Synthetische und natürliche Modellsysteme für die ... · DG Distanz Geometrie DMSO...
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Technische Universität München
Max-Planck-Institut für Biochemie
Synthetische und natürliche Modellsysteme für die oxidative
Proteinfaltung
Alexander G. Milbradt
München 2005
Techn ische Univers i t ä t München
Max-Planck- Ins t i tu t fü r Biochemie
Synthetische und natürliche Modellsysteme für die oxidative
Proteinfaltung
Alexander G. Milbradt
Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie
der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
genehmigten Dissertation.
Vorsitzender: Univ. Prof. Dr. St. J. Glaser
Prüfer der Dissertation: 1. apl. Prof. Dr. L. Moroder
2. Univ. Prof. Dr. H. Kessler
3. Univ. Prof. Dr. W. Hiller
Die Dissertation wurde am 13.1.2005 bei der Technischen Universität München
eingereicht und durch die Fakultät für Chemie am 15.2.2005 angenommen.
Meinen Eltern
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Dezember 2001 bis Januar 2005 am
Max-Planck-Institut für Biochemie in Martinsried unter Anleitung von Prof. Dr. Luis
Moroder angefertigt.
Mein besonders herzlicher Dank gilt meinem Doktorvater Prof. Dr. Luis Moroder, der
mir diese sehr abwechslungsreiche, interessante und vielfältige Aufgabe gegeben hat
und mir bei ihrer Bearbeitung immer hilfsbereit zur Seite stand. Er gab mir einerseits
immer ausreichend Freiräume, anderseits aber auch Lenkung und Zielorientierung, die
für einen erfolgreichen Abschluss jeder Arbeit nötig sind.
Des Weiteren möchte ich meinem Betreuer PD Dr. Christian Renner danken. Sein
fundiertes Fachwissen auf dem Gebiet der NMR und Physik gab mir unschätzbare
Hilfen. Seine klar strukturierte, logische und kompetente Herangehensweise an
wissenschaftliche Fragestellungen waren für mich Vorbild und Hilfe, aber auch
Motivation für die Durchführung meiner eigenen Arbeit.
Meinem Arbeitskollegen Markus Löweneck, geb. Schütt, danke ich für die gute
Zusammenarbeit, insbesondere für die Synthese so manches Azopeptids sowie für
seine humorvolle und unkomplizierte Art.
Ich möchte der gesamten Arbeitsgruppe Bioorganische Chemie für das angenehme
Arbeitsklima und die ständige ausdauernde Hilfsbereitschaft danken.
Elisabeth Weyher-Stingl danke ich für die unzähligen LC-MS-Analysen, die
Einführung in das UV-, CD- und Fluoreszenzspektrometer und die vielen analytisch-
chemischen Hilfestellungen.
Hans-Jürgen Musiol danke ich für sein umfangreiches, stets abrufbares chemisches
Wissen und sein freundliches und geduldiges Naturell, welches viel zur guten
Arbeitsatmosphäre beigetragen hat.
Dr. Cyril Boulegue danke ich für die Synthese der Cystein-reichen Rohpeptide. Sein
umfangreiches Wissen der Peptidchemie und der HPLC-Geräte gepaart mit seiner
ruhigen hilfsbereiten Art haben mir sehr geholfen.
Dr. Norbert Schaschke danke ich für die ausführlichen Erörterungen chemischer
Probleme sowie für manch unterhaltsame Kaffeerunde und Kongressfahrt.
Jose Pfizer danke ich für den unermüdlichen und aufopfernden EDV-Einsatz.
Bei Marion Götz, Alexandra Barazza, Ulrike Kusebauch, Leslie Hötzer und Dr. Stefan
Übel möchte ich mich für ihre Hilfsbereitschaft und das gute und kollegiale
Arbeitsklima bedanken.
Auch bei den vielen möchte Ehemaligen möchte ich mich bedanken.Sie haben mir ein
ums andere Mal bei Problemen geholfen und ihr Wissen uns Nachfolgenden
weitergegeben:
Dr. Markus M. Müller, Dr. Alina Ariosa Alvarez, Dr. Stella Fiori, Dr. Raymond
Behrendt, Dr. Frank Freudenmann, Drs. Barbara und Markus Kaiser und Dr. Dirk
Barth.
Bei Nicola Heim bedanke ich mich für die Hilfe bei der Benutzung des Programms
MS-Word und für die Unterstützung während der gesamten Arbeit.
Mein herzlicher Dank gilt meinen Eltern, die mich während des gesamten Studiums
und meiner Doktorarbeit finanziell und ideell unterstützt haben.
Die vorliegende Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft
(Sonderforschungsbereich 533) finanziell unterstützt.
Abkürzungen 1D eindimensional
2D zweidimensional
APB p-Aminophenylazobenzoesäure
AMPB p-Aminomethylphenylazobenzoesäure
COSY Correlated Spectroscopy
CD Circular Dichroismus
Da Dalton
DG Distanz Geometrie
DMSO Dimethylsulfoxid
HPLC High Performance Liquid Chromatography
Hz Hertz
IR Infrarot
K Kelvin
LC-MS Liquid Chromatography Mass Spectrometry
M Molar (mol/l)
Mr Molgewicht
MD Molecular Dynamics
NMR Nuclear Magnetic Resonance
NOESY Nuclear Overhauser Enhancement
Spectroscopy
PDB Protein Data Bank
PDI Proteindisulfidisomerase
ppm parts per million
ROESY Rotating Frame Overhauser Enhancement
Spectroscopy
RMSD Root Mean Square Deviation
RT Raumtemperatur
TOCSY Total Correlation Spectroscopy
TRR Thioredoxin Reduktase
TRX Thioredoxin
Abkürzungen
UV Ultraviolett
Θ /[Θ]R Elliptizität, Elliptizität pro Aminosäure
(Residue)
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits teilweise in folgenden
Fachzeitschriften veröffentlicht:
Milbradt AG, Kerek F, Moroder L, Renner C (2003) Structural Characterization of
Hellethionins from Helleborus purpurascens. Biochemisty 42: 2404-2411.
Kaiser M, Siciliano C, Assfalg-Machleidt I, Groll M, Milbradt AG, Moroder L (2003)
Synthesis of a TMC-95A ketomethylene analogue by cyclization via intramolecular Suzuki
coupling. Organic Letters 5: 3435-3437.
Barth D, Musiol HJ, Schütt M, Fiori S, Milbradt AG, Renner C, Moroder L (2003) The
Role of Cystine Knots in Collagen Folding and Stability. I. Conformational Properties of
(Pro-Hyp-Gly)5 and (Pro-(4S)-FPro-Gly)5 Model Trimers with an Artificial Cystine Knot.
Chemical European Journal 9: 3692-3702.
Schütt M, Krupka SS, Milbradt AG, Deindl S, Sinner EK, Oesterhelt D, Renner C,
Moroder L (2003) Photocontrol of cell adhesion processes: model studies with cyclic
azobenzene-RGD peptides. Chemistry & Biology 10: 487-490.
Barth D, Milbradt AG, Renner C, Moroder L (2004) A (4R)- or a (4S)-fluoroproline
residue in position Xaa of the (Xaa-Yaa-Gly) collagen repeat severely affects triple-helix
formation. Chembiochem 5: 79-86.
Kaiser M, Groll M, Siciliano C, Assfalg-Machleidt I, Weyher E, Kohno J, Milbradt AG,
Renner C, Huber R, Moroder L (2004) Binding Mode of TMC-95A Analogues to
Eukaryotic 20S proteasome. ChemBioChem 5: 1256-1266.
Kaiser M, Milbradt AG, Siciliano C, Assfalg-Machleidt I, Machleidt W, Groll M,
Renner C, Moroder L (2004) TMC-95A analogues with endocyclic biphenyl ether group as
proteasome inhibitors. Chemisty & Biodiversity 1: 161-173.
Pokidysheva E, Milbradt AG, Meier S, Renner C, Haussinger D, Bachinger HP,
Moroder L, Grzesiek S, Holstein TW, Ozbek S, Engel J (2004) The structure of the Cys-
rich terminal domain of Hydra minicollagen, which is involved in disulfide networks of the
nematocyst wall. Journal of Biological Chemistry 279: 30395-30340.
Ozbek S, Pokidysheva E, Schwager M, Schulthess T, Tariq N, Barth D, Milbradt AG,
Moroder L, Engel J, Holstein TW (2004) The glycoprotein NOWA and minicollagens are
part of a disulfide-linked polymer that forms the cnidarian nematocyst wall. Journal of
Biological Chemistry 279: 52016-52023.
Milbradt AG, Löweneck M, Krupka SS, Reif M, Sinner EK, Moroder L, Renner C
(2004) Photomodulation of Conformational States. IV. Integrin binding RGD-Peptides with
(4-Aminomethyl)phenylazobenzoic Acid as Backbone Constituent. Biopolymers in press.
Renner C, Kusebauch U, Löweneck M, Milbradt AG, Moroder L (2005) Azobenzene as
photoresponsive conformational switch in cyclic peptides. Journal of Peptide Research in
press.
Carstens H, Renner C, Milbradt AG, Moroder L, Tavan P (2004) Multiple loop
conformations of peptides predicted by molecular dynamics simulations are compatible with
NMR. Biochemistry submitted.
Fuhrmans M, Milbradt AG, Renner C (2004) Comparison of protocols for calculation of
peptide structures from experimental NMR data. submitted.
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG 1
1.1. Das zentrale Problem der Proteinfaltung 1
1.2. Modelle der Proteinfaltung 1
1.2.1. Intermediate und Faltungsbarrieren 4
1.2.2. Bildung von Faltungsmotiven 5
1.2.3. Autonome Faltungseinheiten 6
1.2.4. Die Faltung großer Proteine 6
1.2.5. Faltung in der Zelle 7
1.2.6. Disulfidbrücken und oxidative Faltung 7
1.3. Thionine 8
1.4. Minicollagen 10
1.5. Lichtschaltbare Konformationszustände 13
1.5.1. Photoschalter 14
1.5.2. Azobenzol-enthaltende Photoschalter 16
1.5.3. Isomerisierungsmechanismen im Azobenzol 17
1.5.4. Lichtschaltbare Peptidsysteme 18
1.5.5. TRR und PDI 19
2. AUFGABENSTELLUNG 22
3. ERGEBNISSE 23
3.1. Azopeptide 23
3.1.1. bcAMPB 25
3.1.2. Azo-[Ser2, Ser5]-PDI 30
3.1.3. Azo-PDI 35
Inhaltsverzeichnis
3.1.4. Azo-NonaTRR 45
3.2. Minicollagen 51
3.2.1. C-terminale Domäne 51
3.2.2. N-terminale Domäne 64
3.2.3. N-terminale Domäne mit Propeptid 74
3.2.4. Modell des gesamten trimeren Minicollagen 1 78
3.3. Thionine 80
3.3.1. Hellethionin D 80
4. DISKUSSION 85
4.1. Azopeptide 85
4.2. Minicollagen 90
4.3. Hellethionin 93
5. ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 95
6. MATERIAL UND METHODEN 98
6.1. Allgemeiner Teil 98
6.1.1. UV-Spektroskopie 98
6.1.2. CD-Spektroskopie 98
6.1.3. Analytische HPLC 98
6.1.4. Präparative HPLC 99
6.1.5. Massenspektrometrie 100
6.1.6. NMR-Spektroskopie 100
6.2. Azopeptide 101
6.2.1. Azo-PDI 102
6.2.2. Azo-[Ser2, Ser5]-PDI 107
6.2.3. bcAMPB 108
Inhaltsverzeichnis
6.2.4. Azo-NonaTRR 109
6.3. Minicollagen 109
6.3.1. C-terminale Domäne 109
6.3.2. N-terminale Domäne 112
6.3.3. N-terminale Domäne mit Propeptide 113
6.4. Hellethionin D 114
7. LITERATUR 117
8. ANHANG A: RESONANZLISTEN 126
9. ANHANG B: NMR-RANDBEDINGUNGEN 132
10. ANHANG C: RECHENPROTOKOLLE 146
1. Einleitung
1.1. Das zentrale Problem der Proteinfaltung
Proteine sind an nahezu allen biologischen Prozessen beteiligt, die von motorischen
Funktionen des Organismus bis zu kognitiven Fähigkeiten reichen. Die
dreidimensionale räumliche Struktur des Proteins ist für seine Funktion
charakteristisch. Während der Entstehung eines Proteins faltet es sich von einer
linearen Aminosäuresequenz in die dreidimensionale Struktur. Die gesamte
Information für die Struktur muss in der Aminosäuresequenz enthalten sein. Dieser
Sequenz-Struktur Zusammenhang wird als Problem der Proteinfaltung bezeichnet und
stellt eine der zentralen Herausforderungen der Strukturbiologie bis zum heutigen Tag
dar. Bereits 1945 wurde dieser Zusammenhang von Anson (Anson, 1945) postuliert
und durch umfangreiche Arbeiten von Anfinsen bestätigt (Anfinsen et al., 1961), der
eine Rückfaltung denaturierter Proteine durch einfaches Verdünnen des Denaturants
verfolgte (Anfinsen, 1973). Seit der Formulierung der Postulate durch Anfinsen
Anfang der 60iger des letzten Jahrhunderts steht das Problem der Proteinfaltung im
Mittelpunkt der Strukturbiologie. Obwohl mittlerweile viele Einzelheiten der
Proteinfaltung bekannt sind und zahlreiche ausführliche Studien auf dem Gebiet
durchgeführt wurden (Jaenicke, 1991, Scheraga, 1996, Creighton, 1997, Dobson et al.,
1998), bleibt bis heute die Vorhersage der räumlichen Struktur eines Proteins aufgrund
der Aminosäuresequenz im Allgemeinen unmöglich.
1.2. Modelle der Proteinfaltung
Die meisten Proteine lassen sich reversibel durch Temperaturerhöhungen,
denaturierende Reagenzien wie Harnstoff oder Guanidiniumhydrochlorid, durch pH-
Variation oder Reduktion der Disulfidbrücken entfalten. Sie besitzen im
Gleichgewicht nur zwei Zustände, die in nennenswerten Umfang populiert sind,
nämlich den nativen vollständig gefalteten Zustand und den ungefalteten Zustand
(Murphy and Gill, 1991). Die freie Energie des nativen Zustandes ist nur geringfügig
kleiner als die des ungefalteten Zustandes. Die größten energetischen Beiträge liefern
hierzu die Terme der van-der-Waals Energie und der Coulombenergie. Diese Terme
1
Einleitung
stabilisieren nur den nativen Zustand, wohingegen nicht native Zustände durch die
Wechselwirkungen destabilisiert werden.
Der ungefaltete Zustand eines Proteins lässt sich als „random coil“ beschreiben, in
dem die konformationellen Eigenschaften, insbesondere die Dihedralwinkel des
Peptidrückgrats, jeder einzelnen Aminosäure unabhängig von anderen Aminosäuren in
der Proteinsequenz sind. Es existieren keine weitreichenden Wechselwirkungen außer
lokalen sterischen Abstoßungen. Der ungefaltete Zustand ist ausgesprochen heterogen
und entspricht eigentlich einer astronomisch großen Zahl an unterschiedlichen
konformationellen Zuständen (Murphy and Gill, 1991). Der ungefaltete Zustand
zeichnet sich durch einen größeren hydrodynamischen Radius aus, da die
Polypeptidkette eine ausgedehntere Konformation annimmt als im gefalteten Zustand.
Für ungefaltete Proteine in stark denaturierenden Medien wie einer 8 M
Harnstofflösung konnte gezeigt werden, dass die Polypeptidketten tatsächlich die
durchschnittlichen hydrodynamischen Eigenschaften eines „random-coil“ besitzen
(Miller and Flory, 1966). Es gibt jedoch eine Vielzahl von Hinweisen, dass ungefaltete
Proteine unter Bedingungen wie extremen pH und Temperaturwerten in Abwesenheit
von denaturierenden Reagenzien keine wirklichen „random-coil“ Zustände annehmen
(Dobson et al., 1984). Diese Zustände unterscheiden sich aber in ihren physikalischen
und thermodynamischen Eigenschaften nicht messbar vom echten ungefalteten
Zustand und sind eventuell nur Zwischenzustände des ungefalteten Zustandes.
Für eine korrekte Faltung muss eine Proteinsequenz ein thermodynamisches und ein
kinetisches Kriterium erfüllen (Karplus and Sali, 1995). Das thermodynamische
Kriterium fordert, dass das Protein im nativen Zustand nur eine einzige Konformation
annimmt, die unter physiologischen Bedingungen stabil ist. Das kinetische Kriterium
fordert, dass die ungefaltete Polypeptidkette sich in einer akzeptablen Zeit, d.h. in
einer Größenordnung von Millisekunden bis zu Sekunden, in die native Konformation
faltet. Eine Polypeptidkette kann sehr viele Konformationen annehmen, so dass es
einen Weg geben muss, den nativen Zustand in einer Zeit zu erreichen, die
Größenordnungen unter der Zeit liegt, die für eine rein stochastische Suche des
Konformationsraums benötigt würde. Ein 100 Aminosäuren langes Protein würde
durch rein stochastisches Suchen des Konformationsraums die native Konformation
nach durchschnittlich 1027 Jahren finden und bräuchte damit unendlich länger als die 2
Einleitung
beobachtete Faltungsdauer. Diese offensichtliche Diskrepanz wird als das
Levinthalsche Paradoxon bezeichnet. Levintahl postulierte daher bereits 1968 einen
Faltungsweg (Levinthal, 1968), in dem das Protein nur bestimmte Konformationen auf
seinem Weg vom ungefalteten zum nativen Zustand annimmt.
Durch eine Fülle von theoretischen, meist auf Gittersimulation basierenden
statistischen Mechanikmodellen und experimentellen Studien (Dobson et al., 1998)
kann heute davon ausgegangen werden, dass das Protein während der Faltung
tatsächlich bestimmten Pfaden durch die hochdimensionale Energieoberfläche folgt
und sich nicht stochastisch bewegt. Da zwischen der Kondensierung von
Atomclustern, beim Übergang vom gasförmigen über den flüssigen in den festen
Zustand, und der Proteinfaltung Ähnlichkeiten bestehen und diese
Kondensierungsprozesse sehr detailliert bekannt sind, können diese Modelle auch auf
die Proteinfaltung angewandt werden. Hierbei geht man davon aus, dass der
ungefaltete Zustand mit seiner sehr hohen Anzahl von Konformationen, entsprechend
dem Gaszustand eines Stoffes, zuerst zu einem Zustand des „molten oder random
globule“ kondensiert, der dem kompakteren flüssigen Zustand eines Stoffes entspricht,
und erheblich weniger konformationelle Zustände erlaubt. Dieser „molten globule“
kondensiert nun zum nativen Zustand, der dem festen Zustand eines Stoffes entspricht
und nur noch aus einem einzigen konformationellen Zustand besteht. Die
Energieoberfläche bildet bei diesem Kondensationsprozess eine Art Trichter mit
abfallender freier Energie in Richtung des nativen Zustandes, in den das Molekül in
einer hierarchischen Folge von Zwischenzuständen hineingesogen wird. In Abbildung
1 ist die Energieoberfläche eines 27-Aminosäurepeptids gezeigt. Hierbei ist die
Energie zum einem gegen ein Maß der Entropie P und gegen die Vorschrittsvariable
Q, auch Ordnungsparameter genannt, aufgetragen; Q ist der Anteil der nativen
Kontakte an der gesamten Anzahl der Kontakte zwischen den Aminosäureresten. Die
Variable Q gibt somit in sehr kompakter Form den Fortschritt der Faltung wieder, die
eigentlich in einem hochdimensionalen Raum stattfindet. Gerade für die Beschreibung
der Proteinfaltung hat sie sich als sehr nützlich erwiesen. Sie variiert, je nach
Fortschritt der Faltung, zwischen einem Wert nahe null für den ungefalteten Zustand
und einem Wert von eins für den nativen vollständig gefalteten Zustand (Dobson et al.,
1998). 3
Einleitung
Abbildung 1: Gemittelte Energieoberfläche eines 27 Reste enthaltenden Peptids bei hoher Temperatur. E ist die Energie, Q der Anteil der nativen Kontakte und P ist ein Maß für die Entropie bei bestimmten Q. Links ist die gesamte Energielandschaft, rechts nur der zugängliche Teil der Energielandschaft, der nennenswert populiert ist, gezeigt (Dobson et al., 1998).
1.2.1. Intermediate und Faltungsbarrieren
Betrachtet man allerdings die freie Energie der Proteinfaltung aus Abbildung 1 stellt
sich heraus, dass die freie Energie, je nach genauem Faltungsmechanismus früher oder
später, auf dem Weg zum nativen Zustand ein lokales Maximum besitzt. Ein solches
Maximum entsteht durch die starke Entropieabnahme auf dem Weg zum nativen
Zustand und kann durch die energetischen Terme lokal nicht ausgeglichen werden.
Diese Barriere muss von Proteinen überwunden werden und stellt eine Art
Übergangszustand dar (Dobson et al., 1998). Vor dieser Barriere kann ein lokales
Minimum der freien Energie liegen, welches einem Intermediatzustand entspricht. Ein
solches Intermediat bildet der „molten globule“, der in der frühen Phase der
Proteinfaltung gefunden wird (Balbach et al., 1997). Er formt ein kompaktes Knäuel,
in dem die hydrophoben Gruppen vor der wässrigen Umgebung abgeschirmt werden,
und bildet bereits nativ-ähnliche Sekundärstrukturelemente aus, besitzt aber noch
keine spezifische Tertiärstruktur.
Die Stabilisierung solcher korrekter Zwischenprodukte verringert die Suchzeit der
Proteinfaltung erheblich. Die kumulative Selektion von stabileren Intermediaten führt
zu einer zunehmenden Stabilisierung und Kooperativität im Verlauf der Faltung des
Proteins. Allerdings beträgt der Gewinn der freien Energie für ein 100 Aminosäuren
4
Einleitung
großes Protein zwischen ungefaltetem und nativem Zustand nur etwa 40 kJ/mol
(Privalov, 1979). Der Beitrag der einzelnen Aminosäuren ist daher sehr gering. Dies
rührt daher, dass der native Zustand zwar energetisch günstiger, entropisch aber
ungünstiger als der ungefaltete Zustand ist und beide Terme sich größtenteils
aufheben.
1.2.2. Bildung von Faltungsmotiven
Ein weiterer zentraler Prozess im frühen Verlauf der Faltung ist die Bildung von α-
Helix, β-Faltblatt und β-Turn–Faltungseinheiten. Sie bilden einen Faltungskern, um
den herum sich der Rest der Struktur aufbauen könnte (Dobson et al., 1998). In diesem
Stadium der Faltung sind die bereits vorhandenen nativen Kontakte noch von kurzer
Reichweite und auf die Bildung von Sekundärstrukturelementen beschränkt.
Bestimmte Sequenzmuster und einzelne Aminosäuren treiben die Ausbildung dieser
Sekundärstrukturelemente voran. So begünstigen z.B. Alanin und Leucin die Bildung
von α-Helices, während Valin und Isoleucin β-Faltblattstrukturen stabilisieren
(Horovitz et al., 1992). Ebenso werden Positionen am Anfang (N-cap) und Ende (C-
cap) einer α-Helix durch Aminosäurereste besetzt, deren Seitenketten eine
Wasserstoffbrücke zum Peptidrückgrat ausbilden können. Die Aminosäuren Asn, Asp
und Thr werden vermehrt am Anfang, His und Asn vermehrt am Ende von Helices
gefunden. Diese Aminosäuren initiieren und stabilisieren die Bildung von α-Helices in
Peptiden und Proteinen (Munoz and Serrano, 1994). Experimentelle Studien an
Proteinen und Peptiden, sowie statistische Analysen von Protein-Datenbanken
(Richardson and Richardson, 1988) ergaben, dass negativ geladene Aminosäurereste
bevorzugt am N-Terminus einer α-Helix, positiv geladene Reste dagegen bevorzugt
am C-Terminus einer α-Helix vorkommen. Dadurch entsteht ein Dipol über den
Verlauf der Helix, der die Helix stabilisiert, das Gleichgewicht zwischen der α-Helix
und einer random-coil Konformation der Reste verschiebt und damit die Bildung des
Faltungsmotivs begünstigt. Durch Ultrakurzzeit-IR-spektroskopische Messungen an
Peptiden mit α-helikaler Strukturpräferenz konnte gezeigt werden, dass die
Sekundärstrukturbildungen schnell genug stattfinden, um eine wichtige Rolle in der
frühen Phase der Proteinfaltung spielen zu können (Williams et al., 1996).
5
Einleitung
1.2.3. Autonome Faltungseinheiten
Bei der Faltung von bestimmten Proteinen existieren Substrukturen, die sich
unabhängig vom Rest der Polypeptidkette in nativ-ähnliche Konformationen falten
(Peng and Wu, 2000). Durch CD- und NMR-Messungen konnte gezeigt werden, dass
ein synthetisches Disulfid-verknüpftes Peptidfragment des Trypsin-Inhibitors BPTI bei
4 °C die gleiche Sekundär- und Tertiärstruktur einnimmt wie das intakte Protein. Das
Fragment besteht aus den Aminosäureresten 43-58 und 20-33 des BPTI, wobei die
beiden Sequenzen durch eine Disulfidbrücke zwischen Cys 31 und Cys 51 verbunden
sind. Das erste Fragment bildet eine α-Helix und das zweite eine β-Haarnadelschleife.
Das Fragmentpaar ahmt damit einen Teil des nativen Proteins nach. Allgemein lässt
sich daraus folgern, dass der Faltungsweg durch die sequenzbedingte Neigung
bestimmt ist, Zwischenprodukte zu bilden, die dem nativen Molekül gleichen. Die
Proteinfaltung wird also durch gleiche Wechselwirkungen dirigiert, die auch zum
nativen Zustand führen und diesen stabilisieren.
1.2.4. Die Faltung großer Proteine
Je größer Proteine werden, desto komplexer und schwieriger wird es, den
Faltungsprozess experimentell zu verfolgen. So treten z.B. während der Faltung des
Lysozyms verschiedene Faltungsintermediate und verschiedene Faltungswege auf, da
sich die vollständige Struktur nicht in einem Schritt kooperativ aus dem „molten
globule“ der frühen Faltungsphase bildet (Kiefhaber, 1995). Es entwickeln sich
unabhängige nativ-ähnliche Strukturen in unterschiedlichen Domänen des Lysozyms.
Eine Domäne ist größtenteils α-helikal, wohingegen die andere Domäne größtenteils
β-Faltblattregionen enthält. Da sich eine Domäne schneller als die anderen Domänen
falten kann, entsteht ein partiell gefaltetes Intermediat, in dem die schneller faltende
Domäne bereits den nativen Zustand angenommen hat. Innerhalb jeder Domäne ist die
Bildung der endgültigen Struktur kooperativ und erfolgt in einem Zeitbereich, der dem
Faltungsprozess kleiner Proteine entspricht. Die vollständig native Struktur des
gesamten Proteins wird durch das Zusammenwirken der beiden Domänen in einem
langsamen, geschwindigkeitsbestimmenden Schritt gebildet, bei dem eine
Energiebarriere überwunden werden muss. In Übereinstimmung mit diesen
experimentellen Beobachtungen zeigen Gittersimulationen, dass bei längeren 6
Einleitung
Polypeptidketten mehrere Faltungsdomänen, die sich unabhängig falten, existieren
(Dinner et al., 1996). Die Domänenbildung ist daher eine wichtige Eigenschaft der
Faltung großer Peptide. Sie unterscheiden sich damit von kleinen Proteinen, in denen
die gesamte Polypeptidkette in einem einzigen kooperativen Schritt gefaltet wird.
1.2.5. Faltung in der Zelle
Der Faltungsprozess in der Zelle unterscheidet sich von den theoretischen und
experimentell in vitro bestimmten Mechanismen durch die hohe Proteinkonzentration
in der Zelle und durch die Anwesenheit von anderen, die Faltung beeinflussenden
Molekülen, so genannten Foldasen. Zum einen gibt es Enzyme, die, wie später
ausführlicher beschrieben wird, die Isomerisierung von Disulfidbrücken beschleunigen
und zum anderen Proteine, Chaperone genannt, die entfaltete Polypepdidketten und
Faltungsintermediate binden und damit deren Aggregation verhindern (Hartl, 1996).
Diese Chaperone besitzen auch eine Entfaltungsaktivität, mit der sie fehlgefalteten
Proteinen erlauben, die kinetischen Fallen wieder zu verlassen und den korrekten
Faltungsweg einzuschlagen.
Weitgehend unverstanden sind die Faltungsmechanismen von Membranproteinen
und Membran-assoziierten Proteinen, da hier die Faltung in hydrophober und nicht in
hydrophiler Umgebung stattfindet und die frühe und wichtige Phase des „molten
globule“ wahrscheinlich verändert ist oder gar nicht auftritt.
1.2.6. Disulfidbrücken und oxidative Faltung
Disulfidbrücken in Proteinen erniedrigen durch die Einschränkung des
Konformationsraums die Entropie des ungeordneten Zustandes und begünstigen den
nativen Zustand durch Stabilisierung energetisch bevorzugter Wechselwirkungen
(Darby and Creighton, 1997, Creighton, 1997). Reduziert man in kleinen nativen
Proteinen, wie BPTI, RNase A und α-LA die Disulfidbrücken, entfalten sie sich, da
die Bildung der Disulfidbrücken für die Stabilisierung des nativen Zustandes wichtig
ist. Daher kann die Faltung dieser Proteine über die Anwesenheit von oxidierenden
bzw. reduzierenden Reagenzien gesteuert werden. Faltungsintermediate können nach
der Methode von Creighton (Creighton, 1986) durch Alkylierung freier Thiolgruppen
der Cysteine abgefangen werden. Der Einfluss einzelner Disulfidbrücken kann durch
7
Einleitung
gezielte Mutation der Cysteine gegen Alanin, Serin (Staley and Kim, 1992) und
Selenocystein (Pegoraro et al., 1998) experimentell untersucht werden.
Die Bildung des nativen Zustandes unter Oxidation zu Disulfidbrücken wird als
oxidative Proteinfaltung bezeichnet. Der Mechanismus der oxidativen Proteinfaltung
wurde ausgiebig an den oben erwähnten Proteinen BPTI, RNase und α-LA untersucht.
In der Ribonuklease A bilden sich aus dem ungefalteten Zustand R erst Disulfid-
Ensembles nS, die schließlich im 3S-Intermediat unter einer langsamen Disulfid-
Austauschreaktion die Übergangszustände des [40-95] und des [65-72]-Intermediats
mit nativ-ähnlicher Struktur und ausschließlich nativen Disulfidbrücken ausbilden, die
sich dann schnell in den nativen Zustand N falten (Abbildung 2). Aufgrund der kleinen
Größe und der ungewöhnlich hohen Stabilität des BPTI mit seiner fast vollständigen
korrekten Faltung nach der Bildung einer einzigen Disulfidbrücke (van Mierlo et al.,
1993), könnte das Auftreten relativ ungeordneter Intermediate in der Faltung wie bei
der Ribonuklease A ein zweites Modell der disulfidstabilisierten Proteinfaltung
darstellen (Volles et al., 1999).
R 1S 2S 3S 4
des[40-95] des[65-72]3S*
N
S
Abbildung 2: Kinetisches Modell der oxidativen Faltung der RNase A mit DTTox. Die native RNase A enthält vier Disulfidbrücken an den Positionen [26-84], [40-95], [58-110] und [65-72]; nS symbolisieren Disulfid-Ensembles mit n = 1, 2, 3, 4 Disulfidbrücken, R den vollständig reduzierten und N den nativen Zustand (Rothwarf et al., 1998). In horizontaler Richtung ist die Verteilung der Disulfidbrücken und in vertikaler Richtung der Faltungsgrad aufgetragen.
1.3. Thionine
8
Thionine sind Cystein-reiche Peptide mit einer Größe von ca. 5 kDa, welche eine
wichtige Rolle in der Abwehrreaktion der Pflanzen gegen Pathogene spielen (Garcia-
Olmedo et al., 1998). Getreidepflanzen (Graminacea) bilden eine besonders reiche
Quelle an Thionin, z.B. wurden Purothionine aus Weizen (Triticum aestivum) (Balls et
Einleitung
al., 1942), Hordothionine aus Gerste (Hordeum vulgare) (Redman and Fisher, 1969),
Avenothionine aus Hafer (Avena sativa) (Bekes and Lasztity, 1981), Secalothionin aus
Roggen (Secale cereale) (Hernandez-Lucas et al., 1979) und kürzlich Thionine aus der
Augenbohne (Vigna unguiculata) (Melo et al., 2002) isoliert. Getreidethionine sind
gewöhnliche Bestandteile der Nahrung von Mensch und Tier und zeigen keinerlei
orale Toxizität, da sie bei der Verdauung leicht enzymatisch abgebaut werden. Andere
Quellen von Thioninen sind parasitär lebende Pflanzen. Viscotoxin wurde aus Misteln
(Viscum album) (Schaller et al., 1996), Pyruliathionin aus der Pyrulianuss (Pyrularia
pubera) (Vernon et al., 1985) und Crambin aus der Krambe (Crambe abyssinica)
(Teeter et al., 1981) isoliert.
Thionine besitzen in ihrer Sequenz sechs oder acht Cysteinreste, die drei bzw. vier
Disulfidbrücken bilden (Bohlmann and Apel, 1991). Obwohl alle bis heute bekannten
Thionine sich z.T. erheblich in ihrer Sequenz unterschieden, befinden sich sechs
konservierte Cysteinreste an den Positionen 3, 4, 16, 26, 32 und 40 mit einem
konservierten Disulfidverknüpfungsmuster, ein Arginin an Position 10 und eine
aromatische Aminosäure an der Position 13. Die Tatsache, dass fast alle Thionine
basische Peptide sind, wird mit ihrer Membranaktivität in Verbindung gebracht.
Während die Wechselwirkung mit Phospholipiden eine Vorraussetzung für die
Toxizität ist, reicht sie allein nicht aus, um die Zelle zu lysieren und zu töten. Das
Pyruliathionin behält nach Oxidation des Trp 8 zwar seine Membranaktivität, verliert
aber seine hämolytische Toxizität (Fracki et al., 1992). Thionine sind in vitro toxisch
für Bakterien, Pilze und Hefen, und es wird angenommen, dass sie dieselbe Toxizität
als Abwehrmoleküle in der lebenden Pflanze ausüben (Garcia-Olmedo et al., 1998).
Die isolierten Viscotoxine A1 und A2 können in Zellkultur die Apoptose von
menschlichen Lymphozyten auslösen, während das verwandte Viscotoxin B und das
Pyruliathionin diesen Effekt nicht hervorrufen (Bussing et al., 1999). Der genaue
Mechanismus der Interaktion zwischen den Thioninen und der Zellmembran ist noch
umstritten, es gibt aber eine hohe Korrelation zwischen der Zytotoxizität und der
Fähigkeit, Membrankanäle zu bilden (Hughes et al., 2000). Die antimikrobielle
Wirkung und die Zytotoxizität der Thionine ergeben zwei mögliche
Anwendungsgebiete. Zum einen können transgene Pflanzen mit Thioningenen erzeugt
werden, die dann erhöhte Resistenz gegen Pathogene besitzen (Ohashi et al., 1998). 9
Einleitung
Zum anderen können Thionine an tumorspezifische Antikörper gebunden werden und
so in der Krebstherapie Verwendung finden (Gasanov et al., 1995).
Die dreidimensionale Struktur von verschiedenen Thioninen wurde durch
Röntgenbeugung (Stec et al., 1995, Jelsch et al., 2000) und durch NMR-Spektroskopie
bestimmt (Clore et al., 1987, Romagnoli et al., 2000). Die Strukturen ähneln alle dem
griechischen Buchstaben Γ, in dem der vertikale Balken durch zwei antiparallele α-
Helices und der horizontale Balken durch ein kurzes antiparalles β-Faltblatt gebildet
wird. Die Fähigkeit der Thionine, Membrankanäle zu bilden, hängt wahrscheinlich mit
ihren strukturellen Eigenschaften zusammen, in der die geladenen Gruppen an der
Innenseite der Helices und des β-Faltblattes liegen und die hydrophoben Resten an der
Außenseite des Γ liegen.
