5 50 mM MnCl2·4H2O (MW 197.9)

ชง MnCl2·4H2O . กรม ละลายในนาปราศจากไอออน ปรบปรมาตรดวยขวดปรบปรมาตรขนาด มลลลตร

2. .6 50 mM CuCl2·2H2O (MW 170.48)

ชง CuCl2·2H2O . กรม ละลายในนาปราศจากไอออน ปรบปรมาตรดวยขวดปรบปรมาตรขนาด มลลลตร

77

2. .7 50 mM KCl (MW 74.56)

ชง KCl . กรม ละลายในนาปราศจากไอออน ปรบปรมาตรดวยขวดปรบปรมาตรขนาด มลลลตร

2. .8 50 mM FeSO4·7H2O (MW 278.02)

ชง FeSO4·7H2O . กรม ละลายในนาปราศจากไอออน ปรบปรมาตรดวยขวดปรบปรมาตรขนาด มลลลตร

2. .9 50 mM NaCl (MW 58.44)

ชง NaCl . กรม ละลายในนาปราศจากไอออน ปรบปรมาตรดวยขวดปรบปรมาตรขนาด มลลลตร

2. .10 50 mM ZnSO4·7H2O (MW 287.54)

ชง ZnSO4·7H2O . กรม ละลายในนาปราศจากไอออน ปรบปรมาตรดวยขวดปรบปรมาตรขนาด มลลลตร

2. .11 50 mM EDTA (MW 292.25)

ชง NaOH . กรม ละลายในนาปราศจากไอออน และชง EDTA 0.146 กรม คนให EDTA ละลายจนหมด แลวปรบปรมาตรดวยนาปราศจากไอออน โดยใชขวดปรบปรมาตรขนาด มลลลตร

78

2. การเตรยมสารสาหรบการวเคราะหผลดวยวธ SDS-PAGE

2. .1 สารละลาย 10% (w/v) Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)

ชง SDS 10 กรม ละลายในนากลน 25 มลลลตร แลวปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร

2. .2 สารละลาย 10% (w/v) Ammonium Persulfate สาหรบ electrophoresis

ชง ammonium persulfate (ProPureTM proteomics grade, AMRESCO®) 0.1 กรม ละลายในนากลน 1 มลลลตร (เกบแชแขงใชได 1 อาทตย)

2. .3 Stain Solution

ชง Commasie Brilliant blue R-250 0.5 กรม และเตม methanol ปรมาตร 200 มลลลตร

ละลายสารจนหมดแลวจงเตม acetic acid ปรมาตร 30 มลลลตร ผสมใหเขากนและปรบปรมาตรดวยนากลนเปน 500 มลลลตร

2. .4 Destain Solution I

เตม methanol ปรมาตร 250 มลลลตร ลงใน acetic acid ปรมาตร 50 มลลลตร ผสมใหเขากนและปรบปรมาตรดวยนากลนเปน 500 มลลลตร

2. .5 Destain Solution II

เตม methanol ปรมาตร 25 มลลลตร ลงใน acetic acid ปรมาตร 35 มลลลตร ผสมใหเขากนและปรบปรมาตรดวยนากลนเปน 500 มลลลตร

2. . 0.5 M Tris-HCl pH 6.8

ชง Tris-base (MW 121.1) 6.06 กรม ละลายในนาปราศจากไอออน 70 มลลลตร ปรบ pH

ดวยสารละลาย HCl เปน 6.8 และปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร จากนนนาไปทาใหปลอดเชอดวยหมอนงความดนไอ ทอณหภม องศาเซลเซยส ความดน ปอนดตอตารางนว นาน นาท

2. . 1.5 M Tris-HCl pH 8.8

ชง Tris-base 18.17 กรม ละลายในนาปราศจากไอออน 70 มลลลตร ปรบ pH ดวยสารละลาย HCl เปน 8.8 และปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร จากนนนาไปทาใหปลอดเชอดวยหมอนงความดนไอ ทอณหภม องศาเซลเซยส ความดน ปอนดตอตารางนว นาน นาท

79

2. .8 Electrophoresis Buffer pH 8.3 (10X)

Tris-base 30.29 กรม

Glycine 144 กรม

SDS 10 กรม

ละลายสารทงหมดดวยนากลนปรมาตร 800 มลลลตร วด pH ซงจะมคาประมาณ 8.3

ปรบปรมาตรเปน 1000 มลลลตร

2. . สสงเคราะหสาหรบผสมกบโปรตน (3x Gel loading dye)

0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 3 มลลลตร

10% (w/v) SDS 4.8 มลลลตร

glycerol 2.4 มลลลตร

-mercaptoethanol 1.2 มลลลตร

bromophenol blue (0.05%(w/v)) 0.006 กรม

DI water 4.6 มลลลตร

ละลายสารทงหมดใหเขากนแลวเกบสารละลายไวท - องศาเซลเซยส

2. . แผนเจลสาหรบแยกวเคราะหโปรตน

(1) Separating gel 12%

DI water 1.6 มลลลตร

30% Bis-acrylamide 2.0 มลลลตร

1.5 M Tris-HCl pH 8.8 1.3 มลลลตร

10% (w/v) SDS 0.05 มลลลตร

10% (w/v) ammonium persulfate 0.05 มลลลตร

N, N, N’, N’-Tetramethyl ethylenediamine

(TEMED) 0.002 มลลลตร

ผสมสารทงหมดใหเขากนและคอยๆ เทลงแผนกระจกทประกอบไวแลวใหถงระดบทตองการ เตมนากลนทผวหนาเจลเพอไลฟองอากาศออกและปรบระดบผวหนาเจลใหเรยบอยในระนาบเดยวกน ทงไวใหเจลแขงตว เทนากลนออกและซบดวยกระดาษทชช

