Studie van de bloed-hersenbarrière in twee ratmodellen van ......Studie van de...

Studie van de bloed-hersenbarrière in twee

ratmodellen van hepatische encefalopathie.

Samia El-Barkani

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. H. Van Vlierberghe

Begeleider: Dr. C. Van Steenkiste

Vakgroep Inwendige ziekten

Academiejaar 2012-2013

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor

consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk

gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in

het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te

vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Datum:17/5/2013

Samia El-Barkani Prof. Dr. Hans Van Vlierberghe

Dankwoord

Ik wil graag gebruik maken van de gelegenheid om de vele mensen die me geholpen,

gesteund en geïnspireerd hebben bij het realiseren van dit eindwerk persoonlijk te bedanken.

In de eerste plaats wil ik mijn promotor Hans Van Vlierberghe en begeleider Christophe Van

Steenkiste hartelijk bedanken voor hun grote steun, raad en uitstekende begeleiding

gedurende de voorbije twee jaar. Dankzij hen heb ik meer vertrouwen gekregen in mijn eigen

kunnen en is mijn enthousiasme nog meer aangewakkerd.

Daarnaast wil ik voornamelijk Marijke de Bock bedanken voor alles wat ze voor mij heeft

gedaan, geen taak was teveel voor haar en haar optimistische houding heeft ook op mij een

postieve invloed gehad.

Verder wil ik Julien Dupont, Yedong Fan, dr. Calle en de laborantes bedanken voor hun

spontane hulp en bijdrage tot het realiseren van dit werk.

Tenslotte wil ik mijn vriendinnen, familie, ouders, zus en broers bedanken voor de steun,

wijze raad en gezellige momenten die we samen hebben meegemaakt gedurende de hele

opleiding!

Kortom, bedankt allemaal!

Samia El-Barkani

INHOUDSTAFEL

0. Samenvatting ................................................................................................ 1

1. Inleiding ........................................................................................................ 2

1.1 De bloed-hersenbarrière ................................................................................................2

1.2 De lever ........................................................................................................................5

1.3 Pathofysiologie van hepatische encefalopathie ..............................................................7

1.4 Symptomen ................................................................................................................. 12

1.5 Diagnose ..................................................................................................................... 12

1.6 Huidige behandelingsvormen ...................................................................................... 13

1.7 Doelstellingen en studieopzet ...................................................................................... 14

1.8 Toekomstperspectieven ............................................................................................... 15

2. Materialen en methode............................................................................... 17

2.1 Diermodellen .............................................................................................................. 17

2.2 Functionele tests .............................................................................................................

2.2.1 Reflexen en gedragsobservaties ......................................................................... 19

2.2.2 Open Field Test (OFT) ...................................................................................... 20

2.3. Bloedanalyse .............................................................................................................. 21

2.4 In vivo bepaling van de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière ............................. 22

3. Resultaten ................................................................................................... 26

3.1 Functionele testen .........................................................................................................

3.1.1 Reflexen en gedragsobservaties ............................................................................ 26

3.1.2 Open Field Test .................................................................................................... 27

3.2 Bloedanalyse ............................................................................................................... 32

3.3 Gewichtstoename ........................................................................................................ 33

3.4 In vivo bepaling van de BHB-permeabiliteit ................................................................ 33

3.5 Correlatiestudies ......................................................................................................... 38

4. Discussie ...................................................................................................... 40

4.1 Functionele testen .......................................................................................................

4.1.1 Reflexen en gedragsobservaties ............................................................................ 40

4.1.2 Open Field Test .................................................................................................... 41

4.2 Bloedanalyse ........................................................................................................... 42

4.3 Gewicht en uitwendige observaties .......................................................................... 44

4.4 In vivo bepaling van de BHB-permeabiliteit ............................................................ 44

5. Algemeen besluit ......................................................................................... 46

6. Referentielijst ............................................................................................. 47

1

0. Samenvatting

Hepatische encefalopathie (HE) is een syndroom dat gekenmerkt wordt door mentale en

neuromusculaire stoornissen die kunnen optreden als complicatie bij ernstige acute of

chronische leverziekten en –ontstekingen. Wereldwijd zijn alcoholmisbruik, hepatitis B,

hepatitis C en niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) de voornaamste oorzaken van

leverziekten. Afhankelijk van de ernst en oorzaken van het ontstaan van het syndroom kan HE

in drie grote klassen (A, B en C) opgedeeld worden, maar gaat bij de mens steeds gepaard met

neuromotorische stoornissen. Omdat tegenstrijdigheden teruggevonden werden in de

literatuur of er al dan niet relevante verschillen in motorische activiteit zijn tussen gezonde en

experimentele ratten, werd in dit experiment getracht om aan de hand van bloedanalyses en

een aantal functionele tests HE klinisch en biochemisch op te sporen. Voor deze bloedanalyse

werden albumine, alkalisch fosfatase enzyme (ALP), bilirubine, glucose, zink en

ammoniakwaarden geanalyseerd. Om hun (neuro)motorische activiteit op te volgen werden de

ratten wekelijks aan een Open Field Test (OFT) en tweemaal per week een aantal functionele

testen onderworpen. In deze studie werd HE klinisch en biochemisch aangetoond bij de

experimentele ratmodellen. Er werden echter niet altijd significante verschillen aangetoond

voor bepaalde geanalyseerde parameters van de OFT.

Daarnaast vermoedden we dat een aantasting van de BHB permeabiliteit aan de basis ligt van

het ontstaan van neuromotorische stoornissen. Dit hebben we nagegaan door een in vivo

bepaling van de BHB permeabiliteit met behulp van de fluorescente merkers 3 kDa dextraan-

fluoresceïne en 376 Da fluoresceïne.

Met de gebruikte fluorescente merkers kon echter geen verschil in in vivo permeabiliteit

aangetoond worden tussen de experimentele en controle groepen. Dit zou te wijten kunnen

zijn aan de keuze van de fluorescente merker of de te kleine steekproefgrootte. Anderzijds kan

dit ook een indicatie zijn dat de permeabiliteit op zich niet significant wijzigt maar dat

bepaalde deelmechanismen falen. Een vervolgstudie is vereist waarbij een keuze wordt

gemaakt voor een specifiekere en grotere fluorescente merker, een grotere steekproefgrootte

of studie van andere deelmechanismen die bijdragen tot een goede werking van de bloed-

hersenbarrière.

2

1. Inleiding

Hepatische encefalopathie (HE) is een syndroom dat gekenmerkt wordt door mentale en

neuromusculaire stoornissen die kunnen optreden als complicatie bij ernstige acute of

chronische leverziekten en –ontstekingen (1). Zoals uit de naamgeving blijkt, zijn bij dit

syndroom twee belangrijke organen betrokken: de hersenen en de lever. Om de

pathofysiologie van het syndroom te begrijpen, zal eerst de algemene bouw en functie van

deze organen besproken worden.

1.1 De bloed-hersenbarrière

A. Bouw

Fig. 1: Schematische voorstelling BHB met rondom de haarvaten endotheelcellen verbonden met tight

juncties, een dikke basaal membraan, pericyten, astrocyten en microgliacellen (2).

De bloed-hersenbarrière (BHB) is een semipermeabele barrière tussen de bloedvaten van de

systemische circulatie en de hersenen zelf, waarlangs stoffen selectief worden doorgelaten (2).

De BHB is opgebouwd uit endotheelcellen, een dikke basaal membraan, pericyten, astrocyten

en microgliacellen (figuur 1). De endotheelcellen van de haarvaten van het centraal

zenuwstelsel worden omgeven door een dikke basaal membraan, wat zorgt voor een stevige

basis door verankering aan naburige cellen. Daarnaast zijn in de basaal membraan nog

cellulaire adhesiemoleculen (CAM’s) gevestigd, evenals signaaleiwitten. Pericyten of

myofibroblasten zijn langgerekte contractiele cellen die tegen de endotheelcellen aan liggen

en de bloedflow helpen regelen. Deze cellen kunnen ook fungeren als oligopotente stamcellen

3

(3). Astrocyten zijn steuncellen gelegen tussen de bloedvaten en zenuwcel. Zij staan onder

andere in voor de regulatie van de extracellulaire ion homeostase, neurotransmittertransport

en regulatie van de neuronale prikkelbaarheid (4). Microgliacellen zijn macrofagen van het

centraal zenuwstelsel en spelen een rol in het immuunrespons.

Deze structuren van de BHB vormen samen met neuronen een neurovasculaire eenheid. Dit

uniek afweersysteem is aanwezig in bijna alle hersenregio’s en strekt zich uit langs alle

haarvaten van het centrale zenuwstelstel, met uitzondering van de regio’s die instaan voor de

regulatie van het autonoom zenuwstelsel en endocriene klieren.

Een optimale wisselwerking tussen de verschillende structuren vereist de aanwezigheid van

gap juncties, tight juncties, adhesiemoleculen en solubele factoren. Endotheelcellen die de

haarvaten van het centraal zenuwstelsel omgeven zijn via hun celmembraan aan elkaar

verbonden. Zij vormen zo tight juncties, opgebouwd uit onder andere claudine en occludine-

eiwitten, cadherines en zonula occludens eiwitten (5). Deze juncties vormen zo een barrière

voor moleculen en ionen in de tussenruimte zodat het transcellulair transport wordt behouden,

zoals weergegeven in figuur 2. Cel-cel contacten vertonen een onderlinge functionele

afhankelijkheid en signaaltransductie worden mogelijk gemaakt door verschillende eiwitten:

Serine- , threonine- en tyrosinekinasen, G-eiwitten, proteasen en cytokines. Daarnaast is de

intracellulaire calciumconcentratie een belangrijke factor voor het behoud van de BHB-

permeabiliteit.

Fig. 2: Het transcellulair transport van solubele of apolaire factoren doorheen de BHB gebeurt via

verschillende mechanismen. De voornaamste zijn passieve diffusie en receptor-afhankelijk transport.

Polaire factoren kunnen niet doorheen de BHB migreren (2).

Gap juncties zijn kanalen die zelfstandig en gecoördineerd kunnen samentrekken, afhankelijk

van de calciumconcentratie, en staan in voor de uitwisseling van ionen en kleine moleculen

4

tussen cellen. Gap juncties zijn opgebouwd uit twee halve kanalen of connexons die zelf uit 6

connexine-eiwitten bestaan (figuur 3).

Fig. 3: Schematische voorstelling van de structuur van gap juncties. Deze vormen kanalen tussen de

plasmamembranen van naburige cellen om cel-cel interacties mogelijk te maken (6).

B. Functies

Dankzij deze dynamische en beperkt doordringbare barrière worden de hersenen beschermd

tegen verschillende pathogenen en toxische stoffen. Daarnaast is een constant intern milieu

noodzakelijk voor een goede werking van de neurovasculaire eenheid. Deze fysiologische

omgeving wordt behouden door middel van specifieke en actieve transportmechanismen die

instaan voor een constante aanvoer van nutriënten en stofwisselingsproducten. Daarnaast zal

de regulatie van de ion homeostase wijzigingen in de concentratiegradiënten en bloedwaarden

beperken (5).

Zowel een beschadiging van het basaal membraan als wijzigingen in de matrixstructuur

hebben een negatieve invloed op de werking van de neurovasculaire eenheid. Het

disfunctioneren van één component van de neurovasculaire eenheid heeft een invloed op

verschillende pathways die vaak leiden tot een verhoogde BHB-permeabiliteit in

verschillende neuropathologieën, waaronder Alzheimer en de ziekte van Parkinson.

De aanwezigheid van pro-inflammatoire stoffen als TNFα en interleukines (IL) wordt gezien

bij wijzigingen in de lokale omgeving en kunnen deze regulatiemechanismen verstoren.

