IDENTIFIKASI DAN UJI ANTIBIOTIK BAKTERI GRAM-

NEGATIF PADA SAMPEL URIN PENDERITA INFEKSI

SALURAN KEMIH (ISK)

SKRIPSI

SUYATI

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI PAPUA

MANOKWARI

2010

ABSTRAK

Suyati. Identifikasi dan Uji Antibiotik Bakteri Gram-Negatif pada Sampel Urin

Penderita Infeksi Saluran Kemih (ISK). Dibimbing oleh Rina A. Mogea dan D.K

Erari.

Infeksi saluran kemih merupakan infeksi bakteri yang terjadi di saluran

kemih, yang kejadiannya di Indonesia masih cukup tinggi. Antibiotik merupakan

kelompok obat yang digunakan untuk mengobati penyakit infeksi, temasuk

infeksi saluran kemih. Penggunaan antibiotik yang tidak rasional akan

mempercepat berkembangnya kuman penyebab infeksi yang resisten. Penelitian

ini bertujuan untuk mengetahui bakteri Gram-negatif pada sampel urin penderita

ISK dan mengetahui kepekaan antibiotik terhadap bakteri yang berhasil

diidentifikasi. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode

deskriptif dan hasil yang didapat ditampilkan dalam bentuk tabel dan gambar.

Hasil menunjukkan bakteri yang didapat pada sampel urin penderita ISK adalah

bakteri Gram-negatif bentuk batang atau basil dari famili Enterobacteriaceae

adalah Escherichia coli (3 isolat), Serratia marcencens (1 isolat), Kluyvera

ascorbata (1 isolat) dan Hafnia alvei (1 isolat). Hasil perhitungan persentasi

bakteri penyebab infeksi saluran kemih berturut-turut dari yang tertinggi adalah E.

coli (60%), K. ascorbata (20%) dan H. alvei (20%). Berdasarkan uji antibiotik,

streptomicin bersifat sensitif terhadap bakteri E. coli, S. marcescens, dan K.

ascorbata. Sedangkan bakteri H. alvei bersifat resisten terhadap antibiotik

penisilin, streptomisin dan neomisin.

Kata kunci: infeksi saluran kemih, bakteri Gram-negatif, antibiotik

IDENTIFIKASI DAN UJI ANTIBIOTIK BAKTERI GRAM-

NEGATIF PADA SAMPEL URIN PENDERITA INFEKSI

SALURAN KEMIH (ISK)

SUYATI

Skripsi merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains dari

Universitas Negeri Papua

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI PAPUA

MANOKWARI

2010

RIWAYAT HIDUP

Penulis lahir di Trenggalek 10 September 1987, anak pertama dari tiga

bersaudara dari pasangan Bapak Mislani dan Ibu Tumini. Pada tahun 1996

penulis terdaftar pada SD INPRES SP XI dan lulus pada tahun 2001. Pada tahun

yang sama penulis melanjutkan pendidikan ke SMP N 7 Warmare dan lulus pada

tahun 2003. Pada tahun 2003 penulis melanjutkan pendidikan di SMA 2

Manokwari dan lulus pada tahun 2006. Pada tahun yang sama melalui jalur

Seleksi Mahasiswa Andalan Masuk Universitas Negeri Papua (SESAMA-

UNIPA) penulis terdaftar dan melanjutkan studi pada Jurusan Biologi FMIPA

UNIPA.

Selama kuliah penulis pernah menjadi asisten mata kuliah Mikrobiologi

untuk mahasiswa D3 Keperawatan pada tahun 2010. Penulis juga pernah

menerima beasiswa peningkatan prestasi akademik (PPA).

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI.......... i DAFTAR GAMBAR..... iii DAFTAR TABEL.......... iv DAFTAR LAMPIRAN.. v I PENDAHULUAN.......

