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Struktur-Funktionsbeziehungen
der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien
Inauguraldissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der
Fakultät für Chemie
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Dennis Franz-Josef Fiegen
aus Kleve
April 2005
INHALTSVERZEICHNIS _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien III
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis .................................................................................................................... III
Abbildungsverzeichnis ............................................................................................................ IX
Tabellenverzeichnis ................................................................................................................. XI
Abkürzungsverzeichnis ..........................................................................................................XII
1. Einleitung ........................................................................................................................ 1
1.1 GTP-bindende Proteine als Elemente der Signaltransduktion ..................................... 2
1.2 Die Ras-Superfamilie ..................................................................................................... 3
1.3 Die GTPasen der Rho-Familie ....................................................................................... 7
1.4 Regulatoren und Effektoren der RhoGTPasen ............................................................... 8
1.5 Die Signaltransduktion der Plexin-Transmembranrezeptoren ........................................ 15
2. Zielsetzung ..................................................................................................................... 21
3. Material und Methoden ................................................................................................ 22
3.1 Material ........................................................................................................................... 22
3.1.1 Bakterienstämme ................................................................................................... 22
3.1.2 Insektenzelllinien ................................................................................................ 22
3.1.3 Nährmedien und Antibiotika ................................................................................ 23
3.1.3.1 Nährmedien und Zusätze ......................................................................... 23
3.1.3.2 Antibiotika .............................................................................................. 23
3.1.4 Puffer und Lösungen ............................................................................................ 23
3.1.5 Vektoren .............................................................................................................. 27
3.1.6 Oligonukleotide ................................................................................................... 28
3.1.6.1 Oligonukleotide zur Fragmentherstellung ............................................... 28
3.1.6.2 Oligonukleotide zur Sequenzierung ........................................................ 29
3.1.7 Biochemikalien und Chemikalien ......................................................................... 30
3.1.7.1 Proteine und Enzyme ................................................................................ 30
3.1.7.2 Nukleotide ................................................................................................ 30
3.1.7.3 Protein- und Nukleinsäurestandards ........................................................ 31
3.1.7.4 Proteinase-Inhibitoren ............................................................................. 31
3.1.7.5 FPLC-Säulenmaterial ............................................................................. 31
3.1.7.6 Chemikalien .............................................................................................. 31
3.1.7.7 Antikörper ................................................................................................ 32
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3.1.8 Kit-Systeme .......................................................................................................... 32
3.1.9 Geräte ................................................................................................................... 32
3.1.10 Verbrauchsmaterialien ....................................................................................... 33
3.1.11 Kristallographische Screens ................................................................................ 34
3.1.12 Programme .......................................................................................................... 34
3.2 Molekularbiologische Methoden .................................................................................. 35
3.2.1 Herstellung kompetenter E. coli Zellen ............................................................... 35
3.2.2 Transformation von E. coli .................................................................................. 35
3.2.3 Kultivierung und Lagerung von transformierten Bakterienzellen ....................... 35
3.2.4 Isolierung von Plasmid-DNA ................................................................................ 36
3.2.5 Präparation von Bakmid-DNA ............................................................................. 36
3.2.6 Hydrolyse von Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen ............................ 37
3.2.7 Agarose-Gelelektrophorese .................................................................................. 37
3.2.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen .......................................... 38
3.2.9 Ligation ................................................................................................................. 38
3.2.10 Polymerasekettenreaktion (PCR) ...................................................................... 38
3.2.11 Analytische Schnell-PCR zur Bestimmung positiver Klone .............................. 40
3.2.12 DNA-Sequenzierung ......................................................................................... 41
3.3 Insektenzellen ................................................................................................................. 42
3.3.1 Kulturbedingungen .............................................................................................. 42
3.3.2 Transfektion von Sf21-Zellen mit rekombinanter Bakmid-DNA ....................... 42
3.3.3 Bestimmung des Virus-Titers ............................................................................. 43
3.3.4 Virusamplifikation ................................................................................................ 44
3.3.5 Proteinexpression in Sf21-Zellen ......................................................................... 44
3.4 Proteinchemische Methoden ......................................................................................... 45
3.4.1 Analytische Expression rekombinanter Plasmide ................................................. 45
3.4.2 Analytischer Aufschluss von Bakterienzellen ...................................................... 45
3.4.3 Präparative Expression rekombinanter Proteine .................................................... 45
3.4.4 Präparativer Aufschluss von Bakterienzellen ...................................................... 46
3.4.5 Präparativer und analytischer Aufschluss von Insektenzellen .............................. 46
3.4.6 Affinitätschromatographie .................................................................................. 46
3.4.6.1 GST Gene Fusion System ......................................................................... 47
3.4.6.2 QIAexpress System .................................................................................. 47
3.4.7 Ionenaustauscherchromatographie ...................................................................... 47
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3.4.8 Gelfiltration .......................................................................................................... 48
3.4.9 Protease-Verdau von GST-/6xHis-Fusionsproteinen .......................................... 48
3.4.10 Ultrafiltration zur Konzentrierung ...................................................................... 49
3.4.11 Konzentrationsbestimmung nach Bradford ........................................................ 49
3.4.12 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ........................................ 49
3.4.13 Western Blot ....................................................................................................... 51
3.4.14 Umkehrphasen HPLC ......................................................................................... 53
3.4.15 Nukleotidaustausch ............................................................................................ 53
3.4.16 GTPase Pulldown Assay .................................................................................... 54
3.4.17 Gelelektrophorese nativer Proteine .................................................................... 55
3.5 Biophysikalische Methoden ............................................................................................ 56
3.5.1 Massenspektrometrie ............................................................................................ 56
3.5.2 Fluoreszenzspektroskopische Methoden............................................................... 56
3.5.2.1 Bestimmung langsamer Reaktionskinetiken ............................................. 57
3.5.2.2 Stopped-Flow-Messungen schneller Reaktionen ..................................... 58
3.5.2.3 Graphische Auswertung der Fluoreszenzdaten ........................................ 58
3.5.3 Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ............................................................... 59
3.6 Kristallographische Methoden ....................................................................................... 60
3.6.1 Kristallisation ....................................................................................................... 60
3.6.2 Kristallisation nach der Methode des hängenden Tropfens ................................. 61
3.6.3 Kristallisation nach der Methode des sitzenden Tropfens ................................... 62
3.6.4 Kristallisationsbedingungen .................................................................................. 62
3.6.5 Silikonisierung von Deckgläsern........................................................................... 62
3.6.6 Kristallmontage ..................................................................................................... 63
3.6.6.1 Verwendung einer Quarzkapillare ........................................................... 63
3.6.6.2 Kristallmontage unter kryogenen Bedingungen........................................ 63
3.6.7 Grundlagen der Röntgenstrukturanalyse............................................................... 63
3.6.8 Datensammlung ..................................................................................................... 65
3.6.9 Phasenproblem ..................................................................................................... 65
3.6.10 Strukturbestimmung ............................................................................................ 67
3.6.10.1 Molekularer Ersatz (MR) ...................................................................... 67
3.6.10.2 Multipler isomorpher Ersatz (MIR) ...................................................... 68
3.6.11 Modellbau und Strukturverfeinerung .................................................................. 70
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4. Ergebnisse ........................................................................................................................ 73
4.1 GTPasen der Ras- und Rho-Familien.............................................................................. 73
4.1.1 Klonierung und Expression von Rho-GTPasen .................................................... 73
4.1.2 Reinigung der GTPasen ....................................................................................... 74
4.2 GTPase bindende Domänen der Plexine (GBD) ........................................................... 75
4.2.1 Klonierung und Expression .................................................................................. 76
4.2.2 Reinigung der GBDs ............................................................................................ 76
4.2.3 Kristallisation der GBDs ....................................................................................... 77
4.2.4 Charakterisierung der GTPase-GBD Bindung ...................................................... 78
4.2.4.1 Native Gelelektrophorese ......................................................................... 78
4.2.4.2 Pulldown Experimente .............................................................................. 80
4.2.4.3 GDI Assay ................................................................................................. 81
4.2.4.4 Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) .................................................... 82
4.2.5 Kristallisation von PlexinB1 GBD mit Rnd1........................................................ 84
4.3 Zytoplasmatische Domänen (CPD) der Plexine ............................................................. 84
4.3.1 Klonierung und Expression in E. coli .................................................................. 85
4.3.2 Reinigung der CPDs aus E. coli ........................................................................... 86
4.3.3 α-Chymotrypsin Proteolyse von Plexin A2 CPD ................................................. 88
4.3.4 Klonierung und Expression der CPDs in Insektenzellen ..................................... 89
4.3.5 Reinigung der PlexinA2, B1 und B2 CPDs aus Insektenzellen ............................ 90
4.3.6 Kristallisation der CPDs ....................................................................................... 91
4.3.7 Kristallstruktur von Hsp31 .................................................................................. 93
4.3.7.1 Kristallisationsbedingung ......................................................................... 93
4.3.7.2 Analyse der Kristalle ................................................................................ 93
4.3.7.3 Derivatisierung der Kristalle .................................................................... 95
4.3.7.4 Datenaufnahme und -prozessierung der Hsp31-Kristalle ....................... 96
4.3.7.5 Multipler isomorpher Ersatz (MIR) von Hsp31........................................ 99
4.3.7.6 Modellbau, Strukturverfeinerung und Qualität von Hsp31 ..................... 100
4.3.8 Charakterisierung der GTPase-CPD Interaktion ................................................. 103
4.3.9 Untersuchung der CPDs auf GAP-Aktivität ........................................................ 104
4.4 Kristallstrukturen von Rac1b·GDP und Rac1b·GppNHp ............................................... 107
4.4.1 Verwendete Proteine ............................................................................................ 107
4.4.2 Nukleotidaustausch und Nukleotidbefreiung von Rac1b ..................................... 107
4.4.3 Kristallisation von Rac1b und Rac1b∆C ............................................................. 108
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4.4.4 Datenaufnahme von Rac1b∆C·GDP/GppNHp...................................................... 109
4.4.5 Datenprozessierung von Rac1b∆C·GDP/GppNHp ............................................... 110
4.4.6 Molekularer Ersatz von Rac1b∆C·GDP/GppNHp ............................................... 111
4.4.7 Modellbau, Strukturverfeinerung und Qualität der Modelle ................................. 113
4.4.8 GDP/GppNHp-Bindung von Rac1b∆C ............................................................... 116
4.5 Die Kristallstrukturen von TC10..................................................................................... 119
4.5.1 Verwendete Proteine ............................................................................................ 119
4.5.2 Nukleotidaustausch .............................................................................................. 119
4.5.3 Kristallisation ........................................................................................................ 120
4.5.4 Datenaufnahme und –prozessierung .................................................................... 124
4.5.5 Eigenrotationsfunktionen ..................................................................................... 132
4.5.5 Molekularer Ersatz ................................................................................................. 135
4.5.6 Modellbau, Strukturverfeinerung und Qualität der Modelle ................................. 138
4.5.7 Vergleich der TC10 Strukturen.............................................................................. 148
4.5.7.1 Gemeinsamkeiten ..................................................................................... 148
4.5.7.2 GDP/GppNHp-Bindung von TC10 ........................................................... 149
4.5.7.3 Die Switch-Regionen von TC10 ............................................................... 153
4.5.7.4 Die β2/β3 Region von TC10 .................................................................... 154
4.5.7.5 Oberflächeneigenschaften von TC10 und Cdc42 ..................................... 156
4.5.8 Untersuchung der Normalmodi von TC10·GDP/GTP .......................................... 157
5. Diskussion ........................................................................................................................ 159
5.1 Charakterisierung der Plexin-Proteinfamilie .................................................................. 159
5.1.1 Reinigung und Kristallisation der Plexin-Proteine ............................................... 160
5.1.2 GTPase-Plexin Interaktion .................................................................................. 164
5.1.3 Sind die zytoplasmatischen Domänen der Plexine GAPs? ................................... 165
5.1.4 Hsp31-Struktur ..................................................................................................... 166
5.2 Kristallstrukturen von Rac1b∆C ..................................................................................... 169
5.2.1 Rac1b·GDP/GppNHp zeigen eine konservierte Struktur ..................................... 170
5.2.2 Der hoch mobile Switch II und die Insertion ........................................................ 171
5.2.3 Die offene Konformation des Switch I .................................................................. 171
5.2.4 Interaktion von Rac1b mit Regulatoren und Effektoren ..................................... 173
5.2.5 Rac1b im zellulären Kontext ................................................................................ 174
5.3 Kristallstrukturen von TC10 ......................................................................................... 176
5.3.1 Die TC10 Strukturen im Vergleich ....................................................................... 177
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5.3.2 Das zusätzliche Mg2+-Ion im β2/β3-Bereich von TC10∆C·GDP.......................... 178
5.3.3 Die Nukleotidbindung von TC10 ......................................................................... 178
5.3.4 Die Switch-Regionen von TC10 ........................................................................... 180
5.3.5 Die Insert-Helix ................................................................................................... 186
5.3.6 Die Oberflächen im Vergleich ............................................................................. 187
5.3.7 Interaktion von TC10 mit Regulatoren und Effektoren ........................................ 188
6. Zusammenfassung .......................................................................................................... 194
7. Literaturverzeichnis ....................................................................................................... 197
Danksagung ........................................................................................................................ 218
Lebenslauf .......................................................................................................................... 220
Liste der Publikationen ..................................................................................................... 221
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Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.1: Die molekulare Schalterfunktion kleiner regulatorischer GTPasen. 3Abb. 1.2: Strukturelle Übersicht über das Ras-Protein. 6Abb. 1.3: Regulation der Morphogenese, Adhäsion und Migration durch Rho-GTPasen. 8Abb. 1.4: Schematische Übersicht der Regulation der RhoGTPasen. 9Abb. 1.5: Semaphorine und ihre Rezeptoren. 16Abb. 1.6: Modelle der Semaphorin Signaltransduktion. 17Abb. 1.7: Sequenzvergleich ausgewählter Plexin und RasGAPs. 20Abb. 3.1: Struktur von 3‘-O-(N-methyl)-anthranoyl-GTP. 57Abb. 3.2: Kristallisation und Proteinkonzentration. 60Abb. 3.3: Kristallisation nach der Methode des hängenden Tropfens. 61Abb. 3.4: Kristallisation nach der Methode des sitzenden Tropfens. 62Abb. 3.5: Bragg’s Gesetz. 64Abb. 3.6: Argand Diagramm für den SIR-Fall. 69Abb. 3.7: Harker Konstruktion für den SIR-Fall. 69Abb. 4.1: Übersicht über die verwendeten GTPasen der Ras- und der Rho-Familien. 73Abb. 4.2: Reinigung von Rnd1∆NC. 74Abb. 4.3: Übersicht über die Reinheit der verwendeten GTPasen. 75Abb. 4.4: Übersicht über die verwendeten GTPase-bindenden Domänen der Plexine. 75Abb. 4.5: Exemplarische Reinigung von PlexinD1 GBD. 76Abb. 4.6: Übersicht über die Reinheit der Plexin GBDs. 77Abb. 4.7: Native Gelelektrophorese von verschiedenen Plexinkonstrukten. 79Abb. 4.8: Native Gelelektrophorese von Ras∆C mit RafRBD als Positivkontrolle. 79Abb. 4.9: Pulldown Experimente mit GST-Plexin GBDs 80Abb. 4.10: Pulldown Experiment von Cdc42∆C mit GST-WASp als Positivkontrolle. 81Abb. 4.11: GDI Experiment für Plexin GBDs mit RhoA, Rac1 und Cdc42. 82Abb. 4.12: ITC-Dissoziationsmessung von PlexinB1 GBD. 83Abb. 4.13: ITC-Experiment der Bindung von PlexinB1 GBD an Rho-GTPasen. 83Abb. 4.14: Übersicht über die verwendeten zytoplasmatischen Proteinfragmente der Plexine. 85Abb. 4.15: Exemplarische Reinigung von PlexinA2 CPD. 87Abb. 4.16: α-Chymotrypsin Proteolyse von PlexinA2 CPD. 88Abb. 4.17: Massenspektroskopische Analyse der α-Chymotrypsin behandelten PlexinA2 CPD. 89Abb. 4.18: Exemplarische Reinigung von PlexinB1 CPD aus Sf21-Zellen. 91Abb. 4.19: Kristalle von PlexinB1 CPD. 92Abb. 4.20: Kristalle von Hsp31. 93Abb. 4.21: SDS-PAGE/Westernblot der Hsp31-Kristalle und des Kristallisationstropfens. 94Abb. 4.22: Massenspektroskopische Analyse der Hsp31 Kristalle. 95Abb. 4.23: Wilsondiagramm des nativen Hsp31-Datensatz. 97Abb. 4.24: Ramachandran-Diagramm und gemittelte Temperaturfaktoren von Hsp31. 102Abb. 4.25: Die asymmetrische Einheit der Hsp31-Kristalle. 103Abb. 4.26: Pulldown Experiment von GST-GTPasen mit PlexinB1 CPD. 103Abb. 4.27: Stopped-Flow Experimente zur Bestimmung der GAP-Aktivität von PlexinB1 CPD. 105Abb. 4.28: Stopped-Flow Experimente zur Bestimmung der GAP-Aktivität von COS7 Zelllysaten. 106Abb. 4.29: Übersicht über die von Rac1b verwendeten Konstrukte im Vergleich zu Rac1. 107Abb. 4.30: Kristalle von Rac1b∆C GDP/GppNHp. 109Abb. 4.31: Wilsondiagramme der Rac1b∆C·Datensätze. 110Abb. 4.32: U-V-Ebene bei W=0 der nativen Pattersondichte des Rac1b∆C·GDP Datensatzes. 112Abb. 4.33: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheiten von Rac1b∆C·GDP und GppNHp. 115Abb. 4.34: Überlagerung der asymmetrischen Einheiten von Rac1b∆C·GDP und GppNHp. 115Abb. 4.35: Ramachandran-Diagramme von Rac1b∆C·GDP und GppNHp. 116Abb. 4.36: Nukleotidbindung von Rac1b. 117Abb. 4.37: Stereo-Darstellung des aktiven Zentrums von Rac1b∆C·GDP und GppNHp. 118Abb. 4.38: Übersicht über die von TC10 verwendeten Konstrukte. 119Abb. 4.39: Optimierung der Kristallisationsbedingungen von TC10∆C·GDP. 121Abb. 4.40: Optimierung der Kristallisationsbedingungen von TC10∆C·GppNHp. 122Abb. 4.41: PEG/Ion Kristallisationsbedingungen von TC10∆C·GppNHp. 123
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Abb. 4.42: Optimierung der Kristallisationsbedingungen von TC10∆NC·GDP. 124Abb. 4.43: Wilsondiagramm des TC10∆C·GDP Datensatzes. 126Abb. 4.44: Wilsondiagramm des TC10∆C·GppNHp Datensatzes. 129Abb. 4.45: Wilsondiagramm des TC10∆NC·GDP Datensatzes. 131Abb. 4.46: Stereographische Projektion der Eigenrotationsfunktion von TC10∆C·GDP. 133Abb. 4.47: Stereographische Projektion der Eigenrotationsfunktion von TC10∆C·GppNHp. 134Abb. 4.48: Stereographische Projektion der Eigenrotationsfunktion von TC10∆NC·GDP. 135Abb. 4.49: U-V-Ebene bei W=0,5 der nativen Pattersondichte des TC10∆C·GppNHp Datensatzes. 137Abb. 4.50: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheit von TC10∆C·GDP. 139Abb. 4.51: Die asymmetrische Einheit und Kristallpackung eines TC10∆C·GDP Kristalls. 140Abb. 4.52: Ramachandran-Diagramm von TC10∆C·GDP. 141Abb. 4.53: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheit von TC10∆C·GppNHp. 142Abb. 4.54: Die asymmetrische Einheit und Kristallpackung eines TC10∆C·GppNHp Kristalls. 143Abb. 4.55: Ramachandran-Diagramm von TC10∆C·GppNHp. 144Abb. 4.56: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheit von TC10∆NC·GDP. 146Abb. 4.57: Die asymmetrische Einheit und Kristallpackung eines TC10∆NC·GDP Kristalls. 147Abb. 4.58: Ramachandran-Diagramm von TC10∆NC·GDP. 147Abb. 4.59: Überlagerung der drei TC10 Strukturen. 148Abb. 4.60: Überlagerung der beiden Strukturen von TC10·GDP und von Cdc42·GDP. 149Abb. 4.61: Omit-Elektronendichtekarten des aktiven Zentrums von TC10. 150Abb. 4.62: Nukleotidbindung von TC10. 152Abb. 4.63: Koordination des zusätzlichen Magnesiumions in der TC10∆C·GDP Struktur. 155Abb. 4.64: Oberflächeneigenschaften von TC10∆NC·GDP, TC10∆C·GppNHp und Cdc42·GDP. 157Abb. 4.65: Analyse der Schwingungsmodi von Cdc42·GDP, TC10·GDP und TC10·GTP. 158Abb. 5.1: Modell zur intrazellulären Signaltransduktion der CPD der Plexin-Proteine. 159Abb. 5.2: Sequenzvergleich der GBDs der Plexine. 161Abb. 5.3: Die Koordination des Malonat-Ions. 168Abb. 5.4: Die 19-Aminosäuren lange Insertion von Rac1b. 169Abb. 5.5: Vergleich der Rac1 und Rac1b Strukturen. 170Abb. 5.6:.Der selbstaktivierende Mechanismus von Rac1b. 175Abb. 5.7: Sequenzvergleich ausgewählter Rho-GTPasen. 176Abb. 5.8: Überlagerung aller TC10 Strukturen. 177Abb. 5.9: Stereo-Überlagerung der β2/β3-Regionen. 178Abb. 5.10: Der molekulare Switch I der Rho-GTPasen im Vergleich. 182Abb. 5.11: Sequenzvergleich der Rho-GTPasen für die β2/β3-Region. 185Abb. 5.12: Oberflächeneigenschaften von TC10∆NC·GDP, TC10∆C·GppNHp und Cdc42·GDP. 188
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Tabellenverzeichnis
Tab. 1.1: Die Ras-Superfamilie der kleinen GTPasen. 4Tab. 1.2: Die Rho-Familie. 7Tab. 3.1: Verwendete Bakterienstämme. 22Tab. 3.2: Verwendete Insektenzelllinien. 22Tab. 3.3: Primäre Antikörper. 32Tab. 3.4: Sekundäre Antikörper. 32Tab. 3.5: Herstellung von Glycin-SDS-Polyacrylamidgelen. 50Tab. 3.6: Herstellung von Tricin-SDS-Polyacrylamidgelen. 51Tab. 3.7: Herstellung von Polyacrylamidgelen für die native Gelelektrophorese. 55Tab. 4.1: Klonierung und Expression der GTPasen. 74Tab. 4.2: Klonierung und Expression der Plexin GBDs. 76Tab. 4.3: ITC-Messungen der Bindung von PlexinB1-GBD an Rho-GTPasen. 84Tab. 4.4: Derivatisierung der Hsp31 Kristalle. 96Tab. 4.5: Datenaufnahme des nativen und der Derivatdatensätze. 97Tab. 4.6: Datenprozessierung des nativen und der Derivatdatensätze. 98Tab. 4.7: Ausgewählte Parameter der Datensätze im Vergleich. 99Tab. 4.8: Verfeinerte Schweratomparameter der Derivate. 100Tab. 4.9: Mittlere Figure of Merit (FOM) in Abhängigkeit von der Auflösung. 100Tab. 4.10: Strukturverfeinerung von Hsp31. 101Tab. 4.11: Datensammlung an Rac1b∆C. 109Tab. 4.12: Datenprozessierung von Rac1b∆C. 111Tab. 4.13: Molekularer Ersatz für Rac1b∆C. 112Tab. 4.14: Strukturverfeinerung von Rac1b∆C. 114Tab. 4.15: Datensammlung an TC10∆C·GDP. 125Tab. 4.16: Datenprozessierung an TC10∆C·GDP. 127Tab. 4.17: Datensammlung an TC10∆C·GppNHp. 128Tab. 4.18: Datenprozessierung an TC10∆C·GppNHp. 129Tab. 4.19: Datensammlung an TC10∆NC·GDP. 130Tab. 4.20: Datenprozessierung an TC10∆NC·GDP. 132Tab. 4.21: Molekularer Ersatz für TC10∆C·GDP. 136Tab. 4.22: Molekularer Ersatz für TC10∆C·GppNHp. 137Tab. 4.23: Molekularer Ersatz für TC10∆NC·GDP. 138Tab. 4.24: Strukturverfeinerung von TC10∆C·GDP. 139Tab. 4.25: Strukturverfeinerung von TC10∆C·GppNHp. 142Tab. 4.26: Strukturverfeinerung von TC10∆NC·GDP. 144
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien XII
Abkürzungsverzeichnis
A
A Ampere (Stromstärke)
Abb. Abbildung
Ak Antikörper
Amp Ampicillin
APS Ammoniumperoxodisulfat
Arf ADP-ribosylation factor
Arl Arf-like
AS Aminosäure
ATP Adenosintriphosphat
B
bp Basenpaare (base pairs)
BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)
bzw. beziehungsweise
C
C‘ C-terminal verkürztes Protein
°C Temperatur in Grad Celsius
Ca2+ Kalziumion
Cdc42 cell division cycle 42
cDNA komplementäre DNA (complementary DNA)
cm Zentimeter
C-Terminus Carboxy-Terminus
D
Da Dalton
DEAE Diethylaminoethyl
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNAse Desoxyribonuklease
dNTP Desoxynukleosidtriphosphat
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien XIII
DTE 1,4 – Dithioerythreitol
DTT 1,4 – Dithiothreitol
E
E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
Em Emissionswellenlänge
ERM Ezrin/Radixin/Moesin
et al. et alia (und Co-Autoren)
etc. et cetera
Ex Excitationswellenlänge
F
fl full length (volle Länge)
FPLC fast performance liquid chromatography
G
g Erdbeschleunigung
GAP GTPase aktivierendes Protein
GBD GTPase-bindende Domäne
GDI Guaninnukleotid–Dissoziations-Inhibitor
GDP Guanosindiphosphat
GEF Guaninnukleotidaustauschfaktor (guanine nucleotide exchange factor)
GMP Guanosinmonophosphat
GppCH2p Guanosin-5‘-(β,γ-methylen)triphosphat
GppNHp Guanosin-5‘-(β,γ-imido)triphosphat
G-Protein Guaninnukleotid-bindendes Protein
GSH Glutathion (reduziert)
GST Glutathion-S-Transferase
GTP Guanosintriphosphat
GTPase Guanosintriphosphatase
H
h hora (Stunde)
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien XIV
HCl Salzsäure/Chlorwasserstoff
HPLC high pressure liquid chromatography
H-Ras Harvey-Ras
I
IG Immunglobulin
IgG Immunglobulin G
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
K
kb Kilobasenpaar
kDa Kilodalton
kcat maximale Geschwindigkeitskonstante
KD Dissoziationskonstante
KM Michaelis-Menten-Konstante
kobs beobachtete Geschwindigkeitskonstante
koff Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation
kon Geschwindigkeitskonstante der Assoziation
K-Ras Kirsten-Ras
L
l Liter
LB Luria Bertani
M
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µM Mikromolar
M molar, Mol pro Liter
mA Milliampere
mant N-Methylanthraniloyl
MAPK mitogen activated protein kinase
MCS multiple cloning site
mg Milligramm
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien XV
mant-GDP/mGDP 2’,3’-bis-O-(N-methyl)anthranoyl-GDP
min Minute
ml Milliliter
mM Millimolar
N
nf nukleotidfrei
ng Nanogramm
NLS nuclear localization signal
nm Nanometer
N-Ras Neuroblastoma-Ras
N-Terminus Amino-Terminus
O
OD optische Dichte
P
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Pak p21-activated protein kinase
PBS phosphate-buffered saline
PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
PDE Phosphodiesterase
PDGF platelet derived growth factor
PEG Polyethylenglykol
Pfu Pyrococcus furiosus (Polymerase)
PI 3-K phosphatidylinositol-3-kinase
PKC Proteinkinase C
PVDF Polyvinyldifluorid
R
Rab Ras-like proteins from rat brain
Rac Ras-related C3-botulinum toxin substrate
Rad Ras associated with diabetes
Rag Ras-related GTP-binding protein
Ran Ras-related nuclear proteins
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien XVI
Ras rat sarcoma
RBD Ras-bindende Domäne
Rheb Ras homolog enriched in brain
Rho Ras homology
Rit Ras-like protein in many tissues
RNA ribo nucleic acid (Ribonukleinsäure)
Rock rho-associated coiled-coil kinase
rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
RT Raumtemperatur
S
s Sekunde
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
sec Sekunde
SDS Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
SH2, SH3 src homology 2/3
srp signal recognition particle
T
TAE Tris-Acetat-EDTA
Taq Thermophilus aquaticus
TBA Tetrabutylammoniumbromid
TBST Tris-buffered saline with Tween-20
TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin
Tiam T-Zell-Lymphom Invasion und Metastasierung (T-cell lymphoma
invasion and metastasis)
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
TSS transformation and storage solution
Tween-20 Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaureat
U
U Unit (Einheit der Enzymaktivität)
u.a. unter anderem
U/min Umdrehungen pro Minute
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien XVII
UV Ultraviolett
V
V Volt
Vol. Volumen
v/v Verhältnis Volumen/Volumen
W
wt Wildtyp
w/v Verhältnis Masse/Volumen
Abkürzungsverzeichnis für Aminosäuren Abkürzungen für Aminosäuren werden im Ein- beziehungsweise Drei-Buchstaben-Code
angegeben.
A Ala Alanin
C Cys Cystein
D Asp Aspartat/Asparaginsäure
E Glu Glutamat/Glutaminsäure
F Phe Phenylalanin
G Gly Glycin
H His Histidin
I Ile Isoleucin
K Lys Lysin
L Leu Leucin
M Met Methionin
N Asn Asparagin
P Pro Prolin
Q Gln Glutamin
R Arg Arginin
S Ser Serin
T Thr Threonin
V Val Valin
W Trp Tryptophan
Y Tyr Tyrosin
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien XVIII
Abkürzungsverzeichnis für Nukleotide Abkürzungen für Nukleotide werden im Ein-Buchstaben-Code angegeben.
A Adenin
C Cytosin
G Guanin
T Thymin
U Uracil
EINLEITUNG _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 1
1. Einleitung
Die enorme strukturelle Variabilität und funktionelle Kapazität eines multizellulären
Organismus ist dadurch bedingt, dass er die biochemischen Reaktionen von vielen
verschiedenen Zellen des gesamten Organismus koordinieren kann. Die Basis hierfür ist die
interzelluläre Kommunikation, die es erlaubt, dass eine einzelne Zelle das Verhalten vieler
anderer Zellen in einer spezifischen Art und Weise beeinflusst.
Die Kommunikation von Zellen erfolgt auf vielen unterschiedlichen Wegen. Neben
chemischen Botenstoffen, Gap junctions und direkter Zell-Zell-Interaktion werden auch
elektrische Signale als Kommunikationsmechanismus verwendet.
Die Weiterleitung von elektrischen Impulsen durch Nervenzellen beruht auf Änderungen im
Membranpotential. Nervenzellen benutzen diese Änderungen um mit anderen Zellen an den
Synapsen zu kommunizieren. Wichtig hierfür ist die Tatsache, dass elektrische Signale in
chemische umgewandelt werden können.
Die interzelluläre Signaltransduktion beeinflusst annähernd jede physiologische Reaktion. Sie
stellt sicher, dass alle Zellen eines Typs ein für sie bestimmtes Signal erhalten, umsetzen und
synchron auf dieses Signal reagieren. Eine weitere Funktion von Signalwegen ist die
Koordination des metabolischen Flusses zwischen verschiedenen Geweben. In höheren
Organismen haben Signalwege die wichtige Aufgabe der Regulation und Koordination der
Zellteilung, so dass sich die Zellen eines Gewebes synchron teilen oder, wenn notwendig, die
Zellteilung unterbrechen und in einen Ruhezustand übergehen.
Die zelluläre Kommunikation hat ebenfalls einen hohen Stellenwert in der Differenzierung
und Entwicklung eines Organismus. Die Entwicklung eines Organismus beruht auf einem
genetischen Programm, das zu jedem Zeitpunkt inter- und intrazelluläre Signalkaskaden
verwendet. Botenstoffe, die von einer Zelle produziert und ausgesendet werden, beeinflussen
die Funktion und die Morphologie einer anderen Zelle des Organismus.
Ein weiterer wichtiger Aspekt der Signaltransduktion ist die Wahrnehmung und Verarbeitung
von sensorischen Informationen. Externe Reize, wie optische oder akustische Signale, Stress
oder das Nährstoffangebot werden in sensorischen Zellen registriert und über Signalwege an
andere Zellen des Organismus weitergegeben.
EINLEITUNG _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 2
1.1 GTP-bindende Proteine als Elemente der Signaltransduktion
Signaltransduktion ist im Allgemeinen ein aktiver und folglich energieaufwendiger Prozess,
im Gegensatz zu metabolischen Prozessen, wo die Energie aus der enzymatischen Hydrolyse
der Phosphoanhydridbindungen des ATP stammt, wird im Fall der regulatorischen Prozesse
die Energie des GTP verwendet. Regulatorische GTP-bindende Proteine sind neben der
Regulation der Signaltransduktion ebenfalls an der Regulation der ribosomalen
Proteinbiosynthese, des intrazellulären Transports von Proteinen und RNA und dem
Membrantransport beteiligt (Bourne et al., 1990). Die Einteilung der GTP-bindenden Proteine
in fünf „Superfamilien“ erfolgt anhand ihrer Funktion (Bourne et al., 1990; Bourne et al.,
1991):
1. die α-Untereinheiten der heterotrimeren G-Proteine (Gα mit Gαs, Gαi, Gαt, Gαo und
Gαq)
2. die Translationsfaktoren der Proteinbiosynthese (IF-2, EF-Tu, EF-G und RF-3)
3. die Ras-homologen Proteine
4. das Signalerkennungspartikel und dessen Rezeptor (SRP und SR)
5. die großen GTP-bindenden Proteine (GBP, Mx und Dynamin)
Regulatorische GTPasen binden GTP und hydrolysieren es Magnesium-abhängig zu GDP und
Orthophosphat. Die Grundlage für ihre Schalterfunktion ist durch Konformationsänderungen
gegeben, die dem Übergang vom GDP zum GTP gebundenen Zustand folgen (Abb 1.1). Die
Kristallstrukturen von Gαi (Coleman et al., 1994), Transducin (Noel et al., 1993), FtsY
(Montoya et al., 1997), EF-Tu (LaCour et al., 1985; Berchtold et al., 1993), EF-G
(Czworkowski et al., 1994), Ras (Pai et al., 1989; Milburn et al., 1990), Ran (Scheffzek et al.,
1995), Rho (Wei et al., 1997; Ihara et al., 1998), hGBP1 (Prakash et al., 2000) und Dynamin
(Niemann et al., 2001) konnten zeigen, dass die Bindung des Nukleotids in strukturell
ähnlichen G-Domänen erfolgt. Die Bindungsaffinitäten für das Nukleotid sind sehr hoch und
liegen meist in einem Bereich von 107 – 1011 M-1 (Bourne et al., 1991).
EINLEITUNG _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 3
1.2 Die Ras-Superfamilie
Ras wurde 1979 als virales Onkogenprodukt des rat sarcoma Virus entdeckt (Chien et al.,
1979; Shih et al., 1979). Es ist an der Kontrolle von Wachstum und Differenzierung normaler
und transformierter Zellen beteiligt (Wiesmüller & Wittinghofer, 1993; Macara et al., 1996)
und ist in etwa 30% aller menschlichen Tumore mutiert (Grunicke et al., 1995). Folge der
Mutationen ist häufig, dass onkogene Ras-Proteine konstitutiv im aktiven, GTP-gebundenen
Zustand, vorliegen, da sowohl die intrinsische als auch die GAP-stimulierte GTP
Hydrolysereaktion beeinträchtigt sind (Chung et al., 1993; Bos et al., 1989; Neri et al., 1988;
Seeburg et al., 1984).
Das Ras-Protein ist der Prototyp der Ras-Superfamilie der kleinen GTPasen, die auf der Basis
von Sequenzähnlichkeiten in neun weitere Familien unterteilt werden kann (Tab. 1-1 Die Ras-
Superfamilie):
1. Ras-Proteine (rat sarcoma) regulieren Apoptose, Proliferation und Differenzierung
eukaryotischer Zellen (Vojtek & Der, 1998)
2. Rho-Proteine (ras homologous) sind für die Reorganisation des Zytoskeletts, die
Kontrolle des Zellwachstums und die Regulation der Genexpression verantwortlich
(Mackay & Hall, 1998; Sander & Collard, 1999)
3. Rab-Proteine (ras like proteins from brain) regulieren den Vesikeltransport
(Schimmoller et al., 1998; Somsel & Wandinger-Ness, 2000)
4. Arf-Proteine (ADP-ribosylation factor) steuern die Bildung von Vesikeln, ihren
Transport von und zum Endoplasmatischen Retikulum sowie zum Golgi-Apparat
(Jackson & Casanova, 2000; Moss & Vaughan, 1998)
Abb. 1.1: Die molekulare Schalterfunktion kleiner regulatorischer GTPasen. Die intrinsischen Funktionen, die GTP-Hydrolyse und die Nukleotiddissoziation, der kleinen GTPasen sind langsam, so dass sie regulatorische Proteine benötigen, die diese Prozesse beschleunigen. Der Nukleotidaustausch und die damit verbundene Aktivierung der GTPase kann durch Guaninnukleotidaustauschfaktoren (GEFs) erheblich beschleunigt werden. Gleiches gilt für die Beschleunigung der GTP-Hydrolyse durch GTPase-aktivierende Proteine (GAPs), die dadurch den molekularen Schalter wieder inaktivieren.
EINLEITUNG _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 4
5. Ran-Proteine (ras related nuclear transport) sind an der Regulation des
Kerntransports beteiligt (Moore, 1998)
6. Rad-Proteine (Ras-associated with diabetes) sind wahrscheinlich an der
Reorganisation des Zytoskeletts beteiligt (Bilan et al., 1998; Pan et al., 2000)
7. Rheb-Proteine (ras homolog enriched in brain) scheinen Antagonisten des Ras-
Signalwegs zu sein (Clark et al., 1997; Yee & Worley, 1997)
8. Rit-Proteine (ras-like expressed in many tissues) sind vermutlich an der Calcium-
vermittelten Signaltransduktion beteiligt (Lee et al., 1996)
9. Rag-Proteine (ras related GTP-binding proteins) sind im Ran-RCC1-Signalweg
involviert (Nakashima et al., 1996)
Ras Rho Rab Arf Rad Ran Rheb Rit RagH-Ras RhoA Rab1A Arf1 Rad Ran Rheb Rit RagAK-Ras RhoB Rab1B Arf2 Gem Rin RagBN-Ras RhoC Rab2 Arf3 Rem1 Ric Gtr1R-Ras Rac1 Rab3A Arf4 Rem2 Gtr2M-Ras Rac1b Rab3B Arf5 KirTC21 Rac2 Rab4 Arf6Rap1A Rac3 Rab5A Arl1Rap1B RhoG Rab5B Arl2Rap2A Cdc42 Rab6 Arl3Rap2B Rif Rab7 Arl4RalA TCL Rab8 Arl5RalB Wrch1 Rab9 Arl6dexRas Chp Rab10 Arl7Rhes RhoD Rab11
TC10Rnd1Rnd2Rnd3TTFMiro1Miro2RhoBTB1RhoBTB2RhoBTB3
Das zentrale Strukturmotiv dieser 18 bis 30 kD großen Proteine ist die sogenannte G-
Domäne, die die charakteristischen Funktionen, Nukleotidbindung und Hydrolyse, ausführt.
Diese Kerndomäne besitzt eine konservierte Gesamtstruktur, die aus einem zentralen sechs-
strängigen β-Faltblatt und fünf α-Helices besteht. 10 Schleifenregionen verknüpfen diese
Sekundärstrukturelemente miteinander. Fünf dieser Schleifen (G1 – G5, Abb. 1.2) sind für die
Spezifität und die hoch affine Bindung des Nukleotids verantwortlich (John et al., 1990;
Bourne et al., 1991; Schmidt et al., 1996; Via et al., 2000).
Tab. 1.1: Die Ras-Superfamilie der kleinen GTPasen. Die Ras-Superfamilie kann anhand von der Primärsequenz und funktionellen Gesichtspunkten in neun Familien unterteilt werden. Diese lassen sich erneut anhand vergleichbarer Kriterien in Unterfamilien aufteilen.
EINLEITUNG _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Das G1 oder L1-Motiv, das auch als Phosphat bindende Schleife oder P-Loop bezeichnet
wird, mit der Konsensussequenz 10GxxxxGK(S/T)17 hat den größten Beitrag zu der hoch
affinen Bindung des Nukleotids (Saraste et al., 1990). Es bindet die Phosphatgruppen des
Nukleotids und enthält drei wichtige Aminosäuren: Kodon 12, das für die Aminosäure Gly12
kodiert, ist das am häufigsten mutierte Ras-Kodon in menschlichen Tumoren (Barbacid,
1987; Bos, 1989); Lys16 bildet eine Ring-förmige Struktur, die das β-Phosphat umschließt
und so eine positiv geladene Umgebung schafft; Ser17 koordiniert sowohl das Mg2+-Ion als
auch das β-Phosphat. Die Substitution von Ser17 zu Asparagin (S17N) führt zu einem
dominant negativen Verhalten von Ras, bedingt durch einen drastischen Verlust an
Nukleotidbindungsaffinität und einer damit verbundenen höheren Affinität für
Guaninnukleotid Austauschfaktoren (Farnsworth and Feig., 1991; John et al., 1993; Feig,
1999). Das G2 oder L2 ist ein integraler Bestandteil der Effektor-bindenden Schleife und
enthält das invariante Thr35. Diese Aminosäure ist absolut notwendig für die funktionelle
Dynamik der Switch I Region und folglich wichtig für die Effektorbindung (Spörner et al.,
2001). Die G3 oder L4-Schleife enthalten das 57DxxG60 Motiv. Die Seitenkette von Asp57 ist
dabei an der Koordination des Mg2+-Ions beteiligt, während Gly60 durch eine
Wasserstoffbrückenbindung das γ-Phosphat bindet. Gly60 ist ein wichtiger Sensor für die
Konformationsänderungen der Switch II Region (Wittinghofer et al., 1993). Die G4 und G5
Schleifen sind für die Erkennung der Guaninbase verantwortlich. Wichtig für die hohe
Spezifität der Guanin-Bindung ist das 116NKxD119-Motiv (G4-Schleife), welches mit der Base
interagiert. Eine Mutation von Asp119 in Ras führt, wie gezeigt werden konnte, zu einer
Änderung der Nukleotidspezifität von Guanosin zu Xanthosin (Schmidt et al., 1996; Cool et
al., 1999). Das 145SAK147-Motiv (G5-Schleife) enthält Ser145, das wiederum Asp119
stabilisiert. Ala146 bindet an die Guaninbase und stellt eine weitere Determinante für die
Eigenschaft von Ras dar, Guaninnukleotide zu binden. Die G1, G2 und G3 Sequenzmotive
sind strukturell um das γ-Phosphat lokalisiert und entsprechen dem Reaktionszentrum des
universellen Schalters (Bourne et al., 1991; Wittinghofer & Pai, 1991; Sprang, 1997a).