80

(2) Stacking gel 5%

DI water . มลลลตร

30% Bis-acrylamide . มลลลตร

0.5 M Tris-HCl pH 6.8 . มลลลตร

10% (w/v) SDS . มลลลตร

10% (w/v) ammonium persulfate 0.03 มลลลตร

TEMED 0.003 มลลลตร

ผสมสารทงหมดใหเขากนและคอยๆ เทลงทบบนเจลชน Separating gel ทแขงตวแลว สอดแผนกาหนดรองเจลลงบนเจลทยงไมแขงตว ระวงอยางใหเกดฟองอากาศ ทงไวใหเจลแขงตว ดงแผนกาหนดรองเจลออก ลางดวยนากลนและเตรยมประกอบชดวเคราะห SDS-PAGE (Mini-

PROTEAN® Tetra Cell, BIO-RAD)

2. การเตรยมสารสาหรบวเคราะหผลดวยเครอง HPAC

2. .1 0.5 M Sodium hydroxide (NaOH)

ชง NaOH (MW 40) 20 กรม ละลายในนาปราศจากไอออน ปรบปรมาตรดวยขวดปรบปรมาตรขนาด มลลลตร กรองดวย cellulose acetate membrane ขนาด 0.45 ไมโครเมตร และผานการไลกาซดวยเครอง sonicator เปนเวลา 30 นาท

. . M Sodium acetate (NaOAc)

ชง NaOAc (MW 136.08) 136.08 กรม ละลายในนาปราศจากไอออน ปรบปรมาตรดวยขวดปรบปรมาตรขนาด มล ลลตร กรองดวย cellulose acetate membrane ขนาด 0.45

ไมโครเมตร และผานการไลกาซดวยเครอง sonicator เปนเวลา 30 นาท

ภาคผนวก ข

82

ภาคผนวก ข

กราฟมาตรฐานและการคานวณ

. กราฟมาตรฐานสารละลาย Glucose

.1 เตรยมสารละลาย glucose (Fluka) ทความเขมขน 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 และ 1.4

มลลกรมตอมลลลตรในนากลน

.2 ปเปตสารละลาย glucose ในแตละความเขมขนใสละ 200 ไมโครลตร และเตม DNS

reagent ปรมาตร ไมโครลตร ตมในอางนารอนอณหภม องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท

หลงจากนนแชนาเยนทนท

.3 ปเปตสารตวอยางทได ไมโครลตร ลงใน wells plate วดคาการดดกลนแสงดวยเครอง microplate reader ทความยาวคลน 550 นาโนเมตร นาคาทไดไปเขยนกราฟมาตรฐานความเขมขนของสารละลาย glucose กบคาการดดกลนแสง ดงตารางท 14 และภาพท 28

ตารางท ความสมพนธระหวางความเขมขนของ Glucose กบคาการดดกลนแสงทความยาวคลน

550 นาโนเมตร

ความเขมขน Glucose (mg/ml) OD550 (AU)

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0.0 0.000 0.000 0.000 0.000

0.2 0.095 0.083 0.080 0.086

0.4 0.214 0.220 0.218 0.217

0.6 0.327 0.346 0.333 0.335

0.8 0.455 0.470 0.451 0.459

1.0 0.578 0.586 0.592 0.585

1.2 0.734 0.701 0.694 0.710

1.4 0.843 0.828 0.851 0.841

83

ภาพท 28 กราฟมาตรฐานของ glucose โดยการวเคราะหดวยวธ DNS method

1. การหาปรมาณ glucose

จากกราฟมาตรฐานของ glucose จะไดสมการ y = 0. x

โดย y คอ คาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร

x คอ ความเขมขนของ glucose (มลลกรม/มลลลตร)

สามารถคานวณหาคากจกรรมของเอนไซมอะไมเลสไดดงน

Activity (U) =

โดย A คอ OD550 ของสารตวอยาง

B คอ OD550 ของ Enzyme blank

C คอ OD550 ของ Substrate blank

a คอ dilution factor

MW คอ นาหนกโมเลกลของ glucose เทากบ .

y = 0.5868x

R² = 0.9967

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

OD 55

0(A

U)

Glucose (mg/ml)

84

. กราฟมาตรฐานสารละลายโปรตน (Bovine serum albumin)

2.1 เตรยมสารละลาย Bovine serum albumin (BSA) (Fluka) ทความเขมขน 0.1, 0.2, 0.3, 0.4

และ 0.5 มลลกรมตอมลลลตรในนากลน

2.2 ปเปตสารละลาย BSA ในแตละความเขมขนใส wells plate หลมละ 10 ไมโครลตร และเตม Bradford dye reagent ปรมาตร ไมโครลตร ทงทอณหภมหอง 5 นาท

2.3 วดคาการดดกลนแสงดวยเครอง microplate reader ทความยาวคลน 595 นาโนเมตร นาคาทไดไปเขยนกราฟมาตรฐานความเขมขนของโปรตนกบคาการดดกลนแสง ดงตารางท 15 และภาพท 29

