SUNU.EZGI

DNA DİZİ (SEKANS) ANALİZ TEKNİKLERİ

Ezgi SALMANLI

DANIŞMANPROF. DR. TANER KARAOĞLU

02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI

2

DNA’nın Yapısı

• DNA, genetik bilginin taşıyıcısıdır ve genetik ürünlerin yapısını belirler• Fonksiyonları;

• Genetik bilginin taşınması• Aktarılması• Proteinlerin kodlanması


3

DNA’nın Yapısı• 1953, Watson & Crick• Monomerleri nükleotit olan linear bir

polimerdir• Helikal simetrili• İki polükleotit zinciri, komplementer• Dış tarafta şeker-fosfat omurgası• İç tarafta bazlar• İki iplikçiğin oryantasyonu antiparaleldir

ve 5’-3’ yönleri birbirinin tersidir.


DNA’nın Yapısı• Monomer, Nükleotit

• Heterosiklik baz• N ve C• Pürin, çift halkalı, Adenin (A) ve Guanin (G)• Pirimidin, tek halkalı, Sitozin, Timin ya da Urasil

• Şeker (Riboz ya da Deoksiriboz)• 1C b-glikozil bağı ile baza bağlı

• Fosfat• 5’-OH grubu fosforile olur• Asidik karakter

02.06.2016 ANKARA ÜNİVERSİTESİ VETERİNER FAKÜLTESİ VİROLOJİ ANABİLİM DALI4

DNA’nın Yapısı• Nükleozitler, baz ve şekerin fosfatsız kombinasyonudur.• Nükleozitlerin serbest şekerinin 5’ –OH grubunun esterleşerek

fosforile olmasıyla nükleotitler oluşur


6

DNA’nın polimerizasyonu• 5’>3’

• Nükleotit şekerinin 3’ karbon atomuna bağlı serbest OH grubu, diğer bir nükleotitin fosfat grubuna hamle yaparak yeni bazı ekler, DNA polimeraz

• Pirofosfat salınır

• Fosfodiester bağı oluşur

• İki sarmal karşılıklı olarak ise bazlar arasındaki Hidrojen bağları sayesinde birarada tutulur.

• Hidrofobik etki ile DNA molekülünün stabilitesi sağlanır

• İki halkalı pürin bazlar, tek halkalı pirimidin bazlar ile karşı karşıya gelir.• A her zaman T ile, iki hidrojen bağı• G her zaman C ile, üç hidrojen bağı


8

Dizi (sekans) Analiz Teknikleri-Tarihçe• DNA molekülündeki nükleotit bazlarının sırasıyla hangi baz olduğunun

belirlenmesine denmektedir.• 1953, DNA’nın çift sarmal yapısının bulunması• 1972, ilk genin sekanslanması• 1977, Sanger ve Maxam-Gilbert• 1977, φX174, ilk tam genom sekansı• 1984, ilk uzun genom Epstein-Barr virüs• 1987, Applied Biosystems, otomasyon


9

DNA Dizi ( Sekans) Analiz Teknikleri- Klasifikasyon• Reaksiyon, seperasyon, tespit ve çıktı analizi• Baz spesifik reaksiyonlar ya da enzimatik zincir uzaması DNA polimeraz• Klasifikasyon ;

1.İlk Nesil Sekans Analiz Teknikleri – Geleneksel Yöntemler- Alan-Maxam Gilbert’in Kimyasal degradasyon yöntemi -Sanger’in enzimatik yöntemi ve varyantları (Sanger sekanslama, Dideoxynükleotit yöntemi, Zincir sonlandırma metodu)2.Gelecek Nesil Sekans Analiz Teknikleri ( İkinci Nesil Sekans Analiz Teknikleri)1) Pirosekans analizi2) Reversible Termination3) Ligasyon ile Sekans Analizi


10

Geleneksel Yöntemler-Maxam-Gilbert Kimyasal Degradasyon Yöntemi

• 1977, Purin ve pirimidinlere hasar veren kimyasallar

1. Baz modifikasyonu2. Modifiye bazın şekerden ayrılması3. DNA iplikçiğinin bu bazın olduğu pozisyondan kırılması

Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)


• ds ya da ssDNA 32P• Pürin;

Dimetil Sülfat (DMS), şeker ile baz arasındaki glikozidik bağı kırarPiperidin, aynı bazın olduğu nükleotitte fosfodiester bağlarını katalizler

DMS ve Piperidin Guanine hasar verir (G)DMS ve Piperidin, formik asit içinde Adenin ve Guanine hasar verir ( A+G)

• Pirimidin; Hidrazin, şeker ile baz arasındaki glikozidik bağı kırar Piperidin, fosfodiester bağlarını katalizler

Hidrazin ve piperidin Timin ve Sitozin nükleotitlerine hasar verir (T+C)Hidrazin ve piperidin, 1.5M NaCl solüsyonu içinde Sitozine hasar verir (C)


13

• Dört reaksiyon poliakrilamid jele yüklenir• Fragmanlar büyüklüklerine göre ayrışırlar• En alttan yukarı doğru okunduğunda 5’-3’ yönünde DNA sekansını verir


Geleneksel Yöntemler-Sanger’in Enzimik Yöntemi• Zincir sonlandırma yöntemi,dideoksi nükleotit yöntemi• 1977, Sanger ve ark.