Neben den für die Nukleotidbindung wichtigen Sequenzmotiven existiert bei den meisten
GTPasen der Ras-Superfamilie eine weitere Konsensussequenz, die am C-Terminus der
Proteine lokalisiert ist, die sogenannte CaaX-Box (C = Cystein, a = aliphatische Aminosäure,
X = beliebige Aminosäure). Diese Signalsequenz dient der posttranslationalen Modifikation
der GTPase durch hydrophobe Gruppen wie z.B. Farnesyl- oder Geranylgeranyl-Reste.
Eine solche Lipidmodifikation ist für die Funktion der GTPasen essentiell und führt zu einer
Lokalisierung in der Zellmembran (Brown & Goldstein, 1993). Die letze Aminosäure der
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_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 6
CaaX-Box bestimmt welche Art der Modifikation erfolgt: bei Serin oder Methionin erfolgt
die Modifikation durch eine Farnesyltransferase, bei Leucin hingegen durch eine
Geranylgeranyltransferase (Goldstein et al., 1991; Marshall, 1993; Moores et al., 1991; Reiss
et al., 1991; Seabra et al., 1991). Nachdem die Thioetherbildung durch die Transferase erfolgt
ist, werden die letzten drei Aminosäuren durch eine Endopeptidase abgespalten und die
entstehende Carboxylgruppe durch eine Methyltransferase methyliert (Gutierrez et al., 1989;
Hancock et al., 1991a). Eine weitere Palmitoylierung an C-terminal liegenden Cysteinen
spielt bei der Stabilität der Membranassoziation eine große Rolle und ist aufgrund des
Thioesters reversibel (Hancock et al., 1989; Hancock et al., 1990; Choy et al., 1999; Magee
& Marshall, 1999; Völkert et al., 2001; Rocks et al., 2005).
Abb. 1.2: Strukturelle Übersicht über das Ras-Protein. A Sekundärstrukturelemente sind als Zylinder (α-Helices) und Pfeile (β-Faltblattstränge) dargestellt. Die Guaninnukleotidbindungstasche wird durch fünf Schleifenregionen ausgebildet (G1-G5; gelbe Kästchen), die in allen GTPasen konserviert sind. Die CaaX-Box, die der Isoprenylierung dient, ist am C-Terminus hervorgehoben. B Die Strukturen des C-terminal verkürzten Ras·GDP ist auf der linken Seite (Pai et al., 1990), während auf der rechten Seite Ras·GppNHp (Milburn et al., 1990) dargestellt ist. Der P-Loop ist in blau, der Switch I in rot, der Switch II in grün, das Nukleotid in schwarz und das Mg2+-Ion in zyan hervorgehoben.
EINLEITUNG _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 7
1.3 Die GTPasen der Rho-Familie
Bisher sind 24 verschiedene Proteine bekannt, die der Rho-Familie kleiner regulatorischer
GTPasen zugeordnet werden und aufgrund ihrer Primärsequenzhomologien in sieben
Untergruppen unterteilt werden können (Bishop & Hall, 2000; Ellis & Mellor, 2000; Vignal
et al., 2000; Wherlock & Mellor, 2002). RhoA (ras homologous A), Rac1 (ras-related C3
botulinum toxin substrate 1) und Cdc42 (cell division cycle 42) gehören dabei zu den bisher
am Besten untersuchten Proteinen der Rho-Familie (Hall, 1998).
Rho Rac Cdc42 RhoD TTF Rnd Miro RhoBTBRhoA Rac1 Cdc42 RhoD TTF Rnd1 Miro1 RhoBTB1RhoB Rac1b TCL Rif Rnd2 Miro2 RhoBTB2RhoC Rac2 Wrch1 Rnd3 RhoBTB3
Rac3 ChpRhoG TC10
Im Gegensatz zu den Proto-Onkogenen der Ras-Familie, die durch Punktmutationen
konstitutiv aktiviert werden können und so zur Tumorentstehung und Progression beitragen,
hat man bisher nur in einem Fall (RhoH) mutierte Rho-Proteine in Tumoren entdeckt
(Preudhomme et al., 2000). Dennoch hat diese Proteinfamilie eine zentrale Rolle bei der
Tumorprogression und Metastasierung von Zellen (Price & Collard, 2001; Schmitz et al.,
2000). Diese Eigenschaft beruht auf einem erhöhten Expressionslevel oder der veränderten
Aktivität aktivierender Regulatorproteine (Sahai & Marshall, 2002; Boettner & van Aelst,
2002). Die Signaltransduktion durch RhoGTPasen und die damit verbundenen biologischen
Funktionen waren in den letzten Jahren Gegenstand intensiver Forschung. Ihre Rolle bei der
Tumorentstehung und –progression ist allerdings noch wenig untersucht. Abbildung 1.3 zeigt
eine Übersicht über die biologischen Prozesse in denen RhoGTPasen involviert sind, zu
denen Morphogenese, Phagozytose, Pinozytose, Zytokinese, Axonwachstum, Zell-Zell und
Zell-Matrix Adhäsion, sowie Kontrolle der Zellpolarität, des Zellzyklus und der
Zellbewegung gehören (Kaibuchi et al., 1999; Chimini & Chavier, 2000; Luo, 2000; van
Aelst & D’Souza-Schorey, 1997; Daub et al., 2001; Etienne-Manneville & Hall, 2001;
Raftopoulou & Hall, 2004). Die Zellbewegung ist im Besonderen für die
Embryonalentwicklung, Immunantwort, Wundheilung, Tumorbildung und Metastasierung
von Bedeutung (Horwitz & Parsons, 1999). Die Aktivierung der GTPasen durch
extrazelluläre Signale (Abb. 1.3), wie Wachstumsfaktoren und Zytokine, führt vorwiegend zu
Tab. 1.2: Die Rho-Familie. Die hier dargestellte Unterteilung der Rho-Familie in sieben Gruppen erfolgte auf der Basis von Primärsequenzhomologien und funktionellen Eigenschaften der einzelnen Proteine.
EINLEITUNG _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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einer Reorganisation des Aktinzytoskeletts. Die unterschiedliche subzelluläre Lokalisation der
Rho-Proteine geht einher mit ihren biologischen Funktionen. RhoGTPasen sind sowohl an der
Regulation der Aktinpolymerisation an Membranen, als auch an der Kontrolle der
Genexpression über Signalkaskaden von der Plasmamembran in den Kern beteiligt (Mackay
& Hall, 1998). So reguliert RhoA z.B. die Ausbildung von Aktomyosinfasern, sogenannten
Stressfasern, die eine wichtige Rolle bei der Zellkontraktion spielen, andererseits aber auch
die Entstehung von fokalen Adhäsionen, die für die Zell-Matrix Adhäsion essentiell sind.
Rac1 ist für die Ausbildung von netzartigen Membranfortsätzen verantwortlich, die auch als
Lamellipodien bezeichnet werden. Eine Aktivierung von Cdc42 hingegen führt über die
Polymerisation von Aktin zu langen fingerähnlichen Membranausstülpungen, sogenannten
Filopodien (Hall, 1998).
1.4 Regulatoren und Effektoren der RhoGTPasen
Die Funktion der RhoGTPasen als molekulare Schalterproteine hängt, wie bei den anderen
Mitgliedern der Ras-Superfamilie, von ihrem Nukleotid-gebundenen Zustand ab. Fast alle
GTPasen der Ras-Familie durchlaufen einen Regulationszyklus mit einem inaktiven, GDP-
gebundenem Zustand und einem aktiven, GTP-gebundenem Zustand, in dem die
Signalweiterleitung durch Bindung von Effektorproteinen möglich ist. Die intrinsischen
Prozesse, die Hydrolyse von GTP bzw. der Austausch von GDP zu GTP, sind sehr langsam
Abb. 1.3: Regulation der Morphogenese, Adhäsion und Migration durch Rho-GTPasen. Die Rho-Proteine sind über ihre C-terminale Modifizierung an der Plasmamembran verankert. Die Aktivierung erfolgt aufgrund eines extrazellulären Signals. In ihrer aktiven GTP-gebundenen Form wird das Signal an viele verschiedene Effektorproteine weitergeleitet, die ihrerseits ein Spektrum biologischer Prozesse kontrollieren. Transiente Transfektionexperimente haben gezeigt, dass die GTPasen auch untereinander in Wechselwirkung treten können.
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und bedürfen somit zusätzlicher Regulatorproteine, die den Nukleotid-gebundenen Zustand
der GTPase strikt kontrollieren (Abb. 1.4).
1. Guaninnukleotidaustauschfaktoren (guanine nucleotide exchange factors, GEFs;
Zheng, 2001; Cerione & Zheng, 1996; Schmidt & Hall, 2002)
2. Guanosintriphosphatase-aktivierende Proteine (GTPase activating proteins, GAPs;
Lamarche & Hall, 1994)
3. Guaninnukleotiddissoziationsinhibitoren (guanine nucleotide dissociation inhibitors,
GDIs; Olofsson, 1999)
Guaninnukleotidaustauschfaktoren (GEFs)
Guaninnukleotidaustauschfaktoren aktivieren die GTPase, indem sie die langsame intrinsische
Dissoziation des GDP beschleunigen (Abb. 1.4). Für das Ras-Protein existiert ein Modell
(Lenzen et al., 1998), welches einen ternären Komplex aus Ras·GDP und GEF postuliert. In
diesem Komplex ändert sich die Konformation der Switch-Regionen der GTPase durch die
GEF-Bindung und führt zu einer Verringerung der Nukleotidaffinität. Nach der
Abb. 1.4: Schematische Übersicht der Regulation der RhoGTPasen. Die Rho-Proteine zirkulieren zwischen dem aktiven, GTP-gebundenem und dem inaktiven, GDP-gebundenem Zustand. Dabei wird der Nukleotid-gebundene Zustand der GTPase an der Membran strikt durch GAPs und GEFs kontrolliert. Durch die Translokation von der Membran ins Zytoplasma verhindern GDI-Proteine die Aktivierung der GTPasen durch GEFs, indem sie die RhoGTPasen vom Ort ihrer Aktivierung und Wirkung entfernen. In der aktiven Form übertragen die Rho-Proteine das empfangene Signal auf diverse Effektormoleküle, die das Signal amplifizieren und propagieren. Die Zellantwort ist abhängig von der Art und der Lokalisierung des jeweils aktivierten Effektors.
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Nukleotiddissoziation stabilisiert das GEF den nukleotidfreien Zustand und ermöglicht so die
nachfolgende Bindung von GTP, das in der Zelle in höherer Konzentration als GDP vorliegt.
Durch die GTP-Bindung wird der GTPase·GEF Komplex wieder aufgelöst. Die Nukleotide
GDP und GTP konkurrieren also kompetitiv um die Bindung, wobei das Gleichgewicht
konzentrationsabhängig weit in Richtung GTP-Bindung verschoben ist.
Die Guaninnukleotidaustauschfaktoren für Rho-Proteine gehören fast ausnahmslos zur
Familie der Dbl-homologen Proteine, mit zurzeit mehr als 69 Mitgliedern (Schmidt & Hall,
2002). RhoGEFs werden in den meisten Fällen entweder durch extrazelluläre Signale aktiviert
oder zur Zellmembran rekrutiert, wo sie dann spezifisch den Austausch von GDP zu GTP
katalysieren (Vetter & Wittinghofer, 2001; Zheng, 2001; Schmidt & Hall, 2002; Moon &
Zheng, 2003; Erickson & Cerione, 2004). Charakteristikum der RhoGEFs ist die Dbl-
homologe Domäne (DH), die für die GEF-Aktivität verantwortlich ist (Hart et al., 1994). Der
DH-Domäne folgt eine Pleckstrin-homologe Domäne (PH), die an Inositol-Phospholipide
binden kann und folglich als eine Membran-bindende Domäne angesehen wird (Cerione &
Zheng, 1996; Irvine, 1998). Den PH-Domänen von Trio und SOS wurde eine direkte
regulierende Wirkung auf die DH-Aktivität zugeschrieben. Dies zeigte die Kristallstruktur
von SOS, die eine direkte Interaktion der DH- und der PH-Domäne bestätigte (Liu et al.,
1998; Soisson et al., 1998). Die dreidimensionale Struktur von Tiam1 im Komplex mit Rac1
hingegen zeigte keine Interaktion der PH- mit der DH-Domäne (Worthylake et al., 2000).
Zusätzliche Domänen der jeweiligen GEFs kontrollieren möglicherweise die Variabilität der
intrazellulären Lokalisation (Cerione & Zheng, 1996). Ein weiterer Aspekt in diesem
Zusammenhang könnte die Modulation der GEF-Funktion sein. Es wurde schon vielfach
gezeigt, dass die zusätzlichen Domänen auch regulatorisch auf die GEF-Aktivität einwirken
können (Schmidt & Hall, 2002).
Ein weiterer interessanter Aspekt der RhoGEFs ist die Tatsache, dass viele dieser Proteine
protoonkogene Eigenschaften besitzen (Eva & Aaronson, 1985; Katzav et al., 1989; Miki et
al., 1993; Chan et al., 1994; Horii et al., 1994; Toksoz & Williams, 1994; Whitehead et al.,
1995a,b; Chan et al., 1996; Glaven et al., 1996; Chuang et al., 1995; Habets et al., 1994;
Zheng et al., 1995; Westwick et al., 1998). So ist beispielsweise Bcr an der Entstehung von
Leukämie und Tiam1 an der Tumorinvasion und Metastasierung beteiligt. Eine erhöhte
Genexpression oder eine veränderte subzelluläre Lokalisierung kann zu Fehlregulation und
unkontrollierter Aktivierung der Rho-Proteine führen. Eine der möglichen Folgen ist eine
erhöhte Zellproliferation (Stam & Collard, 1999). Dies wäre ebenfalls eine Erklärung für die
erhöhte, abnormale Aktivität von RhoGTPasen in manchen metastasierenden Tumoren (Clark
et al., 2000; del Peso et al., 1997).
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Guanosintriphosphatase-aktivierende Proteine (GAPs)
Von den Guanosintriphosphatase-aktivierenden Proteinen sind zurzeit etwa 20 Vertreter
bekannt. RhoGAPs können die sehr langsame intrinsische Hydrolyse der RhoGTPasen zur
Beendigung der Signaltransduktion des aktiven GTP-gebundenen Zustands bis zu 105-fach
beschleunigen (Wittinghofer et al., 1997; Graham et al., 1999).
Über den Mechanismus der GAP-katalysierten GTP-Hydrolyse wurde lange spekuliert.
Anhand der Kristallstruktur des Ras·p120GAP-Komplexes in Anwesenheit von
Aluminiumfluorid (Scheffzek et al., 1997a) und durch die biochemische Charakterisierung
des Einflusses verschiedener Aminosäuren auf die GAP-Katalyse (Ahmadian et al., 1997),
konnte gezeigt werden, dass GAP-Proteine aktiv an der GTP-Hydrolyse beteiligt sind.
Aluminiumfluorid bindet in Gegenwart von GDP an der Position des γ-Phosphats und imitiert
so, aufgrund seiner trigonal bipyramidalen Koordination, den Übergangszustand der GTP-
Hydrolysereaktion (Mittal et al., 1996). Für die Stabilisierung dieses Übergangszustands ist
sowohl ein konserviertes Glutamin (Q61 in Ras, Rac und Cdc42 bzw. Q63 in Rho), als auch
auf Seiten des GAP-Proteins ein konserviertes Arginin von entscheidender Bedeutung. Dieser
sogenannte Arginin-Finger ist in allen bekannten Ras- und Rho-GAPs konserviert (Ahmadian
et al., 1997; Scheffzek et al., 1998) und neutralisiert die während des Übergangszustands
entstehende negative Ladung, so dass der in-line Angriff des nukleophilen Wassermoleküls
erfolgen kann. Diese Einblicke in den Mechanismus der GAP-katalysierten GTP-
Hydrolysereaktion lieferten gleichzeitig die Erklärung für die im ras-Gen häufig
vorkommenden onkogenen Mutationen, Gly12 und Q61. Fehlt die Glutaminseitenkette, so
erfolgt keine Stabilisierung des für den nukleophilen Angriff auf das γ-Phosphat
verantwortlichen Wassermoleküls. Eine Substitution des Glycins durch eine andere
Aminosäure verwehrt dem Arginin-Finger sterisch den Zugang zum aktiven Zentrum
(Scheffzek et al., 1997). Ras ist dadurch in einem konstitutiv aktiven, GTP-gebundenem
Zustand und kann auch durch GAP-Proteine nicht mehr inaktiviert werden. Vergleichbare
Mechanismen wurden ebenfalls für die GTP-Hydrolyse der RhoGTPasen nachgewiesen
(Hoffman et al., 1998; Rittinger et al., 1997).
Guaninnukleotiddissoziationsinhibitoren (GDIs)
In stimulierten Zellen sind die RhoGTPasen vornehmlich an der Zellmembran lokalisiert, wo
sie ihre biologische Funktion ausüben. Neben dem schon beschriebenen GTPase Zyklus
(Abb. 1.1) gibt es bei den RhoGTPasen einen weiteren Zyklus, der dem Transfer zwischen
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Plasmamembran und Zytosol entspricht (Abb. 1.4) und durch Guaninnukleotid-
dissoziationsinhibitoren gewährleistet wird (Olofsson, 1999). In ruhenden Zellen können
GDI-Proteine die isoprenylierten RhoGTPasen aus der Zellmembran extrahieren und
erzeugen so eine zytosolische Fraktion. Drei GDIs sind zurzeit für die Rho-Familie
beschrieben: GDI-1 (auch GDIα; ubiquitäre Expression; 23.4 kDa), GDI-2 (auch GDIβ, D4-
GDI oder Ly-GDI; ausschließlich im hämatopoetischen System exprimiert; 25,3 kDa) und
GDI-3 (auch RhoGDIγ; Expression in Gehirn und Pankreas; 25,3 kDa) (Olofsson, 1999). Die
Bindung der RhoGDIs an die RhoGTPasen erfolgt nur mit hoher, subnanomolarer Affinität,
wenn diese isoprenyliert vorliegen (Gosser et al., 1997; Nomanbhoy et al., 1999, Newcombe
et al., 1999).
Insgesamt sind bisher sieben GDI Strukturen bekannt, von denen vier im Komplex mit RhoA,
Cdc42, Rac1 und Rac2 gelöst wurden (Keep et al., 1997; Lian et al., 2000; Longenecker et
al., 1999; Hoffman et al., 2000; Scheffzek et al., 2000; Grizot et al., 2001). Demnach zeigen
GDI-Proteine eine kleine N-terminale Domäne mit einem Helix-Loop-Helix-Motiv (~3 kDa),
der eine Immunglobulin-ähnliche Domäne folgt (16 kDa).
Im vorgeschlagenen regulatorischen Modell binden die GDI-Proteine zunächst an die Switch-
Regionen der GTPase und extrahieren dann in einem zweiten Schritt die Isoprenylgruppe der
RhoGTPasen aus der Zellmembran, durch eine Insertion dieser Gruppe in eine hydrophobe
Tasche des GDI (Hoffman et al., 2000). Hierdurch werden die Rho-Proteine von der
Plasmamembran entfernt und eine Aktivierung durch die Membran-assoziierten GEFs
unmöglich. Diese Translokation ins Zytoplasma der Zelle ist durch eine Interaktion des
GTPase·GDI-Komplexes mit den Proteinen der ERM (Ezrin/Radixin/Moesin)-Familie
reversibel (Abb. 1.4).
Effektorproteine
Die Signalweiterleitung der RhoGTPasen erfolgt im aktiven, GTP-gebundenen Zustand,
durch die Wechselwirkung mit Effektorproteinen (Bishop & Hall, 2000; van Aelst &
D’Souza-Schorey, 1997; Schmitz et al., 2000). Aufgrund der Vielfalt wichtiger zellulärer
Prozesse, an denen die Rho-Proteine beteiligt sind, ist es nicht überraschend, dass intensiv an
der Identifikation und Charakterisierung dieser Ziel- und Effektorproteine gearbeitet wurde,
um die Signalübertragung zwischen GTPase und Effektor zu verstehen. Mehr als 30
potentielle Effektoren für Rho, Rac und Cdc42 sind bis heute bekannt und wurden primär
mittels Two-Hybrid-System und äffinitätschromatographischer Verfahren identifiziert (Bishop
& Hall, 2000; van Aelst & D’Souza-Schorey, 1997). Eine wichtige Eigenschaft von
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Effektoren ist ihre Fähigkeit zwischen dem GDP- und dem GTP-gebundenen Zustand der
GTPase unterscheiden zu können. Die Aktivierung des Effektormoleküls erfolgt durch die
Interaktion mit der aktiven, GTP-gebundenen GTPase, so dass anschließend das Signal an
nachgeschaltete Moleküle weitergegeben werden kann.
Ein Vergleich der Kristallstrukturen von RhoA·GDP und RhoAG14V·GTPγS zeigt
Konformationsänderungen hauptsächlich in der Switch I-Region (Aminosäuren Asp28 –
Thr37) und der Switch II-Region (Aminosäuren Ala61 – Pro71) (Wei et al., 1997; Ihara et al.,
1998). Mutationsstudien haben gezeigt, dass Effektorproteine nicht nur zwischen dem aktiven
beziehungsweise inaktiven Zustand der GTPase unterscheiden, sondern auch zusätzlich
spezifische Regionen außerhalb der Switch-Regionen erkennen. Hier sind insbesondere die
β2/β3-Region und die Insert-Helix (Aminosäuren 125 – 137) zu nennen (Maesaki et al.,
1999; Fujisawa et al., 1998; Lamarche et al., 1996; Joneson et al., 1996).
Die Rho-Effektoren werden zurzeit anhand ihrer Rho-bindenden Domänen (RBD) in drei
Klassen unterteilt. Die bisher als Rho-Effektoren identifizierten Proteine (Citron-Kinase, rho-
associated coiled coil kinase (ROCK), mDia, Rhotekin, Rhophilin und PKN) besitzen nur
geringe Homologie in ihrer Aminosäureprimärsequenz. Die RBD der drei Effektorproteine
Rhotekin, Rhophilin und PKN wird als Klasse I-Motiv, die von ROCK als Klasse II- und die
von Citron als Klasse III-Motiv bezeichnet (Reid et al., 1996).
Für p140mDia, das zur Familie der Formin-ähnlichen Proteine gehört, ist die Art der Rho-
selektiven Bindung Gegenstand intensiver Forschung. Da die Sequenz von mDia aber keine
Homologie zu der eines anderen Effektors aufweist (Watanabe et al., 1997), handelt es sich
bei dieser RBD vermutlich um eine eigene Klasse.
Die Kristallstruktur des RhoA·PKN-Komplexes zeigt für die RBD von PKN eine antiparallele
coiled-coil-Faltung, die auch als ACC-Finger bezeichnet wird (Maesaki et al., 1999). Sie
besteht aus zwei langen und einer kurzen Helix. Der ACC-Finger von PKN interagiert mit der
Switch I-Region, mit den β-Faltblattsträngen β2 und β3, sowie mit der C-terminalen α5-
Helix. Mit der extrahelikalen Domäne konnte allerdings keine Interaktion gezeigt werden. Die
für die Spezifität wichtigen Aminosäurereste liegen in den Interaktionsregionen und
unterscheiden sich von denen, die aus den verschiedenen Cdc42-Effektorkomplexen bekannt
sind. Zusätzlich wurde für den RhoA·PKN-Komplex eine zweite Kontaktfläche gezeigt, die
die β3 und die Switch II-Region umfasst. Die erste Kontaktfläche zeichnet sich durch
elektrostatische Wechselwirkungen aus, während die zweite hydrophober Natur ist. Ob RhoA
tatsächlich über zwei Bindungsstellen verfügt ist derzeit unklar, obwohl in Lösung eine GTP-
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abhängige 1:2-Stöchiometrie für den RhoA·PKN-Komplex gefunden wurde (Maesaki et al.,
1999).
Aus Sequenzvergleichen wurde ursprünglich auch für ROCK vermutet, dass es ein ACC-
Finger-Motiv enthält. Die Struktur des RhoA·ROCK-RBD-Komplexes zeigte hingegen, das
ROCK zwar auch in Form einer coiled-coil-Struktur vorliegt, aber keinen ACC-Finger besitzt
(Ihara et al., 2000; Dvorsky et al., 2004).
Im Gegensatz zu den RhoA-Effektoren enthalten viele Effektorproteine von Rac und Cdc42
eine konservierte GTPase-bindende Konsensussequenz, das sogenannte CRIB (Cdc42/Rac-
interactive binding)-Motiv (Burbelo et al., 1995). Anhand von NMR-Studien an Cdc42 im
Komplex mit αPAK, WASP beziehungsweise ACK (Mott et al., 1999; Abdul-Manan et al.,
1999; Morreale et al., 2000) konnte gezeigt werden, dass alle G-Protein-bindenden Domänen
(GBD) der drei Effektoren an dieselben Regionen von Cdc42 binden. Dies sind die Switch I-
und die Switch II-Region, die Helices α1 und α5, sowie die β-Faltblattstränge β2 und β3. Der
N-Terminus, an dem das CRIB-Motiv lokalisiert ist, zeigt die größte Homologie in der
Sequenz der Effektorproteine. Alle drei Strukturen zeigen, dass die Bindung an Cdc42 durch
Ausbildung eines intermolekularen β-Faltblatts erfolgt. Die C-Termini der GBDs der drei
Effektorproteine sind nicht homolog und zeigen Unterschiede in der Art der Bindung. Die Art
und Weise der Interaktion in Form eines intermolekularen β-Faltblatts ähnelt eher der
Interaktion der Ras-RalGDS und Rap1A-Raf Komplexe (Huang et al., 1998; Nassar et al.,
1995) als der des Rho·PKN-Komplexes (Maesaki et al., 1999).
Bakterielle Toxine
Neben den oben angesprochenen zellulären Regulatoren der Rho-Proteine sind diese auch
Angriffsziel bakterieller Toxine. Diese wirken entweder als GEF- oder GAP-ähnliche
Regulatoren oder modifizieren die Rho-GTPasen kovalent durch ADP-Ribosylierung,
Glykosylierung oder Desaminierung und aktivieren oder inaktivieren diese dadurch langfristig
(Hardt et al., 1998; Goehring et al., 1999; Aktories et al., 2000; Barbieri et al., 2002; Boquet
& Lemichez, 2003). Um der Phagozytose durch Makrophagen zu entgehen, injizieren die
Bakterien ihre pathogenen Faktoren in die eukaryotische Zelle und beeinflussen so die
zelluläre Signaltransduktion, wobei hier vor allem die Dynamik der Aktinpolymerisation von
Bedeutung ist. Hierdurch steuern sie ihre eigene Aufnahme in die Zelle und entgehen so der
Immunantwort des Wirtsorganismus. Die Kristallstruktur des bakteriellen SopE-GEFs bewies,
dass dieses GEF mechanistisch vergleichbar zu den zellulären RhoGEFs ist, aber weder
sequentielle noch strukturelle Homologien zu diesen aufweist (Buchwald et al., 2002).
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1.5 Die Signaltransduktion der Plexin-Transmembranrezeptoren
Auswachsende Axone exprimieren Rezeptoren für Botenmoleküle, die von benachbarten
Zellen präsentiert werden. Die Aktivierung dieser Rezeptoren und die darauffolgende
Signalweiterleitung determinieren, ob ein Axon einem Ziel entgegenwächst oder sich von
diesem entfernt (Tessier-Lavinge & Goodman, 1996). In diesem System des Axonwachstums
spielen die Semaphorine und ihre Rezeptoren die Neuropiline und Plexine, neben anderen,
eine bedeutende Rolle. Allerdings ist ihre Funktion nicht nur auf die neuronale Entwicklung
beschränkt, sondern in vielen anderen Bereichen von ebenso großer Bedeutung.
Die Semaphorin-Familie umfasst etwa 20 Mitglieder, die sowohl löslich als auch Membran-
gebunden vorliegen können. Ihnen gemeinsam ist eine 55 kDa große Domäne, die als ‚Sema’-
Domäne bezeichnet wird. Viele verschiedene neuronale Zellen, wie z.B. sympathische,
Motor-, cerebellare, hippocampale, olfaktorische und corticospinale Neurone, reagieren auf
Semaphorin-Signale (Chisholm & Tessier-Lavigne, 1999).
Repulsive Signale, ausgelöst durch Semaphorine, werden durch zwei Rezeptorfamilien
weitergeleitet: die Neuropiline, NP1 und NP2, und die Plexine, die in vier Familien unterteilt
werden können, PlexinA1-4, PlexinB1-3, PlexinC1 und PlexinD1 (Tamagnone & Comoglio,
2000). Viele Semaphorine binden direkt an die extrazelluläre Domäne der Plexine und
aktivieren so die zytoplasmatischen Signalkaskaden. Die gut charakterisierte Familie der
Klasse 3 Semaphorine (Sema3A-F) benötigt hingegen die Neuropiline als Korezeptoren für
die Plexin-Signaltransduktion (Raper, 2000; Tamagnone et al., 1999; Winberg et al., 1998;
Cheng et al., 2001; Comeau et al., 1998; Swiercz et al., 2002).
Plexine sind Transmembranrezeptoren, die interessanterweise an ihrem N-Terminus selbst
eine Sema-Domäne besitzen, ähnlich zu der ihrer Semaphorin-Liganden. Zusätzlich enthalten
sie ein Cystein-reiches Motiv in der extrazellulären Region und eine konservierte Plexin-
spezifische Sex-Plexin-Domäne in ihrem zytoplasmatischen Teil (Tamagnone & Comoglio,
2000). Die extrazelluläre Sema-Domäne der Plexine übt eine autoinhibitorische Funktion auf
den Gesamtrezeptor aus, die dann durch Ligandenbindung aufgehoben wird (Takahashi &
Strittmatter, 2001).
Vergleichbar zu vielen anderen Rezeptoren werden auch die Plexine nach erfolgter
Ligandenbindung phosphoryliert. Das offensichtliche Fehlen einer Kinasedomäne in den
Plexinen führte zu der Vermutung, dass andere Kinasen dafür verantwortlich sein müssen. Ein
erster Kandidat war Otk (off-track kinase) für den eine Interaktion mit PlexinA nachgewiesen
werden konnte (Winberg et al., 2001). Obwohl Otk zunächst als Kinase identifiziert wurde,
besitzt es, bedingt durch Substitutionen in konservierten Aminosäuren, keine Kinase-
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Aktivität, so dass es vermutlich als Adapter-Protein für andere Kinasen dienen könnte. Im
Fall von PlexinB1 konnte hingegen gezeigt werden, dass es zusammen mit dem Met-
Rezeptor, ein Rezeptor für den Hepatozyten-Wachstumsfaktor, einen Rezeptorkomplex bildet,
der für die Sema4D-Ligandenbindung verantwortlich ist. Der Met-Rezeptor besitzt eine
intrinsische Kinase-Aktivität und ist zusammen mit PlexinB1 für das invasive Wachstum von
Epithelzellen verantwortlich (Giordano et al., 2002).
Abb. 1.5: Semaphorine und ihre Rezeptoren. A Semaphorine existieren als sekretierte, Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerte und transmembrane Proteine. Die Subklassen 1 und 2 repräsentieren die Semaphorine der Invertebraten, 3-7 die der Vertebraten und V die viralen. B Plexine, Otk, Neuropiline, L1 und Met fungieren als Semaphorin Rezeptoren oder sind deren Teilkomponenten: (i) SemaVA, SemaVB, Sema7A und Klasse 4 Semaphorine interagieren direkt mit den Plexinen; (ii) in Drosophila führt das Sema1a Signal zur Axon-Repulsion über einen PlexinA·Otk-Komplex; (iii) die Klasse 3 Semaphorin Rezeptoren sind die derzeit am Besten charakterisierten und bestehen aus Neuropilin, Plexin und L1; (iv) Der Effekt von Sema4D auf das invasive Wachstum von Epithelzellen wird durch einen PlexinB1/Met-Rezeptorkomplex vermittelt. Domänen: BD, basisch; C, intrazelluläre C-terminale GAP-ähnliche Domäne; CUB, Komplement Bindung; FIII, Fibronectin Typ III; FV/FVIII, Koagulationsfaktor; GBD, GTPase-bindend; G-P, Glycin-Prolin reich; GPI, Anker; Ig, Immunoglobulin-ähnlich; MAM, ‚Meprin, A5, Mu’; MRS, Met-verwandte Sequenz; N, intrazelluläre N-terminale GAP-ähnliche Domäne; Sema, Semaphorin; SS, Signalsequenz; TK, Tyrosinkinase; Thrombospondin (modifiziert nach Pasterkamp & Kolodkin, 2003).
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Verschiedene Arbeitsgruppen haben gezeigt, dass die GTPasen der Rho-Familie an der
Signaltransduktion der Semaphorine beteiligt sind und diese physikalisch mit der
zytoplasmatischen Region der Plexine interagieren (Liu & Strittmatter, 2001). Für PlexinB1
konnte eine Bindung an Rac1·GTP gezeigt werden, während die Bindung an den Rac-Effektor
Abb. 1.6: Modelle der Semaphorin Signaltransduktion. A Sema1a Signale führen über einen PlexinA/Otk-Rezeptorkomplex. Da Otk keine intrinsische Kinaseaktivität besitzt, könnte es dazu dienen weitere Rezeptorkomponenten zu rekrutieren. MICAL-Proteine assoziieren direkt mit PlexinA und werden für den Sema1a Signalweg benötigt. Substrate der MICAL und Effektoren sind derzeit unbekannt. B Die PlexinB1 vermittelte Sema4D-induzierte Axonrepulsion erfolgt durch eine koordinierte Regulation der Rac- und Rho-GTPasen: PlexinB1 bindet Rac·GTP und inhibiert seine Bindung an PAK. Gleichzeitig wird über die GEFs PDZ-RhoGEF und LARG Rho aktiviert. Während der Regulation des invasiven Wachstums von Epithelzellen erfolgt die Sema4D-Signaltransduktion über einen PlexinB1-Met Rezeptorkomplex. Die Bindung von Sema4D an PlexinB1 führt zur Aktivierung von Met, wodurch Met, PlexinB1 und das Met-Zielprotein Gab1 phosphoryliert werden. C Der Sema3A induzierte Kollaps von Wachstumskegeln durch Bindung an Neuropilin (NP), die mit einem der vier Klasse A Plexine assoziiert vorliegen. L1 ist ebenso ein Teil des Klasse 3 Semaphorin Rezeptor Komplexes und könnte durch eine Modulation der cGMP-Level an der Semaphorin-Signaltransduktion beteiligt sein. Eine Anzahl von Tyrosinkinasen, wie Cdk5, Fes, Fyn und GSK-3, scheinen nach Ligandenbindung aktiviert zu werden und Plexine, sowie andere intrazelluläre Proteine zu phosphorylieren. Die Klasse A Plexine sind in der antagonistischen Regulation von Rnd1 und RhoD involviert. Eine Aktivierung von PlexinA reduziert die Rac Signaltransduktion via PAK und induziert Rho-abhängige Signalwege, die zu einer Aktivierung von LIM-KInase und zur Inaktivierung von Cofilin führen. Pfeile geben Interaktionen wieder. Gestrichelte Pfeile zeigen mögliche Interaktionen an; NIP, Neuropilin aktivierendes Protein; P, Phosphorylierung; ROCK, Rho-activated kinase (modifiziert nach Pasterkamp & Kolodkin, 2003).
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PAK gleichzeitig inhibiert wird (Driessens et al., 2001; Hu et al., 2001; Vikis et al., 2002).
Eine Bindung von Rac an die PlexinA-Proteine konnte jedoch nicht nachgewiesen werden
(Driessens et al., 2001; Hu et al., 2001; Vikis et al., 2000; Jin & Strittmatter, 1997; Jurney et
al., 2002; Rohm et al., 2000; Vastrik et al., 1999; Kuhn et al., 1999). RhoD und Rnd1
hingegen zeigen eine Bindung an PlexinA1, wobei RhoD antagonistisch auf die PlexinA1-
Rnd1-vermittelte Repulsion von Axonen wirkt (Rohm et al., 2000; Zanata et al., 2002).
Um den Ort der GTPase-Interaktion auf der 66 kDa großen zytoplasmatischen Domäne
einzugrenzen, wurden Deletionsstudien durchgeführt. Die große zytoplasmatische Region
wird aus zwei konservierten Domänen gebildet, die für die Weiterleitung von
Semaphorinsignalen notwendig sind. Die N-terminale und die nicht konservierte „Linker“-
Region, die sich zwischen den beiden Domänen befindet, sind an der Bindung der GTPase
beteiligt, während die C-terminale Domäne hierfür nicht erforderlich ist (Abb. 1.7). Durch
einen Sequenzvergleich wurde ein CRIB-Motiv in der nichtkonservierten „Linker“-Region
lokalisiert (Vikis et al., 2000; Driessens et al., 2001).
Interessanterweise ist das CRIB-Motiv von Regionen umgeben, die Sequenzhomologie zu
RasGAP-Proteinen aufweisen (Abb. 1.7; Rohm et al., 2000). Kürzlich konnte diese
intrinsische GAP-Aktivität der zytoplasmatischen Domäne auf R-Ras nachgewiesen werden
(Oinuma et al., 2004). Hierfür muss der Rezeptor durch Sema4D aktiviert und intrazellulär
Rnd1 an die zytoplasmatische Domäne gebunden sein. Dabei könnte die direkte Regulation
der R-Ras Aktivität durch PlexinB1, das als GAP fungiert, als Mechanismus für die
Transmembranrezeptor-vermittelte Signaltransduktion dienen. Die Inaktivierung von R-Ras
ist gleichzeitig in der Sema3A-induzierten Repulsion von Axonen involviert. Die Aktivierung
von R-Ras führt über Integrine zu Zell-Adhäsion und kontrolliert Zellmigration und
Neuritenwachstum (Zhang et al., 1996; Keely et al., 1999; Ivins et al., 2000; Kinbara et al.,
2003). Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Sema3A und Sema4D die Integrin-vermittelte
Zelladhäsion und –migration inhibieren können (Serini et al., 2003; Takahashi et al., 1999;
Barberis et al., 2004). Folglich könnte eine Inaktivierung von R-Ras durch Plexine die
Integrin-Aktivierung unterdrücken und dadurch die Zelladhäsion verringern. Dies führt
wiederum zu einem Kollaps der Wachstumskegel und zur Neuritenretraktion.
Neben dieser intrinsischen GAP-Aktivität der zytoplasmatischen Domäne konnte auch eine
Involvierung der GEF-Proteine im Rahmen der PlexinB-Signaltransduktion nachgewiesen
werden (Driessens et al., 2002; Aurandt et al., 2002; Hirotani et al., 2002; Perrot et al., 2002;
Swiercz et al., 2002). Dabei interagieren die PDZ-(postsynaptic density protein/Discs
Large/zona occludens 1) Domänen von PDZ-RhoGEF und LARG (leukemia associated
RhoGEF) mit dem extremen C-Terminus der Klasse B Plexine (Abb. 1.7). Die Bindung von
EINLEITUNG _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 19
Sema4D an PlexinB1 bzw. die Aktivierung eines chimären PlexinB2 Proteins zeigten eine
Regulation der beiden RhoGEFs und führten zur Aktivierung von RhoA (Driessens et al.,
2002; Aurandt et al., 2002; Hirotani et al., 2002; Perrot et al., 2002; Swiercz et al., 2002).
EINLEITUNG _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 20
Abb
. 1
.7:
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ZIELSETZUNG _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 21
2. Zielsetzung
Im Rahmen dieser Dissertation sollten die Interaktionen der Ras- und Rho-Familie mit der
zytoplasmatischen Domäne der Plexin-Transmembranrezeptoren biochemisch und strukturell
charakterisiert werden.
Hierzu war zunächst die Klonierung der DNA-Konstrukte der GTPase-bindenden Domänen
(GBDs) und der vollständigen zytoplasmatischen Domänen (CPDs) von PlexinA2, PlexinB1,
PlexinC1 und PlexinD1 erforderlich. Anschließend sollten Expressions- und
Reinigungsprotokolle für die rekombinanten Proteine ausgearbeitet und etabliert werden.
Im Vordergrund des Interesses stand die Untersuchung der Bindungsspezifität der
verschiedenen GBDs und CPDs mit den GTPasen der Rho-Familie. Diese Interaktionen
sollten qualitativ und quantitativ durch in vitro Messungen untersucht werden.
Da die N- und C-terminalen Domänen der CPDs Sequenzhomologien zu GTPase-
aktivierenden Proteinen (GAPs) der Ras-Familie aufweisen, wurden die CPDs auf ihre GAP-
Aktivität und Spezifität hin untersucht.
Weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die dreidimensionale Struktur einer GBD oder CPD
alleine bzw. im Komplex mit einer GTPase darzustellen.
Ein zusätzlicher zentraler Punkt dieser Dissertation war die strukturelle Charakterisierung der
19 Aminosäuren-Insertion von Rac1b. Dabei waren die Struktur dieser 19 zusätzlichen
Aminosäuren und ihr Einfluss auf den übrigen Teil der GTPase, sowie auf die
Nukleotidbindung von besonderem Interesse. Weiterhin sollte untersucht werden, welchen
Einfluss die Art des gebundenen Nukleotids (GDP oder GTP) auf die Struktur der 19
Aminosäuren-Insertion von Rac1b hat.
Durch die strukturelle Charakterisierung von TC10, sowohl im GDP als auch im GTP
gebundenen Zustand, wurde ein Beitrag zum Verständnis der Signaltransduktion dieser
GTPase erwartet. Die Lösung der dreidimensionalen Struktur sollte dabei als Grundlage für
die Suche nach Interaktionspartnern dienen. Dabei waren die Unterschiede zwischen dem
aktiven und dem inaktiven Zustand ein wichtiger Aspekt.
MATERIAL _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 22
3. Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Bakterienstämme
E. coli Stamm Genotyp Referenz
TG1
BL21 (DE3)
BL21(DE3)
CodonPLUS RIL
Rosetta
DH10Bac™
supE, hsd∆5, thi, ∆(lac-proAB), F‘ [traD36,
proAB+, lacIq, lacZ∆M15]
ompT, hsdSB (rB-,mB
-), gal(λcIts857 ind1,
Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), dcm (DE3)
ompT, hsdSB (rB-,mB
-), gal(λcIts857 ind1,
Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), dcm (DE3),
Tetr, endA, HTE (argU, ileY, leuW, Camr)
ompT, hsdSB (rB-,mB
-), gal(λcIts857 ind1,
Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), dcm (DE3),
pRARE2 (CmR)
bMon14272, pMon7124
Gibson, 1984
Studier&Moffat, 1986
Carstens&Waeshe, 1999
Novagen, Produkt-Infor-
mation
Invitrogen (Karlsruhe)
3.1.2 Insektenzelllinien
Zelllinie Beschreibung Referenz
Sf21 Adhärent und in Suspensionskultur
wachsende Zelllinie aus dem Eierstock-
Gewebe von Spodoptera frugiperda,
unregelmäßige Morphologie
Vaughn et al., 1977
Tab. 3.1: Verwendete Bakterienstämme.