ตารางท ความสมพนธระหวางความเขมขนของ BSA กบคาการดดกลนแสงทความยาวคลนท

595 นาโนเมตร

ความเขมขน BSA (mg/ml) OD595 (AU)

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย

0.0 0.000 0.000 0.000 0.000

0.1 0.189 0.167 0.172 0.176

0.2 0.290 0.333 0.278 0.300

0.3 0.433 0.451 0.424 0.436

0.4 0.556 0.577 0.584 0.572

0.5 0.684 0.689 0.697 0.690

85

ภาพท กราฟมาตรฐานของ BSA โดยการวเคราะหดวยวธ Bradford method

2. การหาปรมาณโปรตน

จากกราฟมาตรฐานของโปรตน จะไดสมการ y = 1.4225x

โดย y คอ คาการดดกลนแสงทความยาวคลน 595 นาโนเมตร

x คอ ความเขมขนของโปรตน (มลลกรม/มลลลตร)

สามารถคานวณหาปรมาณโปรตนไดดงน

protein (mg/ml) = x dilution factor

y = 1.4225x

R² = 0.9941

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

OD 59

5 (A

U)

BSA (mg/ml)

86

. การคานวณหาพารามเตอรของการทาบรสทธของเอนไซม

Total activity (U) = Activity (U/mg) x Volume (ml)

Total protein (mg) = Protein (mg/ml) x Volume (ml)

Specific activity (U/mg) =

Recovery (%) =

Purification (fold) =

4. กราฟโปรตนมาตรฐานของ SDS-PAGE

4.1 จากผลการทดลองหานาหนกโมเลกลโดยวธ SDS-PAGE สามารถวดหาระยะการเคลอนทของแถบโปรตนมาตรฐานแตละชนด และระยะการเคลอนทของ loading dye เพอหาคา Rf ดงน

Rf = ระยะการเคลอนทของแถบโปรตน

ระยะการเคลอนทของ

4.2 เขยนกราฟความสมพนธระหวางคา log นาหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานกบคา Rf โดยใชตารางท เพอคานวณหานาหนกโมเลกลของแถบโปรตนทผานการแยกบรสทธ

87

ตารางท ความสมพนธระหวางคา log นาหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานกบคา Rf

Protein marker MW

(kDa) log MW

ระยะการเคลอนท ของแถบโปรตน

(cm)

ระยะการเคลอนท ของ loading dye

(cm)

Rf

Maltose-binding protein 42.7 1.63 2.40 5.5 0.44

Thioredoxin reductase 34.6 1.54 3.00 5.5 0.55

Triosephosphate isomerase 27.0 1.43 3.80 5.5 0.69

Trypsin inhibitor 20.0 1.30 4.65 5.5 0.85

จากกราฟมาตรฐานของโปรตน (ภาพท ) จะไดสมการ y = - 0.7983x + 1.978

โดย y คอ คา log Molecular Weight

x คอ คา Rf

วดระยะการเคลอนทของแถบโปรตนตวอยางทผานการแยกบรสทธได . เซนตเมตร

และระยะการเคลอนทของ loading dye ได 5.5 เซนตเมตร

Rf = = 0.49

คา Rf ของแถบโปรตนตวอยางทผานการแยกบรสทธเทากบ .

คานวณหาคา MW จากสมการจจะได

log MW = - 0.7983(0.49) + 1.978

MW = 10(1.587)

= 38.6

ดงนน โปรตนตวอยางทผานการแยกบรสทธมนาหนกโมเลกลประมาณ . กโลดาลตน

88

5. กราฟมาตรฐานเจลฟลเตรชนโครมาโตกราฟ

5.1 โปรตนทใชคอ Gel Filtration Standard (BIO-RAD) ประกอบดวย Thyroglobulin (bovine),

-globulin (bovine), Ovalbumin (chicken), Myoglobin (horse), Vitamin B12

5.2 วเคราะหดวยเครอง FPLC โดยผาน gel filtration chomatography ทภายในคอลมนบรรจ

Sephacryl S-200 โดยใชสารละลายบฟเฟอร A เปนตวชะ อตราการไหล 0.1 มลลลตรตอนาท ไดโครมาโตแกรมดงภาพท 30 หานาหนกโมเลกลของเอนไซมโดยเขยนกราฟมาตรฐานคา log ของนาหนกโมเลกลของโปรตนกบเวลาทถกชะออกจากคอลมน โดยใชตารางท 17

ภาพท โครมาโตแกรมของสารมาตรฐานโปรตน gel filtration chromatography (Sephacryl

S-200) ทง ชนด

ตารางท ความสมพนธระหวางคา log นาหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานกบปรมาตรทถกชะออกจากคอลมน

Standard protein MW(Da) log MW Retention time (min)

Thyroglobulin (bovine) 670,000 5.826 121.81

-globulin (bovine) 158,000 5.199 142.83

Ovalbumin (chicken) 44,000 4.643 179.20

Myoglobin (horse) 17,000 4.230 210.56

Vitamin B12 1,350 3.130 305.60

0

100

200

300

400

0 100 200 300 400 500

OD 28

0 (m

AU)

Time (min)

89

จากกราฟมาตรฐานของโปรตน (ภาพท ) จะไดสมการ y = -0.014x + 7.2869

โดย y คอ คา log Molecular Weight

x คอ คา Retention time (min)