1.1 Latar Belakang........ 1 1.2 Masalah....... 3 1.3 Tujuan dan Manfaat....

3

II TINJAUAN PUSTAKA............. 2.1 Bakteri.............. 4

2.2 Fisiologi dan Pertumbuhan Bakteri...... 5 2.3 Metabolisme Bakteri.... 7 2.4 Identifikasi Bakteri. 7 2.5 Media Pertumbuhan Bakteri .. 9 2.6 Infeksi Saluran Kemih........ 10 2.7 Antibiotik .. 11

III METODE PENELITIAN. 3.1 Tempat dan Waktu.. 14 3.2 Obyek, Alat dan Bahan .. 14 3.3 Metode Penelitian............................... 14 3.4 Variabel Pengamatan.. 14 3.5 Teknik Penelitian 15

3.5.1 Persiapan Awal... 15 3.5.2 Teknik Pengambilan Sampel. 15 3.5.3 Identifikasi Bakteri Gram-Negatif............................................. 15

3.5.4 Isolasi ............................ 15 3.6 Uji Antibiotik.... 21

3.6.1 Pembuatan Stok Suspensi Bakteri............................................. 21

3.6.2 Pembuatan Uji Antibiotik .. 21 3.7 Analisis Data...... 22

IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...... 4.1 Hasil Identifikasi Bakteri pada Sampel Urin Penderita ISK 23 4.2 Hasil Uji Antibiotik Bakteri pada Sampel Urin Penderita ISK......... 39

V KESIMPULAN DAN SARAN.... 5.1 Kesimpulan.... 42 5.2 Saran... 42

DAFTAR PUSTAKA . LAMPIRAN .............................

DAFTAR GAMBAR

Halaman

4.1 Koloni Bakteri Serratia marcescens.......... 23

4.2 Pewarnaan Gram Bakteri Serratia marcescens...... 23

4.3 Sifat Serratia marcescens pada Media KIA. 24

4.4 Hasil Uji Biokimia Bakteri Serratia marcescens .. 24

4.5 Koloni Escherichia coli............. 25

4.6 Pewarnaan Gram Escherichia coli ....................................................... 25

4.7 Sifat Bakteri Escherichia coli pada Media KIA.... 26

4.8 Hasil Uji Biokimia Escherichia coli...... 26

4.9 Koloni Kluyvera ascorbata............. 27

4.10 Pewarnaan Gram Kluyvera ascornata..... 27

4.11 Sifat Kluyvera ascorbata pada Media KIA..... 28

4.12 Hasil Uji Biokimia Kluyvera ascorbata........... 28

4.13 Koloni Hafnia alvei....... 29

4.14 Pewarnaan Gram Hafnia alvei.......... 29

4.15 Sifat Hafnia alvei pada Media KIA..................................................... 30

4.16 Hasil Uji Biokimia Hafnia alvei........... 30

4.17 Uji Antibiotik Kluyvera ascorbata...................................................... 39

4.18 Uji Antibiotik Escherichia coli........................................................... 39

4.19 Uji Antibiotik Hafnia alvei ................................................................. 39

4.20 Uji Antibiotik Serratia marcescens .................................................... 39

DAFTAR TABEL

Halaman

3.1 Kemampuan Penghambatan Antibiotik..... 22

4.1 Hasil Pengamatan Mikroskopis, Makroskopis dan Uji Biokimia

Bakteri pada Sampel Urin Penderita ISK.......

31

4.2 Hasil Hitung Koloni Bakteri pada Sampel Urin Penderita ISK.............. 35

4.3 Persentasi Bakteri Penyebab Infeksi Saluran Kemih 38

4.4 Hasil Uji Daya Hambat Antibiotik.... 40

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1. Tabel Identifikasi Bakteri Basil Gram-negatif ......................................... 46

2. Komposisi dan Pembuatan Media........................................................... 48

3. Perhitungan Jumlah Koloni Bakteri pada Sampel Urin Penderita

ISK.........

52

III METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu

Pengambilan sampel urin dilakukan di Rumah Sakit Umum Manokwari dan

pengujian sampel dilakukan pada Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Papua.