15

• Metodun orijinalinde;

• P-işaretli primer kalıp DNA’ya bağlanır ve DNA sentezi başlar

• DNA polimeraz dNTP’nin yeni sentezlenen DNA’ya polimerizasyonunu gerçekleştirir.

• Polimerizasyon enzim ddNTP ile zinciri devam ettirmeye çalışana kadar devam eder => chain termination


16

Sanger’in Enzimik Metotu-dNTP ve ddNTP • dNTP ( deoksiribonükleosittrifosfat); deoksiriboz şekeri, azotlu baz ve üç adet

fosfat grubu – iki adet fosfat grubunu polimerizasyon sırasında kaybeder açığa çıkan enerji polimerizasyonun sağlanmasında kullanılır• dATP, dTTP, dCTP, dGTP• Riboz molekülü 2’ ve 3’ karbonlarında, deoksiriboz ise 3’ karbonunda hidroksi

grupları; O-p-O bağları içi gerekli• Ribozun 3. formu OH gruplarından tamamen yoksun: dideoksiriboz• Dideoksiribozlarla oluşturulan dideoksitrifosfat bir polinükleotite girdiği zaman zincir uzaması durur: zincir uzaması inhibitörleri


Geleneksel Yöntemler-Sanger’in Enzimik Yöntemi• Dört reaksiyon miksi hazırlanır ; kalıp DNA, DNA primer’ı, standart

dNTP’ler ve her reaksiyonda bir çeşit ddNTP PCR• ddNTP, dNTP konsenterasyonunun 1% kadar• Polimerizasyon sırasında ddNTP kullanıldığı zaman zincir uzaması durur• Farklı boyutlarda son nükleotiti bilinen fragmentler elde edilir. Hepsinin

5’ ucu aynıdır fakat 3’ uç reaksiyonda kullanılan ddNTP’ye göre değişir.

PAGE


• Her reaksiyon ayrı kuyucukta yürütülür.

• Aşağıdan yukarı DNA’nın sekansı elde edilir.


19

Geleneksel Yöntemler-Sanger’in Enzimik Yöntemi

• Sanger’in enzimik yönteminin zaman içinde çeşitli varyantları geliştirilmiştir. Bunlar;

1.İşaretli primer Yöntemi2.İşaretli dNTP Yöntemi3.İşaretli ddNTP Yöntemi


https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/microbial-genetics-7/bioinformatics-83/dna-sequencing-based-on-sanger-dideoxynucleotides-459-6637/images/sanger-sequencing/

20

İşaretli Primer Yöntemi• 1986, L. Hood ve ark. , Radyoaktif işaret yerine

floresan işaretleri kullanmış ve otoradyografi yerine lazerli floresan detektörlerle baz isimlendirmenin yapılabilirliğini duyurmuş.• 4 reaksiyonda primer dört farklı floresandan

biriyle işaretli, bir tip ddNTP ve dört tip dNTP• Reaksiyon sonunda havuzlanan ürün PAGE’de

tek sırada yürütülmüş ve lazer floresan detektörü ile taranmış. Bigisayar programı yardımı ile kromatogramlar oluşturulmuş


İşaretli ddNTP yöntemi (dye-terminator sequencing)• Jamer M. Prober, floresan işaretli ddNTP • Succinilfloresanslar; SF-505, SF512, SF519, SF526• Büyüklük olarak identiktirler ve aynı yükü taşırlar• ddG, ddC, ddA ve ddT’ye eklenir


21

22

• PCR ile üretilen işaretli DNA fragmentleriPAGE ile ayrılır ve floresan denetleme sistemi tarafından identifiye edilir.• Optik filtreleme sistemi; istenmeyensinyallerin engellenmesi• Ayna; detektörün görüş alanından çıkan ışınlar için dönüş yolu• Filtre; dağılan lazer ışınını yok eder• Kullanılan boyalar emisyon ve absorbsiyon spektrumundaki küçük farklarla ayırt edilir.