โปรตนตวอยางทผานการแยกบรสทธมคา Retention time เทากบ 192.59 นาท

คานวณหาคา MW จากสมการจะได

log MW = -0.014(192.59) + 7.2869

MW = 10(4.591)

= 38,994

ดงนน โปรตนตวอยางทผานการแยกบรสทธมนาหนกโมเลกลประมาณ กโลดาลตน

6. กราฟมาตรฐานของcarbohydratesแตละชนดเมอฉดดวยเครอง HPAC

6. สารมาตรฐาน glucose ม retention time ประมาณ 3.367 นาท

ภาพท โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน glucose จากการวเคราะหดวยวธ HPAC

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 26.0-200

0

125

250

375

500

625

750

875

1,000

1,200 standard 20130501 #4 [modified by Admin] ED_1nC

min

1 - 3.033

2 - 3.367

90

ภาพท กราฟมาตรฐานของ glucose

การหาปรมาณ glucose ในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของ glucose จะไดสมการ y = 5.8397x

โดย y คอพนทท retention time ประมาณ 3.367 นาท

x คอความเขมขนของ glucose (ppm)

สามารถคานวณหาปรมาณ glucose ไดดงน

glucose (ppm) = Area x dilution factor

y = 5.8397x

R² = 0.9936

0

50

100

150

0 5 10 15 20 25

Area

(nC*

min

)

Glucose (ppm)

91

6. สารมาตรฐาน maltose ม retention time ประมาณ 3.750 นาท

ภาพท โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน maltose จากการวเคราะหดวยวธ HPAC

ภาพท กราฟมาตรฐานของ maltose

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 26.0-100

0

100

200

300

400

500

600

700

800 standard 20130501 #8 [modified by Admin] ED_1nC

min

1 - 3.750

y = 1.5688x

R² = 0.9963

0

50

100

150

0 20 40 60 80

Area

(nC*

min

)

Maltose (ppm)

92

การหาปรมาณ maltose ในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของ maltose จะไดสมการ y = 1.5688x


x คอความเขมขนของ maltose (ppm)

สามารถคานวณหาปรมาณ maltose ไดดงน

maltose (ppm) = Area x dilution factor

6. สารมาตรฐาน maltotriose ม retention time ประมาณ 4.700 นาท

ภาพท โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน maltotriose จากการวเคราะหดวยวธ HPAC

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 26.0-100

0

100

200

300

400

500


min

1 - 4.700

93

ภาพท กราฟมาตรฐานของ maltotriose

การหาปรมาณ maltotriose ในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของ maltotriose จะไดสมการ y = 1.1162x


x คอความเขมขนของ maltotriose (ppm)

สามารถคานวณหาปรมาณ maltotriose ไดดงน

maltotriose (ppm) = Area x dilution factor

y = 1.1162x

R² = 0.9971

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80

Area

(nC*

min

)

Maltotriose (ppm)

94

6. สารมาตรฐาน maltotetraose ม retention time ประมาณ 7.733 นาท

ภาพท โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน maltotetraose จากการวเคราะหดวยวธ HPAC

ภาพท กราฟมาตรฐานของ maltotetraose

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 26.0-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400


min

1 - 7.733

y = 1.359x

R² = 0.9973

0

50

100

150

0 20 40 60 80

Area

(nC*

min

)

Maltotetraose (ppm)

95

การหาปรมาณ maltotetraose ในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของ maltotetraose จะไดสมการ y = 1.359x


x คอความเขมขนของ maltotetraose (ppm)

สามารถคานวณหาปรมาณ maltotetraose ไดดงน

maltotetraose (ppm) = Area x dilution factor

6. สารมาตรฐาน maltopentaose ม retention time ประมาณ 8.450 นาท

ภาพท โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน maltopentaose จากการวเคราะหดวยวธ HPAC

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 26.0-50

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225


min

1 - 8.450

96

ภาพท กราฟมาตรฐานของ maltopentaose

การหาปรมาณ maltopentaose ในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของ maltopentaose จะไดสมการ y = 1.099x


x คอความเขมขนของ maltopentaose (ppm)

สามารถคานวณหาปรมาณ maltopentaose ไดดงน

maltopentaose (ppm) = Area x dilution factor

y = 1.099x

R² = 0.9987

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80

Area

(nC*

min

)

Maltopentaose (ppm)

97

6.5 สารมาตรฐาน maltohexaose ม retention time ประมาณ 10.567 นาท

ภาพท โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน maltohexaose จากการวเคราะหดวยวธ HPAC

ภาพท กราฟมาตรฐานของ maltohexaose

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 26.0-20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180


min

1 - 10.567

y = 0.8603x

R² = 0.9984

0

10

20

30

40

50

0 10 20 30 40 50 60

Area

(nC*

min

)

Maltohexaose (ppm)

98

การหาปรมาณ maltohexaose ในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของ maltohexaose จะไดสมการ y = 0.8603x


x คอความเขมขนของ maltohexaose (ppm)

สามารถคานวณหาปรมาณ maltohexaose ไดดงน

maltohexaose (ppm) = Area x dilution factor

ภาคผนวก ค

100

ภาคผนวก ค

ขอมลผลการทดลอง

. การแยกบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอรหส W1

ตารางท คากจกรรมเอนไซมอะไมเลสหลงจากการแยกบรสทธของแตละขนตอน

Step Dilution

(fold)