Penelitian ini berlangsung selama 3 minggu dari tanggal 23 April-13 Mei 2010.

3.2 Objek, Alat dan Bahan

Objek yang diamati pada penelitian ini adalah 7 sampel urin yang diambil di

Rumah Sakit Umum Manokwari. Alat yang digunakan adalah: inkubator, tabung

reaksi dan rak tabung reaksi, ose bulat dan lurus, pH meter, lampu bunsen,

sprider, koloni counter, petridisk, kaca obyek dan penutup glass, mikroskop

(NikonYS100), timbangan analitik (ER-180A), elenmeyer, pipet ukur, hot plate,

gelas piala, gelas ukur, magnetik stirer, lemari pendingin, Autoclaf, botol sampel,

pipet mikro, kamera digital (Canon 4x optical zoom), dan alat tulis menulis.

Bahan yang digunakan adalah: larutan kristal ungu, larutan iodin, alkohol

70%, safranin, minyak emersi, reagen MR, reagen kovacs, reagen PAD, reagen

omiera, media MCA, urea, sitrat, KIA, MIO, PAD, LIA, MR, VP, malonat,

glukosa, laktosa, sukrosa, mannitol, maltosa, NA, NB, antibiotik penisilin,

streptomisin, neomisin, tisu, kapas, sarung tangan, masker, kertas label,

aluminium foil, dan akuades steril.

3.3 Metode Penelitian

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode deskriptif dan

hasil yang didapat ditampilkan dalam bentuk tabel dan gambar.

3.4 Variabel Pengamatan

Variabel yang diamati pada penelitian ini adalah perubahan warna pada

hasil uji, adanya kekeruhan pada media, bentuk morfologi bakteri.

3.5 Teknik Penelitian

3.5.1 Persiapan Awal

a. Melakukan survei awal yaitu dengan mengunjungi Rumah Sakit Umum

Manokwari tempat pengambilan sampel

b. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan

c. Pembuatan medium ( Lampiran 2)

d. Sterilisasi alat dan bahan (medium) yang akan digunakan dalam penelitian

3.5.2 Teknik Pengambilan Sampel

Sampel urin diambil dari Rumah Sakit Umum Manokwari sebanyak 7

sampel kemudian dimasukkan ke dalam botol yang steril lalu ditutup rapat dan

dibawa ke Laboratorium untuk dilakukan analisis lebih lanjut.

3.5.3 Identifikasi Bakteri Gram-Negatif

Identifikasi bakteri dilakukan berdasarkan hasil bentuk morfologi,

pewarnaan Gram dan uji biokimia. Tabel identifikasi bakteri basil Gram-negatif

dapat dilihat pada Lampiran 1.

3.5.4 Isolasi

Kegiatan isolasi bakteri pada sampel urin penderita ISK meliputi inokulasi

pada media selektif, media diferensial dan uji biokimia. Kegiatan isolasi

dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi. Berikut ini adalah

tahapan isolasi bakteri pada sampel urin menurut Gani (2003).

3.5.4.1 Inokulasi Bakteri pada Media Selektif

Pada tahap ini koloni yang tumbuh diamati secara makroskopis meliputi

bentuk, ukuran, tekstur dan warna.

Cara kerja:

Pertama-tama sampel urin yang ada di dalam botol dikocok agar homogen

kemudian diambil sebanyak 10 l menggunakan pipet mikro dan diteteskan pada

media MCA kemudian digores tegak lurus dizig-zag menggunakan ose bulat dan

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Data yang diperoleh dari pertumbuhan

bakteri pada media MCA akan dihitung koloni bakterinya menggunakan koloni

counter. Adapun rumus yang digunakan untuk menghitung koloni bakteri menurut

Gani (2003) adalah:

Jumlah koloni bakteri per ml urin (cfu/ml) = jumlah koloni terduga x 100

Rumus ini digunakan untuk menentukan jumlah koloni bakteri pada sampel urin.