Eine neue Familie von Thioninen, genannt Hellethionine, wurde aus der
Balkanlenzrose (auch Purpurnieswurz genannt) (Helleborus purpurascens) isoliert
(Milbradt et al., 2003). Die Balkanlenzrose gehört zu der Gattung der
Hasenfußgewächse (Ranunculaceae). Auf dem Balkan wird sie seit Jahrhunderten als
Heilpflanze für Nutztiere verwendet. Verschiedene pharmakologisch relevante Stoffe
wie das Herzglykosid Hellebrin (Cioca and Cucu, 1974), eine Bufadienolische
Verbindung (Muhr et al., 1994) und verschiedene andere Naturstoffe sind bereits aus
der Balkanlenzrose isoliert worden.
1.4. Minicollagen
Collagene sind essentielle Bestandteile des Bindegewebes. In Säugetieren sind bis
jetzt mehr als 20 verschiedene Collagene gefunden worden. Die Zahl der Collagen-
kodierenden Gene ist noch größer, da Collagene Trimere sind, und die einzelnen
Monomere zum Teil aus unterschiedlichen Polypeptidketten bestehen. Ketten, die den
charakteristischen Collagensequenzrepeat Gly-Xaa-Yaa besitzen, können eine
Tripelhelix bilden. Viele Collagene der Säugetiere können bis zu frühen Organismen
wie dem Süßwasserpolyp (Hydra), Muscheln und Würmern zurückverfolgt werden.
Beispiele sind das interstitielle Collagen I, II, III und V und das
Basalmembrancollagen IV. Obwohl das Bindegewebe der Wirbellosen und der
Säugetiere unterschiedlich aufgebaut sind, zeigt die hohe Konservierung der Collagene
ihre überragende Bedeutung. 10
Einleitung
Zusätzlich verfügen Wirbellose auch über nicht verwandte Collagene, die spezielle
Funktionen erfüllen. Ein interessantes Beispiel sind die sechs unterschiedlichen
Minicollagene von Hydra, die die kürzesten bis heute bekannten Collagene darstellen
(Kurz et al., 1991). Diese Collagene befinden sich in der Wand des Nematocysten,
einem hochspezialisierten kapselartigen Organell, welches seinen Inhalt
explosionsartig entleeren kann. Der Nematocyst kommt häufig in Nesseltieren
(Cnidaria) vor, ist aber in Säugetieren nicht existent. Der Nematocyst befindet sich in
der Nematocyte, einer Zelle die dem Beutefang, der Fortbewegung und der
Verteidigung der Nesseltiere dient. Die Entleerung der Nematocysten ist einer der
schnellsten Exocytoseprozesse in der Natur und ist nach 3 ms beendet (Holstein and
Tardent, 1984). Die maximale Geschwindigkeit des ausgestoßenen Tubulus beträgt 2
ms-1 und entspricht einer Beschleunigung von 40.000 g. Der sehr hohe osmotische
Druck in den Nematocysten, der den explosionsartigen Ausstoß bewirkt, wird auf 150
bar geschätzt und durch eine 2 M Konzentration an Poly-γ-Glutamat in der Matrix
aufgebaut (Weber, 1990). Die Wände des Organells müssen daher einem enormen
Innendruck widerstehen können. Nach der Entdeckung von sechs eng verwandten
Minicollagenen wurde spekuliert, dass diese für die außergewöhnliche Zugfestigkeit
der Nematocystenwand verantwortlich sind (Kurz et al., 1991).
Das Minicollagen 1 aus Hydra wird von dem N-COL-1 Gen kodiert und bildet
unter physiologischen Bedingungen ein Homotrimer. Die Sequenz (Abbildung 3)
enthält eine zentrale tripelhelikale Region mit 14 Gly-Xaa-Yaa Repeats. Die zentrale
Region wird an ihren N- und C-Termini durch Polyprolin-Bereiche unterschiedlicher
Länge flankiert, an die sich die Cystein-reichen N- und C-terminale Domänen
anschließen.
11
Einleitung
1 5 10 15 20 25 30 35 40
D A N P C G S Y C P S V C A P A C A P V C C Y
P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P A P L P
G N P G P P G R P G P P G A P G P A G P P G L P G P P G P P G A P G Q G G L P G Q P
A P P P P
P C P P V C V A Q C V P T C P Q Y C C P A K R K
Abbildung 3: Sequenz des Minicollagen-1 aus Hydra; oben ist die N-terminale Domäne gezeigt, (Cysteine sind gelb unterlegt) darunter befindet sich der N-terminale Polyprolin-Bereich; in der Mitte ist in grün die zentrale tripelhelikale Region dargestellt, und darunter befinden sich der C-terminale Polyprolin-Bereich (grau) und die C-terminale Cystein-reiche Domäne.
Aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen ist bekannt, dass die Wand der
Nematocystenkapsel aus Collagen-ähnlichen Fibrillen besteht (Holstein et al., 1994).
Diese Fibrillen werden wahrscheinlich aus disulfidverknüpften Polymeren des
Minicollagens gebildet. Die Biogenese des Nematocysten, in Abbildung 4 gezeigt,
folgt einem komplexen Entwicklungsweg, in dem es zur Proteinassemblierung kommt.
Der Nematocyst setzt sich in einer post-Golgi Vakuole aus Bestandteilen, die über
Vesikel vom ER geliefert werden, zusammen (A). An der inneren Wand der
Vakuolenmembran lagern sich zwei unterschiedlich dichte Schichten ab, die
zusammen die Nematocystenwand bilden (B). Anschließend wird ein zylindrischer
Tubulus am apikalen Ende der Kapsel geformt (C) (Holstein, 1981). Nach
Fertigstellung wird dieser Tubulus in die Kapsel hineingestülpt und dort mit einer Art
Gerüst umgeben (Engel et al., 2002) (D). In der letzten Entwicklungsphase wird die
Nemtocystenwand gehärtet, verringert sich auf 50 % ihrer ursprünglichen Dicke und
die Kapsel wird mit Poly-γ-Glutamat gefüllt (Weber, 1990) (E). Bei der Härtung der
Nematocystenwand werden die Minicollagenmoleküle über ihre Disulfidbrücken quer
vernetzt.
12
Einleitung
Abbildung 4: Biogenese eines Nematocysten in Hydra (Engel et al., 2002).
1.5. Lichtschaltbare Konformationszustände
Um Nichtgleichgewichtsdynamiken wie die der Proteinfaltung untersuchen zu
können, müssen die relevanten Prozesse zu einem definierten Zeitpunkt gestartet
werden (Volk, 2001). Induzierte Änderungen der Lösungsbedingungen wie pH-Wert,
Ionenstärke oder Konzentration von Entfaltungsreagenzien (Harnstoff,
Guanidiniumhydrochlorid) können mit speziellen Vorrichtungen („stopped flow“
Apparaturen) bis in den Millisekundenbereich verfolgt werden (Kiefhaber, 1995).
Temperatursprungexperimente sind schneller zu realisieren, aber oft schwieriger zu
kontrollieren bzw. zu analysieren, da der äußere Stimulus durch eine Reihe von
Zwischenschritten auf das zu beobachtende System übertragen wird (Phillips et al.,
1995). Die Kurzzeit- und Ultrakurzzeitspektroskopie hingegen erlaubt mittels sehr
kurzer Laserpulse sowohl eine spektral genau definierte Anregung des Systems als
auch die zeitaufgelöste Beobachtung der folgenden Prozesse im
Femtosekundenbereich. Deswegen können photoschaltbare Konformations-
änderungen, z.B. in Peptiden mit Photoschaltern, die Möglichkeit bieten,
Faltungsvorgänge im Femto- und Pikosekunden Bereich zu beobachten (Spörlein et
al., 2002).
13
Einleitung
1.5.1. Photoschalter
Jedes lichtschaltbare System benötigt einen Photoschalter, um auf entsprechende
Bestrahlung mit Änderungen seiner Eigenschaften reagieren zu können. Sowohl
organische Moleküle als auch Metallkomplexe können in verschiedenen
geometrischen Isomeren existieren, welche unterschiedliche physikalische
Eigenschaften und chemische Reaktivität besitzen (Dugave and Demange, 2003). Ein
Molekül, das zwei Atome besitzt, meist Stickstoff oder Kohlenstoff, die durch eine
Doppelbindung verbunden sind und zwei unterschiedliche Substituenten an dieser
Doppelbindung besitzt, kann in zwei Isomerenzuständen gefunden werden, wenn X ≠
W und Y ≠ Z ist (Abbildung 5)
Abbildung 5: Schematische Darstellung von Molekülen, die π-Elektronen-Systeme enthalten und eine E-Z Isomerie nach Cahn-Ingold-Prelog besitzen.
Unter der Voraussetzung das W = Y ist, werden A und B jeweils das cis- und das
trans-Isomer bezeichnet. Nach der Nomenklatur von Cahn-Ingold-Prelog wird A auch
als das Z-und B auch als das E-Isomer bezeichnet. Diese Nomenklatur gilt auch dann,
wenn ein oder zwei Stickstoffe das π-Elektronensystem bilden. Die entsprechenden
Substituenten sind in diesem Fall freie Elektronenpaare. Die Verbindungen A und B
sind Diasteromere. Sie haben verschiedene physikalische und chemische
Eigenschaften. Geometrische Isomere von Biomolekülen haben daher unterschiedliche
biologische Aktivitäten. So lange der Energieunterschied zwischen den Isomeren
gering ist, sind beide Isomere unter physiologischen Bedingungen existent und
können, falls die Energiebarriere nicht zu hoch ist, nach entsprechender Anregung
ineinander umgewandelt werden.
Für die Isomerisierung existieren, je nach chemischer Struktur und Art des
Photoschalters, eine ganze Reihe möglicher Mechanismen (Dugave and Demange,
2003). Einige von ihnen basieren auf der homo- oder heterolytischen Spaltung der 14
Einleitung
Doppelbindung. Andere Mechanismen basieren auf einer Schwächung des
Doppelbindungscharakters durch Konjugation, die eine Umwandlung erleichtert. Eine
schematische Übersicht ist in Abbildung 6 gegeben.
X
Y X
Y
. .X Y
++
. .
X Y
X Y + -
++
X
Y
+
-++
++
Pfad A
Pfad A'
Olefine
push-pullVerbindungen
X
YNu
Nu-
X
Y
-X
Nu
Y
-++++
RS.
X
RS Y
.X
RS
Y
.++ ++
X
Y
H H +H+ X Y
HH
+
++ ++
X YOlefine
Acrylate
Acrylate
N NX Y
N NY
X
++
N NX Y
++
N NX
Y Diazene
Y
OH
Y
O H
O Y
H
++
OH
YEnole
Pfad B
Pfad B'
Pfad B''
Pfad C
Pfad D
++
Abbildung 6: Mögliche Mechanismen der E-Z Isomerisierung.
Die homolytische Spaltung wurde bei der heterogenen Hydrierung,
Radikalreaktionen initiiert durch Radikalgenerierung (z.B. thermische Zersetzung von
Azoverbindungen), direkter Photoisomerisierung, durch paramagnetische Moleküle
induzierter Isomerisierung und bei der thermischen Isomerisierung beobachtet (Pfad
A). In anderen Fällen kann eine radikalische Addition/Eliminierung eine E-Z
Isomerisierung bewirken (Pfad B’). Außer für Reaktionen, die reaktive Nukleophile
(Pfad B) oder reaktive Elektrophile (Pfad B’’) als Reaktant benötigen, wird die
15
Einleitung
heterolytische Spaltung der Doppelbindung stark durch captodative Etyhlensysteme
mit Elektronendonatoren als Substituent (X) und Elektronenakzeptoren als Substituent
(Y) auf der anderen Seite getrieben. In ausgedehnten konjugierten Systemen, wie z.B.
in Farbstoffen, wird durch die Resonanzenergie die energetische Rotationsbarriere
erniedrigt. Stickstoff-enthaltende π-Systeme mit freien Elektronenpaaren können über
eine Doubletinversion isomerisieren. Der Mechanismus der Doubletinversion
konkurriert allerdings mit einer einfachen Rotation, die durch Tautomerie begünstigt
wird (Pfad D).
1.5.2. Azobenzol-enthaltende Photoschalter
In Gegensatz zu den photoschaltbaren Acrylaten, Enaminen und Iminen werden
Stickstoff-Stickstoff π-Systeme nicht in natürlichen Substanzen gefunden. Es wurden
zahlreiche photoschaltbare Azo-enthaltende Moleküle für die konformationelle
Kontrolle von Peptiden und anderen Biomolekülen entwickelt (Renner et al., 2004).
Auch in der Halbleiter- und Nanotechnologie werden verschiedene Azobenzol-
enthaltene Substanzen als Speichermoleküle verwendet (Kawata and Kawata, 2000).
Aufgrund ihrer breiten Anwendung sind Azobenzol-enthaltende Verbindungen
ausführlich untersucht worden (Suginome, 1995). Diarylazo-Verbindungen existieren
im Dunkeln in der stabileren trans-Form und isomerisieren leicht nach Bestrahlung bei
320 – 350 nm in eine 12 kJ/mol weniger stabile cis-Form (Rau, 1990). Die Reaktion
ist zum einen durch Belichtung bei 400–450 nm oder durch thermische Relaxation bei
erhöhter Temperatur vollständig reversibel. Die genaue Anregungswelllänge variiert je
nach Substituenten, wobei Azo-Verbindungen mit push-pull Substituenten
rotverschobene Anregungsmaxima zeigen (Renner et al., 2004). In unserer Gruppe
wurden die beiden Azobenzol-Bausteine APB (Behrendt et al., 1999) und AMPB
(Ulysse et al., 1995) als ω-Aminosäuren in der Peptidsynthese verwendet (Abbildung
7).
16
Einleitung
O
OH
NH2
NN
O
OH
NN
NH2
Abbildung 7: Azobenzol-Bausteine als ω-Aminosäuren. Links: 4’(Amino)-phenylazobenzoesäure (APB) und rechts 4’(Aminomethyl)phenylazobenzoesäure (AMPB).
Durch die konjugierten push-pull Substituenten sind die Anregungsmaxima des
APB-Bausteins im Vergleich zum AMPB-Baustein, in dem die Aminogruppe durch
Einführung des Methylspacers nicht mehr konjugiert ist, rotverschoben. Das
Anregungsmaximum der trans→cis Isomerisierung des APB-Bausteins in DMSO liegt
bei 370 nm bzw. für die cis→trans Isomerisierung bei 450 nm. Die Anregungsmaxima
des AMPB-Bausteins in einer Peptidkette liegen bei 335 nm für die trans→cis
Isomerisierung und bei 434 nm für die cis→trans Isomerisierung in Wasser (Behrendt,
2000).
1.5.3. Isomerisierungsmechanismen im Azobenzol
Bei der trans→cis Isomerisierung von Azobenzol-enthaltenden Verbindungen
ändert sich sowohl die Polarität als auch die Geometrie des Bausteins. In der planaren
trans-Form des Azobenzols beträgt der mittlere Abstand der beiden para C-Atome
etwa 9 Å und verringert sich in der abgewinkelten nicht-planaren cis-Form auf 6 Å
(Robertson, 1939).
NN R
RN N
RR
trans cis
hν
hν, ∆T
~9 A ~6 A
Abbildung 8: Änderung des Abstands der beiden para-C-Atome bei der Isomerisierung des Azobenzols.
17
Einleitung
Für die Isomerisierung von N=N π-Systemen sind zwei Mechanismen bekannt: i)
eine Inversion des Stickstoff-Doublets und ii) eine Rotation (Cimiraglia and Hofmann,
1994). Die Art der Isomerisierung hängt von dem eingeschlagenen Pfad durch die
Energielandschaft des S0, S1 und S2 Zustands ab.
Abbildung 9: Potentialkurven des S0, S1 und S2 Zustands des Azobenzols (Monti et al., 1982).
Die theoretischen berechneten Potentialkurven der verschiedenen Zustände sind in
Abbildung 9 gezeigt (Monti et al., 1982). Bei dem Inversionsmechanismus geht das
System nach Absorption eines Photons hν, sowohl im trans- als auch im cis-Isomer, in
den ersten elektronisch angeregten Zustand S1 über. Die Rückkehr in den
Grundzustand erfolgt zunächst entlang einer S1 Potentialkurve der Inversion in ein
Minimum bei φ = 0. Von dort kehrt das angeregte Molekül je nach φ Wert in den
trans- oder cis-Grundzustand zurück. Wird nach Absorption eines Photons hν das
System in den zweiten angeregten Zustand S2 angeregt, so wird das System mit Hilfe
des Rotationsmechanismus in den Grundzustand zurückkehren. Bei dem
Rotationsmechanismus wird ein Phenylring um die N=N-Bindungsachse rotiert (Monti
et al., 1982).
1.5.4. Lichtschaltbare Peptidsysteme
In vorhergehenden Arbeiten wurde bereits ein photoschaltbares zyklisches
Octaazopeptid entworfen und synthetisiert, das unterschiedliche Redoxpotentiale
seines Bis(cysteinyl)motivs, welches aus der Thioredoxin-Reduktase (siehe unten)
stammte, in der trans- und in der cis-Form besaß (Cattani-Scholz et al., 2002). Im 18
Einleitung
Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden konformationelle und Redoxeigenschaften
weiterer zyklischer Azopeptide, die das Bis(cysteinyl)motiv der Thioredoxin-
Reduktase oder der Proteindisulfidisomerase besaßen, untersucht.
1.5.5. TRR und PDI
Die beiden redoxaktiven Enyzme Thioredoxin-Reduktase (TRR) und
Proteindisulfidisomerase (PDI) gehören zur Superfamilie der Oxidoreduktasen. Die
Thioredoxin-Reduktase ist am Elektronentransport bei der Reduktion von
Ribonukleotiden zu Desoxyribonukleotiden beteiligt und besitzt neben zwei
redoxaktiven Cystein-Resten FAD/FADH2 als prosthetische Gruppe und eine NADPH
Bindungsstelle. Der Elektronenfluss vom NADPH zur Desoxyribose unter Beteiligung
der Thioredoxin-Reduktase ist in Abbildung 10 gezeigt. Daneben kann die
Thioredoxin-Reduktase aber auch Vitamin K, Dehydroascorbinsäure und freie
Radikale der Ascorbinsäure reduzieren.
NADPH + H+
NADP+ FADH2
FAD TRR
TRR
SH
SH
SH
SH
S
S
S
S
S
S
S
S
TRXSH
SH
SH
SH
TRX
RNR
RNRSH
SH
SH
SH
S
S
S
S
Ribose
Desoxyribose
Thioredoxin Redukatse
(TRR)
Thioredoxin
(TRX)
Ribonukleotid-
Reduktase (RNR)
Abbildung 10: Enzymatischer Elektronentransfer bei der Reduktion von Ribonukleotiden zu Desoxyribonukleotiden.
Die TRR aus E. coli ist ein 321 Aminosäurereste großes globuläres Protein, das aus
zwei Domänen besteht. Eine Domäne besitzt FAD als prosthetische Gruppe, die
andere bildet eine NADP Bindungsstelle. Die Cysteine sind im Bis(cysteinyl)motiv
Cys-Xaa-Yaa-Cys angeordnet, welches sich am N-Terminus einer α-Helix in der
NADPH Bindungsdomäne befindet. An der X-Position befindet sich ein Ala, an der Y-
Position ein Thr. Die Thioredoxin-Reduktase weicht allerdings von der für dieses
Bis(cysteinyl)motiv typischen Thioredoxinfaltung, die in einer ganzen Reihe von
redoxaktiven Enzymen gefunden wurde (Holmgren, 1995), ab (Waksman et al., 1994).
19
Einleitung
In Abbildung 11 ist die Struktur der Thioredoxin-Reduktase aus E. coli mit dem
hervorgehobenem Bis(cysteinyl)motiv gezeigt.
Abbildung 11: Struktur der Thioredoxin-Reduktase (PDB: 1TDE). Das Bis(cysteinyl)motiv ist durch blaue Seitenkettenbindungen gekennzeichnet. Die Disulfidbrücke ist gelb gezeichnet.
Die Proteindisulfidisomerase ist ein endoplasmatisches Reticulum-ständiges
eukaryotisches Enzym, das die Isomerisierung von Disulfidbrücken anderer Proteine
erleichtert und so nicht-native Disulfidverknüpfungen wieder lösen kann. Die
reduzierte Form der PDI wird durch Reduktion mit GSH wiedergewonnen. Neben der
Disulfidisomerase-Aktivität besitzt PDI auch eine Chaperon-Aktivität (Wang and
Tsou, 1993). PDI bindet eine ganze Reihe von ungefalteten Polypeptiden über
hydrophobe Regionen an der Proteinoberfläche. Die PDI besitzt zwei redoxaktive
Bis(cysteinyl)motive in zwei getrennten Domänen. An der X-Position befindet sich ein
Gly und an der Y-Position ein His. Im Vergleich zur Thioredoxin-Reduktase ist das
Redoxpotential des Bis(cysteinyl)motivs positiver. PDI nimmt als native Form die
weitverbreitete Thioredoxinfaltung an. In Abbildung 12 ist die Struktur der N-
terminalen Domäne der Proteindisulfidisomerase mit dem Bis(cysteinyl)motiv
abgebildet.
20
Einleitung
Abbildung 12: Struktur der N-terminalen Domäne der Proteindisulfidisomerase. Das Bis(cysteinyl)motiv ist durch blaue Seitenkettenbindungen gekennzeichnet. Die Disulfidbrücke ist gelb gekennzeichnet.
21
2. Aufgabenstellung Im Rahmen dieser Arbeit sollten Molekülsysteme untersucht werden, die sich als
Modelle für die (oxidative) Proteinfaltung eignen. Die erste untersuchte Klasse von
Molekülen bilden zyklische Azopeptide mit Sequenzen der Thioredoxin-Reduktase
und der Proteindisulfidisomerase. Die zweite Klasse von Molekülen wird durch kleine
natürliche vorkommende Cystein-reiche Peptide gebildet.
Die zyklischen Azopeptide sollten zunächst durch CD- und NMR-Spektroskopie
strukturell charakterisiert werden. Analog zu den Arbeiten über das Azo-TRR-Peptid
(Cabrele et al., 2002a) sollte für die wasserlöslichen bizyklischen (eine Disulfidbrücke
enthaltenden) Peptide auch das Redoxpotential in der cis- und in der trans-Form
gemessen werden. Falls möglich sollte auch die Strukturabhängigkeit des
Redoxpotentials untersucht werden. Anschließend sollten dann in Kooperationen die
sehr schnellen konformationellen Änderungen nach der Lichtschaltung experimentell
über Ultrakurzzeitspektroskopie und theoretisch über MD-Simulationen untersucht
und mit den statischen strukturellen Eigenschaften verglichen werden. Hiermit
erhoffen wir uns einen besseren Einblick in extrem schnelle Prozesse der
Proteinfaltung zu bekommen.
Für die Untersuchung der oxidativen Proteinfaltung ist eine vollständige strukturelle
Charakterisierung des nativen Zustandes und, falls möglich, auch des ungefalteten
Zustandes und Intermediatszuständen von großer Bedeutung. Die Cystein-reichen
Peptide aus der Sequenz des Minicollagens von Hydra und das Hellethionin D,
welches zu den pflanzlichen Abwehrmolekülen der Thionine gehört, sollten daher
durch CD- und NMR-Spektroskopie strukturell untersucht werden. Anschließend
sollten Rückfaltungsexperimente durchgeführt werden.
22
3. Ergebnisse
3.1. Azopeptide
Im Rahmen dieser Arbeit wurden monozyklische und bizyklische AMPB-Peptide
mit Sequenzen aus der Thioredoxin-Reduktase (TRR) und Proteindisulfidisomerase
(PDI) untersucht. In Tabelle 1 sind die verschiedenen Peptide und die jeweiligen
Originalsequenzen aus den Enzymen zusammengestellt.
Tabelle 1. Herkunft und Sequenz der verwendeten Azopeptide
Name Sequenz mit Numerierung Herkunft
bcAMPB Ala1-Cys2-Ala3-Thr4-Cys5-Asp6-Gly7-Phe8-AMPB TRR
Azo-PDI Lys1-Cys2-Gly3-His4-Cys5-Lys6-Lys7-Lys8-AMPB PDI
Azo-[Ser2, Ser5]-PDI Lys1-Ser2-Gly3-His4-Ser5-Lys6-Lys7-Lys8-AMPB PDI
Azo-TRR Lys1-Cys2-Ala3-Thr4-Cys5-Asp6-Lys7-Lys8-AMPB TRR
Azo-NonaTRR Lys1-Cys2-Ala3-Thr4-Cys5-Asp6-Lys7-Lys8-Lys9-AMPB TRR
Originalsequenz Trp35-Cys36-Gly37-His38-Cys39-Lys40-Ala41-Leu42-Ala43 PDI
Originalsequenz Ala134-Cys135-Ala136-Thr137-Cys138-Asp139-Gly140-Phe141-Phe141 TRR
Die Sequenz des bizyklischen (bc) Octapeptids bcAMPB stammt aus der
Thioredoxin-Reduktase. Die Sequenz wurde unverändert übernommen. Das Peptid ist
nicht wasserlöslich. In Abbildung 13 ist die chemische Struktur des bcAMPB Peptids
gezeigt.
Ala-Cys-Ala-Thr-Cys-Asp-Gly-Phe
N N CH2
NHC
O
Abbildung 13: bcAMPB.
Die Sequenz des bizyklischen Octapeptids Azo-PDI stammt aus der
Proteindisulfidisomerase. Nur die Aminosäuren zwischen den beiden Cysteinen
entsprechen noch der Originalsequenz. Um die Wasserlöslichkeit des Peptids zu
23
Ergebnisse
gewährleisten, wurden an den Positionen 1, 5, 6, 7 und 8 Lysine eingesetzt. In
Abbildung 14 ist die chemische Struktur des Azo-PDI Peptids gezeigt.
Lys-Cys-Gly-His-Cys-Lys-Lys-Lys
N N CH2
NHC
O
Abbildung 14: Azo-PDI.
Die Sequenz des monozyklischen Octapeptids Azo-[Ser2, Ser5]-PDI stammt
ebenfalls aus der Proteindisulfidisomerase. Das Azo-[Ser2, Ser5]-PDI Peptid ist das
diSerin-Analogon des Azo-PDI Peptids. In Abbildung 15 ist die chemische Struktur
des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI Peptids gezeigt.
Lys-Ser-Gly-His-Ser-Lys-Lys-Lys
N N CH2
NHC
O
Abbildung 15: Azo-[Ser2, Ser5]-PDI.
Die Sequenz des bizyklischen Nonapeptids Azo-NonaTRR stammt aus der
Thioredoxin-Reduktase. Die Aminosäuren an den Positionen 2 bis 6 entsprechen der
Originalsequenz. Um die Wasserlöslichkeit des Peptids zu gewährleisten, wurden an
den Positionen 1, 7, 8 und 9 Lysine eingeführt. In Abbildung 16 ist die chemische
Struktur des Azo-NonaTRR Peptids gezeigt.
Lys-Cys-Ala-Thr-Cys-Asp Lys-Lys-Lys
N N CH2
NHC
O
Abbildung 16: Azo-NonaTRR.
24
Ergebnisse
3.1.1. bcAMPB
Die Strukturanalyse dieses Peptids wurde zwar bereits veröffentlicht (Renner et al.,
2000), allerdings zeigten sich Unterschiede zwischen der experimentell bestimmten
Struktur und der theoretisch vorhergesagten Struktur (Carstens, 2004). Daher wurden
die bereits aufgenommenen Spektren nochmals ausgewertet bzw. wurden zusätzliche
Spektren am 750 MHz Spektrometer gemessen und ausgewertet. Das monozyklische
Analogon des bcAMPB, als cAMPB bezeichnet, ist in (Renner et al., 2000)
beschrieben.
NMR-Messungen
1D-Spektren
In Abbildung 17 und Abbildung 18 sind die 1H-1D-Spektren des trans- und des cis-
Isomers des bcAMPB gezeigt. Nur die Resonanzen der Amidprotonen und die des
AMPB-Bausteins wurden gekennzeichnet. Beim Vergleich der beiden Spektren fällt
bereits eine Verschiebung der Amidprotonresonanzen zwischen dem trans- und dem
cis-Isomer auf. Besonders deutlich sind die Verschiebungen der Protonen des AMPB-
Bausteins. In beiden Spektren sind jeweils deutlich separierte Resonanzen zu
erkennen. Die direkt gegenüberliegenden Protonen in den Benzolringen sind entartet.
Durch Integration lässt sich leicht feststellen, dass die Signale jeweils zwei Protonen
entsprechen. Dieses Resonanzmuster wurde in allen untersuchten AMPB enthaltenden
Peptiden gefunden und ist charakteristisch für den AMBP-Baustein.
2D-Spektren
Eine detaillierte Auflistung aller Protonresonanzen des trans- und des cis-Isomers
ist in Tabelle 11 und in Tabelle 12 im Anhang A zu finden. Aus den ROESY-Spektren
des trans-Isomers wurden insgesamt 41 Protonenabstände gewonnen. Von diesen 41
Abständen waren acht intraresiduale und 33 interresiduale Abstände. Von den 33
interresidualen Abständen waren 21 sequentielle, vier mittlere und acht Abstände
zwischen Aminosäuren, die mehr als vier Reste in der Sequenz voneinander getrennt
sind. Aus den 1H-1D-Spektren wurden acht 3J Hα-HN-Kopplungen extrahiert und in
Torsionsrandbedingungen umgewandelt.
25
Ergebnisse
Aus den ROESY-Spektren des cis-Isomers wurden insgesamt 28 Protonenabstände
gewonnen. Keiner der Abstände war intraresidual. Von den 28 interresidualen
Abständen waren 20 sequentielle, fünf mittlere und drei Abstände zwischen
Aminosäuren, die mehr als vier Reste in der Sequenz voneinander getrennt sind. Aus
den 1H-1D-Spektren wurden neun 3J Hα-HN-Kopplungen extrahiert und in
Torsionsrandbedingungen umgewandelt.
Abbildung 17: 1H-1D-Spektrum in DMSO bei 295 K des trans-Isomers des bcAMPB. Die Resonanzfrequenzen der Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet.
26
Ergebnisse
Abbildung 18: 1H-1D-Spektrum in DMSO bei 295 K des cis-Isomers des bcAMBP. Die Resonanzfrequenzen der Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet.
Strukturbestimmung
In Abbildung 19 sind die NMR-Strukturfamilien der zehn energieärmsten
Strukturen des cis- und des trans-Isomers von bcAMPB in DMSO gezeigt. Der
strukturbestimmende Einfluss des AMPB-Bausteins im trans- und im cis-Isomer ist
deutlich zusehen. Wie bei ähnlichen Molekülen bereits beobachtet wurde, (Renner et
al., 2000) ist das trans-Isomer deutlich konvergenter als das cis-Isomer. Der RMSD-
Wert des Peptidrückgrats der zehn energieärmsten Strukturen beträgt für das trans-
Isomer 0,60 Å. Verglichen mit der reduzierten und mit StBu Gruppen geschützten
trans-cAMPB Form des Moleküls mit einem Rückgrat RMSD-Wert von 0,68 Å
(Renner et al., 2000) ist das trans-Isomer der bizyklischen Form etwas besser definiert.
Diese Beobachtung ist nicht weiter überraschend, da die geschlossene Disulfidbrücke
das Peptid stärker konformationell einengt. Offensichtlich ist die Turn-ähnliche
Struktur der Reste Cys-Ala-Thr-Cys-Asp hauptsächlich auf die Restriktion durch die
verknüpften Seitenketten von Cys 2 und Cys 5 zurückzuführen. Von den zehn
27
Ergebnisse
energieärmsten Strukturen bilden alle diese Turn-ähnliche Struktur aus. Die
Ausrichtung der Seitenkette des Asp 6 variiert jedoch bereits zwischen einer dem
AMPB-Baustein zugewandten, einer dem Baustein abgewandten und einer parallel zur
Ebene des AMPBs zeigenden Orientierung. Verantwortlich für die Variabilität ist
wahrscheinlich das Gly 7, das einen weiten Bereich der Peptidrückgratwinkel zulässt.
Mit einem RMSD-Wert des Peptidrückgrats von 1,60 Å ist das cis-Isomer ebenfalls
besser definiert als sein reduziertes und mit StBu geschütztes cAMPB Analogon mit
einem RMSD-Wert des Peptidrückgrats von 1,67 Å (Renner et al., 2000). Wie in
Abbildung 19 zu sehen, existieren im cis-Isomer, im Gegensatz zum trans-Isomer,
verschiedene Subkonformationen. Die Turn-ähnliche Struktur der Reste Cys-Ala-Thr-
Cys-Asp ist in allen Konformation durch den Einfluss der Disulfidbrücke zu finden.
Durch den abgewinkelten AMPB-Baustein werden die folgenden Reste allerdings
nicht wie im trans-Isomer in eine ausgestreckte Konformation gezwungen, sondern
können einen relativ großen Konformationsraum einnehmen. Trotzdem überwiegt eine
in Abbildung 19 B mit hellblauen Bändern skizzierter Konformation mit sieben von
zehn Strukturen.
28
Ergebnisse
Abbildung 19: NMR Strukturfamilien der zehn energieärmsten Strukturen des trans- (A) und cis-(B) Isomers des bcAMPB in DMSO. Für die Hauptkonformation wird der Verlauf des Peptidrückgrats durch blaue Bänder verdeutlicht, für eine zweite Konformation sind die Bänder dunkelblau gefärbt. Alle Atome außer Wasserstoff sind in den üblichen Atomfarben dargestellt. Die Disulfidbrücken sind in gelb gekennzeichnet.
29
Ergebnisse
3.1.2. Azo-[Ser2, Ser5]-PDI
Das Azo-[Ser2, Ser5]-PDI diente als Modellsystem für das reduzierte Azo-PDI,
welches in wässriger Lösung instabil ist.
NMR-Messungen
1D-Spektren
In Abbildung 20 und Abbildung 21 sind 1H-1D-Spektren des trans- und des cis-
Isomers des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI gezeigt. Die Resonanzen der Amidprotonen und der
Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet. Die NMR-Spektren des cis-
Isomers wurden bei 288 K aufgenommen, da bei 283 K mehrere Signale im
NH/Aromatenbereich überlagerten. Das Muster der AMPB-Protonenresonanzen ist
ähnlich der des Musters im bcAMPB.
Abbildung 20: 1H-1D-Spektrum in H2O/D2O bei 283 K des trans-Isomers desAzo-[Ser2, Ser5]-PDI. Die Resonanzfrequenzen der Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet.
30
Ergebnisse
Abbildung 21: 1H-1D-Spektrum in H2O/D2O bei 288 K des cis-Isomers des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI. Die Resonanzfrequenzen der Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet.
2D-Spektren
Eine detaillierte Auflistung aller Protonenresonanzen des trans- und des cis-Isomers
ist in Tabelle 13 und in Tabelle 14 im Anhang A zu finden. Aus den ROESY-Spektren
des trans-Isomers wurden insgesamt 42 Protonenabstände gewonnen. Keiner der
Abstände war intraresidual. Von den 42 interresidualen Abständen waren 20
sequentielle, sieben mittlere und 15 Abstände zwischen Aminosäuren, die mehr als
vier Reste in der Sequenz voneinander getrennt sind. Aus den 1H-1D-Spektren wurden
sieben 3J Hα-HN-Kopplungen extrahiert und in Torsionsrandbedingungen
umgewandelt.
Aus den ROESY-Spektren des cis-Isomers wurden insgesamt 49 Protonenabstände
gewonnen. Keiner der Abstände war intraresidual. Von den 49 interresidualen
Abständen waren 25 sequentielle, 15 mittlere und neun Abstände zwischen
Aminosäuren, die in der Sequenz mehr als vier Reste voneinander getrennt sind. Aus
den 1H-1D-Spektren wurden sechs 3J Hα-HN-Kopplungen extrahiert und in
Torsionsrandbedingungen umgewandelt.
31
Ergebnisse
Strukturbestimmung
In Abbildung 22 sind die NMR-Strukturfamilien des trans- und des cis-Isomers
gezeigt. Sowohl das cis- als auch das trans-Isomer sind im Vergleich zum
bizyklischen Azo-PDI, unter 3.1.3 beschrieben, weniger gut definiert. Der RMSD-
Wert des Peptidrückgrats der zehn energieärmsten Strukturen beträgt 1,37 Å für das
trans- und 1,33 Å für das cis-Isomer. Auffällig ist, dass das cis-Isomer einen leicht
geringeren RMSD-Wert hat als das trans-Isomer. Entfällt die zusätzliche
konformationelle Einengung durch die Disulfidbrücke, ist der Einfluss der
unterschiedlichen AMPB-Isomere vermutlich gering. Die Ringgröße ist bereits zu
groß, als dass die unterschiedlichen AMPB-Isomere das Peptid hinreichend
einschränken können. Beide Peptidisomere zeigen eine enge Schleife zwischen den
Resten Lys 1 und His 4. Danach verläuft das trans-Isomer in einer mehr
ausgestreckten Form, wohingegen das cis-Isomer nach der Schleife eine verwundene
Form annimmt. Um einen regulären Turn handelt es sich bei der Schleife allerdings
nicht, da sowohl die Temperaturverschiebung der Amidresonanzen als auch die D2O-
Austauschexperimente keinen Hinweis auf eine Wasserstoffbrücke ergaben.
