平成元年　 東京大学農学系博士課程修了平成3年 　 東京大学農学部助手平成4年　 アメリカNIHポスドク平成8年　 慶応大学医学部助手、講師平成13年　 山口大学医学部助教授

Nature (1994) 371, 67Immunity (1995) 2, 413J. Exp. Med. (1997) 186. 17Science (1999) 283. 390Nature Genetics (1999) 21. 230Nature Immunol. (2003) 4. 280

「免疫00-01」中山書店　80 (2000)「免疫学がわかる」羊土社　p18 (2000)「新用語ライブラリー免疫」羊土社　p124 (2000)「免疫2004」 中山書店　印刷中 (2003)

最新医学 54, 2162 (1999)医学のあゆみ 194, 390 (2000)

臨床免疫 37, 403 (2002)医学のあゆみ207, 897 (2003)

主要な原著論文

ホームページ

主要な著書、総説

略歴

鈴 木 春 巳微生物学教室　助教授本館３Ｆ　内線　2227suzukih@yamaguchi-u.ac.jp

http://www.cc.yamaguchi-u.ac.jp/~suzukih/lab毎週木曜６時より本館３Fセミナー室にて

１．遺伝子導入　　レトロウイルスによる効率的な遺伝子導入

２．遺伝子ノックダウン（siRNA）　　ノックアウトマウス、アンチセンスに代わる新技術

４．造血幹細胞による造血系再構築　　 造血幹細胞、Pax5欠損ProB細胞、胎児肝細胞、ES細胞

３．フローサイトメトリー　　4-color同時解析とセルソーティング

もくじ

I. 遺伝子導入法

１．遺伝子導入法

lipofection（リポフェクション）

electroporation（電気穿孔法）

CaCl2法（リン酸カルシウム沈殿法）

viral infection（ウイルス）

naked DNA injection（DNA水溶液）gene gun （金粒子）生体認識分子提示型中空バイオナノ粒子(HBV-envL粒子)bacteria mediated oral introduction

アデノウイルス　adenovirus

レトロウイルス　retrovirus

HIVベクター　letivirus

アデノ随伴ウイルス　adeno-associated virus

一過性、大量発現、長いインサートを入れられる毒性あり、免疫応答、CARレセプター、分裂必要なし全長36Kb、human>>mouse　造血系には入らない正20面体タンパクcapside、堅くて濃縮が容易

ゲノムに組み込まれる、長期間安定、分裂していないと入らない発現量少ない、ウイルス由来遺伝子なしLTRによりunexpectedなゲノム遺伝子発現の可能性

ゲノムに組み込まれる、長期間安定、造血幹細胞によく入る増殖してなくてもOK、 silencingを受けにくい第三世代ベクター（HIVゲノムの20%以下）はP2で使用可ViraPower Lentiviral expression system (Invitrogen)

ゲノムに組み込まれる、長期間安定、病原性、細胞障害性なし分裂してなくてもOK、自分自身では増殖できない入れられる長さが短い（4.7Kb）、タイターが低いAAV Helper free system (Stratagene)

ウイルスベクターの比較

レトロウイルス

標的細胞に取りつくRNAウイルス → 逆転写2本鎖cDNA染色体DNAに挿入LTRは強力なプロモーター

レトロウイルスの生活環

MMLVのレセプター（gap70)

mCAT-1(murine cationic amino acid transporter 1)マウスにしかない

clathrine/dynamin-independent（エンドサイトーシス経路とは違う）

integrase (from virus)

BAF(barrier-to-autointegration factor)