Tab. 3.2: Verwendete Insektenzelllinien.
MATERIAL _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 23
3.1.3 Nährmedien und Antibiotika
3.1.3.1 Nährmedien und Zusätze
Luria-Bertani(LB)-Voll-Medium 10 g/l Bacto-Tryptone
10 g/l NaCl
5 g/l Hefe-Extrakt
(0,25% (v/v) 2M NaOH)
LB-Platten-Agar 10 g/l Bacto-Tryptone
10 g/l NaCl
5 g/l Hefe-Extrakt
16 g/l Bacto-Agar
TB-Voll-Medium 12 g/l Bacto-Tryptone
24 g/l Hefe-Extrakt
0,4% (v/v) Glycerin
2,31 g/l KH2PO4
12, 54 g/l K2HPO4
TC100-Insektenzellmedium Invitrogen (Karlsruhe)
Fötales Kälberserum (FCS) Invitrogen (Karlsruhe)
3.1.3.2 Antibiotika
Ampicillin 100 mg/l Medium
Chloramphenicol (in EtOH) 25 mg/l Medium
Kanamycin 50 mg/l Medium
Tetrazyklin 25 mg/l Medium
Gentamycin 7 mg/l Medium
3.1.4 Puffer und Lösungen
Acrylamid-Lösung 30% (w/v) Acrylamid
0,8% (w/v) Bisacrylamid
MATERIAL _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 24
Anodenpuffer für Semi-dry Blot 300 mM Tris
100 mM Tricin pH 8,8
Anodenpuffer (Tricingel) 200 mM Tris.HCl pH 8,9
Anodenpuffer (native Gele) 4 mM Tris HCl pH 8,4
50 mM Glycin
Austauschpuffer (10x) 2 M (NH)2SO4
1 mM ZnCl2
Blockierlösung 4% Magermilchpulver in TBST
6x DNA-Probenpuffer 10 mM Tris.HCl
25 mM EDTA
30% (v/v) Glycerin
0,4% (w/v) Orange G
dNTP-Lösung 0,5 mM dATP
0,5 mM dCTP
0,5 mM dGTP
0,5 mM dTTP
Entfärbelösung 40% (v/v) Ethanol
10% (v/v) Essigsäure
Färbelösung 40% (v/v) Methanol
10% (v/v) Essigsäure
4 g/l Coomassie Brilliant Blue R250
4 g/l Coomassie Brilliant Blue G250
GSH-Elutionspuffer 50 mM Tris.HCl pH 7,5
100 mM NaCl
1 mM MgCl2
5 mM DTT
MATERIAL _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 25
20 mM Glutathion (reduziert)
GST-Fish-Puffer 50 mM Tris.HCl pH 7,4
100 mM NaCl
2 mM MgCl2
10% (v/v) Glycerin
1% (w/v) Igepal CA-630
Hochsalz/ATP-Puffer 50 mM Tris.HCl pH 7,5
100 mM NaCl
400 mM KCl
1 mM MgCl2
5 mM DTT
1 mM ATP
HPLC-Puffer 10 mM TBA
57,48 g/l K2HPO4
93,25 g/l KH2PO4
Kathodenpuffer für Semi-dry Blot 300 mM Capronsäure
30 mM Tris pH 8,7
Kathodenpuffer (Tricin-Gel) 100 mM Tris.HCl pH 8,25
160 mM Tricin
1% (w/v) SDS
Kathodenpuffer (native Gele) 40 mM Tris HCl pH 8,4
500 mM Glycin
5x Laemmli Probenpuffer 50 mM Tris.HCl
50% (v/v) Glycerin
500 mM DTE
10% (w/v) SDS
MATERIAL _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 26
Meßpuffer 30 mM Tris.HCl pH 7,5
10 mM NaxHxPO4 pH 7,5
1 mM MgCl2
3 mM DTT
PBS (phosphate-buffered saline) 137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10,2 mM Na2HPO4
1,8 mM KH2PO4
4x SDS-Probenpuffer 33% (v/v) Glycerin
300 mM DTE
6,7% (w/v) SDS
0,01% (w/v) Bromphenolblau
80 mM Tris.HCl pH 6,8
SDS-Laufpuffer 25 mM Tris
192 mM Glycin
2% (w/v) SDS
SDS-Sammelgelpuffer 500 mM Tris.H3PO4 pH 6,8
4% (w/v) SDS
SDS-Trenngelpuffer 500 mM Tris.H3PO4 pH 8,8
4% (w/v) SDS
Standard-Puffer (GSH-Sepharose) 50 mM Tris.HCl pH 7,5
100 mM NaCl
1 mM MgCl2
5 mM DTT
Standardpuffer (Ni-NTA-Agarose) 50 mM Tris.HCl pH 7,5
100 mM NaCl
1 mM MgCl2
1 mM β-Mercaptoethanol
MATERIAL _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 27
Standardpuffer (salzfrei) 50 mM Tris.HCl pH 7,5
5 mM DTT
TAE-Puffer 40 mM Tris.NaOH pH 8,5
1 mM EDTA
TBST-Puffer 150 mM NaCl
0,1% Tween 20
20 mM Tris.HCl pH 7,4
TE-Puffer 100 mM Tris pH 8,0
10 mM EDTA pH 8,0
Tricin-Gelpuffer 3 M Tris pH 8,45
0,3% (w/v) SDS
TSS-Puffer 85% LB-Medium (ohne NaOH)
10 % (w/v) PEG 8000
5% DMSO
50 mM MgCl2 pH 6.5
Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Puffer und Lösungen in Aqua bidest angesetzt.
3.1.5 Vektoren
pcDNA3-Flag Invitrogen (Paisley, UK)
pGEX4T1, 4T2, 4T3 Amersham Pharmacia (Freiburg)
pProEx HTa, HTb, HTc Invitrogen (Paisley, UK)
pQE 30 Qiagen (Hilden)
pFastBac HTa, HTb, HTc Invitrogen (Paisley, UK)
MATERIAL _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 28
3.1.6 Oligonukleotide
3.1.6.1 Oligonukleotide zur Fragmentherstellung
Plexa2 K1740*sal as
5' - CG GAA TTC TCA CTT GCT GCC CCG GTC ACC CT - 3'
Plexa2S1963*sal1 as
5' - ACG CGT CGA CTC AGC TCT CAA TGG ACA TGG C - 3'
Plexa2*xho1A1910as60
5' - CCG CTC GAG TCA GGC GTG CAG GCG GGA CTG CT - 3'
Plxa2*xho1S1963as58
5' - CCG CTC GAG TCA GCT CTC AAT GGA CAT GGC ATT AAT - 3'
Plexb1bamh1V1599s62
5' - CGC GGA TCC GTG GAG CAA GGG CTG GGG CAG - 3'
Plexb1bamh1L1640s60
5' - CGC GGA TCC CTG CTC ACC GTG GCA CTG CAT G - 3'
PlxB1BamH1V1769s60
5' - CGC GGA TCC GTG AAG GTC CTA GAC TGT GAC AC - 3'
plexb1*ecor1_c1_as
5' - CT GAA CTG TCC TGG AAC TAC TCC TGA GAA TTC CG - 3'
plexb1*xho1S2079as60
5' - CCG CTC GAG TCA GGA GTA GTT CCA GGA CAG TTC AG - 3'
Plxb1*sal1L2135as60
5' - ACG CGT CGA CTC ATA GAT CTG TGA CCT TGT TTT CCA - 3'
Plxb1*xho1L2135as60
5' - CCG CTC GAG TCA TAG ATC TGT GAC CTT GTT TTC CAC - 3'
Plxb1*ecor1L2135_as60
5' - CG GAA TTC TCA TAG ATC TGT GAC CTT GTT TTC CAC A - 3'
plexb1*ecor1_c3_as
5' - GAT GAC CTG TTC CAG GTG ATT CTC TGA GAA TTC CG - 3'
plxb1*sal1L1941s62
5' - ACG CGT CGA CTC AGA GAA TCA CCT GGA ACA GGT CAT - 3'
plexb1bamh1_n4_s
5' - CGC GGA TCC GAC AGT GTG ACA GGC AAG GCC A - 3'
MATERIAL _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 29
plexb1*ecor1_c4_as
5' - GG CCT CGG AGG GGC AGC CTT TGA GAA TTC CG - 3'
Plexb1_r1724bam_s58
5' - CGC GGA TCC CGT GCC TAC GTG GCA TCT CTG - 3'
Plexb1 e1639bamh1 s58
5' - CGC GGA TCC GAG ATG ACC GAT CTC ACC AGT - 3'
Plexb1 L2226*sal as
5' - ACG CGT CGA CCT ATA GAT CTG TGA CCT TGT TTT C - 3'
Plexb1 t1885*sal as
5' - ACG CGT CGA CCT AGG TGA GAG GCA CTC CTT TAT AAA - 3'
Plexd1_Dbam_s60
5' - CGC GGA TCC GAC GCC ATC ACA GGC AAG GCC - 3'
Plxd1*ecor1H_as58
5' - CG GAA TTC TCA GTG AGA CTT CTT GGG CTC CGC - 3'
Rnd1_P9_bamh1_s_60
5' - CGC GGA TCC CCA GTC GTG GCC AGA TGT AAG C - 3'
Rnd1_K190*_xho1_as_58
5' - CCG CTC GAG TCA CTT GTT CAG ACA CAG CAT GGA TG - 3'
3.1.6.2 Oligonukleotide zur Sequenzierung
5'pGEX 60C
5' – GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG - 3'
3'pGEX 76C
5' – CGG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG - 3'
Plexina2_1720seqs56
5' - GTG GCA TCT GGT GAA GAA CCA T - 3'
Plexa2D1544bams58
5' - CGC GGA TCC GAT GCC ATC ACG GGC GAG GC - 3'
Plexa2 D1368bams58
5' - CGC GGA TCC GAT ATC AAT GAG TTG ACC AGT GAC - 3'
Plexa2bamh1Q1415s60
5' - CGC GGA TCC CAG CAC GTG GAG AAG GCC CTG - 3'
MATERIAL _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 30
Plexa2bamh1L1458s58
5' - CGC GGA TCC CTC ATC ATG ACC GGC CTG CAG - 3'
Plexinb1_1870seqs56
5' - GGA GAA GAT GCT GGA CCA GCT - 3'
3.1.7 Biochemikalien und Chemikalien
3.1.7.1 Proteine und Enzyme
Alkalische Phosphatase Sigma (Deisenhofen)
Faktor Xa Roche Diagnostics (Mannheim)
Glutathion S-Transferase MPI-Dortmund
Igase MPI-Dortmund
TEV MPI-Dortmund
Pfu-DNA-Polymerase Stratagene (Amsterdam)
Phosphodiesterase Sigma (Deisenhofen)
Pwo-DNA-Polymerase Roche Diagnostics (Mannheim)
Rac Antikörper Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY)
Restriktionsendonukleasen New England Biolabs (Beverly, MA)
T4-DNA-Ligase New England Biolabs (Beverly, MA)
Taq-DNA-Polymerase Qiagen (Hilden)
Thrombin Serva (Heidelberg)
3.1.7.2 Nukleotide
GDP Sigma (Deisenhofen)
GppNHp Sigma (Deisenhofen)
GppCH2p Sigma (Deisenhofen)
GTP Sigma (Deisenhofen)
mant-GDP MPI-Dortmund, Jena Biosciences (Jena)
mant-GppNHp MPI-Dortmund, Jena Biosciences (Jena)
mant-GTP MPI-Dortmund, Jena Biosciences (Jena)
mant-GTPγS Jena Biosciences (Jena)
tamra-GTP MPI-Dortmund, Jena Biosciences (Jena)
MATERIAL _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 31
3.1.7.3 Protein- und Nukleinsäurestandards
Proteinstandard: SDS 7 (Sigma) mit 66/45/36/29/24/20/14,2 kDa
SDS6-H (Sigma) mit 205/116/97/66/45/29 kDa
Nukleinsäurestandard: λ-DNA, BstEII hydrolysiert (AGS) (113-8453 bps)
MBBL (Bielefeld)
3.1.7.4 Proteinase-Inhibitoren
Aprotinin (2 mg/ml) ICN Biomedicals (Eschwege)
Benzamidin (78 mg/ml) ICN Biomedicals (Eschwege)
Leupeptin (1 mg/ml) ICN Biomedicals (Eschwege)
Pepstatin (0,7 mg/ml) ICN Biomedicals (Eschwege)
Pefabloc (5 mg/ml) ICN Biomedicals (Eschwege)
3.1.7.5 FPLC-Säulenmaterial
GSH-Sepharose fast flow Amersham Pharmacia (Freiburg)
Hi-Load™ Superdex 75 und 200 Amersham Pharmacia (Freiburg)
Ni-NTA-Agarose Qiagen (Hilden)
3.1.7.6 Chemikalien
Agarose Life Technologies (Karlsruhe)
DMSO Serva (Heidelberg)
DTE/DTT Gerbu (Gaiberg)
Entwickler/Fixierer für Röntgenfilme Agfa (Mortels, BE)
Ethidiumbromid Serva (Heidelberg)
Formaldehyd Roth (Karlsruhe)
Glutathion Merck (Darmstadt)
Glutathion Sepharose 4B Amersham Pharmacia (Freiburg)
Imidazol Merck (Darmstadt)
IPTG Gerbu (Gaiberg)
Ni-NTA-Agarose Qiagen (Hilden)
SDS Gerbu (Gaiberg)
MATERIAL _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 32
Alle weiteren Chemikalien wurden im höchsten erhältlichen Reinheitsgrad von den Firmen
Aldrich, Fluka, Merck, Roth, Serva, Riedel de Haen, ICN und Sigma bezogen.
3.1.7.7 Antikörper
3.1.7.7.1 Primäre Antikörper
Bezeichnung, Spezifität Organismus, Typ Firma
anti-GST Maus IgG MPI-Dortmund
anti-His Kaninchen IgG Santa Cruz (Heidelberg)
3.1.7.7.2 Sekundäre Antikörper
Spezifität, Organismus Konjugat Firma
Schaf anti-Maus IgG
(SHAMPO)
Meerrettich-Peroxidase
Amersham Pharmacia
(Freiburg)
Esel anti-Kaninchen IgG
(DARPO)
Meerrettich-Peroxidase Amersham Pharmacia
(Freiburg)
3.1.8 Kit-Systeme
ABI PRISM™ Dye Terminator Cycle Perkin Elmer (Überlingen)
Sequencing Ready Reaction Kit
ECL Chemolumineszenz Kit (West Pico) Perbio Science (Bonn)
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen (Hilden)
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen (Hilden)
QIAprep Spin Gel Extraction Kit Qiagen (Hilden)
QIAprep Spin PCR Purification Kit Qiagen (Hilden)
3.1.9 Geräte
Analysenwaage Sartorius (Göttingen)
Detektor Drei-Kreis Hi-Star Siemens
Detektor MAR345 Image Plate System X-Ray Research GmbH (Norderstedt)
DNA-Gelelektrophoresekammer Werkstatt MPI Dortmund
Tab. 3.3: Primäre Antikörper.
Tab. 3.4: Sekundäre Antikörper.
MATERIAL _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 33
ESI-MS Finnigan (San Jose, CA, USA)
Fast-Blot Apparatur Power Pack P25 Biometra (Göttingen)
Fluidizer Microfluidics Corporation
Fluoreszensspektrometer (LS 50 B) Perkin Elmer (Überlingen)
FPLC (Äkta Prime) Amersham Pharmacia (Freiburg)
HPLC (System Gold 166) Beckman (München)
Inkubator HAT Infors GmbH (Übach Palenberg)
Magnetrührer RCT basic IKA Labortechnik
PAGE-Kammern cti (Idstein)
PCR-Gerät MiniCycler MJ Reasearch (Watertown, USA)
PerpHect LogRmeter model 320 (pH-Meter) Orion
Photometer BioPhotometer Eppendorf (Hamburg)
Pipetten Gilson (Abimed, Langenfeld)
Präzisions-Quarzküvetten Hellma
Rotierende Anoden Nonius / Siemens
Rotoren (JA 10-17, 30.50) Beckman (München)
Spannungsquellen (Power Pac 300) BioRad (München)
Stopped Flow (SX16MV) Applied Photophysics
Thermomixer (5436) Eppendorf (Hamburg)
Thermoschrank WTC binder (Tuttlingen)
Tischzentrifuge (Biofuge 13) Kendro (Hanau)
Tischzentrifuge, kühlbar (5427R) Eppendorf (Hamburg)
Tischzentrifuge, kühlbar (Universal 32R) Hettich (Tuttlingen)
Vakuum-Membranpumpe Ilmvac GmbH (Ilmenau)
Zentrifugen (J2-HC, J2-HS und Avanti30) Beckman (München)
3.1.10 Verbrauchsmaterialien
Zentrifugen-/Kultur-Röhrchen Becton Dickinson/Falcon (Heidelberg)
Pipettenspitzen Gilson (Abimed, Langefeld)
Mikropipettenspitzen Eppendorf (Hamburg)
Nap-5 Säulen Amersham Pharmacia (Freiburg)
Plastik-Küvetten Sarstedt (Nümbrecht)
PVDF Membran Roche Diagnostics (Mannheim)
Reaktionsgefäße Eppendorf (Hamburg)
MATERIAL _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 34
Sterilfilter Schleicher &Schüll (Dassel)
Vivaspin-Röhrchen Vivascience
Whatman 3 MM Papier Schleicher & Schüll (Dassel)
3.1.11 Kristallographische Screens
Crystal Fast Screen I Hampton Research
Crystal Fast Screen I Lite Hampton Research
Crystal Fast Screen II Hampton Research
Index Screen HT Hampton Research
Qick Screen Hampton Research
Clear Strategy Screen (CSS) MPI-Dortmund
NaCl-Screen MPI-Dortmund
LiCl-Screen MPI-Dortmund
(NH4)2SO4-Screen MPI-Dortmund
MPD-Screen MPI-Dortmund
PEG/Ion-Screen Hampton Research
PEG6000-Screen Hampton Research
PEG/NaCl-Screen Hampton Research
3.1.12 Programme
Die Auswertung und graphische Darstellung von Messdaten erfolgte mit GraFit (Erithacus
Software, Staines, UK, Version 3.0/4.0/5.0), Microsoft Excel (Microsoft Corporation) und
Microcal Origin 7.
Zur Datenreduktion, Strukturaufklärung und -verfeinerung wurden XDS (Kabsch, 1993),
Programme des CNS-Pakets (Brünger et al., 1998), Programme des CCP4-Pakets (CCP4,
1994) sowie Solve/Resolve (Terwilliger, 1999; Terwilliger & Berendzen, 1999) verwendet.
Elektronendichtekarten wurden mit Hilfe des Grafikprogrammes O (Jones, 1991) interpretiert.
Zur Strukturüberprüfung wurden die Programme WHATIF/WHATCHECK und PROCHECK
verwendet. Strukturbiologische Abbildungen wurden mit Molscript/Bobscript angefertigt. Für
Darstellungen von Oberflächen wurde Grasp (Nicholls et al., 1991) bzw. MSMS (Sanner et
al., 1996) verwendet.
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 35
3.2 Molekularbiologische Methoden
3.2.1 Herstellung kompetenter E. coli Zellen
Damit E. coli Zellen Plasmide bei einer Transformation aufnehmen können, müssen die
Zellen zunächst kompetent gemacht werden. Dies erfolgt für die hier verwendeten TG1-,
BL21(DE3)- und BL21(DE3)CodonPlus-Stämme nach einer nach Chung et al., 1989
modifizierten Methode.
Die 5 ml Vorkultur eines Einzelklons wurde über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten
Tag wurden 200 ml LB-Medium mit 2 ml der Vorkultur angeimpft und unter Schütteln (180
rpm) bei 37 °C kultiviert. Beim Erreichen einer OD600 von 0,3 bis 0,4 lagerte man die
Zellsuspension für 20 Minuten auf Eis. Nach einer 10 minütigen Zentrifugation bei 1200 g
und 4 °C wurde das Sediment in 1/10 des Ausgangsvolumens (20 ml) eiskaltem TSS
resuspendiert. Die kompetenten Zellen wurden aliquotiert, in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bei -80 °C gelagert.
3.2.2 Transformation von E. coli
Für die Transformation wurden 100 µl, der auf Eis aufgetauten kompetenten Bakterien, mit
10 µl des Ligationsansatzes oder 20 ng gereinigter Plasmid-DNA (Mini-Präparation) zunächst
30 Minuten auf Eis inkubiert. Der für die Aufnahme des Plasmids in die Bakterienzellen
nötige Hitzeschock erfolgte durch zweiminütige Inkubation bei 42 °C. Dann wurde 1 ml LB-
Medium zugegeben und die Bakteriensuspension zur Ausbildung der Antibiotikaresistenz für
60 Minuten bei 37 °C unter Schütteln im Heizblock kultiviert.
Nach Sedimentation der Zellen durch Zentrifugation (60 Sekunden bei 13000 rpm) wurde 1
ml des Überstands abgenommen und verworfen. Die Zellen wurden dann im Restvolumen
resuspendiert und die Bakteriensuspension auf einer LB-Platte mit dem entsprechenden
Antibiotikum zur Selektion ausgestrichen. Die Inkubation der Kultur erfolgte bei 37 °C über
Nacht in einem Brutschrank oder bei Raumtemperatur über drei Tage.
3.2.3 Kultivierung und Lagerung von transformierten Bakterienzellen
Von dem Ausstrich auf der LB-Platte wurde eine einzelne Kolonie gepickt und damit eine 5
ml Minikultur (LB-Medium + Antibiotikum) angeimpft. Diese wurde über Nacht bei 37 °C
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 36
im Schüttelinkubator kultiviert. Für die stabile Lagerung der Kultur als Glycerinstock wurden
500 µl der Kultur mit 500 µl Glycerin (50% v/v) versetzt und bei -80 °C gelagert.
3.2.4 Isolierung von Plasmid-DNA
Plasmid-DNA wurde aus 5 ml Schüttelkulturen mit Hilfe des Qiaprep Spin Plasmid Kit der
Firma Qiagen nach Herstellerangaben durchgeführt.
Die Plasmidisolierung erfolgt dabei durch alkalische Lyse der Bakterienzellen mit
anschließender Neutralisation und dem Einstellen von Hochsalzbedingungen. Das Abtrennen
der DNA vom restlichen Lysat erfolgt durch eine selektive Adsorption der DNA an eine
DEAE-gekoppelte Silicagelmatrix.
2-4 ml der E. coli Übernachtkulturen wurden für 60 Sekunden bei 13000 rpm zentrifugiert.
Das Zellsediment wurde dann in 250 µl Puffer P1 (enthält RNase A) resuspendiert und durch
Zugabe von 250 µl Puffer P2 (enthält NaOH/SDS) lysiert. Die Zugabe von SDS bewirkt eine
Solubilisierung der Membranlipide und der Membranproteine, wodurch der Zellinhalt
freigesetzt wird. Die alkalischen Bedingungen sind für die Hydrolyse der RNA, die
Denaturierung der DNA und der Proteine notwendig. Die Zugabe von 350 µl des Puffers N3
führte zu einer Neutralisierung der klaren, viskosen Suspension. Die mit diesem Puffer
gleichzeitig geschaffenen Hochsalzbedingungen führen zur Präzipitation der Proteine, der
chromosomalen DNA und des SDS. Die im Vergleich zur chromosomalen DNA kurze
Plasmid-DNA kann unter diesen Bedingungen renaturieren und verbleibt in Lösung. Das
Präzipitat wurde durch 10 minütige Zentrifugation bei 13000 rpm sedimentiert.
Der klare Überstand wurde auf eine QIAprep Spin Säule überführt und für 1 Minute bei 13000
rpm in das sich darunter befindende Eppendorfreaktionsgefäß abzentrifugiert. Die negative
Ladung des Phosphatrückgrats der Plasmid-DNA führt zur Adsorption an die positiv
geladenen DEAE-Gruppen der Silicalgel-Matrix. Optional konnte die an die Membran
adsorbierte DNA zunächst mit 500 µl Puffer PB und dann mit 750 µl Puffer PE gewaschen
werden. Die Elution der DNA erfolgte durch 20-100 µl Wasser.
Die im Wasser gelöste Plasmid-DNA wurde bei -20 °C gelagert.
3.2.5 Präparation von Bakmid-DNA
Die Isolierung von Bakmid-DNA erfolgte aus 5 ml-Kulturen von DH10Bac-Zellen, die mit
pFastBac HT-Derivaten transformiert worden waren und auf Selektionsplatten blau gefärbt
waren. 2 ml der Kultur wurden bei 13000 rpm (Tischzentrifuge) für 2 Minuten
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 37
abzentrifugiert. Das Zellsediment wurde mit 300 µl Lösung 1 (s.u.) resuspendiert. Dann
wurden 300 µl Lösung 2 (s.u.) zugegeben und vorsichtig gemischt. Nach 5-minütiger
Inkubation wurden 300 µl 3 M Kaliumacetat pH 5,5 zugegeben und wiederum vorsichtig
gemischt. Die Lösung wurde 10 Minuten auf Eis inkubiert und schließlich für 10 Minuten bei
13000 rpm (Tischzentrifuge) abzentrifugiert. Der Überstand wurde mit 800 µl Isopropanol
gefällt. Nach 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde die DNA abzentrifugiert (15
Minuten, 13000 rpm) und mit 70 % Ethanol gewaschen. Nach erneutem Abzentrifugieren
wurde das Sediment für 5 bis 10 Minuten getrocknet und in 40 µl TE (3.1.4) aufgenommen.
Lösung 1: 15 mM Tris HCl pH 8,0
10 mM EDTA
100 µg/ml RNAse A
Lösung 2: 0,2 N NaOH
1 % (w/v) SDS
3.2.6 Hydrolyse von Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen
Die Hydrolyse von doppelsträngiger DNA mit Restriktionsendonukleasen erfolgte sowohl für
analytische (Überprüfung des Klonierungserfolgs) als auch für präparative Zwecke
(Herstellung kompatibler Enden für Ligationen).
Restriktionsendonukleasen hydrolysieren doppelsträngige DNA in palindromischen DNA-
Sequenzen, die eine für den jeweiligen Typ spezifische Erkennungssequenz aufweisen.
Bei der Wahl der Pufferbedingungen, Inkubationstemperaturen und Inkubationszeiten wurden
die Angaben des Herstellers berücksichtigt. Die durch die Restriktion entstandenen Fragmente
wurden durch DNA-Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt mit Ethidiumbromid angefärbt
(interkaliert in doppelsträngige DNA) und unter ultraviolettem Licht anhand ihrer Größe
identifiziert.
3.2.7 Agarose-Gelelektrophorese
DNA-Fragmente wurden durch horizontale Agarose-Gelelektrophorese anhand ihrer Größe
aufgetrennt (McDonell et al., 1977). Das Trennprinzip beruht hierbei auf dem
Molekularsiebeffekt des Gels. Kleinere Fragmente wandern schneller durch das Gel als
größere Fragmente.
Um eine optimale Auftrennung von 300-6000 Basenpaaren langen Fragmenten zu erhalten
wurden 0,8 %ige Agarosegele verwendet. Hierzu wurde die Agarose mit TAE-Puffer bis zur
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 38
vollständigen Auflösung der Agarose aufgekocht und nach einer Abkühlung auf cirka 50 °C
mit Ethidiumbromid (0,75 µg/ml) versetzt. Aus dieser Lösung wurde ein Gel in einer
horizontalen Gelkammer gegossen und nach dem Erhärten mit TAE-Puffer überschichtet.
Die Proben wurden mit 1/5 Volumen 6-fach DNA-Probenpuffer versetzt und dann zusammen
mit einem Größenstandard als Referenz auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte
bei einer konstanten Spannung von 8 bis 12 V/cm Gellänge. Die Detektion der DNA-
Fragmente erfolgte auf einem UV-Transilluminator bei 312 nm Wellenlänge.
3.2.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen
Für die präparative Reinigung einer DNA-Bande aus einem Agarose-Gel wurde diese mittels
eines Skalpells aus dem Gel ausgeschnitten und mit Hilfe des QIAprep Gel Extraction Kits
nach Herstellerangaben isoliert.
Das hierbei verwendete Prinzip der Reinigung ähnelt dem des QIAprep Spin Miniprep Kits.
Hierbei wird die Agarose jedoch zuvor in einer 6 M Natriumiodid Lösung bei 50 °C aufgelöst
und die freigesetzte DNA wiederum an eine DEAE-gekoppelte Silicagel-Matrix gebunden,
nachfolgend gewaschen und eluiert.
3.2.9 Ligation
Um über eine PCR-Reaktion amplifizierte DNA-Fragmente in Vektoren zu ligieren wurde das
Enzym T4-DNA-Ligase verwendet. Das komplementär zum Vektor restringierte Fragment
wurde in 5-8 fachem Überschuss zu dem linearisierten Vektor (20 ng) eingesetzt. Weitere
Bestandteile waren 1 µl T4-DNA-Ligase-Puffer (New England Biolabs) und eine Einheit
Enzym. Das Endvolumen von 10 µl wurde mit Wasser eingestellt. Nach Inkubation bei 4 °C
über Nacht wurde der vollständige Ligationsansatz für die nachfolgende Transformation
eingesetzt. Für die Religationskontrolle, zur Überprüfung der Selbstligation des Vektors,
wurde anstelle des Fragments Wasser in die Reaktion eingesetzt.
3.2.10 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction, Mullis et al., 1992) ist ein in
vitro Verfahren zur selektiven Amplifizierung von Nukleinsäuren.
Die Reaktion erfolgt durch eine hitzestabile DNA-Polymerase sowie durch zwei
Oligonukleotide, die die zu vervielfältigende DNA-Sequenz flankieren und zu je einem
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 39
(Gl. 3.1)
kurzen Abschnitt der beiden DNA-Stränge komplementär sind. Die Amplifizierung erfolgt
durch mehrfaches Durchlaufen eines dreistufigen Reaktionszyklus: zunächst erfolgt die
Trennung des Matrizenstrangs (template) durch thermische Denaturierung bei 95 °C. Das
nachfolgende Abkühlen des Reaktionsgemisches auf eine Temperatur von 50 bis 60 °C, führt
zur Anlagerung der Oligonukleotide an die komplementären Sequenzen des Matrizenstrangs
(annealing). Im dritten Schritt synthetisiert die DNA-Polymerase bei 72 °C, vom
Oligonukleotid ausgehend, unter Verwendung von dNTPs den neuen DNA-Strang
(elongation).
Die hier dargestellten drei Schritte (Denaturierung, Anlagerung und Elongation) werden 25 -
30-mal wiederholt, wobei die Anzahl der Kopien pro Zyklus theoretisch exponentiell
anwachsen sollte. In der praktischen Anwendung ist eine Verdopplung der Kopienzahl pro
Zyklus realistischer.
Für den Erfolg einer PCR-Reaktion ist die richtige Bestimmung der Annealing-Temperatur
der Oligonukleotide von entscheidender Bedeutung. Eine zu hohe Temperatur verhindert die
Hybridisierung, während eine zu niedrige Temperatur zu einer unspezifischen Bindung des
Primers an die Template-DNA führt. Die Annealing-Temperatur ist im Wesentlichen von der
Länge und vom G/C-Gehalt des Oligonukleotids abhängig und kann anhand der Wallace-
Formel (Sambrook et al., 1989) angenähert berechnet werden:
( ) ( ) [ ]CNNNNT CGTA °−+++= 1042
NX ist die Anzahl der paarenden Basen X in der Primersequenz.
Wichtig für die routinemäßige Anwendung der PCR war die Verfügbarkeit von
thermostabilen DNA-Polymerasen mit einem hohen Temperaturoptimum, wodurch ein
kontinuierlicher Ablauf der Amplifikationszyklen möglich wurde. Für analytische Zwecke
wurde die Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus verwendet. Diente die Vervielfältigung der
DNA jedoch zum weiteren Klonieren, so wurde die Pfu-Polymerase aus Pyrococcus furiosus
eingesetzt, die im Gegensatz zur Taq-Polymerase eine Korrekturlesefunktion (3'-5'-
Exonukleaseaktivität) verfügt und deshalb eine geringere Fehlerrate aufweist.
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 40
Die Reaktionsansätze hatten ein Volumen von 100 µl:
10-fach Pfu-Puffer 10 µl
dNTP-Mix 2 mM 10 µl
MgCl2 10 µl
DMSO 10 µl
Template-DNA 100 ng
5'-Primer 100 pmol
3'-Primer 100 pmol
Pfu-Polymerase 2,5 U
H2O ad 100 µl auffüllen
Programm
2 min 94 °C
1 min 92 °C
1 min 60 °C
1 min, 30 sec 72 °C
5 min 72 °C
∞ 24 °C
Die Schritte 2 bis 5 wurden 30-mal wiederholt.
Die verwendeten Primer sind unter 3.1.6.1 aufgeführt.
Um die unspezifische Bildung von Sekundärstrukturen zu verhindern wurde bei der
Klonierung rekombinanter Sequenzen 10% DMSO zugesetzt.
Nach der PCR-Reaktion wurden die Proben mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, das PCR-
Produkt aus der Agarose zurückgewonnen und dann mit den entsprechenden
Restriktionsendonukleasen geschnitten. Diese mit kohäsiven Enden versehenen Fragmente
wurden dann für die Ligation eingesetzt.
3.2.11 Analytische Schnell-PCR zur Bestimmung positiver Klone
Zur schnellen Überprüfung des Klonierungserfolgs wurde die Fast-PCR verwendet (mit
verkürzten Zeiten und weniger Zyklen). Mit einem sterilen Zahnstocher wurde ein einzelner
Klon von der LB-Platte gepickt, in einem 0,5 ml Eppendorfreaktionsgefäss abgestreift und
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 41
dann eine 5 ml Minikultur angeimpft. Folgendes Reaktionsgemisch wurde dann in das
Eppendorfreaktionsgefäss hinzugegeben:
10-fach Taq-Puffer 1 µl
5-fach Q-Solution 2 µl
dNTPs 2 mM 0,5 µl
5'-Primer (10pmol/µl) 0,5 µl
3'-Primer (10pmol/µl) 0,5 µl
Taq-DNA-Polymerase 0,5 µl
H2O ad 10 µl auffüllen
Bei der Fast-PCR wurde das gleiche Programm wie bei 3.2.10 verwendet, allerdings mit nur
20 Zyklen. Die verwendeten Primer sind unter 3.1.6.2 aufgeführt.
3.2.12 DNA-Sequenzierung
Für die DNA-Sequenzierung wurde ein ABIMED-Sequenzierer verwendet. Die
Sequenzierreaktion wurde mittels der Didesoxykettenabbruchmethode nach Sanger et al.
(1977) mit dem ABIPRISM™ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit der
Firma Perkin Elmer (Überlingen) durchgeführt. Die Plasmid-DNA wurde mit einer
thermostabilen Polymerase in einer PCR-Reaktion unter Anwesenheit von
fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotiden amplifiziert. Der hier verwendete Terminator-
Mix enthält dNTPs, fluorophormarkierte ddNTPs und die Polymerase Amplitaq©FS. Diese
fluorophormarkierten ddNTPs führen bei einem Einbau in die DNA zum Kettenabbruch. Die
Sequenzbestimmung erfolgt durch Auftrennung der amplifizierten DNA auf einem
Polyacrylamidgel und nachfolgende Abtastung des Gels mit einem Laser, der die
fluorophormarkierten Basen anhand der Emmissionscharakteristika des Fluorophors erkennt.
Ansatz für die PCR-Reaktion:
Terminator-Mix 4 µl
Plasmid-DNA 1 µg
Sequenzierprimer (vektorspezifisch) 10 pmol
H2O ad 20 µl auffüllen
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 42
PCR-Programm:
5 min 96 °C
30 sec 96 °C
15 sec 50 °C
4 min 60 °C
Nach der PCR-Reaktion wurde der Reaktionsansatz ad 100 µl mit sterilem Wasser aufgefüllt,
mit 1/10 des Volumen an 3 M Natriumacetat (pH 4,6-4,8) und 3 Volumina absolutem Ethanol
(100%) gefällt. Zur Detektion des DNA-Sediments wurde dem Ansatz 1 µl Dextranblau (10
µg/µl in H2O) zugefügt, da der Farbstoff DNA bindet und markiert. Nach 30 minütiger
Zentrifugation bei 13000 rpm wurde der Überstand abgenommen und verworfen. Die gefällte
DNA wurde dann mit 450 µl Ethanol (70% v/v) gewaschen und erneut bei 13000 rpm für 20
Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet bei 37 °C an der
Luft getrocknet.
Die anschließende Polyacrylamidgelelektrophorese und die Auswertung des Bandenmusters
mit Hilfe des ABIMED-Sequenzierers (Langenfeld) erfolgte durch die zentrale Einrichtung
''Synthese und Sequenzierung'' des MPI Dortmund. Bei der Verwendung von Plasmid-DNA
aus einer Mini-Präparation wurden für die Sequenzierung 5 µl der Mini-Präparation nach der
oben beschriebenen Methode gefällt und das Pellet direkt in die PCR- Reaktion eingesetzt.
3.3 Insektenzellen
3.3.1 Kulturbedingungen
Die Kultivierung von Sf21-Zellen (3.1.2) erfolgte bei 27°C entweder in 6 Well-Platten,
Petrischalen oder in Suspensionskultur. Suspensionskulturen wurden in Fährenbach-Kolben
bei 27°C kultiviert. Die Zellen wurden alle zwei Tage gezählt und passagiert, um eine
Zelldichte von 1·106 - 2·106 Zellen/ml einzuhalten. Sf21-Zellen wurden in TC10-Medium mit
10 % (v/v) FCS und 1 % (v/v) Pluronic (Invitrogen) kultiviert.
3.3.2 Transfektion von Sf21-Zellen mit rekombinanter Bakmid-DNA
Im Bac-to-Bac-System der Firma Invitrogen wurden rekombinante Bakuloviren zur
Expression von Fremdgenen unter der Kontrolle des Polyhedrinpromoters des Autographa
californica-nukleären-Polyhedrosis-Virus (AcNPV) benutzt. Das Polyhedringen wurde in der
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 43
sehr späten Phase des Bakulovirus-Zyklus exprimiert. Die rekombinanten Bakuloviren
wurden durch homologe Rekombination in E. coli hergestellt. Dazu wurden E. coli
DH10Bac-Zellen (3.1.1) mit dem rekombinanten pFastBac HTB-Plasmid transformiert. Auf
der Basis von sequenzspezifischer Transposition erfolgte in diesen Zellen die Eingliederung
der Expressionskassette in die Bakmid-DNA des Stammes. Das Bakmid stellt das
rekombinante Virus-Genom dar. Rekombinante Bakmide konnten durch Blaufärbung auf LB-
Platten mit Kanamycin, Gentamicin, Tetrazyclin, 50 µM IPTG und 100 µg/ml X-Gal
identifiziert werden. Sie wurden isoliert und durch PCR und Restriktionsanalyse
charakterisiert. Durch Transfektion der Sf21-Zellen mit rekombinanter Bakmid-DNA erfolgte
die Bildung von Viruspartikeln.
Zur Transfektion wurden je 1·106 Sf21-Zellen in 2 ml Medium in einer 6 well-Platte ausgesät
und für eine Stunde bei 27°C inkubiert. 5 µl Bakmid-DNA und 6 µl CellFECTIN wurden
getrennt in jeweils 100 µl Medium verdünnt, kurz gemischt und dann 45 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden nach einer Stunde mit 2 ml Medium
gewaschen. Zu jedem Transformationsansatz wurden 800 µl Medium gegeben und die
Mischung anschließend auf die Zellen getropft. Die Zellen wurden 5 Stunden im Brutschrank
inkubiert. Anschließend wurde der Transfektionskomplex von den Zellen abgenommen und 2
ml Medium zugegeben. Die Zellen wurden für 4 Tage im Brutschrank kultiviert. Danach
wurden die Zellen mit dem Medium abgeschwemmt, in Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt
und bei 2500 rpm (Tischzentrifuge) abzentrifugiert. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. Die
Zellen wurden zur Überprüfung der Expression lysiert und im Western Blot analysiert (s.u.).
3.3.3 Bestimmung des Virus-Titers
Zur Bestimmung des Virus-Titers wurden 6·106 Zellen abzentrifugiert und in 12 ml Medium
mit Serum gelöst. Je 2 ml wurden in die sechs Vertiefungen einer 6 well-Platte gegeben und 1
Stunde inkubiert. Währenddessen wurden Verdünnungen des zu testenden Virus hergestellt.
Der Virus wurde 1:105, 1:106 und 1:107 in Medium verdünnt. Nach 1 Stunde wurde das
Medium von den Zellen abgenommen und 1 ml Virus-Verdünnung aufgetropft. Ein well
wurde nur mit Medium betropft und diente als Kontrolle. Die Platte wurde dann 2 Stunden bei
Raumtemperatur geschwenkt. In dieser Zeit wurden 0,5 g Agarose in 20 ml A. bidest
aufgekocht und in ein 48°C-Wasserbad gestellt. Außerdem wurden 5 ml Medium mit Serum
auf 48°C erwärmt. Nachdem der Virus von den Zellen abgenommen worden war, wurden 5
ml Agarose mit 5 ml 48 °C-Medium und 10 ml Medium (Raumtemperatur) gemischt und je
2,5 ml vorsichtig auf die Zellen gegeben. Bis die Agarose erstarrt war, wurde die Platte nicht
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 44
bewegt. Anschließend wurde sie für 10 Tage im Brutschrank inkubiert. Um die Plaques
sichtbar zu machen wurde mit 0,1 % (w/v) Neutralrot für 1 Stunde gefärbt.
3.3.4 Virusamplifikation
Für die erste Virusamplifikation nach der Transfektion von Sf21 Zellen mit Bakmid-DNA
und der anschließenden Ernte der gebildeten Viruspartikel wurden 3·106 Sf21-Zellen pro 60
mm-Schale in 4,7 ml Medium ausgesät. Dann wurden 300 µl Virus zugegeben und die Zellen
für 3 bis 4 Tage im Inkubator kultiviert. Anschließend wurden die Zellen bei 2500 rpm
(Tischzentrifuge) abzentrifugiert, und der Überstand verwahrt. Für die nächste Amplifikation
wurden 5·106 Zellen in einer 10 cm-Schale in 9 ml Medium ausgesät, und mit 2 ml Virus
versetzt. Nach 3- bis 4-tägiger Inkubation wurde der Überstand durch Abzentrifugieren der
Zellen gesammelt. Für die dritte Amplifikation wurden 2·108 Zellen in 500 ml Medium in
einer 1 l Spinner-Flasche mit 5 ml Virus versetzt. Nach 3 bis 4 Tagen wurde der Überstand
wie oben beschrieben gesammelt und der Titer bestimmt. Der Virus wurde bei 4°C als Stock
gelagert. Für alle weiteren Amplifikationen des Viruses wurde generell eine Sf21-Kultur bei
2500 g 10 Minuten abzentrifugiert und in frischem Medium auf eine Zelldichte von 2·106
Zellen/ml verdünnt. Dann wurde die Kultur mit einer MOI (multiplicity of infection,
Viruspartikel pro Zelle) von 0,1 infiziert und für vier Tage unter Kulturbedingungen
inkubiert. Danach wurden die Zellen wiederum abzentrifugiert. Der virushaltige Überstand
wurde im Plaque-assay untersucht, das Zellpellet wurde zur Überprüfung der Expression
und/oder zur Proteinreinigung verwendet.