32
Ergebnisse
Abbildung 22: NMR Strukturfamilien der zehn energieärmsten Strukturen des trans- (A) und cis- (B) Isomers des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI in H2O/D2O. Der Verlauf des Peptidrückgrats wird durch blaue Bänder verdeutlicht. Alle Atome außer Wasserstoff sind in den üblichen Atomfarben dargestellt.
33
Ergebnisse
15N- Relaxationsmessungen
In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der 15N Relaxationsmessungen gezeigt. Die
Korrelationszeit beträgt nur die Hälfte der des DMSO-löslichen cAMPB (Renner et
al., 2000). Dieses Ergebnis stimmt relativ gut mit dem Verhältnis der Viskositäten von
Wasser und DMSO überein.
Tabelle 2: 15N Relaxationsmessungen des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI.
cis und trans T1 840 ms T2 694 ms Tc 0,804 ns Het NOE -0,64
Thermische Isomerisierung
In Tabelle 3 sind die thermischen Isomerisierungsraten des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI
aufgelistet. Die thermischen Isomerisierungsraten und die Aktivierungsenergie sind
vergleichbar mit denen anderer AMPB-Baustein-enthaltender Peptide (Renner et al.,
2002).
Tabelle 3: Geschwindigkeitskonstanten der thermischen cis→trans Isomerisierung des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI in H2O. Die Konstanten bei verschiedenen Temperaturen wurden mit UV-Spektren extrahiert.
Thermische Isomerisierung, kct (h-1) 293 K 303 K EA (kJ×mol-1) Azo-[Ser2, Ser5]-PDI 0,0015 0,0049 87,4
34
Ergebnisse
CD-Spektren
190 200 210 220 230 240 250-18000
-16000
-14000
-12000
-10000
-8000
-6000
-4000
-2000
0
2000
cis trans
[Θ] r [
deg
cm2 dm
ol-1]
λ [nm]
Abbildung 23: CD-Spektrum des trans- und des photostationären cis-Isomers des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI in Wasser (pH 3,8).
In Abbildung 23 sind die CD-Spektren des trans- und des photostationären cis-
Isomers (ca. 80 % cis, 20 % trans) gezeigt. Sowohl das trans- als auch das cis-Isomer
zeigen einen ähnlichen Verlauf des Spektrums mit einem ausgeprägten Minimum bei
196 nm. Dies deutet auf eine ungeordnete Struktur hin, die auch durch die NMR-
Strukturbestimmung bestätigt wurde. Auffällig ist, dass das cis-Isomer ein deutlich
stärker ausgeprägtes Minimum besitzt, obwohl der RSMD Wert des Proteinrückgrats
des cis-Isomers leicht unter dem des trans-Isomers liegt.
3.1.3. Azo-PDI
Das bizyklische Azo-PDI Peptid besitzt das Bis(cysteinyl)motiv der
Proteindisulfidisomerase. Vor dem Motiv sind ein Lysin und nach dem Motiv drei
Lysine eingeführt worden, um die Wasserlöslichkeit des Peptids sicherzustellen.
35
Ergebnisse
NMR-Messungen
1D-Spektren
In Abbildung 24 und in Abbildung 25 sind 1H-1D-Spektren des trans- und des cis-
Isomers des Azo-PDI bei 283 K in Wasser gezeigt. Die Resonanzen der Amidprotonen
und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet. Das Muster der AMPB-
Protonenresonanzen ist ähnlich der des Musters in bcAMPB.
Abbildung 24: 1H-1D-Spektrum in H2O/D2O bei 283 K des trans-Isomers des Azo-PDI. Die Resonanzfrequenzen der Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet.
36
Ergebnisse
Abbildung 25: 1H-1D-Spektrum in H2O/D2O bei 283 K des cis-Isomers des Azo-PDI. Die Resonanzfrequenzen der Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet.
2-D Spektren
Eine detaillierte Auflistung aller Protonenresonanzen des trans- und des cis-Isomers
ist in Tabelle 15 und in Tabelle 16 im Anhang zu finden. Aus den ROESY-Spektren
des trans-Isomers wurden insgesamt 49 Protonenabstände gewonnen. Von diesen
waren drei intraresidual und 46 interresidual. Von den 46 interresidualen Abständen
waren 21 sequentielle, 14 mittlere und elf Abstände zwischen Aminosäuren, die mehr
als vier Reste auseinander lagen. Aus den 1H-1D-Spektren wurden acht 3J Hα-HN-
Kopplungen extrahiert und in Torsionsrandbedingungen umgewandelt.
37
Ergebnisse
Abbildung 26: Amidregion eines TOCSY-Spektrums des trans- und des cis-Isomers des Azo-PDI. Die HN-Hα Signale der jeweiligen Aminosäure und die Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet. Hierbei steht t für das trans- und c für das cis-Isomer.
Aus den ROESY-Spektren des cis-Isomers wurden insgesamt 27 Protonenabstände
gewonnen. Von diesen war ein Abstand intraresidual und 26 Abstände interresidual.
Von den 26 interresidualen Abständen waren 19 sequentielle, fünf mittlere und zwei
Abstände zwischen Aminosäuren, die mehr als vier Reste auseinander lagen. Aus den 1H-1D-Spektren wurden fünf 3J Hα-HN-Kopplungen extrahiert und in
Torsionsrandbedingungen umgewandelt.
Strukturbestimmung
Die NMR-Strukturbestimmung ergab zwei gut definierte, aber unterschiedliche
Strukturfamilien des trans- und des cis-Isomers, welche in Abbildung 27 gezeigt sind.
Im Gegensatz dazu ist das offenkettige Azo-[Ser2, Ser5]-PDI Peptid stärker ungeordnet
38
Ergebnisse
und entspannt. Der RMSD-Wert des Peptidrückgrats der zehn energieärmsten
Strukturen beträgt 0,61 Å für das trans- und 1,09 Å für das cis-Isomer.
Abbildung 27: NMR Strukturfamilien der zehn energieärmsten Strukturen des trans- (A) und cis- (B) Isomers des Azo-PDI in H2O/D2O. Der Verlauf des Peptidrückgrats wird durch blaue Bänder verdeutlicht. Alle Atome außer Wasserstoff sind in den üblichen Atomfarben dargestellt. Die Disulfidbrücken sind in gelb gekennzeichnet.
39
Ergebnisse
Beide Isomere zeigen einen verzerrten β-Turn für das Bis(cysteinyl)motiv, das
durch die Disulfidbrücke in seiner Geometrie stark eingeengt ist. Im cis-Isomer bildet
der hintere Teil des Peptids wiederum einen verzerrten β-Turn, der durch einen
regulären γ-Turn, zentriert auf Lys 6 und um 90° gegenüber der Ebene des ersten β-
Turns verdreht, mit dem ersten β-Turn verbunden ist. Im trans-Isomer besitzt das
Peptidrückgrat eine mehr ausgestreckte Form. Der auf Lys 6 zentrierte γ-Turn ist
stärker verzerrt und die Reste Lys 6, Lys 7 und Lys 8 nehmen eine ausgestreckte β-
Konformation an. Überraschenderweise befindet sich die Seitenkette des Lys 7
zwischen dem Peptidrückgrat und dem Chromophor. Weder in der Strukturfamilie des
cis-Isomers noch in der des trans-Isomers konnten Nebenkonformationen gefunden
werden. In Abbildung 28 sind diese Sekundärstrukturelemente noch einmal
schematisch gezeigt.
Abbildung 28: Schematische Darstellung der Sekundärstrukturelemente des trans- und des cis-Isomers des Azo-PDI. Die Elemente des cis-Isomers sind pink, die des trans-Isomers sind grün gezeichnet.
40
Ergebnisse
CD-Spektren
In Abbildung 29 sind die CD-Spektren des trans- und des photostationären cis-
Isomers gezeigt. Die beiden Isomere zeigen deutlich unterschiedliche Spektren. Das
trans-Isomer besitzt ein Minimum bei 220 nm, welches eine β-Faltblatt ähnliche
Struktur anzeigt. Das cis-Isomer besitzt ein Minimum bei 205 nm mit stark negativen
Werten zwischen 200 und 225 nm. Dieser Verlauf des Spektrums zeigt eine gemischt
α-helikale und β-Faltblatt-ähnliche Struktur an. Insofern bestätigen die CD-Spektren
die einerseits stärker ausgestreckte Konformation des trans-Isomers und die mehr
gewundene Struktur des cis-Isomers.
190 200 210 220 230 240 250-10000
-5000
0
5000
10000
15000
20000
cis trans
[Θ] r [
deg
cm2 dm
ol-1]
λ [nm]
Abbildung 29: CD-Spektrum des trans- (-) und des photostationären cis- (--) Isomers des Azo-PDI in Wasser (pH 3,8).
UV-Spektren
In Abbildung 30 ist das UV-Spektrum des cis- und des trans-Isomers des Azo-PDI
gezeigt. Da alle UV Spektren der wasserlöslichen AMPB-Peptide praktisch identisch
sind (Renner et al., 2002), stehen die Spektren in Abbildung 30 auch stellvertretend für
die der anderen Peptide. Das trans-Isomer zeigt hier ein ausgeprägtes Maximum um
335 nm, wohingegen das cis-Isomer ein schwächeres Maximum um 425 nm besitzt.
41
Ergebnisse
Isosbesten befinden sich bei ca. 280 nm und 395 nm. Die unterschiedliche Lage der
Absorptionsmaxima des trans- und des cis-Isomers erleichterten die Zuordnung in den
HPLC-Elutionsprofilen erheblich.
250 300 350 400 450 5000
5
10
15
20
25
30
cis trans
ε* 1
0-3 [M
-1 c
m-1]
λ [nm]
Abbildung 30: UV-Spektren des trans- (-) und des cis- (--) Isomers des Azo-PDI in Wasser.
Thermische Isomerisierung
In Tabelle 4 sind die thermischen Isomerisierungsraten des Azo-PDI aufgelistet.
Die thermischen Isomerisierungsraten und die Aktivierungsenergie sind vergleichbar
mit denen anderer AMPB-Baustein-enthaltenden Peptide (Renner et al., 2002).
Tabelle 4: Geschwindigkeitskonstanten der thermischen cis→trans Isomerisierung des Azo-PDI in H2O. Die Konstanten bei verschiedenen Temperaturen wurden mit Hilfe von 1H-1D-Spektren bestimmt.
Thermische Isomerisierung, kct (h-1) 283 K 293 K 303 K 313 K EA (kJ×mol-1) Azo-PDI 0,00044 0,0019 0,00672 0,0274 101
42
Ergebnisse
Bestimmung des Redoxpotentials
Wie bereits unter (Cabrele et al., 2002a) für ein zyklisches Azopeptid mit dem
Bis(cysteinyl)motiv der Thioredoxin-Reduktase beschrieben wurde, sollte für das Azo-
PDI der Einfluss der unterschiedlichen Konformationen des trans- und des cis-Isomers
auf das Redoxpotential des Bis(cysteinyl)motivs untersucht werden.
Das komplizierte Netzwerk von Edukten und Produkten der Reaktion mit
GSH/GSSG und dem Azopeptid ist in Abbildung 31 gezeigt. Zusätzlich zu den
oxidierten und reduzierten Spezies 1 und 2 treten die Monoglutathion-Peptid
gemischten Disulfide 3 und 4 sowie die Bisglutathion-Peptid gemischten Disulfide 5
auf. Die HPLC-Signale der trans-Isomere konnten eindeutig mit LC-MS-Analysen den
verschiedenen Spezies zugeordnet werden.
Abbildung 31: Thiol/Disulfidaustauschgleichgewicht des Azo-PDI im Glutathionredoxpuffer. Die Spezies des trans-Isomers befinden sich auf der linken Seite und sind mit einem (’) gekennzeichnet. Die Spezies des cis-Isomers befinden sich auf der rechten Seite.
In Abbildung 32 ist das Chromatogramm mit der Absorption bei 210 nm und der
Zuordnung der Signale zu den Spezies des trans-Isomers aus Abbildung 31 gezeigt.
43
Ergebnisse
Die beiden Monoglutathion-Peptid gemischten Disulfide 3 und 4 konnten nicht
unterschieden werden. Der Versuch wurde insgesamt mit drei unterschiedlichen
GSH/GSSG Konzentrationen durchgeführt: 10 mM GSH, 10 mM GSSG; 5mM GSH,
10 mM GSSG; 10 mM GSH, 3 mM GSSG. Die Peptidkonzentration betrug zwischen
0,1 und 0,3 mM. Die Signale der oxidierten und reduzierten Spezies 1 und 2 wurden
integriert und aus der Gleichgewichtskonstante Kox wurde das Redoxpotential E0
mittels der Nernstschen Gleichung, welche unter Gleichung (3) in 6.2 gegeben ist,
ermittelt. Dabei wurde ein Referenzpotential E’0 = -240 mV (Rost and Rapoport,
1964) verwendet. Die Werte wurden aus drei Experimenten gemittelt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 5 gegeben.
19 20 21 22
0,0
0,1
0,2
2'1'4' + 3'5'
AU b
ei 2
10 n
m
min
Abbildung 32: UV-Spur bei 210 nm eines HPLC-Chromatogramm nach Equilibrierung des trans-Isomers des Azo-PDI mit10 mM GSH und 3 mM GSSG. Gezeigt sind die Spezies des trans-Isomers mit Zuordnung.
Tabelle 5: Gleichgewichtskonstante und Redoxpotential der Thiol/Disulfid-Austauschreaktion des trans-Isomers des Azo-PDI, bestimmt mittels Glutathion. Für Glutathion wurde ein Referenzpotential von –240 mV bei pH 7 und 25 °C verwendet (Rost and Rapoport, 1964).
Isomer Kox [mM] E0’[mV]
trans 3,72 ± 0,08 -0,167
44
Ergebnisse
Die Bestimmung des Redoxpotentials des cis-Isomers wurde durch zwei
Nebenreaktionen erschwert. Zum einen neigt das cis-Isomer stärker zur Reduktion des
Azobenzols durch Glutathion, zum anderen wird durch Gegenwart von GSH/GSSG
die cis→trans Isomerisierung um Größenordnungen beschleunigt. Beide
Nebenreaktionen zusammen verhinderten, dass alle theoretisch vorhandenen Signale
der Spezies aus Abbildung 31 im HPLC-Chromatogramm gefunden und zweifelsfrei
zugeordnet werden konnten.
3.1.4. Azo-NonaTRR
Das zyklische Azopeptid Azo-NonaTRR besitzt das Bis(cysteinyl)motiv der
Thioredoxin-Reduktase.
NMR-Messungen
1D-Spektren
In Abbildung 33 und in Abbildung 34 sind 1H-1D-Spektren des trans- und cis-
Isomers des Azo-PDI Peptids bei 283 K in Wasser gezeigt. Die Resonanzen der
Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins des trans-Isomers sind
gekennzeichnet. Das Muster der AMPB-Protonenresonanzen ist ähnlich dem Muster
des bcAMPB. Die Resonanzen des cis-Isomers sind aufgrund der Signalüberlagerung
nicht zugeordnet.
45
Ergebnisse
Abbildung 33: 1H-1D-Spektrum in H2O/D2O bei 283 K des trans-Isomers des Azo-NonaTRR. Die Resonanzfrequenzen der Amidprotonen und der Protonen des AMPB-Bausteins sind gekennzeichnet.
Abbildung 34: 1H-1D-Spektrum in H2O/D2O bei 283 K des cis-Isomers des Azo-NonaTRR.. Aufgrund der Signalüberlagerung sind die Resonanzzuordnungen nicht gezeigt.
46
Ergebnisse
2-D Spektren
Eine detaillierte Auflistung aller Protonenresonanzen des trans-Isomers ist in
Tabelle 17 im Anhang A zu finden. Aus den ROESY-Spektren des trans-Isomers
wurden insgesamt 66 Protonenabstände gewonnen. Von diesen war keiner
intraresidual. Von den 66 interresidualen Abständen waren 34 sequentielle, 14 mittlere
und 18 Abstände zwischen Aminosäuren, die durch mehr als vier Reste in der Sequenz
voneinander getrennt sind. 3J Hα-HN-Kopplungen wurden nicht extrahiert.
Aus den ROESY-Spektren des cis-Isomers konnten aufgrund der verstärkten
Signalüberlagerung nicht genügend eindeutige strukturbestimmende Protonenabstände
gewonnen werden. Daher wurde die Struktur des cis-Isomers nicht bestimmt.
Strukturbestimmung
In Abbildung 35 ist der Strukturfamilie des trans-Isomers von Azo-NonaTRR
gezeigt. Der RMSD-Wert des Peptidrückgrats der zehn energieärmsten Strukturen des
trans-Isomers beträgt 1,01 Å. Wie bei den anderen bizyklischen Azopeptiden hat die
Disulfidbrücke einen großen Einfluss auf die Konformation des Peptids. Die Position
der Cysteine ist identisch mit denen des Azo-PDI, daher wird auch wie in diesem eine
Schleife zwischen den Resten Cys 2 und Cys 5 ausgebildet. Das Peptid besitzt die
Sequenz des Azo-TRR-Peptids ist aber um ein Lysin am C-Terminus verlängert.
Bedingt durch die größere Ringgröße ist die Struktur weniger stark eingeschränkt und
im Vergleich zum Azo-TRR (Cabrele et al., 2002a) weniger definiert. Der RMSD-
Wert des Proteinrückgrats beträgt 1,13 Å.
47
Ergebnisse
Abbildung 35: NMR Strukturfamilien der zehn energieärmsten Strukturen des trans-Isomers des Azo-NonaTRR in H2O/D2O. Der Verlauf des Peptidrückgrats wird durch blaue Bänder verdeutlicht. Alle Atome außer Wasserstoff sind in den üblichen Atomfarben dargestellt. Die Disulfidbrücken sind in gelb gekennzeichnet.
Thermische Isomerisierung
In Tabelle 6 sind die thermischen Isomerisierungsraten des Azo-NonaTRR
aufgelistet. Die thermischen Isomerisierungsraten sind bei niedriger Temperatur
schneller als die anderer Azopeptide. Dafür ist die Aktivierungsenergie deutlich
niedriger als die bisher bestimmten Werte (Renner et al., 2002).
Tabelle 6: Geschwindigkeitskonstanten der thermischen cis→trans Isomerisierung des Azo-NonaTRR in H2O. Die Konstanten wurden mit Hilfe von 1H-1D-Spektren bei verschiedenen Temperaturen bestimmt.
Thermische Isomerisierung, kct (h-1) 283 K 293 K 303 K EA (kJ×mol-1) Azo-
NonaTRR 0,0036 0,0062 0,0091 33
48
Ergebnisse
Bestimmung des Redoxpotentials
Vorgehen und Auswertung der Experimente erfolgte analog dem Azo-PDI. In
Abbildung 36 ist das Chromatogramm mit der Absorption bei 210 nm und der
Zuordnung der Signale zu den Spezies aus Abbildung 31 gezeigt. Die beiden
Monoglutathion-Peptid gemischten Disulfide 3 und 4 konnten nicht unterschieden
werden. Der Versuch wurde insgesamt mit vier unterschiedlichen GSH/GSSG
Konzentrationen durchgeführt: 94 mM GSH, 32 mM GSSG; 85 mM GSH, 50 mM
GSSG; 70 mM GSH, 29 mM GSSG und 50 mM GSH, 50 mM GSSG. Die
Peptidkonzentration betrug zwischen 0,1 und 0,5 mM. Die Signale der oxidierten und
reduzierten Spezies 1 und 2 wurden integriert und aus der Gleichgewichtskonstante
Kox wurde das Redoxpotential E0 mittels der Nernstschen Gleichung, welche unter
Gleichung (3) in 6.2 gegeben ist, ermittelt. Dabei wurde ein Referenzpotential E’0 = -
240 mV (Rost and Rapoport, 1964) verwendet. Es wurden die Werte aus vier
Experimenten gemittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gegeben. Das
Redoxpotential des trans-Isomers ist mit -218 mV negativer als das des trans-Azo-PDI
(-167 mV) und des trans-Azo-TRR (-201 mV) (Cabrele et al., 2002a).
18 19 20 21 22
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
2'1'4' + 3'5'
AU b
ei 2
10 n
m
min
Abbildung 36: UV-Spur bei 210 nm eines HPLC-Chromatogramm nach Equilibrierung des trans-Isomers des Azo-NonaTRR mit 85 mM GSH und 50 mM GSSG. Gezeigt sind die Spezies des trans-Isomers mit Zuordnung.
49
Ergebnisse
Wie bei dem cis-Isomer des Azo-PDI war es aufgrund beschleunigter
Isomerisierung und Reduktion des Azobenzols nicht möglich, Kox und E0 für das cis-
Isomer zweifelsfrei zu bestimmen.
Tabelle 7: Gleichgewichtskonstante und Redoxpotential der Thiol/Disulfid-Austauschreaktion des trans-Isomers des Azo-NonaTRR bestimmt mittels Glutathion. Für Glutathion wurde ein Referenzpotential von –240 mV bei pH 7 und 25 °C verwendet (Rost and Rapoport, 1964).
Isomer Kox [mM] E0’[mV]
trans 188 ± 10 -0,218
50
Ergebnisse
3.2. Minicollagen
3.2.1. C-terminale Domäne
Die Sequenz der C-terminalen Domäne stammt aus dem Minicollagen 1 von Hydra.
In Abbildung 37 ist die Sequenz der C-terminalen Domäne gezeigt.
Ac-Pro-Cys-Pro-Pro-Val-Cys-Val-Ala-Gln-Cys-Val-Pro-Thr-Cys-Pro-Gln-Tyr-Cys-
Cys-Pro-Ala-Lys-Arg-Lys-NH2
Abbildung 37: Sequenz der C-terminale Domäne des Minicollagens.
Synthese
Die Synthese des Peptids erfolgte an einem continuous flow-Synthesizer auf einem
Fmoc-Rink-Amide Harz nach der Fmoc/tBu Strategie (Pokidysheva et al., 2004).
Oxidative Faltung
Für die oxidativen Faltung wurde das Oxidationssystem GSH/GSSG (Saxena and
Wetlaufer, 1970) verwendet, da durch die Gegenwart von GSH thermodynamisch
ungünstige Disulfidverknüpfungen wieder geöffnet und günstigere Verknüpfungen
gefunden werden können. Unter den experimentellen Bedingungen (4 °C etc.) war die
Reaktion nach ca. fünf bis sieben Tagen abgeschlossen. Die Reaktionsgeschwindigkeit
der Reaktion ist stark pH-abhängig. Dauert die Reaktion bei einem pH-Wert von 6
mehrere Tage, ist sie bei einem pH-Wert von 8 und höher bereits nach wenigen
Stunden abgeschlossen. HPLC, LC-MS und NMR bestätigen, dass neben
„gefangenen“ fehlgefalteten bis-Glutathionylderivaten weitgehend ein einziges
Topoisomer entsteht. Die analytischen HPLC-Chromatogramme des
Reaktionsgemisches zeigen bei ca. 50 % Eluent B ein scharfes und intensives Signal,
welches durch LC-MS-Analyse eindeutig dem vollständig oxidierten Peptid
zugeordnet werden konnte. Ein breites und wesentlich schwächeres Signal, welches
bei ca. 30 % bis 50 % B eluiert, besteht wahrscheinlich aus fehlgefalteten Peptiden und
gemischten Glutathiondisulfiden. Letztere konnte durch LC-MS-Analysen
nachgewiesen werden.
51
Ergebnisse
Überraschenderweise stellte das Lyophilisieren des Reaktionsgemisches den
Ausbeute-limitierenden Schritt da. Wurde das Reaktionsgemisch zu lange, in diesem
Falle über mehrere Tage, im lyophilisierten festen Zustand gelassen, nahm das Signal
des korrekt gefalteten Peptids ab, wohingegen die Signale der fehlgefalteten Peptide in
der analytischen HPLC zunahmen. Offensichtlich findet im festen Zustand des
Reaktionsgemisches eine Umlagerung der Disulfidbrücken statt. Daher wurden bei den
präparativen HPLC-Läufen nicht nur das korrekt gefaltete Peptid, sondern auch die
fehlgefalteten Peptide gesammelt. Wurden die Fraktionen mit fehlgefaltetem Peptid
lyophilisiert und anschließend mit dem Redoxpuffer inkubiert, konnte das korrekt
gefaltete Peptid zurück gewonnen werden. In Abbildung 38 sind die Chromatogramme
vor (links) und nach der Rückfaltung (rechts) der fehlgefalteten Peptide gezeigt. Unter
den Rückfaltungsbedingungen konnten die fehlgefalteten Spezies (A) in die korrekt
gefaltete Spezies (B) überführt werden. Es existiert eine Form des Gleichgewichtes, da
bereits in den eigentlich vollständig fehlgefalteten Fraktionen korrekt gefaltetes Peptid
entstanden ist (B linkes Chromatogramm). Andererseits bleibt ein kleiner Anteil des
fehlgefalteten Peptids auch unter den Rückfaltungsbedingungen bestehen (A rechtes
Chromatogramm). Mit dieser Form des Recyclings konnte die Ausbeute der
oxidativen Faltung merklich verbessert werden.
0 2 4 6 8 10 12-0,10
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
B
A
AU
bei
210
nm
min0 2 4 6 8 10 12
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
A
B
AU b
ei 2
10 n
m
min
Abbildung 38: HPLC der fehlgefalteten Peptide vor (links) und nach Rückfaltung im Redoxpuffer (rechts).
52
Ergebnisse
NMR-Messungen
1D-Spektren
In Abbildung 39 ist das 1H-1D-Spektrum der oxidierten C-terminalen Domäne des
Minicollagens, gemessen am DRX 500 Spektrometer, in H2O/D2O gezeigt. Die
Amidregion ist vergrößert als Insert in der Abbildung gezeigt. Die Signaldispersion
der Amidresonanzen deutet eindeutig auf ein gefaltetes Peptid hin. Die Lage der
Amidresonanzen des oxidierten Peptids diente in den späteren Reduktions- und
Rückfaltungsversuchen als Referenz.
Abbildung 39: 1H-1D-Spektrum der C-terminalen Domäne des Minicollagens in H2O/D2O bei 283 K.
2D-Spektren
Aus den TOCSY- und NOESY-Spektren konnte eine eindeutige
resonanzspezifische Zuordnung getroffen werden. In Abbildung 40 ist die Amidregion
eines TOCSY-Spektrums mit den zugeordneten HN-Hα Signale gezeigt. Die
vollständige Zuordnung aller Protonenresonanzen ist in Tabelle 18 des Anhangs
aufgelistet.
53
Ergebnisse
Abbildung 40: Amidregion eines TOCSY-Spektrums der C-terminalen Domäne bei 283 K. Die HN-Hα Signale der jeweiligen Aminosäure sind gekennzeichnet.
Aus den NOESY-Spektren wurden insgesamt 173 Protonenabstände gewonnen.
Von diesen 173 waren 30 intraresiduale und 143 interresiduale Abstände. Von den 143
interresidualen Abständen waren 76 sequentielle, 51 mittlere und 76 Abstände
zwischen Aminosäuren, die in der Sequenz durch mehr als 4 Reste voneinander
getrennt sind. In Abbildung 41 sind die NOE-Kontakte der einzelnen Aminosäurereste
gezeigt. Zusätzlich konnten fünf Wasserstoffbrücken durch D2O Austausch- und
Temperaturverschiebungs-Experimente gefunden werden. In Abbildung 42 sind die
diagnostischen NOE-Kontakte und die H/D Austauschraten mit den zugehörigen
Sekundärstrukturelementen dargestellt.
54
Ergebnisse
NOE-Kontakte der Aminosäuren
0
5
10
15
20
25
30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Aminosäure
Anz
ahl d
er N
OEs
Intra.Seq.Rest
Abbildung 41: Anzahl der ermittelten NOEs der einzelnen Aminosäurereste. Intraresiduale Kontakte sind in weißer, sequentielle Kontakte in hellgrauer und die übrigen Kontakte in dunkelgrauer Farbe dargestellt.
Abbildung 42: Sekundärstrukturdarstellung der C-terminalen Domäne. Die diagnostischen NOE Kontakte und die H/D Austauschraten (KNH) sind hier zusammengestellt. Die gefundenen Sekundärstrukturelemente sind über der Sequenz dargestellt. Helices sind als Röhren, gestreckte Bereiche als Pfeil und Turns als Bögen dargestellt. Langsame Austauschraten sind als großer Kreis, mittelschnelle als kleiner Kreis dargestellt.
Strukturbestimmung
Die Struktur der C-terminalen Domäne wurde unabhängig von der Arbeitsgruppe
von Stephan Grzesiek (Meier et al., 2004) und von uns bestimmt. Beide Strukturen
stimmen überein. In Abbildung 43 ist die Strukturfamilie der zehn energieärmsten 55
Ergebnisse
Strukturen gezeigt. In Abbildung 44 sind die Sekundärstrukturelemente anhand einer
Struktur aus der Familie hervorgehoben.
Abbildung 43: Die zehn energieärmsten Strukturen der C-terminalen Domäne des Minicollagens in Wasser. Wasserstoffatome sind nicht gezeigt. Die übrigen Atome sind in den üblichen Atomfarben dargestellt. Die Disulfidbrücken sind in gelb gekennzeichnet.
Abbildung 44: Darstellung der Sekundärstrukturelemente der C-terminalen Domäne. Die α-Helix und die drei Turns sind durch breite Bänder hervorgehoben. Die Abbildung wurde mit Hilfe des Programms Molmol (Koradi et al., 1996) erstellt.
56
Ergebnisse
Die C-terminale Domäne besitzt insgesamt eine kompakte Form und weist eine
Reihe von Sekundärstrukturelementen auf. Der N-Terminus bis Val 5 zeigt eine
ausgestreckte Konformation. Es folgt eine kurze α-Helix zwischen Val 5 und Gln 9.
Die Reste Gln 9 und Val 11 bilden einen inversen γ -Turn mit einer Wasserstoffbrücke
zwischen dem Amidproton von Val 11 und dem Carbonylsauerstoff von Gln 9. Darauf
folgt ein Typ I β-Turn, der von den Resten Val 11 bis Cys 14 ausgebildet wird. Der
Typ I β-Turn wird durch eine Wasserstoffbrücke zwischen dem Amidproton von Cys
14 und dem Carbonylsauerstoff von Val 11 stabilisiert. Ein Typ III β-Turn wird als
letztes Sekundärstrukturelement von Pro 15 bis Cys 18 ausgebildet. Dieser wird
ebenfalls durch eine Wasserstoffbrücke zwischen dem Amidproton von Cys 18 und
dem Carbonylsauerstoff von Pro 15 stabilisiert. Der C-Terminus bildet eine
ausgestreckte variable Konformation. Hier befinden sich alle drei positiv geladenen
Aminosäuren des Peptids.
Die Energien und RMSD-Werte der C-terminalen Domäne sind in Tabelle 8
aufgelistet.
Tabelle 8: Energien und RMSD-Werte der Strukturfamilie der C-terminalen Domäne.
RMSDs der Rest 1 bis 19 RMSD Proteinrückgrat 0,70 RMSD schwere Atome 0,99 RMSD alle Atome 1,17
Energien (CVFF Kraftfeld) kJ mol-1 ± Standardabweichung Gesamtenergie 1321,44 ± 28,44 Van der Waals Energie 514,92 ± 40,64 Coulombenergie 19,08 ± 0,96 Bindungsenergie 201,28 ± 3,71 Thetaenergie 580,46 ± 25,71 “Out of plane“ Energie 5,49 ± 0,85
Die RMSD-Werte wurden nur für die Reste 1 bis 19 berechnet, da der C-Terminus
variabel ist und die Werte verzerren würde. Die RMSD-Werte der einzelnen
Aminosäurereste sind in Abbildung 45 individuell aufgezeigt. Die RMSD-Werte des
variablen C-Terminus sind aufgrund der variablen Struktur deutlich im Vergleich zum
Rest des Peptids erhöht.
57
Ergebnisse
RMSD der Aminosäurenreste
0
2
4
6
8
10
12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Aminosäure
RMSD
RückgratSeitenketten
Abbildung 45: RMSD-Werte der einzelnen Aminosäurereste. Die RMSD-Werte des Rückgrats sind schwarz, die der Seitenketten weiß dargestellt.
In Abbildung 46 ist ein Ramachandrandiagramm der Strukturfamilie gezeigt, in
dem die Aminosäuren entsprechend ihres Ψ und Φ-Winkels aufgetragen sind.
Lediglich die Aminosäuren des variablen C-Terminus liegen außerhalb der
bevorzugten Regionen.
58
Ergebnisse
Abbildung 46: Ramachandrandiagramm der Strukturfamilie der C-terminalen Domäne. Das Diagramm wurde mit Hilfe des Programms Procheck (Laskowski et al., 1996) erstellt.
59
Aus den Strukturrechnungen ergab sich eine eindeutige Disulfidverknüpfung der
sechs Cysteine: Cys 2-Cys 18, Cys 6-Cys 14 und Cys 10-Cys 19. Diese
Disulfidverknüpfung ist in Abbildung 47 schematisch gezeigt. Versuche, die
Disulfidverknüpfung durch enzymatischen Verdau mit anschließender LC-MS-
Analyse zu bestimmen, waren nicht erfolgreich. Aufgrund der äußerst kompakten und
stabilen Struktur des Peptids war das Peptid für eine proteolytische Spaltung nicht
zugänglich.
Ergebnisse
1 5 10 15 20 24P C P P V C V A Q C V P T C P Q Y C C P A K R K
Abbildung 47: Sequenz der C-terminalen Domäne mit der bestimmten Disulfidverknüpfung.
Die gefundene Disulfidverknüpfung entspricht einem von zwei vorgeschlagenen
Verknüpfungsmustern (Engel et al., 2002). Die erste Disulfidbrücke, Cys 2-Cys 18
klammert den N- und C-Terminus zusammen. Die zweite Disulfidbrücke Cys 6-Cys
14 verbindet die kurze α-Helix mit dem Typ I β-Turn zwischen Val 11 und Cys 14,
und formt so den Kern des Peptids. Die dritte Disulfidbrücke Cys 10-Cys 19 ist im
Vergleich zu den anderen beiden stärker dem Lösungsmittel ausgesetzt und zwingt
dem Peptid zwei aufeinander folgende Turns auf.
CD-Spektren
Die CD-Spektren bestätigen und ergänzen das Modell des Peptids. In Abbildung 48
ist ein CD-Spektrum einer 150 µM wässrigen Lösung der C-terminalen Domäne bei
pH 3,8 gezeigt. Dominiert wird das Spektrum durch ein ausgeprägtes Minimum bei
200 nm. Hierfür sind die variablen Bereiche des N- und vor allem des C-Terminus
verantwortlich. Der Verlauf des Spektrums zwischen 215 und 240 nm weist auf α-
helikale und Turn enthaltende Elemente hin. Dieses Resultat stimmt mit den aus den
NMR-Daten berechneten Strukturen überein.
60
Ergebnisse
190 200 210 220 230 240 250-16000
-14000
-12000
-10000
-8000
-6000
-4000
-2000
0
[Θ] [
deg
cm2 d
mol
-1]
λ [nm]
Abbildung 48: CD Spektrum der C-terminalen Domäne in H2O bei 10 °C.
Strukturelle Funktion und Stabilität der Disulfidbrücken
Mit Hilfe einer partiellen Reduktion und anschließender Vinylpyridin-
Derivatisierung des Peptids sollten präferentiell labile Disulfidbrücken bestimmt
werden. Eine Reduktion aller Disulfidbrücken führt zur vollständigen Entfaltung des
Peptids. In Abbildung 49 ist das 1H-1D-Spektrum der C-terminalen Domäne nach
Reduktion mit 5 Äquivalenten Phosphin gezeigt. Die für die definierte Faltung
charakteristische Dispersion der Amidprotonensignale ist im Vergleich zu den
Spektren des oxidierten Peptids verschwunden. Stattdessen überlagern die
Amidprotonensignale stark und zeigen damit einen charakteristischen ungefalteten
Zustand an.