Daarnaast werd aangetoond dat astrocyten stikstofoxide (NO), glutamaat, cytokines en ATP

vrijstellen in pathologische omstandigheden wat leidt tot een verhoogde BHB-permeabiliteit

5

(4). De permeabiliteit van gap juncties kan bovendien wijzigen onder invloed van onder

andere een verhoogde [Ca2+

]i , verlaagde [Ca2+

]ex en daling van de intracellulaire pH.

1.2 De lever

A. Bouw

De lever is een groot orgaan (1,5 kg) dat zich bevindt in het abdomen net onder het diafragma

en is opgebouwd uit acht kwabben, die elk gedeeltelijk door ligamenten gescheiden worden.

De lever wordt van bloed voorzien door twee bloedtoevoerkanalen: de vena portae en de

arteria hepatica. Het bloed verlaat de lever via de vena hepatica.

B. Functies

De lever is één van de grootste en belangrijkste organen bij de mens en vervult verschillende

taken. Het speelt een rol bij de eiwit-, vet- en koolhydraatstofwisseling, maakt gal aan, slaat

verschillende belangrijke stoffen zoals vitaminen, ijzer en vetten op en ontgift het lichaam

door een efficiënte afbraak van diverse stoffen zoals alcohol en medicijnen.

In fysiologische omstandigheden wordt het bloed vanuit de buikorganen via de vena portae

naar de lever getransporteerd. Daar worden de opgenomen (toxische) afbraak- en

voedingsstoffen gemetaboliseerd zodat de giftige stoffen de algemene circulatie niet zullen

bereiken. Ammoniak is een belangrijk afbraakproduct van eiwitten en wordt normaal via de

ureumcyclus (die doorgaat in de lever) in ureum omgezet om het lichaam via de urine te

verlaten (7). Sommige leverziekten worden gekenmerkt door een aftakeling van de

leverfunctie die gepaard gaat met onder andere een verminderde afbraak van toxische stoffen

en metabolieten. Wanneer neurologische verschijnselen ontstaan ten gevolge van leverfalen

spreekt men van hepatische encefalopathie.

C. Leverziekten

Hepatische encefalopathie treedt op als symptoom wanneer de patiënt lijdt aan een acute of

chronische leverziekte. Wereldwijd zijn alcoholmisbruik, hepatitis B, hepatitis C en niet-

alcoholische steatohepatitis (NASH) de voornaamste oorzaken (8, 9).

Alcohol blijft het meest gebruikte genotsmiddel in Europa. Meer dan 5% van de Europeanen

kampt met een alcoholprobleem (10). Er is sprake van een alcoholprobleem wanneer de

6

richtlijn van 21 en 14 standaardglazen per week voor respectievelijk mannen en vrouwen

wordt overschreden.

Hepatitis B en C worden veroorzaakt door een virale infectie waarbij de levercellen

beschadigd worden door een immuunrespons van het lichaam. Deze virussen kunnen van

mens op mens overgedragen worden door blootstelling aan geïnfecteerde

lichaamsvloeistoffen en bloed. Er wordt geschat dat zo’n 3% van de wereldbevolking is

besmet met hepatitis C, terwijl tot 15% van de wereldbevolking drager is van het hepatitis B

virus.

Het aantal gevallen van obesitas is de voorbije decennia wereldwijd sterk toegenomen en

wordt gelinkt aan verschillende complicaties zoals hart- en vaatziekten, diabetes en NASH.

Deze laatste complicatie wordt ook wel een niet-alcoholische leverontsteking genoemd,

waarbij initieel een omkeerbare vervetting van de lever optreedt. Naarmate de vervetting blijft

doorgaan, treedt een chronische leverontsteking op.

In alle gevallen treedt op termijn een hepatocellulaire destructie op. Bij een deel van de

patiënten (5 tot 10% voor hepatitis B, 30% voor hepatitis C, 15% voor alcohol en 20% voor

NASH) treden er verdere complicaties op en evolueert dit van een acute naar een chronische

hepatocellulaire destructie. Eens dit stadium bereikt wordt, treedt er in de lever een definitieve

vorming op van niet-functioneel littekenweefsel wat gedefinieerd wordt als levercirrose

(figuur 5). De lever is dan niet meer in staat om efficiënt te functioneren. Daarnaast treedt er

een verharding op van de lever, waardoor de doorbloeding in het gedrang komt vanwege de

zeer hoge druk. Dit wordt beschreven als portale hypertensie.

Naast onder andere ascitesvorming, leverfalen en hepatische encefalopathie als complicaties

zal 10 tot 20% van de cirrosepatiënten uiteindelijk een hepatocellulair carcinoom (HCC)

ontwikkelen. 2,5 % van alle sterfgevallen zullen uiteindelijk te wijten zijn aan cirrose en/of

HCC.

7

Fig. 5: Uitzicht normale en lever bij cirrose (11)

1.3 Pathofysiologie van hepatische encefalopathie

Afhankelijk van de ernst en oorzaken van het ontstaan van het syndroom kan HE in drie grote

klassen (A, B en C) opgedeeld worden (1, 12). Type A HE ontstaat bij acuut leverfalen ten

gevolge van een snelle en ernstige inflammatoire reactie en kent een slechte prognose waarbij

80 à 90 procent van de patiënten sterft (13). Gevallen van portocavale shunts (PCS) zonder

bijkomende leverziekten waarbij HE optreedt, worden gegroepeerd als type B HE. Deze

portocavale shunt is een extra aangelegd bloedvat dat de vena portae verbindt met de vena

cava inferior, die naar het hart loopt. Een gevolg hiervan is dat het bloed grotendeels via de

vena portae om stroomt naar de vena cava inferior en onveranderd de algemene circulatie

bereikt. Chronische leverziekten waarbij HE als complicatie optreedt wordt gedefinieerd als

type C HE.

Alle vormen van HE worden veroorzaakt door een insufficiënte metabolisatie en detoxificatie

van stoffen door de lever. Verschillende stoffen en neurotoxines zoals ammoniak en mangaan

komen hierdoor onveranderd in de bloedbaan terecht. Deze kunnen leiden tot wijzigingen in

diverse neurotransmittersystemen, een veranderde intracerebrale energiehuishouding en

veranderingen in de bloed-hersenbarrière permeabiliteit (1).

8

A. Glutamaat-glutaminesysteem

Ammoniak blijft een van de belangrijkste factoren in de pathogenese van HE (1). Ammoniak

wordt gevormd uit stikstofbronnen uit voedingsmiddelen (voornamelijk eiwitten), deaminatie

van het aminozuur glutamine en bij de afbraak van ureum (ureumcyclus). Bij leverlijden

komen hoge concentraties ammoniak vrij in de bloedbaan. Een deel van het ammoniak dat

niet meer door de lever kan gemetaboliseerd worden, zal via de skeletspieren en nieren

geklaard worden om zo de ammoniakwaarden te beperken. Toch zullen deze alternatieve

afbraakmechanismen niet voldoende in staat zijn de ammoniakwaarden laag te houden

(figuur 6).

Astrocyten staan in voor het constant houden van onder andere de osmolariteit, pH, volume

en neurotransmitterconcentraties. De release van mediatoren en interacties tussen astrocyten

wordt mogelijk gemaakt door de aanwezigheid van connexine-43 kanalen in de membranen,

ionkanalen en transporters. Zelfs kleine wijzigingen van de fysiologische omstandigheden

kunnen een invloed hebben op de permeabiliteit van deze connexinekanalen.

In fysiologische omstandigheden zullen de astrocyten via de metabolisatie van glutamaat tot

glutamine ammoniak metaboliseren (reactie: Glutamaat + NH3 → glutamine) die dan

getransporteerd wordt naar presynaptische neuronen. Deze reactie is belangrijk voor een

goede werking van de neurovasculaire eenheid. Glutamaat is een exciterende neurotransmitter

en is belangrijk voor verschillende hersenfuncties. Glutamine is een aminozuur dat wordt

gebruikt als organisch osmolyt om het celvolume constant te houden. Glutaminase is een

enzym dat instaat voor de deaminatie van glutamine en is gelokaliseerd ter hoogte van de

mitochondria van de astrocyten.

9

Fig. 6: Vorming en metabolisme van ammoniak. Porto-systemische shunts en leverfalen veroorzaken

een verhoging van de ammoniaklevels in het bloed. Dit induceert storingen in astrocyten, het

glutamaat-glutaminesysteem, alsook de astrocyt-neuron interacties (1).

Door de concentratieverhoging van ammoniak zal het glutaminesynthetase in astrocyten

geactiveerd worden waardoor de omzetting van glutamaat naar glutamine wordt bevorderd.

De glutamaat-glutamine uitwisseling tussen neuronen en astrocyten zal dus wijzigen. De

intracellulaire osmolariteit stijgt waardoor astrocytaire zwelling zal optreden (12). Daarnaast

raakt de intracerebrale energiehuishouding verstoord.

Type A HE wordt gekenmerkt door cytotoxisch oedeem en intracraniale hypertensie.

Astrocytaire zwellingen die ontstaan ten gevolge van type B en C HE worden Alzheimer type

II astrocyten genoemd. Deze zwellingen manifesteren zich in een gewijzigde expressie van

genen die coderen voor astrocytaire eiwitten, zwelling van de nucleus en

glycogeenaccumulaties. Type C HE wordt volgens sommige studies geassocieerd met een

significante neuronale celdood, terwijl in andere studies sprake is van significante neuronale

celdood in een beperkt aantal gevallen van type C HE (12, 14). Wel staat vast dat bij HE

voornamelijk Purkinje cellen aangetast worden en is de mate van aantasting veel groter bij

chronisch alcoholmisbruik (15). Deze cellen komen dicht gestapeld voor in de cerebellaire

cortex, die een belangrijke rol speelt in de coördinatie van motorische bewegingen en het

behoud van evenwicht.

10

B. Inflammatoire reacties en synergisme

Naast ammoniak treden ook verhoogde concentraties op van andere inflammatoire stoffen. In

pathologische omstandigheden zullen astrocyten stikstofoxide (NO), glutamaat, cytokines en

ATP vrijstellen. Pro-inflammatoire cytokines zoals TNFα en interleukines (IL) worden in

gevallen van HE geproduceerd door zowel de lever als de hersenen (12). Een aantal studies

hebben aangetoond dat bepaalde toxines elkaars effect synergetisch versterken (12). Deze

interacties zijn al beschreven voor ammoniak, mangaan, pro-inflammatoire cytokines, fenolen

en thiolen. Ammoniak en mangaan activeren de perifere of mitochondirale type

benzodiazepinereceptoren (PTBR) wat leidt tot een verhoogde neurosteroïdensynthese en een

versterkte GABA-erge neurotransmissie zoals weergegeven in figuur 7. Perifere

benzodiazepinereceptoren komen bijna exclusief voor op astrocyten en microgliacellen. Zij

staan in voor een gefaciliteerde opname en transport van cholesterol doorheen het

mitochondrion van astrocyten. Een activatie van PTBR in de hersenen leiden tot een

verhoogde synthese van een nieuwe klasse van componenten die uit cholesterol worden

gevormd. Deze worden neurosteroïden genoemd en kunnen gemakkelijk de BHB doordringen

waar ze bepaalde processen kunnen exciteren en/of inhiberen. Zo kunnen neurosteroïden

fungeren als GABA-a receptor agonisten. GABA of γ- aminoboterzuur is de belangrijkste

inhiberende neurotransmitter in de hersenen en heeft een remmende invloed op andere

neurotransmitters. Een versterkte GABA-erge neurotransmissie veroorzaakt onder andere

concentratiestoornissen.

11

Fig. 7: Schematische voorstelling van het synergetisch effect van ammoniak en mangaan op de

astrocytaire perifere of mitochondriale type benzodiazepinereceptoren (PTBR) (12).