OD550 (AU) Enzyme

blank

Substrate

blank

Enzyme

activity

(U/ml)

Volume

(ml)

Total

activity

(U)

ครงท 1

ครงท 2

ครงท 3

เฉลย

Crude extract 10 0.330 0.380 0.482 0.397 0.067 0.154 14.895 900 13405.489

Ethanol, 80% 100 0.360 0.322 0.376 0.353 0.030 0.154 151.879 50 7593.953

Q sepharose

+ ultrafiltration 1000 0.243 0.223 0.224 0.230 0.014 0.130 1020.972 2 2041.944

Sephacryl S-200

+ ultrafiltration 500 0.256 0.268 0.299 0.274 0.016 0.152 610.184 2.5 1525.459

ตารางท ปรมาณโปรตนของเอนไซมอะไมเลสหลงจากการแยกบรสทธของแตละขนตอน

Step

OD595 (AU) Protein

(mg/ml)

Volume

(ml)

Total

protein

(mg)

ครงท

1

ครงท

2

ครงท

3 เฉลย

Crude extract 0.088 0.086 0.089 0.088 0.062 900 55.466

Ethanol, 80% 0.314 0.350 0.388 0.351 0.247 50 12.326

Q sepharose

+ ultrafiltration 0.354 0.379 0.387 0.373 0.262 2 0.525

Sephacryl S-200

+ ultrafiltration 0.194 0.199 0.195 0.196 0.138 2.5 0.344

101

ตารางท ผลการแยกบรสทธเอนไซมอะไมเลสจากเชอรหส W1

Step Volume

(ml)

Activity

(U/ml)

Total

activity

(U)

Protein

(mg/ml)

Total

protein

(mg)

Specific

activity

(U/mg)

Recovery

(%)

Purification

(fold)

Crude extract 900 14.895 13405.489 0.062 55.466 241.690 100 1

Ethanol, 80% 50 151.879 7593.953 0.247 12.326 616.106 56.6 2.5

Q sepharose

+ ultrafiltration 2 1020.972 2041.944 0.262 0.525 3890.177 15.2 16.1

Sephacryl S-200

+ ultrafiltration 2.5 610.184 1525.459 0.138 0.344 4428.502 11.4 18.3

102

. การศกษาคณลกษณะสมบตของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W ทแยกบรสทธ

(Characterization)

ตารางท การศกษา pH ทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอะไมเลส (เจอจาง เทา)

pH

OD550 (AU) Enzyme

blank

Substrate

blank

Enzyme

activity

(U/ml)

Relative

activity

(%)

ครงท

1

ครงท

2

ครงท

3 เฉลย

3 0.233 0.241 0.263 0.246 0.011 0.245 21.039 39.0

4 0.268 0.308 0.288 0.288 0.011 0.245 25.043 46.5

5 0.450 0.411 0.484 0.448 0.011 0.245 40.209 74.6

6 0.541 0.513 0.574 0.543 0.011 0.245 49.132 91.2

7 0.584 0.559 0.636 0.593 0.011 0.245 53.893 100

8 0.495 0.443 0.495 0.478 0.011 0.245 42.984 79.8

9 0.402 0.367 0.413 0.394 0.011 0.245 35.070 65.1

10 0.285 0.300 0.311 0.299 0.011 0.245 26.052 48.3

ตารางท การศกษาอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซมอะไมเลส (เจอจาง เทา)

Temperature

(oC)

OD550 (AU) Enzyme

blank

Substrate

blank

Enzyme

activity

(U/ml)

Relative

activity

(%)

ครงท

1

ครงท

2

ครงท

3 เฉลย

30 0.446 0.420 0.401 0.422 0.023 0.278 36.459 72.6

40 0.488 0.441 0.463 0.464 0.025 0.294 40.135 79.9

50 0.535 0.520 0.498 0.518 0.021 0.279 45.661 90.9

60 0.583 0.58 0.579 0.581 0.036 0.268 50.253 100

70 0.483 0.521 0.564 0.523 0.031 0.294 45.117 89.9

80 0.352 0.339 0.410 0.367 0.025 0.290 30.979 61.7

103

ตารางท การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซมอะไมเลส (เจอจาง เทา)

pH Time

(h)

OD550 (AU) Enzyme

blank

Substrate

blank

Enzyme

activity

(U/ml)

Relative

activity

(%)