In einem zweiten Versuch wurde, um eine komplette Entfaltung des Peptids zu
vermeiden, nur ein Äquivalent Phosphin verwendet. Die nachfolgende Behandlung mit
Vinylpyridin derivatisierte alle freien Thiolgruppen und erleichterte die Identifizierung
von Reaktionsprodukten sowohl durch die charakteristisch größere Masse von
reduzierten und teilreduzierten Spezies als auch durch eine deutliche Verschiebung der
Resonanzen der Cystein β-Protonen. In Abbildung 50 ist das 1H-1D-Spektrum der
partiell reduzierten derivatisierten C-terminalen Domäne gezeigt. Das dazugehörige
61
Ergebnisse
HPLC-Chromatogramm ist in Abbildung 52 gezeigt. Das 1H-1D-Spektrum in
Abbildung 50 und das zugehörige TOCSY-Spektrum kann in zwei Signalsätze zerlegt
werden. Subtrahiert man vom 1H-1D-Spektrum in Abbildung 50 das 1H-1D-Spektrum
des oxidierten und gefalteten Peptids (Abbildung 39), erhält man in Abbildung 51 das
Differenzspektrum. Vergleicht man das Differenzspektrum aus Abbildung 51 mit dem
Spektrum der vollständig reduzierten Spezies in Abbildung 49, zeigt sich, dass beide
Spektren praktisch identisch sind. Das Differenzspektrum gehört damit zur vollständig
reduzierten und ungefalteten Spezies. Die β-Protonen der gefalteten Spezies weisen
keine Resonanzverschiebungen im TOCSY-Spektrum auf. Somit ist die Spezies noch
vollständig oxidiert. Ein weiterer gefalteter Signalsatz existiert nicht, was darauf
schließen lässt, dass das Peptid nur in der vollständig oxidierten Form gefaltet ist.
Durch LC-MS-Analyse konnte gezeigt werden, dass die entfaltete Spezies aus
unterschiedlich reduzierten Molekülen besteht. In Abbildung 52 ist das HPLC-
Chromatogramm und die entsprechende Zuordnung des LC-MS-Laufes gezeigt.
Zusammenfassend lässt sich feststellen: Nur die komplett oxidierte Spezies ist
gefaltet, da sich in Abbildung 50 kein weiterer gefalteter Signalsatz finden lässt. Aus
dem zugehörigem TOCSY-Spektrum kann ausgeschlossen werden, dass der gefaltete
Signalsatz mit Vinylpyridin derivatisiert wurde. Folglich wurde die gefaltete Spezies
auch nicht teilreduziert. Aus den LC-MS-Analysen und dem HPLC-Chromatogramm
ist zu sehen, dass verschiedene teilreduzierte und die vollständig reduzierte Spezies
gebildet worden sind und mit Vinylpyridin derivatisiert wurden. Da aber kein weiterer
gefalteter Signalsatz in den NMR-Spektren existiert, müssen die vollständig
reduzierte, aber auch die teilreduzierten Spezies ungefaltet sein.
Daraus ergibt sich die Schlussfolgerung, dass bereits das reduktive Öffnen einer
Disulfidbrücke zur Entfaltung des gesamten Peptids führt. Die LC-MS-Analyse zeigte,
dass alle teilreduzierten Spezies etwa in gleichen Verhältnissen gebildet werden. Keine
der Disulfidbrücken scheint daher präferentiell labil zu sein. Andernfalls hätten alle
Moleküle teilreduziert werden müssen, da ein Äquivalent Phosphin eingesetzt wurde.
62
Ergebnisse
Abbildung 49: 1H-1D-Spektrum der reduzierten C-terminalen Domäne.
Abbildung 50: 1H-1D-Spektrum der mit einem Äquivalent Phosphin partiell reduzierten C-terminalen Domäne.
63
Ergebnisse
Abbildung 51: Differenzspektrum der teilreduzierten Spezies aus Abbildung 50 und der oxidierten und vollständig gefalteten Spezies aus Abbildung 39.
0 10 20 30 4-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0
ungefaltete Spezies
6x VP
4x VP2x + 4x VP
2 X VP
Oxidierte Spezies
AU
bei
210
nm
min
Abbildung 52: HPLC-Elutionsprofil der C-terminalen Domäne nach Teilreduktion und Vinylpyridin-Derivatisierung. Die Zuordnung der Signale erfolgte mittels LC-MS.
3.2.2. N-terminale Domäne
Die Sequenz der N-terminalen Domäne stammt aus dem Minicollagen 1 von Hydra.
In Abbildung 53 ist die Sequenz der N-terminalen Domäne gezeigt. N- und C- 64
Ergebnisse
Terminus wurden acetyliert bzw. amidiert, um eine fortlaufende Peptidkette
nachzuahmen.
Ac-Pro-Cys-Ser-Tyr-Cys-Pro-Ser-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Cys-Ala-Pro-Val-Cys-Cys-
Tyr-Pro-NH2.
Abbildung 53: Sequenz der N-terminale Domäne des Minicollagens.
Synthese
Die Synthese des Peptids erfolgte an einem continuous flow-Synthesizer auf einem
Fmoc-Rink-Amide Harz nach der Fmoc/tBu Strategie.
Oxidative Faltung und Reinigung
Das anfänglich verwendete Oxidationssystem GSH/GSSG erwies sich als wenig
geeignet, da sich zeigte, dass die N-terminale Domäne stärker zu Aggregation neigt
und die Ausbeuten an löslichem Produkt gering waren. Im Gegensatz zu der C-
terminalen Domäne besitzt die N-terminale Domäne keine Ladungen. Eine Oxidation
in DMSO ergab ebenfalls keine akzeptablen Ausbeuten. Daher wurde ein
Cystein/Cystin-Oxidationssytem in 2 M Guadinium HCl verwendet. Im Gegensatz
zum GSH/GSSG System wurden weniger Aggregationsprodukte gebildet, die
Ausbeute an löslichem Produkt somit entsprechend höher. HPLC, LC-MS und NMR
bestätigten, dass weitgehend ein einziges Topoisomer entsteht. Der Vergleich von 1H-
1D-Spektren der löslichen Produkte der GSH/GSSG und der Cystein/Cystin Oxidation
zeigte, dass die Faltung beider Produkte identisch ist.
NMR-Messungen
1D-Spektren
In Abbildung 54 ist ein 1H-1D-Spektrum der N-terminalen Domäne gezeigt.
Aufgrund der Signaldispersion der Amidprotonresonanzen kann von einem gefalteten
Peptid ausgegangen werden.
65
Ergebnisse
Abbildung 54: 1H-1D-Spektrum der N-terminalen Domäne des Minicollagens bei 283 K in H2O/D2O.
2D-Spektren
Aus den TOCSY- und NOESY-Spektren konnte eine eindeutige
resonanzspezifische Zuordnung getroffen werden. In Abbildung 55 ist die Amidregion
eines TOCSY-Spektrums gezeigt. Die zugeordneten HN-Hα Signale sind
gekennzeichnet. Die vollständige Zuordnung ist in Tabelle 19 des Anhangs A
aufgelistet.
Aus den NOESY-Spektren wurden insgesamt 118 Protonenabstände gewonnen.
Von diesen waren vier intraresiduale und 114 interresiduale Abstände. Von den 114
interresidualen Abständen waren 60 sequentielle, 36 mittlere und 18 Abstände
zwischen Aminosäuren, die in der Sequenz durch mehr als vier Reste voneinander
getrennt sind. In Abbildung 56 sind die NOE-Kontakte der einzelnen Aminosäurereste
gezeigt. Aus den D2O-Spektren und den Temperaturverschiebungen der
Amidresonanzen konnten keine eindeutigen Wasserstoffbrücken identifiziert werden.
In Abbildung 57 sind die diagnostischen NOE-Kontakte und die H/D Austauschraten
mit den zugehörigen Sekundärstrukturelementen dargestellt.
66
Ergebnisse
Abbildung 55: Amidregion eines TOCSY-Spektrums der N-terminalen Domäne. Die HN-Hα Signale der jeweiligen Aminosäure sind gekennzeichnet.
NOE-Kontakte der Aminosäuren
02468
101214161820
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Aminosäure
Anz
ahl d
er N
OEs
Intra.Seq.Rest
Abbildung 56: Anzahl der ermittelten NOEs der einzelnen Aminosäurereste. Intraresiduale Kontakte sind in weißer, sequentielle Kontakte in hellgrauer und die übrigen Kontakte in dunkelgrauer Farbe dargestellt.
67
Ergebnisse
Abbildung 57: Sekundärstrukturdarstellung der N-terminalen Domäne. Die diagnostischen NOE Kontakte und die H/D Austauschraten(KNH) sind hier zusammengestellt. Die gefundenen Sekundärstrukturelemente sind über der Sequenz dargestellt. Helices sind als Röhren, gestreckte Bereiche als Pfeil und Turns als Bögen dargestellt.
68
Ergebnisse
Strukturbestimmung
In der Abbildung 58 ist die Strukturfamilie der N-terminalen Domäne gezeigt. Die
Sekundärstrukturelemente sind in Abbildung 59 anhand einer Struktur dargestellt.
Abbildung 58: Die zehn energieärmsten Strukturen der N-terminalen Domäne des Minicollagens in Wasser. Wasserstoffatome sind nicht gezeigt. Die übrigen Atome sind in den üblichen Atomfarben dargestellt. Die Disulfidbrücken sind in gelb gekennzeichnet.
Abbildung 59: Darstellung der Sekundärstrukturelemente der N-terminalen Domäne. Neben dem kurzen helikalen Bereich sind auch die drei verschiedenen Turns und die Disulfidbrücken hervorgehoben. Die Abbildung wurde mit Hilfe des Programms Molmol (Koradi et al., 1996) erstellt.
69
Ergebnisse
Im Gegensatz zur C-terminalen Domäne ist das Peptid weniger kompakt gefaltet
und zeigt eine mehr gestreckte Form. Die ersten Reste besitzen eine ausgestreckte
Konformation wie in der C-terminalen Domäne, allerdings zieht sich dieser Bereich
bis zum Rest 7 hin. Darauf folgt ein Typ II β-Turn zwischen Pro 7 und Cys 10. Die
Reste Cys 10 bis Ala 13 bilden einen offenen Typ IV β-Turn. Die Voraussetzung für
diesen Turn ist eine cis-Peptidbindung zwischen Ala 11 und Pro 12. Ein irregulärer γ-
Turn zwischen Ala 13 und Ala 15 bewirkt einen Knick am Cys 14. Die letzten Reste
formen einen α-helikalen Turn zwischen den Resten Cys 18 und Tyr 21, der von
einem 310 Helix-Turn zwischen den Resten Pro 16 und Cys 18 gedeckelt wird.
In Tabelle 9 sind die Energien und RMSD-Werte der Strukturfamilie aufgelistet.
Der RMSD-Wert des Peptidrückgrats beträgt 0,81 Å. Die RMSD-Werte der einzelnen
Aminosäurereste sind in Abbildung 60 individuell gezeigt. In Abbildung 61 ist ein
Ramachandrandiagramm der Strukturfamilie gezeigt, in dem die Aminosäuren
entsprechend ihres Ψ- und Φ-Winkels aufgetragen sind. Die Ψ und Φ-Winkel aller
Aminosäuren liegen in den erlaubten Bereichen.
Tabelle 9: Energien und RMSD-Werte der Strukturfamilie der N-terminalen Domäne.
RMSDs RMSD Proteinrückgrat 0,81 RMSD schwere Atome 0,99 RMSD alle Atome 1,19
Energien (CVFF Kraftfeld) kJ mol-1 ± Standardabweichung Gesamtenergie 1231,78 ± 19,73 Van der Waals Energie 585,01 ± 16,07 Coulombenergie 12,43 ± 0,23 Bindungsenergie 207,34 ± 6,01 Thetaenergie 419,79 ± 23,09 “Out of plane“ Energie 7,47 ± 1,11
70
Ergebnisse
RMSD der Aminosäurenreste
00,5
11,5
22,5
33,5
4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Aminosäure
RM
SD
RückgratSeitenketten
Abbildung 60: RMSD-Werte der einzelnen Aminosäurereste. Die RMSD-Werte des Rückgrats sind schwarz, die der Seitenketten weiß dargestellt.
71
Ergebnisse
Abbildung 61: Ramachandrandiagramm der Strukturfamilie der N-terminalen Domäne. Das Diagramm wurde mit Hilfe des Programms Procheck (Laskowski et al., 1996) erstellt.
Aus den Strukturrechnungen ergab sich überraschend ein anderes Muster der
Disulfidverknüpfungen als in der C-terminalen Domäne, obwohl die Positionen der
Cysteine in beiden Peptiden identisch sind: Cys 2-Cys 14, Cys 6- Cys, 19 und Cys 10-
Cys 18. Die Disulfidverknüpfung ist in Abbildung 62 schematisch gezeigt.
72
Ergebnisse
1 5 10 15 20 21P C G S Y C P S V C A P A C A P V C C Y P
Abbildung 62: Sequenz der N-terminalen Domäne mit der gefundenen Disulfidverknüpfung.
Die erste Disulfidbrücke verknüpft den N-Terminus mit dem Knick an Position Cys
14. Der C-Terminus ist über die zweite Cysteinbrücke mit dem Typ II β-Turn
verbunden und bewahrt so den Zusammenhalt der Struktur. Die dritte Disulfidbrücke
verbindet den offenen Typ IV β-Turn mit dem α-helikalen Turn. Da im Gegensatz zur
C-terminalen Domäne die Struktur der N-terminalen Domäne keinen wirklichen Kern
besitzt, sind alle drei Disulfidbrücken lösungsmittelexponiert. Verantwortlich für die
abweichende Disulfidverknüpfung und Struktur ist wahrscheinlich die cis-
Peptidbindung zwischen Ala 11 und Pro 12, die eine Disulfidverknüpfung wie in der
C-terminalen Domäne verbietet.
CD-Spektren
In Abbildung 63 (links) ist das CD-Spektrum einer 171 µM wässrigen Lösung der
C-terminalen Domäne bei pH 5,4 gezeigt. In seinem Verlauf ähnelt es qualitativ dem
CD-Spektrum der C-terminalen Domäne in Abbildung 48. In Abbildung 63 (rechts)
sind die normierten CD-Spektren der N- und C-terminalen Domäne überlagert. Es fällt
auf, dass sich die Spektren im Bereich 190-200 nm und 215-245 nm unterscheiden. Im
Bereich 190–200 nm verläuft das Spektrum der C-terminalen Domäne unterhalb des
Spektrums der N-terminalen Domäne. Daraus lässt sich ableiten, dass die C-terminale
Domäne einen größeren „random coil“-Anteil als die N-terminale Domäne besitzt. In
den NMR-Strukturen sind die letzten Aminosäuren der C-terminalen Domäne
ungeordnet. Die N-terminale Domäne ist jedoch am C-Terminus verkürzt und besitzt
keine ungeordnete Konformation am C-Terminus. Im Bereich 215 – 240 nm verläuft
das Spektrum der C-terminalen Domäne ebenfalls unterhalb des Spektrums der N-
terminalen Domäne. Dieses Ergebnis sagt aus, dass die C-terminale Domäne mehr α-
Helices oder β-Faltblätter als die N-terminale Domäne besitzt. Auch ist das Resultat
mit den NMR-Strukturen konsistent, in denen die C-terminale Domäne eine α-Helix
73
Ergebnisse
und mehrere reguläre Turns besitzt. Die N-terminale Domäne hingegen hat nur einen
regulären Typ II β-Turn und besitzt keine Helices oder Faltblätter.
190 200 210 220 230 240 250
-28000
-24000
-20000
-16000
-12000
-8000
-4000
0
[Θ] [
deg
cm2 d
mol
-1]
λ[nm]
190 200 210 220 230 240 250
N- terminale Domäne C-terminale Domäne
λ[nm]
Abbildung 63: CD Spektrum der N-terminalen Domäne in H2O bei 10 °C (links). Rechts sind die normierten CD-Spektren der N- und C-terminalen Domäne übergelagert gezeigt.
3.2.3. N-terminale Domäne mit Propeptid
Mit Hilfe der um die Propeptidsequenz verlängerten N-terminalen Domäne sollte
untersucht werden, in wieweit die Anwesenheit des Propeptids die Faltung des
gesamten Peptids beeinflusst. Insbesondere wurde untersucht, ob die Strukturen
identisch sind.
Synthese
Die Synthese des Peptids erfolgte an einem continuous flow Synthesizer auf einem
Fmoc-Rink-Amide Harz nach der Fmoc/tBu Strategie.
Oxidative Faltung
Die N-terminale Domäne mit Propeptid wurde mit dem Cystein/Cystin System
oxidativ gefaltet. Durch die Gegenwart von mehreren geladenen Resten im Propeptid
neigt die N-terminale Domäne mit Propeptid weniger zu Aggregation als die N-
terminale Domäne, und die Oxidation ergab bessere Ausbeuten.
74
Ergebnisse
NMR-Messungen
1D-Spektren
In Abbildung 64 ist das 1H-1D-Spektrum der N-terminalen Domäne mit Propeptid
gezeigt.
Abbildung 64: 1H-1D-Spektrum der N-terminalen Domäne mit Propeptid des Minicollagens in H2O/D2O.
2D-Spektren
In Abbildung 65 ist eine Überlagerung von einem NOESY-Spektrum der N-
terminalen Domäne auf ein NOESY-Spektrum der N-terminalen Domäne mit
Propeptid gezeigt. Eine detaillierte Auswertung zeigt, dass zwar die
Protonenresonanzen, insbesondere der ersten Sequenzreste, leicht verschoben sind,
jedoch die NOE-Kontakte sowohl in ihrer Intensität als auch in ihrem Muster identisch
sind. Die Resonanzen der C-terminalen Amidprotonen sind praktisch identisch, was
zur Überlagerung der Signale führt. Daher besitzt die N-terminale Domäne mit und
ohne Propeptidsequenz dieselbe Struktur. Das Propeptid hat daher keinen Einfluss auf
das Faltungsprodukt selbst, erhöht aber zumindest in vitro die Ausbeuten, da weniger
fehlgefaltete Aggregationsprodukte entstehen. 75
Ergebnisse
Abbildung 65: Überlagerung eines NOESY-Spektrums der N-terminalen Domäne mit Propeptid (rote Signale) mit einem NOESY-Spektrum der N-terminalen Domäne (blaue Signale).
1 5 10 15 20 21
K T L H E M L K R D A N P C G S Y C P S V C A P A C A P V C C Y P
Abbildung 66: Sequenz der N-terminalen Domäne mit Propeptid mit Cysteinverknüpfung. Die zusätzlichen Aminosäuren sind rot unterlegt.
Da die Faltung der N-terminalen Domäne mit und ohne Propeptid identisch ist, ist
auch das Muster der Disulfidverknüpfung identisch. Die sich ergebende
Disulfidverknüpfung ist in Abbildung 66 gezeigt. Da keine NOE-Kontakte zwischen
Aminosäuren der N-terminalen Domäne und dem Propeptid gefunden wurden und die
Resonanzen der Amidprotonen des Propeptids nur eine kleine Dispersion zeigen, ist
davon auszugehen, dass das Propeptid selbst nicht strukturiert ist.
76
Ergebnisse
Tryptischer Verdau der N-terminalen Domäne mit Propeptid
Durch einen tryptischen Verdau der oxidierten N-terminalen Domäne mit Propeptid
sollte festgestellt werden, ob das entstehende Spaltprodukt ebenfalls dieselbe
Konformation annimmt wie die N-terminale Domäne. Anhand der Sequenz (siehe
Abbildung 66) werden nach einem tryptischen Verdau vier Spaltprodukte erwartet: die
beiden einzelnen Aminosäuren Lysin und Arginin, ein sieben-Reste langes Fragment
des Propeptids und die N-terminale Domäne mit Asp -3, Ala -2 und Asn -1. Die
beiden größeren Peptide konnten klar in der LC-MS-Analyse nachgewiesen werden.
Aufgrund ihrer sehr kleinen Retentionszeit wurden die beiden einzelnen Aminosäuren
nicht detektiert. Der problemlose Verdau des nativen Peptids deutet weiterhin darauf
hin, dass das Propeptid und der N-Terminus nicht gefaltet sind.
In Abbildung 67 ist das 1H-1D-Spektrum des gesamten Verdaus gezeigt. Ein
Vergleich mit dem 1H-1D-Spektrum der N-terminalen Domäne in Abbildung 54 zeigt,
dass alle Amidprotonenresonanzen der N-terminalen Domäne im Spektrum wieder
gefunden werden. Eine Überlagerung der entsprechenden TOCSY-Spektren bestätigt
dieses Ergebnis (Daten nicht gezeigt).
77
Ergebnisse
Abbildung 67: 1H-1D-Spektrum des tryptischen Verdaus der N-terminalen Domäne mit Propeptid.
3.2.4. Modell des gesamten trimeren Minicollagen 1
Minicollagen 1 kommt unter physiologischen Bedingungen wahrscheinlich als
nicht-kovalent gebundenes Trimer vor. In früher vorgeschlagenen Modellen ging man
von einer linearen Struktur der N- und C-terminalen Domäne aus (Engel et al., 2002).
Nachdem nun in der vorliegenden Arbeit die Strukturen der N- als auch der C-
terminalen Domäne bestimmt wurden, kann man das in Abbildung 68 gezeigte Modell
vorschlagen. Hierbei wurden die aus der Sequenz bekannten Domänen der
tripelhelikalen Repeats und der Polyprolinbereiche als Collagentripelhelix und als
Poly-Pro-II Helices (Bateman et al., 2004) modelliert. Die Struktur der einzelnen
Domänen kann als relativ wahrscheinlich angenommen werden. Spekulativ sind aber
die Winkel, die die einzelnen Domänen zueinander einnehmen.
78
Ergebnisse
Abbildung 68: Modell des gesamten trimeren Minicollagenmoleküls. Die N- und die C-terminale Domäne sind rot, die Poly-Pro-II Bereiche grau und die tripelhelikale Domäne grün gezeichnet.
79
Ergebnisse
3.3. Thionine
3.3.1. Hellethionin D
NMR-Messungen
Die NMR-Messungen und die Strukturbestimmung wurden bereits in meiner
Diplomarbeit durchgeführt (Milbradt, 2001). Dort sind die Ergebnisse der Messung
und der Strukturrechnung ausführlich beschrieben. In Abbildung 69 ist ein 1H-1D-
Spektrum des Hellethionin D gezeigt. Charakteristisch für die korrekte Faltung sind
die stark Hochfeld-verschobenen Signale des Val 35 bei 0,3 ppm und des Ile 33 bei 0,2
ppm.
Abbildung 69: 1H-1D-Spektrum des Hellethionin D in H2O/D2O.
Strukturbestimmung
Die Sequenz mit den gefundenen Disulfidverknüpfungen und weitere verwandte
Thionine sind in Abbildung 70 aufgeführt. Die Strukturfamilie ist in Abbildung 71
gezeigt. Die Sekundärstrukturelemente und wichtige funktionelle Aminosäuren sind in
Abbildung 72 dargestellt. Die Struktur wurde bei der PDB unter der Zugangsnummer
80
Ergebnisse
1NBL abgelegt. Hellethionin D besitzt eine typische Thioninfaltung, die dem
griechischem Γ ähnelt. Hierbei bilden die vertikalen Bestandteile zwei kurze
antiparallele α-Helices, und die horizontalen Bestandteile ein zweisträngiges
antiparalleles β-Faltblatt (Milbradt et al., 2003). Eine Überlagerung (Milbradt et al.,
2003) mit den Homologen Viscotoxin A3 (PDB 1EDO, (Romagnoli et al., 2000)), β-
Purothionin (PDB 1EJG, (Stec et al., 1995)) und Crambin (PDB 1BHP, (Jelsch et al.,
2000)) in Abbildung 73 zeigt, dass die vier Moleküle dieselbe globale Struktur
besitzen. Insbesondere die Sekundärstrukturelemente lassen sich gut überlagern. Der
RMSD-Wert der Proteinrückgratatome in den Sekundärstrukturelementen beträt 0,7 Å
bei Überlagerung mit dem Viscotoxin, 0,9 Å mit dem Purothionin und 0,92 Å mit dem
Crambin. Lokale Abweichungen existieren für die Schleife zwischen den Resten 19
bis 21, zwischen den beiden α-Helices und für den Bereich der Reste 36 bis 39, in dem
sich im Hellethionin D vier aufeinander folgende Threonine befinden.
1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 46
Alpha-1 Purothionin K S C C R T T L G R N C Y N L C R S R G A Q K L C S T V C R C K L I S S L S C P K G F P KBeta Purothionin K S C C K S T L G R N C Y N L C R A R G A Q K L C A N V C R C K L T S G L S C P K D F P KViscotoxin A3 K S C C P N T T G R N I Y N A C R L T G A P R P T C A K L S G C K I I S G S T C P S D Y P KCrambin B T T C C P S I V A R S N F N V C R L P G T P E A L C A T Y T G C I I I P G A T C P G D Y A NHelionin A K S C C R N T L G R N C Y N G C R F T G G S Q P T C G R L C D C I H V T T T T C P S S H P SHelionin D 1 K S C C R N T L A R N C Y N A C R F T G G S Q P T C G I L C D C I H V T T T T C P S S H P SHelionin E 1 K S C C R N T L G R N C Y A A C R L T G L F S Q E Q C A R L C D C I T V T T P T P C P R T H P S
Abbildung 70: Sequenzvergleiche verschiedener Thionine. Farbcode: grün = identische Aminosäure zu Hellethionin D, rot = Insertionen, gelb = konservierte Cysteine und türkis = funktionell wichtige Tyr 13.
81
Ergebnisse
Abbildung 71: Strukturfamilie der 20 energieärmsten Strukturen des Hellethionins D in Wasser. Wasserstoffatome sind nicht gezeigt. Die übrigen Atome sind in den üblichen Atomfarben dargestellt. Disulfidbrücken sind gelb gekennzeichnet.
Abbildung 72: Darstellung der Sekundärstrukturelemente des Hellethionins D. Die beiden α-Helices sind in rotgelb, das β-Faltbaltt in grün dargestellt. Aminosäuren mit möglicher biologischer Aktivität sind hervorgehoben. Die Abbildung wurde mit Hilfe des Programms Molmol (Koradi et al., 1996) erstellt.
82
Ergebnisse
Abbildung 73: Überlagerung des Peptidrückgrats der Sekundärstrukturelemente von Hellethionin D (rotes Band), Viscotoxin (blaues Band), β-Purothionin (grünes Band) und Crambin (violettes Band).
Bestimmung des oligomeren Zustandes von Hellethionin D in Wasser
Um sicherzustellen, dass Hellethionin D in Wasser als Monomer vorliegt, wurden
Verdünnungs- und NMR-Diffusionsexperimente durchgeführt. Eine leichte
Linienverschmälerung wurde nach Verdünnung einer Hellethioninlösung von 4 auf 2
mM beobachtet. Bei weiterer Verdünnung der Lösung bis auf 0,1 mM Protein trat
keine weitere Linienverschmälerung ein. Die Translationsdiffusionskonstante wurde
bei 300 K mit 1,4 × 10-10 m2 s-1 bestimmt. Sie liegt damit in einem typischen Bereich
für Proteine mit einer Größe von 5 kDa. Das Protein liegt somit in den verwendeten
Lösungen als Monomer vor.
Oxidative Rückfaltung des Hellethionin D
Um detaillierte Kenntnis über die Faltung des Hellethionins, insbesondere über den
Einfluss der Disulfidbrücken zu gewinnen wurde das Peptid reduktiv entfaltet und
83
Ergebnisse
anschließend wieder oxidativ rückgefaltet. Die Reduktion mit Tris(2-
carboxyethyl)phosphin erfolgte nur sehr langsam, wie durch 1H-1D-NMR-Spektren
und LC-MS-Analyse beobachtet wurde. Nach Inkubation bei 50 °C über Nacht war
das Protein komplett reduziert. Das reduzierte Peptid zeigt sowohl im CD-Spektrum
als auch im NMR-Spektrum, in Abbildung 74 gezeigt, keine geordnete Struktur mehr.
Insbesondere sind die Hochfeld-verschobenen Signale des Val 35 und des Ile 33
verschwunden. Es ist bekannt, dass reduzierte kleine Cystein-reiche Peptide unter
mehr oder weniger optimalen Bedingungen mit guten Ausbeuten oxidativ rückgefaltet
werden können. Insofern ist es wenig überraschend, dass durch Luftoxidation ca. 50 %
des nativen Peptids rückgefaltet werden konnten. Erfolgte die Oxidation mit Hilfe des
GSSG/GSH Systems, konnte das Peptid fast vollständig rückgefaltet werden.
Abbildung 74: 1H-1D-Spektrum des vollständig reduzierten und entfalteten Hellethionin D in H2O/D2O. Die für die korrekte Faltung charakteristischen Hochfeld-verschobenen Signale von Val 35 und Ile 33 sind verschwunden.
84
4. Diskussion
4.1. Azopeptide
Ein Vergleich der durch NMR-Spektroskopie bestimmten Strukturensembles des
bcAMPB als cis- und trans-Isomer mit den MD-bestimmten Strukturensembles ist in
Abbildung 75 gezeigt.
Abbildung 75: Vergleich der MD-Strukturensembles (links) mit den NMR-Strukturensembles (rechts) des bcAMPBs. Die links aufgeführten Strukturen gehören jeweils zum cis-, die rechts gezeigten jeweils zum trans-Isomer. Die freie Energie der MD-Strukturen ist durch Graustufen des Peptidrückgrats kodiert (Spörlein et al., 2002).
Sowohl die Strukturen des cis- als auch des trans-Isomers stimmen für beide
Methoden gut überein. In beiden Methoden ergeben sich ähnlich molekulare
Geometrien und vorhergesagte Strukturensembles, in denen das cis-Isomer nur eine
geringfügig höhere Flexibilität als das trans-Isomer zeigt. Für das monozyklische
Azopeptid-Analogon cAMPB, in dem die Cysteine durch StBu geschützt und nicht
verbrückt sind, sind die NMR-Strukturen kompakter und zeigen weniger Variabilität
als die MD-Strukturen. Die größere konformationelle Variabilität des monozyklischen
Peptids wird durch die NMR-Strukturbestimmung nicht so gut wie durch die MD-
Strukturvorhersage wiedergegeben (Carstens et al., 2004).
Vergleicht man die Rückgrat-RMSD-Werte der verschiedenen Azopeptide,
(Abbildung 76) fällt auf, dass der RMSD-Wert des trans-Azo-[Ser2, Ser5]-PDI deutlich
höher als der anderer trans-Isomere ist. Durch das Fehlen der Disulfidbrücke ist zwar
auch das trans-cAMPB etwas variabler als das trans-bcAMPB, allerdings ist die
Differenz eher gering. Zum einen ist hierfür die unterschiedliche Sequenz des cAMPB
und des Azo-[Ser2, Ser5]-PDI verantwortlich, zum anderen spielen die
85
Diskussion
unterschiedlichen Lösungsmittel, DMSO für cAMPB/bcAMPB und Wasser für Azo-
[Ser2, Ser5]-PDI /Azo-PDI, eine Rolle.
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
cAMPB
rb127
AzoPDIdi
Ser
AzoPDI
rb191
Rück
grat
-RM
SD[Ǻ
]
transcis
Abbildung 76: RMSD-Werte der jeweils zehn energieärmsten Strukturen der verschiedenen Azopeptide. Für die Ermittlung der RMSD-Werte wurden nur die Atome des Proteinrückgrats verwendet.
In Tabelle 10 sind die Redoxpotentiale von Peptidfragmenten verschiedener
Oxidoreduktasen und die der Oxidoreduktasen selbst zusammengestellt. Cystein-
enthaltende Oxidoreduktasen, wie Thioredoxin (TRX), Glutaredoxin (GRX),
Thioredoxin-Reduktase und Proteindisulfidisomerase unterscheiden sich signifikant in
ihrem Redoxpotential, welches von reduzierenden Werten von -270 mV für
Thioredoxin (Krause et al., 1991) bis zu eher oxidierenden Werten von -122 mV für
DsbA (Huber-Wunderlich and Glockshuber, 1998) reicht, obwohl alle, bis auf PDI, die
weit verbreitete Thioredoxin Faltung mit dem Cys–Xaa-Yaa-Cys Motiv am N-
Terminus einer α-Helix besitzen (Martin, 1995). Die großen Unterschiede im
Redoxpotential sind größtenteils der Sequenz des Dipeptids zwischen den Cysteinen
zugeschrieben worden (Huber-Wunderlich and Glockshuber, 1998). Gleichzeitig
wurden auch die Einflüsse von benachbarten geladenen Gruppen diskutiert (Jacobi et
al., 1997).
Die linearen Octapeptide (Siedler et al., 1993) besitzen, unabhängig von ihrer
Sequenzherkunft, Redoxpotentiale im Bereich von -200 mV. Durch die
86
Diskussion
konformationelle Einengung zu zyklischen Hexapeptiden (Cabrele et al., 2002b) wird
das Redoxpotential differenziert und zeigte eine stärkere Sequenzabhängigkeit.
Tabelle 10: Übersicht über die Redoxpotentiale verschiedener Fragmente aus verschiedenen Oxidoreduktasen.
Redoxpotentiale verschiedener Peptidfragmente
E0’ [mV] E0’ [mV] E0’ [mV] E0’ [mV]
Sequenz-
herkunft
Lineare
Octapeptidea
Zyklische
Hexapeptideb
Enzym Azopeptide
GRX -215 -179 -233c
TRX -190 -152 -270d
PDI -205 -130 -110e
-175f
-167 (trans)
TRR
Azo-
NonaTRR
-210 -204 -254/-271g
-200 (trans)h
-146 (cis)h
-218 (trans)
a: (Siedler et al., 1993); b: (Cabrele et al., 2002b); c: (Aslund et al., 1997); d: (Lin and Kim, 1989); e: (Hawkins et al., 1991); f: (Lundstrom and Holmgren, 1993); g: (O'Donnell and Williams, Jr., 1983); h: (Cabrele et al., 2002a).
In Studien (Cabrele et al., 2002a) über die Thioredoxin-Reduktasesequenz (TRR)
enthaltenden Azopeptide (Azo-TRR) konnte gezeigt werden, dass sich das trans-
Isomer des Azo-TRR-Peptids sehr gut auf das aktive Zentrum der Thioredoxin-
Reduktase überlagern lässt. Trotzdem beträgt der Unterschied des Redoxpotentials
zwischen Enzym und Azopeptid 50 mV. Dieser Unterschied kann auf die
Entropieabnahme bei Bildung des relativ rigiden Typ I β -Turn im Protein während
der Oxidation zurückgeführt werden.
Das Redoxpotential des Azo-PDI ist deutlich positiver als das des trans-Isomers des
Azo-NonaTRR und des trans-Isomers des Azo-TRR. Ähnlich wie für das Azo-TRR
beträgt das Redoxpotential des linearen Modellpeptids von PDI –205 mV. Das native
PDI Enzym hingegen hat ein deutlich positiveres Redoxpotential von –110 mV
(Hawkins et al., 1991). Offensichtlich hat auch im Falle der PDI die Proteinumgebung
einen dominierenden Einfluss auf das Redoxpotential. Die Sequenz des Dipeptids
87
Diskussion
beeinflusst das Redoxpotential allerdings auch, da gezeigt werden konnte, dass ein
Austausch des Dipeptids Pro-His im Enzym DsbA gegen das Dipeptid Gly-His aus der
PDI Sequenz das Redoxpotential des mutierten DbsA veränderte (Huber-Wunderlich
and Glockshuber, 1998). In diesem Fall wurde es negativer, was einem negativeren
Redoxpotential des PDI Enzyms im Vergleich zum DbsA Enzym entspricht. Wurde in
den Mutationsstudien das Dipeptid Ala-Thr eingesetzt, welches der Thioredoxin-
Reduktasesequenz entspricht, lag das Redox-potential noch unter der PDI Mutante
(Huber-Wunderlich and Glockshuber, 1998). Insofern gibt es also auch einen
Dipeptidsequenz–abhängigen Einfluss auf das Redoxpotential. Es wird angenommen,
dass die Sequenz Gly-His durch das bei physiologischem pH zumindest teilweise
positiv geladene Histidin ein Thiolat-Anion des N-terminalen Cysteins stabilisieren
kann. Die Bildung des Thiolat-Anions am N-terminalen Cystein ist für das
Redoxverhalten von großer Bedeutung. Bei der Thioredoxin-Reduktasesequenz Ala-
Thr fehlt eine solche stabilisierende positive Ladung.