C. Invloed op de hersenen

In de hersenen treden samengevat twee belangrijke mechanismen op. Ten eerste treden

abnormaliteiten in het metabolisme van neurotransmitters en aminozuren op zodat ook de

osmotische druk (secundair) wijzigt, zoals hierboven besproken. Ten tweede wordt

neurotoxiciteit geïnduceerd door oxidatieve en nitrosatieve stress, uitgelokt door verhoogde

ammoniakconcentraties (1, 13). Oxidatieve stress ontstaat wanneer vrije radicalen gevormd

worden en tyrosinatie van herseneiwitten plaatsvindt. Dit heeft een grote impact op de

mitochondriale functies en kan secundair leiden tot een verstoorde neurotransmissie en

zwelling van de astrocyten. Nitrosatieve stress kan ontstaan door een falende verwerking van

schadelijke stikstofcomponenten. Ammoniakmoleculen zijn hierbij in staat om de

intracellulaire calciumconcentraties te verhogen die op hun beurt een hele reeks Ca2+

afhankelijke enzymen kunnen activeren die naast het NO-synthetase ook de synthese van

andere reactieve moleculen kunnen verhogen.

12

1.4 Symptomen

De klachten ontstaan niet altijd geleidelijk aan maar zijn wel steeds neuropsychologisch van

aard (16). De symptomen kunnen in vier graden onderverdeeld worden. Patiënten die

symptomen hebben van de eerste graad kunnen last hebben van slapeloosheid, beven, een

verminderd concentratievermogen en abnormale gedragingen zoals vergeetachtigheid en

stemmingswisselingen. In een tweede stadium zullen naast de bovenvermelde symptomen

ook een verlies van het tijdsbesef optreden alsook desoriëntatie. Angst en verergering van de

symptomen worden vastgesteld in de derde fase. Een eindstadium zal bereikt worden wanneer

persoonlijkheidskenmerken ontbreken of wanneer de patiënt in (sub)coma geraakt.

Type B en C HE kunnen, afhankelijk van de kenmerken, nogmaals onderverdeeld worden in

episodische of onregelmatige, minimale en persistente types zoals weergegeven in figuur 8.

De neurologische verschijnselen bij onregelmatige HE zullen typisch fluctueren, afhankelijk

van de precipiterende factoren. Minimale of subklinische HE kan omschreven worden als een

beginstadium van het symptoom en kan enkel met behulp van specifieke neuropsychologische

en –fysiologische testen aangetoond worden. Type C HE waarbij de cognitieve functies

gedurende langere tijd sterk zijn aangetast wordt persistente HE genoemd.

Fig. 8: Subtypes van type B en C HE: Episodische, persistente en minimale HE (19).

1.5 Diagnose

Het monitoren en classificeren van het type van HE wordt mogelijk gemaakt door een

gecombineerd gebruik van gestandaardiseerde neuropsychologische testen, medische

beeldvorming, leverfunctietesten, visualisatie van eventuele porto-systemische shunts en een

uitgebreide hematologische analyse (1, 16).

13

Om de ernst van het syndroom in te schatten, worden klinische classificatiesystemen gebruikt,

waarbij de West Haven indeling wereldwijd het meest gebruikt wordt (17). Hierbij worden

het bewustzijn, gedrag en scores van neurologische testen in rekening gebracht om de graad

(0, 1, 2, 3 of 4) van HE vast te leggen. Omwille van de relatief subjectieve manier van indelen

en lage reproduceerbaarheid, drong een aangepast en meer objectief classificatiesysteem zich

op.

De meest gebruikte nieuwe classificatiemethode staat gekend als de Clinical Hepatic

Encephalopathy Staging Scale (CHESS) (tabel 1). Aan de hand van negen vragen wordt

telkens een score van 0 of 1 toegekend en wordt een som van de scores gemaakt (met score 0

voor een normale status en 9 voor diepe coma). Ook hier zijn nog verdere verbeteringen

vereist om een eenduidige diagnose mogelijk te maken.

Tabel 1: Clinical Hepatic Encephalopathy Staging Scale (CHESS), een nieuwere classificatiemethode

om de ernst van HE in te schatten (18).

1.6 Huidige behandelingsvormen

Primair worden eventuele uitlokkende factoren behandeld zoals weergegeven in tabel 2 (13).

Daarnaast worden lactulose of antibiotica frequent voorgeschreven. Lactulose is een

synthetisch disacharide dat gegeven wordt om de pH in de darm te verlagen waardoor de

14

samenstelling van de darmflora verandert en minder eiwit in ammoniak wordt omgezet. Het

eventueel gevormde ammoniak wordt als ammoniumzout uitgescheiden.

De helft van de patiënten met type C HE zullen het eerste jaar overleven (1). Dit toont aan dat

de complicaties van HE zeer ernstig kunnen zijn en dat de voorgaande behandelingsvormen

alleen niet voldoende zijn. Een levertransplantatie is momenteel de enige succesvolle manier

om de overlevingskansen te verhogen, zelfs in de meest ernstige gevallen. Er dient opgemerkt

te worden dat de vraag veel hoger ligt dan het aanbod en dat nieuwe behandelingsvormen

vereist zijn.

Tabel 2: Precipiterende factoren van hepatische encefalopathie (13).

1.7 Doelstellingen en studieopzet

Deze studie werd uitgevoerd met het oog op het bereiken van twee grote doelstellingen.

1. Validatie van twee ratmodellen voor hepatische encefalopathie

Hepatische encefalopathie gaat bij de mens steeds gepaard met neuromotorische stoornissen.

In de literatuur worden portocavale shunt of PCS-ratmodellen als geschikt model voor type B

HE beschouwd, CBDL ratten zouden idealiter als model voor type C HE kunnen gebruikt

worden. Voor deze studie werden deze twee ratmodellen gevalideerd.

15

Onze voorkeur gaat naar het gebruik van de rat als diermodel voor HE om een aantal redenen

(18). Deze dieren ontwikkelen binnen een aanvaardbaar tijdsinterval vergelijkbare

symptomen en complicaties als de mens. Daarnaast reageren ze in vergelijking met andere

proefdieren zoals konijnen en honden het best op chirurgische ingrepen die ook in dit

experiment zullen uitgevoerd worden. Een derde reden is dat het gebruik van de rat als

proefdier voor onder andere leverziektes reeds beschreven staat in de literatuur. Muis

modellen kunnen ook gebruikt worden voor deze studie, maar omwille van technische

redenen werd de rat als diermodel gebruikt.

We trachten gebruik te maken van twee diermodellen van slechts twee types van HE,

namelijk type B en C. Een diermodel voor type A HE kan experimenteel bekomen worden

door het toedienen van een overdosis van een toxische stof zoals thioacetamide (19). Een rat

model voor type A HE wordt niet gebruikt in dit experiment, omdat de progressie van de

ziekte niet altijd voorspelbaar is (20).

Omdat tegenstrijdigheden teruggevonden werden in de literatuur of er al dan niet relevante

verschillen in motorische activiteit zijn tussen gezonde en experimentele ratten, werd in dit

experiment getracht om aan de hand van bloedanalyses en een aantal functionele tests HE

klinisch en biochemisch op te sporen (21).

2. Studie van de BHB permeabiliteit

We vermoeden dat een aantasting van de BHB permeabiliteit aan de basis ligt van het

ontstaan van neuromotorische stoornissen. Dit willen we nagaan door een in vivo bepaling

van de BHB permeabiliteit (in plaats van een in vitro bepaling) met behulp van de

fluorescente merkers 3 kDa dextraan-fluoresceïne en 376 Da fluoresceïne.

1.8 Toekomstperspectieven

Een proef waarin HE modellen in ons labo worden geëvalueerd is nooit eerder gebeurd. Ook

de studie van de bloedhersenbarrière-permeabiliteit is nooit op een eenduidige manier gebeurd.

Eerder werd aangetoond dat een experiment in vivo het meest geschikt is om de progressie

van een neurologische aandoening in kaart te brengen, evenals transport- en

beschadigingsmechanismen van de BHB (2). Daarnaast kunnen methodologische bezwaren

aangehaald worden voor studies waarin een Evans Blue kleuring wordt uitgevoerd om de

BHB permeabiliteit te evalueren (22).

16

Een vervolgstudie bestaat uit de studie van afzonderlijke mechanismen die bijdragen tot een

(ab)normale BHB-permeabiliteit, zoals connexines. Dit zou in de toekomst eventueel kunnen

geëxtrapoleerd worden naar de mens, waarbij de connexinekanalen mogelijks als target

kunnen gebruikt worden bij de behandeling van HE.

Actueel wordt er nog onderzoek gedaan naar drie nieuwe behandelingen die de genezing

kunnen helpen bevorderen. Deze zijn geneesmiddelen die de ammoniakconcentraties in het

bloed doen dalen, hulpmiddelen voor de falende lever en manieren om hersenoedeem te

minimaliseren (1).

17

2. Materialen en methode

2.1 Diermodellen

Voor deze studie werden twee experimentele diermodellen en een controlegroep geïnduceerd.

Jonge mannelijke Wistar ratten van 6 à 8 weken oud werden in de studie opgenomen. Onder

andere een snellere progressie van de ziekte en een snellere wijziging in waarden van

leverenzymen in vergelijking met vrouwelijke ratten verklaart de voorkeur voor

mannetjesdieren (23). Om statistisch significante resultaten te kunnen bekomen, werden

minstens 10 dieren in elke groep opgenomen.

A. Shamratten

Shamratten dienen als controlegroep voor operatieve modellen van PCS en CBDL. Het

abdomen wordt geopend ter hoogte van de linea alba. De vena portae, vena cava en de

galweg worden gemanipuleerd en vrij geprepareerd zonder respectievelijke ligatie of

shuntoperatie. Daarna wordt het abdomen gesloten met een silk 5-0 draad. Deze ingreep

wordt uitgevoerd om er zeker van te zijn dat eventuele verschillen met de experimentele

groep niet te wijten zijn aan eventuele bijwerkingen van het anestheticum.

B. Portocavale shunt of PCS ratmodellen

Het abdomen wordt geopend ter hoogte van de linea alba. De vena portae wordt vrijgemaakt

van de pylorusvene en er wordt een draad onderdoor getrokken. De distale zijde van de venae

portae wordt via een end-to-side anastomose techniek geligeerd aan de vena cava (8-0

ligatuur). Hierdoor zal het bloed vanuit de buikorganen grotendeels via de vena cava inferior

onveranderd de algemene circulatie bereiken (figuur 9). Een end-to-side portocavale

anastomose ingreep is het meest succesvol en wordt daarom ook op de rat uitgevoerd om als

model voor type B HE te dienen (24). Het abdomen wordt gesloten met een silk 5-0 draad.

18

Fig. 9: Schematische voorstelling van een porto-cavale shunt met in de eerste figuur de normale

situatie, op de tweede figuur een enkelvoudige PCS (25).

C. Common Bile Duct Ligation of CBDL-rat modellen

Het abdomen wordt geopend ter hoogte van de linea alba en de ductus choledochus wordt

vrijgeprepareerd. De ductus choledochus wordt aan twee zijden afgebonden met een silk 6-0

draad en daarna doorgesneden tussen de twee knopen. Het abdomen wordt gesloten met een

silk 5-0 draad. Aangezien de galwegen hierdoor vernauwd raken, treedt een galwegobstructie,

portale hypertensie en secundair biliaire cirrose op (26). Vanaf zes weken na inductie takelen

de dieren progressief af en sterven aan de gevolgen van sepsis (27, 28).