ครงท 1

ครงท 2

ครงท 3

เฉลย

3

0 0.355 0.347 0.345 0.349 0.025 0.116 30.099 100

1 0.178 0.162 0.121 0.154 0.025 0.116 11.622 38.6

2 0.150 0.130 0.141 0.140 0.025 0.116 10.361 34.4

3 0.152 0.114 0.119 0.128 0.025 0.116 9.226 30.7

4 0.114 0.131 0.123 0.123 0.025 0.116 8.690 28.9

4

0 0.355 0.347 0.345 0.349 0.025 0.116 30.099 100

1 0.176 0.138 0.135 0.150 0.025 0.116 11.244 37.4

2 0.146 0.140 0.134 0.140 0.025 0.116 10.329 34.3

3 0.136 0.149 0.116 0.134 0.025 0.116 9.730 32.3

4 0.137 0.140 0.116 0.131 0.025 0.116 9.478 31.5

5

0 0.355 0.347 0.345 0.349 0.025 0.116 30.099 100

1 0.151 0.160 0.181 0.164 0.025 0.116 12.600 41.9

2 0.120 0.149 0.135 0.135 0.025 0.116 9.825 32.6

3 0.122 0.136 0.138 0.132 0.025 0.116 9.573 31.8

4 0.128 0.120 0.125 0.124 0.025 0.116 8.847 29.4

6

0 0.355 0.347 0.345 0.349 0.025 0.116 30.099 100

1 0.239 0.225 0.247 0.237 0.025 0.116 19.505 64.8

2 0.187 0.197 0.189 0.191 0.025 0.116 15.154 50.3

3 0.207 0.188 0.177 0.191 0.025 0.116 15.122 50.2

4 0.171 0.168 0.161 0.167 0.025 0.116 12.852 42.7

104

ตารางท 3 การศกษา pH ทมผลตอความเสถยรของเอนไซมอะไมเลส (เจอจาง เทา) (ตอ)

pH Time

(h)

OD550 (AU) Enzyme

blank

Substrate

blank

Enzyme

activity

(U/ml)

Relative

activity

(%) ครงท

1

ครงท 2

ครงท 3

เฉลย

7

0 0.355 0.347 0.345 0.349 0.025 0.116 30.099 100

1 0.235 0.277 0.264 0.259 0.025 0.116 21.554 71.6

2 0.215 0.265 0.230 0.237 0.025 0.116 19.473 64.7

3 0.210 0.237 0.220 0.222 0.025 0.116 18.117 60.2

4 0.191 0.235 0.221 0.216 0.025 0.116 17.487 58.1

8

0 0.355 0.347 0.345 0.349 0.025 0.116 30.099 100

1 0.205 0.197 0.217 0.206 0.025 0.116 16.604 55.2

2 0.188 0.139 0.174 0.167 0.025 0.116 12.883 42.8

3 0.186 0.151 0.158 0.165 0.025 0.116 12.694 42.2

4 0.146 0.146 0.147 0.146 0.025 0.116 10.928 36.3

9

0 0.355 0.347 0.345 0.349 0.025 0.116 30.099 100

1 0.163 0.150 0.150 0.154 0.025 0.116 11.685 38.8

2 0.162 0.151 0.158 0.157 0.025 0.116 11.937 39.7

3 0.138 0.129 0.129 0.132 0.025 0.116 9.573 31.8

4 0.143 0.130 0.114 0.129 0.025 0.116 9.289 30.9

10

0 0.355 0.347 0.345 0.349 0.025 0.116 30.099 100

1 0.15 0.137 0.153 0.147 0.025 0.116 10.960 36.4

2 0.163 0.122 0.132 0.139 0.025 0.116 10.235 34.0

3 0.141 0.137 0.132 0.137 0.025 0.116 10.014 33.3

4 0.124 0.128 0.152 0.135 0.025 0.116 9.825 32.6

105

ตารางท 4 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซมอะไมเลส (เจอจาง เทา)

Temperature

(oC)

Time

(min)

OD550 Enzyme

blank

Substrate

blank

Enzyme

activity

(unit/ml)

Relative

activity

(%)

ครงท 1

ครงท 2

ครงท 3

เฉลย

30

0 0.492 0.519 0.39 0.467 0.036 0.083 40.376 100.0

15 0.408 0.45 0.426 0.428 0.036 0.083 36.687 90.9

30 0.421 0.439 0.398 0.419 0.036 0.083 35.867 88.8

45 0.411 0.417 0.399 0.409 0.036 0.083 34.890 86.4

60 0.398 0.394 0.426 0.406 0.036 0.083 34.606 85.7

40

0 0.492 0.519 0.39 0.467 0.036 0.083 40.376 100.0

15 0.373 0.431 0.417 0.407 0.036 0.083 34.701 85.9

30 0.419 0.391 0.399 0.403 0.036 0.083 34.322 85.0

45 0.418 0.403 0.388 0.403 0.036 0.083 34.322 85.0

60 0.399 0.371 0.346 0.372 0.036 0.083 31.390 77.7

50

0 0.492 0.519 0.39 0.467 0.036 0.083 40.376 100.0

15 0.417 0.443 0.469 0.443 0.036 0.083 38.106 94.4

30 0.42 0.432 0.465 0.439 0.036 0.083 37.728 93.4

45 0.436 0.414 0.419 0.423 0.036 0.083 36.214 89.7

60 0.421 0.434 0.413 0.423 0.036 0.083 36.183 89.6

106

ตารางท 4 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซมอะไมเลส (เจอจาง เทา) (ตอ)

Temperature

(oC)

Time

(min)

OD550 Enzyme

blank

Substrate

blank

Enzyme

activity

(unit/ml)

Relative

activity

(%)