Im Falle des trans-Isomers des Azo-PDI kann die günstige Orientierung des positiv
geladenen Histidins als wahrscheinlich angenommen werden. Eine Überlagerung der
Struktur des trans-Isomers und des cis-Isomers des Azo-PDI in Abbildung 77 zeigt,
dass sowohl das trans- als auch das cis-Isomer dieselbe Turnstruktur zwischen den
beiden Cysteinen ausbilden wie das native Enzym. Als weitere stabilisierende positive
Ladungen müssen aber auch die vier Lysine im Azo-PDI in Betracht gezogen werden.
Eventuell sind sie sogar die redoxbestimmenden Reste des Peptids. Das Azo-TRR und
das Azo-NonaTRR besitzen allerdings auch drei bzw. vier Lysine. Der deutliche
Unterschied zwischen dem Redoxpotential des trans-Azo-PDI einerseits und des
trans-Azo-TRR und trans-Azo-NonaTRR anderseits spricht gegen einen
dominierenden Einfluss der Lysine auf das Redoxpotential. Zusätzlich besitzen das
trans-Azo-NonaTRR und das trans-Azo-TRR ein leicht negativeres oder nahezu
gleiches Redoxpotential wie ihre linearen Octapeptidanaloga, welche keine Lysinreste
enthalten.
Über das tatsächliche Redoxpotential des cis-Azo-PDI kann nur spekuliert werden.
Abschätzungen deuten darauf hin, dass das Redoxpotential des cis-Isomers deutlich
negativer als das des trans-Isomers ist. Damit würde sich das Azo-PDI qualitativ
umgekehrt zum löslichen Azo-TRR verhalten (Cabrele et al., 2002a), bei dem das cis- 88
Diskussion
Isomer ein deutlich positiveres Redoxpotential besitzt. Anderseits zeigt die
Überlagerung in Abbildung 77, dass cis- und trans-Isomer im oxidierten Zustand eine
ähnliche Konformation des Bis(cysteinyl)motivs besitzen, die auch der lokalen
Konformation des nativen Enzyms entspricht.
Abbildung 77: Überlagerung der Strukturen des nativen PDI Enzyms (PDB Eintrag: 1MEK) (Kemmink et al., 1996) (grünes Peptidrückgratband) mit dem trans- (rotes Band) und cis-Isomer des Azo-PDI (blaues Band). Alle Atome außer Wasserstoff sind in den üblichen Atomfarben dargestellt. Die Disulfidbrücken sind in gelb gekennzeichnet.
89
Diskussion
4.2. Minicollagen
Obwohl beide Cystein-reichen Domänen dasselbe Cysteinmotiv besitzen,
unterscheiden sie sich in ihren Strukturen und ihrer Disulfidverknüpfung. Damit wird
die These bestätigt, dass Sequenz und Cysteinmotiv gemeinsam die Faltung
bestimmen, nicht aber das Cysteinmotiv allein (Creighton, 1997). Die These, dass
identische Cysteinverteilungen zu identischen Cysteinverknüpfungen führen (Gupta et
al., 2004), wird jedoch nicht bestätigt.
Die C-terminale Domäne ist vier Reste länger und die N-terminale Domäne ein Rest
länger als die eigentliche Kerndomäne von Position 1 bis Position 20. In der Struktur
der C-terminalen Domäne sind Pro 1 und die letzten drei Reste zufällig orientiert und
wahrscheinlich nicht für die korrekte Faltung verantwortlich, erhöhen aber die
Löslichkeit des Peptids und damit in vitro auch die Ausbeute der oxidativen Faltung.
Die restliche Struktur der C-terminalen Domäne ist definiert und besteht nur aus einem
einzigen Konformations-Isomer.
Die N-terminale Domäne ist insgesamt besser definiert, da ihr der flexible C-
Terminus der C-terminalen Domäne fehlt. Sie weist aber zwischen den Resten Gly 3
bis Tyr 5 eine variablere Region auf. Aus den HPLC-Läufen und den NMR-Spektren
der N-terminalen Domäne lässt sich vermuten, dass noch ein weiteres Konformations-
Isomer besteht. Der Anteil des zweiten Isomers ist mit 5 – 10 % aber relativ gering.
Detaillierte Untersuchungen wurden am zweiten Isomer nicht vorgenommen. Obwohl
das Propeptid der N-terminalen Domäne keinen Einfluss auf die Faltung hat, erhöht es
die Ausbeuten der oxidativen Faltung in vitro und möglicherweise auch in vivo.
Der Grund für den strukturellen Unterschied der beiden Domänen liegt
wahrscheinlich in der cis-Peptidbindung zwischen Ala 11 und Pro 12 begründet. Die
C-terminale Domäne besitzt zwar auch ein Prolin an Position 12, eine cis-
Peptidbindung wurde aber nicht beobachtet. Die Strukturen der N-terminalen und der
C-terminalen Domäne sind nach unserem Wissen singulär, da keine homologen
Strukturen bekannt sind.
Im reduzierten Zustand besitzt die C-terminale Domäne keine bevorzugte
Konformation und liegt in einem ungeordneten Zustand vor. Für die N-terminale
Domäne wurde entsprechendes nicht untersucht. Es ist allerdings sehr wahrscheinlich,
90
Diskussion
dass die N-terminale Domäne im reduzierten Zustand ebenfalls ungefaltet ist, da bei
vielen anderen Cystein-reichen Domänen das Öffnen der Disulfidbrücken zum Verlust
der Struktur führt. Wurden beispielsweise die Cysteine im Tachyplesin gegen Alanine
ausgetauscht, verlor das Protein seine Struktur (Laederach et al., 2002).
Interessanterweise konnte die Faltung durch den Austausch der Alanine gegen
Tyrosine wiederhergestellt werden (Laederach et al., 2002). Offensichtlich können die
hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den Tyrosinen die kovalenten Bindungen
der Disulfidbrücken ersetzen. Da auch das Öffnen nur einer Disulfidbrücke der C-
terminalen Domäne bereits zu einem Verlust der Faltung führt, erfolgt durch die freie
SH-Gruppe wahrscheinlich ein schneller intramolekularer Austausch aller
Disulfidbrücken. Die Verknüpfung der Disulfidbrücken erfolgt anschließend bis auf
Verknüpfungen, die energetisch stark benachteiligt sind, stochastisch, und ungefaltete
Zustände der Peptidkonformation resultieren daraus.
Erstaunlich ist, dass einige wenige nicht kovalente Wechselwirkungen in der N- und
C-terminalen Domäne die korrekte Verknüpfung der Cysteine bewirken, obwohl
statistisch gesehen eine große Anzahl von unterschiedlichen Verknüpfungen möglich
ist. Um die korrekte Disulfidverknüpfung zu formen, müssen ungünstige
Verknüpfungen vermieden und die korrekte Disulfidverknüpfung durch die Faltung
begünstigt werden, die dann wiederum die Faltung stabilisiert (Creighton, 1997). Die
jeweils drei zwischen den Cysteinen liegenden Aminosäuren machen eine
Verknüpfung von benachbarten Cysteinen energetisch ungünstig und schließen damit
bestimmte Verknüpfungsmuster aus (Zhang and Snyder, 1989).
Für die Faltung der C-terminalen Domäne ist möglicherweise die Bildung des Typ I
β-Turns mit der Wasserstoffbrücke zwischen dem Amidproton des Cys 15 und dem
Carbonylsauerstoff des Val 11 der entscheidende Schritt. Aus den Strukturen ist zu
erkennen, dass der Typ I β-Turn und der inverse γ-Turn die Cysteine in enge
Nachbarschaft für die korrekte Verknüpfung rücken. In diesem Fall würde der Bildung
der Disulfidbrücken und damit der nativen Faltung die Bildung von
Sekundärstrukturelementen vorausgehen.
91
Frühere Untersuchungen an Minicollagenen in der Nematocystenwand zeigten, dass
es einen Wechsel von einer löslichen Form, in der alle Disulfidbrücken intramolekular
verknüpft sind, zu einer nicht löslichen dichten polymeren Form, in der die
Diskussion
Disulfidbrücken intermolekular verknüpft sind, gibt. Ähnliche
Assemblierungsprozesse, welche eine Umlagerung der Disulfidbrücken beinhalten,
wurden vom Virus Capsid Protein (Li et al., 2002), dem Collagen IV (Gunwar et al.,
1998) und anderen Systemen berichtet (Knaus et al., 2001), (Wagner et al., 1987). Die
einzigen Cysteine des Minicollagens befinden sich in der N- und C-terminalen
Domäne. Daher wurde eine Disulfidumlagerung zwischen diesen Domänen
vorgeschlagen. In vivo ist die Situation sehr viel komplizierter, da auch
Verknüpfungen zwischen N- und C-terminalen Domänen verschiedener Proteine eines
Organismus möglich sind.
Es stellt sich die Frage nach dem funktionellen Grund für die unterschiedliche
Struktur der N- und C-terminalen Domäne, trotz identischer Cysteinverteilung.
Aufgrund ihrer verschiedenen Struktur und der unterschiedlichen Lagen der
Disulfidbrücken werden sich die N- und C-terminale Domäne während der
Disulfidumlagerung in der Quervernetzungsphase der Nematocystenbiogenese
unterschiedlich verhalten. Wie in Abbildung 68 des Ergebnisteils gezeigt wird, besitzt
das Minicollagen ebenfalls keine Symmetrie bezüglich der Polyprolindomänen. So
kann eine Kopf-zu-Schwanz-Verknüpfung verschiedener Minicollagene gewährleistet
und eine Kopf-zu-Kopf oder Schwanz-zu-Schwanz-Verknüpfung vermieden werden.
Die damit entstehende Orientierung der Minicollagene im Netzwerk der Zellwand
verleiht ihr möglicherweise ganz spezielle mechanische Eigenschaften.
Im Minicollagen der Korallen treten Cysteinreste interessanterweise besonders
häufig nach Glycinen in der tripelhelikalen Collagendomäne auf. Cysteinreste, welche
verschiedene Collagenstränge desselben Moleküls verbinden, befinden sich am Ende
der Tripelhelix (Bruckner et al., 1978) (Barth et al., 2003) oder in Unterbrechungen
der regulären Gly-X-Y Repeats (Kühn, 1995) und bilden dort einen stabilen
Disulfidknoten.
Cysteinreste in Position X der Tripelhelix sind sehr selten und dienen
wahrscheinlich der Verknüpfung von unterschiedlichen Collagenmolekülen. Es kann
spekuliert werden, dass zusätzlich zu den Verknüpfungen des Minicollagens über die
N- und C-terminalen Domänen die Nematocystenwand der Korallen über eine direkte
Disulfidverknüpfung der tripelhelikalen Domänen des Minicollagens verfügt und so
eine höhere Zugfestigkeit besitzt. 92
Diskussion
4.3. Hellethionin
Im Gegensatz zu den Cystein-reichen Domänen des Minicollagens, besitzen die α-
und β-Thionine (Garcia-Olmedo et al., 1998) identische Cysteinverteilungen und
identische Strukturen, wie sie in den meisten anderen Cystein-reichen Peptiden
gefunden werden.
Purothionin, Crambin und Viscotoxin, deren Strukturen in Abbildung 73 des
Ergebnisteils gezeigt sind, zeigen eine ähnliche Anordnung von Schleifen und Turns in
den letzten zwölf Aminosäureresten, wohingegen das Hellethionin D in den Resten
Thr 34 bis zum C-Terminus in der Struktur von den anderen Thionin abweicht. Nur
der C-Terminus selbst ist wieder ähnlich zum C-Terminus anderer Thionine.
Offensichtlich sind die Unterschiede durch die Gegenwart der konservierten
Disulfidbrücke zwischen Cys 3 und Cys 40 beschränkt. Obwohl das Strukturensemble
des Hellethionin D für die Reste Thr 36 bis Thr 39 weniger definiert ist, ist die
Spreizung der Konformation klein verglichen mit den Unterschieden der
Schleifenkonformationen innerhalb der anderen Thionine. Dies bedeutet, dass der
Unterschied nicht auf einen Mangel an experimentellen Daten zurückzuführen ist. Die
Existenz von zahlreichen mittellangen und weitreichenden NOE-Kontakten
unterstreicht diese Vermutung. Zusätzlich würde eine Konformation der Schleife
zwischen den Resten Thr 36 und Thr 39, die der anderen Thionine entspräche, die
Rückgratatome der Reste Thr 37 und Thr 38 sehr in die Nähe der
Seitenkettenaminogruppe des Lys 1 rücken. NOE-Kontakte zwischen diesen Resten
können jedoch ausgeschlossen werden. Obwohl die Bedeutung als auch der Ursprung
dieses Unterschiedes zum jetzigen Zeitpunkt unbekannt sind, kann spekuliert werden,
dass dafür die unterschiedliche Ladungsverteilung und die vier Threonine zwischen
den Resten 36 bis 39 verantwortlich sind.
Bei einem pH Wert von 7 ist das Hellethionin D positiv geladen. In der N-
terminalen Hälfte der Sequenz aller Hellethionine ist die Verteilung der geladenen
Aminosäuren identisch mit denen der anderen Thionine. Große Unterschiede
existieren in der zweiten Hälfte der Sequenz. Die positiven Ladungen, die in anderen
Thioninen gefunden werden, existieren im Hellethionin D nicht. Die Seitenketten der
93
Diskussion
Reste Asp 31 und Arg 5 sind in enger Nachbarschaft und bilden wahrscheinlich eine
Salzbrücke aus.
Das reduzierte Hellethionin D lässt sich in einem GSH/GSSG Redoxpuffer
problemlos und quantitativ rückfalten. Unter Luftoxidation ist die Ausbeute der
oxidativen Rückfaltung deutlich geringer, da fehlgefaltete Intermediate nicht aus den
lokalen Energieminima durch Umlagerung von Disulfidbrücken befreit werden
können. Für die korrekte Faltung ist die Ausbildung der Sekundärstrukturelemente,
zwei antiparallele α-Helices und ein antiparalles β-Faltblatt, die in allen Typ I, II und
IV Thioninen gefunden werden (Garcia-Olmedo et al., 1998), sehr wahrscheinlich
erforderlich.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Hellethionin D, als Repräsentant einer
größeren neuen Familie von Thionin, die typische Thioninstruktur zeigt und eine
Disulfidverknüpfung, die dem Typ II der Thionine (Garcia-Olmedo et al., 1998)
entspricht, besitzt. Trotz des gemeinsamen Faltungsmotivs bestehen Unterschiede
zwischen dem Hellethionin D und anderen Thioninen, welche wahrscheinlich auf die
ungewöhnliche Ladungsverteilung und die vier aufeinander folgenden Threonine im
C-terminalen Bereich zurückzuführen sind.
94
5. Zusammenfassung und Ausblick In der vorliegenden Arbeit wurden Moleküle untersucht, die Modellsysteme für die
(oxidative) Proteinfaltung sind.
Die erste untersuchte Klasse von Molekülen besteht aus zyklischen Azopeptiden,
deren Sequenzen aus den beiden Oxidoreduktasen Thioredoxin-Reduktase (TRR) und
Proteindisulfidisomerase (PDI) stammen. Durch den AMPB-Photoschalter lassen sich
die Peptide reversibel in das trans- und das cis-Isomer schalten. Die Isomere
unterscheiden sich sowohl konformationell als auch in ihren physikalisch-chemischen
Eigenschaften voneinander. Mit CD- und NMR spektroskopischen Untersuchungen
konnten die konformationellen Eigenschaften aufgeklärt werden. Das Redoxpotential
der wasserlöslichen Bis(cysteinyl)-Azopeptide wurde über die
Gleichgewichtskonstante mit Glutathion bestimmt.
Am DMSO-löslichen Azopeptid bcAMPB wurde bereits in vorhergehenden
Arbeiten die konformationelle Dynamik nach Schalten des AMPB Bausteins im
Bereich von Pikosekunden verfolgt (Spörlein et al., 2002). Eine verfeinerte NMR-
Struktur des bcAMPB zeigte eine bessere Übereinstimmung der NMR-Strukturen mit
theoretischen Strukturvorhersagen aus MD Simulationen (Carstens et al., 2004) als die
bereits veröffentlichten NMR-Strukturen (Renner et al., 2000).
Das bizyklische wasserlösliche Azo-PDI mit der Sequenz der
Proteindisulfidisomerase besitzt sowohl als trans- als auch als cis-Isomer gut
definierte, aber unterschiedliche Strukturensembles. Damit ist es für die
Ultrakurzzeitspektroskopie besonders interessant, da das Peptid von einem definierten
konformationellen Zustand in einen anderen konformationellen Zustand geschaltet
werden kann. Sein monozyklisches Analogon Azo-[Ser2, Ser5]-PDI besitzt weder als
trans- noch als cis-Isomer eine definierte Struktur und unterstreicht damit den
strukturbestimmenden Einfluss der Disulfidbrücke.
Das trans-Azo-PDI Peptid besitzt mit -167 mV ein positiveres Redoxpotential als
das trans-Isomer des Azo-TRR (Cabrele et al., 2002a) und als das trans-Isomer des
Azo-NonaTRR, dessen Sequenz ebenfalls aus der Thioredoxin-Reduktase stammt.
95
Zusammenfassung und Ausblick
Das Azo-TRR wurde in vorhergehenden Arbeiten bereits als Modulator der
oxidativen Proteinfaltung verwendet (Cattani-Scholz et al., 2002). Hieran könnte mit
Untersuchungen des Azo-PDI anknüpft und aufgeklärt werden, welchen Einfluss
Unterschiede des Redoxpotentials und der Konformation auf die oxidative
Proteinfaltung haben.
Die zweite Klasse von Molekülen als Modelle der Proteinfaltung stellen kleine
natürliche Cystein-reiche Peptide dar. In der vorliegenden Arbeit wurden die
strukturellen Eigenschaften und die Faltungseigenschaften der N- und C-terminalen
Cystein-reichen Domäne des Minicollagens aus Hydra und des Hellethionin D,
welches zu der Gruppe der Thionine zählt, untersucht.
Interessanterweise besitzen die N- und die C-terminale Domäne, obwohl sie
dasselbe Cysteinmuster besitzen, unterschiedliche Strukturen. Sie eignen sich damit
besonders gut als Modellsysteme der oxidativen Proteinfaltung, da an ihnen die
wechselseitige Beeinflussung der sequenzabhängigen Faltung und das Knüpfen von
Disulfidbrücken auf den gesamten Faltungsprozess untersucht werden kann. Die
durchgeführten Rückfaltungsexperimente der C-terminalen Domäne zeigen, dass die
native Faltung nur durch die Bildung aller Disulfidbrücken stabilisiert wird. Der
Prozess der Disulfidumlagerung der Cystein-reichen Domänen ist für die Härtung der
Nematocystenwand essentiell. Hierbei lagern sich die intramolekularen
Disulfidbrücken zu intermolekularen Disulfidbrücken um und verknüpfen so die
einzelnen Minicollagentrimere miteinander. Eine detaillierte Kenntnis der Stabilität
der einzelnen Disulfidbrücken in der N- und C-terminalen Domäne könnte diesen
Prozess durch einen molekularen Mechanismus im Detail aufklären. Interessant ist in
diesem Zusammenhang auch, inwieweit die unterschiedlichen Strukturen der N- und
der C-terminalen Domäne diesen Härtungsprozess beeinflussen oder sogar
Voraussetzung für die korrekte Verknüpfung der Minicollagene sind.
Zur zweiten Klasse von Modellsystemen der oxidativen Proteinfaltung gehört das
Cystein-reiche Hellethionin D, das zur Gruppe der Thionine zählt. Die ermittelte
NMR-Struktur des Hellethionin D weist dieselbe stabile Faltung wie andere homologe
Thionine, z.B. Crambin, auf. Obwohl die Sequenzhomologien zum Teil nur 30 %
betragen, nehmen alle Thionine dieselbe Struktur an. Die Thionine besitzen, wie auch 96
Zusammenfassung und Ausblick
die Cystein-reichen Domänen des Minicollagens, ein identische Cysteinmuster. Im
Gegensatz zu ihnen sind ihre Faltung und ihre Disulfidverknüpfung aber identisch. Die
Rückfaltung des Hellethionin D erfolgte im GSH/GSSG Redoxpuffer problemlos und
quantitativ. In zukünftigen detaillierten Rückfaltungsexperimenten wäre auch hier das
Wechselspiel von sequenzabhängiger Faltung und Knüpfung der Disulfidbrücken
interessant, allerdings mit umgekehrten Voraussetzungen im Vergleich zu den
Cystein-reichen Domänen des Minicollagens.
97
6. Material und Methoden
6.1. Allgemeiner Teil
6.1.1. UV-Spektroskopie
Die UV-Spektren wurden am Zweistrahlspektrometer Lambda19 (Perkin Elmer,
Überlingen) aufgenommen und mit dem Programm UV Winlab Version 2.7 (Perkin
Elmer) ausgewertet. Die Chromophorkonzentration wurde so gewählt, dass die
Absorption zwischen 0,1 und 2 Absorptionseinheiten lag. Zur Aufnahme der Spektren
wurden Quarzküvetten aus Quarzglas Suprasil® 114 QS (Hellma, Jena) mit einer
Schichtdicke von 10 mm und Volumina zwischen 200 und 850 µl verwendet. Die
Spektren wurden in einem Wellenlängenbereich von 210-600 nm aufgenommen.
6.1.2. CD-Spektroskopie
Die CD-Spektren wurden an einem J-715 Spektrapolarimeter (Jasco, Groß-
Umstadt) aufgenommen, welches mit einem thermostatisierbaren Küvettenhalter
ausgestattet ist. Prozessierung und Auswertung der Spektren erfolgte mit dem
Programm Spectra Manager for Windows95/NT (Jasco, Groß-Umstadt). Die
Messungen erfolgten im Bereich von 190–260 nm mit einer Quarzküvette aus
Quarzglas Suprasil® 110 QS (Hellma, Jena) mit 1 mm Schichtdicke. Im Bereich von
260–600 nm wurde eine Küvette Quarzglas Suprasil® 110 QS (Hellma, Jena) mit einer
Schichtdicke von 10 mm verwendet. Abhängig von der Konzentration der Proben
wurden die Spektren mit unterschiedlicher Anzahl von Scans aufgenommen. Die
Spektren im Bereich von 190 bis 250 nm wurden in Elliptizität pro Aminosäure
angegeben. Die Elliptizität pro Aminosäure wird mit folgender Formel aus den
Rohdaten berechnet:
[Θ]R = [Θ]/n [deg × cm2 × dmol-1] (1)
Hierbei ist n die Anzahl der Aminosäuren des Peptids.
6.1.3. Analytische HPLC
Für die analytische HPLC standen vier verschiedene Systeme (alle Waters,
Eschborn) zur Verfügung:
98
Material und Methoden
• System I: Pumpen: Waters 616 mit Controller 600S; Autosampler: Waters
717plus; Detektor: Waters 2487 Dual Absorbance Detector; Eluent A: 5 %
Acetonitril und wässrige 95 % H3PO4 (2 %); Eluent B: 90 % Acetonitril und
wässrige 10 % H3PO4 (2 %).
• System II: Pumpen: Waters 600 mit Controller 600E; Autosampler: Waters
717plus; Detektor: Waters 2487 Dual Absorbance Detector; Eluent A: wässrige
TFA (0,1 %); Eluent B: 100 % Acetonitril mit TFA (0,1 %).
• System III: Pumpen und Autosampler: Waters 2690 Alliance; Detektor: Waters
2996 Photo Dioden Array; Eluent A: 5 % Acetonitril und 95 % wässrige H3PO4
(2 %); Eluent B: 90 % Acetonitril und 10 % wässrige H3PO4 (2 %).
• System IV: Pumpen: Waters 515; Autosampler: Waters 717plus; Detektor:
Waters 996 Photo Dioden Array; Eluent A: 5 % Acetonitril und 95 % wässrige
H3PO4 (2 %); Eluent B: 90 % Acetonitril und 10 % wässrige H3PO4 (2 %).
Alle Systeme wurden mit der Millenium32 Software (Waters, Eschborn) bedient.
Auf diesen Systemen wurden folgende analytische Trennsäulen verwendet:
• Nucleosil 100-5 C 8 (Macherey & Nagel, Düren), 125 × 4 mm,
Flussgeschwindigkeit 1,5 ml min-1.
• Nucleosil 100-5 C 18 (Macherey & Nagel, Düren), 250 × 4 mm,
Flussgeschwindigkeit 1 ml min-1.
• Nucleosil 300-5 C 4 (Macherey & Nagel, Düren), 125 × 4 mm,
Flussgeschwindigkeit 1,5 ml min-1.
• Chromolith Performance 3 (Merck, Darmstadt), RP 18e, 100 × 4,8 mm,
Flussgeschwindigkeit 3 ml min-1.
6.1.4. Präparative HPLC
Für die präparative HPLC wurde das analytische System II verwendet, da es
Flussgeschwindigkeiten bis 15 ml min-1 erreicht, sowie ein Gilson System (Gilson,
Frankreich, Villiers le Bel) mit einer Gilson 321 Pumpe, einem Gilson 151 UV/Vis
Detektor und einem Gilson 202 Fraktionskollektor. Als Eluent A wurde wässrige TFA
(0,1 %) und als Eluent B Acetonitril mit TFA (0,1 %) eingesetzt. Das Gilson System
wurde mit dem Programm UniPoint V2.10 (Gilson, Frankreich, Villiers le Bel)
bedient. 99
Material und Methoden
Folgende Trennsäulen wurden verwendet:
• Nucleosil 100-5 C 8 (Macherey & Nagel, Düren), 250 × 21 mm,
Flussgeschwindigkeit 10ml min-1
• Nucleosil 100-5 C 8 (Macherey & Nagel, Düren), 250 × 10 mm,
Flussgeschwindigkeit 6ml min-1
Auf dem System II wurden die Fraktionen manuell anhand der UV-Absorption
gesammelt. Auf dem Gilson System konnten die Fraktionen automatisch gesammelt
werden.
6.1.5. Massenspektrometrie
LC-MS-Massenspektrometrie wurde an einem PE Sciex API165 (PE Sciex,
Langen) Massenspektrometer durchgeführt. Als HPLC-System wurde eingesetzt: Das
Microgradient System 140 C (Applied Biosystems, Forster City CA, USA), PE 785A
UV-Vis Detektor (Perkin Elmer, Überlingen), PE Series 200 Autosampler (Perkin
Elmer) und ein PE Nelson 200 Interface (Perkin Elmer, Überlingen). Als Software
wurde BioMultiView 1.3.1 (PE Sciex, Langen) und als HPLC-Trennsäule eine
Nucleosil 100-5 C 8, 125 × 2 mm mit einer Flussgeschwindigkeit von 250 µl min-1
verwendet. Dabei wurde ein Gradient von 5 % Acetonitril und 95 % wässrige TFA
(0,05 %) nach 90 % Acetonitril und 10 % wässrige TFA (0,05 %) gefahren.
6.1.6. NMR-Spektroskopie
Folgende NMR Spektrometer wurden verwendet:
AMX 400 (Bruker, Rheinstetten), DRX 500 (Bruker, Rheinstetten), DMX 750
(Bruker, Rheinstetten), DM 900 (Bruker, Rheinstetten).
Alle Spektrometer wurden mit dem Programm XWINNMR (Version 3.1 Bruker)
bedient und die Spektren prozessiert. Mit Ausnahme des AMX 400 war eine
Vorkühlung an die Spektrometer angeschlossen, so dass Spektren bis zu Temperaturen
von 0 °C gemessen werden konnten. Die Signalzuordnung wurde mit Hilfe des
Programms Sparky 3 (Goddard and Kneller, 2001) durchgeführt.
100
Material und Methoden
6.2. Azopeptide
Die Synthese und Reindarstellungen der mono- und bizyklischen Azobenzol-
Peptide wurden teilweise veröffentlicht oder werden anderswo beschrieben.
Oxidiertes bizyklisches c[Ala-Cys-Ala-Thr-Cys-Asp-Gly-Phe-AMPB-]
bcAMPB; (Behrendt, 2000): Mr = 1003,4; Peptidgehalt: 83 %.
Oxidiertes bizyklisches c[Lys-Cys-Gly-His-Cys-Lys-Lys-Lys-AMPB-]
Azo-PDI; (Loeweneck, 2005): Mr = 1147,6.
Monozyklisches c[Lys-Ser-(15N)Gly-His-Cys-Lys-Lys-Lys-AMPB-]
Der Amidstickstoff des Gly 3 wurde 15N markiert. Azo-[Ser2, Ser5]-PDI;
(Loeweneck, 2005): Mr = 1118,3.
Oxidiertes bizyklisches c[Lys-Cys-Ala-Thr-Cys-Asp-Lys-Lys-Lys-AMPB-]
Azo-NonaTRR, (Behrendt, unveröffentlichte Ergebnisse): Mr = 1241,5.
In den Fällen, in denen kein Peptidgehalt bekannt war, wurde die
Peptidkonzentration der AMPB-Peptide über den Extinktionskoeffizient des trans-
Isomers bei 335 nm in Wasser (ε = 25.000 M-1 cm-1) bestimmt.
Photoisomerisierung
Die Azopeptide wurden mit einer UV-Lampe (Firma Müller Elektronik-Optik,
Moosinning), ausgestattet mit einem Quarzkondensator, sphärischen Rückspiegeln
sowie einer Blende, belichtet. Als Strahlungsquelle diente eine 450 W XBO
Xenonlampe (Osram, München). Der Lichtstrahl wurde zunächst durch ein H2O-
Reservoir zur Filterung der IR-Strahlung geleitet, um die nachfolgenden UV/Vis-Filter
vor zu starker Erwärmung zu schützen. Anschließend wurde der Lichtstrahl durch
einen Glasfaserlichtleiter mit einer Länge von 3 m und einem Durchmesser von 3 mm
geführt. Für die cis→trans Isomerisierung wurden die Proben bei 450 nm mit einer
Kombination von GG 435 und BG12 Filtern (Itos, Mainz) belichtet. Für die trans→cis
Isomerisierung wurden die Proben bei 350 nm mit einem UG1 Filter (Itos, Mainz)
belichtet. Je nach Konzentration und Isomerenverhältnis betrug die Belichtungszeit
101
Material und Methoden
zwischen 30 sec und 10 min. Die Belichtung erfolgte entweder durch Platzierung der
Probe direkt hinter den Filtern, falls sich die Probe in einem NMR-Röhrchen befand,
oder über den Glasfaserlichtleiter, der auf die Probe gerichtet war. Die Leistung des
aus dem Lichtleiter austretenden Lichtstrahls bei unterschiedlichen Wellenlängen
wurde mit der Photodiode HT 90 (Firma HI-TOP international) bestimmt.
6.2.1. Azo-PDI
NMR-Spektroskopie
Für die Messung von 1H 1D- und 2D-NMR-Spektren wurde eine Peptidlösung mit
einer Konzentration von 3 mM in 450 µl H2O und 50 µl D2O (pH 2,6) verwendet. Für
reine D2O Proben wurde das Peptid lyophilisiert und in 100 % D2O gelöst. Die
Spektren wurden bei Temperaturen zwischen 283 K und 323 K aufgenommen.
1D-Experimente
Für die 1H-1D-Experimente in wässriger Lösung wurden die Pulsprogramme
cr1dwg, mit einer Watergatepulssequenz (Sklenar et al., 1993) zur
Lösungsmittelunterdrückung, oder zgpr (mit einer Vorsättigung zur
Lösungsmittelunterdrückung) verwendet. Im Falle der D2O Proben wurden die
Spektren mit einer schwachen Vorsättigung oder ganz ohne Wasserunterdrückung, je
nach Stärke des residualen Wassersignals, aufgenommen. Alle 1D-Spektren wurden
mit 32 K Datenpunkten aufgenommen und mit 32 K oder 64 K digitalen Datenpunkten
prozessiert. Das aufgenommene Signal wurde mit einer Fouriertransformation in die
Frequenzdomäne transformiert und mit einer Fensterfunktion gefaltet. Als
Fensterfunktion wurde typischerweise eine abfallende Exponentialfunktion mit einer
Zeitkonstante von 1–3 Hz verwendet. Die Signale wurden mit Hilfe der
Phasenkorrektur 0. und 1. Ordnung absorptiv phasiert. Die Basislinie wurde entweder
nach Augenmaß oder durch einen Algorithmus mit einem polynomialen Term 5.
Ordnung korrigiert. Zusätzlich wurde das Lösungsmittelsignal durch einen digitalen
Filter während der Transformation reduziert.
102
Material und Methoden
2D-Experimente
Für die Signalzuordnung der Signale wurden NOESY- (Jeener et al., 179), TOCSY-
(Bax and Davis, 1985a), DQF-COSY- (Rance et al., 1983) und ROESY- (Bax and
Davis, 1985b) Spektren verwendet. Die Wasserunterdrückung erfolgte durch
Vorsättigung des Wassersignals oder durch die Watergate Pulssequenz. Die TOCSY-
Spektren wurden mit acht Scans, 400 Experimenten und einer MLEV Mischsequenz
mit 75 ms Mischzeit auf genommen (Bax and Davis, 1985a). In der indirekten
Richtung wurden 400 Experimente aufgenommen. Auf dem DRX 500 Spektrometer
betrug die spektrale Breite in der direkten Richtung 6000 Hz und in der indirekten
Richtung 5500 Hz. Die ROESY-Spektren wurden mit 192 bzw. 256 Scans und einem
Spinlockpuls von 100 ms aufgenommen (Bax and Davis, 1985b). In der indirekten
Richtung wurden zwischen 800 und 1000 Experimente aufgenommen. Die spektrale
Breite betrug 6000 Hz in der direkten und 5500 Hz in der indirekten Richtung. Die
DQF-COSY-Spektren wurden mit einer spektralen Breite von 6000 Hz in der direkten
und 5500 Hz in der indirekten Richtung aufgenommen. In der indirekten Richtung
wurden 1000 Experimente aufgenommen. Phasensensitivität in der indirekten
Richtung wurde bei allen Spektren durch TPPI erreicht (Marion and Wüthrich, 1982).
Als Fensterfunktion in der direkten und indirekten Richtung wurde eine quadratische
Sinusfunktion bzw. eine Gausfunktion mit exponentiellen und quadratisch
exponentiellen Anteil verwendet.
Auswertung der Spektren
Die resonanzspezifische Zuordnung erfolgte nach der Methode von Wüthrich (Kurt
Wüthrich, 1986). Experimentelle Protonenabstände (ROE) wurden aus den 2D-
ROESY-Spektren gewonnen. 3J Hα-HN-Kopplungskonstanten wurden aus den 1D-
Spektren oder aus den DQF-COSY-Spektren extrahiert. Die Temperaturabhängigkeit
der chemischen Verschiebung wurde aus TOCSY-Spektren bei Temperaturen von 283
K, 293 K und 303 K bestimmt. Deuteriumaustauschraten wurden bei 277 K gemessen,
nachdem die lyophilisierte Probe in D2O auf Eis gelöst wurde. Die Wasserstoffbrücken
der Amidprotonen wurden anhand zweier Kriterien identifiziert:
1) Das Amidproton ist gegen den H/D-Austausch geschützt.
103
Material und Methoden
2) Die Temperaturabhängigkeit der chemischen Verschiebung des Amidprotons
ist weniger negativ als - 5 ppb K-1.
Strukturrechnungen
Die Strukturrechungen und Evaluation wurde mit dem INSIGHTII (Version 98)
Software Packet (Acceclrys, San Diego) auf Silicon Graphics O2 R5000 und Origin
200 Computern durchgeführt. Die ROE Intensitäten wurden mit Hilfe der folgenden
Klassifikation in Protonenabstände umgewandelt: sehr stark (vs) 1.7 -2.3 Å; stark (s),
2.2 -2.8 Å, mittel (m), 2.6 – 3.4 Å; schwach (w) 3.0 -4.0 Å; and sehr schwach (vw) 3.2
– 4.8 Å. Die Pseudoatomabstände wurden wie bei Wüthrich beschrieben (Kurt
Wütherich, 1986) korrigiert. Die 3J Hα-HN-Koppelungskonstanten wurden in
Randbedingungen für die φ-Dihedralwinkel des Peptidrückgrats unter Verwendung der
Karplusbeziehung umgewandelt. Verschiedene diskrete Bereiche wurden für die
Randbedingung der φ-Torsionswinkel verwendet, wenn verschiedene nicht
überlappende Lösungen für die Karplusgleichung existierten. Es wurde ein
experimenteller Fehler von 1 Hz und eine Ungenauigkeit von 5° von den
Karplusparametern angenommen. Die Kraftkonstante für die Distanzrandbedingung
betrug 50 kcal mol-1 Å-2 und 50 kcal mol-1 rad-2 für die Dihedralwinkelrandbedingung.