Alle ingrepen werden uitgevoerd worden onder isofluraan anesthesie. Om het comfort van de

dieren te verhogen werd zowel pre- als postoperatief pijnstilling toegediend (om de 12 u,

gedurende 48 u). Pre-operatief werd Temgesic (0,1 ml/kg) IM toegediend. Bij het sluiten van

de wonde werd een lokale infiltratie van xylocaïne gegeven. De dieren werden pas drie dagen

na de ingreep aan de testen onderworpen. Een dag-nachtcyclus van 12u, ad libidum toegang

tot voedsel en een constante kamertemperatuur (22 +/- 2°C) werd behouden (21). De dieren

werden ook dagelijks post-operatief gecontroleerd en tweemaal per week gewogen. Een

opvolging van het gewicht blijft van belang gedurende het hele experiment. We verwachtten

een minder snelle gewichtstoename in PCS ratmodellen ten gevolge van een lever- en

hersendysfunctie (29), maar wel een snellere gewichtstoename bij de CBDL ratten. Het

ontstaan van biliomen en ascites zouden deze gewichtstoename in de laatste groep kunnen

verklaren.

19

In de CBDL groep werd in deze studie een mortaliteit van meer dan 10% vastgesteld, daar

waar in de literatuur sprake was van 10%. De oorzaak van sterfte is te wijten aan de invasieve

ingreep zelf. Soms is er een bloeding of gallek waarbij de dieren overlijden binnen de eerste

drie dagen. Daarna is de mortaliteit van CBDL ratten voornamelijk te wijten aan de

achteruitgang van hun algemene toestand, zoals hierboven beschreven. Ook in de PCS groep

was de mortaliteit relatief hoog in de vroeg-operatieve fase (meer dan 10%).

2.2 Functionele tests

2.2.1 Reflexen en gedragsobservatie

De evaluatie van een bepaald gedrag of reflex kan een beeld geven van de ernst van HE. Alle

dieren werden aan een aantal sensoriële en motorische tests onderworpen. Om de individuele

progressie of aftakeling van ieder dier te evalueren werden deze testen tweemaal per week

uitgevoerd op dezelfde tijdstippen. Voor iedere test werd een score (0, 1, 2, 3 of 4) toegekend

volgens een gestandaardiseerd protocol (30).

Tabel 3: Gestandaardiseerd protocol voor de evaluatie van reflexen en het gedrag (30).

TEST MOGELIJKE OUTCOMES SCORE Bewustzijn Comateus

Lethargisch, maar wel nog reactie op fysische

prikkels

Bij bewustzijn, maar weinig spontane

bewegingen

Alert en bij bewustzijn

0

1

2

3

Grijpreflex: Draad wordt tegen de palmen v/d voorpoten aangedrukt

Draad wordt niet vast gegrepen

Draad wordt onmiddellijk vast gegrepen

0 1

Evenwichtstest: Gekanteld platform

test. Helling (α=30°) moet overstegen

worden.

Rat valt er af

Duur: Langer dan 30s

Duur: tussen 15 en 30s

Duur: binnen 15s

0

1

2

3

Visuele plaatsingsreflex voor elke

voorpoot Reflex afwezig

Reflex aanwezig

0

1

Plaatsingsreflex met telkens een

voorpoot niet ondersteund (4x

herhaald voor iedere poot)

Reflex afwezig

Reflex aanwezig

0

1

Motorische functies Helemaal niet in staat om zich voort te bewegen

Beweegt zich voort na stimulatie

Beperkte spontane bewegingen

Spontane bewegingen, maar abnormale pasjes

Spontane bewegingen, normale pasjes

0

1

2

3 4

Horizontale staaftest (evenwichtstest) :

De rat werd bovenop een staaf van 30

cm lang en een diameter van 2 cm

geplaatst op een hoogte van 30 cm.

Rat valt eraf binnen 30 s

Rat valt eraf tussen de 30e en 180e seconde

Rat blijft langer dan 3 minuten in evenwicht.

0

1

2

20

De totale neurologische score (maximaal 20) werd bepaald door de som van de scores op

iedere test voor iedere rat. Hoe lager de neurologische score, hoe ernstiger de neurologische

functies zullen aangetast zijn.

2.2.2 Open Field test (OFT)

Fig. 10: De Open Field Test

Een kwalitatieve en kwantitatieve meting van de algemene locomotorische activiteit en

natuurlijk exploratief gedrag van de rat kan uitgevoerd worden met een open field test (20,

29). De rat werd wekelijks en op vergelijkbare tijdstippen in een gesloten box geplaatst die

verder ingedeeld is in virtuele zones (figuur 10). Bovenop de box werd een camera geplaatst

die de beelden registreert. Iedere rat werd gedurende een tijdsinterval van 4 minuten

geobserveerd. Alvorens de volgende rat erin werd geplaatst, werd de box eerst gereinigd en

gedesinfecteerd om de negatieve invloed van eventuele vrijgestelde stresshormonen ongedaan

te maken.

De OFT laat toe om gelijktijdig zowel de locomotorische activiteit, natuurlijk exploratief

gedrag en angstlevel op te meten (31, 32). De beelden worden opgenomen en achteraf

geanalyseerd waarbij de frequentie van een bepaald gedrag werd bepaald.

Het aantal hokjes dat doorlopen wordt, alsook het aantal keer dat de rat op de achterpoten

staat geven een beeld weer van de locomotorische activiteit en hun natuurlijk exploratief

gedrag. Een hoge score voor beide indiceert een lagere angstlevel en een verhoogde

locomotorische activiteit/exploratie.

21

De tijd die doorgebracht wordt in het midden van de box, alsook het aantal hokjes dat wordt

doorlopen in het midden, zullen indicatief zijn voor angst en exploratie. Hoe langer het dier

zich vrij rond beweegt in het midden, hoe minder angstig en hoe meer exploratief. Het

schoonlikken wordt geuit als respons op verplaatsing uit zijn vertrouwde omgeving. Dit zou

dus vaker gezien worden wanneer een rat zich bevindt in een onbekende omgeving. Hoe

vaker het dier in die nieuwe omgeving wordt gebracht, hoe minder hij zichzelf zou moeten

schoonlikken wegens gewenning. De defecatie- en urinefrequentie, alsook het aantal keer dat

het dier volledig blokkeert zijn indicatief voor stress en angst. Een hoge graad van angst

wordt geassocieerd met een hoge urine-, blokkerings- en/of defecatiefrequentie.

2.3 Bloedanalyse

Verschillende variabelen die in tabel 4 zijn weergegeven zijn een goede indicatie voor de

bepaling van onder andere leverschade en ernst van HE (16, 23). Alvorens de dieren te

sacrifiëren, werd een bloedstaal genomen van iedere nuchtere rat. Voor de bepaling van iedere

component is minstens 250 µl serum vereist. Daarom werd een staaltje volbloed (600µl)

afgenomen via de staartvene. De stalen werden gecentrifugeerd, het serum na centrifuge

geïsoleerd en ingevroren. Deze werden dan naar het lab voor klinische biologie (UZ Gent)

verzonden voor analyse van de opgegeven bloedcomponenten. De bloedresultaten van de

experimentele groepen zullen beoordeeld worden met de controlegroep als referentie (28).

Tabel 4: Bloedcomponenten die bepaald werden en de verwachte wijzigingen in concentratie bij de

experimentele groepen (CBDL en PCS).

Bloedcomponent Concentratie Indicatie voor…

Albumine ↓ Leverschade

Bilirubine ↑ Galwegobstructie en leverschade

ALP (Alkalisch Fosfatase enzyme) ↑ Galwegobstructie

NH3 ↑ Hepatische encephalopathie

Glucose ↓ Verminderde energievoorziening

hersenen

Zink ↓ Astrocytzwelling en oxidatieve stress (33)

22

2.4 In vivo bepaling van de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière

Omdat we vermoeden dat de BHB-permeabiliteit wijzigt, wordt de BHB-permeabiliteit in

vivo bepaald. Portocavale shunt en CBDL dieren werden gesacrifieerd van zodra de

symptomen zich maximaal hebben ontwikkeld. Voor PCS dieren dient dit op dag 45 na de

inductie te gebeuren, voor CBDL ratten na 42 dagen. Erna zouden de dieren te sterk aftakelen

en sterven ze ten gevolge van sepsis en andere complicaties.

Vanwege de zeer hoge kostprijs van fluorescente stoffen, werd het goedkopere 376 Da

fluoresceïne (376 Dalton) als alternatieve stof gebruikt. Voor 4 PCS en 2 Sham ratten werd

3kDa dextraan-fluoresceïne gebruikt, omdat we vermoeden dat we met deze grotere molecule

een eenduidiger verschil zouden kunnen aantonen tussen de twee groepen.

Een dag voor de in vivo bepaling van de BHB-permeabiliteit werden de nodige oplossingen

gemaakt.

2.4.1 Protocol voor aanmaak van 0,2 molair fosfaatbuffer

Eerst wordt 28,4 g/l Na2HPO4 toegevoegd aan 1 liter gedestilleerd water om zo een

dibasische oplossing te vormen. Daarnaast wordt 24g NaH2PO4 toegevoegd aan 1 liter

gedestilleerd water om een monobasische oplossing te bekomen. De zouten moeten goed

opgelost worden in het water, eventueel met behulp van een magnetische roerder.

Daarna dient de pH-meter gekalibreerd te worden. Om 1 liter fosfaatbuffer te maken wordt

800 ml van de dibasische vloeistof overgegoten in een andere glazen fles en op de

magnetische plaat geplaatst. De pH meter wordt erin gedompeld en vastgeklemd en de

monobasische oplossing wordt er traag aan toegevoegd met behulp van een automatische

pipet tot een pH van 7,4 en een volume van 1 liter wordt bereikt. De benaderende fracties

bedragen 190 ml voor de monobasische en 810 ml voor de dibasische oplossing.

2.4.2 Protocol voor aanmaak van 1 liter Phosphate Buffered Saline (PBS)

Om deze fysiologische zoutoplossing te bekomen wordt het fosfaatbuffer 20 keer verdund en

aangelengd met gedestilleerd water tot 1l. Daaraan wordt dan nog 9g NaCl toegevoegd.

2.4.3 Protocol voor de aanmaak van 4% paraformaldehyde (PFA) in 0.1 M

fosfaatbuffer

23

Voeg 350 ml gedestilleerd water toe aan 500 ml fosfaatbuffer. Deze oplossing wordt

verwarmd op de warmteplaat tot ongeveer 50°C. Vervolgens wordt de fles op een

magnetische roerder en onder de trekkast gezet en wordt 40 g paraformaldehyde toegevoegd.

Deze oplossing wordt 8 uur bovenop de magnetische roerder geplaatst, zonder warmte. De

volgende ochtend wordt deze heldere oplossing gefilterd en aangelengd met gedestilleerd

water tot 1 liter.

2.4.4 Heparine oplossing

Deze oplossing wordt aangemaakt om bloedstolling tijdens de in vivo bepaling van de BHB-

permeabiliteit te voorkomen. Hiervoor wordt 27 mg heparin sodium salt opgelost per ml NaCl.

2.4.5 Afwegen van fluorescente stoffen

Om een evaluatie van de permeabiliteit mogelijk te maken, is een intraveneuze injectie met

een fluorescente stof vereist. De nodige concentratie hangt af van het totaal plasmavolume

van de rat. Algemeen wordt aangenomen dat het plasmavolume 4% van het totaal

lichaamsgewicht bedraagt en dat 200 µM van de fluorescente stof in het plasma moet

circuleren. De ratten werden daarom vlak voor dit experiment gewogen, de nodige

hoeveelheid fluoresceïne werd afgewogen en opgelost in 500 µl HBSS-Hepes.

2.4.6 Protocol voor een in vivo bepaling van de BHB-permeabiliteit

Afhankelijk van het gewicht en algemene toestand van de rat wordt gemiddeld 0,8 ml van

een pentobarbital (Nembutal ®) intra-peritoneaal geïnjecteerd in de rat (23G BDM naald).