HMG I(Y)

ds viral cDNA

Pre-Integration Complex

Host DNA修復系が必要

ベクター

ウイルス粒子

標的細胞のゲノムに挿入された状態

標的細胞での発現RNA

5’-LTR 3’-LTR

U3

promoter

AAA

AAA

U5U3 R

逆転写反応 染色体への挿入

promoter

Mouse Moloney Leukemia Virus

レトロウイルスベクター

普通のウイルスと同じように標的細胞に感染するが、標的細胞にはgag,pol, envがないので感染性のウイルス粒子を再び産生することはできない。

transfection

5’-LTR 3’-LTRgene of interesty

パッケージ細胞

RNA

RNA

DNA

標的細胞CAT-1

pMXs-PREP7501bp5’-LTR

3’-LTR

y

puromycin r

SV40-promoter

wPRE

EGFPMCS

Amp r

IRES

3’-LTRy IRES

puror

3’-LTRPRE

EGFPGENE

mRNA

protein

感染細胞に組み込まれたウイルスDNA

pMXs-PREPベクター

特徴

puromycinで薬剤選択可能高いパッケージング効率IRES-GFPでmRNA検出PREでmRNAを安定化

AAAAAAAAA

U3 R U5

MMLV （マウスMoloney 肉腫ウイルス）env(gp70) → mouse specific receptor

vesicular stomatitis virus （水疱性口内炎ウイルス）env (VSV-G) → phosphatidylserine, phosphatidylinositol, Gm3 ganglioside, heparan sulfate

パッケージング（ウイルス粒子の産生）

Plat-E cell 293gp cell

ecotropic amphtropic　 ベクター（目的遺伝子）

pMXs-PREP pMXs-PREP

IRES - BSrEFIa

IRES - purorEFIa

VSV env

pseudo-typing

感染（遺伝子導入）効率を上げるtips

ウイルス上清の濃縮 　　6000g x16hr

パッケージ細胞へのトランスフェクション　 細胞の管理、GFPモニター

pH低下の阻止、培養温度、保存、凍結溶解、titerを測る　　　　

lipofectamine, polybrene カチオン　　　　

retronectin (TakaRa)　　　プレコートしておく

spinoculation 　　　　　　 2000rpm　40分　常温

pseudotyping 　　　　　 細胞によって違う

温度、ウイルス濃度、

薬剤選択、ソーティング、多重感染ベクターの長さ（選択マーカーなし）

ウイルスの産生段階

標的細胞に感染させる段階

その他

実際の実験結果

primary cell　(mouse spleen cell ConA blast) 感染率̃1%

DPK（CD4CD8 ダブルポジティブ細胞株）

+: retronectin,spin - : lipofectamine　 感染効率　<1%~50%

Pax5 knockout Pro B cell

+: lipofectamine, spin

49 lineを確立

18 lineを確立

M1

M1

GFP

84%

0.02%

pMX-IG-bclxL

uninfected DPK

その他、Hela, BW5147, DO11.10, Raw, J774, P815 等多数の細胞に導入

胸腺cDNAライブラリmRNA

thymus

cDNA expressionlibrary (retrovirus)

pMX-puro

EcoRIAAAAAAA

Not IcDNA5’ 3’

5’ LTR

3’ LTR

puror

CMV

EcoRI

Not I

Average insert length: 1.3kbLibrary size: 9.0 x 106 cfu

2kbp

600bp

RLm6parental line

CD4-SP clones

RL4RL7RL39

CD8a

C D

4

C D

4

CD8a

DP19

DP12DP3

DPKparental line

CD4-SP clones

CD8-SP clones

CD8a

C D

4

CD8a

C D

4C

D 4

CD8a

cDNA infectionpuro selectionsortinglimiting dilution

レトロウイルスによる遺伝子導入　まとめ

Cons

　　　　　効率の差はあるが必ず入る。

１．分裂細胞でないとダメ２．初代培養細胞には効率がかなり悪い３．発現量が少ない４．有害なもの(stableが取れないもの)は無理５．Gene silencing効果６．挿入により他の遺伝子を阻害、活性化

不死化細胞なら選択することにより、確実に安定発現株が取れる。

II. 遺伝子ノックダウン

siRNAによる遺伝子ノックダウン法とは？

ノックアウトマウス　　遺伝子をゲノムから相同組み換えによって物理的に取り除く。

アンチセンスRNA 目的遺伝子のmRNAと相補的なRNAを発現させ、ハイブリして不活性化する。

目的遺伝子と相補配列を持つ、

① <21mer, 3’-over hang dsRNA　② hairpin RNA w/ 19-29stem + 4-9loop（<30mer）

RNAを導入(発現）することにより、目的遺伝子のmRNAを分解する。

　Dicer : RNase III like dsRNase

RISC : RNA induced silencing comoplex RNA (anti-sense strand) EIF2C, GEM1, GEM3

siRNA, RNAi (small/short interfareing RNA)　

RNAiの生理学的意義1 ：　 miRNA(転写後抑制)

50-200 miRNAs?