3.3.5 Proteinexpression in Sf21-Zellen
Zur Proteinexpression wurden 2,5·108 Zellen in der gewünschten Menge frischem Medium
aufgenommen und mit einer MOI (multiplicity of infection) von 3 infiziert. Nach dreitägiger
Kultivierung in Fährenbach-Kolben bei 27°C wurden die Zellen bei 2500 g für 10 Minuten
abzentrifugiert und bei -20°C eingefroren.
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 45
3.4 Proteinchemische Methoden
3.4.1 Analytische Expression rekombinanter Plasmide
Zur Bestimmung optimaler Expressionsbedingungen und des Anteils an löslichem
rekombinantem Protein wurden Proteinpräparationen zunächst in analytischem Maßstab
durchgeführt.
20 ml Expressionskulturen wurden mit 200 µl einer über Nacht Kultur angeimpft und bis zum
Induktionszeitpunkt bei 37 °C und 180 rpm kultiviert. Variiert wurden der
Induktionszeitpunkt, die Konzentration des Induktors (0,05 mM, 0,1 mM und 1 mM IPTG)
und die Temperatur (20-37 °C). In gewissen Zeitintervallen (3h, 6h und über Nacht) wurden
je zwei 1 ml Proben entnommen. Eine Probe diente dazu, nach Sedimentation der Zellen eine
SDS-PAGE zur Kontrolle des Genexpressionsmusters durchzuführen. Mit der anderen Probe
wurde ein analytischer Zellaufschluss durchgeführt, der der Bestimmung des löslichen Anteils
an rekombinantem Protein mittels SDS-PAGE dienen sollte.
3.4.2 Analytischer Aufschluss von Bakterienzellen
Der analytische Aufschluss von Bakterienzellen erfolgte, im Gegensatz zum präparativen,
mittels Blockbuster-Kit der Firma Novagen.
3.4.3 Präparative Expression rekombinanter Proteine
10 bis 20 l TB-Medium, mit dem entsprechenden Antibiotikum versehen (Ampicillin 100
mg/l), wurden mit einer über Nacht gewachsenen Vorkultur (100-300 ml) im Verhältnis 1:100
angeimpft und im Schüttler bis zum Induktionspunkt (meist eine OD600 von 0,5-0,8) bei 37 °C
und 180 rpm inkubiert. Nach der Induktion mit der in der analytischen Expression bestimmten
IPTG-Konzentration (meist 200 µM), wurde die Temperatur auf die optimale Temperatur
eingestellt. Nach Abschluss der Inkubation (meist über Nacht) wurden die Zellen 20 Minuten
bei 5000 rpm in einer Zentrifuge mit Ausschwingrotor zentrifugiert und dann in Waschpuffer
(30 mM Tris pH 7,5) resuspendiert. Die Zellen wurden dann 20 Minuten bei 8000 rpm
abzentrifugiert und pro Gramm Zellen in 3 ml Standardpuffer gründlich resuspendiert. Zur
Verbesserung des Aufschlusses wurden die Zellen bei -20 °C eingefroren. Der präparative
Aufschluss der Zellen erfolgte mittels Microfluidizer wie nachfolgend beschrieben.
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 46
3.4.4 Präparativer Aufschluss von Bakterienzellen
Die Suspension der rekombinanten E. coli-Zellen wurde über Nacht bei 4 °C aufgetaut und
mit Proteinaseinhibitoren 1:1000 (v/v) aus den entsprechenden Stammlösungen versetzt. Der
Aufschluss der Bakterienzellen erfolgte mittels Microfluidizer. Dabei werden die Zellen mit
etwa 700 kPa durch eine Kapillare gepresst. Durch die entstehenden hohen Scherkräfte
brechen die Zellen auf. Dieser Vorgang wurde einmal wiederholt, um einen möglichst
vollständigen Aufschluss zu gewährleisten.
Zur Abtrennung unlöslicher Proteine und höhermolekularer Zellbestandteile wurde 60
Minuten bei 40000 bis 100000 g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig
dekantiert und das Sediment verworfen.
3.4.5 Präparativer und analytischer Aufschluss von Insektenzellen
Zur Isolierung von Proteinen aus Sf21-Zellen wurde das Zellsediment (aus 10 ml – 2 l Kultur)
zunächst 1 ml PBS-Puffer pro Gramm Zellen resuspendiert. Die Zellsuspension wurde durch
Ultraschallbehandlung im Eisbad aufgeschlossen. Die Behandlung erfolgte dreimal für je 10
Sekunden (Mikrospitze; Stufe 5). Nach dem Aufschluss wurde NaCl aus einer 5 M
Stammlösung bis zu einer Konzentration von 500 mM zugegeben. Dann wurde das Lysat für
45 Minuten bei 40000 g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig dekantiert und
das Sediment verworfen.
3.4.6 Affinitätschromatographie
Die Reinigung von Proteinen mittels Affinitätschromatographie beruht auf der selektiven
hochaffinen Interaktion zwischen auf der Matrix der Säule fixierten Molekülen und einem
sogenannten tag am Protein. Die anderen Proteine, die im Lysat enthalten sind, haben keine
oder eine nur geringe Affinität für den matrixfixierten Liganden, so dass sie durch
Waschschritte mit Puffer eluiert werden können. Das aufzureinigende Protein kann
anschließend unter geeigneten Pufferbedingungen von der Affinitätsmatrix eluiert werden.
Der Vorteil dieser Methode ist die sehr hohe Spezifität, da aufgrund biochemischer
Eigenschaften und nicht nach chemisch-physikalischen Unterschieden (Masse, Ladung, etc.)
getrennt wird.
Die am häufigsten verwandten Systeme sind das GST Gene Fusion System von Amersham
Pharmacia und das QIAexpress System von Qiagen.
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 47
3.4.6.1 GST Gene Fusion System
Bei diesem System wird das aufzureinigende Protein in einen pGEX-Vektor kloniert und so
als Fusionsprotein mit einem N-terminalen GST-Anker, der Glutathion-S-Transferase (aus
Schistosoma japonicum) exprimiert. Bei der Reinigung wird der Proteinüberstand auf die mit
Standard I-Puffer äquilibrierte Glutathion-Sephadex-Säule (GSH Sepharose 4B, GSH
FastFlow-Sepharose 4B, Pharmacia) aufgetragen und bis zur Rückkehr auf eine konstante
Basislinie (OD280) mit Standard I-Puffer gewaschen. Um unspezifisch bindende Proteine
abzutrennen wurde anschließend mit Hochsalzpuffer (Standard I-Puffer mit 500 mM
Natriumchlorid) gewaschen bis die Basislinie wieder erreicht war. Dann wurde nochmals mit
Standard I-Puffer gespült.
Die Elution des an die Affinitätsmatrix gebundenen Proteins erfolgte mit Glutathion-Puffer
(Standard I-Puffer mit 20 mM Glutathion, reduziert, pH 7,5). Die erhaltenen 5 ml Fraktionen
wurden anhand des Elutionsdiagramms vereinigt. Zur Kontrolle wurde das vereinigte Eluat
auf einem SDS-Gel analysiert.
3.4.6.2 QIAexpress System
Das QIAexpress System mit seinen pQE-Plasmidvektoren verwendet einen sogenannten 6-
fachen His-tag, der aus 6 Histidin-Resten besteht und sowohl am carboxyterminalen als auch
am aminoterminalen Ende des Proteins exprimiert werden kann. Als Affinitätsmatrix dient
hier eine Sephadex-Säule, an die Nickel-Nitriloessigsäure (Nickel-NTA) gekoppelt wurde.
Nitriloessigsäure komplexiert das Ni2+-Ion, lässt aber noch Bindungsstellen frei, an die dann
der Histidin-Anker des Fusionsproteins binden kann. Die Elution erfolgt über einen
Imidazolgradienten nach dem Konkurrenzprinzip, analog zur GSH-Elution beim GST-
Fusionssystem.
3.4.7 Ionenaustauscherchromatographie
Die Ionenaustauscherchromatographie ist wie die Gelfiltration eine Methode, die sich
physikalische Eigenschaften der Proteine – in diesem Fall Ladung – zunutze macht, um eine
Trennung zu erreichen. An das geladene Trägermaterial absorbieren die verschiedenen
Proteinmoleküle, abhängig von ihrer Ladung, mehr oder weniger gut und können durch das
Anlegen eines Gradienten, der nach und nach die Ionenstärke des Puffers durch Steigern der
Salzkonzentration (0-500 mM NaCl) erhöht, fraktioniert eluiert werden. Mit den gesammelten
Fraktionen wurde analog zur Affinitätschromatographie (3.4.6) verfahren.
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 48
3.4.8 Gelfiltration
Das Prinzip der Gelfiltration beruht im Gegensatz zur Affinitätschromatographie auf physiko-
chemischen Unterschieden, hier der Molekülgröße. In das hochporöse Säulenmaterial können
bevorzugt kleine Moleküle eindringen, denen damit annähernd das gesamte Säulenvolumen
zur Verfügung steht. Große Moleküle hingegen verbleiben im Ausschlussvolumen und
passieren die Säule schneller. Diesen Effekt bezeichnet man auch als Molekularsiebeffekt.
Bedingt durch die Größenunterschiede wird das Volumen, das zur Diffusion zur Verfügung
steht, limitiert. Die Moleküle eluieren somit in der Reihenfolge abnehmender molekularer
Masse. Über eine Kalibrierung der Säule mit Proteinen bekannter Größe lassen sich so die
Größen der eluierten Proteine über das Elutionsvolumen abschätzen. Folglich kann die
Gelfiltration auch als analytische Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-
Interaktionen eingesetzt werden. Ein hinreichend affiner Proteinkomplex kann über das
Elutionsvolumen und damit über sein Molekulargewicht von seinen einzelnen Untereinheiten
unterschieden werden.
Die Porengröße des Säulenmaterials definiert die Größe der auftrennbaren Proteine. Hier
wurden Sephadex S75- und Sephadex S200-Säulen (Pharmacia) verwendet. Proteine mit
einen Molekulargewicht über 75 beziehungsweise 200 kDa werden nicht mehr aufgetrennt, da
sie im Ausschlussvolumen eluieren.
Die Gelfiltrationssäulen wurden mit mindestens einem Säulenvolumen Kristallisationspuffer I
äquilibriert. Nach dem Probenauftrag wurde dann mit demselben Puffer eluiert und
fraktioniert gesammelt. Die für die Gelfiltration verwendeten Puffer wurden filtriert und
entgast.
3.4.9 Protease-Verdau von GST-/6xHis-Fusionsproteinen
Zur Abtrennung des GST- bzw. 6xHis-Anteils vom Fusionsprotein wurde das Protein meist
über Nacht bei 4 °C mit einer spezifischen Protease behandelt. Es wurden pro Milligramm
Fusionsprotein etwa 1 Einheit (unit) Thrombin bzw. 4 µg TEV-Protease verwendet. Die
Abtrennung des GST/6xHis erfolgte dann durch einen weiteren Reinigungsschritt, der
entweder aus einer Gelfiltration oder einer Nickel-NTA-Säule bestand.
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 49
3.4.10 Ultrafiltration zur Konzentrierung
Die nach den Reinigungsschritten erhaltene Proteinlösung wurde aufkonzentriert, entweder
um sie konzentriert in einen weiteren Reinigungsschritt einzusetzen oder um sie zur
dauerhaften Lagerung einzufrieren.
Für eine relativ schonende Konzentrierung des Proteins wurde das Vivaspin-System
(Vivascience) verwendet. Es basiert darauf, dass die Proteinlösung durch Zentrifugation durch
eine Membran mit definierter Porengröße gepresst wird. Die Membran ist für das
Lösungsmittel und niedermolekulare Substanzen permeabel, während das Protein
zurückgehalten wird. Es wurden Vivaspin-Membranen mit Ausschlussgrößen von 5000,
10000 und 30000 Da (MWCO = molecular weight cut off) verwendet. Zur Konzentrierung
wurde die Proteinlösung in das Reservoirgefäss gefüllt und dann in einer Hettich-
Tischzentrifuge bei 4000g und 4 °C so lange zentrifugiert, bis die gewünschte
Endkonzentration erreicht war.
3.4.11 Konzentrationsbestimmung nach Bradford
Die Konzentration von Proteinlösungen wurde nach der Methode von Bradford (1976)
bestimmt. Dabei interagiert der Farbstoff Coomassie Brilliant Blue© G250 mit den
Seitenketten von Arginin, Histidin, Lysin, Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin (Compton
& Jones, 1987) und wird in seiner anionischen Form stabilisiert. Dadurch kommt es zu einer
bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 nach 595 nm.
Für die Konzentrationsbestimmung der Proteinlösung wurden verschiedene Volumina (meist
1 bis 10 µl) der Lösung in 500 µl Coomassie Protein Assay Plus Reagenz (Sigma) gegeben,
gründlich gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion wurde dann
bei 595 nm gegen pures Reagenz bestimmt. Als Proteinstandard zur Kalibrierung diente
bovine serum albumin (BSA).
3.4.12 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Zur analytischen Auftrennung von Proteinen anhand ihres Molekulargewichts wurde die
denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Laemmli, 1970; Shapiro et al., 1967)
mit einem diskontinuierlichen Puffersystem verwendet.
Die durch den Probenpuffer geschaffenen denaturierenden Bedingungen führen zur
Auflösung von Sekundär-, Tertiär- und Quartärstrukturen, so dass die Proteine als ellipsoide
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 50
Strukturen vorliegen. Im Puffer ist das Detergenz Sodiumdodecylsulfat (SDS) enthalten und
durch seine Bindung (etwa ein Molekül SDS pro zwei Aminosäurereste) werden die intra-
und intermolekularen Wechselwirkungen zerstört. Das ebenfalls enthaltene β-
Mercaptoethanol (alternativ DTE/DTT) bewirkt die reduktive Spaltung von
Disulfidbrückenbindungen. Aufgrund der negativen Ladung der Kopfgruppe des SDS-
Moleküls wird die Eigenladung des Proteins maskiert und führt so zu einem nahezu
konstanten Verhältnis von Ladung zu Molekulargewicht. Die Auftrennung einer Proteinprobe
auf einem Polyacrylamidgel mit definierter Porengröße erfolgt durch den Molekularsiebeffekt
des Gels. Die relativen Mobilitäten der Proteine sind umgekehrt proportional zum
Logarithmus des Molekulargewichts.
Um die Proteinprobe konzentriert, als dünne Bande, auf das Trenngel aufzugeben, wurde dem
Trenngel ein grobporigeres Sammelgel vorgeschaltet (sogenannte diskontinuierliche SDS-
PAGE). Das Prinzip der Bandenschärfung beruht auf der Anwesenheit von Leit- und
Folgeionen im Puffer (Pingoud & Urbanke, 1997). Als Folgeion fungiert das negativ geladene
Glycinat, das aufgrund des pH-Wertes (pH 6,8) im Gleichgewicht mit Glycin vorliegt. Glycin
trägt als Zwitterion keine Nettoladung und hat so eine geringere Mobilität. Als Leition an der
Probenfront dient Chlorid, dicht gefolgt von den SDS-Proteinkomplexen. Zwischen den
getrennten Leit- und Folgeionen erhöht sich die lokale Feldstärke. Dies führt zu einer
Beschleunigung der SDS-Proteinkomplexe und so dicht hinter der Leitionenfront als scharfe,
konzentrierte Bande laufen. Erreicht die Proteinprobe das Trenngel, so verschiebt sich das
Gleichgewicht zwischen Glycin und Glycinat, aufgrund des höheren pH-Werts im Trenngel in
Richtung des negativ geladenen Glycinat. So können die Folgeionen die Proteinbande
überholen.
Polyacrylamidgele wurden durch die Kopolymerisation von Acrylamid und N,N'-Methylen-
Bisacrylamid hergestellt. Die radikalische Kettenreaktion wurde durch Ammoniumperoxi-
disulfat (APS) als Radikalstarter und Tetramethylethylendiamin (TEMED) als Katalysator
initiiert.
Tab. 3.5: Herstellung von Glycin-SDS-Polyacrylamidgelen.
5% Sammelgel 12,5% Trenngel 15% Trenngel
H2O 2,1 ml 1,65 ml 1,14 ml Acrylamidlösung 30 % 0,45 ml 2,1 ml 2,5 ml Trenngelpuffer - 1,25 ml 1,25 ml Sammelgelpuffer 0,84 ml - - 10% (w/v) APS 100 µl 100 µl 100 µl TEMED 10 µl 10 µl 10 µl
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 51
Trenn- und Sammelgel wurden entsprechend der Tabellen 3.5 bzw. 3.6 hergestellt. Das
Trenngel wurde zwischen zwei Glasplatten mit Abstandhaltern gegossen und während der
Polymerisation mit Ethanol überschichtet, um die Ausbildung eines Meniskus zu verhindern
und Luftausschluss zu gewährleisten. Das Ethanol wurde dekantiert und das auspolymerisierte
Trenngel mit dem Sammelgel überschichtet. Zur Ausbildung der Probentaschen wurde ein
Teflonkamm zwischen den Glasplatten positioniert.
Die Proteinproben wurden mit 1/4 des Probenvolumens 5-fach Probenpuffer versetzt und vor
dem Auftragen fünf Minuten bei 95 °C gekocht. Die Elektrophorese erfolgte bei konstanter
Stromstärke mit 34 mA.
Die SDS-Gelelektrophorese nach Schägger & von Jagow (1987), stellt eine Variante, der
oben beschriebenen SDS-PAGE dar. Sie kennzeichnet sich vor allem durch ein größeres
Auflösungsvermögen im Bereich bis 20 kDa Proteingröße, und verwendet neben Glycerin
und Tricin auch ein spezielles Puffersystem aus Anoden- bzw. Kathodenpuffer.
Zur Färbung des Gels wurde es in eine Färbelösung bestehend aus Coomassie Brilliant Blue
G250 und R250, Ethanol und Essigsäure überführt. Die Kontrastierung erfolgte mit einer
Mischung aus Ethanol und Essigsäure oder alternativ mit Wasser.
3.4.13 Western Blot
Unter Blotting versteht man den elektrophoretischen Transfer von Proteinen von einem Gel
auf eine Membran. Der Transfer von zuvor elektrophoretisch aufgetrennten Proteinen auf eine
Membran wird als Western Blot bezeichnet und erlaubt spezifische Nachweisreaktionen von
auf der Membran immobilisierten Proteinen.
Der Transfer wird nach dem Elektroblot-Verfahren in einer Halbtrockenzelle (semi-dry)
druchgeführt. Auf die Anodenplatte werden zunächst zwei in Anodenpuffer getränkte
Tab. 3.6: Herstellung von Tricin-SDS-Polyacrylamidgelen.
5% Sammelgel 10% Trenngel 16% Trenngel
H2O 7,76 ml 5 ml 1,9 ml Acrylamidlösung 30 % 1,24 ml 5,2 ml 8,3 ml Tricin-Gelpuffer 3 ml 6,7 ml 6,7 ml Glycerin 100 % - 3,1 ml 3,1 ml 10% (w/v) APS 100 µl 100 µl 100 µl TEMED 10 µl 10 µl 10 µl
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 52
Whatman-Papiere, dann die durch Methanol aktivierte PVDF-Membran und schließlich das
Gel gelegt. Darauf plaziert man dann zwei weitere, diesmal allerdings in Kathodenpuffer
getränkte, Whatman-Papiere. Die abschließende Kathodenplatte wird während der Blotting-
Prozedur mit Eis gekühlt. Das Blotting erfolgt für ein Gel bei 300 mA für 15 Minuten.
Danach wird die Membran kurz in Färbelösung geschwenkt und dann 5 Minuten in Entfärber
gewaschen, bis klare Proteinbanden zu erkennen sind. Die Markerbanden und die einzelnen
Spuren werden mit Kugelschreiber auf der Membran markiert. Die Membran wird
anschließend in TBST-Puffer entfärbt.
Nach dem Transfer von Proteinen aus einem Polyacrylamid-Gel auf eine PVDF-Membran
können diese selektiv durch Antigen-spezifische Antikörper immunologisch nachgewiesen
werden. Der spezifische Nachweis rekombinanter Proteine erfolgt durch Antikörper, die
gegen ein Epitop der entsprechenden Proteine gerichtet sind. Für die Detektion nach der
ECL™-Methode wird der primäre Antikörper von einem sekundären Antikörper erkannt und
gebunden, welcher kovalent an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt ist. Das Vorhandensein
eines bestimmten Proteins wird also indirekt durch die enzymatische Aktivität eines Enzyms
sichtbar gemacht.
Unspezifische Bindungsstellen auf der Membran werden zunächst durch Inkubation mit
Blockierlösung (4% Magermilchpulver in TBST-Puffer) für mindestens eine Stunde
abgesättigt. Alle Inkubationen werden auf einem Schüttler bei Raumtemperatur durchgeführt.
Es folgt die einstündige Inkubation mit dem Erst-Antikörper, der in TBST-Puffer mit 0,4%
Magermilchpulver entsprechend verdünnt wird. Danach wird dreimal mit TBST gewaschen
und es erfolgt analog zum Erst-Antikörper die Inkubation mit dem Zweit-Antikörper.
Abschließend wird die Membran dreimal für 10 Minuten mit TBST-Puffer gewaschen.
Zur Visualisierung der Proteinbanden wird das ECL™-Chemolumineszenz-Substrat benutzt.
Dabei wird ein zyklisches Diacylhydrazid (Luminol) mit Wasserstoffperoxid durch die an den
Sekundär-Antikörper gekoppelte Peroxidase oxidiert. Das Reaktionsprodukt befindet sich in
einem elektronisch angeregten Zustand und gibt seine Energie durch Aussendung von Licht
wieder ab. Diese Chemolumineszenz wird dabei durch die Anwesenheit von sogenannten
Enhancer-Molekülen verstärkt. Das Maximum der Lichtemission liegt bei 428 nm und kann
mit kurzen Expositionszeiten zur Belichtung von hochsensitiven Röntgenfilmen benutzt
werden.
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 53
3.4.14 Umkehrphasen HPLC
HPLC-Analysen wurden zur relativen und absoluten Bestimmung der Nukleotidkonzentration
von Lösungen sowie zur Unterscheidung von unterschiedlichen Nukleotidderivaten
verwendet.
Die Probenauftrennung bei der Umkehrphasen (Reversed phase) HPLC erfolgte isokratisch
unter Ionenpaarbindung (Tucker et al., 1986). Die positiv geladenen Tetrabutylammonium
(TBA)-Ionen binden an die negativ geladenen Phosphatgruppen. Der hydrophobe Acylanteil
der TBA-Ionen interagiert mit der stationären ODS Hypersil C18 Matrix der Trennsäule.
Unter diesen Bedingungen nimmt die Retentionszeit mit steigender Anzahl an
Phosphatgruppen zu. Eventuell in der Probe enthaltene Proteine wurden über eine Nucleosil
100-C18-Vorsäule (Bischoff, Leonberg) entfernt.
Die Nukleotidkonzentration kann über den molaren Extinktionskoeffizienten
( ( ) 11254 16700 −− ⋅⋅⋅= cmmollGXPε , ( ) 11
254 22000 −− ⋅⋅⋅= cmmollGXPε ) nach dem Lambert-
Beer'schen-Gesetz aus der Absorption bei λ = 254 nm berechnet werden. Durch Kalibrierung
des HPLC-Durchflussphotometers mit Proben bekannter Konzentration und
Zusammensetzung können sowohl die Zusammensetzung als auch die Nukleotidkonzentration
bestimmt werden.
Über eine Variation der Acetonitrilkonzentration der mobilen Phase (7,5 bis 25%) kann bei
einer Flussgeschwindigkeit von 1,8 ml/min die Retentionszeiten der Nukleotide verändert
werden.
3.4.15 Nukleotidaustausch
Um Proteine quantitativ mit verschiedenen Nukleotiden zu beladen, müssen sie zunächst vom
gebundenen Nukleotid, in der Regel GDP, befreit werden. Die Nukleotidbefreiung erfolgt in
zwei Schritten in einem speziellen Austauschpuffer (3.1.4), in welchem die
Nukleotidaustauschrate erhöht ist. Im ersten Schritt wird ein Nukleotidanalog, GppCH2p oder
GppNHp, in etwa 1,2-2fachem Überschuß zugegeben. Durch die Zugabe von Alkalischer
Phosphatase (5U/mg Protein) wird freies GDP zu GMP hydrolysiert, während
GppCH2p/GppNHp aufgrund der Methylen- bzw. Imido-β-γ-Verknüpfung nicht hydrolysiert
werden können. Der Ansatz wird bei 4°C inkubiert und die Hydrolyse von GDP zu GMP
mittels HPLC verfolgt. GppCH2p/GppNHp binden mit wesentlich höherer Affinität an das
GTP-bindende Protein als GMP, so dass letztlich das gesamte Protein GppCH2p/GppNHp
gebunden vorliegt. Das Protein kann in diesem Zustand über eine kleine Gelfiltration von dem
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 54
Austauschpuffer und Nukleotidresten befreit werden, was allerdings nur nötig ist, wenn man
mit dem GppCH2p/GppNHp-gebundenem Protein weiterarbeiten möchte. Die Reaktion ist bis
hier vor allem für den Austausch zu dem nicht hydrolysierbaren GTP-Analog GppNHp von
Bedeutung.
Für die eigentliche Nukleotidbefreiung ist ein zweiter Schritt nötig, in welchem dann das
GppCH2p mittels Phosphodiesterase hydrolysiert wird. Der Abbau kann auch hier mittels
HPLC verfolgt werden. Das nukleotidfreie Protein kann mit einem beliebigen (auch
fluoreszenzmarkierten) Nukleotid beladen werden, indem dieses im 1.2-1.5fachen Überschuß
zu der GTPase gegeben wird. Nach einer kurzen Inkubationsphase wird ungebundenes
Nukleotid durch eine weitere Gelfiltration über eine NAP® 5-Säule (Pharmacia) abgetrennt.
Die Konzentration an aktivem, nukleotidgebundenem Protein wird wie beschrieben mittels
HPLC (3.4.14) bestimmt.
3.4.16 GTPase Pulldown Assay
Die GTPase-bindenden Domänen von Rho-Effektoren binden mit sehr hoher Affinität und
Spezifität an die zugehörigen aktiven GTPasen. Diese Eigenschaft kann man sich zunutze
machen, um festzustellen, ob und wieviel eines isolierten Proteins in aktiver Form vorliegt.
Zusätzlich kann damit auch überprüft werden, ob eine GTPase in GDP-, GppNHp, oder
nukleotidfreier Form an einen bestimmten Bindungspartner bindet. Mit GST (Glutathion S-
Transferase) fusionierte GTPase-bindende Domänen des entsprechenden Bindungspartners
werden dazu an GSH-Sepharose-Material (Amersham, Pharmacia) gekoppelt. Dazu wird die
in Ethanol gelagerte Sepharose dreimal mit Meßpuffer gewaschen und anschließend mit der
entsprechenden Proteinlösung versetzt. Nach 30 Minuten Inkubation bei 4°C auf einem
Rotator wird der Überstand abgenommen und die Sepharose erneut dreimal mit Puffer
gewaschen. Anschließend werden 110 µl des Gel-Materials mit der entsprechenden GTPase
(in bereits gereinigter und mit dem gewüschten Nukleotid beladender Form) oder
präpariertem Zelllysat versetzt und erneut 30 Minuten bei 4°C auf einem Rotator inkubiert.
Anschließend wird die Sepharose kurz anzentrifugiert, der Überstand abgenommen und
dreimal mit Puffer gewaschen. Im letzten Schritt wird der Überstand abgenommen und
verworfen, während das Matrixmaterial mit Elutionspuffer (Messpuffer mit 20 mM
Glutathion) oder direkt mit SDS-Probenpuffer versetzt wird. Zu dem Eluat wird danach, falls
noch nicht geschehen, SDS-Probenpuffer gegeben, die Probe einige Minuten bei 95°C
inkubiert und danach mittels SDS-PAGE (3.4.12) oder Western Blot (3.4.13) analysiert.
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 55
3.4.17 Gelelektrophorese nativer Proteine
Die Gelelektrophorese nativer Proteine wurde in dieser Arbeit dazu verwendet Protei-Protein
Interaktionen nachzuweisen. Da Proteine unter alkalischen Bedingungen vornehmlich negativ
geladen sind, wandern sie in einem Polyacrylamidgel mit definierter Porengröße auf der Basis
ihrer Eigenladung und des Molekularsiebeffekts. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist dabei
abhängig von der Ladung, der Porengröße des Gels, der Proteinstruktur und dem
Molekulargewicht des Proteins. Der Nachweis der Proteininteraktion erfolgt dann durch
Vergleich der Laufweiten der Einzelproteine und des Komplexes.
Trenn- und Sammelgel wurden entsprechend der Tabelle 3.7 hergestellt. Das Trenngel wurde
zwischen zwei Glasplatten mit Abstandhaltern gegossen und während der Polymerisation mit
Ethanol überschichtet, um die Ausbildung eines Meniskus zu verhindern und Luftausschluss
zu gewährleisten. Das Ethanol wurde dekantiert und das auspolymerisierte Trenngel mit dem
Sammelgel überschichtet. Zur Ausbildung der Probentaschen wurde ein Teflonkamm
zwischen den Glasplatten positioniert.
3 µg der Proteinproben wurden in 10 µl des Probenpuffers (30 % Glycerol, 0,25 %
Bromphenolblau) aufgenommen in die Taschen aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte bei
konstanter Spannung mit 100 V bei 4°C. Die Färbung der nativen Gele erfolgte entsprechend
der von denaturierenden Gelen.
Tab. 3.7: Herstellung von Polyacrylamidgelen für die native Gelelektrophorese.
3 % Sammelgel 10 % Trenngel
H2O 2,0 ml 0,2 ml Acrylamidlösung 30 % 0,5 ml 3,3 ml Tris-pH8,8 - 3,0 ml Sucrose 50 % 2,5 ml 3,4 ml 10% (w/v) APS 100 µl 100 µl TEMED 10 µl 10 µl
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 56
(Gl. 3.2)
3.5 Biophysikalische Methoden
3.5.1 Massenspektrometrie
Massenspektren von Proteinen zur Bestimmung des Molekulargewichts wurden an einem
Elektrospray Ionisations LCQ Massenspektrometer (ESI-MS, Finnigan, San Jose, CA, USA)
mit Nano-Elektrospray Ionenquelle aufgenommen. Die Proteinlösung wurde in MeOH/H2O
1:1 (v/v) und 5% Ameisensäure aufgenommen. Das Verdampfen der Probe erfolgte aus einer
goldbeschichteten Quartzkapillare mit 1 µm Durchmesser an der Spitze (Wilm & Mann,
1996). Zur Dekonvolution des Spektrums wurde folgende Beziehung verwendet:
zzmzMW −⋅=
3.5.2 Fluoreszenzspektroskopische Methoden
Moleküle sind, abhängig von ihrer elektronischen Struktur, in der Lage Lichtquanten zu
absorbieren. Durch Licht einer bestimmten Wellenlänge und den enthaltenen Energiebetrag
werden Elektronen vom Grundzustand auf ein höheres Energieniveau gehoben. Durch das
Zurückfallen in den Zustand niedrigerer Energie wird die Energiedifferenz in Form von
Wärme und Strahlung wieder frei. Das elektronisch angeregte Molekül verliert einen Teil
seiner Energie durch Translation, Rotation und Vibration, bevor es in den Grundzustand
zurückkehrt. Aus diesem Grund ist die Strahlung, die dabei abgegeben wird, energieärmer
und damit langwelliger, als die Anregungswellenlänge. Die Strahlungsemission wird als
Fluoreszenz bezeichnet.
Die Fluoreszenz eines Moleküls ist eine Funktion der Umgebung. Die Polarität der
Umgebung hat Einfluß auf die Fluoreszenzintensität, weil strahlungslose Übergänge, das
sogenannte „Quenching“, unterschiedlich stark begünstigt oder verhindert werden. Dabei wird
die Energie strahlungslos in Form von Translations-, Schwingungs- und Rotationsenergie auf
die molekulare Umgebung des angeregten Moleküls übertragen. Die Wellenlänge wird durch
diesen Prozeß kaum verschoben.
Damit ermöglicht die Fluoreszenzspektroskopie die zeitaufgelöste Messung von
Polaritätsänderungen in der Umgebung des Fluorophors. Aus diesem Grund kann die
Methode für kinetische Messungen verwendet werden, wenn sich die Fluorophorumgebung
im Laufe der Reaktion genügend ändert.
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Um die Nukleotidassoziation bzw. –dissoziation bestimmter GTPasen zeitaufgelöst verfolgen
zu können, werden in dieser Arbeit Nukleotidanaloga verwendet, die mit fluoreszierenden
Gruppen modifiziert sind. Diese werden durch Nukleotidaustausch an die jeweilige GTPase
gebunden (3.3.10). In diesem Fall werden mant- oder tamra-modifizierte Nukleotide
verwendet, welche kovalent an die 2‘ bzw. 3‘-Position der Ribose gebunden ist.
O N
OHO
O
N
N
NH
NH2
O
PO
O-OPO
O-
OP-OO-
O
CONH CH3
Die Messungen werden alle in entgastem und steril filtriertem Messpuffer bei 20 bzw. 25°C
durchgeführt. Eingesetzte Proteinlösungen werden zentrifugiert, um Schwebepartikel zu
entfernen, und vor Gebrauch entsprechend verdünnt.
3.5.2.1 Bestimmung langsamer Reaktionskinetiken
Fluoreszenzemissionsspektren langsamer Reaktionen (>1000 sec) werden im
Fluoreszenzspektrometer (Perkin-Elmer LS50B) gemessen. Konstante Meßparameter sind die
Exzitations- und Emissionswellenlänge, die auf 366 und 450 nm eingestellt sind, während die
Schlitzbreiten je nach Anfangsfluoreszenz variiert werden (Exzitation: 5-15 mm; Emission:
10-20 mm).
Durch den Einsatz eines Küvettenwechslers werden 4 Proben mit je 600µl Küvettenvolumen
simultan in 20 sec-Intervallen gemessen. Die mit fluoreszenzmarkiertem Nukleotid beladene
GTPase wird in einer konzentration von 0,1-0,2 µM vorgelegt und sowohl GEF als auch
nicht-fluoreszenzmarkiertes Nukleotid (sowie alle weiteren verwendeten Komponenten) hinzu
pipettiert.
Die Auswertung der Meßdaten erfolgt mit dem Programm GraFit (Erithacus Software Ltd.).
Abb. 3.1: Struktur von 3‘-O-(N-methyl)-anthranoyl-GTP.
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 58
3.5.2.2 Stopped-Flow-Messungen schneller Reaktionen
Reaktionen, die zeitlich mittels Fluoreszenzspektrometer nicht mehr aufgelöst werden können
(u.a. Nukleotidassoziation an nukleotidfreie GTPasen), werden mit Hilfe einer Stopped-Flow-
Apparatur (Applied Photophysics SX16MV) aufgenommen. Auf diesem Weg kann die
Kinetik von sehr schnellen Reaktionen fluoreszenzspektroskopisch gemessen werden. Das
Prinzip dieser Methode beruht auf der automatischen Injektion zweier Lösungen, welche die
beiden Interaktionspartner enthalten, in eine Meßzelle und dem Aufnehmen des
Fluoreszenzsignals. Die gerätebedingte Totzeit ist bei dem verwendeten Gerät kleiner als 2
Millisekunden. Die Exzitation für mant-modifizierte Nukleotide erfolgt bei 360nm, das
Emissionsignal wird hinter einem Kantenfilter bei Wellenlängen über 408 nm mit einem
Photomultiplier gemessen. Für tamra-modifizierte Nukleotide erfolgt die Exzitation bei 546
nm. Für die Emission werden die Wellenlängen unterhalb von 570 nm mit einem Kantenfilter
abgeschnitten und ebenfalls mittels Photomultiplier detektiert.
Jede Messung wird bei 20°C mindestens dreimal durchgeführt und anschließend über die
mitgelieferte Software (Applied Photophysics-SpectraKinetic Workstation© 1990,1994
v4.099) gemittelt. Die Auswertung erfolgt auch hier mit dem Programm GraFit (Erithacus
Software Ltd.).
3.5.2.3 Graphische Auswertung der Fluoreszenzdaten
Die erhaltenen Daten werden mit Hilfe des Programms GraFit ausgewertet, wobei im Zuge
dieser Arbeit folgende drei mathematische Funktionen zur Anpassung an die Daten
angewandt werden:
(1) Einfach exponentielle Funktion:
y = A . (1 – e–kt) + offset (Gl. 3.3)
(2) Doppelt exponentielle Funktion:
y = A1 . (1 – e–k1t) + A2 . (1 – e–k2t) + offset (Gl. 3.4)
(3) Hyperbolische Funktion:
y = k . c / c + KD (Gl. 3.5)
y = relative Fluoreszenz
t = Zeit in s
A = Amplitude
k = Rate in s-1
A1 = Amplitude 1
A2 = Amplitude 2
k1 = 1. Rate in s-1
k2 = 2. Rate in s-1
y = Rate in s-1
c = Konzentration des Titranden in µM k = Rate der Reaktion aus (1) oder (2)
KD = Gleichgewichtskonstante in µM
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 59
(Gl. 3.6)
(Gl. 3.7)
(Gl. 3.8)
3.5.3 Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)
Kalorimetrische Titrationen wurden an einem Microcal MCS Titrationskalorimeter (Microcal,
Northhampton, MA, USA) durchgeführt. In der Zelle (V0 = 1,4195 mL) wurden 50 µM
Protein vorgelegt und mit einer 500 µM Lösung des Liganden in der Titrationsspritze in 8 µl
Schritten bis zur Sättigung titriert. Die Injektionszeit betrug etwa 2 µl/s, die Integrationszeit 2
s. Nach jeder Injektion wurde 240 s die Rückkehr zur Basislinie abgewartet. Die Integration
der Wärmeänderungen und der Kurvenangleich wurden mit Microcal Origin für die ITC
Version 7 durchgeführt.
Zur Herleitung der für die Auswertung der Daten verwendeten Gleichung wird die
Assoziationsgleichgewichtskonstante K (in M-1) für die Bindung des Liganden L an ein
Enzym E als Funktion des Bindungsgrades ν ausgedrückt:
( ) [ ]LK
⋅−=
νν
1.
Dabei ist [L] die Konzentration an freiem Liganden in M und ν der Anteil der mit Ligand
besetzten Bindungsstellen. Die Massenbilanz für den Liganden lautet dann
[ ] [ ] [ ]00 EnLL ⋅⋅+= ν ,
Wobei [L]0 und [E]0 die Gesamtkonzentrationen des Liganden bzw. Enzyms in M und n die
Anzahl aktiver Bindungsstellen des Enzyms bedeuten. Kombination der Gleichungen 3.6 und
3.7 führt auf Gleichung 3.8
[ ][ ] [ ]
[ ][ ] 011
0
0
00
02 =⋅
+⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛⋅⋅
+⋅
+⋅−En
LEKnEn
Lνν .
Der Wärmeinhalt Q der Lösung in V0 bei Bindungsgrad ν relativ zu ν = 0 ist
[ ] 00 VHEnQ ⋅∆⋅⋅⋅= ν .
(Gl. 3.9)
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 60
Q ist die Wärmemenge in J, ∆H die molare Reaktionsenthalpie der Ligandenbindung in J/mol
und V0 das Messvolumen der Zelle. Lösen von Gleichung 3.8 nach ν und Einsetzen in
Gleichung 3.9 liefert Gleichung 3.10:
[ ] [ ][ ] [ ]
[ ][ ] [ ]
[ ][ ] ⎟⎟
⎟
⎠
⎞
⎜⎜⎜
⎝
⎛
⋅⋅
−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛⋅⋅
+⋅
+−⋅⋅
+⋅
+⋅⋅∆⋅⋅
=0
0
2
00
0
00
000 411112 En
LEKnEn
LEKnEn
LVHEnQ
Durch Anpassen einer Kurve nach Gleichung 3.10 an die gemessenen Wärmemengen kann
die Gleichgewichtsassoziationskonstante K, die molare Bindungswärme ∆H und die Anzahl
aktiver Bindungsstellen n berechnet werden. Bei Kenntnis der Stöchiometrie ist aus n der
Anteil aktiven Enzyms ermittelbar.
3.6 Kristallographische Methoden
3.6.1 Kristallisation
Kristallkeime wachsen nicht innerhalb gesättigter Lösungen. Das System muss dazu
übersättigt sein (sogenanntes Nicht-Gleichgewicht), um die treibende thermodynamische
Kraft für eine Kristallisation zu liefern.
Bei einer langsamen Verdunstung des Lösungsmittels geht die Lösung in einen übersättigten
Zustand über und eine feste Phase (Kristall, Keim) kann entstehen. An diese kann sich dann
das Protein anlagern. Hat sich in einer übersättigten Lösung ein stabiler Keim gebildet wird er
(Gl. 3.10)
Abb. 3.2: Kristallisation und Proteinkonzentration. Kristallwachstum ist nur im Bereich oberhalb der Sättigungskonzentration (durchgezogene Linie) der Proteinlösung möglich. Die Bildung von stabilen Keimen ist nur oberhalb der gestrichelten Linie möglich. Aus McPherson, 1989.
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 61
kontinuierlich weiterwachsen bis der Gleichgewichtszustand wieder erreicht ist. Ein stabiler
Kristallkeim kann als ein molekulares Aggregat angesehen werden, an dessen Oberfläche sich
mehr Moleküle anlagern, als zurück in Lösung gehen. Ideales Kristallwachstum beginnt mit
Keimen, die in der labilen Phase gerade oberhalb der Phasengrenze der metastabilen Phase
(gestrichelte Linie, Abb. 3.2) gebildet werden. Das Kristallwachstum vollzieht sich dann
langsam, und die Lösung geht in die metastabile Phase über, in der keine weiteren Keime
mehr gebildet werden, gebildete Kristalle aber weiterwachsen.
3.6.2 Kristallisation nach der Methode des hängenden Tropfens
Um eine kontrollierte Konzentrierung des Präzipitans und des Proteins zu erhalten wurde in
dieser Arbeit die Methode des hängenden Tropfens (hanging drop method) verwendet (siehe
Abb. 3.3).
Dabei wurden 2 µl der Proteinlösung auf die silikonisierte Oberfläche des Deckglases
aufgebracht und mit 2 µl der Reservoirlösung vermischt. Das Deckglas wurde dann kopfüber
auf eine Vertiefung gelegt, die mit 400 bis 1000 µl der Reservoirlösung gefüllt war. Damit
das Deckglas die Vertiefung luftdicht abschließt, wurden die Ränder mit Vakuumfett
bestrichen. Für die einzelnen Ansätze wurden Linbro-Platten mit 24 Vertiefungen verwendet.