Na een aantal minuten is het anestheticum ingewerkt. De staartknijp- en voetreflexen moeten

weggevallen zijn alvorens de volgende stappen te starten. Drie kDa dextraan-fluoresceïne of

376 Da fluoresceïne opgelost in 500 µl HBSS-Hepes oplossing om vervolgens te worden

geïnjecteerd in de laterale staartvene (18G naald). Deze kleurstof laten we precies een half uur

circuleren in de bloedbaan. Vervolgens wordt een thoracale incisie gemaakt, zodanig dat het

hart en aorta zichtbaar worden. Het overtollig vetweefsel wordt weggesneden.

Om bloedstolling te voorkomen wordt 0,2 ml heparine geïnjecteerd in het apex van het hart

(0,3 ml BD Microfine naald, 27 mg heparine/ml NaCl-oplossing). Vervolgens wordt een botte

naald, verbonden met een katheter, doorheen de apex geprikt en doorgeschoven tot de aorta

wordt bereikt waar het ook vastgeklemd wordt. Het hart moet nog steeds kloppen zodat de

oplossingen doorheen het lichaam kunnen circuleren.

24

Er wordt een incisie gemaakt in het rechteratrium zodat de (lichaams)vloeistoffen uit het

lichaam kunnen treden na perfusie met PBS. Dit wordt toegediend via de katheter zolang tot

er enkel PBS uit het rechteratrium stroomt en de lever ontkleurt. Vanaf dat moment wordt de

perfusie met PBS stopgezet en zal het lichaam geperfundeerd worden met een 4%

paraformaldehyde oplossing om fixatie te induceren. Als het lichaam voldoende gefixeerd is,

wordt het dier onthoofd met een scalpel en de schedel ontbloot om de hersenen te isoleren. De

hersenen worden steeds bewaard in een 4% paraformaldehyde oplossing. Met behulp van een

rat brain slicer matrix worden ongeveer 1 mm dikke coupes gesneden in een coronaal vlak (6

coupes in totaal). Deze coupes worden steeds bewaard in een PBS oplossing om artefacten te

beperken. Deze coupes zijn idealiter volledig kleurloos, omdat de aanwezigheid van bloed de

beeldanalyse kunnen belemmeren. Daarnaast is een volledige fixatie reeds in het lichaam

vereist om latere artefacten te beperken.

2.4.7 Beeldvorming en analyse

Voor de beeldvorming worden de coupes per drie op een draagglaasje geplaatst en op een

Gene Flash toestel gezet (figuur 11). De coupes worden belicht met Uv-stralen gedurende 5

seconden. Wanneer een duidelijk en scherp beeld bekomen wordt, worden deze beelden

opgeslagen op de memorycard. Met behulp van het ImageJ computerprogramma kunnen we

de cortex-oppervlakte van ieder coupe scannen en wordt van ieder gescand oppervlak, met

steeds dezelfde grootte, een gemiddelde fluorescentiescore weergegeven in een

resultatentabel. Voor ieder beeld dient een blanco waarde of fluorescentie in de regio rondom

de coupes afgetrokken te worden. De gemiddelde fluorescentiescore van de experimentele

ratten PCS en CBDL worden na berekeningen in Excel vergeleken met de fluorescentiescores

van de controlegroep. Er wordt verwacht dat de BHB-permeabiliteit verhoogd zal zijn in de

experimentele groepen en dat de fluorescentiescores dus hoger zullen zijn bij de

experimentele groepen.

25

Fig. 11: Hersencoupes van een CBDL rat na belichting met UV-stralen. Met behulp van ImageJ kan

de fluorescentiescore bepaald worden voor ieder coupe.

2.5 Statistische analyse

Om de resultaten met elkaar te kunnen vergelijken, werd gebruik gemaakt van het statistisch

programma SPSS 20. Wanneer de p-waarde voor een verschil kleiner is dan 0,05 (p<0,05)

wordt dit als statistisch significant beschouwd. Een p waarde kleiner dan 0,1 toont een trend

aan.

26

3. Resultaten

3.1 Functionele testen

3.1.1 Reflexen en gedragsobservaties.

De ratten werden gedurende 6 opeenvolgende weken aan een aantal sensoriële en motorische

tests onderworpen. Voor iedere test werd een score (0, 1, 2, 3 of 4) toegekend volgens een

gestandaardiseerd protocol zoals hiervoor beschreven. Voor de analyse van de scores werd het

gemiddelde van alle resultaten van iedere rat gedurende de 6 weken in rekening gebracht.

Deze scores werden dan vergeleken tussen de 3 groepen, wat ook weergegeven wordt in

figuur 12.

Fig. 12: Gemiddelde scores op de functionele testen (maximale score =20), weergegeven per groep

met N=10 in de controle en PCS groep, N=12 in de CBDL groep en N=7 voor de CBDL ratten vanaf

week 5, dropout wegens sterfte. Met ○ uitschieters binnen de CBDL groep en □ als uitschieter binnen

de PCS groep.

14

15

16

17

18

19

20

Sham CBDL PCS

Boxplot: Scores functionele test

Mediaan tot Q3

Q1 tot mediaan

Onderkant box

*

***

ᵠᵠ

Sham CBDL PCS

27

Er werd een statistisch significant verschil (p<0.05) waargenomen tussen de Sham en PCS

ratten (*) en een zeer sterk significant verschil (p<0.001) tussen de scores van de CBDL en

Sham ratten (***). Ook tussen de twee experimentele groepen werd een sterk significant

(p<0.01) verschil vastgesteld (ψψ).

Omdat we verwachten dat de experimentele groepen functioneel achteruitgaan naarmate het

experiment vordert, werd ook de evolutie van de scores in functie van de tijd bepaald, zoals

weergegeven in figuur 13.

Fig. 13: Evolutie scores functionele testen in functie van de tijd. Met N=10 in de Sham en PCS groep

en N=12 binnen de CBDL groep, vanaf week 5 N=7 in de CBDL groep, dropout wegens sterfte.

3.1.2 Open field test

De open field test werd wekelijks uitgevoerd om de functionaliteit van de ratten in kaart te

brengen. Deze resultaten zouden, indien gecombineerd met de resultaten van de vorige

functionele testen, moeten leiden tot een meer eenduidige conclusie over de motorische en

neurologische functies.

15,5

16

16,5

17

17,5

18

18,5

19

19,5

20

1 2 3 4 5 6

Sco

re

Week

Evolutie scores functionele testen

Sham

CBDL

PCS

28

Fig. 14a: Aantal hokjes doorlopen als maat voor de locomotorische activiteit.

In de eerste week is het al duidelijk dat de PCS en CBDL ratten een lager aantal hokjes

hebben doorlopen. Deze trend blijft voor de CBDL groep behouden tot het einde van het

experiment, terwijl PCS ratten een minder groot verschil in locomotorische activiteit vertonen

ten opzichte van de controlegroep. Er werd enkel een significant verschil (*) in activiteit

ontdekt in de 3e week tussen de Sham en CBDL ratten (figuur 14a).

Fig. 14b: Steiger gedrag als indicator van het natuurlijk exploratief gedrag.

Het steiger gedrag van de drie groepen vertoont een gelijkaardig verloop in functie van de

tijd. Het exploratief gedrag daalt naarmate het dier meer vertrouwd raakt aan de nieuwe

omgeving. Er werd wel steeds een lagere frequentie opgemeten bij de CBDL groep, maar dit

verschil was niet statistisch significant (figuur 14b).

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6

Aa

nta

l h

ok

jes

Week

Aantal hokjes doorlopen

Sham

CBDL

PCS

*

0

2

4

6

8

1 2 3 4 5 6

Fre

qu

enti

e

Week

Steigeren

SHAM

CBDL

PCS

29

Fig. 14c: Tijd doorgebracht in het midden van de box als maat voor angst en exploratie.

De ratten werden steeds in het midden van de box geplaatst zodat de resultaten eenduidiger

met elkaar konden vergeleken worden. Voornamelijk de CBDL ratten bleven in de 1e en 6

e

week gemiddeld gedurende een derde van de analysetijd onbeweeglijk in het midden zitten. In

de laatste week was dit verschil in gedrag zeer sterk significant (**p=0,005) tussen de Sham

en CBDL groep.

Fig. 14d: Het schoonlikken van de vacht als respons op verplaatsing uit een vertrouwde omgeving.

Dit gedrag zou vaker gezien moeten worden wanneer de rat zich bevindt in een nieuwe,

onbekende omgeving. Men verwacht een lagere frequentie naarmate het dier vaker in de

nieuwe omgeving wordt gebracht. Uit de grafiek werd dit ook afgeleid voor Sham- en CBDL

ratten, waarbij de Shamratten globaal gezien zichzelf het minst vaak hebben schoongelikt.

Een statistisch significant verschil (*) werd gevonden tussen de Sham en CBDL ratten in

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6

Aan

tal

seco

nd

en

Week

Tijd doorgebracht in het midden

SHAM

CBDL

PCS

**

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1 2 3 4 5 6

Fre

qu

enti

e

Week

Schoonlikken

Sham

CBDL

PCS

* #

*

#

30

week 2, en een statistisch significant verschil (*) tussen Sham en PCS ratten in week 3. Ook

tussen de experimentele groepen werd een significant verschil (#) waargenomen in de 2e en 6

e

week.

Fig. 14e: Het aantal keer dat de rat volledig blokkeert, een indicator voor angst en stress.

Met uitzondering van week 2 vertoonden de CBDL ratten steeds een hogere

blokkeringsfrequentie, maar deze frequenties waren niet significant verschillend van de

andere groepen. Enkel in week 2 werd een trend gevonden (p=0,056) dat Sham ratten vaker

blokkeerden ten opzichte van de PCS ratten.

Fig. 14f: Urinefrequentie als indicator voor angst en stress.

0

0,5

1

1,5

2

1 2 3 4 5 6

Aan

tal k

ee

r

Week

Volledig stationair

Sham

CBDL

PCS

#

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1 2 3 4 5 6

Fre

qu

en

tie

Week

Urinefrequentie

SHAM

CBDL

PCS

*

**

#

* ##

31

Globaal gezien werd een lagere urinefrequentie opgemeten bij de controlegroep, toch was dit

niet steeds statistisch significant. In de eerste twee weken na de ingrepen werd een significant

hogere urinefrequentie (*) waargenomen bij de PCS groep ten opzichte van de controlegroep.

In de 3e week werd een significant verschil (#) tussen de experimentele groepen gezien,

evenals in week 6, waar een sterk significant verschil (##) aanwezig was. In de 2e en 6

e week

werd ook een significant verschil (*) gevonden tussen de Sham en CBDL groep.

Fig. 14g: Defecatiefrequentie als indicator voor stress en angst.

Globaal gezien werd steeds een hogere defecatiefrequentie vastgesteld in de CBDL groep, wat

een hoger angst- en stressniveau suggereert. Toch was dit verschil niet statistisch significant

tussen de drie groepen. Shamratten vertoonden in de eerste week wel een significant hogere

defecatiefrequentie (*).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2 3 4 5 6

Fre

qu

enti

e

Week

Defecatiefrequentie

SHAM

CBDL

PCS

*

32

3.2 Bloedanalyse.

Omwille van een aantal praktische problemen werd het bloed geanalyseerd van 18 ratten met

N= 6, 5 en 7 voor respectievelijk Sham, CBDL en PCS ratten. Deze resultaten worden

gebruikt om de ernst van leverschade, galwegobstructie en HE mee te bepalen en zullen later

gecorreleerd worden aan de BHB-permeabiliteit en functionele tests.

Tabel 5: Resultaten van de bloedanalyse weergegeven als gemiddelden, evenals de range.