23

• Detektörlerden toplanan dijitalleştirilmiş sinyaller, pik bulan bir algoritmada kullanılır ve DNA bantlarının zaman-pozisyonları belirlenir• Piklerin yer-zaman pozisyonları belirlendiğinde istatiksel analizle baz

sırası belirlenir• Tek reaksiyon, tek sıra jel, prematüre sonlanan fragmentler

görüntülenmez• İlk 15-40 baz düşük kalitede• 700-900 bazdan sonra kalite düşer


24

• Floresan işaretler;1) Rhodamin’lerLeroy Hood ve ark.FAM, JOE, TAMRA, ROX

2) dRhodamin’lerRosenblum ve ark.Dichlororhodamine’ler (dRhodamine)Rosenblum ve ark.

3) BigDye boyalar- Enerji Transfer Boyaları5-karboksi-d-rhodamine boyalarını alıcı olarak, 4-aminometilfloresceinin,5 ya da 6- karboksil izomerlerini ise dönör olarak kullanan enerji transfer boyaları


25

• Rhodamine boyalarla yapılan sekans analizlerinde, elektroferogram piklerindeki değişkenlik, baz isimledirme işleminin kesinliğini ve heterozigot mutasyonların tespitini engellemektedir.• G bazını A bazı ve bazen C bazı takip ettiği zaman, G bazının pik

uzunluğu normal G nükleotit pikinden ve önceki A veya C nükleotit pikinden daha az olmaktadır.• G pikleri, suprese bir G pikini de takip ettiğinde de gizlenebilmektedir.



• EO bağlantısı• G piklerinin üstesinden gelinmiştir• BigDye; G piklerinden sonra Zayıf T pikleri

27

Seperasyon- Tabaka Jel Sekans Analizi• PAGE;

Molekülleri büyüklüklerine göre ayıran sistemlerFazla dişli tarak kullanımı verimliliği artırır

Partiküllerin eliminasyonu, dikkatli manipülasyon ve jel dökmenin dikkat ve iş gücü gerektirmesi


28

Seperasyon-Kapillar Elektroforez, CE• Harold Swerdlow ve ark.,• 50nm çapında ısıyı iyi dağıtan sistemlerdir• Yüksek voltajda çalıştırılabilir; koşturma zamanı düşer.• Otomasyona uygun.• Kapillar sistemler ilk olarak poliakrilamid gibi çapraz bağlı polimerlerle, jel doldurmalı

olarak floresan okuyan lazerlerle kullanılmaktaydı ve bunlar tekrar kullanıma imkan vermemekteydi• 1993, Karger ve ark. düşük viskoziteli çapraz bağlı olmayan polimer koşturmadan

sonra geri çekilir ve yeni koşturmada yenisi tekrar kapillara doldurulur.• Multikapillar sistemler;

8-384’lü


30

Büyük Boyutlu Sekans Stratejileri

• 700-800 nt sınırlaması

1) Shotgun, Rastgele Yaklaşım2) Primer walking- primer yürütme stratejisi


31

Shotgun Sekans Analizi• Rastgele yaklaşım• Sekanslanacak bölge üzerinde kontrol yoktur• DNA çeşitli kesim metotları ile 2-3 kb’lık fragmentlere ayrılır• Bu fragmentler bir vektöre aktarılır; M13, plasmid• Bakteriyel kültür’de amplifikasyon• Pozitif klonların purifikasyonu• Her DNA parçası ayrı olarak sekanslanır ve elektronik olarak devamlı

tek bir sekans haline getirilir; sekans toplanması


33

• Shotgun sekansları bilgisayar ortamında contig denen devamlı sekanslar haline getirilmek üzere toplanır• Contig, orijinal kalıp DNA’dan alınan temelle iki ya da daha fazla

sekansın çakışan bölgelerinin okunmasından oluşur.• Otomatik olarak başlayıp manuel olarak düzenleme ile son bulur


34

• Bu işlem için kullanılan bilgisayar programları;

• Vektör sekansını filtreler• Benzerlik skorlaması yapar

• Nadir olarak homojen kalitede tek bir contig ile karşılaşılır

Manuel faz, gap closure (boşluk kapanması), bitirme

Consed



• Her birleştime işlemi için Consed vb editörler bir sekans okuması listesi gösterir.• Manuel denetim aşaması• Konsensus sekansı• Bazen ek sekans reaksiyonu bazen de o bölgenin direk sekansı gerekebilmektedir.

36

Primer yürütme stratejisi• Bilinmeyen DNA sekansı tam boyutlu olarak vektöre insersiye edilipamplifiye edilir• Ticari vektör primerları ilk sekans reaksiyonu için kullanılır,600-650 bazlık bir sekans çıktısı elde edilir• Bu bölge içinden 2. bir spesifikoligonükleotit sentezlenir ve ilkiyle aynı yönü izlerek sekansı 500 bp civarı genişletmek için kullanılır.