100 Strukturen wurden in 4 Dimensionen generiert, dann auf 3 Dimensionen mit dem
EMBED Algorithmus (Crippen and Havel, 1988) reduziert und unter Beachtung der
Randbedingungen mit einem „simulated annealing“ Schritt (Nilges et al., 1988)
optimiert. Hierfür wurden Standardprotokolle aus dem DG II Packet des INSIGHT 98
Programm verwendet. Abweichend von dem Standardprotokoll betrug die Temperatur
300 K und die Schrittlänge 1 × 10-14 s. Die 100 Strukturen wurden mit einem MDSA
Protokoll verfeinert. Die nachfolgende initiale Minimierung bestand aus 1000
Schritten mit dem „conjugated gradient“ Algorithmus und aus 500 Schritten mit dem
„steepest descent“ Algorithmus. Um das vorzeitige Abbruchskriterium der
Minimierung zu erfüllen, musste die größte Ableitung kleiner als 1.0 kcal Å1 im Falle
des ersten Algorithmus und 0.1 kcal Å im Falle des zweiten Algorithmus sein. Für die
Minimierung wurden weder ein Morsebindungspotential noch
Vielteilchenwechselwirkungsterme verwendet. Die initiale MD-Rechnung bestand aus
5000 Schritten bei einer Temperatur von 300 K. Danach wurde das System in 10000 104
Material und Methoden
Schritten mit einer Zeitkonstante von 1 ps auf 0 K abgekühlt. Für die MD Simulation
wurde eine Schrittdauer von 1 fs und das CVFF Kraftfeld (Dauber-Osguthorpe et al.,
1988) gewählt. Es wurden weder ein Morsebindungspotential noch
Vielteilchenwechselwirkungsterme verwendet. Die Randbedingungen wurden auf
jeder Stufe der Rechung berücksichtigt. Das Lösungsmittel H2O wurde durch eine
Dielektrizätskonstante von 80.0 simuliert. Um eine ungewollte cis→trans
Isomerisierung zu verhindern wurde ein zusätzliches Torsionspotential für die
Azobindung mit einer Kraftkonstante von 100 kcal mol-1 rad -2 definiert. So konnten
die Moleküle während der Rechung im cis- bzw. im trans-Zustand fixiert werden.
Messung der thermischen cis→trans Relaxation
Die thermische cis→trans Relaxation wurde mittels 1H-1D-Spektren bei 283 K,
303K, 313 K und 323 K bestimmt. Nach der Belichtung wurde die Probe im Magneten
bei konstanter Temperatur im Dunkeln gehalten. 10 bis 30 Spektren wurden innerhalb
der geschätzten Halbwertszeit bei einer Temperatur aufgenommen. Die Abnahme von
gut aufgelösten Signalen des cis-Isomers wurde an eine abfallende exponentielle
Kurve angepasst. Die Aktivierungsenergien wurden aus dem Arrhenius-Diagramm (ln
kcis→trans vs T-1) erhalten.
CD-Spektroskopie
Eine 50 µM Lösung des trans-Isomers in Wasser wurde bei 283 K im CD-
Spektrometer mit vermessen. Die Schichtdicke der Küvette betrug 1 mm. Das
Spektrum wurde zwischen 190-250 nm mit acht Scans aufgenommen. Anschließend
wurde die Probe solange belichtet bis der photostationäre Zustand erreicht wurde. Das
CD-Spektrum des cis-Isomers wurde analog dem des trans-Isomers aufgenommen.
Bestimmung der Gleichgewichtskonstante von Thiol/Disulfidaustauschreaktionen
105
Die Austauschreaktionen wurden in 1,5 ml Eppendorfgefäßen durchgeführt. Die
gewünschte konstante Reaktionstemperatur wurde durch ein mit einem Thermostat
verbundenem Wasserbad auf 0,2 °C genau gewährleistet. Für die Herstellung von
Stammlösungen von GSH, GSSG und Peptid wurden die Substanzen gewogen und in
einem entgasten und mit Argon gesättigten Redoxpuffer (1 mM EDTA, 100mM NaCl,
100 mM Phosphat Puffer, pH 7,0) gelöst. Anschließend wurden die Reaktionslösungen
Material und Methoden
in der gewünschten Konzentration vereinigt und das Reaktionsvolumen mit Puffer auf
300 µl aufgefüllt. Der pH - Wert wurde überprüft und gegebenenfalls mit NaOH und
HCl auf pH 7,0 eingestellt. Das cis/trans-Verhältnis wurde mittels HPLC-Analyse
(System II oder System IV) bestimmt. Um Lösungen des reinen trans-Isomers
einzusetzen, wurde die Peptidstammlösung mehrere Tage bei 30 °C inkubiert. Sollten
trans/cis-Mischungen eingesetzt werden, um simultan beide Isomere zu vermessen,
wurde die Peptidstammlösung für ca. 1-5 min wie oben beschrieben belichtet, und das
cis/trans-Verhältnis wurde mittels HPLC bestimmt.
Quantifizierung der Komponenten im Gleichgewicht
Die Reaktionslösungen wurden mittels HPLC (System II und IV) an einer C18
analysiert. Die UV Absorption wurde bei 210 und 335 nm auf einem dualen UV
Detektor und von 200-600 nm auf einem UV-Photodiodenarray verfolgt. Die
Retentionszeiten der Edukte wurden durch HPLC separat bestimmt. Um die UV-
Signale auf dem HPLC-Elutionsprofil einem Produkt zuordnen zu können wurden die
Reaktionslösungen parallel auf der LC-MS analysiert. Wurde ein Photodiodenarray als
Detektionseinheit verwendet (System IV), konnte anhand der UV-Spektren bereits eine
eindeutig Zuordnung der trans- oder cis-Spezies vorgenommen werden. Unter der
Annahme der gleichmäßigen Elution aller Reaktanten und identischer
Extinktionskoeffizienten der Isomere bei 210 nm, wurden die
Konzentrationsverhältnis aus den Signalintensitäten bei 210 nm berechnet.
Bestimmung der Gleichgewichtskonstante
Zur Bestimmung der Gleichgewichtskonstante wurde das oxidierte Peptid als trans-
oder als eine Mischung trans/cis-Isomer mit GSH/GSSG in verschiedenen
Verhältnissen und Konzentrationen in Redoxpuffer versetzt. Die Peptidkonzentration
betrug in der Reaktionslösung zwischen 0,3 und 0,1 mM bei einem Gesamtvolumen
von 300 µl. GSH/GSSG wurden in verschiedenen Verhältnissen (5, 2,5, 1, 0,5, 0,2)
und im großen Überschuss (40- bis 200 fach zum Peptid) eingesetzt. Die
Redoxreaktion fand unter Argonatmosphäre bei 25 °C statt. Zu unterschiedlichen
Zeitpunkten wurden Proben von 50 µl entnommen und unmittelbar mittels HPLC
analysiert. Je nach GSH/GSSG Konzentration wurde das Gleichgewicht relativ schnell
106
Material und Methoden
erreicht, so dass die Reaktion nach spätestens einer 1 h den Gleichgewichtszustand
erreichte. Obwohl die cis→trans Isomerisierungsraten temperaturabhängig sind und
zwischen den mono- und bizyklischen Peptiden variieren, wurde die
Isomerisierungsrate als langsam im Vergleich zur Austauschreaktionsrate
angenommen und daher von einem annährend konstantem cis/trans
Isomerenverhältnis ausgegangen.
Kox = ([Peptidox] × [GSH]2) / ([Peptidred] × [GSSG]) (2)
E’ = E0’ (Glutathion) – 0,03 × log Kox (3)
Die Gleichgewichtskonstante Kox wurde nach Gleichung 2 bestimmt, während die
Nernstsche Gleichung (Gleichung 3) zur Berechnung des Redoxpotentials eingesetzt
wurde. Dabei wurde als Standardredoxpotential des Glutathions ein Wert von –240
mV (Rost and Rapoport, 1964) verwendet. Die GSH und GSSG
Gleichgewichtskonzentration wurde aufgrund des großen Überschusses mit der
bekannten Anfangskonzentration gleichgesetzt.
6.2.2. Azo-[Ser2, Ser5]-PDI
NMR-Spektroskopie
Für die Messung von 1H-1D-und 2D-NMR-Spektren wurde eine Peptidlösung mit
einer Konzentration von 12 mM in 450 µl H2O und 50 µl D2O pH 2,6 verwendet. 1D-
und 2D-Spektren wurden wie für das Azo-PDI beschrieben aufgenommen. Die
Messung der Geschwindigkeit der thermischen cis→trans Relaxation erfolgte wie für
das Azo-PDI beschrieben.
15N Relaxationsmessungen
Die NMR Dynamik Messungen wurden bei einer Protonenfrequenz von 500 MHz
mit einem triple-Resonanzmesskopf am Bruker DRX 500 gemessen. Modifizierte
Versionen der Experimente von (Farrow et al., 1994) und (Tessari et al., 1997), bei
denen die Wasserunterdrückung durch die Watergate Pulssequenz anstatt durch
Gradientkohärenzenselektion erreicht wurde, wurden benutzt um 15N T1, T2-Zeiten und 107
Material und Methoden
den heteronuklearen NOE zu bestimmen. In den T1 und T2 Experimenten wurde durch
Verwendung von leistungsarmen water-flip-back Pulsen eine Sättigung des
Wassersignals vermieden. Den Richtlinien von (Jones et al., 1996) für 500 MHz
folgend, wurden Relaxationszeiten von 16 ms + n × 160 ms für T2 und 11 ms + n ×
220 ms für T1 mit n = 0, 1, 2, 3, 4 verwendet. Die Sättigung des Amidprotonensignals
im heteronuklearen Experiment wurde durch eine Serie von 120° Pulsen vor dem
eigentlichen Experiment erreicht (Markley et al., 1971).
Die NOE-Werte lassen sich leicht aus dem Verhältnis der Signale von
Experimenten mit und ohne Protonensättigung bestimmen. Um die T2-Werte zu
berechnen, wurden die experimentellen Datenpunkte (Signalhöhen) an eine abfallende
Exponentialfunktion angepasst.
6.2.3. bcAMPB
NMR-Spektroskopie
Für die Messung von 1D- und 2D-NMR-Spektren wurde eine 3 mM Peptidlösung
in deuteriertem d6-DMSO verwendet. Die Spektren wurden bei Temperaturen von 295
K bis 305 K aufgenommen.
1D-Experimente
Für die 1H-1D-Experimente in DMSO wurden die Pulsprogramme zg (ohne
Lösungsmittelunterdrückung) oder zgpr (mit einer Vorsättigung zur
Lösungsmittelunterdrückung) verwendet. Die 1H-1D-Spektren wurden mit 32 K
Datenpunkten aufgenommen. Das aufgenommene Signal wurde mit einer
Fensterfunktion multipliziert und mit einer Fouriertransformation in die
Frequenzdomäne transformiert. Als Fensterfunktion wurde typischerweise eine
abfallende Exponentialfunktion mit einer Zeitkonstante von 1 – 3 Hz verwendet. Die
Signale wurden mit Hilfe der Phasenkorrektur 1. und 2. Ordnung absorptiv phasiert.
Die Basislinie wurde entweder nach Augenmaß oder durch einen Algorithmus mit
einem polynomialen Term 5. Ordnung korrigiert.
108
Material und Methoden
2D-Experimente
Für die Signalzuordnung der Signale wurden NOESY-, TOCSY-, DQF-COSY- und
ROESY-Spektren verwendet. Die Unterdrückung von residualen
Lösungsmittelsignalen erfolgte durch Vorsättigung des Signals. Die TOCSY-Spektren
wurden mit acht Scans, 400 Experimenten und einer MLEV Mischsequenz mit 75 ms
Mischzeit aufgenommen. Die ROESY-Spektren wurden mit 160 bzw. 224 Scans und
einem Spinlockpuls von 100 ms aufgenommen. In der indirekten Richtung wurden
zwischen 600 und 850 Experimente aufgenommen. Die DQF-COSY-Spektren wurden
mit Vorsättigung und in der indirekten Richtung mit 850 Experimenten aufgenommen.
Phasensensitivität in der indirekten Richtung wurde bei den Spektren durch TPPI
erreicht.
Auswertung und Strukturrechnungen
Die Auswertung der Spektren und die Strukturrechnung und Evaluation wurden wie
für das Azo-PDI beschrieben durchgeführt. Abweichend wurde ein experimenteller
Fehler von 0,5 bis 1 Hz für die Kopplungskonstante angenommen. Das Lösungsmittel
DMSO wurde durch eine Dielektrizätskonstante von 46,7 simuliert.
6.2.4. Azo-NonaTRR
NMR-Spektroskopie
Für die Messung von 1H-1D- und 2D-NMR-Spektren wurde eine Peptidlösung mit
einer Konzentration von 5,3 mM in 450 µl H2O und 50 µl D2O (pH 2,6) verwendet,
die Aufnahme und Auswertung der Spektren sowie die Strukturrechnung erfolgte wie
für das Azo-PDI beschrieben. D2O Austauschexperimente wurden nicht durchgeführt.
Bestimmung der Gleichgewichtskonstante
Die Bestimmung des Redoxpotentials erfolgte wie für das Azo-PDI beschrieben.
6.3. Minicollagen
6.3.1. C-terminale Domäne
In Abbildung 78 ist die Sequenz der C-terminalen Domäne gezeigt. N- und C-
Terminus wurden acetyliert bzw. amidiert. 109
Material und Methoden
Ac-Pro-Cys-Pro-Pro-Val-Cys-Val-Ala-Gln-Cys-Val-Pro-Thr-Cys-Pro-Gln-Tyr-
Cys-Cys-Pro-Ala-Lys-Arg-Lys-NH2
Abbildung 78: Sequenz der C-terminalen Domäne des Minicollagens.
Synthese
Die Synthese des linearen reduzierten Rohpeptids erfolgte an einem continues flow-
Synthesizer auf einem Fmoc-Rink-Amide Harz nach der Fmoc/tBu Strategie
(Pokidysheva et al., 2004). Mr = 2633,3; HPLC (SystemI): tr = 8,1 min (>86 %); LC-
MS: m/z = 1317,0 [M+2H]2+, 878,4 [M+3H]3+.
Oxidative Faltung und Aufreinigung
100 mg (38 µmol) des entschützten Rohpeptids (M = 2633,28) wurden in 300 ml 25
mM NH4Ac, pH 8,0 mit 9 Äquivalenten GSSG (208 mg) und einem Äquivalent GSH
(11,6 mg) unter Rühren an der Luft bei 7 °C oxidiert. Der Fortschritt der Reaktion
wurde mittels HPLC (System I) und LC-MS verfolgt. Nach 7 d war die Reaktion
abgeschlossen, das Reaktionsgemisch wurde lyophilisiert, in 2 ml 5 % Essigsäure
gelöst und auf einer präparativen C 8 Trennsäule mit einem linearen Gradienten von
100 % Eluent A auf 100 % Eluent B in 60 min gereinigt und mittels HPLC (System I)
und LC-MS analysiert. Fraktionen mit homogenem Produkt (M=2627,23) wurden
vereinigt und lyophilisiert; Ausbeute 20 mg (20 %); HPLC (SystemI): tr = 6,4 min (70
%); LC-MS: m/z = 1314,4 [M+2H]2+, 876,8 [M+3H]3+.
NMR-Spektroskopie
Für die Messung von 1H-1D- und 2D-NMR Spektren wurde eine Peptidlösung mit
einer Konzentration von 3 mM und 2,3 mM in 450 µl H2O und 50 µl D2O (pH 3,5)
verwendet. Für reine D2O Proben wurde das Peptid lyophilisiert und in 100 % D2O
gelöst. Die Spektren wurden bei Temperaturen zwischen 283 K und 303 K
aufgenommen.
Die Aufnahme der 1H-1D- und 2D-Spektren erfolgte wie für das Azo-PDI
beschrieben. Es wurden TOCSY-, NOESY-, DQF-COSY- und ROESY-Spektren
aufgenommen. Die Spektren wurden bei Temperaturen zwischen 283 K und 303 K
110
Material und Methoden
aufgenommen. NOESY-Spektren wurden mit Mischzeiten von 75, 100 und 200 ms
Mischzeit aufgenommen. Die Anzahl der Scans variierte nach Spektrum und Gerät
zwischen 128 und 256 Scans. Zur Bestimmung des Aggregationsgrades des Peptids
wurden Diffussionsspektren aufgenommen.
Auswertung und Strukturrechnungen
Die Auswertung der Spektren und die Strukturrechungen erfolgten wie für das Azo-
PDI beschrieben. Dihedralwinkelrandbedingungen wurden nicht verwendet. Die
Protonenabstände wurden aus den NOESY-Spektren gewonnen. Zur Bestimmung der
Disulfidverknüpfung wurden zuerst die Strukturen mit offenen Disulfidbrücken
gerechnet. Aus den berechneten Strukturen mit offenen Disulfidbrücken konnte dann
die Disulfidverknüpfung eindeutig bestimmt werden.
CD-Spektroskopie
Die CD-Spektren wurden bei einer Konzentration von 150 µM in Wasser (pH 5) bei
283 K im Wellenlängenbereich von 190-250 nm aufgenommen mit vier Scans bei
einer Schichtdicke von 1 mm. Anschließend wurde eine Schmelzkurve von 283 K bis
363 K aufgenommen. Die Temperatur wurde um 10 K pro 1 h erhöht. Alle 10 K wurde
ein Spektrum von 190 – 250 nm aufgezeichnet.
Vinylpyridin-Derivatisierung
Zu einer 0,96 mM Minicollagen C Probe in 450 µl H2O und 50 µl D2O (pH 3,2)
wurde ein Äquivalent Tris(2-carboxyethyl)phosphin gegeben. Der Fortschritt der
Reduktion wurde mittels 1H-1D-Spektren verfolgt. Nachdem alles Tris(2-
carboxyethyl)phosphin umgesetzt worden war, wurde der pH auf 6,3 eingestellt. Zur
Derivatisierung der freien Thiolgruppen wurde Vinylpyridin im vierfachen Überschuss
zugegeben. Der Fortschritt der Reaktion wurde wiederum im NMR mit 1H-1D-
Spektren verfolgt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Produktverteilung mittels
HPLC, LC-MS und NMR-Spektren analysiert. Zur besseren Vergleichbarkeit mit den
anfänglichen NMR-Spektren wurde der pH-Wert wieder auf 3,2 eingestellt.
111
Material und Methoden
6.3.2. N-terminale Domäne
In Abbildung 79 ist die Sequenz der N-terminalen Domäne gezeigt. N- und C-
Terminus wurden acetyliert bzw. amidiert, um auch an den Termini Amidbindungen
zu erhalten.
Ac-Pro-Cys-Ser-Tyr-Cys-Pro-Ser-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Cys-Ala-Pro-Val-Cys-Cys-
Tyr-Pro-NH2.
Abbildung 79: Sequenz der N-terminalen Domäne des Minicollagens.
Synthese
Die Synthese des linearen reduzierten Rohpeptids erfolgte an einem continues flow-
Synthesizer auf einem Fmoc-Rink-Amide Harz nach der Fmoc/tBu Strategie. Mr =
2132,6; HPLC (SystemI): tr = 7,39; LC-MS: m/z = 1067,2 [M+2H]2+.
Oxidation und Aufreinigung
12 mg (8 µmol) des entschützten Rohpeptids wurden zuerst in 32 ml wässriger 6 M
Guanidiniumchloridlösung gelöst. Danach wurde die Lösung mit 2 Volumen wässriger
0,2 M NaHCO3-Lösung mit 4,5 mM Cystein und 0,45 mM Cystin verdünnt. Die
Reaktion verlief unter Rühren bei Raumtemperatur über Nacht. Der Fortschritt der
Reaktion wurde mittels HPLC (System I) und LC-MS verfolgt. Danach wurde das
Reaktionsgemisch mit Essigsäure angesäuert, filtriert und mittels HPLC (System II)
auf einer semipräparativen C 8 Trennsäule und einem linearen Gradienten von 0 %
Eluent B auf 100 % Eluent B in 60 min gereinigt. Die gesammelten Fraktionen wurden
mittels HPLC und LC-MS analysiert. Fraktionen mit homogenem Produkt
(Mox=2126,6) wurden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 2 mg (16 %); HPLC
(SystemI): tr = 7,26; LC-MS: m/z = 1063,8 [M+2H]2+. Die Bestimmung der
Peptidkonzentration in Lösung erfolgte über die Tyrosinabsorption bei 275 nm in
Wasser (ε = 1375 M-1 cm-1 je Tyrosin).
112
Material und Methoden
NMR-Spektroskopie
Für die Messung von 1H-1D- und 2D-NMR-Spektren wurde eine Peptidlösung mit
einer Konzentration von 2 mM in 450 µl H2O und 50 µl D2O (pH 3,8) verwendet. Für
reine D2O Proben wurde das Peptid lyophilisiert und in 100 % D2O gelöst. Die
Spektren wurden bei Temperaturen zwischen 283 K und 303 K aufgenommen.
Aufnahme, Auswertung und Strukturrechnungen
Die NMR-Messungen, Auswertungen und Strukturrechnungen wurden wie für die
C-terminale Domäne beschrieben durchgeführt.
6.3.3. N-terminale Domäne mit Propeptide
Ac-Lys-Thr-Leu-His-Glu-Met-Leu-Lys-Arg-Asp-Ala-Asn-Pro-Cys-Gly-Ser-Tyr-
Cys-Pro-Ser-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Cys-Ala-Pro-Val-Cys-Cys-Tyr-Pro-NH2
Abbildung 80: Sequenz der N-terminalen Domäne mit Propeptid.
Synthese
Die Synthese des linearen reduzierten Rohpeptids erfolgte an einem continues flow-
Synthesizer auf einem Fmoc-Rink-Amide Harz nach der Fmoc/tBu Strategie. Mr =
3570,3; HPLC (SystemI): tr = 6,68 min (>90 %); LC-MS: m/z = 1785,8 [M+2H]2+,
1191,2 [M+3H]3+.
Oxidation und Aufreinigung
12 mg (3,3 µmol) des entschützten Peptids (Mr = 3570,3) wurden zuerst in 32 ml 6
M Guanidiniumchloridlösung gelöst. Danach wurde die Lösung mit 2 Volumen 0.2 M
NaHCO3 Lösung mit 4.5 mM Cystein und 0.45 mM verdünnt. Die Reaktion verlief
unter Rühren bei Raumtemperatur über Nacht. Der Fortschritt der Reaktion wurde mit
analytischen HPLC-Läufen auf System I und LC-MS verfolgt. Danach wurde das
Reaktiongemisch mit Essigsäure angesäuert, filtriert und auf dem System II mit der
präparativen C 8 Trennsäule und einem linearen Gradienten von 100 % Eluent A auf
100 % Eluent B in 60 min. gereinigt. Die gesammelten Fraktionen wurden über
analytische HPLC-Läufe und LC-MS geprüft. Fraktionen mit homogenem Produkt
(Mr=3564,3) wurden vereinigt und lyophilisiert. Zusätzlich wurde die korrekte Faltung
113
Material und Methoden
der Produkte mit 1H-1D-NMR Spektren überprüft. Ausbeute 6 mg (50 %). HPLC
(SystemI): tr = 6,76 min; LC-MS: m/z = 1189,2 [M+3H]3+. Die Bestimmung der
Peptidkonzentration in Lösung erfolgte über die Tyrosinabsorption bei 275 nm in
Wasser (ε = 1375 M-1 cm-1 je Tyrosin).
NMR-Spektroskopie
Für die NMR Experimente wurde eine 3,3 mM Proben in 450 µl H2O und 50 µl
D2O (pH 3,8) verwendet. Die 1H-1D- und die TOCSY-, DQF-COSY- und NOESY-
Spektren wurden wie für die C-terminale Domäne beschrieben aufgenommen.
Tryptischer Verdau
1 mg der oxidierten N-terminalen Domäne mit Propeptid wurde in 560 µl H2O/D2O
gelöst. Hierzu wurden 80 µl einer 1 µg/10µl konzentrierten Trypsinlösung (Modified
Sequencing Grade) gegeben. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 8,0 eingestellt. Die
Lösung wurde bei 37 °C über Nacht inkubiert. Die Produktverteilung wurde mittels
HPLC und eines LC-MS analysiert. Von einem Teil des Verdaus wurde direkt ein 1H-
1D- und ein TOCSY-Spektrum aufgenommen. Der andere Teil des Verdaus wurde auf
einer HPLC (System II) mit einer semipräparativen C 8 Säule aufgereinigt. Die
einzelnen Spaltungsprodukte wurden gesammelt und mittels LC-MS identifiziert. Die
Fraktionen des Restpeptids wurden vereinigt, lyophilisiert und in 500 µl H2O/D2O (pH
3,5) gelöst. Anschließend wurden 1H-1D-NMR Spektren aufgenommen.
6.4. Hellethionin D
In Abbildung 81 ist die Sequenz des Hellethionin D gezeigt.
H-Lys-Ser-Cys-Cys-Arg-Asn-Thr-Leu-Ala-Arg-Asn-Cys-Tyr-Asn-Ala-Cys-Arg-
Phe-Thr-Gly-Gly-Ser-Gln-Pro-Thr-Cys-Gly-Ile-Leu-Cys-Asp-Cys-Ile-His-Val-Thr-
Thr-Thr-Thr-Cys-Pro-Ser-Ser-His-Pro-Ser-OH
Abbildung 81: Sequenz des Hellethionin D
Isolierung und Charakterisierung
Das Hellethionin D wurde aus Helleborus purpurascens isoliert und in seiner
Primärstruktur charakterisiert (Kerek 2001, unveröffentlichte Ergebnisse).
114
Material und Methoden
NMR-Spektroskopie
Für die NMR-Experimente wurden 3-5 mM Proteinlösungen in 450 µl H2O und 50
µl D2O (pH 2,8) verwendet. Die Aufnahme der 1H-1D-Spektren erfolgte wie für das
Azo-PDI beschrieben. Bei 283 K, 293 K und 303K wurden die für das Azo-PDI
beschriebenen 1H-2D-Standardspektren zur Strukturbestimmung aufgenommen. Die
TOCSY-Spektren wurden mit einer MLEV Mischsequenz von 75 ms aufgenommen,
während die NOESY-Spektren mit Mischzeiten zwischen 50 – 150 ms gemessen
wurden. Mit Hilfe von NOE-Aufbaukurven von gut separierten Signalen konnte die
Spindiffusion in Abhängigkeit der Mischzeit abgeschätzt werden. Aus den 2D-DQF-
COSY-Spektren und den 1H-1D-Spektren wurden die Kopplungskonstanten extrahiert.
Die Bestimmung der D2O/H2O Austauschraten erfolgt wie für das Azo-PDI
beschrieben.
Die Translationsdiffusionskonstante des Moleküls wurde bei 300 K mit den
Standardspektren von XWINNMR unter Verwendung einer Diffusionverzögerung von
200 ms bestimmt. Die Diffusionskonstante wurde mit der bekannten Diffusion von
H2O in D2O bei 300 K von 18,7 × 10-10 m2 s-1 kalibriert.
Strukturrechnungen
Die Strukturrechnungen erfolgten wie für die C-terminale Domäne beschrieben.
Abweichend wurde das AMBER Kraftfeld (Weiner et al., 1986) für die Rechnungen
verwendet.
Oxidative Rückfaltung
Eine wässrige 1 mM Hellethionin D Lösung (500 µl) wurde durch Zugabe von 14
Äquivalenten Tris(2-carboxyethyl)phosphin quantitativ reduziert. Der Fortschritt der
Reaktion wurde durch 1H-1D-Spektren verfolgt und war nach 24 h bei 50 °C
abgeschlossen. Von verdünnten Lösungen (50 µM) wurden CD-Spektren vor und nach
der Reduktion aufgenommen. Für die Rückfaltungsexperimente wurde das
überschüssige Phosphin durch Gelchromatographie an einer NAP-5 Säule (Pharmacia,
Erlangen) entfernt und das Peptid mit 50 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,2) eluiert. Die
Rückfaltung der 0,5 mM reduzierten Proteinlösung erfolgte über Nacht bei 37 °C in 50
mM Tris-HCl Puffer an der Luft. Alternative erfolgte die Rückfaltung unter
115
Material und Methoden
identischen Bedingungen aber in Gegenwart von Glutathion mit einem
GSSG:GSH:Peptid-Verhältnis von 100:10:1. 1H-1D-NMR Spektren dienten zur
Bestimmung der Ausbeute, wobei die Spektren mit denen des gefalteten und
entfalteten Peptids verglichen wurden. Die Ausbeute wurde aus den Signalintensitäten
der HPLC (SystemI) Elutionsprofile bestimmt.
Proteasominhibitoren
TMC 416
NMR-Spektroskopie
Die NMR-Messungen wurden mit einer 2 mM Probe in 500 µl d6-DMSO
durchgeführt. Für die Strukturbestimmung wurden TOCSY-Spektren mit 75 ms
Mischzeit und einer MLEV Mischsequenz, DQF-COSY-Spektren, ROESY-Spektren
mit einer Mischzeit von 200 ms und 1D-Spektren mit Vorsättigung bei 295 K
aufgenommen.
Strukturrechnung
Die Strukturrechnung erfolgte wie für das Azo-PDI beschrieben. Das Lösungsmittel
DMSO wurde mit einer Dielektrizitätskonstante von 46,7 simuliert.
BIA 49
Die NMR-Messungen wurden mit einer 3 mM Probe in 300 µl d6-DMSO
durchgeführt. Aufnahme der NMR-Spektren und Strukturrechnung erfolgten wie unter
TMC 416 beschrieben.
116
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8. Anhang A: Resonanzlisten
Tabelle 11: Protonenresonanzfrequenzen des trans-bcAMPB in DMSO bei 295K in ppm
AS NH Hα Hβ Hγ andere Ala 1 8,86 4,49 1,32 Cys 2 7,48 4,57 3,28;
2,85
Ala 3 8,87 4,09 1,34 Thr 4 7,14 4,14 4,25 0,96 Cys 5 7,03 4,42 2,85 Asp 6 8,12 4,51 2,43 Gly 7 7,89 3,66;
3,46
Phe 8 8,31 4,45 2,95; 2,77
H�/H�/H� 7,22; 7,17
AMPB HN 8,71, HM1/HM2 4,53; 3,96, H2/H6 7,92, H3/H5 8,04, H8/H12 7,83, H9/H11 7,47
Tabelle 12: Protonenresonanzfrequenzen des cis-bcAMPBs in DMSO bei 295 K in ppm
AS NH Hα Hβ Hγ andere Ala 1 8,75 4,56 1,36 Cys 2 8,24 4,59 3,22;
3,13
Ala 3 8,96 4,16 1,41 Thr 4 7,24 4,26 4,17 1,05 Cys 5 7,11 4,59 3,13 Asp 6 8,44 4,55 2,73;
2,56
Gly 7 8,09 3,60; 3,82
Phe 8 8,17 4,57 3,07; 2,90
Hδ/Hε/Hζ 7,29
AMPB HN 8,59, HM1/HM2 4,31; 4,26, H2/H6 7,02, H3/H5 7,90, H8/H12 6,87, H9/H11 7,06
Tabelle 13: Protonenresonanzfrequenzen des trans-Azo-[Ser2, Ser5]-PDI in Wasser bei 283 K in ppm
AS NH Hα Hβ Hγ andere Lys 1 8,76 4,19 1,71 1,31 Hε 2,73 Ser 2 8,26 4,19 3,64 Gly 3 8,19 3,86
3,50
His 4 7,91 4,36 2,85; 2,75
Hδ 6,83, Hε 8,20
Ser 5 8,23 3,96 3,47; 3,41
126
Anhang A: Resonanzlisten
Lys 6 8,10 3,96 1,13 0,98; 0,89
Hε 2,52
Lys 7 7,79 3,92 1,38; 1,24
0,98 Hε 2,55
Lys 8 8,03 4,00 1,56; 1,50
Hε 2,71
AMPB HN 8,49, HM1/HM2 4,31; 4,08, H2/H6 7,60, H3/H5 7,89, H8/H12 7,64, H9/H11 7,22
Tabelle 14: Protonenresonanzfrequenzen des cis-Azo-[Ser2, Ser5]-PDI in Wasser bei 288 K in ppm
AS NH Hα Hβ Hγ andere Lys 1 8,64 4,31 1,73;
1,67 1,29 Hδ 1,48, Hε 2,78
Ser 2 8,29 4,26 3,65 Gly 3 8,40 3,80;
3,66
His 4 8,44 4,51 3,13; 2,95
Hδ 7,06, Hε 8,38
Ser 5 8,07 4,27 3,66; 3,57
Lys 6 8,34 4,07 1,65; 1,52
1,23 Hδ 1,44, Hε 2,76
Lys 7 7,89 4,01 1,43, 1,33
1,03 Hδ 1,30, Hε 2,61
Lys 8 8,14 3,97 1,55 1,18 Hδ 1,43, Hε 2,75 AMPB HN 8,28, HM1/HM2 4,19; 4,11, H2/H6 6,85, H3/H5 7,54, H8/H12 6,75,
H9/H11 7,01
Tabelle 15: Protonenresonanzfrequenzen des trans-Azo-PDI in Wasser bei 283K in ppm
AS NH Hα Hβ Hγ andere Lys 1 8,9 4,2 1,70 1,28 Hδ 1,50; Hε 2,77 Cys 2 7,7 4,5 3,28;
2,70
Gly 3 8,5 3,6; 3,5
His 4 8,4 4,5 3,11; 2,93
Hδ 7,04; Hε 8,35
Cys 5 7,4 4,3 2,81; 2,74
Lys 6 8,2 3,9 1,33 0,95 Hδ 1,33, Hε 2,65 Lys 7 7,8 3,9 0,79 0,62;
0,53 Hδ 0,96; 0,89, Hε 2,13
Lys 8 7,9 3,9 1,52; 1,43
1,10 Hε 2,73
AMPB HN 8,47, HM1/HM2 4,23; 4,10, H2/H6 7,70, H3/H5 7,81, H8/H12 7,68, H9/H11 7,30
127
Anhang A: Resonanzlisten
Tabelle 16: Protonenresonanzfrequenzen des cis-Azo-PDI in Wasser bei 283 K in ppm
AS NH Hα Hβ Hγ andere Lys 1 8,47 4,10 1,52;
1,41 1,06;
1,00 Hδ 1,26; Hε 2,54
Cys 2 8,00 4,32 2,87; 2,78
Gly 3 8,54 3,48; 3,40
His 4 8,24 4,36 2,94; 2,79
Cys 5 7,52 4,22 2,80; 2,59
Lys 6 8,18 3,75 1,41; 1,34
1,06; 0,98
Hδ 1,26; Hε 2,57
Lys 7 7,65 3,82 1,29; 1,23
0,88; 0,79
Hδ 1,11; Hε 2,44
Lys 8 7,97 3,81 1,30 0,92 Hδ 1,20; Hε 2,44 AMPB HN 8,10, HM1/HM2 3,94, H2/H6 6,64, H3/H5 7,31, H8/H12 6,54, H9/H11
6,80
Tabelle 17: Protonenresonanzfrequenzen des trans-Azo-NonaTRR in Wasser bei 283 K in ppm
AS HN Hα Hβ Hγ andere Lys 1 8,94 4,31 1,81;
1,71 1,35;
1,38 Hδ 1,49, Hε 2,75
Cys 2 7,50 4,77 3,11 Ala 3 8,87 3,98 1,28 Thr 4 7,60 4,27 4,25 0,89 Cys 5 7,23 3,93 2,60;
1,75
Asp 6 7,96 4,22 2,58 Lys 7 7,26 3,97 1,27;
0,86 0,76 Hδ 1,15, Hε 2,57
Lys 8 7,75 3,89 1,42; 1,30
0,95 Hδ 1,29, Hε 2,75
Lys 9 7,81 4,11 1,57; 1,47
1,20; 1,15
Hδ 1,42, Hε 2,75
AMPB HN 8,55, HM1/HM2 4,20; 4,10, H2/H6 7,74, H3/H5 7,84, H8/H12 7,72, H9/H11 7,23
Tabelle 18: Protonenresonanzfrequenzen der C-terminalen Domäne in Wasser bei 283 K in ppm
AS NH Hα Hβ Hγ andere PRO 1 4,22 2,04;
1,67 1,75 Hδ 3,39
Cys 2 8,63 4,70 2,65; 2,47
128
Anhang A: Resonanzlisten
Pro 3 4,52 2,27; 1,78
1,87 Hδ 3,92; 3,41
Pro 4 4,01 2,14; 1,75
1,84 Hδ 3,66
Val 5 7,71 3,86 2,02 0,81; 0,71
Cys 6 7,52 4,49 2,93; 2,59
Val 7 7,08 3,53 1,84 0,78; 0,73
Ala 8 7,81 4,02 1,25 Gln 9 7,85 4,09 1,72 2,04;
1,92
Cys 10 8,59 4,67 2,97; 2,72
Val 11 7,16 4,36 2,22 0,71; 0,64
Pro 12 4,13 2,17; 1,69
1,74 Hδ 3,62; 3,54
Thr 13 6,84 3,93 4,20 Cys 14 7,91 4,38 2,96;
2,39
Pro 15 4,07 1,82; 0,81
1,76 Hd 3,92; 3,23
Gln 16 8,82 3,67 1,85 2,18 Tyr 17 6,81 4,28 3,11;
2,68 Hδ 6,77; Hε 6,59
Cys 18 7,37 4,29 2,97; 2,62
Cys 19 7,28 4,64 3,14; 2,96
Pro 20 4,11 2,07; 1,67
1,76 Hδ 3,69; 3,42
Ala 21 8,22 4,60 1,14 Lys 22 8,11 4,04 n.a. Hε 2,75 Arg 23 8,13 4,06 1,60;
1,54 1,39 Hδ 2,95; Hε 6,96; Hζ 6,67;
6,24 Lys 24 8,26 4,60 1,53 1,20 Hδ 1,43 Hε 2,75; Hζ 7,34
Tabelle 19: Protonenresonanzfrequenzen der N-terminalen Domäne in Wasser bei 283 K in ppm
AS NH Hα Hβ Hγ andere Pro 1 4,23 2,26; 1,77 1,97 Hδ 3,55 Cys 2 8,51 5,02 3,27; 2,24 Gly 3 7,83 4,23;
3,73
Ser 4 8,60 3,95 3,36; 3,20 Tyr 5 8,13 4,52 3,16; 2,70 Hδ 6,95; Hε 6,68 Cys 6 7,06 4,78 3,06; 2,43
129
Anhang A: Resonanzlisten
Pro 7 4,22 2,28; 1,98 2,01 Hδ 3,98; 3,83 Ser 8 8,67 3,79 3,82 Val 9 7,58 4,01 2,15 0,82 Cys 10 7,53 4,61 2,20; 1,84 Ala 11 7,78 3,96 1,32 Pro 12 4,31 2,20; 1,84 2,03;172 Hδ 3,66; 3,30 Ala 13 8,71 4,01 1,40 Cys 14 8,56 3,56 2,99; 2,86 Ala 15 9,34 4,35 1,29 Pro 16 4,10 2,34 2,10 H� 3,83; 3,78 Val 17 7,63 3,86 1,98 0,84; 0,76 Cys 18 7,29 4,24 3,26; 2,81 Cys 19 8,23 4,40 2,39 Tyr 20 8,19 4,89 2,89; 2,81 Hδ 7,05; Hε 6,66 Pro 21 4,29 1,83 2,20 Hδ 3,43
Tabelle 20: Protonenresonanzfrequenzen des trans-rgd1 in Wasser bei 303 K in ppm
AS NH Hα Hβ Hγ andere Lys 1 8,8 4,49 1,96;
1,94 1,59 Hδ 1,77; Hε 3,02
Ala 2 8,03 4,50 1,35 Arg 3 7,88 4,07 1,65;
1,57 1,43; 1,29 Hδ 2,97 Hε 6,97
Gly 4 7,59 3,97; 3,43
Asp 5 8,08 4,42 2,55 d-Phe 6 7,98 4,41 2,88;
2,47 Hδ/Hε/Hζ 7,14
Val 7 7,98 3,91 1,96 0,89; 0,78 AMPB HN 8,70, HM1/HM2 4,52; 4,37, H2/H6 7,75 H3/H5 7,97, H8/H12 7,86,
H9/H11 7,50
Tabelle 21: Protonenresonanzfrequenzen des cis- rgd1 in Wasser bei 303 K in ppm
AS NH Hα Hβ Hγ andere Lys 1 8,56 4,34 1,91 1,50 Hδ 1,72, Hε 3,01 Ala 2 8,37 4,29 1,38 Arg 3 8,11 4,31 1,87; 1,71 1,50 Hδ 3,02, Hε 7,12 Gly 4 8,25 3,92;
3,86
Asp 5 8,20 4,57 2,67 d-Phe 6 8,09 4,55 3,06; 2,99 Hδ/Hε/Hζ 7,33 Val 7 7,80 3,96 1,99 0,74; 0,69 AMPB HN 8,52, HM1/HM2 4,37; 4,31, H2/H6 6,99, H3/H5 7,69, H8/H12 6,93,
H9/H11 7,25
Tabelle 22: Protonenresonanzfrequenzen des tmc416 in DMSO bei 295 K in ppm
130
Anhang A: Resonanzlisten
AS NH Hα Hβ Hγ andere Tyr 1 5,96 4,49 3,09; 2,96 Hδ 7,12, Hδ/Hε 6,95 Leu 2 8,75 4,23 1,59; 1,52 1,72 Hδ 0,87 Trp 3 8,20 3,86 2,49; 2,41 3,60 Hδ 7,12, Hε 6,95 NLeu 4 7,05 4,17 1,59; 1,45 1,18 Hδ 0,86 NH2 7,38
Tabelle 23: Protonenresonanzfrequenzen des bia49 in DMSO bei 295 K in ppm
AS NH Hα Hβ Hγ andere Phe 1 6,24 4,44 3,08; 2,78 Hδ 6,01; 6,66, Hε 7,81 Asn 2 8,26 4,53 2,43 Tyr 3 8,21 4,46 3,24; 2,55 Hδ 7,41; 7,30, Hε 7,09;
6,82 AP 4 8,10 3,08 1,47 0,86
Tabelle 24 Temperaturverschiebung von NH Protonen der C-terminalen Domäne, deren Temperaturverschiebung positiver als -4,5 bbp K-1 ist.