Variabele Sham (N=6) CBDL (N=5) PCS (N=7)

Albumine 4,265

Range: (3,80-4,78)

2 SD= 0,80148

3,018 *

Range: (1,86-4,49)

2 SD= 2,01332

3,8657

Range: (3,32-4,23)

2 SD= 0,59832

ALP 102,5167

Range: (70,8-167,1)

2SD= 84,5649

286,12 *

Range: (100,1-482)

2 SD= 274,93918

102,6

Range: (68,1-129,6)

2 SD= 45,11852

Bilirubine 0,1

Range: (0,05-0,28)

2 SD= 0,178

6,834 *

Range: (0,06-10,1)

2 SD= 7,96

0,2071 *

Range: (0,16-0,25)

2 SD= 0,06502

Glucose 1,5367

Range: (1,08-2,43)

2 SD= 1,04526

1,156

Range: (0,68-2,19)

2 SD= 0,12047

1,0357 *

Range: (0,79-1,20)

2 SD= 0,33662

Zink 143,1167

Range: (110-165)

2 SD= 43,67158

113,48 #

Range: (82,2-147,7)

2 SD= 55,3654

81,2 **

Range: (65,2-110)

2 SD= 27,62776

Ammoniak 122,84

Range: (72,1-202)

2 SD= 106,62688

131,0

Range: (35-402)

2 SD= 304,86202

298,1571 *

Range: (211,2-357,7)

2 SD= 105,17742

Met * p<0,05 ten opzichte van de controlegroep en # p<0,1.

Uit deze analyse blijkt dat de gemiddelde albumine, ALP en zinkwaarden van de CBDL groep

significant verschillend (* p<0,05) zijn van de controlegroep. Portocavale shunt ratten

33

vertonen een significant hogere (*p<0,05) ammoniak en bilirubineconcentratie, een

significant lagere glucosewaarde en een zeer sterke daling in zinkwaarden.

3.3 Gewichtstoename

De ratten werden tweemaal per week gewogen gedurende het hele experiment. De bepaling

van het lichaamsgewicht is nodig om de algemene gezondheidstoestand te helpen opvolgen.

Van iedere rat werd de procentuele gewichtstoename van dag 42/45 ten opzichte van dag 3

bepaald om een vergelijking tussen de groepen mogelijk te maken. Dit werd gedaan voor 10

Shamratten, 8 CBDL en 10 PCS ratten. De resultaten staan weergegeven in onderstaande

figuur.

Fig. 15: Boxplots van de gemiddelde gewichtstoename in procent voor iedere groep.

De gemiddelde gewichtstoename in procent was het grootst bij de CBDL groep en het laagst

bij de PCS groep. Binnen de CBDL groep was er één uitschieter met een gemiddelde

gewichtstoename van 64% ten opzichte van dag 3. Deze verschillen waren echter niet

statistisch significant.

3.4 In vivo bepaling van de bloed-hersenbarrière permeabiliteit

Op dag 42 en 45 werden respectievelijk de CBDL en PCS ratten gesacrifieerd voor een in

vivo bepaling van de BHB-permeabiliteit. De Shamratten werden ook gesacrifieerd tussen dag

42 en 45 om als controle te dienen bij de analyse. Alle 10 ratten van de controle- en PCS

34

groep overleefden tot de dag van de sacrificatie. Van de 12 CBDL ratten hebben slechts 7

ratten de 42e dag gehaald.

Zoals vermeld werd vanwege de zeer hoge kostprijs van fluorescente stoffen met een relatief

hogere molecuulmassa het goedkopere 376 Da fluoresceïne als alternatieve stof gebruikt.

Deze stof werd gebruikt als merker voor 8 Sham, 7 CBDL en 6 PCS ratten. De

fluorescentiewaarden werden uitgedrukt in absolute waarden met Shamratten als

referentiegroep. In de onderstaande figuur worden de fluorescentiewaarden weergegeven per

groep.

Fig. 16: Boxplot met de absolute fluorescentiescores, weergegeven per groep.

De BHB van CBDL ratten lijkt de hoogste permeabiliteit te vertonen voor deze merker ten

opzichte van de andere groepen. Toch kon geen significant verschil of trend aangetoond

worden tussen de controle- en experimentele groepen.

Wanneer de fluorescentiescores van de afzonderlijke coupes wordt bestudeerd in plaats van

de algemene fluorescentiescore als som van de fluorescentiescores, valt het op dat er binnen

de verschillende coupes van eenzelfde rat soms grote verschillen zijn. Dit verschil was het

grootst ter hoogte van de 5e coupe waar de achterhersenen zijn gelokaliseerd. In tabel 6

worden de resultaten weergegeven van de fluorescentiescores ter hoogte van coupe 5 ten

opzichte van de gemiddelde fluorescentiescore van iedere rat afzonderlijk.

35

Tabel 6: Fluorescentiescores van coupe 5 vergeleken met de gemiddelde fluorescentiescores van

iedere rat. Voornamelijk binnen de experimentele groepen lijkt de permeabiliteit sterker verhoogd ten

opzichte van de gemiddelde fluorescentiescore.

Rat Coupe 5 Gemiddelde

Sham 1 73410 66731

Sham 2 67599 55079

Sham 3 57961 59685

Sham 4 48328 49493

Sham 7 33478 31835

Sham 8 35783 35642

Sham 9 26109 24826

Sham 10 62173 59460

CBDL 1 72055 59854

CBDL 3 71050 67080

CBDL 4 68880 63405

CBDL 6 40595 49714

CBDL 8 79192 64096

CBDL 9 43809 46138

CBDL 11 48020 43027

PCS 1 75917 67478

PCS2 61728 50855

PCS 3 75166 51773

PCS 8 33980 30691

PCS 9 86592 58963

PCS 10 50706 39140

Een statistische analyse werd uitgevoerd om na te gaan of deze verhoging al dan niet relevant

is. In figuur 17 zijn de fluorescentiescores ter hoogte van de achterhersenen weergegeven ten

opzichte van de gemiddelde fluorescentiescores voor iedere groep.

36

Fig. 17: Fluorescentiescore opgemeten ter hoogte van coupe 5 ten opzichte van de gemiddelde

fluorescentiescores, voor de drie groepen. Er blijkt geen significant verschil aanwezig te zijn in

fluorescentiescores ter hoogte van coupe 5 (p=0,225 en p=0,153 voor respectievelijk Sham ten

opzichte van CBDL en Sham ten opzichte van de PCS groep).

Alhoewel de fluorescentiescores niet statistisch verschillend zijn van elkaar, is er

vermoedelijk binnen de experimentele groep een selectieve verhoging van de permeabiliteit

opgetreden ter hoogte van de achterhersenen.

Voor 2 controle en 4 PCS ratten werd 3 kDa dextraanfluoresceïne als merker gebruikt. Er

werd verwacht dat deze grotere fluorescente stof minder goed doorheen de BHB van de

gezonde rat zou diffunderen en dat een groter verschil zou vastgesteld worden tussen de PCS

en Sham groep. De resultaten worden weergegeven in onderstaande figuur.

37

Fig. 18: Boxplot met de absolute fluorescentiescores (3kDa dextraanfluoresceïne), weergegeven voor

de twee groepen.

De PCS ratten vertoonden een hogere permeabiliteit voor dextraanfluoresceïne, maar dit

verschil was niet statistisch significant (p= 0,165). Ook hier werd nagegaan of er al dan niet

een permeabiliteitsverhoging is opgetreden ter hoogte van de achterhersenen (tabel 7)

Tabel 7: Fluorescentiescores van coupe 5 vergeleken met de gemiddelde fluorescentiescores van

iedere rat na perfusie met 3kDa dextraan fluoresceïne.

Rat Coupe 5 Gemiddelde

Sham 5 29473 27957

Sham 6 38731 32492

PCS 4 61321 51754

PCS 5 36800 35960

PCS 6 45570 39390

PCS 7 93507 57140

38

Fig. 19: Fluorescentiescore opgemeten ter hoogte van coupe 5 ten opzichte van de gemiddelde

fluorescentiescores. Er blijkt geen significant verschil aanwezig te zijn in fluorescentiescores ter

hoogte van coupe 5 (p=0,355).

Uit de voorgaande resultaten blijkt dat de verschillen in permeabiliteit tussen de drie groepen

niet statistisch significant is. Daarom trachten we aan de hand van correlatiestudies een

verband te vinden tussen de verschillende bepaalde parameters.

3.5 Correlatiestudie

Een correlatiecoëfficient is een maat voor het verband tussen twee variabelen. In dit

experiment werden Pearson correlaties bepaald. Een negatieve waarde dicht bij -1 duidt op

een omgekeerde correlatie, een positieve waarde dicht bij +1 op een lineaire correlatie.

Waarden dichtbij nul tonen aan dat er geen verband is tussen de 2 variabelen.

39

Tabel 8: Pearsoncorrelatie tussen fluorescentiescores met 376 Da fluoresceïne, scores functionele test

en gewichtstoename.

Fluorescentie

Gemiddelde score

functionele test

Gewichtstoename

Fluorescentie

1 -0,248 -0,01

Gemiddelde score

functionele test

-0,248 1 -0,105

Gewichtstoename -0,01 -0,105 1

Uit deze correlatiestudie konden geen significante verbanden gelegd worden tussen de

afzonderlijke variabelen.

Deze correlatiestudie werd ook uitgevoerd voor de ratten die een in vivo BHB-

permeabiliteitsbepaling hebben ondergaan met 3 kDa dextraanfluoresceïne (niet

weergegeven). Vanwege de kleine steekproefgrootte werd enkel een correlatiecoëfficiënt van

0,721 (met p=0,106) gevonden voor de relatie tussen de gewichtstoename en scores op de

functionele tests.

Tabel 9: Pearsoncorrelatie voor zink en ammoniak ten opzichte van de fluorescentiescores voor 376

Da fluoresceïne, gewichtstoename en gemiddelde scores functionele testen.

Fluorescentiescores

Gemiddelde score functionele testen

Zink

-0,501

0,398

Ammoniak

-0,056

-0,034

Uit deze correlatiestudie werd een postitieve correlatie teruggevonden van de zinkwaarden ten

opzichte van de gemiddelde scores op de functionele testen (met p<0,1). Mogelijks kan er een

omgekeerd verband zijn tussen de zinkwaarden en fluorescentiescores (met p=0,169). Er kon

geen verband aangetoond worden tussen de zink en ammoniakwaarden en fluorescentiescores

of scores op de functionele testen voor de groep die met 3kDa DF werden behandeld (niet

weergegeven).

40

4. Discussie

4.1 Functionele testen

4.1.1 Reflexen en gedragsobservaties

Om HE klinisch te kunnen aantonen, moesten de ratten onderworpen worden aan een

gestandaardiseerde functionele test. Deze test laat toe om via een objectieve beoordeling van

verschillende parameters te komen tot een algemeen beeld van de (neuro)musculaire functies.

Dit experiment werd, in tegenstelling tot Calle et al. (30), om praktische redenen tweemaal

per week uitgevoerd in plaats van dagelijks. In onze studie werd een sterk verlaagde score

opgemeten bij de CBDL groep en een verlaagde score bij de PCS groep ten opzichte van de

controlegroep. Er werd ook vastgesteld dat voornamelijk de experimentele ratten faalden bij

de horizontale staaftest waarbij de ratten minstens drie minuten hun evenwicht moesten

houden en het gekanteld platform test waarbij ze binnen de 30 seconden verwacht werden de

helling te gaan overstijgen. Deze gegevens indiceren dat het evenwicht verstoord is geraakt

bij deze twee groepen. De resultaten komen deels overeen met deze van Norton et al. die

werd uitgevoerd op ratten die type A HE hebben ontwikkeld (23).