Jumlah koloni bakteri tersebut digunakan untuk memastikan apakah bakteri yang

terdapat pada sampel urin sebagai bakteri penginfeksi (>105) atau bakteri

kontaminan (

merah maka bakteri bersifat Gram-negatif, kemudian difoto

menggunakan kamera digital.

3.5.4.3 Inokulasi Bakteri pada Media Diferensial

Media KIA (klinger iron agar) merupakan media diferensial untuk bakteri

Gram-negatif. Kemampuan bakteri mengubah dekstros dan laktosa serta

kemampuan memproduksi hidrogen sulfida adalah merupakan dasar untuk

mengetahui jenis bakteri tertentu dari pertumbuhannya dalam media ini.

Cara kerja:

Diambil satu ose biakan bakteri dari media MCA kemudian diinokulasi ke

dalam media KIA dengan cara menarik garis lurus pada media dan ditusuk ke

dalam dasar media dan dibuat goresan berbentuk zig-zag di atas permukaan

media. Selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Hal-hal yang

dinilai:

- Dasar : Merah (K: alkali) /kuning (A: acid)

- Lereng : Merah (K: alkali) /kuning (A: acid)

- H2S : Warna hitam antara dasar dan lereng

- Gas : Agar bagian dasar pecah/ada gelembung

Perubahan pH karena adanya fermentasi menyebabkan terjadinya warna kuning,

dengan adanya indikator phenol red. Jika hanya dekstros yang difermentasi maka

dasarnya saja yang akan berwarna kuning, tetapi jika dekstros maupun laktosa

keduanya difermentasi maka dasar dan lerengnya akan berwarna kuning.

Terbentuknya H2S adalah berasal dari natrium tiosulfat dan ferrik ammonium

citrat sebagai sumber sulfur.

3.5.4.4 Uji Biokimia untuk Bakteri Gram-Negatif

Uji biokimia dilakukan dengan menginokulasi biakan bakteri pada media

KIA(klinger iron agar) ke dalam media: Urea, Citrat, MIO (motiliti indol ornitin),

PAD (phenilalanin deaminase), LIA (lysine iron agar), MR (methyl red), VP

(voger proskauer), Malonat, Gula-gula (glukosa, sukrosa, manitol, laktosa,

maltose). Berikut adalah cara kerja dari uji biokimia menurut Gani (2003).

3.5.4.5 Uji Urea

Uji urea bertujuan untuk mengetahui bakteri yang memiliki enzim urease.

Bakteri tertentu dapat menghidrolisis urea dan membentuk amonia dengan

menimbulkan warna merah karena indikator phenol red. Terbentuknya amonia

menyebabkan nilai pH menjadi alkali sehingga jika uji urea terjadi warna merah

muda pada media berarti tes positif.

Cara kerja:

Koloni bakteri pada media KIA diambil dengan menggunakan ose lancip

dan diinokulasi pada media urea, kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 24

jam. Terjadinya warna merah muda pada media berarti tes positif dari warna dasar

media yaitu kuning.

3.5.4.6 Uji Sitrat

Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui jenis bakteri yang mengutilisasi

sitrat. Bakteri yang memanfaatkan sitrat sebagai sumber karbon akan

menghasilkan natrium karbonat yang bersifat alkali, sehingga dengan adanya

indikator brom thymol blue menyebabkan warna biru pada media.

Cara kerja:

Koloni bakteri pada media KIA diambil dengan ose dan diinokulasi pada

media sitrat, selanjutnya diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Terjadi warna

biru pada medium berarti tes positif dari warna dasar media yaitu hijau.

3.5.4.7 Uji Mortiliti

Tujuan untuk mengetahui bakteri yang dites bergerak atau tidak. Pergerakan

bakteri dapat dilihat dengan adanya kekeruhan di sekitar tusukan pada media

karena media dalam keadaan semi solid.