AS Temperaturverschiebung der NH Resonanz in ppb K-1
Cys 6 -3 Val 7 -3 Gln 9 -2,4 Val 11 -4,2 Thr 13 -1,7 Cys 14 -1,4 Cys 18 -1,0 Cys 19 -3,5
Tabelle 25: Temperaturverschiebung von NH Protonen der N-terminalen Domäne, deren Temperaturverschiebung positiver als -4,5 bbp K-1 ist.
AS Temperaturverschiebung der NH Resonanz in ppb K-1
Cys 6 -2,9 Glu 9 -2,4 Thr 13 -1,6 Cys 14 -1,3 Cys 18 -1,5 Cys 19 -3,5
131
9. Anhang B: NMR-Randbedingungen
trans -bcAMPB !BIOSYM restraint 1 #NOE_distance !Peaks aus dem 750MHz roesy !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:BENZ_1F:H2,H4 1:ALA_1:HN 1 5.5 2.3 50 50 1000 1:CYS_2:HN 1:ALA_1:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ALA_1:HA 1:CYS_2:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:ALA_1:HB* 1:CYS_2:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:CYS_2:HB2 1:CYS_2:HA 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:CYS_2:HB1 1:CYS_2:HA 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:CYS_2:HB2 1:CYS_2:HN 1 4 4 50 50 1000 1:CYS_2:HB1 1:CYS_2:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:CYS_2:HA 1:ALA_3:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:CYS_2:HB2 1:ALA_3:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:THR_4:HN 1:ALA_3:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:CYS_5:HN 1:THR_4:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ALA_3:HA 1:THR_4:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:CYS_2:HB2 1:THR_4:HN 1 4 4 50 50 1000 1:ALA_3:HB* 1:THR_4:HN 1 3.9 2.8 50 50 1000 1:ALA_3:HA 1:CYS_5:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:THR_4:HA 1:CYS_5:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:THR_4:HB 1:CYS_5:HN 1 4 4 50 50 1000 !1:ASP_6:HN 1:CYS_5:HN 1 4.9 4.9 50 50 1000 1:CYS_5:HA 1:ASP_6:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:CYS_5:HB2 1:ASP_6:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:CYS_5:HB1 1:ASP_6:HN 1 4.9 4.9 50 50 1000 1:ASP_6:HA 1:GLY_7:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:CYS_5:HA 1:GLY_7:HN 1 4 4 50 50 1000 1:ASP_6:HB* 1:GLY_7:HN 1 5.8 4.9 50 50 1000 1:GLY_7:HA1 1:GLY_7:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:GLY_7:HA2 1:GLY_7:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:GLY_7:HA1 1:PHE_8:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:GLY_7:HA2 1:PHE_8:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:PHE_8:HB1 1:PHE_8:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:PHE_8:HB2 1:PHE_8:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:PHE_8:HA 1:AMDE_1B:H1 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:PHE_8:HB2 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:AMDE_1B:H1 1:BENZ_1D:H5,H1 1 5 2.8 50 50 1000 1:METH_1C:H1* 1:BENZ_1D:H5,H1 1 5.9 2.8 50 50 1000 1:ASP_6:HA 1:BENZ_1D:H2,H4 1 6.2 4 50 50 1000 1:CYS_5:HB2 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7 4.8 50 50 1000 1:ALA_1:HA 1:BENZ_1F:H2,H4 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:ALA_1:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.3 4 50 50 1000 1:CYS_5:HB2 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.2 4.0 50 50 1000 !1:CYS_5:HB1 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7 4.8 50 50 1000 !1:CYS_2:HB1 1:BENZ_1F:H2,H4 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:CYS_2:HB2 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7 4.8 50 50 1000 1:CYS_5:HB2 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7 4.8 50 50 1000 #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:THR_4:HN 1:THR_4:N 1:THR_4:CA 1:THR_4:HA 9.30 0.50 50.00 50.00 500.000 152.0 -152.0 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:CYS_5:HN 1:CYS_5:N 1:CYS_5:CA 1:CYS_5:HA 7.50 0.50 50.00 50.00 500.000 134.5 163.2 -163.2 -134.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ASP_6:HN 1:ASP_6:N 1:ASP_6:CA 1:ASP_6:HA 8.20 0.50 50.00 50.00 500.000 140.4 170.8 -170.8 -140.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:GLY_7:HN 1:GLY_7:N 1:GLY_7:CA 1:GLY_7:HA1 4.70 1.00 50.00 50.00 500.000 16.5 57.3 109.0 144.5 -144.5 -109.0 -57.3 -16.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:GLY_7:HN 1:GLY_7:N 1:GLY_7:CA 1:GLY_7:HA2 4.70 1.00 50.00 50.00 500.000 16.5 57.3 109.0 144.5 -144.5 -109.0 -57.3 -16.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:PHE_8:HN 1:PHE_8:N 1:PHE_8:CA 1:PHE_8:HA 8.20 0.50 50.00 50.00 500.000 140.4 170.8 -170.8 -140.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500
132
Anhang B: NMR-Randbedingungen
1:AMDE_1B:H1 1:AMDE_1B:N1 1:METH_1C:C1 1:METH_1C:H12 5.80 0.50 50.00 50.00 500.000 8.4 41.1 121.5 149.0 -149.0 -121.5 -41.1 -8.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:AMDE_1B:H1 1:AMDE_1B:N1 1:METH_1C:C1 1:METH_1C:H11 5.80 0.50 50.00 50.00 500.000 8.4 41.1 121.5 149.0 -149.0 -121.5 -41.1 -8.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500
cis-bcAMPB !BIOSYM restraint 1 ! #remote_prochiral_center ! #NOE_distance 1:BENZ_1F:H2,H4 1:ALA_1:HN 1.000 4.400 2.200 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:CYS_2:HN 1:ALA_1:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:ALA_1:HA 1:CYS_2:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:ALA_1:HB* 1:CYS_2:HN 1.000 4.500 3.400 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:CYS_2:HA 1:ALA_3:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:CYS_2:HB* 1:ALA_3:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:THR_4:HN 1:ALA_3:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:ALA_3:HB* 1:THR_4:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:CYS_5:HN 1:THR_4:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:THR_4:HA 1:CYS_5:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:THR_4:HB 1:CYS_5:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:THR_4:HG2* 1:CYS_5:HN 1.000 5.900 4.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:CYS_5:HA 1:ASP_6:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:CYS_5:HB* 1:ASP_6:HN 1.000 3.700 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:THR_4:HN 1:ASP_6:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:GLY_7:HN 1:ASP_6:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:ASP_6:HA 1:GLY_7:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:ASP_6:HB* 1:GLY_7:HN 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:CYS_5:HB* 1:GLY_7:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:GLY_7:HA* 1:PHE_8:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:PHE_8:HA 1:AMDE_1B:H1 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:PHE_8:HB* 1:AMDE_1B:H1 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:BENZ_1D:H1,H5 1:AMDE_1B:H1 1.000 5.600 3.400 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:METH_1C:H1* 1:BENZ_1D:H1,H5 1.000 5.400 2.300 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:PHE_8:HB* 1:BENZ_1D:H1,H5 1.000 7.100 4.000 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:PHE_8:HA 1:BENZ_1D:H1,H5 1.000 6.200 4.000 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:ALA_1:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1.000 6.500 3.400 50.00 50.00 1000.000 0.00 1:ALA_1:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1.000 8.200 4.900 50.00 50.00 1000.000 0.00 ! #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:ALA_1:HN 1:ALA_1:N 1:ALA_1:CA 1:ALA_1:HA 7.50 0.50 50.00 50.00 500.000 134.5 163.2 -163.2 -134.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:CYS_2:HN 1:CYS_2:N 1:CYS_2:CA 1:CYS_2:HA 7.30 0.50 50.00 50.00 500.000 132.9 161.3 -161.3 -132.9 -17.4 17.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ALA_3:HN 1:ALA_3:N 1:ALA_3:CA 1:ALA_3:HA 5.20 0.50 50.00 50.00 500.000 16.5 47.4 116.9 144.5 -144.5 -116.9 -47.4 -16.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:CYS_5:HN 1:CYS_5:N 1:CYS_5:CA 1:CYS_5:HA 7.50 1.00 50.00 50.00 500.000 130.6 168.4 -168.4 -130.6 -24.9 24.9 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ASP_6:HN 1:ASP_6:N 1:ASP_6:CA 1:ASP_6:HA 7.80 0.50 50.00 50.00 500.000 137.0 166.2 -166.2 -137.0 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:GLY_7:HN 1:GLY_7:N 1:GLY_7:CA 1:GLY_7:HA1 5.60 0.50 50.00 50.00 500.000 11.4 43.2 120.0 147.5 -147.5 -120.0 -43.2 -11.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:GLY_7:HN 1:GLY_7:N 1:GLY_7:CA 1:GLY_7:HA2 5.60 0.50 50.00 50.00 500.000 11.4 43.2 120.0 147.5 -147.5 -120.0 -43.2 -11.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:PHE_8:HN 1:PHE_8:N 1:PHE_8:CA 1:PHE_8:HA 8.00 0.50 50.00 50.00 500.000 138.7 168.4 -168.4 -138.7 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:AMDE_1B:H1 1:AMDE_1B:N1 1:METH_1C:C1 1:METH_1C:H12 5.80 0.50 50.00 50.00 500.000 8.4 41.1 121.5 149.0 -149.0 -121.5 -41.1 -8.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:AMDE_1B:H1 1:AMDE_1B:N1 1:METH_1C:C1 1:METH_1C:H11 5.80 0.50 50.00 50.00 500.000 8.4 41.1 121.5 149.0 -149.0 -121.5 -41.1 -8.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500
Azo-[Ser2, Ser5]-PDI
133!BIOSYM restraint 1
Anhang B: NMR-Randbedingungen
#NOE_distance !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:BENZ_1F:H1,H5 1:LYS+_1:HN 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:BENZ_1F:H2,H4 1:LYS+_1:HN 1 4.5 2.3 50 50 1000 1:SER_2:HN 1:LYS+_1:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:LYS+_1:HN 1 4.9 4.0 50 50 1000 1:LYS+_1:HA 1:SER_2:HN 1 4.0 4.0 50 50 1000 1:LYS+_1:HB* 1:SER_2:HN 1 3.7 2.8 50 50 1000 1:LYS+_1:HG* 1:SER_2:HN 1 4.9 4.0 50 50 1000 1:BENZ_1F:H2,H4 1:SER_2:HN 1 6.2 4.0 50 50 1000 1:SER_2:HA 1:GLY_3:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:SER_2:HB* 1:GLY_3:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:BENZ_1F:H2,H4 1:GLY_3:HN 1 7.0 4.8 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:HIS+_4:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:SER_2:HA 1:HIS+_4:HN 1 4.0 4.0 50 50 1000 1:SER_2:HB* 1:HIS+_4:HN 1 4.9 4.0 50 50 1000 1:GLY_3:HN 1:HIS+_4:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:SER_5:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:SER_5:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:HIS+_4:HN 1:SER_5:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:LYS+_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_6:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:LYS+_6:HA 1:LYS+_7:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:LYS+_7:HN 1 4.9 4.0 50 50 1000 1:LYS+_8:HN 1:LYS+_7:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HA 1:LYS+_8:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:LYS+_8:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_8:HA 1:AMDE_1B:H1 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:LYS+_8:HB* 1:AMDE_1B:H1 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_8:HN 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:LYS+_6:HB* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_8:HA 1:BENZ_1D:H1,H5 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_6:HA 1:BENZ_1D:H2,H4 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:SER_5:HA 1:BENZ_1F:H1,H5 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.0 4.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_1:HN 1:BENZ_1F:H1,H5 1 5.0 2.8 50 50 1000 1:LYS+_1:HN 1:BENZ_1F:H2,H4 1 4.5 2.3 50 50 1000 1:LYS+_1:HA 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.2 4.0 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.2 4.0 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.1 4.0 50 50 1000 ! #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:LYS+_1:HN 1:LYS+_1:N 1:LYS+_1:CA 1:LYS+_1:HA 5.65 0.50 50.00 50.00 500.000 -180.0 180.0 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:SER_2:HN 1:SER_2:N 1:SER_2:CA 1:SER_2:HA 6.26 0.50 50.00 50.00 500.000 84.9 -84.9 -75.8 75.8 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:HIS+_4:HN 1:HIS+_4:N 1:HIS+_4:CA 1:HIS+_4:HA 6.71 0.50 50.00 50.00 500.000 88.3 -88.3 -69.8 69.8 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:SER_5:HN 1:SER_5:N 1:SER_5:CA 1:SER_5:HA 6.41 0.50 50.00 50.00 500.000 86.1 -86.1 -73.9 73.9 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_6:HN 1:LYS+_6:N 1:LYS+_6:CA 1:LYS+_6:HA 7.48 0.50 50.00 50.00 500.000 94.3 -94.3 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_7:N 1:LYS+_7:CA 1:LYS+_7:HA 6.41 1.00 50.00 50.00 500.000 82.3 -82.3 -79.9 79.9 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_8:HN 1:LYS+_8:N 1:LYS+_8:CA 1:LYS+_8:HA 6.71 1.00 50.00 50.00 500.000 84.6 -84.6 -76.4 76.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500
cis-Azo-[Ser2, Ser5]-PDI !BIOSYM restraint 1 #NOE_distance !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:BENZ_1F:H2,H4 1:LYS+_1:HN 1 4.5 2.3 50 50 1000
134
Anhang B: NMR-Randbedingungen
1:SER_2:HN 1:LYS+_1:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:LYS+_1:HN 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:LYS+_1:HA 1:SER_2:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:LYS+_1:HB* 1:SER_2:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_1:HG* 1:SER_2:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_1:HE* 1:SER_2:HN 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:SER_2:HA 1:GLY_3:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:SER_2:HN 1:GLY_3:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:HIS+_4:HN 1 3.7 2.8 50 50 1000 1:SER_2:HA 1:HIS+_4:HN 1 4.0 4.0 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:SER_5:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:SER_5:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:HIS+_4:HN 1:SER_5:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:SER_5:HN 1 4.9 4.0 50 50 1000 1:LYS+_6:HN 1:SER_5:HN 1 4.0 4.0 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:LYS+_6:HN 1 4.8 4.8 50 50 1000 1:SER_5:HA 1:LYS+_6:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:LYS+_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_6:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:LYS+_6:HA 1:LYS+_7:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:LYS+_6:HB* 1:LYS+_7:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_6:HG* 1:LYS+_7:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:LYS+_7:HN 1 4.9 4.0 50 50 1000 1:LYS+_8:HN 1:LYS+_7:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HA 1:LYS+_8:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:LYS+_8:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:LYS+_8:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:BENZ_1D:H1,H5 1:LYS+_8:HN 1 6.2 4.0 50 50 1000 1:LYS+_8:HA 1:AMDE_1B:H1 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:LYS+_8:HB* 1:AMDE_1B:H1 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_8:HN 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:BENZ_1D:H1,H5 1:AMDE_1B:H1 1 5 2.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HE* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:LYS+_8:HA 1:BENZ_1D:H1,H5 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HE* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:LYS+_8:HA 1:BENZ_1D:H2,H4 1 6.2 4.0 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:SER_5:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4.0 50 50 1000 ! #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:LYS+_1:HN 1:LYS+_1:N 1:LYS+_1:CA 1:LYS+_1:HA 6.56 0.50 50.00 50.00 500.000 87.2 -87.2 -71.9 71.9 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:HIS+_4:HN 1:HIS+_4:N 1:HIS+_4:CA 1:HIS+_4:HA 7.48 0.50 50.00 50.00 500.000 94.3 -94.3 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:SER_5:HN 1:SER_5:N 1:SER_5:CA 1:SER_5:HA 7.17 0.50 50.00 50.00 500.000 91.9 -91.9 -61.2 61.2 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_6:HN 1:LYS+_6:N 1:LYS+_6:CA 1:LYS+_6:HA 6.87 0.50 50.00 50.00 500.000 89.6 -89.6 -67.2 67.2 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_7:N 1:LYS+_7:CA 1:LYS+_7:HA 6.71 1.00 50.00 50.00 500.000 84.6 -84.6 -76.4 76.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_8:HN 1:LYS+_8:N 1:LYS+_8:CA 1:LYS+_8:HA 6.56 1.00 50.00 50.00 500.000 83.4 -83.4 -78.2 78.2 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500
trans-Azo-PDI !BIOSYM restraint 1 #NOE_distance !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:BENZ_1D:H1,H5 1:AMDE_1B:H1 0 5 2.8 50 50 1000 1:LYS+_1:HA 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.2 4 50 50 1000 1:LYS+_1:HA 1:CYS_2:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000
135
Anhang B: NMR-Randbedingungen
1:LYS+_1:HN 1:BENZ_1F:H2,H4 1 4.5 2.3 50 50 1000 1:METH_1C:H12,H11 1:BENZ_1D:H1,H5 1 4.5 2.3 50 50 1000 1:CYS_2:HA 1:GLY_3:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:CYS_2:HA 1:HIS+_4:HN 1 4 4 50 50 1000 1:CYS_2:HB* 1:GLY_3:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:CYS_2:HB* 1:HIS+_4:HN 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:CYS_2:HB* 1:CYS_5:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:CYS_2:HN 1:LYS+_1:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:CYS_2:HN 1:GLY_3:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:HIS+_4:HD2 1 4.9 4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:HIS+_4:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:CYS_5:HN 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:CYS_5:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:LYS+_6:HN 1 4 4 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:HIS+_4:HD2 1 3.7 2.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:HIS+_4:HE1 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:CYS_5:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:HIS+_4:HN 1:HIS+_4:HD2 1 4 4 50 50 1000 1:CYS_5:HA 1:HIS+_4:HD2 1 4.8 4.8 50 50 1000 1:CYS_5:HA 1:LYS+_6:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:CYS_5:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4 50 50 1000 1:CYS_5:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:CYS_5:HB* 1:CYS_2:HB* 1 5.8 4 50 50 1000 1:CYS_5:HB* 1:LYS+_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:CYS_5:HN 1:HIS+_4:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:CYS_5:HN 1:LYS+_6:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:LYS+_6:HB* 1:LYS+_7:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:LYS+_6:HG* 1:LYS+_7:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:AMDE_1B:H1 1 4.9 4 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:LYS+_7:HB* 1:LYS+_8:HN 1 3.7 2.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HD* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:LYS+_7:HD* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4 50 50 1000 1:LYS+_7:HD* 1:LYS+_8:HN 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HE* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HE* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4 50 50 1000 1:LYS+_7:HE* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HG* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HN 1:CYS_5:HN 1 4 4 50 50 1000 1:LYS+_8:HB* 1:AMDE_1B:H1 1 4.9 4 50 50 1000 1:LYS+_8:HB* 1:AMDE_1B:H1 1 4.9 4 50 50 1000 1:LYS+_8:HN 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000 !BIOSYM restraint 1 ! #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:LYS+_1:HN 1:LYS+_1:N 1:LYS+_1:CA 1:LYS+_1:HA 6.40 1.00 50.00 50.00 500.000 127.2 152.8 -152.8 -127.2 -35.0 35.0 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:GLY_3:HN 1:GLY_3:N 1:GLY_3:CA 1:GLY_3:HA1 5.50 1.00 50.00 50.00 500.000 9.9 44.4 120.4 145.6 -145.6 -120.4 -44.4 -9.9 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:GLY_3:HN 1:GLY_3:N 1:GLY_3:CA 1:GLY_3:HA2 5.50 1.00 50.00 50.00 500.000 9.9 44.4 120.4 145.6 -145.6 -120.4 -44.4 -9.9 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:HIS+_4:HN 1:HIS+_4:N 1:HIS+_4:CA 1:HIS+_4:HA 8.00 1.00 50.00 50.00 500.000 139.5 169.9 -169.9 -139.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:CYS_5:HN 1:CYS_5:N 1:CYS_5:CA 1:CYS_5:HA 6.00 1.00 50.00 50.00 500.000 124.2 149.5 -149.5 -124.2 -39.3 39.3 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_6:HN 1:LYS+_6:N 1:LYS+_6:CA 1:LYS+_6:HA 7.00 1.00 50.00 50.00 500.000 131.7 158.2 -158.2 -131.7 -27.7 27.7 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_7:N 1:LYS+_7:CA 1:LYS+_7:HA 8.50 1.00 50.00 50.00 500.000 143.7 -143.7 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_8:HN 1:LYS+_8:N 1:LYS+_8:CA 1:LYS+_8:HA 7.30 0.50 50.00 50.00 500.000 137.9 156.3 -156.3 -137.9 -12.4 12.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500
cis-Azo-PDI !BIOSYM restraint 1 !
136
Anhang B: NMR-Randbedingungen
#remote_prochiral_center ! #NOE_distance !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:LYS+_8:HA 1:AMDE_1B:H1 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:METH_1C:H11,H12 1:BENZ_1D:H1,H5 0 5 2.8 50 50 1000 1:CYS_5:HA 1:BENZ_1D:H1,H5 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:BENZ_1F:H2,H4 1:LYS+_1:HN 1 4.5 2.3 50 50 1000 1:CYS_2:HN 1:LYS+_1:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:METH_1C:H11,H12 1:BENZ_1F:H2,H4 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:LYS+_1:HA 1:CYS_2:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:LYS+_1:HB* 1:CYS_2:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:CYS_2:HA 1:GLY_3:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:CYS_2:HN 1:GLY_3:HN 1 4 4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:HIS+_4:HD2 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:HIS+_4:HD2 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:HIS+_4:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:GLY_3:HN 1:HIS+_4:HN 1 4 4 50 50 1000 1:CYS_5:HN 1:HIS+_4:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:CYS_2:HB* 1:CYS_5:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:GLY_3:HA* 1:CYS_5:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:HIS+_4:HA 1:CYS_5:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:HIS+_4:HB* 1:CYS_5:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:CYS_5:HA 1:LYS+_6:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:CYS_5:HB* 1:LYS+_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:CYS_5:HN 1:LYS+_6:HN 1 4 4 50 50 1000 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_6:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:CYS_5:HA 1:LYS+_7:HN 1 4.8 4.8 50 50 1000 1:CYS_5:HB* 1:LYS+_7:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:LYS+_6:HA 1:LYS+_7:HN 1 2.8 2.8 50 50 1000 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_8:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:LYS+_1:HN 1:LYS+_1:N 1:LYS+_1:CA 1:LYS+_1:HA 7.30 1.00 50.00 50.00 500.000 134.0 161.2 -161.2 -134.0 -23.4 23.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:CYS_2:HN 1:CYS_2:N 1:CYS_2:CA 1:CYS_2:HA 7.00 2.00 50.00 50.00 500.000 124.2 169.9 -169.9 -124.2 -39.3 39.3 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:HIS+_4:HN 1:HIS+_4:N 1:HIS+_4:CA 1:HIS+_4:HA 8.30 1.00 50.00 50.00 500.000 142.0 175.5 -175.5 -142.0 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_7:HN 1:LYS+_7:N 1:LYS+_7:CA 1:LYS+_7:HA 6.00 1.00 50.00 50.00 500.000 124.2 149.5 -149.5 -124.2 -39.3 39.3 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LYS+_8:HN 1:LYS+_8:N 1:LYS+_8:CA 1:LYS+_8:HA 7.00 1.00 50.00 50.00 500.000 131.7 158.2 -158.2 -131.7 -27.7 27.7 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500
trans-RGD1 !BIOSYM restraint 1 ! #NOE_distance !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:BENZ_1F:H1,H5 1:LYS+_1:HN 1 7 4.8 50 50 1000 1:BENZ_1F:H2,H4 1:LYS+_1:HN 1 5.5 2.3 50 50 1000 1:ARG+_3:HN 1:LYS+_1:HN 1 4 4 50 50 1000 1:LYS+_1:HB* 1:ALA_2:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_1:HG* 1:ALA_2:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:ALA_2:HA 1:ARG+_3:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:ALA_2:HB* 1:ARG+_3:HN 1 4.5 3.4 50 50 1000 1:ALA_2:HA 1:GLY_4:HN 1 4.8 4.8 50 50 1000 1:ARG+_3:HA 1:GLY_4:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:ARG+_3:HB* 1:GLY_4:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:ARG+_3:HG* 1:GLY_4:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:ASP_5:HN 1:GLY_4:HN 1 4.8 4.8 50 50 1000 1:PHE_6:HD* 1:GLY_4:HN 1 6 4.8 50 50 1000 1:PHE_6:HE*,HZ 1:GLY_4:HN 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:GLY_4:HA* 1:ASP_5:HN 1 3.2 2.3 50 50 1000 1:PHE_6:HN 1:ASP_5:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ARG+_3:HA 1:PHE_6:HE*,HZ 1 6.2 4.0 50 50 1000 1:GLY_4:HA* 1:PHE_6:HE*,HZ 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:PHE_6:HA 1:PHE_6:HE*,HZ 1 6.2 4.0 50 50 1000 1:PHE_6:HB* 1:PHE_6:HE*,HZ 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:PHE_6:HE*,HZ 1 9.4 4.8 50 50 1000
137
Anhang B: NMR-Randbedingungen
1:GLY_4:HA* 1:PHE_6:HD* 1 7.1 4.0 50 50 1000 1:PHE_6:HA 1:PHE_6:HD* 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:PHE_6:HD* 1 9.4 4.8 50 50 1000 1:GLY_4:HA* 1:PHE_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:ASP_5:HB* 1:PHE_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:PHE_6:HD* 1:PHE_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:PHE_6:HE*,HZ 1:PHE_6:HN 1 6.2 4 50 50 1000 1:PHE_6:HA 1:VAL_7:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:PHE_6:HB* 1:VAL_7:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:PHE_6:HD* 1:VAL_7:HN 1 7 4.8 50 50 1000 1:METH_1C:H1* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 5.4 2.3 50 50 1000 1:PHE_6:HB* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:METH_1C:H1* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:PHE_6:HB* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:ARG+_3:HG* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:GLY_4:HA* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4 50 50 1000 1:PHE_6:HA 1:BENZ_1F:H1,H5 1 6.2 4 50 50 1000 1:PHE_6:HE*,HZ 1:BENZ_1F:H1,H5 1 8.4 4 50 50 1000 1:ARG+_3:HD* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.9 4.8 50 50 1000 1:VAL_7:HA 1:AMDE_1B:H1 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:VAL_7:HB 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:AMDE_1B:H1 1 5.8 3.4 50 50 1000 1:VAL_7:HN 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000! ! #3J_dihedral 1:LYS+_1:HN 1:LYS+_1:N 1:LYS+_1:CA 1:LYS+_1:HA 6.80 0.50 30.00 30.00 1000.000 134.0 152.0 -152.0 -134.0 -23.4 23.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ALA_2:HN 1:ALA_2:N 1:ALA_2:CA 1:ALA_2:HA 8.20 0.50 30.00 30.00 1000.000 145.4 165.8 -165.8 -145.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ARG+_3:HN 1:ARG+_3:N 1:ARG+_3:CA 1:ARG+_3:HA 5.80 1.00 30.00 30.00 1000.000 2.4 41.3 122.7 147.9 -147.9 -122.7 -41.3 -2.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ASP_5:HN 1:ASP_5:N 1:ASP_5:CA 1:ASP_5:HA 6.80 0.50 30.00 30.00 1000.000 134.0 152.0 -152.0 -134.0 -23.4 23.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:PHE_6:HN 1:PHE_6:N 1:PHE_6:CA 1:PHE_6:HA 5.30 1.00 30.00 30.00 1000.000 13.4 46.3 118.8 144.0 -144.0 -118.8 -46.3 -13.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 !