翻訳阻止 mRNA分解

miR23 HES-1

lin4lin14lin28

let7 lin41

MR171 SCL

MR165 PHV,PHB

C. elegans

Arabidopsis

Mouse/human

他の遺伝子の転写後調節

miRNA 標的遺伝子

RNAiの生理学的意義２：　転写レベルでの発現抑制

miRNA

siRNA

相補的な遺伝子部分のヒストンメチル化(H3K9)

当該領域のヘテロクロマチン化

転写抑制

LTR? LTR近傍遺伝子群

人工プラスミド ura4

S. pombe

遺伝子座のヘテロクロマチン化

miRNA 標的遺伝子座

GFP-Hela細胞にdsRNAを導入 3 日後

BF GFP

no RNA

GY441siRNA

M2

M2

2%

81%

log10 GFP

Hela-GFP

Hela-GFP/GY441

5-GCCACAACGUCUAUAUCAUGGGUCGGUGUUGCAGAUAUAGUA-5

GY441　siRNA

M2

MFI = 308

MFI = 248

6.3%

14.4%GY441

no RNA

GFP-DPK（胸腺細胞）では入らない

siRNA をレトロで導入 　(RNAが入らない場合：継続して発現させたい場合)

Pol III ポリメラーゼで転写させる ( H1, U6, tRNA)

セルフハイブリによって２本鎖ヘアピンRNAを形成

Dicerで切らせる

siRNA を細胞内で生成

A A A A A

T T T T T

U6 promoter

T T

T T

T T T T

T T

T T T T

A A A A A

pol III

U6 promoter

stop

T T

RISC

ノックダウンしたいmRNA

アンチセンス配列

センス鎖配列

short hairpin RNA

Dicer

siRNA

相補配列ループ

GFP puro

プロモーターレス

U6

short hairpin RNA

5' CACC GAGATCGGTGCTGTCAAATAC TTCAAGAGA GTATTTGACAGCACCGATCTC TTTTT 3CTCTAGCCACGACAGTTTATG aagttctct CATAAACTGTCGTGGCTAGAG aaaaa tacg5'GTGG

ATGC

BspMIBspMI

U6-promoter

pMSU7501bp5’-LTR

3’-LTR(DU3)

y

puromycin rSV40-promoter

EGFP

Amp r

stufferCMV promoter

U6-promoter

BspMI BspMI GAGATCGGTGCTGTCAAATAC

----- AA G-------------------- -------

19-21 merGC content <50%coding regionno homology on BLAST searchRNA structure

ループセンス鎖 センス相補鎖

Rac1 knockdown

#1 285 aaGTGGTATCCTGAAGTGCGACA

#2 381 aaGCTGAAGGAGAAGAAGCTGAC

#3 　439 aaGAGATCGGTGCTGTCAAATAC

Qiagen http://python.penguindreams.net/Xeragon_Order_Entry/jsp/SearchBySequence.jsp

Dharmacon http://www.dharmacon.com/

Ambion http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html

RNA folding analysis http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/

sequence探し

場所（配列）選び...　コンセンサスがない。

dsRNAと同じsequenceでexpression vectorに使えるか？(効く配列のpre-screening)

hairpinRNA、siRNA発現のモニター　　real-time RT-PCR?