Bei dieser Methode ist die Konzentration an Präzipitans im Reservoir größer als die des
Tropfens, so dass durch Diffusionsvorgänge eine Equilibrierung beider Lösungen stattfindet.
Wasser diffundiert aus dem Tropfen, wodurch sich die Präzipitanskonzentration und die
Proteinkonzentration erhöhen. Dieser Prozess findet solange statt, bis sich ein Gleichgewicht
zwischen Reservoir und Tropfen eingestellt hat. Die resultierende übersättigte Lösung im
Tropfen kann zur Kristallisation des Proteins führen.
Abb. 3.3: Kristallisation nach der Methode des hängenden Tropfens. (modifiziert nach J. Drenth)
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 62
3.6.3 Kristallisation nach der Methode des sitzenden Tropfens
Um initiale Kristallisationsbedingungen zu finden wurde in dieser Arbeit der Mosquito
Kristallisationsroboter (TTP Labtech, UK) verwendet. Verfahrenstechnisch ist hier eine
Kristallisation nach der Methode des sitzenden Tropfens einfacher realisierbar und in
Abbildung 3.4 schematisch dargestellt. Für die einzelnen Ansätze wurden 96-well Platten
benutzt, in deren Vertiefungen die Reservoirösungen manuell vorgelegt wurden. Die
Mischung von 200 nl Proteinlösung mit 200 nl der Reservoirlösung erfolgte dann durch den
Roboter. Anschließend wurde die Platte mit selbstklebender Folie luftdicht verschlossen und
bei der gewünschten Temperatur inkubiert.
3.6.4 Kristallisationsbedingungen
Angesichts der vielen unterschiedlichen Parameter, die die Kristallisation von Proteinen
beeinflussen, werden kommerziell verschiedene Screens angeboten. Diese verwenden
unterschiedliche Konzentrationen an Präzipitantien und Salzen, sowie unterschiedliche Puffer
und pH-Werte. In dieser Arbeit wurden dazu die unter (3.1.11) aufgeführten Screens
verwendet.
3.6.5 Silikonisierung von Deckgläsern
Um eine gute Tropfenform zu erhalten wurden die verwendeten Deckgläser silikonisiert.
Dazu wurden sie zunächst in Wasser und 70% igem Ethanol (v/v) gewaschen. Zum
Silikonisieren wurde eine 1%ige (w/v) Lösung aus AquaSil und Aqua dest. hergestellt. In
dieser Lösung wurden die Deckgläser 72 Stunden inkubiert, danach mit Aqua dest. gründlich
gespült und zum Trocknen ausgelegt.
Abb. 3.4: Kristallisation nach der Methode des sitzenden Tropfens. (modifiziert nach J. Drenth)
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 63
3.6.6 Kristallmontage
3.6.6.1 Verwendung einer Quarzkapillare
Makromolekulare Kristalle bestehen durchschnittlich zu etwa 50% aus Lösungsmittel. Das
restliche Volumen besteht aus dem Protein selbst, so dass der gesamte Kristall als ein
geordnetes Gel mit ausgedehnten Zwischenräumen, in denen Lösungsmittel und kleine
Moleküle frei diffundieren, angesehen werden kann.
Um eine Austrocknung und damit verbundene Zerstörung des Kristalls im Röntgenstrahl zu
verhindern, muss der Verlust des im Kristall enthaltenen Lösungsmittels vermieden werden.
Dazu wurde der Kristall in eine dünnwandige Quarzkapillare überführt und durch absaugen
der Mutterlauge in der direkten Umgebung trocken gelegt. Die beiden Enden füllte man dann,
in einigem Abstand zum Kristall, mit der Mutterlauge, so dass der Kristall zwar trocken liegt,
sich aber in einer Lösungsmittel gesättigten Umgebung befindet. Zum verschließen der
Kapillare wurde Hartwachs verwendet.
Der Kristall wurde unmittelbar vor der Datensammlung auf einem Goniometerkopf im
Schnittpunkt des Röntgenstrahls mit der Rotationsachse montiert.
3.6.6.2 Kristallmontage unter kryogenen Bedingungen
Um eine Strahlenschädigung der Kristalle zu verringern wurden sie in flüssigem Stickstoff
schockgefroren. Dazu mussten sie zunächst in eine cryogene Lösung, bestehend aus
Mutterlauge und einem Gefrierschutzzusatz, überführt werden. Als Zusätze dienten in dieser
Arbeit Glycerol, Sucrose, Xylitol, MPD, PEG400 und Malonat. Für den eigentlichen
Friervorgang wurde dann der Kristall aus der Gefrierschutzlösung in einem passenden Loop
(Hampton Research) aufgenommen und in flüssigen Stickstoff getaucht. Die Lagerung der
Kristalle bis zur Datensammlung erfolgte unter flüssigem Stickstoff (100 K).
3.6.7 Grundlagen der Röntgenstrukturanalyse
Die molekulare Struktur und die Anordnung der Moleküle in der Einheitszelle bestimmen die
Intensitäten der am Kristallgitter gebeugten Strahlen. Der Streuvorgang ist eine Interaktion
zwischen Röntgenstrahlen als elektromagnetische Wellen und den Elektronen der Atome in
den Proteinen. Wenn elektromagnetische Wellen auf ein Elektronensystem einwirken, üben
die elektronischen und magnetischen Komponenten der Wellen eine Kraft auf die Elektronen
aus. Dies bewirkt ein Oszillieren der Elektronen mit der gleichen Frequenz wie die der
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 64
einwirkenden Welle. Die oszillierenden Elektronen wirken wie ''Strahlungsstreuer'' und
senden ihrerseits Strahlung aus, was man als Sekundärwellenbildung bezeichnet. Durch die
Elektronen wird Energie der einwirkenden Welle absorbiert und dann eine neue Welle
emittiert. Die Elektronen eines Atoms können bei der Röntgenstreuung als freie Elektronen
angesehen werden.
Die durch einen Kristall gestreuten Wellen können als Summation einer großen Anzahl von
Einzelwellen angesehen werden. Jede dieser Einzelwellen wird durch Wechselwirkung mit
einem einzelnen Elektron gebildet. Eine Einheitszelle in einem typischen Kristall umfasst
mehrere hunderttausend Elektronen und ein Kristall besteht aus einer großen Anzahl von
Einheitszellen. Die Interferenz zwischen allen vom Röntgenstrahl im Kristallgitter
getroffenen Elektronen führt zu deutlich voneinander getrennten Beugungspunkten (Reflexen)
in bestimmten Richtungen. Jeder dieser Reflexe wird aus der Summe aller positiven
Interferenzen mit gleichem Beugungswinkel gebildet. Dies wird durch die Bragg'sche
Reflexionsbedingung (Bragg, 1913) beschrieben:
λθ ⋅=⋅⋅ nd sin2
Hierbei sind d der Netzebenenabstand im Kristall, λ die Wellenlänge der Röntgenstrahlung, θ
der Glanzwinkel und n die Beugungsordnung.
Nach Bragg kann man sich die Streuung von Röntgenstrahlen als Reflexion der
Röntgenstrahlen an Ebenen im Kristall vorstellen. Die geometrischen Verhältnisse sind in
Abbildung 3.5 dargestellt. Trifft ein einfallender Strahl unter dem Glanzwinkel θ auf eine
Netzebenenschar, so kommt es genau dann zu konstruktiver Interferenz der an den einzelnen
Ebenen gestreuten Strahlen, wenn der Gangunterschied ein ganzzahliges Vielfaches der
Wellenlänge ist. Dies ist der Fall, wenn θ die Bragg'sche Gleichung erfüllt. Unter der
(Gl. 3.11)
Abb. 3.5: Bragg’s Gesetz. Dargestellt sind zwei Gitterebenen, die durch den Abstand d voneinander getrennt sind. Der einfallende und der reflektierte Strahl erzeugen mit der Gitterebene den Winkel θ. (modifiziert nach J. Drenth)
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 65
Voraussetzung, dass die betreffenden Ebenen mit Atomen besetzt sind, erhält man einen
Reflex, der genau diese Netzebenenschar repräsentiert.
3.6.8 Datensammlung
Die erhaltenen Einkristalle wurden zum Testen und zur Datensammlung auf einem
Goniometerkopf im Schnittpunkt des Röntgenstrahls mit der Rotationsachse montiert. Als
Detektor kam ein MAR345 Image Plate System (X-Ray Research GmbH, Norderstedt) zum
Einsatz. Als Röntgenquelle diente eine rotierende FR591 CuKα Anode (Enraf Nonius, Delft,
Niederlande), die mit 10 kV und 20 mA betrieben wird. Die damit erzeugte
monochromatisierte CuKα Röntgenstrahlung besitzt eine Wellenlänge von λ = 1,54179 Å.
Zur Fokussierung des Strahls finden osmische Spiegel (X-Ray Research GmbH, Norderstedt)
Verwendung. Der verwendete Kollimator besaß eine Breite von 0,3 mm.
Hochauflösende Datensätze von nativen und derivatisierten Kristallen wurden an
verschiedenen Synchrotronquellen (ESRF Grenoble, Frankreich bzw. DESY Hamburg)
gesammelt.
Zur Indizierung (Suche nach einem reziproken Gitter) und Integration der Intensitätsdaten
sowie zur Datenreduktion wurde das Programmpaket XDS (Kabsch, 1993) verwendet.
3.6.9 Phasenproblem
Die Elektronendichte eines Moleküls wird durch folgende Gleichung definiert:
[ ]∑ +++−=hkl
hklilzkyhxihklFV
xyz )()(2exp)(1)( απρ
|F(hkl)| entspricht dabei der Strukturfaktoramplitude des Reflexes (hkl), inklusive des
Temperaturfaktors. α(hkl) ist der Phasenwinkel. x, y und z sind die kartesischen Koordinaten
in der Einheitszelle.
Aus dem aus der Messung erhaltenen Streumuster erhält man die Werte der einzelnen
Intensitäten der Reflexe I(hkl). Über die Beziehung
( ) ( ) 2hklFhklI =
können die Amplituden |F(hkl)|, der mit den Millerschen Indizes h, k und l bezeichneten
(Gl. 3.12)
(Gl. 3.13)
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 66
Reflexe bestimmt werden. Aus der Messung erhält man allerdings keine Informationen über
die Phasenwinkel, was gemeinhin auch als Phasenproblem bezeichnet wird. Aus Gleichung
3.12 geht hervor, dass für die Berechnung von Elektronendichtekarten sowohl die
Amplituden, als auch die Phasenwinkel bekannt sein müssen. Anhand dieser Werte lassen
sich dann die Strukturfaktoren berechnen.
Es werden vier verschiedene Techniken angewendet, um die Phaseninformation zu erhalten.
Die erste Methode findet bei kleinen Molekülen Anwendung und basiert auf statistischen
Beziehungen von Intensitätsverteilungen (Hauptmann et al., 1991). Die Gültigkeit dieser
statistischen Beziehungen fällt mit ansteigender Anzahl von Atomen in der Einheitszelle und
ist deshalb für die Phasenbestimmung von Proteinen nicht anwendbar (Karle, 1989).
Zur Anwendung des multiplen isomorphen Ersatzes (MIR) benötigt man Protein, an das eine
kleine Anzahl von Schweratomen (Atome mit einer großen Anzahl von Elektronen)
angelagert sind. Der Intensitätsunterschied für jeden Reflex zwischen dem derivatisierten und
dem nativen Kristall wird dann dazu benutzt, die Schweratompositionen zu bestimmen und
damit die gesuchte Phaseninformation.
Bei der dritten Methode handelt es sich um multiple anomale Wellenlängenstreuung (MAD).
Für diese Methode sind anomal streuende Atome nötig. Die anomale Streuung wird von
Elektronen hervorgerufen, die innerhalb des Kristalls als nicht vollkommen frei betrachtet
werden können und mit den Röntgenstrahlen in Resonanz treten. Dieser Effekt hängt von der
verwendeten Wellenlänge ab. Der Streufaktor f ist folgendermaßen definiert:
( ) ( ) ( ) ( )λλθλθ fifff ′′⋅+′+= o,
wobei f° der normale freie Elektronenstreufaktor ist. f' und f'' sind die anomalen
wellenlängenabhängigen Korrekturen. Der reale Teil der anomalen Streuung, f', ist der
dispersive Teil und der imaginäre Teil, f'', ist der Absorptionsterm und um 90°
phasenverschoben. Die Phaseninformation wird durch die Lokalisation der Atome erhalten,
die durch Variationen ihrer anomalen Streueigenschaften bei verschiedenen Wellenlängen
identifiziert werden. Diese Methode benötigt eine in der Wellenlänge veränderbare
Röntgenquelle (Synchrotronstrahlung).
Der molekulare Ersatz ist die vierte verwendete Methode. Hierbei wird die Ähnlichkeit einer
unbekannten Struktur mit einer bekannten Struktur ausgenutzt. Diese Methode wurde in
dieser Arbeit zur Strukturaufklärung verwendet.
(Gl. 3.14)
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 67
3.6.10 Strukturbestimmung
3.6.10.1 Molekularer Ersatz (MR)
Die zur Berechnung der Elektronendichteverteilung nötige Phaseninformation wurde für die
Proteine Rac1b und TC10 nach der Methode des molekularen Ersatzes (Navaza, 1993)
indirekt bestimmt. Sie kann angewendet werden, wenn die Struktur eines Proteins mit
homologer Aminosäuresequenz bekannt ist. Die Struktur dieses homologen Proteins wird
dann als Ausgangspunkt für das neue Protein verwendet. Die Phasen des kristallisierten
Moleküls werden durch die Phasen des anderen Moleküls angenähert.
Dazu wird ein Suchmodell durch Rotation und Translation in der Einheitszelle des
gemessenen Datensatzes plaziert. Anschließend können mit den gemessenen
Strukturfaktoramplituden und den berechneten Phasen die ersten Elektronendichtekarten
berechnet werden. Die Rotationssuche dient der korrekten Orientierung des Suchmodells im
Kristallgitter. Dies wird durch Vergleich der aus dem Suchmodell und den gemessenen Daten
berechneten Pattersonfunktion erreicht. Pattersonfunktionen sind Karten aller interatomaren
Abstandvektoren, die von einem gemeinsamen Ursprung ausgehen und ohne
Phaseninformation berechnet werden können. Die korrekte relative Orientierung des
Suchmodells führt zu einem Maximum im Produkt der Pattersonfunktionen P1 und P2
(Gleichung 3.15).
( ) ( ) ( )∫ ⋅′⋅=U
dVxPxPCR 21
R(C) ist die Rotationsfunktion, C eine Matrix, die eine Rotation von Molekül x relativ zu x'
definiert und U ist das Volumen, über das integriert wird. Das Integrationsvolumen U wird
durch den Pattersonintegrationsradius definiert. Dieser liegt im Idealfall im Bereich des
Molekülradius, so dass die Pattersonfunktion keine intermolekularen Abstände enthält,
welche das Signal/Rausch-Verhältnis der Rotationsfunktion verschlechtern würden. Die
exakte Lösung des Rotationsproblems ist Voraussetzung für eine eindeutige Lösung des
Translationsproblems. Das Konzept für die Translationsfunktion ist dem der
Rotationsfunktion ähnlich. Hier wird das orientierte Suchmodell in Schritten von etwa 1 Å
durch die Einheitszelle bewegt. An jedem Punkt wird die Korrelation der beobachteten
Intensitäten und der Abstandsvektoren der symmetrieverwandten Moleküle untersucht. An
der richtigen Position sollte die Translationsfunktion Maxima an den Stellen haben, die den
Translationsvektoren zwischen den symmetrieverwandten Molekülen entsprechen. Die Suche
(Gl. 3.15)
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 68
nach einer richtigen Lösung erfolgte in dieser Arbeit mit den Programmen AMoRe (Navaza,
1993), Molrep (CCP4, 1994) und Phaser (CCP4, 1994).
3.6.10.2 Multipler isomorpher Ersatz (MIR)
Um die Methode des multiplen isomorphen Ersatzes anwenden zu können, benötigt man die
Amplitudeninformation des nativen Proteinkristalls und wenigstens eines
Schweratomderivats. Um die Intensitätsdaten zwischen nativen und derivatisierten Kristallen
miteinander vergleichen zu können, müssen diese zunächst relativ zum nativen skaliert
werden. Um ein gutes Signal für die gebundenen Schweratome zu bekommen, ist eine gute
Isomorphie der Kristalle untereinander besonders wichtig. Nicht-Isomorphie zeigt sich häufig
in einer Veränderung der Parameter der Einheitszelle; kann aber auch durch eine leichte
Rotation des Proteins durch die Scweratombindung zustande kommen, ohne eine Änderung
der Zellparameter zu verursachen. Dies kann im Weiteren zu einer schlechten Verfeinerung
der Schweratomparameter führen.
Folgende Schritte sind im allgemeinen Teil des Isomorphen Ersatzes:
1. Herstellung mehrer Schweratom enthaltende Kristalle
2. Sammlung von Intensitätsdaten für den nativen und die derivatisierten Kristalle
3. Anwendung der Patterson Funktion, zur Bestimmung der Schweratompositionen
4. Verfeinerung der Schweratomparameter und anschließende Berechnung der
Proteinphasenwinkel
5. Berechnung der Elektronendichte für das Protein
Nach dem Erhalt von Intensitätsdaten können aus den Amplituden des nativen Kristall PF
und des Derivats PHF die isomorphen Unterschiede iso
F∆ berechnet werden. Verwendet
man diese dann als Koeffizienten zur Berechnung der Pattersonfunktion, so erhält man eine
Differenz-Pattersonkarte:
∑ ++−∆=hkl
isolzkyhxiF
VuvwP ))(2exp()(1)( 2 π
mit PPHisoFFF −=∆ .
Hierbei sind u, v und w die Koordinaten des Pattersonraums, während x, y und z denen des
realen Raums entsprechen. Das Volumen V der Einheitszelle dient der Normierung.
(Gl. 3.16)
(Gl. 3.17)
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 69
Anhand der Harker-Sektionen (Anhäufung von Maxima in bestimmten Ebenen der
Pattersonkarte bedingt durch Symmetrieelemente) der Pattersonkarte können dann die
Positionen der Schweratome berechnet werden. Sind die Positionen der Schweratome einmal
bekannt, so kann die darin enthaltene Information dazu verwendet werden, die Phasenwinkel
des nativen Proteins anzunähern. Dies ist schematisch in den beiden folgenden Abbildungen
dargestellt (Abb. 3.6 und 3.7).
Die Skalierung der Intensitätsdaten der Derivate relativ zum nativen Datensatz erfolgte in
dieser Arbeit durch die Programme FHSCAL und SCALEIT (CCP4, 1994). Die Analyse der
Derivate erfolgte durch eine Vielzahl von Programmen: MLPHARE (CCP4, 1994), FFT
(CCP4, 1994), SHELX (Schneider & Sheldrick, 2002), CNS 1.1 (Brünger et al., 1998) und
SHARP (La Fortelle & Bricogne, 1997). Die Phasenbestimmung erfolgte letztendlich unter
Abb. 3.6: Argand Diagramm für den SIR-Fall. |FP| entspricht der Amplitude des nativen Kristalls und |FPH| der des Derivats. |FH|, der Schweratombeitrag zu den Amplituden von |FPH| kann aus der oben aufgeführten Formel berechnet werden. α sind die zugehörigen Winkel.
Abb. 3.7: Harker Konstruktion für den SIR-Fall.
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 70
Verwendung von SOLVE (Terwilliger & Berendzen, 1999). Die anschließende
Elektronendichtemodifikation erfolgte mit RESOLVE (Terwilliger, 1999).
3.6.11 Modellbau und Strukturverfeinerung
Der abschließende Schritt zum Lösen einer Struktur ist der Modellbau und die
Strukturverfeinerung. Im Allgemeinen sind hier vier verschiedene Parameter pro Atom zu
verfeinern: die Raumkoordinaten x, y und z sowie der Temperaturfaktor B.
Zur Strukturverfeinerung wird eine Energiefunktion E minimiert, die im Wesentlichen aus
einem Kraftfeldterm und einem Term für die Röntgendaten besteht.
rayXKraftfeld EEE −+=
Das Kraftfeld berücksichtigt Van-der-Waals-Abstände, polare und ionische
Wechselwirkungen. Bei dem Prozess der Verfeinerung einer Struktur wird versucht, die
beobachteten und die berechneten Strukturfaktoren unter Erhalt der Stereochemie
anzugleichen.
Durch einen Vergleich der beobachteten und der aus dem Modell berechneten
Strukturfaktoramplituden kann die Qualität des Angleichs abgeschätzt werden (R-Faktor).
Der aus diesem Vergleich berechnete Fehler wird als kristallographischer R-Faktor, Rcryst,
bezeichnet und ist definiert als
( ) ( )
( )∑∑ −
=
hklo
hklco
cryst hklF
hklFhklFR
wobei Fo und Fc die beobachteten beziehungsweise die berechneten Strukturfaktoramplituden
des Reflexes hkl bezeichnen.
Die Zahl der anzugleichenden Parameter übersteigt häufig die Anzahl der Reflexe, so dass das
System unterbestimmt ist und der Angleich des Modells an die Daten zu lokalen, aber
falschen Minima führen kann. Der sogenannte freie R-Faktor, Rfree, wurde deshalb zur
Kontrolle entsprechend zu Rcryst berechnet. Hierfür wurden 5-10% der gemessenen Reflexe
verwendet, die nicht für die Strukturverfeinerung eingesetzt wurden ( Th ⊂ ).
(Gl. 3.18)
(Gl. 3.19)
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 71
( ) ( )
( )∑∑
⊂
⊂
−=
Thklo
Thklco
free hklF
hklFhklFR
Die Konvergenz der Strukturverfeinerung kann über diese Kreuzvalidierung kontrolliert
werden (Brünger, 1992b).
Für die Strukturverfeinerung und Energieminimierung wurde in dieser Arbeit das
Programmpaket CNS Version 1.1 (Brünger et al., 1998) verwendet. Die Interpretation der
Elektronendichtekarten und der Modellbau erfolgte mit dem Programm O (Jones et al., 1991)
an einem Octane Computer (Silicon Graphics, Mountain View, CA, USA).
Sowohl für den Molekularen Ersatz als auch für die initiale Phase der Verfeinerung wurde das
Nukleotid, das Magnesiumion und die Effektorschleifen (Switch I und II) aus dem Modell
entfernt.
Nach einer rigid body-Verfeinerung des Moleküls erfolgte eine simulated annealing
Minimierung. Dies diente dazu den Einfluss des ursprünglichen Modells auf die zu
bestimmende Struktur zu verringern.
Der Einbau der Aminosäuren, des GTP-Nukleotids und des Magnesiumions erfolgte durch
wiederholten Modellbau im Graphikprogramm O und anschließendes simulated annealing
mittels CNS (Brünger et al., 1998). Nach einer Verfeinerung der individuellen B-Faktoren
(bindividual). Der B-Faktor ist ein Maß für die Beweglichkeit eines Moleküls oder Atoms in
einer bestimmten Umgebung. Temperaturänderungen beeinflussen die thermischen
Bewegungen von Atomen, was wiederum die Streuintensitäten beeinflusst. Die thermische
Bewegung von Atomen bewirkt einen Intensitätsabfall um den Faktor ⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ Θ
− 22sinexp
λB ,
wobei 28 −= iuB π der Temperaturfaktor ist und 2−iu die Beweglichkeit des Teilchens i in den
drei Raumrichtungen x, y und z angibt.
Nachdem alle Aminosäuren eingebaut waren wurde eine composite omit map erstellt bei
deren Berechnung eine Anzahl von Aminosäuren des Modells nicht berücksichtigt wird, so
dass die entstehende Elektronendichtekarte ohne Einfluss des Modells ist. Mit dieser Methode
können bei der Interpretation der Elektronendichte unterlaufene Fehler nachträglich entdeckt
und korrigiert werden.
Der Einbau von Wassermolekülen erfolgte automatisiert mit CNS 1.1 (waterpick, Brünger et
al., 1998) oder ArpWarp (Perrakis et al., 1997). Wassermoleküle die den verwendeten
(Gl. 3.20)
METHODEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________ Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 72
Parametern nicht entsprachen, oder deren B-Faktor oberhalb von 80 lag wurden nicht
eingebaut. Jedes einzelne Wassermolekül wurde dann in seiner Position und auf eine
Absättigung der Wasserstoffbrückenbindungen überprüft. Für die letzten Schritte der
Verfeinerung wurde das Programm REFMAC5 (CCP4, 1994) unter Verwendung der TLS-
Option benutzt.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 73
4. Ergebnisse
4.1 GTPasen der Ras- und Rho-Familien
Um die Interaktion des zytoplasmatischen Teils der Plexine mit den GTPasen der Ras- und
der Rho-Familien in vitro zu untersuchen, mussten zunächst verschiedene GTPasen
rekombinant exprimiert und isoliert werden. Abbildung 4.1 gibt einen Überblick über die
verwendeten GTPasen.
4.1.1 Klonierung und Expression von Rho-GTPasen
Für die rekombinante Expression der GTPasen wurden zunächst verschiedene DNA-
Konstrukte aus cDNA oder von vorhandenen Konstrukten mittels PCR (3.2.10), Restriktion
(3.2.6) und Ligation (3.2.9) hergestellt.
Abb. 4.1: Übersicht über die verwendeten GTPasen der Ras- und der Rho-Familien. Die Zahlen geben die N- und C-terminale Aminosäure des verwendeten Fragmentes an.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 74
Protein Vektor Restriktion Menge in mg/10lRnd1 pGEX 4T1 BamHI/XhoI 100Rnd1∆NC pGEX 4T1 BamHI/XhoI 150Rac1∆C (Q61L) pGEX 4T1 BamHI/EcoRI 220
Tab. 4.1: Klonierung und Expression der GTPasen
Die Expression aller verwendeten GTPasen erfolgte unter ähnlichen Bedingungen. Die
Kulturen wurden bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,6 inkubiert und dann durch Zugabe von
0,1-0,3 mM IPTG induziert. Nach einer 10-14 stündigen Inkubation bei 30°C in einem
Schüttelinkubator (150-170 rpm) wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert.
4.1.2 Reinigung der GTPasen
Alle in dieser Arbeit verwendeten GTPasen wurden aufgrund ihrer vergleichbaren
Eigenschaften ähnlich gereinigt. Abbildung 4.2 zeigt den Verlauf der Proteinreinigung
beispielhaft für Rnd1∆NC. Die Expression als GST-Fusionsprotein erfolgte über Nacht in 5 -
20 l Medium bei 30°C. Der Zellaufschluss erfolgte wie unter 3.4.4 beschrieben.
Der erste Reinigungsschritt erfolgte durch eine Affinitätschromatographie (3.4.6). Da der
affinitätschromatographische Schritt häufig keine ausreichende Reinheit des Proteins
gewährleistete, wurde anschließend eine Größenausschlusschromatographie (3.4.8)
durchgeführt.
Alle verwendeten GTPasen konnten mit hohem Reinheitsgrad erhalten werden (Abb. 4.3).
Reinheit und Nukleotidbeladung wurden nach jeder Reinigung mittels SDS-PAGE bzw.
Abb. 4.2: Reinigung von Rnd1∆NC. A) Aufschluss und Reinigung mittels GSH-Sepharose Säule. 1 Gesamtprotein nach Zellaufschluss; 2 Sediment nach Zentrifugation; 3 Überstand nach Zentrifugation; 4 Durchfluss Affinitätschromatographie; 5 Durchfluss Hochsalzwaschschritt; 6 Eluat B) Gelfiltration; Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an.
A) B)
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 75
HPLC analysiert. Rnd1 ist nach der Proteinreinigung, genauso wie die homologen Proteine
Rnd2 und Rnd3, mit GTP beladen und zeigt keine nennenswerte GTP Hydrolyse.
4.2 GTPase bindende Domänen der Plexine (GBD)
Die Bindung von GTPasen der Rho-Familie an die zytoplasmatische Domäne (CPD) der
Plexine wurde im Jahr 2000 erstmals beschrieben (Rohm et al., 2000; Vikis et al., 2000;
Driessens et al., 2000). Die GTPase-bindende Domäne (GBD) konnte auf eine 20 kDa große
zentrale Region der CPD eingegrenzt werden. Im Verlauf dieser Arbeit sollte die Interaktion
der GTPasen mit den GBDs der Plexine bezüglich Spezifität und kinetischer Parameter in
vitro charakterisiert werden. Außerdem wurden die erhaltenen Proteinfragmente für die
Kristallisation eingesetzt. Abbildung 4.4 zeigt die verwendeten Konstrukte.
Abb. 4.4: Übersicht über die verwendeten GTPase-bindenden Domänen der Plexine. Die Zahlen geben die N- und C-terminale Aminosäure des verwendeten Fragmentes an.
Abb. 4.3: Übersicht über die Reinheit der verwendeten GTPasen. 1 RhoA∆C, 2 Rac1, 3 Rac1b∆C, 4 Cdc42, 5 TC10∆C, 6 TC10∆NC, 7 Rnd1∆NC, 8 Rnd3∆NC, 9 H-Ras∆C.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 76
4.2.1 Klonierung und Expression
Um die Interaktion mit den GBDs charakterisieren zu können, mussten diese rekombinant in
E. coli exprimiert werden. Dazu wurden die in Tabelle 4.2 aufgelisteten Konstrukte mittels
PCR (3.2.10), Restriktion (3.2.6) und Ligation (3.2.9) ausgehend von vorhandenen
Konstrukten kloniert.
Protein Vektor Restriktion Menge in mg/10lPlexin A2 GBD pGEX2TTEV BamH1/EcoR1 125Plexin B1 GBD pGEX2TTEV BamH1/EcoR1 440Plexin C1 GBD pGEX2TTEV Nco1/Xho1 240Plexin D1 GBD pGEX2TTEV BamH1/EcoR1 310
Tab. 4.2: Klonierung und Expression der Plexin GBDs
Die Expression der GBDs erfolgte als GST-Fusionsprotein unter ähnlichen Bedingungen. Die
Expressionsbedingungen wurden zunächst durch Variation der Temperatur und der IPTG-
Konzentration optimiert. Die Standardbedingungen erwiesen sich dabei als optimal. Die
Kulturen wurden bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,6 inkubiert und dann durch Zugabe von
0,3 mM IPTG induziert. Nach einer 10-14 stündigen Inkubation bei 30°C in einem
Schüttelinkubator (150-170 rpm) wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert.
4.2.2 Reinigung der GBDs
Die Reinigung der GBDs von PlexinA2, B1, C1 und D1 erfolgte unter vergleichbaren
Bedingungen und ist für PlexinD1-GBD exemplarisch in Abbildung 4.5 dargestellt.
Abb. 4.5: Exemplarische Reinigung von PlexinD1 GBD. A) Aufschluss und Reinigung mittels GSH-Sepharose Säule. 1 Gesamtprotein nach Zellaufschluss; 2 Sediment nach Zentrifugation; 3 Überstand nach Zentrifugation; 4 Durchfluss Affinitätschromatographie; 5 Durchfluss Hochsalzwaschschritt; 6 Eluat; 7 proteolytische Spaltung B) Gelfiltration; Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an.
A) B)
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 77
Die GBDs wurden über den N-terminalen GST-Anteil affinitätschromatographisch gereinigt
(3.4.6). Das Fusionsprotein wurde anschließend proteolytisch durch TEV Protease gespalten.
Da nicht alle bakteriellen Verunreinigungen durch den ersten Reinigungsschritt abtrennbar
waren, wurde als zweiter Reinigungsschritt eine Gelfiltration verwendet. Dadurch konnten
sowohl bakterielle Verunreinigungen als auch ein Teil des GST von den GBDs abgetrennt
werden. Das noch vorhandene GST wurde durch eine weitere GSH-Sepharose-Säule
quantitativ vom zu reinigenden Protein getrennt. Die Reinheit der Proteine war in allen Fällen
größer 95%. Die Stabilität der GBDs von PlexinB1, C1 und D1 war sehr gut, so dass sie mit
guten Ausbeuten erhalten wurden. Die GBD von Plexin A2 hingegen war schon als GST-
Fusionsprotein sehr instabil. Dies konnte während der Proteinkonzentrierung und der
proteolytischen Spaltung beobachtet werden, da hier eine Präzipitation des Proteins erfolgte.
Demzufolge konnten nur geringe Proteinmengen von PlexinA2-GBD erhalten werden, die für
eine vollständige biochemische Charakterisierung nicht ausreichten.
4.2.3 Kristallisation der GBDs
Die GBDs von PlexinB1, C1 und D1 wurden nach der Proteinreinigung auf etwa 20 mg/ml
konzentriert und in Kristallisationpuffer (20 Tris/HCl, pH 7,5 und 2mM DTT) überführt. Die
Kristallisation erfolgte sowohl unter Verwendung der Methode des hängenden als auch des
sitzenden Tropfens. Die unter 3.1.11 aufgeführten Bedingungen wurden unter Variation der
Proteinkonzentration (5 mg/ml, 10 mg/ml und 20 mg/ml) und der Temperatur (4°C, 12°C und
20°C) ausgetestet. So wurden für jedes Protein etwa 3600 mögliche
Kristallisationsbedingungen getestet, von denen keine zu streufähigen Kristallen führte.
Abb. 4.6: Übersicht über die Reinheit der Plexin GBDs. 1 PlexinA2-GBD, 2 PlexinB1-GBD, 3 PlexinC1-GBD, 4 PlexinD1-GBD.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 78
4.2.4 Charakterisierung der GTPase-GBD Bindung
Da bisher die Charakterisierung der GTPase-GBD Interaktion nur durch Pulldown-, Two-
Hybrid- und Overlay-Assays (Rohm et al., 2000; Vikis et al., 2000; Driessens et al., 2000)
erfolgte, war ein Ziel dieser Arbeit die Suche nach einer Methode, die sowohl eine Aussage
bezüglich der Spezifität der Interaktionen als auch eine Quantifizierung der kinetischen
Parameter ermöglichte.
4.2.4.1 Native Gelelektrophorese
Um die Spezifität der Interaktion von mehreren GTPasen mit vielen Bindungspartnern
untersuchen zu können, wurde nach einer einfachen, schnellen und aussagekräftigen Methode
gesucht. Die native Gelelektrophorese (3.4.17) schien in diesem Zusammenhang bestens
geeignet, so dass für die Etablierung der Methode zunächst die Interaktion zwischen Ras und
RafRBD verwendet wurde. Dabei ist eine Interaktion zwischen beiden Molekülen durch eine
Änderung des Laufverhaltens im Vergleich zu den einzelnen Proteinen als Referenz zu
beobachten.
Für die Untersuchung der GTPase-GBD Interaktion wurden die GTPasen RhoA, Rac1, Cdc42
und TC10, jeweils im GppNHp-gebundenen Zustand, mit den GBDs der Plexine A2, B1, C1
und D1 gemischt und für 30 min auf Eis inkubiert. Die sich anschließende elektrophoretische
Trennung erfolgte wie unter 3.4.17 beschrieben (siehe Abb. 4.7, Geltaschen 3, 5, 7 und 9). Als
Referenz dienten hierbei ebenfalls die einzelnen Proteine (siehe Abb. 4.7, Geltaschen 1, 2, 4,
6 und 8). Alle untersuchten Proteine konnten bei dieser Methode verwendet werden, da sie ein
entsprechendes Laufverhalten zeigten. Auffallend war die hohe Laufgeschwindigkeit der
PlexinC1-GBD, die sich deutlich von PlexinA2, B1 und D1-GBD unterschied. Dies kann
durch die hohe negative Nettoladung von -14 erklärt werden. PlexinB1 GBD besitzt zum
Vergleich eine negative Nettoladung von -5.
Für keine der getesteten GTPase-GBD Kombinationen konnte mit dieser Methode eine
Interaktion nachgewiesen werden, obwohl die Positivkontrolle zeigt, dass dies prinzipiell
möglich sein sollte. Ein Grund hierfür könnte eine nur niedrigaffine Bindung zwischen
GTPasen und GBDs sein (5.1.2).
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 79
Um die Methode zu etablieren und um eine Positivkontrolle zu haben, wurde die sehr gut
untersuchte Interaktion zwischen Ras und seinem Effektor RafRBD untersucht. Abbildung
4.8 zeigt die GTP-abhängige Interaktion durch eine Komplexbildung von Ras∆C·GppNHp
und RafRBD und die damit verbundene Änderung des Laufverhaltens. RafRBD ist mit einem
Molekulargewicht von 8 kDa sehr klein und wanderte deshalb in den nativen Gelen zu
schnell, so dass es nur im Komplex mit Ras nachgewiesen werden konnte.
Abb. 4.7: Native Gelelektrophorese von verschiedenen Plexinkonstrukten mit A) RhoA∆C·GppNHp, B) Rac1∆C·GppNHp, C) Cdc42∆C·GppNHp und D) TC10∆C·GppNHp. Die einzelnen Proben sind wie folgt aufgetragen: 1) GTPase, 2) PlexinA2-GBD, 3) PlexinA2-GBD + GTPase, 4) PlexinB1-GBD, 5) PlexinB1-GBD + GTPase, 6) PlexinC1-GBD, 7) PlexinC1-GBD + GTPase, 8) PlexinD1-GBD, 9) PlexinD1-GBD + GTPase, 10) PlexinB1-CPD, 11) PlexinB1-CPD + GTPase, 12) PlexinA2-CPD und 13) PlexinA2-CPD + GTPase.
Abb. 4.8: Native Gelelektrophorese von Ras ∆C mit RafRBD als Positivkontrolle. 1) Ras∆C·GppNHp 2) Ras∆C·GDP 3) RafRBD 4) Ras∆C·GppNHp + RafRBD 5) Ras∆C·GDP + RafRBD.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 80
4.2.4.2 Pulldown Experimente
Pulldown Experimente werden häufig für einen Interaktionsnachweis zwischen Effektoren
und GTPasen eingesetzt. Auch für die GTPase-Plexin Interaktion wurde diese Methode schon
angewendet (Rohm et al., 2000; Vikis et al., 2000; Driessens et al., 2000).
Mittels Pulldown Assay (3.4.16) sollte in dieser Arbeit die Spezifität der Plexin-GTPase
Interaktion untersucht werden. Dazu wurden die PlexinA2, B1, C1 und D1 GBDs als GST-
Fusionsproteine an GSH-Sepharose gebunden und mit den GDP- und GppNHp-gebundenen
GTPasen RhoA, Rac1, Cdc42 und Rnd1 (GTP-gebunden) inkubiert. Nach mehreren
Waschschritten wurden die GST-Fusionsproteine eluiert und mittels SDS-PAGE
elektrophoretisch getrennt (Abb. 4.9). Eine Interaktion zwischen GTPase und Plexin-GBD
sollte durch eine zusätzliche Bande für die GTPase deutlich erkennbar sein, wie die
Positivkontrolle (Cdc42-WaspGBD) in Abbildung 4.10 zeigt.
Die Untersuchung der GTPase-GBD Interaktion ist in Abbildung 4.9 dargestellt. Es konnte
hierbei in keiner der dargestellten Experimente eine Interaktion nachgewiesen werden, so dass
auch diese Methode für eine Spezifitätsbestimmung nicht geeignet erschien (5.1.2).
Abb. 4.9: Pulldown Experimente mit GST-Plexin GBDs (A2, B1, C1 und D1) und RhoA∆C, Rac1∆C, Cdc42∆C und Rnd1∆NC. 1 GST-Plexin GBD; 2 GBD + RhoA·GDP; 3 GBD + RhoA·GppNHp; 4 GBD + Rac1·GDP; 5 GBD + Rac1·GppNHp; 6 GBD + Cdc42·GDP; 7 GBD + Cdc42·GppNHp; 8 GBD + Rnd1·GTP.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 81
4.2.4.3 GDI Assay
Die Bindung eines Effektors an eine GTPase verringert die Nukleotiddissoziation und kann so
als indirekter Interaktionsnachweis verwendet werden kann. Dieser Guaninnukleotid-
Dissoziations-Inhibitions (GDI) Effekt wurde bisher erfolgreich für die Quantifizierung der
Effektorinteraktion mit Ras (Herrmann et al., 1995, 1996), Cdc42 (Rudolph et al., 1998) und
Rac Proteinen (Haeusler et al., 2003; Fiegen et al., 2004) eingesetzt.
Für einen qualitativen Interaktionsnachweis zwischen Rho-GTPasen und Plexin-GBDs
wurden RhoA, Rac1 und Cdc42 mit mant-GppNHp beladen und mit einer Konzentration von
0,2 µM eingesetzt. Der Effekt der Inhibition der Nukleotiddissoziation sollte bei einem 10-
fachen Überschuss der jeweiligen Plexin-GBD (B1, C1 und D1) sichtbar sein. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe eines 50-fachen Überschusses an GppNHp gestartet. Dies führt zu
der Freisetzung des fluoreszenzmarkierten Nukleotids und damit zu einem Intensitätsabfall.
Die für die qualitative Interaktionsbestimmung zwischen RhoA·GppNHp, Rac1·GppNHp und
Cdc42·GppNHp sowie PlexinB1, C1 und D1 GBD als Bindungspartner durchgeführten
Messungen sind in Abbildung 4.11 dargestellt. Es konnte in keiner der Messungen ein
Hinweis auf eine Interaktion gefunden werden (5.1.2).
Abb. 4.10: Pulldown Experiment von Cdc42∆C mit GST-WASp als Positivkontrolle. 1 GST-WASp; 2 GST-WASp + Cdc42∆C·GDP; 3 GST-WASp + Cdc42∆C·GppNHp
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 82
4.2.4.4 Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)
Da nach den zuvor durchgeführten Experimenten vermutet wurde, dass es sich bei der
GTPase-GBD Interaktion um eine niedrigaffine Bindung handelt, wurden ITC-Messungen
durchgeführt. Dazu wurde zunächst eine 500 µM PlexinB1-GBD-Lösung gegen Puffer titriert
(siehe Abb. 4.12). Dabei zeigte sich, was zuvor schon anhand von analytischen Gelfiltrationen
vermutet wurde, dass die PlexinB1-GBD als Dimer vorliegt.
Hierdurch war der Versuchsaufbau für eine Interaktionsbestimmung mit den verschiedenen
Rho-GTPasen vorgegeben. PlexinB1-GBD wurde mit einer Konzentration von 50 µM in der
Messzelle vorgelegt und mit einer 500 µM Lösung der GTPasen titriert. Die so erhaltenen
Zeit (sec)0 20000 40000 60000 80000 100000
rel.
Fluo
resz
enz
0,4
0,6
0,8
1 RhoA mGppNHp
RhoA mGppNHp + Plexin B1 GBD
RhoA mGppNHp + Plexin C1 GBD
RhoA mGppNHp + Plexin D1 GBD
Zeit (sec)0 10000 20000 30000 40000 50000
rel.
Fluo
resz
enz
0,4
0,6
0,8
1 Rac1 mGppNHp
Rac1 mGppNHp + Plexin B1 GBD
Rac1 mGppNHp + Plexin C1 GBD
Rac1 mGppNHp + Plexin D1 GBD
Zeit (sec)0 10000 20000 30000 40000 50000
rel.