cis-RGD1 !BIOSYM restraint 1 ! #chiral 1:LYS+_1:CA S 1:ALA_2:CA S 1:ARG+_3:CA S 1:ASP_5:CA S 1:PHE_6:CA R 1:VAL_7:CA S ! #NOE_distance !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:VAL_7:HA 1:AMDE_1B:H1 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:VAL_7:HB 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:AMDE_1B:H1 1 6.4 4 50 50 1000 1:VAL_7:HN 1:AMDE_1B:H1 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ALA_2:HN 1:LYS+_1:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:LYS+_1:HA 1:ALA_2:HN 1 4 4 50 50 1000 1:LYS+_1:HB* 1:ALA_2:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:LYS+_1:HG* 1:ALA_2:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:LYS+_1:HD* 1:ALA_2:HN 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:ARG+_3:HN 1:ALA_2:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ALA_2:HB* 1:ARG+_3:HN 1 4.5 3.4 50 50 1000 1:GLY_4:HN 1:ARG+_3:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ARG+_3:HA 1:ARG+_3:HE 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:ARG+_3:HB* 1:ARG+_3:HE 1 5.2 3.4 50 50 1000 1:ALA_2:HB* 1:GLY_4:HN 1 5.9 4.8 50 50 1000 1:ARG+_3:HA 1:GLY_4:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:ARG+_3:HB* 1:GLY_4:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:ARG+_3:HG* 1:GLY_4:HN 1 4.9 4 50 50 1000 1:GLY_4:HA* 1:ASP_5:HN 1 3.2 2.3 50 50 1000 1:ARG+_3:HB* 1:ASP_5:HN 1 5.7 4.8 50 50 1000 1:ARG+_3:HA 1:ASP_5:HN 1 4 4 50 50 1000 1:PHE_6:HN 1:ASP_5:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000
138
Anhang B: NMR-Randbedingungen
!1:ARG+_3:HA 1:PHE_6:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ASP_5:HB* 1:PHE_6:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:VAL_7:HN 1:PHE_6:HN 1 3.4 3.4 50 50 1000 1:ASP_5:HB* 1:PHE_6:HD* 1 7.1 4 50 50 1000 1:PHE_6:HA 1:PHE_6:HD* 1 5 2.8 50 50 1000 1:PHE_6:HB* 1:PHE_6:HD* 1 5.9 2.8 50 50 1000 1:PHE_6:HN 1:PHE_6:HD* 1 5 2.8 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:PHE_6:HD* 1 7.4 2.8 50 50 1000 1:VAL_7:HA 1:PHE_6:HD* 1 7 4.8 50 50 1000 1:VAL_7:HN 1:PHE_6:HD* 1 6.2 4 50 50 1000 1:BENZ_1F:H2,H4 1:PHE_6:HD* 1 8.4 4 50 50 1000 !1:ASP_5:HB* 1:PHE_6:HE*,HZ 1 7.1 4 50 50 1000 1:PHE_6:HA 1:PHE_6:HE*,HZ 1 5.6 3.4 50 50 1000 1:PHE_6:HB* 1:PHE_6:HE*,HZ 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:PHE_6:HN 1:PHE_6:HE*,HZ 1 7 4.8 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:PHE_6:HE*,HZ 1 8 3.4 50 50 1000 1:PHE_6:HA 1:VAL_7:HN 1 2.3 2.3 50 50 1000 1:PHE_6:HB* 1:VAL_7:HN 1 4.3 3.4 50 50 1000 1:PHE_6:HD* 1:VAL_7:HN 1 7 4.8 50 50 1000 1:AMDE_1B:H1 1:BENZ_1D:H1,H5 1 5 2.8 50 50 1000 1:METH_1C:H1* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 5.4 2.3 50 50 1000 !1:PHE_6:HA 1:BENZ_1D:H1,H5 1 6.2 4 50 50 1000 1:ASP_5:HB* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:VAL_7:HA 1:BENZ_1D:H1,H5 1 6.2 4 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 8 3.4 50 50 1000 1:ARG+_3:HG* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.9 4.8 50 50 1000 !1:ARG+_3:HD* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.1 4 50 50 1000 1:METH_1C:H1* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:ASP_5:HB* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:BENZ_1D:H2,H4 1 9.4 4.8 50 50 1000 !1:ASP_5:HA 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7 4.8 50 50 1000 1:ASP_5:HB* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 7.1 4 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:BENZ_1F:H1,H5 1 9.4 4.8 50 50 1000 !1:ARG+_3:HD* 1:BENZ_1D:H1,H5 1 7.1 4 50 50 1000 1:LYS+_1:HN 1:BENZ_1F:H2,H4 1 4.5 2.3 50 50 1000 1:ALA_2:HN 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.2 4 50 50 1000 1:ARG+_3:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 1:ARG+_3:HG* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 6.5 3.4 50 50 1000 !1:ARG+_3:HD* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:GLY_4:HA* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:ASP_5:HB* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 7.1 4 50 50 1000 1:VAL_7:HG* 1:BENZ_1F:H2,H4 1 8.6 4 50 50 1000 !BIOSYM restraint 1 ! #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:LYS+_1:HN 1:LYS+_1:N 1:LYS+_1:CA 1:LYS+_1:HA 5.50 0.50 30.00 30.00 1000.000 12.7 44.3 119.2 146.7 -146.7 -119.2 -44.3 -12.7 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ALA_2:HN 1:ALA_2:N 1:ALA_2:CA 1:ALA_2:HA 6.31 0.50 30.00 30.00 1000.000 125.3 153.0 -153.0 -125.3 -35.2 35.2 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ARG+_3:HN 1:ARG+_3:N 1:ARG+_3:CA 1:ARG+_3:HA 7.41 0.50 30.00 30.00 1000.000 133.8 162.4 -162.4 -133.8 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ASP_5:HN 1:ASP_5:N 1:ASP_5:CA 1:ASP_5:HA 7.41 0.50 30.00 30.00 1000.000 133.8 162.4 -162.4 -133.8 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:PHE_6:HN 1:PHE_6:N 1:PHE_6:CA 1:PHE_6:HA 7.14 0.50 30.00 30.00 1000.000 131.6 159.9 -159.9 -131.6 -22.0 22.0 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:VAL_7:HN 1:VAL_7:N 1:VAL_7:CA 1:VAL_7:HA 7.96 0.50 30.00 30.00 1000.000 138.3 167.9 -167.9 -138.3 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500
C-terminale Domäne Minicollagen !BIOSYM restraint 1 ! #remote_prochiral_center #distance 1:VAL_8:HN 1:PRO_4:O 1.000 2.500 50.00 50.00 1000.00 1:GLN_10:HN 1:VAL_6:O 1.000 2.500 50.00 50.00 1000.00 1:VAL_12:HN 1:GLN_10:O 1.000 2.500 50.00 50.00 1000.00 1:CYS_15:HN 1:VAL_12:O 1.000 2.500 50.00 50.00 1000.00 1:CYS_19:HN 1:PRO_16:O 1.000 2.500 50.00 50.00 1000.00 ! #NOE_distance
139
Anhang B: NMR-Randbedingungen
1:CYS_3:HB2 1:CYS_3:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_3:HB1 1:CYS_3:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_3:HB2 1:CYS_3:HA 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_3:HB1 1:CYS_3:HA 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HD2 1:CYS_3:HA 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HD1 1:CYS_3:HA 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HD1 1:CYS_3:HA 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HD1 1:CYS_3:HB1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HG2* 1:CYS_3:HB1 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HG2* 1:CYS_3:HB2 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HB* 1:CYS_3:HB1 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HA 1:CYS_3:HB1 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_2:HA 1:CYS_3:HN 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_2:HB* 1:CYS_3:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HG* 1:CYS_3:HN 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_2:HD* 1:CYS_3:HN 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HE* 1:CYS_3:HN 1.000 6.200 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_5:HD* 1:PRO_4:HA 1.000 3.200 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_3:HB1 1:PRO_4:HD2 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HB1 1:PRO_4:HD1 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HA 1:PRO_4:HD1 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HD1 1:PRO_4:HD1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HB1 1:PRO_4:HG* 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HG2* 1:PRO_5:HA 1.000 3.900 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HB2 1:PRO_5:HD* 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:ALA_9:HB* 1:VAL_6:HA 1.000 4.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HA 1:VAL_6:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HB2 1:VAL_6:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HB1 1:VAL_6:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_5:HA 1:VAL_6:HN 1.000 4.000 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_5:HB* 1:VAL_6:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_5:HD* 1:VAL_6:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HB 1:VAL_6:HA 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HA 1:VAL_6:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HB 1:VAL_6:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HN 1:VAL_6:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HN 1:VAL_6:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HB* 1:CYS_7:HA 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HG* 1:CYS_7:HA 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_11:HA 1:CYS_7:HA 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 !1:VAL_12:HG2* 1:CYS_7:HA 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 !1:VAL_12:HG1* 1:CYS_7:HA 1.000 4.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 !1:PRO_4:HB1 1:CYS_7:HB1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HB1 1:CYS_7:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HG* 1:CYS_7:HN 1.000 5.700 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HA 1:CYS_7:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HB 1:CYS_7:HN 1.000 4.900 4.900 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HG* 1:CYS_7:HN 1.000 5.800 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HN 1:CYS_7:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_5:HA 1:VAL_8:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HA 1:VAL_8:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HA 1:VAL_8:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HB1 1:VAL_8:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HB2 1:VAL_8:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HB 1:VAL_8:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HA 1:VAL_8:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HG2* 1:VAL_8:HN 1.000 3.900 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HA 1:ALA_9:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HA 1:ALA_9:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HB 1:ALA_9:HN 1.000 4.900 4.900 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HG1* 1:ALA_9:HN 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HN 1:ALA_9:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG1* 1:GLN_10:HB* 1.000 5.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG2* 1:GLN_10:HB* 1.000 5.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_6:HA 1:GLN_10:HN 1.000 4.900 4.900 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HA 1:GLN_10:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_8:HN 1:GLN_10:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:ALA_9:HB* 1:GLN_10:HN 1.000 3.900 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HA 1:GLN_10:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HB* 1:GLN_10:HN 1.000 3.700 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_11:HN 1:GLN_10:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HB1 1:CYS_11:HA 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG1* 1:CYS_11:HA 1.000 4.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG2* 1:CYS_11:HA 1.000 4.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HD1 1:CYS_11:HB* 1.000 5.800 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HA 1:CYS_11:HN 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HB* 1:CYS_11:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG1* 1:VAL_12:HA 1.000 3.900 2.800 50.00 50.00 1000.00 0
140
Anhang B: NMR-Randbedingungen
1:VAL_12:HG2* 1:VAL_12:HA 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HB1 1:VAL_12:HG2* 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HB2 1:VAL_12:HG2* 1.000 4.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HA 1:VAL_12:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HA 1:VAL_12:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_10:HB* 1:VAL_12:HN 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_11:HA 1:VAL_12:HN 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_11:HB* 1:VAL_12:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HA 1:VAL_12:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HB 1:VAL_12:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HB1 1:VAL_12:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HN 1:VAL_12:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HA 1:PRO_13:HD2 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HA 1:PRO_13:HD1 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HB 1:PRO_13:HD1 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HB 1:PRO_13:HD2 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG2* 1:PRO_13:HD1 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG1* 1:PRO_13:HD2 1.000 4.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 !1:CYS_20:HA 1:PRO_13:HD* 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG2* 1:THR_14:HB 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HB 1:THR_14:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HA 1:THR_14:HN 1.000 4.900 4.900 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_13:HA 1:THR_14:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_13:HB1 1:THR_14:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_13:HB2 1:THR_14:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_13:HD2 1:THR_14:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_13:HD1 1:THR_14:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HN 1:THR_14:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HA 1:CYS_15:HB1 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HA 1:CYS_15:HB2 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_7:HA 1:CYS_15:HB1 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 !1:CYS_7:HB* 1:CYS_15:HB1 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HD2 1:CYS_15:HB1 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HD1 1:CYS_15:HB1 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG2* 1:CYS_15:HN 1.000 3.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:VAL_12:HG1* 1:CYS_15:HN 1.000 5.900 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 !1:VAL_12:HB 1:CYS_15:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_13:HA 1:CYS_15:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:THR_14:HA 1:CYS_15:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:THR_14:HB 1:CYS_15:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:THR_14:HG2* 1:CYS_15:HN 1.000 5.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HA 1:CYS_15:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HB1 1:CYS_15:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HB2 1:CYS_15:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_4:HG* 1:PRO_16:HD1 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HA 1:PRO_16:HD1 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_15:HA 1:PRO_16:HD2 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HB* 1:PRO_16:HD1 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HA 1:GLN_17:HN 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB1 1:GLN_17:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB2 1:GLN_17:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_17:HA 1:GLN_17:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HN 1:GLN_17:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_2:HG* 1:TYR_18:HD* 1.000 7.100 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB1 1:TYR_18:HD* 1.000 6.200 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB2 1:TYR_18:HD* 1.000 5.600 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HB1 1:TYR_18:HD* 1.000 4.500 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HB2 1:TYR_18:HD* 1.000 4.500 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HA 1:TYR_18:HD* 1.000 5.600 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HA 1:TYR_18:HD* 1.000 6.200 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_2:HA 1:TYR_18:HE* 1.000 7.000 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_2:HG* 1:TYR_18:HE* 1.000 6.500 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HA 1:TYR_18:HE* 1.000 7.000 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB1 1:TYR_18:HE* 1.000 5.600 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB2 1:TYR_18:HE* 1.000 5.000 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HA 1:TYR_18:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB1 1:TYR_18:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_17:HA 1:TYR_18:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_17:HB* 1:TYR_18:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HA 1:TYR_18:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HB1 1:TYR_18:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HB2 1:TYR_18:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HN 1:TYR_18:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HD2 1:CYS_19:HB* 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB1 1:CYS_19:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HB2 1:CYS_19:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_16:HD1 1:CYS_19:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_17:HA 1:CYS_19:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0
141
Anhang B: NMR-Randbedingungen
1:GLN_17:HN 1:CYS_19:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:TYR_18:HB1 1:CYS_19:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HB* 1:CYS_19:HN 1.000 3.200 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HA 1:CYS_19:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HD2 1:CYS_20:HA 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HD1 1:CYS_20:HA 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HD1 1:CYS_20:HB* 1.000 3.700 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_17:HA 1:CYS_20:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:GLN_17:HA 1:CYS_20:HB* 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HA 1:CYS_20:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HB* 1:CYS_20:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:CYS_19:HN 1:CYS_20:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 !1:TYR_18:HN 1:CYS_20:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HA 1:ALA_22:HN 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HB1 1:ALA_22:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HB2 1:ALA_22:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HD1 1:ALA_22:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:LYS+_23:HN 1:ALA_22:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.00 0 1:PRO_21:HB2 1:LYS+_23:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 1000.00 0 1:ALA_22:HA 1:LYS+_23:HN 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:ALA_22:HB* 1:LYS+_23:HN 1.000 3.900 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:LYS+_23:HA 1:ARG+_24:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 1000.00 0 1:ARG+_24:HA 1:LYS+_25:HN 1.000 2.300 2.300 50.00 50.00 1000.00 0 1:ARG+_24:HN 1:LYS+_25:HN 1.000 4.900 4.900 50.00 50.00 1000.00 0 ! #mixing_times -9.990000E+02
N-terminale Domäne Minicollagen !BIOSYM restraint 1 ! #remote_prochiral_center ! #NOE_distance 1:ALA_12:HB* 1:PRO_2:HB* 1.000 4.800 2.800 50 50 1000 1:ALA_12:HB* 1:PRO_2:HD* 1.000 6.800 4.800 50 50 1000 1:CYS_7:HB* 1:CYS_3:HB* 1.000 4.100 2.300 50 50 1000 1:PRO_2:HA 1:CYS_3:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 1000.0 1:PRO_2:HB* 1:CYS_3:HN 1.000 4.300 3.400 50.00 50.00 1000.0 1:PRO_2:HG* 1:CYS_3:HN 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.0 1:GLY_4:HN 1:CYS_3:HN 1.000 2.300 2.300 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HA 1:CYS_3:HN 1.000 4.000 4.000 50 50 1000 1:ALA_12:HB* 1:CYS_3:HN 1.000 5.900 4.800 50 50 1000 1:PRO_2:HG* 1:GLY_4:HN 1.000 4.900 4.000 50.00 50.00 1000.0 1:CYS_3:HA 1:GLY_4:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_3:HB* 1:GLY_4:HN 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:SER_5:HN 1:GLY_4:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:GLY_4:HA* 1:SER_5:HN 1.000 3.200 2.300 50.0 50.00 1000.0 1:TYR_6:HN 1:SER_5:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:SER_5:HB* 1:TYR_6:HD* 1.000 6.500 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:TYR_6:HA 1:TYR_6:HD* 1.000 5.000 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:TYR_6:HA 1:TYR_6:HE* 1.000 6.200 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:TYR_6:HN 1:TYR_6:HD* 1.000 5.000 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_7:HB* 1:TYR_6:HD* 1.000 7.900 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HB* 1:TYR_6:HD* 1.000 7.900 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HB* 1:TYR_6:HE* 1.000 6.500 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:TYR_6:HN 1:TYR_6:HE* 1.000 5.600 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_14:HB* 1:TYR_6:HE* 1.000 7.300 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HB* 1:TYR_6:HE* 1.000 7.300 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:GLY_4:HA* 1:TYR_6:HN 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:SER_5:HA 1:TYR_6:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:SER_5:HB* 1:TYR_6:HN 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_7:HN 1:TYR_6:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_8:HD* 1:CYS_7:HA 1.000 3.200 2.300 50 50 1000 1:CYS_20:HA 1:CYS_7:HA 1.000 3.400 3.400 50 50 1000 1:SER_5:HA 1:CYS_7:HN 1.000 4.000 4.000 50 50 1000 1:TYR_6:HA 1:CYS_7:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:TYR_6:HB* 1:CYS_7:HN 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_7:HB* 1:PRO_8:HD* 1.000 5.800 4.000 50 50 1000 1:CYS_20:HA 1:PRO_8:HD* 1.000 3.700 2.800 50 50 1000 1:PRO_8:HA 1:SER_9:HN 1.000 2.300 2.300 50 50 1000 1:PRO_8:HB* 1:SER_9:HN 1.000 4.300 3.400 50 50 1000 1:VAL_10:HG* 1:SER_9:HN 1.000 7.000 3.400 50 50 1000 1:VAL_10:HN 1:SER_9:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_8:HA 1:VAL_10:HN 1.000 3.400 3.400 50 50 1000 1:PRO_8:HB* 1:VAL_10:HN 1.000 4.300 3.400 50 50 1000
142
Anhang B: NMR-Randbedingungen
1:SER_9:HA 1:VAL_10:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HB* 1:VAL_10:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_8:HB* 1:CYS_11:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HA 1:CYS_11:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HB* 1:CYS_11:HN 1.000 5.700 4.800 50.0 50.0 1000.0 1:VAL_10:HA 1:CYS_11:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.0 1000.0 1:VAL_10:HB 1:CYS_11:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.0 1000.0 1:VAL_10:HG* 1:CYS_11:HN 1.000 5.400 2.800 50.0 50.0 1000.0 1:ALA_12:HN 1:CYS_11:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_13:HA 1:ALA_12:HA 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_13:HA 1:ALA_12:HB* 1.000 3.400 2.300 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HA 1:ALA_12:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HB* 1:ALA_12:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:VAL_10:HA 1:ALA_12:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_11:HA 1:ALA_12:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_11:HB* 1:ALA_12:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_13:HA 1:ALA_12:HN 1.000 4.300 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_12:HB* 1:PRO_13:HD* 1.000 6.800 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_14:HB* 1:PRO_13:HD* 1.000 6.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HA 1:ALA_14:HB* 1.000 5.100 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HB* 1:ALA_14:HB* 1.000 5.000 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_12:HA 1:ALA_14:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_12:HB* 1:ALA_14:HN 1.000 5.900 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_13:HA 1:ALA_14:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_13:HD* 1:ALA_14:HN 1.000 3.700 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_13:HG* 1:ALA_14:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_15:HN 1:ALA_14:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HA 1:CYS_15:HA 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:SER_9:HB* 1:CYS_15:HA 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HB* 1:CYS_15:HA 1.000 5.100 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_3:HA 1:CYS_15:HB* 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_7:HB* 1:CYS_15:HN 1.000 4.600 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_12:HA 1:CYS_15:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_12:HB* 1:CYS_15:HN 1.000 5.100 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_13:HA 1:CYS_15:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_14:HA 1:CYS_15:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_14:HB* 1:CYS_15:HN 1.000 3.900 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HN 1:CYS_15:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HD* 1:ALA_16:HA 1.000 3.200 2.300 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HD* 1:ALA_16:HB* 1.000 4.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_19:HB* 1:ALA_16:HB* 1.000 5.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_7:HB* 1:ALA_16:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_14:HB* 1:ALA_16:HN 1.000 4.500 3.400 50.0 50.00 1000.0 !1:ALA_14:HN 1:ALA_16:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_15:HA 1:ALA_16:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_15:HB* 1:ALA_16:HN 1.000 5.700 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_19:HB* 1:ALA_16:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_19:HN 1:ALA_16:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HN 1:ALA_16:HN 1.000 4.800 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HB* 1:PRO_17:HA 1.000 3.700 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HB* 1:VAL_18:HN 1.000 3.900 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HA 1:VAL_18:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HB* 1:VAL_18:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HG* 1:VAL_18:HN 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_19:HN 1:VAL_18:HN 1.000 2.800 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HN 1:VAL_18:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HB* 1:CYS_19:HN 1.000 4.500 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HA 1:CYS_19:HN 1.000 4.800 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:VAL_18:HA 1:CYS_19:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:VAL_18:HB 1:CYS_19:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HN 1:CYS_19:HN 1.000 2.300 2.300 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_7:HB* 1:CYS_20:HA 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_22:HD* 1:CYS_20:HA 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_7:HB* 1:CYS_20:HN 1.000 4.900 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:ALA_16:HB* 1:CYS_20:HN 1.000 5.100 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:VAL_18:HA 1:CYS_20:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_19:HA 1:CYS_20:HN 1.000 3.400 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_19:HB* 1:CYS_20:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_22:HD* 1:TYR_21:HA 1.000 3.200 2.300 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HA 1:TYR_21:HN 1.000 4.000 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HB* 1:TYR_21:HN 1.000 4.300 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HA 1:TYR_21:HD* 1.000 4.000 2.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HB* 1:TYR_21:HD* 1.000 6.500 3.400 50.0 50.00 1000.0 1:TYR_6:HB* 1:TYR_21:HE* 1.000 7.900 4.800 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HA 1:TYR_21:HE* 1.000 6.200 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:PRO_17:HB* 1:TYR_21:HE* 1.000 7.100 4.000 50.0 50.00 1000.0 1:CYS_20:HB* 1:TYR_21:HE* 1.000 6.500 3.400 50.0 50.00 1000.0
143
Anhang B: NMR-Randbedingungen
TMC416 !BIOSYM restraint 1 ! #remote_prochiral_center ! #chiral 1:TYR_1F:CA S 1:LEU_1G:CA S 1:TRP_1H:CA S 1:TRP_1H:CG S 1:LEUN_1D:CA S ! #NOE_distance 1:TRP_1H:HA 1:LEUN_1D:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HB2 1:LEU_1G:HA 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HG 1:LEU_1G:HA 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HB1 1:LEU_1G:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HB2 1:LEU_1G:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HG 1:LEU_1G:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HA 1:LEU_1G:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB2 1:LEU_1G:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HN 1:LEU_1G:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HA 1:TRP_1H:HE1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TRP_1H:HA 1:TRP_1H:HE1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TRP_1H:HG 1:TRP_1H:HE1 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HN 1:TRP_1H:HE1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TRP_1H:HA 1:TRP_1H:HE3,HZ3,HH2 1.000 5.600 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TRP_1H:HG 1:TRP_1H:HE3,HZ3,HH2 1.000 5.600 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEUN_1D:HN 1:TRP_1H:HN 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HA 1:TRP_1H:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HB1 1:TRP_1H:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HB2 1:TRP_1H:HN 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HG 1:TRP_1H:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB1 1:TYR_1F:HA 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB2 1:TYR_1F:HA 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HA 1:TYR_1F:HD1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:LEU_1G:HN 1:TYR_1F:HD1 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TRP_1H:HA 1:TYR_1F:HD1 1.000 3.400 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TRP_1H:HE1 1:TYR_1F:HD1 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HA 1:TYR_1F:HD1 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB1 1:TYR_1F:HD1 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB2 1:TYR_1F:HD1 1.000 2.800 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HN 1:TYR_1F:HD1 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB1 1:TYR_1F:HD2,HE2 1.000 4.100 2.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB2 1:TYR_1F:HD2,HE2 1.000 6.100 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HN 1:TYR_1F:HD2,HE2 1.000 4.700 3.400 50.00 50.00 100.000 0.00 1:METH_1B:H1* 1:TYR_1F:HN 1.000 5.700 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB1 1:TYR_1F:HN 1.000 4.000 4.000 50.00 50.00 100.000 0.00 1:TYR_1F:HB2 1:TYR_1F:HN 1.000 4.800 4.800 50.00 50.00 100.000 0.00 ! #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:TYR_1F:HN 1:TYR_1F:N 1:TYR_1F:CA 1:TYR_1F:HA 7.50 0.50 50.00 50.00 100.000 139.5 158.2 -158.2 -139.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:LEU_1G:HN 1:LEU_1G:N 1:LEU_1G:CA 1:LEU_1G:HA 7.50 0.50 50.00 50.00 100.000 139.5 158.2 -158.2 -139.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:TRP_1H:HN 1:TRP_1H:N 1:TRP_1H:CA 1:TRP_1H:HA 9.20 0.50 50.00 50.00 100.000 155.8 -155.8 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500
BIA49 !BIOSYM restraint 1 ! #chiral 1:PHE_1:CA S 1:ASN_1B:CA R 1:TYR_2:CA S ! #NOE_distance !ATOM #1 ATOM#2 Distance Force Constant Max ! Lower Upper Upper Lower Upper Force ! +correction 1:PHE_1:HA 1:ASN_1B:HN 1 3.4 3.4 50 50 100
144
Anhang B: NMR-Randbedingungen
1:PHE_1:HB2 1:ASN_1B:HN 1 3.4 3.4 50 50 100 1:PHE_1:HD1 1:ASN_1B:HN 1 4.8 4.8 50 50 100 1:PHE_1:HN 1:ASN_1B:HN 1 4.8 4.8 50 50 100 1:ASN_1B:HA 1:PHE_1:HD1 1 4 4 50 50 100 1:ASN_1B:HN 1:PHE_1:HD1 1 4 4 50 50 100 1:PHE_1:HA 1:PHE_1:HD1 1 4 4 50 50 100 1:PHE_1:HB2 1:PHE_1:HD1 1 2.8 2.8 50 50 100 1:METH_1E:H1* 1:PHE_1:HD2 1 3.2 2.3 50 50 100 1:PHE_1:HB1 1:PHE_1:HD2 1 2.8 2.8 50 50 100 1:PHE_1:HN 1:PHE_1:HD2 1 3.4 3.4 50 50 100 1:METH_1E:H1* 1:PHE_1:HN 1 5.7 4.8 50 50 100 1:ASN_1B:HA 1:TYR_2:HD1 1 4.8 4.8 50 50 100 1:ASN_1B:HB* 1:TYR_2:HD1 1 4.3 3.4 50 50 100 1:ASN_1B:HN 1:TYR_2:HD1 1 4.8 4.8 50 50 100 1:PHE_1:HD1 1:TYR_2:HD1 1 4.8 4.8 50 50 100 1:TYR_2:HA 1:TYR_2:HD1 1 2.8 2.8 50 50 100 1:TYR_2:HB2 1:TYR_2:HD1 1 2.8 2.8 50 50 100 1:ASN_1B:HA 1:TYR_2:HD2 1 4 4 50 50 100 1:PHE_1:HD1 1:TYR_2:HD2 1 4.8 4.8 50 50 100 1:TYR_2:HA 1:TYR_2:HD2 1 4.8 4.8 50 50 100 1:TYR_2:HB1 1:TYR_2:HD2 1 2.3 2.3 50 50 100 1:PHE_1:HD1 1:TYR_2:HE1 1 4 4 50 50 100 1:ASN_1B:HA 1:TYR_2:HE2 1 4.8 4.8 50 50 100 1:PHE_1:HD1 1:TYR_2:HE2 1 3.4 3.4 50 50 100 1:ASN_1B:HA 1:TYR_2:HN 1 4 4 50 50 100 1:ASN_1B:HB* 1:TYR_2:HN 1 4.3 3.4 50 50 100 1:TYR_2:HD2 1:TYR_2:HN 1 3.4 3.4 50 50 100 1:LEU_3:HN 1:TYR_2:HN 1 4 4 50 50 100 1:TYR_2:HA 1:LEU_3:HN 1 2.8 2.8 50 50 100 1:TYR_2:HB2 1:LEU_3:HN 1 4 4 50 50 100 ! #mixing_times -9.990000E+02 ! #3J_dihedral 1:PHE_1:HN 1:PHE_1:N 1:PHE_1:CA 1:PHE_1:HA 7.30 0.50 50.00 50.00 100.000 137.9 156.3 -156.3 -137.9 -12.4 12.4 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:ASN_1B:HN 1:ASN_1B:N 1:ASN_1B:CA 1:ASN_1B:HA 8.80 0.50 50.00 50.00 100.000 151.2 175.5 -175.5 -151.2 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500 1:TYR_2:HN 1:TYR_2:N 1:TYR_2:CA 1:TYR_2:HA 9.80 0.50 50.00 50.00 100.000 165.5 -165.5 !A=6.700, B=-1.300, C=1.500
145
10. Anhang C: Rechenprotokolle
Azopeptide in trans ! INPUT FILE FOR DISCOVER GENERATED BY INSIGHT ! ! overlap = 0.01 begin simulation * add-automatic bond torsion valence out-of-plane reduce ! set dielectric = 80.00000 bzw. 46,7 für DMSO ! Assign the torsion name azo to * residue BENZ 1D atom C3 * residue AZO 1E atom N1 * residue AZO 1E atom N2 * residue BENZ 1F atom C6 Assign the torsion name phi1 to * residue BENZ 1D atom C2 * residue BENZ 1D atom C3 * residue AZO 1E atom N1 * residue AZO 1E atom N2 Assign the torsion name phi2 to * residue AZO 1E atom N1 * residue AZO 1E atom N2 * residue BENZ 1F atom C6 * residue BENZ 1F atom C5 ! force azo in AZO 1E to 180 using 100.000000 force phi1 in BENZ 1D to 180 using 100.000000 force phi2 in AZO 1E to 180 using 100.000000 ! CONSTRAIN ! DEMAX=100000 aloop=1 bloop=101 100 retrieve as file number aloop ! Minimize * no cross terms * no morse * for 1000 iterations * using conjugate gradients * until the maximum derivative is less than 1.0 kcal/A ! Minimize * no cross terms * no morse * for 500 iterations * using steepest descent * until the maximum derivative is less than 0.10 kcal/A ! initialize dynamics * for 5000 iterations * at 300.000 K * steps of 1.000 * no cross terms * no morse * write history file every 1000 steps * averages every 100 ! KTEMPB=1 TIMTMP=1.0 ! resume dynamics * for 10000 iterations * no cross terms
146 * no morse
Anhang C: Rechenprotokolle
* at 0.0 K ! archive as file number bloop aloop=aloop+1 bloop=bloop+1 ! if aloop.le.100 then 100 ! ! end
Azopeptide in cis ! INPUT FILE FOR DISCOVER GENERATED BY INSIGHT ! ! overlap = 0.01 begin simulation * add-automatic bond torsion valence out-of-plane reduce ! set dielectric = 80.00000 bzw. für 46,7 ! Assign the torsion name azo to * residue BENZ 1D atom C3 * residue AZO 1E atom N1 * residue AZO 1E atom N2 * residue BENZ 1F atom C6 force azo in AZO 1E to 0 using 100.000000 ! CONSTRAIN ! DEMAX=100000 aloop=1 bloop=101 100 retrieve as file number aloop ! Minimize * no cross terms * no morse * for 1000 iterations * using conjugate gradients * until the maximum derivative is less than 1.0 kcal/A ! Minimize * no cross terms * no morse * for 500 iterations * using steepest descent * until the maximum derivative is less than 0.10 kcal/A ! initialize dynamics * for 5000 iterations * at 300.000 K * steps of 1.000 * no cross terms * no morse * write history file every 1000 steps * averages every 100 ! KTEMPB=1 TIMTMP=1.0 ! resume dynamics * for 10000 iterations * no cross terms * no morse * at 0.0 K ! archive as file number bloop aloop=aloop+1 bloop=bloop+1 ! if aloop.le.100 then 100 !
147
Anhang C: Rechenprotokolle
! end
C- und N-terminale Domäne ! INPUT FILE FOR DISCOVER GENERATED BY INSIGHT ! ! overlap = 0.01 ! begin simulation * add-automatic bond torsion valence out-of-plane reduce ! set dielectric = 80.00000 ! ! CONSTRAIN ! DEMAX=100000 aloop=1 bloop=101 100 retrieve as file number aloop ! Minimize * no cross terms * no morse * for 1000 iterations * using conjugate gradients * until the maximum derivative is less than 1.0 kcal/A ! Minimize * no cross terms * no morse * for 500 iterations * using steepest descent * until the maximum derivative is less than 0.10 kcal/A ! initialize dynamics * for 5000 iterations * at 300.000 K * steps of 1.000 * no cross terms * no morse * write history file every 1000 steps * averages every 100 ! KTEMPB=1 TIMTMP=1.0 ! resume dynamics * for 10000 iterations * no cross terms * no morse * at 0.0 K ! archive as file number bloop aloop=aloop+1 bloop=bloop+1 ! if aloop.le.100 then 100 ! ! end
TMC416 und BIA 49 ! INPUT FILE FOR DISCOVER GENERATED BY INSIGHT ! ! overlap = 0.01 begin simulation * add-automatic bond torsion valence out-of-plane
148 reduce
Anhang C: Rechenprotokolle
! set dielectric = 46.7000 ! CONSTRAIN ! DEMAX=100000 aloop=1 bloop=101 100 retrieve as file number aloop ! Minimize * no cross terms * no morse * for 100 iterations * using conjugate gradients * until the maximum derivative is less than 1.0 kcal/A ! Minimize * no cross terms * no morse * for 100 iterations * using steepest descent * until the maximum derivative is less than 0.10 kcal/A ! initialize dynamics * for 5000 iterations * at 300.000 K * steps of 1.000 * no cross terms * no morse * write history file every 1000 steps * averages every 100 ! KTEMPB=1 TIMTMP=1.0 ! resume dynamics * for 10000 iterations * no cross terms * no morse * at 0.0 K ! archive as file number bloop aloop=aloop+1 bloop=bloop+1 ! if aloop.le.100 then 100 ! ! end
RGD-Modelling auf Integrinrezeptor
Minimierung des Komplexes mit Wasserhülle ! INPUT FILE FOR DISCOVER GENERATED BY INSIGHT ! ! overlap = 0.01 begin simulation * add-automatic bond torsion valence out-of-plane reduce ! set dielectric = 1.000000 ! Assign the torsion name azo to * residue BENZ 1D atom C3 * residue AZO 1E atom N1 * residue AZO 1E atom N2 * residue BENZ 1F atom C6 force azo in AZO 1E to 0 using 100.000000 ! tethered list * add side
149 * molecule 1 residue ARG+ 3 to ASP- 5
Anhang C: Rechenprotokolle
! ! Fixed atom list generation * add all * molecule 2 residue GL-n A121 to METH 1 ! ! template force with a force constant of 100.0 kcal/A2 * no cross terms * no morse * for 1000000 iterations * using steep descents * until the maximum derivative is less than 0.001000000 kcal/A ! ! end
Sampling bei hoher Temperatur ! INPUT FILE FOR DISCOVER GENERATED BY INSIGHT ! fuer AMPB Peptide in cis ! overlap = 0.01 CUTOFF=12.0 CUTDIS=10.0 SWTDIS=2.0 begin simulation * add-automatic bond torsion valence out-of-plane reduce ! set dielectric = 4.0*r ! CONSTRAIN ! DEMAX=100000 ! Assign the torsion name azo to * residue BENZ 1D atom C3 * residue AZO 1E atom N1 * residue AZO 1E atom N2 * residue BENZ 1F atom C6 Assign the torsion name a1 to * residue ALHD 1G atom O2 * residue ALHD 1G atom C1 * residue LYS+ 1 atom N * residue LYS+ 1 atom HN Assign the torsion name a2 to * residue GLY 2 atom HN * residue GLY 2 atom N * residue LYS+ 1 atom C * residue LYS+ 1 atom O Assign the torsion name a3 to * residue GLY 2 atom O * residue GLY 2 atom C * residue ARG+ 3 atom N * residue ARG+ 3 atom HN Assign the torsion name a4 to * residue ARG+ 3 atom O * residue ARG+ 3 atom C * residue GLY 4 atom N * residue GLY 4 atom HN Assign the torsion name a5 to * residue GLY 4 atom O * residue GLY 4 atom C * residue ASP- 5 atom N * residue ASP- 5 atom HN Assign the torsion name a6 to * residue ASP- 6 atom HN * residue ASP- 6 atom N
150 * residue ASP- 5 atom C
Anhang C: Rechenprotokolle
* residue ASP- 5 atom O Assign the torsion name a7 to * residue ASP- 6 atom O * residue ASP- 6 atom C * residue VAL 7 atom N * residue VAL 7 atom HN Assign the torsion name a8 to * residue AMDE 1B atom H1 * residue AMDE 1B atom N1 * residue VAL 7 atom C * residue VAL 7 atom O ! ! force azo in AZO 1E to 0.0 using 100.000000 ! force a1 in ALHD 1G to 180.0 using 100.000000 ! force a2 in GLY 2 to 180.0 using 100.000000 ! force a3 in GLY 2 to 180.0 using 100.000000 ! force a4 in ARG+ 3 to 180.0 using 100.000000 ! force a5 in GLY 4 to 180.0 using 100.000000 ! force a6 in ASP- 6 to 180.0 using 100.000000 ! force a7 in ASP- 6 to 180.0 using 100.000000 ! force a8 in AMDE 1B to 180.0 using 100.000000 ! ! ! ! ! Fixed atom list generation * add all * molecule 2 residue GL-n A121 to METH 1 ! ! initialize dynamics * for 50000 iterations * at 310.000 K * steps of 1.000 * no cross terms * no morse * write history file every 2000 steps ! KTEMPB=1 TIMTMP=1.0 ! resume dynamics * for 5000000 iterations * no cross terms * no morse * at 2000.0 K ! end Abkühlen des Komplexes ! INPUT FILE FOR DISCOVER GENERATED BY INSIGHT ! ! overlap = 0.01 CUTOFF=12.0 CUTDIS=10.0 SWTDIS=2.0 begin simulation * add-automatic bond torsion valence out-of-plane reduce ! set dielectric = 1.0 ! ! !
151
Anhang C: Rechenprotokolle
DEMAX=100000 ! Assign the torsion name azo to * residue BENZ 1D atom C3 * residue AZO 1E atom N1 * residue AZO 1E atom N2 * residue BENZ 1F atom C6 force azo in AZO 1E to 0 using 100.000000 ! ! ! Fixed atom list generation * add all * molecule 2 residue GL-n A121 to METH 1 ! Minimize * no cross terms * no morse * for 5000 iterations * using conjugate gradients * until the maximum derivative is less than 1.0 kcal/A ! initialize dynamics * for 5000 iterations * at 10.000 K * steps of 1.000 * no cross terms * no morse * write history file every 2000 steps ! KTEMPB=1 TIMTMP=1.0 ! resume dynamics * for 100000 iterations * no cross terms * no morse * at 300 K ! KTEMPB=1 TIMPTMP=1.0 ! resume dynamics * for 10000 iterations * no cross terms * no morse * at 0 K
152