Dicer, RISC componentが標的細胞に存在するか？

siRNAによる遺伝子ノックダウン　まとめ

dsRNAが入る細胞ならよく効く

レトロでしか入らない細胞の場合

III. フローサイトメトリー

FACS fluorescein activated cell sorter

細胞表面に出ている抗原を検出

GFP細胞内の蛍光を検出

細胞内の抗原を検出 (permeabilized staining)

細胞一個一個について、それぞれの蛍光強度を検出し（アナライザー）、その情報を元に分取も出来る（ソーター）。細胞内局在はわからない。

導入遺伝子の発現を検出遺伝子を高発現している細胞のみを分取

分化、活性化マーカー、細胞種の特定アポトーシス細胞の検定特定の細胞だけを分取

サイトカインの定量DNA量の測定（cell cycle、アポトーシス）、カルシウムイオン量の測定

FACS Vantage（第一外科）

FACS calibur（遺伝子実験施設）

FACS calibur２レーザー

（小児科）

EPICS (実習機器センター)AutoMACS　　（生体防御、小児科）

細胞を大量に取りたい時は

色素

PE (R-PE、Red-algal phycoerythrin)：紅藻の集光複合体のサブユニット。250 kDa タン

パク質、34個の chromophore prosthetic groupsを持つ。励起波長 492 / 565nm ：発光波長 578nm。光が強い。

FITC (Fluorescein isothiocyanate) ：励起波長494nm, 発光波長520nm。低分子で

conjugateさせやすいが光が弱い。Alexa488に移行？

APC (allophycocyanin)：シアノバクテリウムの集光タンパク。110 kDa, containing 6chromophore prosthetic groups.励起波長 650nm：発光波長 660nm 。光が強い。

Cy5.5 励起波長 675nm ：発光波長 694nm

Cy5 (Cyanine-5.18 / 5.29) 励起波長 650nm：発光波長 667nm

PerCP：葉緑体クロロフィル色素タンパク（Peridinin chlorophyll-a）励起波長 488nm ：発光波長 675nm。光が弱く退色しやすい。

PI (propidium iodide)：DNA結合色素、死細胞が染まる。励起波長 536nm ：発光波長 617nm

Fluo-3：カルシウム結合色素。非結合時には発光しないが、Ca2+と結合すると励起波長 506nm ：発光波長 526nm。

GFP (Green Fluorescein Protein) ：励起波長 489nm ：発光波長 508nm 　　GFP以外の蛍光タンパク(DsRed, YFP他)は使用不可。

Alexa488 (Mol. Probe) ：励起波長 494nm ：発光波長 517nm

Tandem-dye (energy transfer)

488nm

PECy5

578nm670nm

PE-Cy5* (TriColor, Red670, Duochrome)PE-Cy5.5PE-APC (売ってない)

PerCP-Cy5.5 (TruRed)

488nmのアルゴンレーザーで670付近(FL3)まで飛ばせる。４-８分子の２次発光物質を１次発光物質に共有結合させる。

Cy5

* Cy5は633nmで直接励起されるので、HeNeレーザーを用いた４色解析時には、Cy5-tandem dyeをFL3に使うことはできない。

FL1 (500-560nm) FITC (519), GFP (508), Alexa488 (517)

FL2 (543-627nm) PE (580) , PI (617)

FL3 (>670nm) Biotin-Ab, StreptAvidin-dye

　 PerCP-Cy5.5 (TruRed: Pharmingen)　 (694)

　　 PE-Cy5.5 (e-Bio, Caltag) (694)

　　 PE-Cy5 (Tricolor,Duochrome: Dako, Zymed) (670) （4色時はダメ）

　　 PerCP （Pharmingen） (675)

1st laser (Ar: 488nm)

2nd laser (HeNe: 633nm)

FL4 (645-678nm) APC (660), Cy5 (670)

14%

GFP CD8-APC

CD4-PE

DP

DN 8SP

4SP20%

68%

4%7%

DP

8SPDN

4SP

4-Color analysis:thymocytes from GFP-introduced Pax5PB

ソーティング蛍光情報に従って細胞を無菌的に分取することが出来る。

MACS（磁気ビーズ）ソーター

２種類以上のマーカーが使える（CD4+CD8-)high expressorが取れるpurityが高い細胞表面に出ない分子でも可 (GFP)頻度が低くても可

大量に取れない操作が難しい、面倒くさい装置が高い

大量に取れる簡単ですぐ取れる

purityが低い頻度が低いとダメ

遺伝子を導入した細胞から高発現している細胞のラインを確立する。ライブラリー導入細胞の選択。胸腺細胞からCD4-SPを調製する。造血幹細胞（c-kit+, sca-1+, Lin-）の部分精製