De resultaten van de sensoriële en motorische testen werden gebruikt om de ernst van HE in

te schatten. Bepaalde reflexen zoals het gekanteld platform test bleken ook in deze studie weg

te vallen bij een deel van de experimentele groep. In de vierde week van de studie werd bij de

helft van de CBDL dieren een lager bewustzijn vastgesteld (score 2) en waren de spontane

bewegingen beperkt (score 2). In de studie van Norton et al. werd dit gebruikt als criterium

om aan te tonen dat het tweede stadium van HE is bereikt. In tegenstelling tot wat deze studie

aantoont, werd in onze studie reeds in de eerste week significant lagere scores teruggevonden

voor de evenwichtstesten, daar waar in de studie van Norton et al. een stapsgewijze aftakeling

werd aangetoond voor deze testen. Hieruit blijkt dat het patroon van aftakelen verschillend is,

afhankelijk van het type van HE. Ratten met type A HE blijken een meer progressieve en

stapsgewijze aftakeling van de motorische functies te ondergaan.

Het grijp- en plaatsingsreflex bleken steeds aanwezig te zijn gedurende het hele experiment in

de drie groepen. Ook in de studie van Norton et al. werd vastgesteld dat deze reflexen

gemiddeld gezien later wegvielen dan de andere reflexen en motorische functies.

41

Wanneer we kijken naar de evolutie van de neuromotorische functies in functie van de tijd,

wordt een quasi lineaire daling in scores vastgesteld voor de CBDL groep tussen week 1 en 4.

Vanaf week 5 treedt er schijnbaar weer een toename in functionaliteit. Hierbij kan echter

opgemerkt worden dat slechts 7 van de 12 CBDL ratten de 5e week overleefd hebben en de

meest afgetakelde dieren al stierven voor het beëndigen van het experiment. Binnen de PCS

groep is de evolutie doorheen de tijd minder eenduidig te bespreken. In de eerste week na de

ingreep waren de scores vergelijkbaar met deze van de controlegroep. In de tweede week

werden lagere scores gegeven omdat de horizontale staaftest en het gekanteld platform test

niet door alle PCS ratten binnen het tijdsinterval konden volbracht worden. Deze testen

werden steeds tweemaal per week uitgevoerd en alle ratten werden aan deze tests

onderworpen. Voor de PCS groep die bestaat uit 10 ratten gaat het dus samengeteld om 40

evenwichtsmetingen in de tweede week. In de tweede week werd een lagere score genoteerd

voor 13 van de 40 metingen (horizontale staaftest en het gekanteld platform test). In de derde

week werden slechts 9 van de 40 testen als niet succesvol voltooid gerapporteerd. Uit de

analyse met de Open Field Test is ook gebleken dat de PCS ratten in de derde week een hoger

aantal hokjes doorlopen hebben en dat de frequentie van het steigeren schoonlikgedrag is

gestegen (zie verder). In de vierde week werd bij twee van deze ratten een sterkere

functionele achteruitgang (beiden een score van 14) gerapporteerd. Deze functionele

achteruitgang bleek zich in de 5e week te herstellen, daar waar in de 6

e week weer een sterkere

functionele achteruitgang werd vastgesteld voor één van de twee ratten. Uit het grillig verloop

van de evolutie van de scores voor de PCS ratten kan verondersteld worden dat HE bij een

aantal van deze ratten episodisch of onregelmatig van karakter is.

4.1.2 De Open Field Test

De OFT werd wekelijks uitgevoerd om het leervermogen, functionaliteit en algemeen gedrag

van de proefdieren te observeren. Algemeen wordt aangenomen dat ratten die voor het eerst

blootgesteld worden aan een nieuwe omgeving een meer exploratieve houding gaan

aannemen, wat zich zal uiten in een hogere motorische activiteit en frequentie van het

steigergedrag (29). Wanneer de rat herhaaldelijk in dezelfde omgeving wordt geplaatst, zou

dit moeten leiden tot een graduele afname van hun natuurlijk exploratief gedrag wegens

gewenning. Dit principe kan gekoppeld worden aan het leervermogen van de rat om een

vertrouwde omgeving te herkennen.

42

Over de eventuele veranderingen van de locomotorische activiteit en gedragingen van de PCS

rat zijn meerdere tegenstrijdigheden teruggevonden in de literatuur (29). Sommige studies

rapporteren minimale of zelfs geen veranderingen in motorische activiteit ten opzichte van de

controlegroep, terwijl in een meerderheid van de studies hypoactiviteit werd gerapporteerd.

In deze studie werd in de eerste week een lager aantal hokjes doorlopen door beide

experimentele groepen, alsook het steigergedrag bleek lager te zijn. Binnen de CBDL groep

bleek deze trend behouden te blijven gedurende het hele experiment en er werden steeds een

lager aantal hokjes doorlopen en ook de steigerfrequentie nam af in functie van de tijd. Deze

bevindingen komen overeen met de verwachtingen dat de algemene activiteit van de

experimentele ratten lager zou liggen dan de controlegroep naarmate het experiment vordert

(23). Dit zou toegeschreven kunnen worden aan een ernstigere aantasting van de motorische

functies. Alhoewel deze gegevens niet statistisch aangetoond konden worden, kan deze

hypothese versterkt worden wanneer de andere parameters ook in rekening worden gebracht.

De ratten werden bij de aanvang van de test steeds in het midden van de box geplaatst zodat

de bekomen resultaten eenduidiger met elkaar konden vergeleken worden. Uit de gegevens

blijkt dat CBDL ratten in de 1e en 6

e week gemiddeld een derde van de analysetijd stationair

in het midden bleven zitten, wat indicatief is voor een hogere stress-status. In de laatste week

was dit verschil zelfs zeer sterk significant verschillend van de controlegroep. In de 2e en 6

e

week werd ook een significant hogere urinefrequentie gerapporteerd binnen de CBDL groep,

alsook een hogere defecatiefrequentie over de hele lijn, wat ook kan duiden op een hogere

stress-status binnen deze groep. Wanneer we het likgedrag analyseren wat typisch geuit wordt

als respons op een verplaatsing uit een vertrouwde omgeving, valt het op dat de CBDL dieren

zichzelf vaker schoonlikken in vergelijking met de controlegroep. Het likgedrag blijkt wel te

verminderen naarmate het experiment vordert. Dit kan verklaard worden doordat mogelijks

een vertraagde gewenning is opgetreden en kan gekoppeld worden aan het feit dat het

leervermogen mogelijks beperkter is geworden binnen de experimentele groepen.

Het steigergedrag en aantal hokjes die werden doorlopen door PCS ratten, steeg in de derde

week na de ingrepen. De ratten bleken in die week een hogere motorische activiteit te

vertonen, wat eveneens bevestigd wordt door de scores op de reflexen en gedragsobservaties.

Deze verhoogde motorische activiteit werd ook opgemeten in week 6, waarbij toch ook een

verhoogde mate van schoonlik gedrag werd gezien, evenals een (niet-significant) verhoogde

43

urine- en defecatiefrequentie. Mogelijks is dit onverwacht patroon te wijten aan de

ontwikkeling van onregelmatige HE.

Wanneer we de resultaten van de OFT op week 6 vergelijken ten opzichte van week 1 zien we

dat een aantal veranderingen hebben plaatsgevonden binnen de derde groep die niet steeds

duidelijk te verklaren zijn. De CBDL ratten vertoonden op het einde van het experiment een

lagere urinefrequentie, een lager aantal hokjes werd doorlopen, het schoonlikken als respons

op de verplaatsing werd minder frequent gezien, evenals het steigergedrag verminderde ten

opzichte van week 1. Deze veranderingen kunnen gedeeltelijk een verklaring zijn voor het feit

dat gewenning is opgetreden. Deze gegevens lijken wel paradoxaal wanneer we kijken naar

de tijd die doorgebracht werd in het midden en de blokkeringsfrequentie. Uit deze data blijkt

dat de verschillen ten opzichte van week 1 zeer beperkt zijn en dat het stressniveau eerder

verhoogd is.

4.2 Bloedanalyse

Diermodellen voor type C HE vertonen een significant lagere albuminewaarde. Dit indiceert

dat een relevante leverschade is opgetreden binnen deze groep (19). Daarnaast zijn de ALP

waarden significant gestegen wat een galwegobstructie aantoont. Deze galwegobstructie

manifesteerde zich in zichtbare ascites en een gewichtstoename en biliomen werden gezien bij

de sacrificatie. De significant hogere bilirubinewaarden die werden geanalyseerd en een

galwegobstructie en leverschade indiceren, versterken de voorgaande data. Daarnaast werd

een lagere zinkwaarde vastgesteld, dit werd niet beschouwd als relevant, maar er is wel een

indicatie (p<0,1) dat astrocytzwelling en oxidatieve stress is opgetreden. Een zinkdeficiëntie

wordt geassocieerd met stoornissen in het leerproces en geheugen. Wanneer we kijken naar de

scores op de functionele testen zien we dat er mogelijks een lineair verband bestaat tussen de

scores op de functionele testen en de zinkwaarden.

De ammoniak en glucosewaarden waren niet relevant verschillend van de controlegroep. Er

moet echter opgemerkt worden dat de ammoniakwaarden binnen de CBDL groep sterk

uiteenlopend zijn en dat bij één outlier zelfs een verdubbeling van de ammoniakwaarden is

opgetreden.

44

De leverschade bij PCS ratten kon enkel aangetoond worden door de significante stijging van

de bilirubineconcentratie in het serum. De ALP waarden waren sterk vergelijkbaar met deze

van de controlegroep wat een galwegobstructie kan uitsluiten.

De zinkwaarden voor deze groep waren zeer sterk gedaald ten opzichte van de controlegroep,

wat geassocieerd kan worden met een verstoord leervermogen. Dit gegeven kan bevestigd

worden met de data die bekomen werden uit de functionele testen. De sterkere daling bij de

PCS ratten ten opzichte van de CBDL ratten kan echter wel in vraag gesteld worden

aangezien de CBDL ratten significant lager scoorden op de functionele testen. Een mogelijke

verklaring hiervoor is dat de steekproefgrootte voor de bloedanalyse slechts beperkt was tot

respectievelijk 6 en 5 ratten.

De ammoniakwaarden binnen de PCS groep waren sterk verhoogd, wat indiceert dat de ratten

HE hebben ontwikkeld.

4.3 Gewichtstoename en uitwendige observaties

De bepaling van het lichaamsgewicht is belangrijk om de algemene gezondheidstoestand van

het dier op te volgen (29). Om deze parameter beter op te volgen werden de ratten, in

tegenstelling tot de studie van Apelqvist et al. waar de ratten wekelijks werden gewogen,

tweemaal per week en nuchter gewogen. Alhoewel er geen significant verschil kon

aangetoond worden in gewichtstoename tussen de PCS en controlegroep, werd enkel bij twee

experimentele ratten een gewichtsafname vastgesteld na 6 weken.

Een meerderheid van de CBDL ratten vertoonden daarnaast tekenen van ascites en geelzucht,

werden apatisch en het uitzicht van de vacht vergrauwde. Deze gegevens versterken, samen

met de voorgaande data, ons vermoeden dat HE zich klinisch heeft geuit.

4.4 In vivo bepaling van de BHB-permeabiliteit

Een in vivo bepaling van de BHB-permeabiliteit met 376 Da fluoresceïne en 3kDa

dextraanfluoresceïne heeft niet geleid tot een aantoonbaar verschil tussen de groepen. Een

opmerking hierbij is dat met 376 Da fluoresceïne als merker zelfs binnen de controlegroep

een zeer grote spreiding werd waargenomen (figuur 16). Het gebruik van deze merker om een

verschil in permeabiliteit aan te tonen kan hierbij in vraag gesteld worden. Uit andere studies

is gebleken dat er een sterk vermoeden is dat de bloed-hersenbarrière bij HE selectief

45

beschadigt raakt (22). Voorgaande studies op ratten met HE waarbij routinematig Evans Blue

gemerkt albumine als merker werd gebruikt, hebben ook geleid tot negatieve resultaten.