ครงท 1

ครงท 2

ครงท 3

เฉลย

60

0 0.492 0.519 0.39 0.467 0.036 0.083 40.376 100.0

15 0.407 0.46 0.407 0.425 0.036 0.083 36.372 90.1

30 0.383 0.349 0.327 0.353 0.036 0.083 29.593 73.3

45 0.317 0.337 0.316 0.323 0.036 0.083 26.787 66.3

60 0.293 0.333 0.339 0.322 0.036 0.083 26.629 66.0

70

0 0.492 0.519 0.39 0.467 0.036 0.083 40.376 100.0

15 0.325 0.365 0.337 0.342 0.036 0.083 28.584 70.8

30 0.318 0.286 0.31 0.305 0.036 0.083 25.021 62.0

45 0.216 0.218 0.213 0.216 0.036 0.083 16.602 41.1

60 0.207 0.214 0.22 0.214 0.036 0.083 16.413 40.7

80

0 0.492 0.519 0.39 0.467 0.036 0.083 40.376 100.0

15 0.249 0.26 0.245 0.251 0.036 0.083 19.976 49.5

30 0.254 0.292 0.201 0.249 0.036 0.083 19.755 48.9

45 0.277 0.228 0.241 0.249 0.036 0.083 19.724 48.9

60 0.227 0.217 0.224 0.223 0.036 0.083 17.265 42.8

107

ตารางท การศกษาไอออนโลหะและรเอเจนตความเขมขนของ มลลโมลาร ทมผลตอกจกรรมของเอนไซมอะไมเลส (เจอจาง เทา)

Metal

ion

OD550 (AU)

เฉลย Enzyme

blank

Substrate

blank

Enzyme

activity

(U/ml)

Relative

activity

(%) ครงท

1

ครงท 2

ครงท 3

Control 0.234 0.200 0.235 0.223 0.025 0.121 18.157 100.0

Ca 0.333 0.305 0.385 0.341 0.025 0.121 29.319 161.5

Mg 0.295 0.311 0.288 0.298 0.025 0.121 25.251 139.1

Ba 0.284 0.260 0.269 0.271 0.025 0.121 22.697 125.0

Co 0.534 0.599 0.575 0.569 0.025 0.121 50.917 280.4

Mn 0.429 0.475 0.431 0.445 0.025 0.121 39.156 215.7

Cu 0.218 0.198 0.160 0.192 0.025 0.121 15.224 83.8

K 0.285 0.283 0.280 0.283 0.025 0.121 23.801 131.1

Fe 0.326 0.342 0.329 0.332 0.025 0.121 28.499 157.0

Na 0.240 0.270 0.218 0.243 0.025 0.121 20.017 110.2

Zn 0.293 0.293 0.292 0.293 0.025 0.121 24.747 136.3

EDTA 0.205 0.239 0.204 0.216 0.025 0.121 17.495 96.4

108

ตารางท 6 การศกษาไอออนโลหะและรเอเจนตความเขมขนของ 20 มลลโมลาร ทมผลตอกจกรรมของเอนไซมอะไมเลส (เจอจาง เทา)

Metal

ion

OD550 (AU)

เฉลย Enzyme

blank

Substrate

blank

Enzyme

activity

(U/ml)

Relative

activity

(%) ครงท

1

ครงท 2

ครงท 3

Control 0.199 0.182 0.189 0.190 0.058 0.116 11.937 100

Ca 0.288 0.260 0.189 0.246 0.058 0.116 17.203 144.1

Mg 0.191 0.233 0.284 0.236 0.058 0.116 16.289 136.5

Ba 0.145 0.149 0.154 0.149 0.058 0.116 8.091 67.8

Co 0.667 0.623 0.635 0.642 0.058 0.116 54.661 457.9

Mn 0.859 0.780 0.811 0.817 0.058 0.116 71.215 596.6

Cu 0.152 0.144 0.175 0.157 0.058 0.116 8.816 73.9

K 0.237 0.217 0.204 0.219 0.058 0.116 14.712 123.2

Fe 0.433 0.470 0.404 0.436 0.058 0.116 35.175 294.7

Na 0.203 0.169 0.190 0.187 0.058 0.116 11.685 97.9

Zn 0.164 0.155 0.170 0.163 0.058 0.116 9.383 78.6

EDTA 0.239 0.169 0.183 0.197 0.058 0.116 12.600 105.5

109

ตารางท 7 การศกษาสารตงตนทมผลตอกจกรรมของเอนไซมอะไมเลส (เจอจาง เทา)

Substrate

OD550 (AU) Enzyme

blank

Substrate

blank

Enzyme

activity

(U/ml)

Relative

activity

(%)

ครงท 1

ครงท 2

ครงท 3

เฉลย

Soluble starch 0.381 0.353 0.457 0.397 0.025 0.114 46.198 100

แปงมนฝรง 0.290 0.350 0.358 0.333 0.025 0.033 38.595 83.5

แปงขาวโพด 0.305 0.320 0.389 0.338 0.025 0.027 39.306 85.1

แปงมนสาปะหลง 0.327 0.348 0.288 0.321 0.025 0.017 37.225 80.6

แปงขาวเจา 0.430 0.313 0.400 0.381 0.025 0.018 44.786 96.9

แปงขาวเหนยว 0.438 0.389 0.598 0.475 0.025 0.189 55.563 120.3

แปงสาล 0.253 0.288 0.365 0.302 0.025 0.124 34.154 73.9

ตารางท 28 การศกษาคาจลศาสตรของเอนไซมอะไมเลส (เจอจาง เทา)

Concentration

of soluble

starch

(%), [S]

OD550 (AU)

Enzyme

blank

Substrate

blank

Enzyme

activity

(U/ml),

V

1/[S]

(ml/g

starch)

1/V

(ml.min/

μmol)