37

Gelecek Nesil Sekanslama Teknolojileri• Next generation sequencing, Gelecek Nesil Sekans Analizleri, Büyük

ölçekte paralel sekans analizleri• 454 sekanslama(454 genom sekanslayıcı,roche applied science) • Solexa teknoloji (Illumina genom analyser) • The SOLID platform(Applied biosystem)


38

1)Pirosekans analizi• DNA sentezi sırasında açığa çıkan pirofosfatın (PPi) tespitine dayalı

tekniktir.• Her nükleotit birleştirilmesinde PPİ açığa çıkar• PPİ adenosine 5’ fosfosülfat varlığında ATP sülfürilaz tarafından ATP'ye

dönüştürülür. • ATP, kemiluminesens bir enzim olan, lusiferazın lusiferine okside olması

ve ışık yayması reaksiyonuna enerji sağlar ve substrat olarak görev yapar. Eklenen nükleotit bilindiğinden, kalıbın sekansı tespit edilebilir.• Işık CCD kamera (charge coupled device) tarafından tespit edilir


39

• Kalıp hazırlanması;

emPCR kullanılırStreptavidin kaplı boncuklar


40

1) Solidfaz pirosekanslamaÜçlü enzim sistemi, fazla substrat her basamakta yıkama ile atılır.


41

2) Likit faz pirosekanslama

Dördüncü bir enzim, apirazNükleotit degrade ederTek tüpte pirosekans reaksiyonu


42

• Roche 454

DNA’nın fragmentasyon

Adaptör bağlanması

Boncuklar

Her boncuk mikroplate’e alınır ve kuyucuklar daha küçük boncuklarla doldurulur (sulfurilaz ve lusiferaz)

Zincir uzaması CCD kamera tarafından takip edilir


44

2)Reversible Termination• Kalıp DNA,DNA'nın fragmentasyonu,uçlara adaptörlerin bağlanması• Bu fragmentler daha sonra cam bir yüzeye sabitlenmiş 'çimenlik'

alanda bulunan problara hibridize olurlar.• Burada hem amplifikasyon hem sekanslama gerçekleşir.

Amplifikasyon 'bridge pcr' denen bir teknikle yapılır; yüzeye sabitlenmiş iki primer DNA salkımları oluşturur.


45

• Illumina (SOLEXA) Genome Analyzer

• Sekans kimyası 3 aşamalı;• Zincir uzaması DNA polimeraz ve dört reversible nükleotit sonlandırıcı

ile• Her nükleotit birleşmesinden sonra birleşmeyen nükleotitler yıkanır

ve görüntüleme işlemi yapılır• Görüntülemeden sonra 3’-OH bloke grup kimyasal olarak uzaklaştırılır.• Yeni siklus gerçekleştirilir.


46

3)Ligasyon ile Sekans Analizi• DNA polimeraz içermez• İkişer baz tespit eder• Kalıp DNA, fragmentasyon, adaptör bağlanması, boncuklara hibridizasyon ve

emPCR• Primer ve prob eklenmesi reaksiyonu başlatır• Prob’un ilk iki bazı prob’u tanımlar geri kalan 6 baz dejeneredir• İki baz mümkün tüm kombinasyonları içerir• Prob kalıba hibridize olduktan sonra DNA ligaz tarafından zincire bağlanır.

‘Flow cell’ prob’u uzaklaştırmak için yıkanır ve görüntü kaydedilir ve renk tespit edilir.


47

• Applied Biosystem’s Solid

• Oktamerin son üç bazı floresan boya ile uzaklaştırılır ve geride 5 baz bırakılır• Önceki aşamalar 6. ve 7. bazlar için tekrarlanır. Tipik olarak bu aşama

yaklaşık 10 kez tekrarlanır. Sonuç olarak on adet dinükleotite karşılık gelen floresan renkler tespit edilir (1-2, 6-7, 11-12, 16-17, 21-22, 26-27, 31-32, 36-37, 41-42, 46-47)• İlk primer ve tüm bağlanmış parçalar eritilir • Primer reset, n-1 primer ile devam eder


48

Sonuç• Sekans analizi günümüze kadar birçok gelişme göstermiş ve hala gelişmeye

devam eden bir tekniktir• Temelde araştırıcılar sekans analizini çeşitli hastalıkların tanımlanmasında

kullanmaktadırlar• Globalizasyon Yeni patojenler (Marburg, Severe Acute respiratory

Syndrome)• Otomatik sanger sekans analiz platformları insan genom projesinin 13 yıldan kısa

bir sürede tamamlanmasını sağlamış olsa da teknoloji hala çok fazla DNA, reagent, işgücü gerektirmektedir.• Oxford’s Nanopore tech., elektriksel potansiyel• ZS Genetics, EM


49

Teşekkürler


SUNU.EZGI

Documents

Transcript of SUNU.EZGI