Cara kerja :

Pertumbuhan bakteri diambil sedikit dari media KIA dengan ose lancip

steril dan diinokulasi ke dalam media MIO (motiliti indol ornitin) dengan cara

menusukkan bakteri pada ose hingga ke dasar media, kemudian diinkubasi pada

suhu 370C selama 24 jam. Jika pertumbuhan bakteri hanya pada bekas tusukan

berarti tes negatif, tetapi pertumbuhan yang menyebabkan kekeruhan sebagian

besar dari medium menunjukkan tes positif dari warna dasar media yaitu ungu.

3.5.4.8 Uji Indol

Uji ini bertujuan untuk mendeteksi kemampuan mikroba mendegradasi

asam amino tryptophan. Pembentukan indol dari mikroorganisme dapat diketahui

dengan menumbuhkannya dalam media biakan yang kaya akan tryptophan. Untuk

melihat adanya indol digunakan reagen kovac yang memberikan reaksi warna

merah apabila tes positif.

Cara kerja:

Diambil bakteri biakan pada media KIA sebanyak 1 ose dan diinokulasi

pada media MIO (motiliti indol ornitin) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu

370C. Setelah 24 jam biakan tadi ditambahkan dengan larutan reagen kovacs

sebanyak 0,2 ml, dimana larutan ini digunakan untuk melihat kehadiran indol

yang ditandai dengan terbentuknya cincin merah pada lapisan atas media.

3.5.4.9 Uji Phenylalanine Deaminaase (PAD)

Media PAD merupakan media agar miring. Tujuan dari uji PAD yaitu untuk

mengetahui jenis bakteri yang memiliki enzim Phenylalanine Deaminase.

Cara kerja:

Diambil biakan bakteri pada media KIA kemudian diinokulasikan pada

media PAD dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Setelah 24 Jam

pertumbuhan agar miring ditetesi 5 tetes reagen PAD dan tabung dibolak-balikan

setengah lingkaran hingga reagen menutupi seluruh permukaan agar. Timbulnya

warna hijau dalam waktu 10 menit, berarti tes positif dari warna dasar media yaitu

putih.

3.5.4.10 Uji Voges Proskauer (VP)

Uji ini bertujuan untuk mendeteksi adanya acethyl methyl carbinol yang

diproduksi oleh bakteri tertentu dalam pembenihan VP. Adanya bekteri tertentu

yang dapat memproduksi acethyl methyl carbinol dapat diketahui dengan

penambahan reagen voges proskauer (reagen VP).

Cara kerja:

Biakan bakteri dari media KIA diinokulasi pada media VP dan diinkubasi

selama 24 jam pada suhu 370C. Selanjutnya ditambahkan reagen omiera

kemudian dikocok pelan hingga tercampur dan dibiarkan selama 15 menit,

terjadinya warna orange berarti tes positif dari warna dasar media yaitu putih

bening.

3.5.4.11 Uji Methyl Red (MR)

Uji ini bertujuan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran.

Beberapa bakteri memfermentasi glukosa dan menghasilkan berbagai produk

yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH media pertumbuhan menjadi

5,0 atau lebih rendah. Penambah indikator pH methyl red dapat menunjukan

adanya perubahan pH menjadi asam.

Cara kerja:

Biakan bakteri dari media KIA diinokulasi pada media MR dan diinkubasi

selama 24 jam pada suhu 370C. Pertumbuhan bakteri pada biakan MR selanjutnya

ditetesi dengan 2-3 tetes reagen Methyl Red. Terjadinya warna merah berarti tes

positif dari warna dasar media yaitu putih bening.

3.5.4.12 Uji Malonat

Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui jenis bakteri yang

mendegradasi malonat.

Cara kerja:

Pertumbuhan bakteri dari biakan KIA diambil sedikit dengan ose steril,

kemudian diinokulasi pada malonat broth. Inkubasi pada suhu 370C selama 24

jam. Terjadinya warna biru pada medium berarti tes positif dari warna dasar

media yaitu hijau.