Wel is uit onze studie gebleken dat een (niet-significant) hogere fluorescentiegraad aanwezig

was ter hoogte van de achterhersenen (coupe 5), wat mogelijks indiceert dat de BHB-

permeabiliteit daar voornamelijk is gewijzigd. Als we kijken naar de experimentele groepen,

zien we dat dit verschil met 376 Da fluoresceïne als merker net niet statistisch significant is

voor de CBDL groep ten opzichte van de controlegroep (p-waarde= 0,153). Wanneer we de

slechtere resultaten op de evenwichtstesten hieraan koppelen, kan een verklaring gevonden

worden voor het feit dat de achterhersenen aangetast zijn en het evenwicht verstoord is

geraakt. Deze verklaring is echter hypothetisch en verdere studies zijn noodzakelijk om dit

vermoeden al dan niet te bevestigen.

Dat de verschillen in permeabiliteit ter hoogte van de achterhersenen niet significant zijn, kan

mogelijks ook verklaard worden door de keuze van de fluorescente merker of de te kleine

steekproefgrootte.

Uit onze studie komt voort dat de fluorescentiescores met 376 Da fluoresceïne als merker met

een laag moleculair gewicht gemiddeld 47844, 54864 en 47987 bedraagt voor respectievelijk

Sham, CBDL en PCS ratten. Voor dextraanfluoresceïne als middelgrote merker werd een

lagere gemiddelde fluorescentiescore, namelijk 30224 voor de controlegroep en 40212 voor

PCS ratten, gerapporteerd. Dit verschil zou hoogstwaarschijnlijk een gevolg kunnen zijn van

de invloed van de moleculaire grootte op de beweging van moleculen doorheen de BHB zoals

ook als hypothese vooropgesteld werd door Mayhan et al. (34).

Wanneer we de boxplot van de resultaten voor dextraanfluoresceïne bekijken, zien we dat een

verhoogde permeabiliteit is opgetreden binnen de PCS groep (score van 40212) ten opzichte

van de controlegroep (score van 30224). Alhoewel dit verschil niet significant is, is er een

vermoeden dat eventuele wijzigingen van de permeabiliteit eerder door een merker met een

hogere moleculair gewicht zouden kunnen aangetoond worden.

46

5. Algemeen besluit

In deze studie werd aangetoond dat HE zich klinisch heeft geuit in de twee experimentele

groepen. Dit is gebleken uit de analyse van de reflexen en gedragsobservaties, waar

significante en zeer siginificante verschillen werden aangetoond tussen respectievelijk de PCS

en CBDL ratten ten opzichte van de controlegroep. Deze gegevens worden versterkt door de

uitwendige observaties, alsook de bloedresultaten bleken compatibel met de bekomen data.

Wanneer we echter de resultaten van de Open Field test in rekening brengen, worden de

verschillen tussen de drie groepen minder eenduidig en zijn de veranderingen in functie van

de tijd grillig van verloop, wat een besluitformulering bemoeilijkt.

Uit het grillig verloop van de evolutie van de scores op de OFT, evenals de individuele scores

op de gedragsobservaties voor de PCS ratten kan echter wel verondersteld worden dat HE bij

een aantal van deze ratten episodisch of onregelmatig van karakter is.

Een in vivo bepaling van de BHB-permeabiliteit met 376 Da fluoresceïne en 3kDa

dextraanfluoresceïne heeft niet geleid tot een aantoonbaar verschil tussen de groepen. Een

opmerking hierbij is dat met 376 Da fluoresceïne als merker zelfs binnen de controlegroep

een zeer grote spreiding werd waargenomen. Wel is uit onze studie voorgekomen dat een

hogere fluorescentiegraad aanwezig was ter hoogte van de achterhersenen, wat mogelijks

indiceert dat de BHB-permeabiliteit daar voornamelijk is gewijzigd. Wanneer we de slechtere

resultaten voor de evenwichtstesten hieraan koppelen, kan een verklaring gevonden worden

voor het feit dat de achterhersenen aangetast zijn en het evenwicht verstoord is geraakt.

De keuze van de fluorescente merker of de te kleine steekproefgrootte zouden ook een reden

kunnen zijn waarom er geen relevante verschillen in permeabiliteit werd opgespoord.

Anderzijds kan dit ook een indicatie zijn dat de permeabiliteit op zich niet significant wijzigt

maar dat bepaalde deelmechanismen falen. Een vervolgstudie is vereist waarbij een keuze

wordt gemaakt voor een specifiekere en grotere fluorescente merker, een grotere

steekproefgrootte of studie van andere deelmechanismen die bijdragen tot een goede werking

van de bloed-hersenbarrière. Er is wel een zekere indicatie dat voornamelijk de regio van de

achterhersenen een selectieve permeabiliteitsverhoging ondergaat ten gevolge van leverfalen.

47

6. Referentielijst

1. Cordoba J, Minguez B (2008). Hepatic encephalopathy. Semin Liver Dis. 28: 70-80.

2. Cardoso FL, Brites D, Brito MA (2010). Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Research Reviews 64: 328-63.

3. Hirschi KK, Damore PA (1996). Pericytes in the microvasculature. Cardiovascular Research

32: 687-98.

4. Benarroch EE (2005). Neuron-astrocyte interactions: Partnership for normal function and disease in the central nervous system. Mayo Clinic Proceedings 80: 1326-38.

5. Wolburg H, Lippoldt A (2002). Tight junctions of the blood-brain barrier: Development,

composition and regulation. Vascular Pharmacology 38: 323-37. 6. Thevenin AF, Kowal TJ, Fong JT, Kells RM, Fisher CG, Falk MM (2013). Proteins and

Mechanisms Regulating Gap-Junction Assembly, Internalization, and Degradation. Physiology 28: 93-

116.

7. Morris SM (2002). Regulation of enzymes of the urea cycle and arginine metabolism. Annu Rev Nutr 22: 87-105.

8. Perz JF, Armstrong GL, Farrington LA, Hutin YJF, Bell BP (2006). The contributions of

hepatitis B virus and hepatitis C virus infections to cirrhosis and primary liver cancer worldwide. Journal of Hepatology 45: 529-38.

9. Cortez-Pinto H, Camilo ME (2004). Non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic

steatohepatitis (NAFLD/NASH): diagnosis and clinical course. Best Practice & Research in Clinical Gastroenterology 18: 1089-104.

10. http://www.vad.be/alcohol-en-andere-drugs/feiten-en-cijfers/alcohol.aspx.

11. http://depts.washington.edu/hepstudy/healthed/counselingHepC/discussion.html.

12. Butterworth RF (2008). Pathophysiology of hepatic encephalopathy: The concept of synergism. HEPATOLOGY RESEARCH 38: S116-S21.

13. Norenberg MD, Rao KVR, Jayakumar AR (2009). Signaling factors in the mechanism of

ammonia neurotoxicity. Metabolic brain disease 24: 103-17. 14. Vaquero J, Butterworth RF (2006). The brain glutamate system in liver failure. Journal of

neurochemistry 98: 661-9.

15. Butterworth RF (2007). Neuronal cell death in hepatic encephalopathy. Metabolic Brain Disease 22: 309-20.

16. Cordoba J (2011). New assessment of hepatic encephalopathy. JOURNAL OF

HEPATOLOGY 54: 1030-40.

17. Bajaj JS (2010). Review article: the modern management of hepatic encephalopathy. Alimentary Pharmacology & Therapeutics 31: 537-47.

18. Butterworth RF, Norenberg MD, Felipo V, Ferenci P, Albrecht J, Blei AT et al. (2009).

Experimental models of hepatic encephalopathy: ISHEN guidelines. Liver International 29: 783-8. 19. Kawai H, Kudo N, Kawashima Y, Mitsumoto A (2009). Efficacy of urine bile acid as a non-

invasive indicator of liver damage in rats. Journal of Toxicological Sciences 34: 27-38.

20. Stam R, Croiset G, Akkermans LMA, Wiegant VM (1997). Behavioural and intestinal

responses to novelty in rats selected for diverging reactivity in the open field test. Behav Brain Res 88: 231-8.

21. Mendez M, Mendez-Lopez M, Lopez L, Aller MA, Arias J, Cimadevilla JM, et al. (2008).

Spatial memory alterations in three models of hepatic encephalopathy. Behav Brain Res 188: 32-40. 22. Mossakowski MJ, Smialek M, Pronaszko A (1971). Disturbances in the permeability of the

cerebral blood vessels in experimental hepatic encephalopathy. Polish Medical Journal 10: 208-17.

23. Norton NS, McConnell JR, RodriguezSierra JF (1997). Behavioral and physiological sex differences observed in an animal model of fulminant hepatic encephalopathy in the rat. Physiology &

Behavior 62: 1113-24.

http://www.vad.be/alcohol-en-andere-drugs/feiten-en-cijfers/alcohol.aspx

http://depts.washington.edu/hepstudy/healthed/counselingHepC/discussion.html

48

24. Miyamoto S, Okazaki M, Ohura N, Shiraishi T, Takushima A, Harii K (2008). Comparative

study of different combinations of microvascular anastomoses in a rat model: End-to-end, end-to-side,

and flow-through anastomosis. Plast Reconstr Surg 122: 449-55. 25. http://www.artreality.com/portfolio/wdwork/vet/portosystemicvascularshunts.htm.

26. Geerts AM, De Vriese AS, Vanheule E, Van Vlierberghe H, Mortier S, Cheung KJ, et al.

(2006). Increased angiogenesis and permeability in the mesenteric microvasculature of rats with cirrhosis and portal hypertension: an in vivo study. Liver International 26: 889-98.

27. Takakuwa Y, Kokai Y, Sasaki KI, Chiba H, Tobioka H, Mor M, et al. (2002) Bile canalicular

barrier function and expression of tight-junctional molecules in rat hepatocytes during common bile

duct ligation. Cell Tissue Res 307: 181-9. 28. Kato Y, Katsuta Y, Zhang XJ, Ohsuga M, Akimoto T, Miyamoto A, et al. (2011). Inhibition of

Nitric Oxide Synthase in Hyperdynamic Circulation of Rats with Early or Late Cirrhosis Secondary to

Common Bile Duct Ligation. Journal of Nippon Medical School 78: 146-55. 29. Apelqvist C, Hindfelt B, Andersson G, Bengtsson F (1999). Altered adaptive behaviour

expressed in an open-field paradigm in experimental hepatic encephalopathy. Behav Brain Res 106:

165-73. 30. Calle PA, Bogaert MG, Vanreempts JL, Buylaert WA (1989). NEUROLOGICAL DAMAGE

IN A CARDIOPULMONARY ARREST MODEL IN THE RAT. Journal of Pharmacological

Methods 22: 185-95.

31. Walsh RN (1976). The Open Field Test: A critical review. Psychological Bulletin 83: 482-504. 32. http://www.uonbi.ac.ke/projects/ibro/images/documents/workshops2005/open-field-method-

2005.pdf.

33. Schliess F, Gorg B, Haussinger D (2009). RNA oxidation and zinc in hepatic encephalopathy and hyperammonemia. Metabolic brain disease 24: 119-34.

34. Mayhan WG. (2002) Inhibition of nitric oxide synthase does not alter basal permeability of the

blood-brain barrier. Brain Research 855: 143-9.

http://www.artreality.com/portfolio/wdwork/vet/portosystemicvascularshunts.htm

http://www.uonbi.ac.ke/projects/ibro/images/documents/workshops2005/open-field-method-2005.pdf

http://www.uonbi.ac.ke/projects/ibro/images/documents/workshops2005/open-field-method-2005.pdf

Studie van de bloed-hersenbarrière in twee ratmodellen van ......Studie van de...

Documents

Transcript of Studie van de bloed-hersenbarrière in twee ratmodellen van ......Studie van de...