Fluo
resz
enz
0,4
0,6
0,8
1 Cdc42 mGppNHp
Cdc42 mGppNHp + Plexin B1 GBD
Cdc42 mGppNHp + Plexin C1 GBD
Cdc42 GppNHp + Plexin D1 GBD
A) B)
C)
Abb. 4.11: GDI Experiment für Plexin GBDs mit RhoA, Rac1 und Cdc42. Die Messungen erfolgten mit 0,2 µM GTPase und einem 10-fachen Überschuss Plexin GBD (2 µM). Die Reaktion wurde durch die Zugabe eines 50-fachen Überschusses GppNHp (10 µM) gestartet. A) RhoA·mantGppNHp B) Rac1·mantGppNHp C) Cdc42·mantGppNHp.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 83
ITC-Thermogramme und thermodynamischen Parameter sind in Abbildung 4.13 dargestellt
bzw. in Tabelle 4-3 zusammengefasst.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5-8
-6
-4
-2
0
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0 30 60 90 120 150
t (min)
µcal
/sec
Molares Verhältnis (B1 GBD/Rac1Q61L)
kcal
/mol
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
-6
-4
-2
0-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0 30 60 90 120 150
t (min)
µcal
/sec
Molares Verhätnis (B1 GBD/Rnd1∆NC)
kcal
/mol
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5-6
-4
-2
0
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0 30 60 90 120 150
t (min)
µcal
/sec
Molares Verhältnis (B1 GBD/Rnd3∆NC)
kcal
/mol
Abb. 4.13: ITC-Experiment der Bindung von Plexin B1 GBD an GTPasen der Rho-Familie. Alle Messungen erfolgten bei 20°C und in Puffer bestehend aus 20 mM Tris/HCl, pH 7,5 und 2 mM MgCl2. A) Titration von 50 µM PlexinB1 GBD in der Messzelle mit 500 µM Rac1(Q61L)·GTP aus der Spritze. Eine Anpassung der Daten an Gleichung 3-10 liefert: Ka = 7,47·104 M-1, ∆H° = -9,0 kcal/mol und n = 0,69. B) Titration von 50 µM Plexin B1 GBD in der Messzelle mit 500 µM Rnd1·GTP aus der Spritze. Eine Anpassung der Daten an Gleichung 3-10 liefert: Ka = 8,21·104 M-1, ∆H° = -7,7 kcal/mol und n = 1,0. C) Titration von 50 µM Plexin B1 GBD in der Messzelle mit 500 µM Rnd3·GTP aus der Spritze. Eine Anpassung der Daten an Gleichung 3-10 liefert: Ka = 9,73·104 M-1, ∆H° = -6,6 kcal/mol und n = 0,62.
Abb. 4.12: ITC-Dissoziationsmessung von Plexin B1 GBD. Titration von 500 µM Plexin B1 GBD aus der Spritze gegen Puffer (20 mM Tris/HCl, pH 7,5 und 2 mM MgCl2) in der Messzelle. Die Anpassung der Daten an eine Dissoziationsgleichung liefert: K = 325 µM und ∆H°= 8,6 kcal/mol. Die Messung erfolgte bei 20°C.
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,100,0
0,5
1,0
1,5
-0,1
0,0
0,1
0,2
0 30 60 90 120 150
t (min)
µcal
/sec
Äquivalente Monomer Konzentration
kcal
/mol
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 84
Es konnte für Rac1(Q61L), Rnd1 und Rnd3 eine Bindung an die PlexinB1-GBD gezeigt
werden. Die Anzahl der Bindungsstellen (n) liegt in der Nähe von 1. Dies zeigt, dass sowohl
das Protein in der Probenzelle (PlexinB1-GBD) als auch die GTPasen in der Spritze während
der gesamten Messung aktiv bleiben und nicht oder nur gering präzipitieren.
Die Assoziation der PlexinB1-GBD an die Rho-GTPasen ist durch energetisch günstige
Enthalpieänderungen getrieben (negative ∆H°-Werte) und im Fall von Rac1(Q61L) bzw.
Rnd1 entropisch ungünstig (negative T∆S°-Werte). Die Bindung kann mit KD-Werten im
mikrokolaren Bereich als niedrigaffin angesehen werden. Weiterhin unterscheiden sich die
Bindungskonstanten für die drei GTPasen nur unwesentlich.
Für Rac1·GDP bzw. GppNHp, RhoA·GppNHp, Cdc42·GppNHp und TC10·GppNHp konnte
mit dieser Methode keine Bindung nachgewiesen werden (5.1.2)
Protein n Kd (µM) ∆G° (kcal/mol) ∆H° (kcal/mol) T∆S° (kcal/mol)
Rac1(Q61L) GTP 0,69 13,4 -6,537 -9,000 -2,463Rac1 GDPRac1 GppNHpRnd1 1,01 12,0 -6,592 -7,650 -1,058Rnd3 0,62 10,3 -6,693 -6,565 0,128RhoA GppNHpCdc42 GppNHpTC10 GppNHp
Tab. 4.3: ITC-Messungen der Bindung von Plexin B1 GBD an Rho-GTPasen
keine Bindung
keine Bindungkeine Bindung
keine Bindung
keine Bindung
4.2.5 Kristallisation von PlexinB1-GBD mit Rnd1
Die GBD von PlexinB1 wurde äquimolar mit Rnd1·GTP gemischt und mit
Kristallisationspuffer auf eine Proteinkonzentration von 10 mg/ml eingestellt. Die
Kristallisation erfolgte unter Verwendung der Methode des hängenden Tropfens. Die unter
3.1.11 aufgeführten Bedingungen wurden bei 20°C ausgetestet. Keine der getesteten
Bedingungen führte zu Kristallen.
4.3 Zytoplasmatische Domänen (CPD) der Plexine
Neben den GBDs der Plexine wurde versucht, die vollständigen CPDs sowohl biochemisch
als auch kristallographisch zu charakterisieren. Hierfür ist es häufig nötig nach stabilen
kleineren Proteinfragmenten zu suchen und so einzelne Subdomänen zu charakterisieren. Die
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 85
in dieser Arbeit verwendeten bzw. hergestellten Proteinfragmente der CPDs der Plexine A2,
B1 und B2 sind in Abbildung 4.14 graphisch dargestellt.
Die verkürzten Konstrukte von Plexin B1 wurden auf der Basis von Sequenzvergleichen zu
R-RasGAP und durch Sekundärstrukturvorhersagen (JPred, Expasy) hergestellt. Da die GBD-
Fragmente eine hohe Stabilität zeigten, wurde diese Information ebenfalls dazu verwendet
neue Fragmente herzustellen (N0C4 und N4C2). Diese Fragmente enthalten dann entweder
die N- bzw. C-terminal GAP-homologe Region sowie die GBD.
4.3.1 Klonierung und Expression in E. coli
Um die verschiedenen zytoplasmatischen Proteinfragmente biochemisch und/oder
kristallographisch charakterisieren zu können, mussten diese rekombinant in E. coli
exprimiert werden. Die verwendeten Konstrukte wurden mittels PCR (3.2.10), Restriktion
(3.2.6) und Ligation (3.2.9) ausgehend von vorhandenen Konstrukten kloniert.
Die Expression der Proteinfragmente erfolgte im Fall der pGEX-Vektoren als GST-
Fusionsprotein bzw. als 6xHis-Fusionsprotein bei den pQE-Vektoren. Die
Abb. 4.14: Übersicht über die verwendeten cytoplasmatischen Proteinfragmente der Plexine. Die Zahlen geben die N- und C-terminale Aminosäure des verwendeten Fragmentes an.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 86
Expressionsbedingungen wurden zunächst durch Variation der Temperatur und der IPTG-
Konzentration optimiert und waren je nach Konstrukt sehr verschieden.
Für die CPD-Fragmente von Plexin A2, B1 und B2 erwiesen sich die Standardbedingungen
als optimal, so dass die Kulturen bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,6 inkubiert und dann
durch Zugabe von 0,3 mM IPTG induziert wurden. Nach einer Inkubation über Nacht bei
30°C in einem Schüttelinkubator (150-170 rpm) wurden die Zellen durch Zentrifugation
sedimentiert. Allerdings war die Überexpression dieser Proteine trotz akzeptabler Löslichkeit
nur gering. Die übrigen Konstrukte (N0C4, N1C1, N2C2, N4C2, N3C3 und ∆GBD) zeigten
unter keiner der getesteten Bedingungen eine gute Überexpression. Auch ihre Löslichkeit war
in vielen Fällen nur gering.
4.3.2 Reinigung der CPDs aus E. coli
Die Reinigung der zytoplasmatischen Fragmente erfolgte entweder über einen N-terminalen
GST-Tag (pGEX-Vektoren), oder über einen N-terminalen 6xHis-Tag. Für die CPD-
Fragmente war eine Reinigung über den His-Tag nötig, da die entsprechenden GST-
Fusionsproteine nicht in ausreichender Qualität isoliert werden konnten.
Die Reinigung von 6xHis-PlexinA2-CPD aus E. coli ist in Abbildung 4.15 exemplarisch
dargestellt. Nach dem präparativen Aufschluss der Bakterienzellen (3.4.4) wurden die
Zellfragmente sedimentiert. Der Überstand wurde auf eine Ni-NTA-Agarose-Säule
aufgetragen (3.4.6.2), wodurch ein Großteil der Verunreinigungen abgetrennt werden konnte.
Die sich anschließende Elution (Abb. 4.15B) zeigte, dass PlexinA2-CPD schon bei sehr
geringen Imidazolkonzentrationen und über einen breiten Bereich eluiert (50-210 mM). Die
relativ starke Verunreinigung oberhalb von 66 kDa konnte durch die folgende Gelfiltration
(3.4.8) abgetrennt werden (Abb. 4.15B/C). Dies war für die Verunreinigung bei etwa 24 kDa
nicht möglich. Hierbei könnte es sich auch um ein Abbauprodukt der CPD handeln, da der N-
Terminus und der C-Terminus miteinander interagieren (4.3.3). Der Western-Blot in
Abbildung 4.15D zeigt, dass tatsächlich eine Degradation des Proteins stattfindet, wie an der
Bande bei etwa 36 kDa zu erkennen ist. Es wurden weitere Reinigungsverfahren wie z.B.
Ionenaustauschchromatographie (3.4.7) getestet, allerdings führten sie zu keiner Verbesserung
der Proteinqualität. So waren die Verunreinigungen bzw. die Abbauprodukte bei 36 und 24
kDa mit keiner der verwendeten Methoden vom Protein (66 kDa) abtrennbar.
Schon bei den ersten Reinigungsversuchen der CPDs zeigte sich eine Salzabhängigkeit
bezüglich der Löslichkeit der Proteine. Geringe Salzkonzentrationen führten zu einer
Präzipitation des Proteins, so dass während der gesamten Reinigung mit mindestens 300 mM
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 87
NaCl im Puffer gearbeitet wurde. Die Reinheit (>90%) und Ausbeute (~6mg/l Kultur) von
PlexinA2 CPD war nicht optimal (Abb. 4.16A). Es wurde dennoch für erste biochemische
und kristallographische Experimente eingesetzt.
PlexinB1-CPD konnte ebenfalls aus E. coli rekombinant gewonnen und gereinigt werden.
Dieses Protein war aber instabil und präzipitierte innerhalb kürzester Zeit nahezu vollständig.
Da sich die Expression und Reinigung der größeren zytoplasmatischen Fragmente aus E. coli
schwierig gestaltete, eine Aussage über eine korrekte Faltung der Proteine nicht möglich war
und ein geeigneter Aktivitätstest nicht zur Verfügung stand, wurden später die CPDs in einem
Insektenzellsystem hergestellt (4.3.4 und 4.3.5).
Abb. 4.15: Exemplarische Reinigung von Plexin A2 CPD. A) Aufschluss und Reinigung mittels Ni-NTA-Sepharose Säule. 1 Gesamtprotein nach Zellaufschluss; 2 Sediment nach Zentrifugation; 3 Überstand nach Zentrifugation; 4 Durchfluss Affinitätschromatographie; 5 Durchfluss Hochsalzwaschschritt; 6 Durchfluss nach Hochsalz B) Elution der Ni-NTA Sepharose Säule mit Imidazolgradient von 0 – 250 mM. Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an. C) Gelfiltration; Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an. D) Western-Blot der Reinigung 1 Gesamtprotein; 2 Sediment nach Zentrifugation; 3 Überstand nach Zentrifugation; 4 Durchfluss; 5 Protein (2,5 µg) nach Elution; 6 Protein (5 µg) nach Elution.
A) B)
C) D)
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 88
4.3.3 α-Chymotrypsin Proteolyse von PlexinA2-CPD
Da flexible Regionen in Proteinen für die Kristallisation häufig hinderlich sind, wurde das
rekombinant hergestellte PlexinA2-CPD Protein mit α-Chymotrypsin und ProteinaseK
behandelt. Hierzu wurden zunächst verschiedene Proteolysebedingungen ausgetestet. So
wurden die Temperatur (8°C und 25°C) und die Inkubationszeit der Proteolyse (2h, 4h, 6h,
12h und 4d) variiert. Der Verlauf der Proteolyse von PlexinA2-CPD mit α-Chymotrypsin und
die anschließende Reinigung sind in Abbildung 4.16 exemplarisch dargestellt.
Optimale Bedingungen für die α-Chymotrypsin-Behandlung von PlexinA2-CPD waren ein
Protein-Protease Verhältnis von 1:3600, bei einer Inkubation von drei Stunden und 8°C. Die
Bedingungen für ProteinaseK waren vergleichbar. Das Ausgangsprotein war hier nach etwa
sechs Stunden vollständig verdaut. Um die Reaktion zu beenden, wurden die α-Chymotrypsin
spezifischen Proteaseinhibitoren Aprotinin und Pefabloc im Verhältnis 1:100 zugegeben.
Um die entstandenen Fragmente (35 kDa, 30 kDa und 24 kDa laut Gel) voneinander zu
trennen, wurden verschiedene chromatographische Reinigungsschritte getestet. Allerdings
war eine Trennung weder durch Ionenaustauscherchromatographie noch durch Gelfiltration
möglich, so dass hier ein hochaffiner Komplex vorliegen muss. Die Analyse der Fragmente
der α-Chymotrypsin Behandlung mittels Western-Blot (Abb. 4.21B) zeigte, dass der 6xHis-
Tag im 36 kDa Fragment enthalten ist. Folglich muss eine der kleineren Banden (30 kDa oder
24 kDa) dem C-terminalen Fragment der CPD entsprechen. Weiterhin lässt sich aus diesen
A) B) C)
Abb. 4.16: α-Chymotrypsin Proteolyse von Plexin A2 CPD. A) Zeitlicher Verlauf der Proteolyse mit α-Chymotrypsin bei 8°C. 1 Plexin A2 CPD nach der Reinigung; 2 Proteolyse mit α-Chymotrypsin (Verhältnis 1:3600) nach 3h bei 8°C; 3 Proteolyse mit α-Chymotrypsin (Verhältnis 1:3600) nach 12h bei 8°C; B) Ionenaustauscherchromatographie, Q-Sepharose, Gradient 50-500 mM NaCl; Ch Chymotrypsin behandeltes Plexin A2 CPD Protein vor der Q-Sepharose; D Durchfluss beim Probenauftrag; Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an. C) Gelfiltration; Sephadex S200; vor Proteinqualität nach der Q-Sepharose und vor der Gelfiltration; Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 89
Daten schlussfolgern, dass der N- und der C-Terminus der CPD von PlexinA2 miteinander
interagieren (5.1.3).
Die erhaltenen Fragmente wurden massenspektroskopisch untersucht (Abb. 4.17), wobei vier
Maxima erhalten wurden. Das Maximum entspricht dem größten erhaltenen Fragment und
enthält den N-Terminus mit einem Molekulargewicht von 36955 Da. Die kleineren Maxima
haben Molekulargewichte von 30840, 30525 und 20927 Da. Das N-terminale Fragment
enthält folglich den 6xHis-Tag und geht voraussichtlich bis zu Aminosäure I1607. Über die
anderen Fragmente ist auf der Basis der hier zur Verfügung stehenden Daten keine
vergleichbare Aussage möglich.
4.3.4 Klonierung und Expression der CPDs in Insektenzellen
Da die Qualität der rekombinant in E. Coli hergestellten CPD Proteine nicht zufriedenstellend
war und vermutet wurde, dass die Proteine nicht richtig gefaltet sein könnten, wurden die
CPD-Fragmente für ein Insektenzellsystem (Sf21) vorbereitet. Dazu wurden die vorhandenen
Abb. 4.17: Massenspektroskopische Analyse der α-Chymotrypsin behandelten PlexinA2-CPD.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 90
Konstrukte der zytoplasmatischen Domänen von PlexinA2, B1 und B2 mittels Restriktion
(3.2.6) und Ligation (3.2.9) kloniert.
Nach der erfolgreichen Klonierung in pFastBac-Vektoren erfolgte die Rekombination in das
Bacmid (3.2.5). Bacmid-DNA wurde anschließend isoliert (3.2.5) und in Sf21-Zellen
transfiziert (3.3.2). Nach einer ersten Virusamplifikation (3.3.4) wurde die Expression der
Proteine mittels Western-Blot (3.4.13) überprüft. Nach weiteren Virusamplifikationen in
ansteigenden Volumina erfolgte die Bestimmung des Virustiters (3.3.3). Die Expressionen
erfolgten dann in 500 ml – 2 l Medium, je nach Bedarf und Expression des Proteins.
Nach einer Inkubation über drei bis vier Tage in einem Schüttelinkubator wurden die Zellen
durch Zentrifugation sedimentiert. Der Zellaufschluss erfolgte wie unter 3.4.5 beschrieben.
Die CPD-Fragmente von PlexinA2 und B1 zeigten eine gute Überexpression in diesem
eukaryotischen System, während die Expression von Plexin B2 nur gering war.
4.3.5 Reinigung der PlexinA2, B1 und B2 CPDs aus Insektenzellen
Die Reinigung der CPD-Proteine erfolgte über den N-terminalen 6xHis-Tag und ist für 6xHis-
PlexinB1-CPD in Abbildung 4.18 exemplarisch dargestellt. Nach dem präparativen
Aufschluss der Insektenzellen (3.4.5) wurden die Zellfragmente sedimentiert. Der Überstand
wurde auf eine Ni-NTA-Agarose-Säule aufgetragen (3.4.6.2), wodurch ein Großteil der
Verunreinigungen abgetrennt werden konnte. Die sich anschließende Elution (Abb. 4.15A)
zeigte, dass PlexinB1 CPD bei Imidazolkonzentrationen zwischen 30 mM und 60 mM eluiert.
Die Proteinreinheit war nach diesem ersten Reinigungsschritt schon besser als die des in E.
coli hergestellten Proteins am Ende der Reinigung. Kleinere Verunreinigungen konnten durch
die folgende Gelfiltration (3.4.8) abgetrennt werden (Abb. 4.18B). Das Abbauprodukt bei 36
kDa konnte aber auch hier nicht vom full length-Protein abgetrennt werden, wie ein Western-
Blot zeigte. Es wurden weitere Reinigungsverfahren wie z.B. Ionenaustauschchromatographie
(3.4.7) getestet, allerdings führten sie zu keiner Verbesserung der Proteinqualität. So waren
die Abbauprodukte bei 36 und 24 kDa mit keiner der verwendeten Methoden vom Protein
(~66 kDa) abtrennbar.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 91
Im Fall von PlexinB1 CPD konnten ungefähr 15mg reines (>95%) Protein pro Liter Kultur
erhalten werden. Diese Ausbeute ist für ein eukaryotisches Expressionssystem erstaunlich
hoch. PlexinA2-CPD konnte unter sehr ähnlichen Bedingungen und in vergleichbarer
Ausbeute aus Insektenzellen isoliert werden. PlexinB2 CPD hingegen wurde in nur geringen
Mengen exprimiert, so dass hier nur etwa 0,5 – 1 mg reines Protein pro Liter Kultur erhalten
wurden. Die in Insektenzellen exprimierten CPD-Proteine zeigten insgesamt bessere
Eigenschaften (Reinheit, Löslichkeit und Stabilität) als die aus E. coli erhaltenen Proteine.
4.3.6 Kristallisation der CPDs
Für die Kristallisation der CPDs wurden die aus E. coli erhaltenen Proteine 6xHisPlexinA2
CPD, GST-PlexinA2 CPD, 6xHisPlexinB1 CPD und GST-PlexinB1 CPD, sowie die mit α-
Chymotrypsin verdauten Fragmente von PlexinA2 CPD eingesetzt. Nach der Etablierung der
Reinigung von PlexinA2 und B1 CPD aus Insektenzellen wurden auch diese Proteine zur
Kristallisation verwendet. Alle Proteine wurden nach der Proteinreinigung auf 10-20 mg/ml
konzentriert und in Kristallisationpuffer (20 Tris/HCl, pH 7,5, 150 - 300 mM NaCl und 2mM
DTT) überführt. Die Kristallisation erfolgte sowohl unter Verwendung der Methode des
hängenden als auch des sitzenden Tropfens. Die unter 3.1.11 aufgeführten Bedingungen
wurden unter Variation der Proteinkonzentration (5 mg/ml, 10 mg/ml und 20 mg/ml) und der
Temperatur (4°C, 12°C und 20°C) ausgetestet.
A) B)
Abb. 4.18: Exemplarische Reinigung von PlexinB1 CPD aus Sf21-Zellen. A Aufschluss und Reinigung mittels Ni-NTA-Sepharose Säule. G Gesamtprotein nach Zellaufschluss; Ü Überstand nach Zentrifugation; P Sediment nach Zentrifugation; D Durchfluss Affinitätschromatographie; Zahlen Elution der Ni-NTA Sepharose Säule mit Imidazolgradient von 0 – 250 mM. Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an. B Gelfiltration; Sephadex S200; Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an. C Reinheit der verwendeten cytoplasmatischen Domänen von 1 PlexinA2 und 2 PlexinB1.
C)
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 92
Für das aus Insektenzellen gereinigte PlexinB1 CPD Protein konnten mittels des Indexscreens
(Hampton Research, Bedingungen F9, G5 und H10) initiale Kristallisationbedingungen
erhalten werden (Abb. 4.19A). Diesen Bedingungen war eine hohe PEG 3350 Konzentration
(20 - 25%) gemeinsam, während die Salzart verschieden war (Ammoniumsulfat,
Lithiumsulfat und Natriumcitrat). Diese initialen Bedingungen mussten weiter optimiert
werden, da es sich zunächst um sehr dünne Nadeln handelte. Durch Zinkchlorid als Additiv
konnte die Nukleationsrate erhöht werden. Durch das wiederholte Aussähen von
Kristallisationkeimen (Seeding) bei niedrigeren PEG3350 Konzentrationen konnten die
Bedingungen weiter optimiert werden (Abb. 4.19B). Erste Diffraktionstests unter
verschiedenen kryogenen Bedingungen zeigten jedoch keine Diffraktion.
Im Fall des in E. coli hergestellten PlexinA2-CPD Proteins wurde nach etwa acht Wochen ein
einzelner Kristall erhalten, der auch reproduziert werden konnte (4.3.7.1). Aufgrund der
langen Inkubationszeit wurde vermutet, dass es sich hierbei um ein Abbaufragment von
PlexinA2 handeln könnte. Trotz eingehender Analyse der Kristalle (4.3.7.2) konnte dies nicht
verifiziert werden. Die Strukturaufklärung dieser Kristalle (4.3.7.6) zeigte später, dass hier
nicht ein Fragment von PlexinA2 kristallisierte, sondern eine Verunreinigung durch das
Hsp31 Chaperonprotein.
Abb. 4.19: Kristalle von Plexin B1 CPD. A Initiale Bedingung des Hampton Research Indexscreens. B Optimierte Bedingung nach Seeding bei 25-facher Vergrößerung
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 93
4.3.7 Kristallstruktur von Hsp31
4.3.7.1 Kristallisationsbedingung
Unter Verwendung des aus E. coli gereinigten PlexinA2-CPD Proteins kristallisierte, wie
später die Strukturaufklärung zeigte, das Hsp31 Protein statt des Plexins. Die Bedingung
hierfür wurde aus dem Crystal Screen II (Hampton Research) unter Verwendung der Methode
des hängenden Tropfens erhalten. Die ersten Kristalle wuchsen in Bedingung Nr. 14 (2 M
Ammoniumsulfat, 200 mM Na/K-Tartrat und 100 mM Natriumcitrat, pH 5,6) nach etwa 8
Wochen. Unter Variation der Ammoniumsulfat-Konzentrationen konnten die Kristalle in
einem Zeitraum von 8 Wochen reproduziert werden. Durch eine Erhöhung der
Proteinkonzentration von 10 mg/ml auf 40 mg/ml konnte die Inkubationszeit von acht
Wochen auf zwei bis vier Wochen verkürzt werden. Es wurden üblicherweise ein bis zwei
Kristalle pro Tropfen erhalten (Abb. 4.20).
4.3.7.2 Analyse der Kristalle
Da, wie zuvor schon angedeutet, nicht eindeutig klar war, welches Protein in den Kristallen
enthalten war, wurden diese biochemisch näher charakterisiert. Aufgrund der langen
Inkubationszeiten lag die Vermutung nahe, dass es sich bei dem kristallisierenden Protein um
ein Abbauprodukt von PlexinA2 CPD handeln könnte (Abb. 4.21). Allerdings konnte die
Kristallisation einer Verunreinigung ebenfalls nicht ausgeschlossen werden.
Als erstes wurden die Kristalle mittels SDS-PAGE analysiert, wodurch gezeigt werden
konnte, dass tatsächlich ein kleineres Protein (~32 kDa) in den Kristallen enthalten ist (Abb.
Abb. 4.20: Kristalle von Hsp31. A Kristall bei 25-facher Vergrößerung B Im Loop aufgenommener mit K2PtCl4 derivatisierter Kristall (aufgenommen an der ESRF Synchrotronröntgenquelle ID14-EH3)
A B
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 94
4.21). Eine Western-Blot Analyse der Kristalle konnte den N-terminalen 6xHis-Tag nicht
nachweisen, so dass nach diesen beiden Experimente nach wie vor keine Aussage über die Art
des kristallisierten Proteins gemacht werden konnte.
Als nächstes wurden die Kristalle vollständig trypsinisiert und die entstandenen Fragmente
massenspektroskopisch untersucht. Bei der Trypsinisierung eines Proteins entstehen
proteinspezifische Fragmente, über deren Massen ein Protein eindeutig identifiziert werden
kann. Durch diese Methode konnte allerdings ebenfalls keine klare Aussage über die Art des
Proteins getroffen werden.
Weiterhin wurde das Protein in den Kristallen einer N-terminalen Proteinsequenzierung
unterzogen (Seqlab, Göttingen). Die erste Sequenzierung von sieben Aminosäuren ergab
folgendes Ergebnis: X - V/I - Q/F - N/T - D/S - D/K - N/I - P. Hieraus ergeben sich 64
mögliche Sequenzen, so dass ein eindeutiger Nachweis unwahrscheinlich ist. Die erhaltene
Sequenz wurde trotzdem mit der Sequenz von PlexinA2-CPD und einer E. coli Datenbank
verglichen. Allerdings wie vermutet ohne eindeutiges Ergebnis. Ein zweiter
Sequenzierungsversuch (fünf Aminosäuren) der gleichen Kristalle ergab dann eine N-
terminale Modifizierung/Blockierung des Proteins, so dass kein Ergebnis erhalten werden
konnte.
Durch eine massenspektroskopische Analyse der Kristalle konnte das Molekulargewicht des
kristallisierenden Proteins auf einen Bereich von 31307 - 31320 Da eingeschränkt werden
(Abb. 4.22).
Abb. 4.21: SDS-PAGE/Westernblot der Hsp31-Kristalle und des Kristallisationstropfens. A SDS-PAGE des 1 Kristallisationstropfens und der 2 Kristalle B Western-Blot des 2/3 Kristallisationstropfens und der 4 Kristalle. 1 Westernblot des α-Chymotrypsin verdauten Plexin A2 CPD Proteins (sh 4.3.3) als Vergleich und Positivkontrolle.
A) B)
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 95
Trotz der diversen biochemischen Kristallanalysen konnte also keine klare Aussage über das
in den Kristallen enthaltene Protein gemacht werden, so dass die Strukturaufklärung
fortgesetzt wurde.
4.3.7.3 Derivatisierung der Kristalle
Für das Derivatisieren der Kristalle musste zunächst eine adäquate Aufbewahrungslösung
gefunden werden, die im besten Fall auch gleichzeitig als Gefrierschutz dienen könnte. Es
wurde zunächst 10% Sucrose und 5% Xylitol zur Mutterlauge hinzugegeben, was allerdings
bei längeren Inkubationszeiten zu einem Streuverlust der Kristalle führte. Am Besten geeignet
als Aufbewahrungs- und Gefrierschutzlösung erschien eine 2,5 M Ammoniumsulfatlösung pH
6,5. Nach einigen Derivatisierungsexperimenten und der Sammlung von Röntgendaten stellte
sich allerdings heraus, dass keines der bisher erhaltenen Derivate isomorph zum nativen
Datensatz war. Zu erkennen war dies vornehmlich an den sehr unterschiedlichen
Zellparametern, die für die c-Achse zwischen 312 Å und 325 Å je nach Derivat variierten.
Folglich wurde dann versucht, die Struktur mittels eines SAD- (Single Anomalous
Dispersion) oder MAD-(Multiple Anomalous Dispersion) Ansatzes zu lösen. Dies führte aber
zu keiner Lösung des Phasenproblems, da die Datenqualität nicht ausreichte.
Da Malonat schon häufiger dazu verwendet wurde, Ammoniumsulfat in der Mutterlauge zu
ersetzen (Holyoak et al., 2003), wurde eine 2,5 M Malonatlösung (pH 6,5) als
Aufbewahrungs- und Gefrierschutzlösung getestet. Diese zeigte sich für beide Zwecke als
Abb. 4.22: Massenspektroskopische Analyse der Hsp31 Kristalle. Das in den Kristallen enthaltene Protein besitzt ein Molekulargewicht von 31307-31320 Da. Gezeigt sind drei Einzelbestimmungen (rot, blau und gelb).
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 96
bestens geeignet. Vor dem eigentlichen Derivatisierungsexperiment wurden die Kristalle für 2
Stunden in dieser Lösung aufbewahrt, um für eine vollständige Äquilibrierung zu sorgen.
Hiermit wurde gewährleistet, dass alle verwendeten Kristalle möglichst gleiche
Ausgangsbedingungen hatten und die Vorbehandlung nicht der Grund für spätere
Isomorphieprobleme ist. Die spätere Strukturaufklärung unter diesen Bedingungen zeigte,
dass der Wechsel zur Malonatlösung tatsächlich zu einer besseren Isomorphie der Kristalle
führte (siehe 5.1.4).
Tabelle 4.4 zeigt die zur Strukturaufklärung verwendeten Kristallderivate und unter welchen
Bedingungen die Derivatisierung erfolgte. Neben den in Tabelle 4.4 aufgeführten
Verbindungen wurden noch eine Reihe weiterer Verbindungen getestet (GdCl, EuCl3,
KAuCN, LaCl3, AuCl3, SmCl3 und PbAcetat), die allerdings entweder nicht zur
Strukturaufklärung beitrugen oder als Derivat nicht brauchbar waren.
Kristall HgCl2 I2/KI PCMBS K2PtCl4 TAMMKonzentration (mM) 2,5 200/100 2,5 10 1Zeit (min) 150 2 30 360 600"Backsoaked " ja nein ja nein nein
Tab. 4.4: Derivatisierung der Hsp31 Kristalle
4.3.7.4 Datenaufnahme und -prozessierung der Hsp31-Kristalle
Zur Datensammlung bei 100 K an den DESY Röntgenquellen BW-7A und BW-7B wurden
die nativen und derivatisierten Kristalle in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Einige der
verwendeten Messparameter sind in Tabelle 4.5 zusammengefasst. Die maximale Auflösung
des nativen Datensatzes betrug 2,10 Å. Besonders berücksichtigt wurde bei der
Datensammlung die ungewöhnlich lange c-Achse der Einheitszelle, da hierdurch die maximal
mögliche Auflösung der Kristalle unter den gegebenen Messbedingungen eingeschränkt
wurde. Ein weiteres wichtiges Kriterium für die Datensammlung war eine hohe Redundanz
der Daten. Die Wellenlänge der Röntgenquelle wurde basierend auf den Eigenschaften des
jeweiligen Derivats und eines Fluoreszenzscans so gewählt, dass das anomale Signal
möglichst groß war und somit für die Strukturaufklärung verwendet werden konnte.
Sämtliche erhaltenen Datensätze wurden mit XDS (Kabsch, 1993) prozessiert. Die
Indizierung der Daten zeigte ein primitiv hexagonales Gitter (P622). Da jeder zweite Reflex
auf der l-Achse systematisch abwesend war, wurde das Vorliegen einer Schraubenachse
vermutet. Da hier sowohl P6(1)22 als auch P6(5)22 in Betracht kamen, wurden beide
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 97
möglichen Raumgruppen im multiplen isomorphen Ersatz berücksichtigt. Die Raumgruppe
P6(5)22 konnte durch die Lösung des multiplen isomorphen Ersatzes bestätigt werden.
Kristall nativ HgCl2 I2/KI PCMBS K2PtCl4 TAMM
Anzahl der Bilder 151 518 200 400 166/115 63/340
DetektorMAR345 MARCCD
(165mm)MAR345 MARCCD
(165mm)MARCCD (165mm)
MARCCD (165mm)
RöntgenquelleDESY BW7A
DESY BW7B
DESY BW7A
DESY BW7B
DESY BW7B
DESY BW7B
Wellenlänge (λ, D) 0,8414 1,0064 0,8414 1,0056 1,072 1,0056Anzahl der Oszillationen 1 1 1 1 1 1Startwinkel (ϕ, °) 0 0 0 0 90/45 0/24Endwinkel (ϕ, °) 45,3 207,2 80 160 156,4/91 25,2/160Winkel pro Bild (°) 0,3 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4Detektor-Abstand (mm) 400 250 430 250 250 250Maximale Auflösung (D) 2,1 3,23 2,6 3,24 3,45 3,3
Tab. 4.5: Datenaufnahme des nativen und der Derivatdatensätze
sin2(θ)/λ2
0 0,02 0,04
log(
<I>)
10
12
14
Das Wilsondiagramm des nativen·Datensatzes ist in Abb. 4.23 mit einem Auflösungsbereich
von 19,41 – 2.10 Å dargestellt. Die Auflösung ist in Einheiten von ( ) 22 /sin λθ aufgetragen,
mit λ (Wellenlänge des Röntgenlichts) und θ als Beugungswinkel. Nach linearer Regression
ergibt sich aus dem y-Achsenabschnitt der Skalierungsfaktor des Datensatzes (13,6). Aus der
Steigung der Geraden erhält man den mittleren Temperaturfaktor (B = 27 Å2). Tabelle 4.6
fasst die wesentlichen Kristallparameter und die Statistik der Datenprozessierung zusammen.
Abb. 4.23: Wilsondiagramm des nativen Hsp31-Datensatz. Die Abbildung zeigt die Intensitätsverteilung (log(<I>)) in Abhängigkeit von der Auflösung (19,4 - 2,1 Å) in Einheiten von
( ) 22 /sin λθ .
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 98
Alle Datensätze zeigen ein sehr hohes Signal/Rausch-Verhältnis in der äußeren Schale, da
aufgrund der langen Zellachse, nicht die gesamte Auflösung der Kristalle verwendet werden
konnte.
Kristall nativ HgCl2 I2/KI
Raumgruppe P6(5)22 / Nr. 179 P6(5)22 / Nr. 179 P6(5)22 / Nr. 179Einheitszelle (D) a=b=52,98 c=313,64 a=b=52,88 c=315,2 a=b=52,90 c=313,01
α=β=90° γ=120° α=β=90° γ=120° α=β=90° γ=120°Auflösungbereich (D) 19,41-2,10 27,82 - 3,23 14,99 - 2,60Zahl der Reflexe/Zahl der unabhängigen Reflexe 83473 / 16354 103615 / 7919 80312 / 15012Redundanz (-fach) 5,1 13,1 5,3Rsym (%, alle Reflexe, äußere Schale) 4,2 / 11,1 5,7 / 15,8 4,5 / 13,0Vollständigkeit (%, alle Reflexe, äußere Schale) 98,9 / 98,9 98,9 / 89,3 98,7 / 97,3Signal/Rausch-Verhältnis (alle Reflexe, äußere Schale) 26,2 / 13,5 43,5 / 14,8 29,1 / 11,3
Kristall PCMBS K2PtCl4 TAMMRaumgruppe P6(5)22 / Nr. 179 P6(5)22 / Nr. 179 P6(5)22 / Nr. 179Einheitszelle (D) a=b=53,14 c=314,82 a=b=52,98 c=314,75 a=b=52,88 c=314,95
α=β=90° γ=120° α=β=90° γ=120° α=β=90° γ=120°Auflösungbereich (D) 27,85 - 3,24 27,81 - 3,45 27,81 - 3,23Zahl der Reflexe/Zahl der unabhängigen Reflexe 80258 / 7944 46530 / 6539 77109 / 7442Redundanz (-fach) 10,1 7,1 10,4Rsym (%, alle Reflexe, äußere Schale) 4,3 / 10,0 4,4 / 12,8 5,7 / 12,4Vollständigkeit (%, alle Reflexe, äußere Schale) 99,2 / 91,9 99,0 / 92,5 99,4 / 99,8Signal/Rausch-Verhältnis (alle Reflexe, äußere Schale) 44,41 / 18,03 37,29 / 12,77 36,63 / 18,29
Tab. 4.6: Datenprozessierung des nativen und der Derivatdatensätze
Das Zellvolumen liegt in diesem Fall bei 762702 Å3. Das Molekulargewicht des in den
Kristallen enthaltenen Proteins war aufgrund der massenspektroskopischen Analyse bekannt
und beträgt 31,3 kDa. Aufgrund der vorliegenden hexagonalen Symmetrie ist die
Einheitszelle aus 12 asymmetrischen Einheiten aufgebaut. Mit einem Molekül pro
asymmetrischer Einheit ergibt sich ein Matthews Koeffizient von 2,0 Å3/Da und ein
Solvensanteil von 39%.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 99
4.3.7.5 Multipler isomorpher Ersatz (MIR) von Hsp31
Als erster Schritt für den multiplen isomorphen Ersatz mussten die aufgenommenen
Datensätze gegen den nativen Datensatz skaliert werden. Dies erfolgte durch Programme des
CCP4 Pakets (CCP4, 1994). Aufgrund der zusätzlichen Schweratome im Kristall verändern
sich die Amplituden der Schweratomdatensätze relativ zum nativen Datensatz. Quantitativ
gibt der Rscale diese Unterschiede wieder, so dass er als Indikator für Isomorphie und Qualität
des jeweiligen Derivats dienen kann (Tab. 4.7).
Kristall HgCl2 I2/KI PCMBS K2PtCl4 TAMMRScale (%, alle Reflexe) 28,3 13,9 20,0 16,3 25,0
Auflösungbereich (D) 27,82 - 3,23 14,99 - 2,60 27,85 - 3,24 27,81 - 3,45 27,81 - 3,23Anzahl der Schweratome 2 6 2 1 2R (%, zentrische Reflexe) 68 69 59 69 66anomales Signal (%) 12 3 12 14 12
Tab. 4.7: Ausgewählte Parameter der Datensätze im Vergleich
Die Phasenbestimmung erfolgte mit dem Programmpaket Solve/Resolve (Terwilliger, 1999;
Terwilliger & Berendzen, 1999). Solve wurde für die Bestimmung der Schweratomparameter
und deren Verfeinerung verwendet. Hierbei wurden alle Derivate gleichzeitig benutzt und die
Auflösung iterativ (3.0 Å, 2,5 Å und 2,1 Å) erhöht. Die Anzahl der gefundenen Schweratome
und deren verfeinerte Parameter sind in den Tabellen 4.7 bzw. 4.8 wiedergegeben. In allen
fünf Derivaten wurden die anomalen Differenzen für die Lokalisierung der Schweratome,
aber nicht für die Verfeinerung der Schweratomparameter verwendet. Drei der Schweratome
in Tabelle 4.8 zeigen einen Temperaturfaktor von 1 und eine niedrige Besetzung (Occ). Diese
wurden nur der Vollständigkeit halber aufgeführt und haben wahrscheinlich keinen
nennenswerten Beitrag zur Strukturaufklärung.
Die mittlere Figure of Merit (FOM), wie sie in Tabelle 4.9 aufgeführt ist, kann als Maßstab
für die Qualität der erhaltenen Elektronendichte angesehen werden. Nach Solve betrug sie für
den gesamten Auflösungsbereich 0,3. Für den Auflösungsbereich, in dem
Schweratominformation vorhanden war (bis 2,6Å), betrug die mittlere FOM hingegen 0,55.
Der letzte Schritt der Phasenbestimmung in Solve erfolgte mit der gesamten zur Verfügung
stehenden Auflösung, da diese im nächsten Schritt für die Dichtemodifikation und
Phasenerweiterung mittels Resolve eingesetzt wurde. Durch Resolve konnte, wie an den
FOM-Werten in Tabelle 4.9 zu erkennen ist, die Qualität der Phaseninformation verbessert
werden. Hinzu kam die Phasenerweiterung bis 2,1 Å, so dass für die nachfolgende
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 100
Elektronendichteinterpretation auch der höhere Auflösungsbereich zur Verfügung stand. Die
mittlere FOM betrug nach Resolve 0,64 für den gesamten Auflösungsbereich. Die
berechneten Elektronendichtekarten zeigten klare Sekundärstrukturelemente, sowie
Seitenketteninformation in vielen Bereichen.
Parameter X Y Z B OccHgCl2#1 0,2207 0,3263 0,0053 24,3 0,67#2 0,3332 0,4028 0,0057 1 0,05
I2/KI#1 0,1334 0,8668 0,0831 18,1 0,17#2 0,2708 0,8691 0,0488 39,3 0,29#3 0,3627 0,0962 0,0584 13,5 0,18#4 0,2495 0,1052 0,0398 53,2 0,23#5 0,3080 0,8531 0,0748 31,8 0,19#6 0,6137 0,9423 0,0505 14,7 0,17
PCMBS#1 0,2308 0,3266 0,0043 34,3 0,55#2 0,8789 0,8821 0,0157 1 0,02
K2PtCl4#1 0,0221 0,5754 0,0756 60 0,63
TAMM#1 0,2229 0,3248 0,0054 25,0 0,71#2 0,5554 0,5740 0,0284 1 0,004
Tab. 4.8: Verfeinerte Schweratomparameter der Derivate
Solve
Auflösung (D) Gesamt 7,51 4,76 3,72 3,16 2,79 2,53 2,33 2,17Anzahl Reflexe 16245 829 1391 1764 2018 2266 2483 2695 2799FOM 0,30 0.83 0.81 0.70 0.45 0.34 0.06 0.00 0.00
ResolveAuflösung (D) Gesamt 6,0 3,8 3,0 2,6 2,3 2,1Anzahl Reflexe 16245 770 2257 2775 2734 4813 2896FOM 0,64 0,94 0,94 0,86 0,72 0,47 0,30
Tab. 4.9: Mittlere Figure of Merit (FOM) in Abhängigkeit von der Auflösung
4.3.7.6 Modellbau, Strukturverfeinerung und Qualität des Hsp31-Modells
Die Interpretation der erhaltenen Elektronendichtekarte erfolgte zunächst automatisch mit
Resolve und führte zu einem schon recht vollständigen Modell. In diesem Modell war bereits
die Hauptketteninformation für 213 Aminosäuren enthalten. Dies entspricht bezüglich der
Hauptkette etwa 70% des vollständigen Modells.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 101
Auf der Basis dieses Modells und der Elektronendichte wurde versucht, die Sequenz von
PlexinA2 anhand großer Seitenketten (Tyr, Phe, Arg und Trp) in der Struktur zu lokalisieren.