臓器から特定の細胞を取る。生化学的解析（ウエスタンなど）用細胞の調製。ソート前のプレソート。高発現細胞を取ることは出来ない。

log10GFP

非感染DPK細胞

pMX-PREP -MEK5aD1回め感染

ソート後

2回め感染＆ソート後

フローサイトメトリー　　まとめ

FL1 = FITC, GFP, Alexa488FL2 = PE, PIFL3 = Biotin-Ab, StreptAvidin-PerCP-Cy5.5 (TruRed) PE-Cy5.5 (e-Bio, Caltag) 　　 PE-Cy5 (Tricolor, Duochrome) ･･4色はXFL4 = APC, Cy5 　　

ソーター：　トランスフェクタント　→　高発現クローンを分離　　　　　　とても便利だから使ってください！　

小技：　stainingは96穴U底プレートで行う　→　早くて楽！

IV. 造血系細胞の再構築

造血系細胞のいろいろ

造血幹細胞

リンパ系

骨髄系

赤血球

樹状細胞

顆粒球多形核白血球　　　

マクロファージ単球

NK細胞

T細胞

B細胞

好中球好酸球好塩基球

血小板

白血球

E2A,EBFPax5

NotchGATA3

Id2

Ikaros

PU.1

HSCCD34+

c-Kit+

Sca-1+

Lin-

(SP)

骨髄造血幹細胞 (adlut骨髄)

胎児肝細胞 Pax5-/-ProB細胞

放射線照射したB6-CD45.1-RAG2-/- マウス（Ｂ細胞、Ｔ細胞なし）

HSC含む、IL-3,6,SCFで培養３日程度、全ての血球ヘ分化再構築に２ヶ月かかる

IL-7, stroma cellで長期培養可能Ｂ細胞には分化できない３週間でＴ細胞に分化

造血系細胞の再構築

Pax5-/- proB cells = HSC-like cell line　　　　　　　　　（多分化能を持った細胞）

GFP

GFP+ cells

thymus

spleen

Pax5-/- ProB 細胞を使ったＴ細胞分化の再構築

レトロ感染薬剤選択ソート

ST2 stroma+ IL-7

can reconstitute T cell, NK, MF Neutrophil, RBC Osteocrast

CD45.2

irradiated B6-CD45.1-RAG2-/-

pMX-PREP

CD8

CD4

（Ｔ細胞もＢ細胞もいないマウス）

pMX-PREP空ベクター

pMX-puro-Rac1N17-GFP

元のPax5PB細胞

分化した胸腺細胞

5’-LTR

3’-LTR

ypuromycin r

SV40-promoter

EGFP - Rac1N17

Amp r

pMX-puro-Rac1N17-GFP

GFP-Rac1(N17) fusion proteinをPax5PBに入れ、ソートした高発現細胞をRAG-/-マウスに注入した。

GFPnon lo hi

non lo hinon lo hi34 18 19

34 18 1934 18 19

長い間、分化能を保ったままin vitroで培養できる。レトロによる遺伝子導入、選択が容易。凍結保存できるので、いちど遺伝子導入細胞を確立してしまえば繰り返し実験できる。

プロＢ細胞による造血系細胞（Ｔ細胞）再構築　まとめ

Ｔ細胞へと分化できる細胞はHSC（骨髄、臍帯血中、胎児肝細胞）と、Pax5-/- ProB細胞のみin vitroで5日以上培養できるのは Pax5-/- ProB細胞だけ

Pax5-/-ProB細胞の実験系の特徴

Cons１．再構成の割合が常に一定でないので、数の比較ができない２．Pax5遺伝子欠損による影響（があれば）を阻止できない