ครงท 1

ครงท 2

ครงท 3

เฉลย

1 0.367 0.3790 0.380 0.375 0.078 0.041 27.931 1.00 0.036

1.5 0.439 0.431 0.413 0.428 0.078 0.071 32.740 0.67 0.031

2 0.461 0.447 0.476 0.461 0.078 0.134 35.626 0.50 0.028

3 0.521 0.509 0.517 0.516 0.078 0.230 40.312 0.33 0.025

110

. การศกษาคา DP จากการยอยแปงของเอนไซมอะไมเลสจากเชอ W ทแยกบรสทธ

ตารางท 29 การศกษาผลของ pH ทมตอการยอยแปงของเอนไซมอะไมเลสใหไดคา DP จาเพาะ

(เจอจาง เทา)

pH Concentration (ppm.U-1ml-1)

glucose maltose maltotriose maltotetraose maltopentaose maltohexaose

3 0.7202 0.1270 0.1885 0.1483 0.1327 0.1723

4 0.7172 0.1317 0.2868 0.3000 0.1333 0.1239

5 0.3733 1.3296 3.0146 2.6557 0.8170 0.6588

6 0.3073 1.2828 3.1070 2.4498 0.7163 0.5205

7 0.4874 2.5130 5.9993 3.8976 1.1944 0.9128

8 23.0861 3.6531 2.0702 3.0523 1.2962 1.0205

9 0.2222 5.8033 0.7754 1.6724 0.7203 0.5652

10 0.2219 5.1608 0.1002 0.1212 0.0737 0.0766

ตารางท 0 การศกษาผลของอณหภมทมตอการยอยแปงของเอนไซมอะไมเลสใหไดคา DP

จาเพาะ (เจอจาง เทา)

Temperature

(oC)

Concentration (ppm.U-1ml-1)


30 0.4450 0.2948 1.1747 0.9904 0.2948 0.2236

40 0.3565 0.4096 1.5298 1.2862 0.3729 0.2617

50 0.5532 0.7350 2.4731 2.1880 0.6673 0.4765

60 0.4669 0.9906 3.0002 2.7050 0.8156 0.5789

70 0.4556 0.5935 2.0014 1.9895 0.6315 0.4327

80 0.4449 0.1863 0.4884 0.5390 0.2204 0.1746

111

ตารางท 1 การศกษาผลของระยะเวลาทมตอการยอยแปงของเอนไซมอะไมเลสใหไดคา DP

จาเพาะ (เจอจาง เทา)

Time

(min)

Concentration (ppm.U-1ml-1)


10 1.7412 0.2394 0.7546 0.7977 0.3894 0.2356

20 1.7561 0.3570 1.1707 1.3428 0.5379 0.3627

30 1.8188 0.4279 1.5181 1.7390 0.6794 0.4729

40 1.9109 0.5233 1.8141 2.1147 0.8189 0.5449

50 1.8604 0.6998 2.4494 2.7524 1.0254 0.7386

60 1.3631 0.8152 2.8766 3.1955 1.1914 0.8042

112

คาอธบายสญลกษณและคายอ

% เปอรเซนต

μmol ไมโครโมล

AU หนวยของคาการดดกลนแสง (Absorbance Unit) ๐C องศาเซลเซยส

h ชวโมง

kDa กโลดาลตน

log ลอการทม

M โมลาร

mAU หนวยของคาการดดกลนแสง (milli Absorbance Unit)

mg มลลกรม

min นาท

ml มลลลตร

mM มลลโมลาร

MW นาหนกโมเลกล

OD คาการดดกลนแสง (Obtical Density)

ppm หนวยของความเขมขน (Part Per Million)

[S] ความเขมขนของสารตงตน

U หนวยของเอนไซม (Unit)

V อตราเรวในการเกดปฏกรยา

113

ประวตผวจย

ชอ-สกล นายวสต แกวมหา Mr. Wisoot Kaewmaha

วน เดอน ปเกด 18 มถนายน 2530

ทอย 22/10 หมท 2 ตาบลแหลมบว อาเภอนครชยศร จงหวดนครปฐม 73120

ประวตการศกษา พ.ศ. 2552 สาเรจการศกษาปรญญาวทยาศาสตรบณฑต ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ

คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร

พ.ศ. 2553 ศกษาตอระดบปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลย- ชวภาพ คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร

ประวตการทางาน

-

การเสนอผลงานวจย

Poster presentation and Proceeding

พ.ศ. Wisoot Kaewmaha, Methus Suanchan and Jesdawan Wichitwechkarn. Cloning

and expression of mpdB gene responsible for methyl parathion degradation using

a vector designed for periplasmic secretion. The 22th Annual Meeting of the Thai

Society for Biotechnology (TSB2010), 20-22 October 2010, Prince of Songkla

University, Trang Campus, Thailand.

พ.ศ. 2555 Wisoot Kaewmaha and Jesdawan Wichitwechkarn. A starch-converting bacterial

strain capable of producing oligosaccharides with specific degree of

polymerization and the purification of its -amylase. The 24th Annual Meeting

of the Thai Society for Biotechnology (TSB2012), 29-30 November 2012,

Ubonratchathani, Thailand.

]]t DP จําเพาะ และการแยกบริสุทธิÍ ·...

Documents

Transcript of ]]t DP จําเพาะ และการแยกบริสุทธิÍ ·...