Da keine der PlexinA2-Sequenzmotive in die Elektronendichte passte, wurde das erhaltene
Modell für das Proteinrückgrat mit der Datenbank des DALI-Server (Holm & Sander, 1993)
verglichen, um so nach verwandten Strukturen zu suchen.
Die DALI-Suche ergab als ersten Treffer das Hsp31 Chaperon Protein aus E. coli, mit einer
Koordinatenabweichung von 0,7 Å. Dies entspricht einer sehr hohen Übereinstimmung, so
dass davon auszugehen war, dass tatsächlich nicht ein PlexinA2 Fragment in den Kristallen
enthalten war, sondern das Hsp31 Chaperon Protein.
Um das Modell zu vervollständigen und endgültige Sicherheit zu haben, wurde die Hsp31
Proteinsequenz zusammen mit ArpWarp (Perrakis et al., 1997) verwendet, um das Modell zu
komplettieren. ArpWarp konnte so 271 der 292 Aminosäuren (~93%) vollständig, das heißt
mit Seitenketten, interpretieren. Die letzten Schritte der Verfeinerung erfolgten durch
REFMAC5 (CCP4, 1994) unter Verwendung der TLS Option. Die Verfeinerung der
anisotropen Bewegung mittels TLS führte zu einer Verringerung des freien R-Faktors. Nach
etwa 5 Zyklen wurde ein Modell erhalten, dessen freier R-Faktor nicht mehr verringerbar war.
Tabelle 4.10 gibt einen Überblick über die Verfeinerung und die geometrischen Eigenschaften
des finalen Modells. Der kristallographische R-Faktor Rcryst des finalen Modells liegt bei 15,7
%, mit einem freien R-Wert von 22,2 %.
Tab. 4.10: Strukturverfeinerung von Hsp31
StatistikAuflösungbereich (D) 19,43 - 2,10Anzahl der Reflexe 15427Atome in asymmetrischer Einheit 2373Malonat Moleküle 1Wassermoleküle 199ungeordnetes Lösungsmittel (k, B) (e/D3, D2) 0,614 / 250Rcryst / Rfree (%) 15,7 / 22,2Größe des Testsets (%) 5
Stereochemische ParameterStandardabweichung der Bindungslängen / -winkel (D, °) 0,020 / 1,802<B> Proteinatome (D2) 17,4mittlerer Koordinatenfehler nach Luzzati (1952) (D2) 0,21
Das finale Modell der Hsp31-Struktur umfasst die Aminosäuren 5 bis 282 (Abb. 4.25).
Weiterhin sind in dem Modell ein Malonatmolekül und 199 Wassermoleküle enthalten. Um
die relative Mobilität einzelner Bereiche in der Struktur abzuschätzen, wurden die gemittelten
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 102
Temperaturfaktoren der Aminosäuren gegen die Sequenzposition aufgetragen (Abb. 4.24A).
Abbildung 4.25 zeigt das finale Modell von Hsp31 mit seinen Sekundärstrukturelementen.
Die sterisch sinnvolle Verteilung der φ/ψ-Winkel des Modells geht aus dem dargestellten
Ramachandran Diagramm (Abb. 4.24B; Ramachandran & Sasisekharan, 1968; Laskowski et
al., 1993) hervor. 88,6 % aller nicht Gly-Reste besitzen φ/ψ-Winkel in bevorzugten Bereichen
und 10,1 % der Aminosäuren liegen in zusätzlich erlaubten Bereichen. Zwei Aminosäuren
(0,8%) liegen in erweitert erlaubten Bereichen und eine Aminosäure (Cys185, 0,4%) liegt in
einem nicht erlaubten Bereich. Cys185 ist in einer sehr engen Schleifenregion zwischen einer
α-Helix und einem β-Strang lokalisiert. Weiterhin ist die konformationelle Freiheit dieser
Aminosäure bedingt durch die Seitenketten der umgebenden Aminosäuren stark
eingeschränkt. Interessanterweise ist dieses Cystein am Schwefel der Seitenkette durch ein
Sauerstoffatom modifiziert (Hydroxy-Cystein), was zu einer weiteren Einschränkung führen
könnte. Da Cys185 zur katalytischen Triade von Hsp31 gehört, könnte die beobachtete
Konformation auch von katalytischer Bedeutung sein (siehe 5.1.4).
Abb. 4.24: A) Ramachandran-Diagramm und B) gemittelte Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheit von Hsp31. Aufgetragen sind die gemittelten Temperaturfaktoren gegen die Sequenzposition.
Aminosäure
10 30 50 70 90 110
130
150
170
190
210
230
250
270
Mitt
lere
r Tem
pera
turfa
ktor
0
20
40
A) B)
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 103
4.3.8 Charakterisierung der GTPase-CPD Interaktion
Mittels Pulldown Assay (3.4.16) sollte in dieser Arbeit die Interaktion der rekombinant
gewonnenen PlexinB1-CPD mit den GTPasen der Rho-Familie untersucht werden. Dazu
wurden GST-Rnd1∆NC, GST-Rnd1 und GST-Rac1(Q61L) an GSH-Sepharose gebunden und
mit PlexinB1-CPD inkubiert. Nach mehreren Waschschritten, wurden die GST-
Fusionsproteine eluiert und mittels SDS-PAGE elektrophoretisch getrennt (Abb. 4.26). Eine
Interaktion zwischen GTPase und PlexinB1-CPD sollte durch eine zusätzliche Bande für das
Plexin-Protein deutlich erkennbar sein.
Abb. 4.26: Pulldown Experiment von GST-GTPasen mit Plexin B1 CPD. A) 1-4 zeigen das Gesamtprotein und 5-8 das Pulldown-Experiment. 1 GST-Rnd1∆NC; 2 GST-Rnd1; 3 GST-Rnd1∆NC + PlexinB1-CPD; 4 GST-Rnd1 + PlexinB1-CPD; 5 GST-Rnd1∆NC; 6 GST-Rnd1; 7 GST-Rnd1∆NC + PlexinB1-CPD; 8 GST-Rnd1 + PlexinB1-CPD. B) 1 Gesamtprotein GST-Rac1(Q61L) + PlexinB1-CPD; 2 Pulldown-Experiment GST-Rac1(Q61L) + PlexinB1-CPD. Die Pfeile zeigen die Position der PlexinB1-CPD Bande.
Abb. 4.25: Die asymmetrische Einheit der Hsp31-Kristalle. Die Sekundärstrukturelemente sind folgendermaßen hervorgehoben: α-Helices in rot, β-Faltblattstränge in blau und flexible Regionen in grau.
A) GST-Rnd1 B) GST-Rac1(Q61L)
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 104
Die Experimente in den Abbildungen 4.26A und B zeigen eine schwache aber im Rahmen des
Experimentes signifikante Interaktion zwischen den Rnd1-Proteinen und der CPD von
PlexinB1 (Abb. 4.26A, Spuren 7 und 8), sowie zwischen Rac1(Q61L) und PlexinB1 (Abb.
4.26B, Spur 2). Für die hier dargestellten Experimente wurde mit der aus Insektenzellen
gewonnenen PlexinB1-CPD gearbeitet. In zuvor durchgeführten Pulldown-Experimenten
konnte allerdings keine Interaktion von Rac1(Q61L) mit GST-PlexinB1-CPD aus E. Coli
nachgewiesen werden. Dies könnte darauf hindeuten, dass tatsächlich ein Unterschied
bezüglich der Faltung der Proteine abhängig vom Expressionssystem besteht. Weiterhin
scheinen die N- und C-terminalen Regionen von Rnd1 keinen Einfluss auf die Bindung von
PexinB1 zu haben, da für beide Proteine GST-Rnd1∆NC und GST-Rnd1 eine schwache
Bindung gezeigt werden konnte (siehe 5.1.2).
4.3.9 Untersuchung der CPDs auf GAP-Aktivität
Auf der Basis von Sequenzhomologien (Rohm et al., 2000) wurde vermutet, dass die CPDs
der Plexine eine GTPase aktivierende (GAP)-Aktivität besitzen könnten. Da in verschiedenen
Experimenten (in Zusammenarbeit mit Dr. M. Driessens) keine GAP-Aktivität der Plexine
auf eine Reihe von Rho-GTPasen mittels einer HPLC-basierten Methode gezeigt werden
konnte, wurde dass in der Einleitung (Abb. 1.7) bereits vorgestellte Modell postuliert. Dieses
Modell sieht zunächst eine Aktivierung der Plexine durch eine Upstream-GTPase vor, die an
die GBD des Plexins bindet und so zu einer Aktivierung der GAP-Funktion führt. Eine
Downstream-GTPase wird daraufhin inaktiviert. Aber auch die in diesem Zusammenhang
durchgeführten HPLC-Experimente (ebenfalls in Zusammenarbeit mit Dr. M. Driessens)
konnten keine GAP-Funktion der Plexine nachweisen.
Basierend auf einer kürzlich erschienenen Studie (Oinuma et al., 2004), die eine GAP-
Aktivität für den aktivierten Transmembranrezeptor PlexinB1 anhand von
Membranfraktionen zeigen konnte, wurden die in Abbildung 4.27 dargestellten Stopped-Flow
Experimente durchgeführt. Hierbei wurden 0,1 µM R-Ras (mit Tamra-GTP beladen) in einer
Spritze vorgelegt, während in der anderen Spritze die CPD von PlexinB1 (10-facher
Überschuss, 1µM) zusammen mit Rnd1 (Abb. 4.27A) bzw. Rac1(Q61L) (Abb. 4.27B) (100-
facher Überschuss, 10µM) enthalten war.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 105
Da Tamra-modifiziertes GTP bei der GTP-Hydrolyse von GTPasen eine Fluoreszenzänderung
zeigt (persönliche Mitteilung von A. Eberth), sollte bei Vorhandensein von GAP-Aktivität
eine Beschleunigung der Hydrolyse anhand der Fluoreszenzänderung messbar sein.
Allerdings konnte, wie aus Abbildung 4.27 erkennbar ist, für die rekombinant hergestellte
CPD von PlexinB1 unter den verwendeten Bedingungen keine GAP-Aktivität gemessen
werden (5.1.3). Interessanterweise zeigte schon die Inkubation von Rnd1 bzw. Rac1(Q61L)
mit dem Tamra-beladenen R-Ras eine Fluoreszenzänderung, die aus den dargestellten
Experimenten allerdings nicht direkt erklärt werden konnte.
Da die Vermutung nahe lag, dass vielleicht eine zusätzliche Aktivierung der Plexine bzw.
posttranslationale Modifikationen eine Rolle in der Signaltransduktion der Plexine spielen
könnten, wurde in Zusammenarbeit mit Prof. A. Püschel und C. Hömme (Universität
Münster) eine Expression des PlexinA1 Rezeptors in COS7-Zellen angestrebt. Hierzu wurde
PlexinA1 alleine oder zusammen mit Rnd1, Rac1 und Neuropilin1 für 24h in COS7-Zellen
exprimiert.
Abb. 4.27: Stopped-Flow Experiment zur Bestimmung der GAP-Aktivität von rekombinantem Plexin B1 CPD Protein. Für die Experimente wurden 0,1 µM R-Ras, 1 µM Plexin B1 CPD und 10 µM GTPase eingesetzt. A Rnd1∆NC als Upstream-GTPase von Plexin B1. B Rac1(Q61L) als Upstream-GTPase von PlexinB1.
Zeit (sec)0 200 400 600 800 1000
rel.
Fluo
resz
enz
0,96
0,98
1
1,02
R-RasR-Ras + PlexinB1 CPD + Rnd1
R-Ras + PlexinB1 CPD
R-Ras + Rnd1
Zeit (sec)0 200 400 600 800 1000
rel.
Fluo
resz
enz
1
1,02
1,04
1,06
R-Ras
R-Ras + PlexinB1 CPD
R-Ras + PlexinB1 CPD + Rac1(Q61L)
R-Ras + Rac1(Q61L)
A) B)
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 106
Nach dem Zellaufschluss erfolgte die Isolation der Membranfraktionen durch C. Hömme.
Anschließend wurden diese in Messpuffer aufgenommen und in Stopped-Flow Experimenten
vergleichbar zu den oben dargestellten Experimenten eingesetzt. Die Ergebnisse dieser GAP-
Aktivitätsmessungen sind in Abbildung 4.28 dargestellt. Es konnte hierbei keine GAP-
Aktivität von aktiviertem PlexinA1 auf H-Ras (Abb. 4.28A) oder auf R-Ras (Abb. 4.28B)
nachgewiesen werden. Als Positivkontrolle wurde in beiden Fällen die GAP-Domäne von
NF1 (NF1-333) verwendet, wo die Beschleunigung der GTP-Hydrolyse gut zu erkennen ist.
Abb. 4.28: Stopped-Flow Experimente zur Bestimmung der GAP-Aktivität von COS7 Zelllysaten. Für die Experimente wurden 0,1 µM H-Ras bzw. R-Ras und 100 µl der Membranfraktionen eingesetzt. A H-Ras als Downstream-GTPase von PlexinA1. B R-Ras als Downstream-GTPase von PlexinA1. Als Positivkontrolle wurde die katalytische Domäne von Neurofibromin1 (NF1-333) eingesetzt.
Zeit (sec)0 100 200 300 400 500
rel.
Fluo
resz
enz
0,88
0,9
0,92
0,94
0,96
0,98
1
H-Ras
Plexin A1 + Rnd1
NF1-333
0 5 10 15 20
0,88
0,9
0,92
0,94
0,96
0,98
1
Plexin A1 + Rac1
Plexin A1 + Neuropilin + Sema3A
Zeit (sec)0 100 200 300 400 500
rel.
Fluo
resz
enz
0,88
0,9
0,92
0,94
0,96
0,98
1
Plexin A1 + Rnd1
Plexin A1 + Rac1
Plexin A1 + Neuropilin + Sema3A
R-Ras NF1-333
0 5 10 15 20
0,88
0,9
0,92
0,94
0,96
0,98
1
A) B)
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 107
4.4 Kristallstrukturen von Rac1b·GDP und Rac1b·GppNHp
Der Sequenzvergleich von Rac1 und Rac1b zeigt eine Insertion von 19 Aminosäuren
zwischen den Aminosäuren Thr75 und Asp76. Strukturell befindet sich diese Insertion
folglich am C-Terminus der Switch II Region von Rac1. Da der Switch II essentiell für die
Funktion von Rac1 als Schaltermolekül ist, war es in dieser Arbeit von Interesse, die Struktur
dieser 19 zusätzlichen Aminosäuren und ihren Einfluss auf den übrigen Teil der Struktur,
sowie auf die Nukleotidbindung zu charakterisieren. Weiterhin sollte untersucht werden,
welchen Einfluss die Art des gebundenen Nukleotids (GDP oder GTP) auf die Struktur der 19
Aminosäuren-Insertion von Rac1b hat. Hierzu wurde die dreidimensionale Struktur von
Rac1b im GDP- und GppNHp-gebundenen Zustand gelöst.
4.4.1 Verwendete Proteine
Die Klonierung, Expression und Reinigung von Rac1b und Rac1b∆C erfolgte durch Dr. Lars-
Christian Häusler. Abbildung 4.29 zeigt die verwendeten Proteine im Vergleich zu Rac1.
Hervorgehoben ist die 19 Aminosäuren lange Insertion von Rac1b zwischen den
Aminosäuren 75/76. Alle verwendeten Proteine besaßen einen hohen Reinheitsgrad (Abb.
4.3) und waren unter den verwendeten Bedingungen stabil. Bedingt durch die intrinsische
GTP-Hydrolyse von Rac1b wurden die Proteine in ihrer GDP gebundenen Form isoliert und
konnten als solche direkt für die Kristallisation verwendet werden.
4.4.2 Nukleotidaustausch und Nukleotidbefreiung von Rac1b
Um Rac1b und Rac1b∆C mit einem GTP-analogen Nukleotid, in diesem Fall GppNHp, zu
beladen bzw. vollständig vom gebundenen Nukleotid zu befreien, wurden die GTPasen wie
Abb. 4.29: Übersicht über die von Rac1b verwendeten Konstrukte im Vergleich zu Rac1. Die Zahlen geben die N- und C-terminale Aminosäure des verwendeten Fragmentes an. Hervorgehoben ist die 19 Aminosäure lange Insertion zwischen den Aminosäuren 75/76 von Rac1.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 108
unter 3.4.15 beschrieben ausgetauscht. Hierzu wurden jeweils 20 mg reines Protein eingesetzt.
Hydrolysiertes Nukleotid wurde durch eine anschließende Größenausschlusschromatographie
(in 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 2 mM MgCl2, 2 mM DTE und 100 µM GDP bzw. GppNHp)
vom Protein getrennt. Die nukleotidfreien Formen von Rac1b und Rac1b∆C stellten sich
dabei, im Vergleich zu anderen GTPasen der Rho-Familie, als ungewöhnlich stabil heraus.
Dies führte zu der Vermutung, dass die 19 Aminosäuren Insertion die Funktion haben könnte,
den nukleotidfreien Zustand der GTPase zu stabilisieren.
Um die Vollständigkeit des Austausches zu überprüfen und um die erfolgreiche
Nukleotidbindung nachzuweisen, wurde die Nukleotidbeladung mittels HPLC überprüft.
Beide Proteine waren vollständig und ausschließlich mit GppNHp beladen. Im Fall der
Nukleotidbefreiung von Rac1b∆C war kein Nukleotid mehr nachweisbar. Die native Faltung
dieses nukleotidfreien Proteins wurde überprüft, indem es mit GTP beladen und mittels HPLC
auf GTP-Hydrolyseaktivität hin untersucht wurde.
4.4.3 Kristallisation von Rac1b und Rac1b∆C
Für die Kristallisation wurden sowohl full length-Rac1b, als auch die C-terminal verkürzte
Variante Rac1b∆C, in jeweils GDP- bzw. GppNHp-gebundenem Zustand, eingesetzt. Ebenso
wurde versucht, nukleotidfreies Rac1b∆C zu kristallisieren. Hierzu fanden die unter 3.1.11
aufgeführten Bedingungen Verwendung. 2 µl der jeweiligen Reservoirlösungen wurden mit 2
µl der verschiedenen Proteinlösungen (10 mg/ml) gemischt und nach der Methode des
hängenden Tropfens bei 20 °C inkubiert.
Kristalle von Rac1b∆C in der GDP- und GppNHp-gebundenen Form konnten unter
Bedingung 41 des Crystal Screen I (Hampton Research) erhalten werden. Diese Bedingung
besteht aus 10 % Isopropanol, 100 mM Hepes/NaOH, pH 7,5 und 20 % PEG 4000. Die
Reproduktion dieser initialen Bedingung gestaltete sich schwierig. Keine der getesteten
Variationen (Isopropanol-Konzentration, pH-Wert, Puffersubstanz oder PEG 4000-
Konzentration) führte zum Kristallisationserfolg. Erst der Wechsel zu einer
niedermolekulareren PEG-Lösung (PEG3350) führte zu einer Reproduzierbarkeit der initialen
Bedingung. Die in Abb. 4.30 dargestellten Kristalle konnten durch Mischen von 2 µl einer 0,5
mM Lösung des entsprechenden Rac1b ∆C Proteins (GDP oder GppNHp, in 20 mM
Tris/HCl, pH 7,5, 2 mM MgCl2, 2 mM DTE und 100 µM GDP bzw. GppNHp) mit 2 µl einer
Reservoirlösung bestehend aus 100 mM Hepes, pH 7,5, 18 - 30 % PEG 3350 und 2 - 6 %
Isopropanol, erhalten werden. Wie in der Abbildung zu erkennen, wuchsen die Kristalle
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 109
häufig in Form von Rosetten an einem zentralen Kristallisationskeim, konnten aber ohne
weiteres zwecks Datensammlung vereinzelt werden.
Für die full length-Rac1b Proteine (GDP und GppNHp) und für das nukleotidfreie Rac1b∆C-
Protein konnten unter den ausgetesteten Bedingungen keine initialen
Kristallisationsbedingungen erhalten werden.
4.4.4 Datenaufnahme von Rac1b∆C·GDP/GppNHp
Um für die erhaltenen Rac1b∆C GDP/GppNHp Kristalle die Datensammlung an einer
Syncrotron-Röntgenquelle zu ermöglichen wurde nach einem Kryoprotektionsmittel gesucht.
Hierzu wurden verschiedene Lösungen an Kryoprotektionsmitteln mit der Reservoirlösung
vermischt. Als geeignet erwies sich eine Mischung aus Reservoirlösung mit 10 – 20%
Glycerol.
Tab. 4.11: Datensammlung an Rac1b∆C GDP GppNHp
Anzahl der Bilder 220 224Detektor ADSC Q4 CCD ADSC Q4 CCDRöntgenquelle ID14-EH1 ID14-EH1Wellenlänge (λ, D) 0,933 0,933
Anzahl der Oszillationen 1 1Startwinkel (ϕ, °) 0 0Endwinkel (ϕ, °) 110 112Winkel pro Bild (°) 0,5 0,5Detektor-Abstand (mm) 159,71 159,61Maximale Auflösung (D) 1,75 1,75
Abb. 4.30: Kristalle von Rac1b∆C GDP/GppNHp. A Kristall bei vierfacher Vergrößerung B Kristall bei zehnfacher Vergrößerung
A B
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 110
Zur Datensammlung bei 100 K an der ESRF (European Syncrotron Radiation Facility)
Röntgenquelle ID14-EH1 wurden die Kristalle von Rac1b∆C GDP bzw. GppNHp in der
Kryoprotektionslösung aufgenommen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Einige der
verwendeten Messparameter sind in Tabelle 4.11 zusammengefasst. Die maximale Auflösung
der Kristalle betrug 1,75 Å.
4.4.5 Datenprozessierung von Rac1b∆C·GDP/GppNHp
Die erhaltenen Datensätze wurden mit XDS (Kabsch, 1993) prozessiert. Die Indizierung der
Daten wies in beiden Fällen auf ein primitiv orthogonales Gitter hin. Da jeder zweite Reflex
auf allen drei hkl-Achsen systematisch abwesend war, wurde das Vorliegen einer
Schraubenachse vermutet. Die Prozessierung in P2(1)2(1)2(1) zeigte für den Rac1b∆C·GDP
Datensatz eine mittlere gemessene Intensität von 0,8 % (1,2 % für GppNHp) der mittleren
Gesamtintensität für 62 (bzw. 85) der gemessenen systematisch abwesenden Reflexionen. Die
Raumgruppe P2(1)2(1)2(1) konnte durch die Lösung des molekularen Ersatzes für die GDP-
und GppNHp-Struktur bestätigt werden.
Die Wilsondiagramme der Rac1b∆C·Datensätze sind in Abb. 4.31 mit einem
Auflösungsbereich von 20 - 1,75 Å dargestellt. Die Auflösung ist in Einheiten von
Abb. 4.31: Wilsondiagramme der Rac1b∆C·Datensätze. Die Abbildung zeigt die Intensitätsverteilung (log(<I>)) in Abhängigkeit von der Auflösung (20 - 1,75 Å) in Einheiten von
( ) 22 /sin λθ .
Rac1b ∆C·GDP
sin2(θ)/λ2
0 0,02 0,04 0,06 0,08
log(
<I>)
8
10
12
14
Rac1b ∆C·GppNHp
sin2(θ)/λ2
0 0,02 0,04 0,06 0,08
log(
<I>)
8
10
12
14
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 111
( ) 22 /sin λθ aufgetragen, mit λ als Wellenlänge des Röntgenlichts und θ als Beugungswinkel.
Nach linearer Regression ergeben sich aus den y-Achsenabschnitten die Skalierungsfaktoren
der Datensätze (12,98 für GDP und 12,97 für GppNHp). Aus der Steigung der Geraden erhält
man den mittleren Temperaturfaktor (B = 30 Å2 für GDP und GppNHp).
Die nachfolgende Tabelle (Tab. 4.12) fasst die wesentlichen Kristallparameter und die
Statistik der Datenprozessierung zusammen.
Tab. 4.12: Datenprozessierung von Rac1b∆C GDP GppNHp
KristallAbmessungen (mm) 0,2 x 0,2 x 0,5 0,2 x 0,2 x 0,7Alter (d) 7-14 7-14Raumgruppe P2(1)2(1)2(1) / Nr. 19 P2(1)2(1)2(1) / Nr. 19Einheitszelle (D) a = 51,64 b = 78,69 c = 96,79 a = 51,55 b = 78,67 c = 96,88
α = β = γ = 90° α = β = γ = 90°VM (D3/Da) 2,5 2,5Zahl der Moleküle pro asym. Einheit 2 2Lösungsmittelgehalt (%) 49,7 49,7Auflösungbereich (D) 24,92 - 1,75 26,26 - 1,75Mosaizität (°) 0,216 0,182
StatistikZahl der Reflexe/Zahl der unabhängigen Reflexe 170229 / 38560 172626 / 38875Redundanz (-fach) 4,4 4,4Rsym (%, alle Reflexe, äußere Schale) 5,4 / 40,9 5,1 / 40,6Vollständigkeit (%, alle Reflexe, äußere Schale) 95,1 / 88,3 96,0 / 90,1Signal/Rausch-Verhältnis (alle Reflexe, äußere Schale) 15,21 / 3,37 16,62 / 3,75
Das Zellvolumen liegt in diesem Fall bei 410523 Å3. Das Molekulargewicht von Rac1b∆C
beträgt etwa 20 kDa. Aufgrund der orthogonalen Symmetrie ist die Einheitszelle aus 4
asymmetrischen Einheiten aufgebaut. Mit einem Molekül Rac1b∆C pro asymmetrischer
Einheit ergibt sich ein Matthews Koeffizient von 4,9 Å3/Da. Mit zwei Molekülen erhält man
einen Wert von 2,5 Å3/Da, was sehr gut einem durchschnittlichen Proteinkristall entspricht.
Der molekulare Ersatz zeigte, dass zwei Moleküle in der asymmetrischen Einheit enthalten
waren.
4.4.6 Molekularer Ersatz von Rac1b∆C·GDP/GppNHp
Für den Molekularen Ersatz von Rac1b∆C·GDP/GppNHp wurde das Programm AMoRe
(Navaza, 1993) verwendet. Als Suchmodell diente die Rac1·GppNHp Struktur (PDB Code:
1MH1, Hirshberg et al., 1997), aus der die beiden Schalterregionen (Switch I und II), das
Magnesiumion und das Nukleotid entfernt wurden. Die Auflösungsbereiche für die Rotations-
und die Translationssuche wurden variiert, ebenso der Integrationsradius. In der P2(1)2(1)2(1)
Raumgruppe wurde für beide Rac1b∆C-Datensätze eine eindeutige Lösung mit zwei
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 112
Molekülen pro asymmetrischer Einheit gefunden. Die Parameter der Lösung sind in Tabelle
4.13 zusammengefasst.
Tab. 4.13: Molekularer Ersatz für Rac1b∆C GDP GppNHpSuchmodell Rac1 GppNHp Rac1 GppNHpAuflösungsbereich Rotation / Translation (D) 10,0-4,0/8,0-4,0 10,0-4,0/8,0-4,0Pattersonradius (D) 22 22Rotation für Molekül 1 (Eulerwinkel) 152,02/70,81/163,02 152,21/70,87/163,31Translation für Molekül 1 (orthogonales System, D) -4,99/-7,34/-8,63 -4,54/-7,50/-8,47Rotation für Molekül 2 (Eulerwinkel) 151,49/70,92/162,12 151,46/70,96/161,47Translation für Molekül 2 (orthogonales System, D) -1,80/32,33/-9,06 -1,89/32,30/-9,40Korrelationskoeffizient / R-Faktor (%) 61,5/47,9 62,6/45,3Korrelationskoeffizient / R-Faktor (der besten falschen Lsg., %) 22,6/64,1 25,3/60,7
Die hier erhaltene Lösung ist in beiden Fällen sehr gut, wie der Unterschied zwischen den
Korrelationskoeffizienten der richtigen und der besten falschen Lösung zeigt. Er beträgt
38,9% für Rac1b∆C·GDP und 37,3% für die GppNHp Struktur. Der Unterschied in den R-
Faktoren liegt bei 16,2% für die GDP und 15,4% für die GppNHp Struktur. Das verwendete
Rac1-Modell wurde mit den angegebenen Parametern rotiert und translatiert. Die sterische
Korrektheit der Lösung wurde anhand der Packung der symmetrieverwandten Moleküle
überprüft. Die anschliessend berechnete Elektronendichtekarte zeigte eindeutig positive
Dichte an den erwarteten Nukleotidpositionen, so dass man von der Korrektheit der Lösungen
ausgehen konnte (das Nukleotid war nicht im Modell enthalten).
Wie der Tabelle 4.13 zu entnehmen ist, sind die beiden Moleküle der jeweiligen
asymmetrischen Einheiten durch eine reine Translation um etwa 40 Å fast genau entlang der
y-Achse des realen Raums (entspricht der Hälfte der y-Achse) miteinander verwandt. Der
Abb. 4.32: U-V-Ebene bei W = 0 der nativen Pattersondichte des Rac1b∆C·GDP Datensatzes. Die Berechnung erfolgte mit dem Programm FFT (CCP4, 1994). Es wurden Daten im Auflösungsbereich 25-4 Å verwendet. Die Konturierung erfolgte bei 15% der Gesamtsignalhöhe in Schritten von 1%. Das Maximum entspricht 50% der Gesamtsignalhöhe.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 113
Vektor für die Transformation von Molekül A nach Molekül B ist gegeben durch x = 0,065, y
= 0,5 und z = 0,000. Eine derartige reine Translation sollte in einer nativen Pattersondichte als
Maximum zu erkennen sein und dient damit als zusätzliche Bestätigung der Richtigkeit der
Lösung. Abbildung 4.32 zeigt die U-V-Ebene bei W = 0 (die Koordinaten des realen Raums
x, y und z, werden im Pattersonraum durch U, V und W wiedergegeben) der nativen
Pattersondichte von Rac1b∆C GDP. Deutlich zu erkennen sind die beiden Maxima bei U =
0,065 bzw. U = 0,935 und V = 0,5. Die zusätzlichen Maxima bei U = 0 und V = 0 sind die
Ursprungmaxima.
4.4.7 Modellbau, Strukturverfeinerung und Qualität der Modelle
Aus dem Suchmodell (Rac1·GppNHp) wurden anhand der Lösungen des molekularen
Ersatzes die asymmetrischen Einheiten der Rac1b∆C·GDP/GppNHp Kristalle konstruiert. In
den anfänglichen Modellen waren die beiden Schalterregionen (Switch I und II), das
Magnesiumion und das Nukleotid nicht enthalten. Eine erste berechnete composite omit-
Elektronendichte wurde dazu verwendet, die Lage der Aminosäuren zu überprüfen und zu
korrigieren. Seitenkettenatome wurden wo möglich eingebaut, ebenso wie Teile der fehlenden
Regionen. Die letzten Schritte der Verfeinerung erfolgten durch REFMAC5 (CCP4, 1994).
Die Verwendung der TLS Option führte zu einer deutlichen Verringerung des freien R-
Faktors. Nach etwa 20 Zyklen wurde in beiden Fällen (Rac1b∆C·GDP und GppNHp) ein
Modell erhalten, dessen freier R-Faktor nicht mehr verringerbar war. Tabelle 4.14 gibt einen
Überblick über die Verfeinerung und die geometrischen Eigenschaften des finalen Modells.
Der kristallographische R-Faktor Rcryst des finalen Modells der Rac1b ∆C·GDP Struktur liegt
bei 18,8 %, mit einem freien R-Wert von 22,3 %. Die Werte für die GppNHp Struktur sind
sehr ähnlich mit einem Rcryst von 18,1 % und einem Rfree von 21,9 %.
Für alle vier Moleküle konnten die beiden artifiziellen N-terminalen, durch die
Thrombinolyse erhaltenen, Gly-Ser-Reste beobachtet werden und sind dementsprechend im
Modell enthalten. Das finale Modell der Rac1b∆C·GDP Struktur umfasst die Aminosäuren 1-
59 und 93-201 für das Molekül A. Das Molekül B dieser Struktur beinhaltet die Aminosäuren
1-58 und 93-199. Die Struktur von Rac1b∆C·GppNHp enthält die Aminosäuren 1-60 und 93-
201 für das Molekül A, sowie die Aminosäuren 1-58 und 93-199 für das Molekül B.
Weiterhin sind in den Modellen jeweils das entsprechende Nukleotid (GDP bzw. GppNHp)
und ein Magnesiumion (Mg2+) enthalten.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 114
Tab. 4.14: Strukturverfeinerung von Rac1b∆C GDP GppNHp
StatistikAuflösungbereich (D) 24,92 - 1,75 26,26 - 1,75Anzahl der Reflexe 37724 38205Atome in asymmetrischer Einheit 2917 2942GDP+Mg2+ / GppNHp+Mg2+ 29 33Wassermoleküle 273 296ungeordnetes Lösungsmittel (k, B) (e/D3, D2) 0,873 / 250 0,840 / 250Rcryst / Rfree (%) 18,8 / 22,3 18,1 / 21,9Größe des Testsets (%) 4,9 5
Stereochemische ParameterStandardabweichung der Bindungslängen / -winkel (D, °) 0,021 / 1,873 0,021 / 1,883<B> Proteinatome 1. Mol / 2. Mol (D2) 22,71/22,10 24,17/22,10<B> GppNHp+Mg2+ 1. Mol / 2. Mol (D2) 15,25/15,88 19,02/17,17mittlerer Koordinatenfehler nach Luzzati (1952) (D2) 0,257 0,254
Um die relative Mobilität einzelner Bereiche in der Struktur abzuschätzen, wurden die
gemittelten Temperaturfaktoren der Aminosäuren gegen die Sequenzposition aufgetragen
(Abb. 4.33). Die Switch I Region (Aminosäuren Tyr32 – Tyr40), die Insert Helix
(Aminosäuren Lys135 – Pro155) und die C-Termini der Strukturen zeigen jeweils leicht
erhöhte Temperaturfaktoren. Die Switch II Region (Aminosäuren Gly60 – Tyr72) konnte für
keines der Moleküle gebaut werden, da in diesem Bereich keine Elektronendichte zu erkennen
war und somit auf eine extrem hohe Mobilität dieser Sequenzregion schließen lässt (siehe
5.2.2).
Die asymmetrische Einheit beider Strukturen zeigt ein kristallographisches Dimer (Abb.
4.34). Die beiden Moleküle liegen „Kopf“ zu „Kopf“ zueinander, wobei die Kontaktfläche
über die β-Faltblattstränge β1 bis β3, die α1-Helix und beide Switch I-Regionen entsteht und
eine Gesamtfläche von 1347 Å2 besitzt. Durch Größenausschlusschromatographie konnte
gezeigt werden, dass Rac1b in Lösung monomer vorliegt und dieses Dimer damit rein
kristallographisch bedingt ist.
Die in Abb. 4.34 dargestellte Überlagerung von Rac1b∆C·GDP und GppNHp zeigt, dass sich
die beiden Strukturen in ihren Sekundärstrukturelementen nicht unterscheiden. Berechnet man
die mittlere Abweichung der Atomkoordinaten für die Cα-Atome der asymmetrischen
Einheiten der beiden Strukturen, so erhält man einen sehr niedrigen Wert von 0,22 Å (für 336
Cα-Atome). Marginale Unterschiede zwischen der GDP und der GppNHp Struktur sind nur
im Bereich des C-Terminus von Molekül A und am C-Terminus der β3-Stränge zu erkennen.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 115
Abb. 4.33: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheiten von Rac1b∆C·GDP und GppNHp. Aufgetragen sind die gemittelten Temperaturfaktoren gegen die Sequenzposition.
Rac1b∆C·GDP Molekül B
Aminosäure
10 30 50 70 90 110
130
150
170
190
Mitt
lere
r Tem
pera
turfa
ktor
0
20
40
60
Rac1b∆C·GDP Molekül A
Aminosäure
10 30 50 70 90 110
130
150
170
190
Mitt
lere
r Tem
pera
turfa
ktor
0
20
40
60
Rac1b∆C·GppNHp Molekül A
Aminosäure
10 30 50 70 90 110
130
150
170
190
Mitt
lere
r Tem
pera
turfa
ktor
0
20
40
60
Rac1b∆C·GppNHp Molekül B
Aminosäure
10 30 50 70 90 110
130
150
170
190
Mitt
lere
r Tem
pera
turfa
ktor
0
20
40
60
Abb. 4.34: Überlagerung der asymmetrischen Einheiten von Rac1b∆C·GDP und GppNHp. Die Struktur von Rac1b∆C·GDP ist in blau dargestellt; die von Rac1b∆C·GppNHp in rot. Die Nukleotide der beiden Moleküle sind als ball-and-stick-Modelle und das Mg2+-Ion als Kugel dargestellt.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 116
Rac1b ∆C·GDP
Rac1b ∆C·GppNHp
Die sterisch sinnvolle Verteilung der φ/ψ-Winkel der vier Moleküle geht aus dem
dargestellten Ramachandran Diagramm (Abb. 4.35; Ramachandran & Sasisekharan, 1968;
Laskowski et al., 1993) hervor. Für die GDP-Struktur besitzen 93,0 % aller nicht Gly-Reste
φ/ψ-Winkel in bevorzugten Bereichen und 7,0 % der Aminosäuren liegen in zusätzlich
erlaubten Bereichen. Vergleichbar ist die Situation für die GppNHp-Struktur mit 91,7 % der
Aminosäuren in den bevorzugten Bereichen und 8,3 % in den zusätzlich erlaubten Bereichen.
4.4.8 GDP/GppNHp-Bindung von Rac1b∆C
Abbildung 4.36 zeigt eine schematische Darstellung der Nukleotidbindung mit den möglichen
Wasserstoffbrückenbindungen und ionischen Wechselwirkungen, während Abb. 4.37 den
Ausschnitt einer Elektronendichte der Nukleotidbindungsstellen von Rac1b∆C·GDP und
Rac1b∆C·GppNHp zeigt.
Für die Nukleotidbindung von kleinen GTPasen sind fünf sehr konservierte Sequenzmotive
von entscheidender Bedeutung (Bourne et al., 1991). Der P-Loop (13AVGKT Motiv) spielt
eine wichtige Rolle bei der Bindung des Phosphatanteils der Nukleotide und ist ebenso an der
Koordination des Mg2+-Ions durch Thr17 beteiligt (Abb 4.36). Das 134TKLD- und das 176CSAL-Motiv (115TKLD bzw. 157CSAL-Motiv, Rac1 Nummerierung) interagieren direkt mit
der Guaninbase und sichern so die Guanin-Spezifität der GTPase. Die zentrale Region des
Switch I (32YIPT) und der N-Terminus des Switch II (57DTAGQ), die für die
Abb. 4.35: Ramachandran-Diagramme von Rac1b∆C·GDP und GppNHp.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 117
Magnesiumkoordination und die Bindung des γ-Phosphat verantwortlich sind, zeigen die
größten strukturellen Unterschiede im Vergleich zwischen Rac1b und Rac1. Der Switch I ist
nicht über Thr35 an der Koordination des Magnesiumions beteiligt und zeigt im Vergleich zu
Rac1 eine offene Konformation (siehe 5.2.3). Durch die Interaktion mit dem NCS-verwandten
Molekül ist er sehr gut definiert. Die Interaktionsfläche der beiden Moleküle ist hydrophober
Natur und wird durch die jeweiligen Aminosäuren Phe37, Tyr40 und Ile21 ausgebildet.
Der Switch II und die darauf folgende 19 Aminosäuren lange Insertion hingegen, konnten in
der Elektronendichte nicht beobachtet werden. Diese Beobachtung ist ein Indiz dafür, dass
diese Insertion sehr mobil ist und weiterhin zu einer höheren Mobilität des Switch II führt
(siehe 5.2.2).
Abb. 4.36: Nukleotidbindung von Rac1b. A Rac1b∆C·GDP; B Rac1b∆C·GppNHp; Die beiden dargestellten Skizzen zeigen die Nukleotidbindung an Rac1b. Der Cofaktor Mg2+ ist entsprechend hervorgehoben. Wassermoleküle wurden mit einem W gekennzeichnet. Die gestrichelten Linien entsprechen Wasserstoffbrückenbindungen mit den in Å angegebenen Distanzen.
A: Rac1b∆C·GDP
B: Rac1b∆C·GppNHp
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 118
Die Koordination des zentralen Magnesiumions erfolgt, wie in den Abb. 4.36 und 4.37
dargestellt, in Rac1b∆C·GDP durch das β-Phosphat, Thr17 und vier Wassermoleküle (W1,
W2, W116 und W117). In der GppNHp-Struktur ist hingegen das β- und das γ-Phosphat,
sowie Thr17 an der Koordination beteiligt. Die restlichen Bindungsstellen werden durch die
Wassermoleküle W1, W142 und W167 eingenommen. Wie oben schon angedeutet, ist die
Carbonylfunktion von Thr35 nicht an der Koordination des Magnesiumions beteiligt (siehe
5.2.3). Diese Bindungsstelle wird in den Rab1b·GDP- und GppNHp-Strukturen jeweils durch
die Wassermoleküle W1 besetzt (Abb. 4.36).
Abb. 4.37: Stereo-Darstellung des aktiven Zentrums von Rac1b∆C·GDP (A) und GppNHp (B). Dargestellt ist die endgültige 2Fo-Fc-Elektronendichtekarte bei einer Kontourierung von 1σ. Für das Nukleotid wurde ein ball-and-stick-Modell gewählt. Wassermoleküle innerhalb des aktiven Zentrums wurden in Orange, während das Mg2+-Ion in Türkis wiedergegeben wurde. C Struktureller Vergleich des P-loop und der Switch I-Region von Rac1b·GppNHp (rot), Rac1·GppNHp (braun; Hirshberg et al., 1997) und des nukleotidfreien Komplexes von Rac1·Tiam1 (grün; Worthylake et al., 2000). Die Seitenketten von Tyr32, Ile33 und Pro34 sind als stick-Modell dargestellt, während Thr35 als ball-and-stick-Modell gezeigt wird.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 119
4.5 Die Kristallstrukturen von TC10
Die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur von Molekülen ist Voraussetzung für das
Verständnis ihrer Wechselwirkung auf atomarer Ebene. Von der Struktur von TC10, sowohl
im GDP als auch im GTP gebundenen Zustand, wurde ein Beitrag zum Verständnis der
Signaltransduktion dieser GTPase erwartet. TC10 ist in der Familie der Rho-GTPasen ein
bisher noch wenig charakterisiertes Mitglied, so dass eine dreidimensionale Struktur als
Grundlage für die Suche nach Interaktionspartnern dienen sollte. Von besonderem Interesse
sollten weiterhin die Unterschiede zwischen dem aktiven und dem inaktiven Zustand sein.