3.5.4.13 Uji Lysine Iron Agar (LIA)

Pada pembenihan ini kemampuan suatu bakteri memproduksi Lysine

Dikarboxylase dapat diketahui dan juga produksi H2S. Lysin Iron Agar adalah

agar semi solid yang mengandung dekstrose dan L-lysine sebagai unsur utama

serta brom cresol purple sebagai indikator. Jika bakteri hanya memfermentasi

dekstros maka dasarnya akan berwarna kuning, tetapi bakteri yang

memfermentasi dekstros serta mendekarboksilase L-lysine, maka pH kembali

menjadi alkali sehingga akan terlihat medium secara keseluruhan berwarna ungu

dengan adanya indikator brom crose purple.

Cara kerja:

Pertumbuhan bakteri pada media KIA diambil sedikit dengan ose steril,

kemudian dimasukan ke dalam dasar tabung agar dan dioleskan ke seluruh

permukaanya kemudia diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Terjadinya

warna ungu pada seluruh bagian perbenihan berarti tes positif. Jika tidak ada

perubahan warna atau dasarnya berwarna kuning maka tes dinyatakan negatif.

3.5.4.14 Fermentasi Karbohidrat (glukosa, laktosa, sukrosa maltosa dan

manitol)

Tujuan untuk mengetahui jenis bakteri yang memfermentasikan jenis

karbohidrat tertentu. Pembenihan gula-gula yang digunakan adalah cair ynag

mengandung satu jenis karbohidrat (kadar 1%) dengan indikator phenol red. Jika,

terjadi fermentasi, medium terlihat berwarna kuning karena perubahan pH

menjadi asam.

Cara kerja:

Koloni bakteri dari media KIA diambil sedikit dengan ose steril dan

diinokulasi pada perbenihan karbohidrat. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam.

Terjadinya warna kuning pada medium berarti tes positif dari warna dasar media

yaitu merah.

Rumus presentasi bakteri pada ISK menurut Samirah dkk (2006).

Persentasi jumlah bakteri i = X 100%

3.6 Uji Antibiotik

Uji kepekaan antibiotik bertujuan untuk mengetahui sejauh mana kepekaan

suatu mikroorganisme terhadap antibiotik tertentu, atau untuk mengetahui sejauh

mana potensi antibiotik tertentu terhadap mikroorganisme secara in vitro.

Penghambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh antibiotik sebagai wilayah

jernih (zona hambat) di sekitar pertumbuhan mikroorganisme. Luasnya wilayah

jernih (zona hambatan) merupakan petunjuk mikroorganisme terhadap antibiotik,

selain itu luasnya wilayah juga berkaitan dengan kecepatan berdifusi antibiotik

dalam media.

3.6.1 Pembuatan Stok Suspensi Bakteri

Cara kerja:

Bakteri dari media KIA yang berumur 24 jam, diambil sebanyak satu ose

kemudian diinokulasi ke dalam media nutrien broth (NB) dan diinkubasi selama

24 jam pada suhu 370C.

3.6.2 Pembuatan Uji Antibiotik

Bakteri yang berhasil diisolasi dari sampel urin selanjutnya diuji dengan

antibiotik penicilin, streptomicin dan neomicin.

Cara kerja:

1. Sebanyak 0,5 ml bakteri dari media NB diteteskan pada media NA dalam

cawan petri kemudian diratakan dengan sprider, kemudian paper disk

antibiotik diletakan di atas media NA.

2. Selanjutnya media NA diinkubasi selama 48 jam pada suhu 370C.

3. Zona hambat atau zona bening di sekeliling paper disk antibiotik kemudian

diukur manggunakan kaliper.

Cara pengukuran zona hambat pertumbuhan bakteri terhadap antibiotik

Zona hambat (mm)

Paper disk

Tabel 3.1 Kemampuan Penghambatan Antibiotik (Gani, 2003).

No Jenis Antibiotik Resisten Intermediet Sensitif

1 Penicilin 13 mm

2 Streptimicin 15 mm

3 Neomicin 13 mm

3.5 Analisis Data

Hasil pengamatan di Labolatorium yang diperoleh merupakan data kualitatif

dan kuantitatif yang disajikan dalam bentuk gambar dan tabel.