Ein zusätzlicher interessanter Aspekt sollte der verlängerte N-Terminus von TC10 sein, über
den weder strukturell noch funktionell etwas bekannt ist. Aus diesem Grund wurden sowohl
TC10∆C als auch TC10∆NC (Abb. 4.38) für die Kristallisation verwendet.
4.5.1 Verwendete Proteine
Die Klonierung, Expression und Reinigung von TC10∆C und TC10∆NC erfolgte durch A.
Eberth. Abbildung 4.38 zeigt die verwendeten Fragmente im Vergleich zum Wildtyp-Protein.
Alle verwendeten Proteine besaßen einen hohen Reinheitsgrad und waren unter den
verwendeten Bedingungen stabil (Abb. 4.3). Bedingt durch die intrinsische GTP-Hydrolyse
von TC10 wurden die Proteine in ihrer GDP gebundenen Form isoliert und konnten als solche
direkt für die Kristallisation verwendet werden.
4.5.2 Nukleotidaustausch
Da GTPasen ihre biologische Aktivität abhängig vom Nukleotidzustand wahrnehmen, müssen
sich die Komplexe in ihrer Struktur unterscheiden. Der Nukleotidzustand bestimmt, ob eine
Wechselwirkung mit Effektormolekülen möglich ist. Um TC10 im GTP-gebundenen Zustand
zu kristallisieren, musste das nach der Reinigung gebundene GDP entfernt und durch ein nicht
Abb. 4.38: Übersicht über die von TC10 verwendeten Konstrukte. Zahlen geben die N- und C-terminale Aminosäure des verwendeten Fragmentes an.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 120
hydrolysierbares GTP-Analog ersetzt werden. Dementsprechend wurden jeweils 20 mg
TC10∆C und TC10∆NC mit GppNHp beladen. Die sich anschließende Gelfiltration diente
dazu, hydrolysiertes Nukleotid (vom GDP stammend) und überschüssiges GppNHp vom
GppNHp beladenen TC10 abzutrennen. Gleichzeitig wurde hierdurch das Protein in
Kristallisationpuffer (20 mM Tris pH 7.5, 2 mM MgCl2 und 2 mM DTT) überführt. Die
Konzentrierung auf 10 mg/ml erfolgte durch Ultrafiltration.
Um die Vollständigkeit des Austausches zu überprüfen und um die erfolgreiche
Nukleotidbindung nachzuweisen, wurde die Nukleotidbeladung mittels HPLC überprüft.
Beide Proteine waren vollständig und ausschließlich mit GppNHp beladen.
4.5.3 Kristallisation
TC10∆C GDP
Für die Kristallisation des gereinigten GDP-gebundenen TC10∆C Proteins wurde zum
Austesten von Kristallisationsbedingungen der Hampton Crystal Screen I und der PEG/Ion
Screen verwendet. Es wurden 2 µl der jeweiligen Reservoirlösungen mit 2 µl einer 0,5 mM
TC10∆C-Lösung nach dem Verfahren des hängenden Tropfens bei 20 °C inkubiert.
Initiale Kristallisationsbedingungen für TC10∆C, in Form von Spheruliten, ergaben sich nach
etwa 2 Tagen aus der Bedingung sechs des Hampton Crystal Screen. Diese Bedingung enthält
200 mM MgCl2, 100 mM Tris/HCl pH 8,5 und 30 % PEG4000 (Abb. 4.39A). Durch eine
gezielte Variation der Salzkonzentration, der Pufferzusammensetzung und des PEG-Gehaltes
konnte die initiale Bedingung verbessert werden. Durch Verwendung von HEPES-Puffer pH
7,5 und einer geringeren PEG3350-Konzentration wurden kleine, aber unregelmäßig
aufgebaute Kristalle erhalten (Abb. 4.39B). Verhältnissmässig große Einkristalle von TC10
wurden nach dreiwöchiger Inkubation unter Verwendung von 100 mM Tris/HCl pH 8,5, 190-
200 mM MgCl2 und 7-9 % PEG4000 als Reservoirlösung erhalten (Abb. 4.39C und D). Für
die finalen Ansätze wurde eine 1 mM Proteinlösung verwendet, da durch eine Erhöhung der
Proteinkonzentration die Kristalle vergrößert werden konnten.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 121
TC10∆C GppNHp
Für die Kristallisation des GppNHp-gebundenen TC10∆C Proteins wurde zunächst die
Kristallisationsbedingung von TC10∆C GDP (100 mM Tris/HCl pH 8,5, 190-200 mM MgCl2
und 7-9 % PEG4000) getestet. Es wurden 2 µl Reservoirlösung mit 2 µl einer 0,5 mM Lösung
von TC10∆C·GppNHp gemischt. Unter dieser Bedingung wurden innerhalb einer Stunde die
in Abb. 4.40 abgebildeten Kristalle erhalten. Die dargestellten Kristalle zeigen deutliche
Verwachsungen und erschienen schon optisch nur bedingt für eine Datensammlung geeignet.
Durch Variation der MgCl2-Konzentration, der PEG-Konzentration, des PEG-
Molekulargewichts und der Pufferzusammensetzung wurde die Bedingung optimiert. Es
konnten allerdings keine Einkristalle erhalten werden.
A B
C D
Abb. 4.39: Optimierung der Kristallisationsbedingungen von TC10∆C·GDP. Dargestellt ist jeweils ein Ausschnitt aus den Tropfen. A 100 mM Tris/HCl pH 8,5, 200 mM MgCl2, 30% PEG 4000 (4 fache Vergrößerung), B 100 mM HEPES pH 7,5, 250 mM MgCl2, 25% PEG 3350 (10 fache Vergrößerung), C und D 100 mM Tris/HCl pH 8,5, 190-200 mM MgCl2, 7-9% PEG 4000 (10 fache Vergrößerung).
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 122
Zum Austesten von weiteren Kristallisationsbedingungen wurde der Hampton Crystal Screen
I und der PEG/Ion Screen verwendet. Es wurden auch hier 2 µl der jeweiligen
Reservoirlösungen mit 2 µl einer 0,5 mM TC10∆C·GppNHp-Lösung nach dem Verfahren des
hängenden Tropfens bei 20 °C inkubiert. Der PEG/Ion Screen war hier mit 16 initialen
Bedingungen besonders erfolgreich. Abbildung 4.41 ist eine Übersicht der erhaltenen
Kristalle unter verschiedenen Bedingungen.
Kritisch für das Kristallwachstum waren das Molekulargewicht der PEG-Lösung (PEG3350)
und die PEG-Konzentration. Die Art des Salzes war hingegen weniger kritisch, wie die große
Anzahl an Treffern im PEG/Ion Screen zeigt. Unter Bedingung 6, mit 200 mM NaCl,
wuchsen Kristallrosetten, die nachträglich vereinzelt werden konnten (Abb. 4.41E). Diese
Bedingung konnte durch eine Variation des Puffers (MES pH 6.0) optimiert werden (Abb.
4.41F).
A B
Abb. 4.40: Optimierung der Kristallisationsbedingungen von TC10∆C·GppNHp. Dargestellt ist jeweils ein Ausschnitt aus den Tropfen unter folgender Bedingung 100 mM Tris/HCl pH 8,5, 190-200 mM MgCl2, 7-9% PEG 4000. A 4 fache Vergrößerung, B 10 fache Vergrößerung.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 123
TC10∆NC GDP
Erste Kristalle von TC10∆NC·GDP wurden durch Mischen einer 0,5 mM Proteinlösung mit
200 mM CaCl2 und 20 % PEG 3350 nach der Methode des hängenden Tropfen bei 20 °C
erhalten (Abb 4.42A). Durch Absenken der PEG-Konzentration und Variation der
Salzkonzentration konnten die Kristalle vergrößert werden. Im weiteren Verlauf zeigte sich,
dass zweiwertige Kationen (Mg2+, Ca2+ oder Mn2+) für die Kristallisation wichtig sind.
Allerdings konnte dadurch keine weitere Verbesserung der Diffraktionseigenschaften im
Vergleich zu CaCl2 erreicht werden. Auch die Verwendung von Puffern hatte lediglich einen
negativen Einfluss. Als finale Kristallisationsbedingung wurde eine Lösung aus 180-210 mM
CaCl2 und 14-16 % PEG 3350 verwendet.
A B
C D
E F
Abb. 4.41: PEG/Ion Kristallisationsbedingungen von TC10∆C·GppNHp. Dargestellt ist jeweils ein Ausschnitt aus den Tropfen in 10 facher Vergrößerung. A PEG/Ion 3; B PEG/Ion 7; C PEG/Ion 23; D PEG/Ion 42; E PEG/Ion 6; F 100 mM MES pH 6.0, 200 mM NaCl, 20 % PEG 3350.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 124
4.5.4 Datenaufnahme und –prozessierung
Die Stabilität von Kristallen im Allgemeinen ist bei Bestrahlung mit Röntgenlicht begrenzt.
Der Grund hierfür ist die Absorption von Röntgenlicht durch das Protein oder durch das im
Kristall enthaltene Wasser. In Folgereaktionen kommt es dabei zur homo- oder
heterolytischen Spaltung von chemischen Bindungen. Nach der Bildung von freien Radikalen
aus Wasser können in Kettenreaktionen viele Bindungen in Proteinmolekülen gespalten
werden. Besonders problematisch sind in diesem Zusammenhang
Raumtemperaturmessungen, da die entstandenen freien Radikale frei in den Kanälen des
Kristalls diffundieren können. Dementsprechend wurde wie im Folgenden beschrieben nach
Kryobedingungen gesucht. Der Vorteil von Messungen bei niedrigen Temperaturen ist eine
Inhibition der Diffusion, wodurch wiederum Strahlenschäden am Kristall verringert werden
können.
TC10∆C·GDP
Um die Kristalle von TC10∆C·GDP längerfristig haltbar zu machen und Strahlenschäden bei
einer Datenaufnahme an einer Syncrotron-Röntgenquelle zu minimieren, wurde nach einem
Kryoprotektionsmittel gesucht. Hierzu wurden Lösungen von Glycerol, PEG 4000, PEG400,
Xylitol und Sucrose mit der Reservoirlösung 100 mM Tris/HCl pH 8,5, 190-200 mM MgCl2
und 7-9 % PEG 4000 vermischt. Die Konzentrationen und die Einwirkdauer der
Kryoprotektionsmittel wurden variiert und die Streueigenschaften der gefrorenen Kristalle
A B
Abb. 4.42: Optimierung der Kristallisationsbedingungen von TC10∆NC·GDP. Dargestellt ist jeweils ein Ausschnitt aus den Tropfen mit 10 facher Vergrößerung. A initiale Bedingung (Nr. 7) des PEG/Ion Screens, B optimierte Kristallisationsbedingung (180-210 mM CaCl2, 14-16 % PEG 3350).
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 125
untereinander verglichen. Als geeignet erwies sich eine Lösung von 100 mM Tris/HCl pH
8,5, 200 mM MgCl2, 8 % PEG 4000 und 25 % Glycerol.
Von einem TC10∆C·GDP Kristall aus 100 mM Tris/HCl pH 8,5, 200 mM MgCl2, 8 % PEG
4000 und einer 1 mM Proteinlösung wurde an der ESRF (European Syncrotron Radiation
Facility) Röntgenquelle ID14-EH4 ein nativer Datensatz aufgenommen. Einige der
verwendeten Messparameter sind in Tabelle 4.15 zusammengefasst. Durch die hohe Intensität
an einer Syncrotronstrahlenquelle konnte die maximale Auflösung von etwa 3 Å an einer
Drehanode auf 2,2 Å verbessert werden.
Tab. 4.15: Datensammlung an TC10∆C GDP 1. Teil 2. Teil
Anzahl der Bilder 120 70Detektor ADSC Q4 CCD ADSC Q4 CCDRöntgenquelle ESRF ID14-EH4 ESRF ID14-EH4Wellenlänge (λ, D) 0,9796 0,9796
Anzahl der Oszillationen 1 1Startwinkel (ϕ, °) 0 70Endwinkel (ϕ, °) 84 105Winkel pro Bild (°) 0,7 0,5Detektor-Abstand (mm) 180 180Maximale Auflösung (D) 2,2 2,2
Die Indizierung und Integration der gemessenen Intensitäten wurde mit XDS (Kabsch, 1993)
durchgeführt. Durch die Indizierung des Datensatzes konnte die Raumgruppe auf ein
tetragonales Gitter eingeschränkt werden. Charakteristisch hierfür sind eine vierzählige und
zwei dazu senkrecht stehende zweizählige Achsen (P422). Das Vorliegen einer
Schraubenachse war wahrscheinlich, da jeder zweite Reflex auf der l-Achse systematisch
abwesend war. Für 12 der gemessen systematisch abwesenden Reflexionen war die mittlere
gemessene Intensität dieser Reflexe -0,5 % der mittleren Gesamtintensität. Die danach
möglichen Raumgruppen waren P4(2)22 und P4(2)2(1)2. Anhand der h- und der k-Achse
konnte keine weitere Einschränkung getroffen werden, da die Daten hier nicht eindeutig
genug waren. Die Prozessierung der Intensitätsdaten erfolgte deshalb zunächst in P422. Durch
die Lösung des molekularen Ersatzes zeigte sich, dass P4(2)22 die richtige Raumgruppe war.
Trägt man den Quotienten aus den gemessenen Intensitäten und den theoretischen
Streuintensitäten ungeordneter Atome gegen die Auflösung auf, so erhält man eine
Abschätzung für den mittleren Temperaturfaktor (B) der Atome in der Einheitszelle (French
& Wilson, 1978).
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 126
sin2(θ)/λ2
0 0,02 0,04 0,06
log(
<I>)
10
12
14
Das Wilsondiagramm des TC10∆C·GDP Datensatzes ist in Abb. 4.43 dargestellt. Es wurden
die Intensitätsdaten im Auflösungsbereich von 20 bis 2,2 Å verwendet. Die Auflösung ist in
Einheiten von ( ) 22 /sin λθ aufgetragen, mit λ der Wellenlänge des Röntgenlichts und θ als
Beugungswinkel. Nach linearer Regression ergibt sich aus dem y-Achsenabschnitt der
Skalierungsfaktor des Datensatzes (13,98), mit dem die Strukturfaktoramplituden der Atome
relativ zu der eines Elektrons normiert werden können. Aus der Steigung der Geraden erhält
man den mittleren Temperaturfaktor (B = 38 Å2).
Die nachfolgende Tabelle (Tab. 4.16) fasst die wesentlichen Kristallparameter und die
Statistik der Datenprozessierung zusammen.
Abb. 4.43: Wilsondiagramm des TC10∆C·GDP Datensatzes. Die Abbildung zeigt die Intensitätsverteilung (log(<I>)) in Abhängigkeit von der Auflösung (20-2,2 Å) in Einheiten von
( ) 22 /sin λθ .
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 127
Tab. 4.16: Datenprozessierung von TC10∆C GDP
KristallAbmessungen (mm) 0,2 x 0,2 x 0,5Alter (d) 21Raumgruppe P4(2)22 / Nr. 93Einheitszelle (D) a = b = 113,3 c = 84,0
α = β = γ = 90°VM (D3/Da) 3,4Zahl der Moleküle pro asym. Einheit 2Lösungsmittelgehalt (%) 63,2Auflösungbereich (D) 20 - 2,2Mosaizität (°) 0,8
Statistik 1. Teil 2. TeilZahl der Reflexe/Zahl der unabhängigen Reflexe 190125 / 28315 79056 / 28085Redundanz (-fach) 6,7 2,8Rsym (%, alle Reflexe, äußere Schale) 10,1 / 43,8 6,7 / 27,4Vollständigkeit (%, alle Reflexe, äußere Schale) 99,8 / 100 99,8 / 99,0Signal/Rausch-Verhältnis (alle Reflexe, äußere Schale) 12,39 / 4,38 9,78 / 3,47
Der zweite Teil der Datensammlung zeigt einen deutlich niedrigeren R-Faktor für den
Vergleich der symmetrieverwandten Reflexe (Rsym = 6,7 % vgl. zu 10,1 %) und war
ausreichend vollständig, so dass für die weitere Strukturaufklärung nur dieser zweite Teil
verwendet wurde. Die Ursache für diesen Unterschied könnte die Verwendung des kleineren
∆ϕ-Winkels während der Datensammlung sein (Tab. 4.15), da dadurch die einzelnen Reflexe
besser voneinander getrennt sind. Dies macht sich, bedingt durch die starken Reflexe,
besonders im niedrigen Auflösungsbereich bemerkbar.
Für einen molekularen Ersatz ist es wichtig, die Anzahl der Moleküle in der Einheitszelle
bzw. in der asymmetrischen Einheit abschätzen zu können. Hierzu ermittelt man zunächst aus
den Zellkonstanten das Volumen der Einheitszelle. Die Divison durch die Masse der darin
enthaltenen Proteinatome definiert dann den Matthewsparameter VM (Å3/Da). Da ein
durchschnittlicher Proteinkristall etwa zu 50 % Wasser enthält, liegt dieser Wert für
Proteinkristalle zwischen 1,7 und 3,0 Å3/Da mit einem Durchschnittswert von 2,6 Å3/Da
(Matthews, 1968).
Das Zellvolumen liegt in diesem Fall bei 1078300 Å3. Das Molekulargewicht von TC10∆C
beträgt etwa 20 kDa. Aufgrund der tetragonalen Symmetrie ist die Einheitszelle aus acht
asymmetrischen Einheiten aufgebaut. Mit einem Molekül TC10∆C pro asymmetrischer
Einheit ergibt sich daher ein Matthews Koeffizient von 6,7. Mit zwei Molekülen erhält man
einen Wert von 3,4 bzw. mit drei Molekülen einen von 2,2. Dementsprechend sind zwei bis
drei Moleküle TC10∆C pro asymmetrischer Einheit am wahrscheinlichsten. Der molekulare
Ersatz zeigte, dass zwei Moleküle in der asymmetrischen Einheit enthalten waren.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 128
TC10∆C GppNHp
Um die Kristalle von TC10∆C·GppNHp mit einem Kryoprotektionsmittel zu schützen,
wurden Lösungen von Glycerol, PEG 3350, PEG400, Xylitol und Sucrose mit der
Reservoirlösung 100 mM MES pH 6,0, 200 mM NaCl und 20 % PEG 3350 vermischt. Als
geeignet erwies sich eine Lösung von 100 mM MES pH 6,0, 200 mM NaCl und 20 % PEG
3350 und 15 % Glycerol.
Von einem der erhaltenen TC10∆C·GppNHp Kristalle wurde an der ESRF (European
Syncrotron Radiation Facility) Röntgenquelle ID14-EH1 ein nativer Datensatz aufgenommen.
Einige der verwendeten Messparameter sind in Tabelle 4.17 zusammengefasst. Die maximale
Auflösung dieser Kristalle betrug 2,6 Å.
Tab. 4.17: Datensammlung an TC10∆C GppNHp
Anzahl der Bilder 145Detektor ADSC Q4 CCDRöntgenquelle ESRF ID14-EH1Wellenlänge (λ, D) 0,934
Anzahl der Oszillationen 1Startwinkel (ϕ, °) 0Endwinkel (ϕ, °) 145Winkel pro Bild (°) 1Detektor-Abstand (mm) 225Maximale Auflösung (D) 2,6
Die Indizierung und Integration der gemessenen Intensitäten wurde mit XDS (Kabsch, 1993)
durchgeführt. Durch die Indizierung des Datensatzes konnte die Raumgruppe auf ein primitiv
orthogonales Gitter eingeschränkt werden. Charakteristisch hierfür sind drei senkrecht
zueinander stehende Achsen (P222). Das Vorliegen einer Schraubenachse war
wahrscheinlich, da jeder zweite Reflex auf allen drei hkl-Achsen systematisch abwesend war.
Für 73 der gemessenen systematisch abwesenden Reflexionen betrug die mittlere gemessene
Intensität dieser Reflexe 1,7 % der mittleren Gesamtintensität. Die danach wahrscheinlichste
Raumgruppe war P2(1)2(1)2(1). Da die Aussagen auf der Basis der systematischen
Abwesenheiten nicht immer absolut eindeutig sind, erfolgte die Prozessierung der
Intensitätsdaten zunächst in P222. Der molekulare Ersatze zeigte, dass P2(1)2(1)2(1) die
richtige Raumgruppe war.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 129
sin2(θ)/λ2
0 0,02 0,04
log(
<I>)
8
10
12
14
Das Wilsondiagramm des TC10∆C·GppNHp Datensatzes zeigt in Abb. 4.44 die
Intensitätsdaten im Auflösungsbereich von 20 bis 2,6 Å. Der Skalierungsfaktor des
Datensatzes beträgt 13,014, während der mittlere Temperaturfaktor des Datensatzes B = 58
Å2 beträgt.
Die wesentlichen Kristallparameter und die Statistik der Datenprozessierung sind in Tabelle
4.18 zusammengefasst.
Tab. 4.18: Datenprozessierung von TC10∆C GppNHp
KristallAbmessungen (mm) 0,1 x 0,1 x 0,4Alter (d) 7Raumgruppe P2(1)2(1)2(1) / Nr. 19Einheitszelle (D) a = 43,69 b = 82,20 c = 114,31
α = β = γ = 90°VM (D3/Da) 2,6Zahl der Moleküle pro asym. Einheit 2Lösungsmittelgehalt (%) 51,7Auflösungbereich (D) 20 - 2,6Mosaizität (°) 1,4
StatistikZahl der Reflexe/Zahl der unabhängigen Reflexe 75580 / 13159Redundanz (-fach) 5,7Rsym (%, alle Reflexe, äußere Schale) 4,8 / 34,8Vollständigkeit (%, alle Reflexe, äußere Schale) 99,4 / 100Signal/Rausch-Verhältnis (alle Reflexe, äußere Schale) 22,37 / 5,41
Abb. 4.44: Wilsondiagramm des TC10∆C·GppNHp Datensatzes. Die Abbildung zeigt die Intensitätsverteilung (log(<I>)) in Abhängigkeit von der Auflösung (20-2,6 Å) in Einheiten von
( ) 22 /sin λθ .
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 130
Das Zellvolumen liegt in diesem Fall bei 410523 Å3. Das Molekulargewicht von TC10∆C
beträgt etwa 20 kDa. Aufgrund der orthogonalen Symmetrie ist die Einheitszelle aus 4
asymmetrischen Einheiten aufgebaut. Mit einem Molekül TC10∆C pro asymmetrischer ergibt
sich ein Matthews Koeffizient von 5,1 Å3/Da. Mit zwei Molekülen erhält man einen Wert von
2,6 Å3/Da. Durch den molekularen Ersatz konnten zwei Moleküle pro asymmetrischer Einheit
bestätigt werden.
TC10∆NC GDP
Zur Kryoprotektion wurden die Kristalle von TC10∆NC·GDP in Lösungen von Glycerol,
PEG 3350, PEG400, Xylitol und Sucrose vermischt mit der Reservoirlösung aufgenommen.
Als geeignet erwies sich eine Lösung von 200 mM CaCl2 und 15 % PEG 3350 und 20 %
Glycerol. Da die Kristalle beim direkten Transfer in das Kryoprotektionsmittel an Ordnung
verloren, erfolgte ein serieller Transfer mit ansteigenden Glycerolkonzentrationen (5 %, 10 %,
15 % und 20 %). Die Verweildauer der Kristalle betrug in den jeweiligen Lösungen etwa 1
min. Mit dem seriellen Transfer konnten die Kristalle dann unter kryogenen Bedingungen
stabilisiert werden. Ebenfalls sehr gute Kryoprotektionseigenschaften wurden mit Mineral-Öl
(Sigma) erzielt. Hierbei wurde der Kristall direkt in das Öl transferiert, von der ihn
umgebenden Mutterlösung befreit und dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
Von einem TC10∆NC·GDP Kristall aus 180-210 mM CaCl2 und 14-16 % PEG 3350 wurde
an der ESRF (European Syncrotron Radiation Facility) Röntgenquelle ID14-EH4 ein nativer
Datensatz aufgenommen. Einige der verwendeten Messparameter sind in Tabelle 4.19
zusammengefasst.
Tab. 4.19: Datensammlung an TC10∆NC GDP 1. Teil 2. Teil 3. Teil
Anzahl der Bilder 100 240 120Detektor ADSC Q4 CCD ADSC Q4 CCD ADSC Q4 CCDRöntgenquelle ESRF ID14-EH4 ESRF ID14-EH4 ESRF ID14-EH4Wellenlänge (λ, D) 0,9198 0,9198 0,9198
Anzahl der Oszillationen 1 1 1Startwinkel (ϕ, °) 0 55 55Endwinkel (ϕ, °) 30 127 127Winkel pro Bild (°) 0,3 0,3 0,6Detektor-Abstand (mm) 215 215 335Maximale Auflösung (D) 2,06 2,06 2,45
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 131
Die Indizierung und Integration der gemessenen Intensitäten wurde mit XDS (Kabsch, 1993)
durchgeführt. Durch die Indizierung des Datensatzes konnte die Raumgruppe auf ein
tetragonales Gitter eingeschränkt werden. Charakteristisch hierfür sind eine vierzählige und
zwei dazu senkrecht stehende zweizählige Achsen (P422). Das Vorliegen einer
Schraubenachse (P4(3)22) war wahrscheinlich, da nur jeder vierte Reflex auf der l-Achse
systematisch vorhanden war. Für 72 der gemessenen systematisch abwesenden Reflexionen
betrug die mittlere gemessene Intensität dieser Reflexe 3,6 % der mittleren Gesamtintensität.
Da die Aussagen auf der Basis der systematischen Abwesenheiten nicht immer absolut
eindeutig sind erfolgte die Prozessierung der Intensitätsdaten zunächst in P422. Durch die
Lösung des molekularen Ersatzes zeigte sich, dass P4(3)22 die richtige Raumgruppe war.
sin2(θ)/λ 2
0 0,02 0,04 0,06
log(
<I>)
10
12
14
Das Wilsondiagramm (Abb. 4.45) zeigt den Auflösungsbereich von 20 bis 2,2 Å. Als Faktor
für die Skalierung der Daten ergibt sich ein Wert von 14,3. Der mittlere Temperaturfaktor ist
B = 36,3 Å2.
Abb. 4.45: Wilsondiagramm des TC10∆NC·GDP Datensatzes. Die Abbildung zeigt die Intensitätsverteilung (log(<I>)) in Abhängigkeit von der Auflösung (20-2,2 Å) in Einheiten von
( ) 22 /sin λθ .
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 132
Tabelle 4.20 zeigt die Statistik der Datenprozessierung.
Tab. 4.20: Datenprozessierung von TC10∆NC GDP
KristallAbmessungen (mm) 0,05 x 0,05 x 0,8Alter (d) 7Raumgruppe P4(3)22 / Nr. 95Einheitszelle (D) a = b = 73,87 c = 289,95
α = β = γ = 90°VM (D3/Da) 2,5Zahl der Moleküle pro asym. Einheit 4Lösungsmittelgehalt (%) 49,9Auflösungbereich (D) 20 - 2,2Mosaizität (°) 1,25
StatistikZahl der Reflexe/Zahl der unabhängigen Reflexe 395458 / 39621Redundanz (-fach) 9,98Rsym (%, alle Reflexe, äußere Schale) 7,4 / 15,5Vollständigkeit (%, alle Reflexe, äußere Schale) 94,2 / 84,5Signal/Rausch-Verhältnis (alle Reflexe, äußere Schale) 20,74 / 11,32
Das Zellvolumen liegt in diesem Fall bei 1582193 Å3. Aufgrund der tetragonalen Symmetrie
ist die Einheitszelle aus 8 asymmetrischen Einheiten aufgebaut. Mit einem Molekül
TC10∆NC pro asymmetrischer Einheit ergibt sich ein Matthews Koeffizient von 9,9 Å3/Da.
Mit zwei Molekülen erhält man einen Wert von 4,9 Å3/Da, mit drei 3,3 Å3/Da und mit vier
2,5 Å3/Da. Demnach sind drei bis fünf Moleküle wahrscheinlich. Der molekulare Ersatz
zeigte, dass vier Moleküle in der asymmetrischen Einheit enthalten sind.
4.5.5 Eigenrotationsfunktionen
Die Eigenrotationsfunktion vergleicht die Eigen-Patterson-Funktion mittels einer Rotation um
ein Winkelinkrement mit sich selbst. Dadurch entstehen Maxima bei allen Rotationswinkeln,
die einer kristallographischen bzw. nichtkristallographischen Symmetrieoperation
entsprechen. Bei der Berechnung der Patterson-Funktion geht die Information für die
Translation verloren. Daraus folgt, dass die Rotationsfunktionen für alle durch Translation
(Schraubenachsen) abgeleiteten Raumgruppen gleich sind.
Ist in einer asymmetrischen Einheit mehr als ein Molekül vorhanden, so sind die beiden
Moleküle durch eine nichtkristallographische Symmetrieoperation (NCS) miteinander
verwandt. Diese zusätzliche Symmetrie kann unter Umständen in der Eigenrotationsfunktion
beobachtet werden, so dass die Eigenrotationsfunktion Aufschluss über den Aufbau des
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 133
Kristalls gibt. Da in allen drei beschriebenen Datensätzen mehr als ein Molekül pro
asymmetrischer Einheit erwartet wurde, war eine Interpretation der Eigenrotationsfunktion
von besonderem Interesse.
TC10∆C·GDP
Für die Berechnung der Eigenrotationsfunktion des TC10∆C·GDP Datensatzes wurde das
Programm POLARRFN (CCP4, 1994) verwendet. Es berechnet die Maxima der
Rotationsfunktion in Polarkoordinaten (ω, θ, mit Drehwinkel κ). Die wahrscheinlichste nicht-
kristallographische Symmetrie für Proteinkristalle entspricht einer zweizähligen Achse, die
durch die κ = 180° Sektion repräsentiert wird. Die Eigenrotationsfunktion für diesen
Datensatz ist in Abb. 4.46 dargestellt.
TC10∆C·GDP kristallisierte in einer tetragonalen Raumgruppe (P422), so dass eine
vierzählige und zwei dazu senkrechte zweizählige Achsen zu erwarten sind. Da die κ = 180°
Sektion entlang der vierzähligen Hauptachse in die Ebene projiziert ist, erscheint diese in der
Mitte der Projektion. Alle Maxima, die auf dem Rand des Kreises liegen, beschreiben Achsen,
die im rechten Winkel auf der vierzähligen Achse stehen mit ω = 90°. Die Position dieser
Maxima auf dem Kreisrand wird wiederum durch den Winkel θ beschrieben. Er ist am Rande
des Kreises angegeben. Bedingt durch die tetragonale Symmetrie ist die Information in der
Rotationsfunktion redundant, so dass die asymmetrische Einheit durch den Winkelbereich θ =
0°-45° vollständig beschrieben ist. Dabei entsprechen die Maxima bei θ = 0° und 45° jeweils
Abb. 4.46: Stereographische Projektion der κ = 180° Sektion der Eigenrotationsfunktion des TC10∆C·GDP Datensatzes. Die Berechnung erfolgte mit dem Programm POLARRFN (CCP4, 1994). Es wurden Daten im Auflösungsbereich 10-5 Å mit einem Integrationsradius von 28 Å verwendet. Die Konturierung erfolgte bei 50 % der Gesamtsignalhöhe.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 134
den beiden zweizähligen Achsen und sind somit kristallographischen Ursprungs (Abb. 4.46).
Der Vergleich zu Abb. 4.48, in der die Rotationsfunktion des TC10∆NC·GDP Datensatzes
dargestellt ist, der ebenfalls eine tetragonale Symmetrie besitzt, zeigt, dass im TC10∆C·GDP
ein zusätzliches Maximum zwischen 0° und 45° vorhanden ist (θ = 22,5° mit 91 % der
Gesamtsignalhöhe). Damit kann man sagen, dass mindestens zwei Moleküle in der
asymmetrischen Einheit vorliegen müssen, die durch die eben beschriebene NCS miteinander
verwandt sind. Es besteht aber nach wie vor die Möglichkeit eines dritten Moleküls, das nicht
in der Eigenrotationsfunktion gefunden wurde. Eine endgültige Entscheidung hierzu kann erst
nach dem molekularen Ersatz getroffen werden.
TC10∆C·GppNHp
Die Eigenrotationsfunktion des TC10∆C·GppNHp Datensatzes ist in der folgenden Abbildung
4.47 dargestellt. Da dieses Protein in einer orthogonalen Raumgruppe (P222) kristallisierte,
sind drei zueinander senkrechte zweizählige Achsen zu erwarten. Die κ = 180° Sektion zeigt
die erste zweizählige Achse im Mittelpunkt der Projektion. Maxima auf dem Kreisrand (ω =
90°) entsprechen wieder Achsen, die zu der ersten senkrecht stehen. Bei θ = 0° und θ = 90°
sind jeweils Maxima zu erkennen, die der zweiten und dritten Achse entsprechen, so dass die
asymmetrische Einheit vollständig durch den Bereich θ = 0°-90° beschrieben wird. Da hier
keine zusätzlichen Maxima zu erkennen sind, ist zunächst keine Aussage über das Vorliegen
bzw. die Beschaffenheit einer NCS möglich.
Abb. 4.47: Stereographische Projektion der κ = 180° Sektion der Eigenrotationsfunktion des TC10∆C·GppNHp Datensatzes. Die Berechnung erfolgte mit dem Programm POLARRFN (CCP4, 1994). Es wurden Daten im Auflösungsbereich 10-5 Å mit einem Integrationsradius von 28 Å verwendet. Die Konturierung erfolgte bei 50 % der Gesamtsignalhöhe.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 135
TC10∆NC GDP
Die Eigenrotationsfunktion des TC10∆NC·GDP Datensatzes ist in Abbildung 4.48 dargestellt.
Da dieses Protein ebenfalls wie TC10∆C·GDP in einer tetragonalen Raumgruppe
kristallisierte, lassen sich die Eigenrotationsfunktionen gut miteinander vergleichen. Da hier
z.B. im Vergleich zu Abb. 4.46 (TC10∆C·GDP) keine zusätzlichen Maxima zu erkennen sind,
kann keine Aussage über die Beschaffenheit einer NCS gemacht werden.
4.5.5 Molekularer Ersatz
TC10∆C GDP
Um eine Lösung für das Phasenproblem bei TC10∆C·GDP durch molekularen Ersatz zu
finden, wurde die strukturelle Information eines sehr ähnlichen Proteins benötigt. Dieses dient
dann als Suchmodell und wird durch Rotation und anschließende Translation im reziproken
Gitter des gemessenen Datensatzes platziert.
Für den Molekularen Ersatz von TC10∆C·GDP wurde das Programm AMoRe (Navaza, 1993)
verwendet. Als Suchmodell diente das Molekül A der Cdc42 Struktur (PDB Code: 1A4R,
Rudolph et al., 1999), aus dem die beiden Schalterregionen (Switch I und II), das
Magnesiumion, das Nukleotid und die β2/β3-Region entfernt wurden. Da auf der Basis der
Indizierung noch keine absolut eindeutige Aussage bezüglich der Raumgruppe möglich ist,
Abb. 4.48: Stereographische Projektion der κ = 180° Sektion der Eigenrotationsfunktion des TC10∆NC·GDP Datensatzes. Die Berechnung erfolgte mit dem Programm POLARRFN (CCP4, 1994). Es wurden Daten im Auflösungsbereich 10-5 Å mit einem Integrationsradius von 28 Å verwendet. Die Konturierung erfolgte bei 50 % der Gesamtsignalhöhe.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 136
wurden zunächst die Raumgruppen P4(2)22 und P4(2)2(1)2 verwendet. Weiterhin wurden die
Auflösungsbereiche für die Rotations- und die Translationssuche variiert, sowie der
Integrationsradius. In der P4(2)22 Raumgruppe wurde eine eindeutige Lösung mit zwei
Molekülen pro asymmetrischer Einheit gefunden. Die Parameter der Lösung sind in Tabelle
4.21 zusammengefasst.
Tab. 4.21: Molekularer Ersatz für TC10∆C GDP
Suchmodell Cdc42 (Rudolph et al , 1999)Auflösungsbereich Rotation / Translation (D) 10,0-5,0 / 8,0-4,0Pattersonradius (D) 22Rotation für Molekül 1 (Eulerwinkel) 13,7 / 45,35 / 255,29Translation für Molekül 1 (orthogonales System, D) -28,99 / 121,21 / 28,23Rotation für Molekül 2 (Eulerwinkel) 57,40 / 44,45 / 252,83Translation für Molekül 2 (orthogonales System, D) 7,60 / 70,19 / 45,92Korrelationskoeffizient / R-Faktor 47,7 / 46,0Korrelationskoeffizient / R-Faktor (der besten falschen Lsg.) 32,6 / 51,7
Der Korrelationskoeffizient und der R-Faktor dienen als Güteparameter für eine Lösung. Für
eine gute Lösung sollten sie sich um etwa 10 % von der nächstbesten falschen Lösung
abheben. Dies ist hier gegeben: der Unterschied zwischen den Korrelationskoeffizienten
beträgt 15 %, der zwischen den R-Faktoren 5,7 %. Das verwendete Cdc42-Modell wurde mit
den angegebenen Parametern rotiert und translatiert. Die sterische Korrektheit der Lösung
wurde anhand der Packung der symmetrieverwandten Moleküle überprüft. Die anschliessend
berechnete Elektronendichtekarte zeigte eindeutig positive Dichte an den erwarteten
Nukleotidpositionen, so dass man von der Korrektheit der Lösung ausgehen kann (das
Nukleotid war nicht im Modell enthalten).
TC10∆C GppNHp
Für den Molekularen Ersatz von TC10∆C·GppNHp wurde das Programm Molrep (CCP4,
1994) verwendet. Als Suchmodell diente die TC10∆C·GDP-Struktur, aus der das
Magnesiumion und das Nukleotid entfernt wurden. Da auf der Basis der Indizierung noch
keine absolut eindeutige Aussage bezüglich der Raumgruppe möglich ist, wurden hier alle in
Frage kommenden Raumgruppen (P222, P222(1), P2(1)2(1)2 und P2(1)2(1)2(1)) verwendet.
Für die Rotations- und die Translationssuche wurde der Auflösungsbereich von 20,0 – 4,0 Å
verwendet. Der Integrationsradius betrug 23 Å. In der P2(1)2(1)2(1) Raumgruppe wurde eine
eindeutige Lösung mit zwei Molekülen pro asymmetrischer Einheit gefunden. Die Parameter
der Lösung sind in Tabelle 4.22 zusammengefasst.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 137
Tab. 4.22: Molekularer Ersatz für TC10∆C GppNHp
Suchmodell TC10∆C GDPAuflösungsbereich Rotation/Translation (D) 20,0-4,0Pattersonradius (D) 23Rotation für Molekül 1 (Eulerwinkel) 55,95 / 90,0 / 142,38Translation für Molekül 1 (fraktional) 0,305 / 0,120 / 0,371Rotation für Molekül 2 (Eulerwinkel) 55,95 / 90,0 / 142,38Translation für Molekül 2 (fraktional) 0,811 / 0,257 / 0,874Korrelationskoeffizient / R-Faktor 58,9 / 45,3Korrelationskoeffizient / R-Faktor (der besten falschen Lsg.) 25,6 / 57,9
Der Korrelationskoeffizient der Lösung beträgt 58,9%, während der R-Faktor einen Wert von
45,3% hat. Wie der Tabelle 4.22 zu entnehmen ist, sind die beiden Moleküle der
asymmetrischen Einheit durch eine Translation miteinander verwandt. Der Vektor für die
Transformation von Molekül B nach Molekül A ist gegeben durch x = -0,496, y = -0,188 und
z = -0,498. Eine derartige reine Translation sollte in einer nativen Pattersondichte als
Maximum zu erkennen sein und dient damit als zusätzliche Bestätigung der Richtigkeit der
Lösung.
Abbildung 4.49 zeigt die U-V-Ebene bei W = 0,5 (die Koordinaten des realen Raums x, y und
z, werden im Pattersonraum durch U, V und W wiedergegeben) der nativen Pattersondichte
von TC10∆C·GppNHp. Deutlich zu erkennen sind die beiden Maxima bei U = 0,5 und V =
0,188 bzw. V = 0,812.
Abb. 4.49: U-V-Ebene bei W = 0,5 der nativen Pattersondichte des TC10∆C·GppNHp Datensatzes. Die Berechnung erfolgte mit dem Programm FFT (CCP4, 1994). Es wurden Daten im Auflösungsbereich 20-4 Å verwendet. Die Konturierung erfolgte bei 15 % der Gesamtsignalhöhe in Schritten von 3 %. Das Maximum entspricht 35 % der Gesamtsignalhöhe.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 138
TC10∆NC GDP
Der Molekulare Ersatz für TC10∆NC·GDP erfolgte ebenfalls mit Molrep (CCP4, 1994). Als
Suchmodell diente auch hier die TC10∆C-GDP Struktur, aus der das Magnesiumion und das
Nukleotid entfernt wurden. Da auf der Basis der Indizierung P4(3)22 die wahrscheinlichste
Raumgruppe war, wurde zunächst diese verwendet. Für die Rotations- und die
Translationssuche wurde der Auflösungsbereich von 20,0 – 3,0 Å verwendet. Der
Integrationsradius betrug 30 Å. In der tetragonalen P4(3)22 Raumgruppe wurde eine
eindeutige Lösung mit vier Molekülen pro asymmetrischer Einheit gefunden. Tabelle 4.23
zeigt die Parameter der Lösung.
Tab. 4.23: Molekularer Ersatz für TC10∆NC GDP
Suchmodell TC10∆C GDPAuflösungsbereich Rotation/Translation (D) 20,0-3,0Pattersonradius (D) 30Rotation für Molekül 1 (Eulerwinkel) 37,27 / 90,00 / 269,86Translation für Molekül 1 (fraktional) 0,187 / 0,981 / 0,437Rotation für Molekül 2 (Eulerwinkel) 38,22 / 90,00 / 317,85Translation für Molekül 2 (fraktional) 0,234 / 0,294 / 0,932Rotation für Molekül 3 (Eulerwinkel) 56,17 / 87,38 / 141,61Translation für Molekül 3 (fraktional) 0,489 / 0,201 / 0,825Rotation für Molekül 4 (Eulerwinkel) 35,70 / 90,00 / 257,76Translation für Molekül 4 (fraktional) 0,233 / 0,756 / 0,939Korrelationskoeffizient / R-Faktor 51,4 / 43,6
4.5.6 Modellbau, Strukturverfeinerung und Qualität der Modelle
TC10∆C GDP
Mit der erhaltenen Lösung des molekularen Ersatzes (AMoRe) wurde aus dem Suchmodell
die asymmetrische Einheit des TC10∆C·GDP-Kristalls konstruiert. Als Startmodell diente das
Molekül A der Cdc42 Struktur (PDB Code: 1A4R, Rudolph et al., 1999), aus dem die beiden
Schalterregionen (Switch I und II), das Magnesiumion, das Nukleotid und die β2/β3-Region
entfernt wurden. Alle nicht-identischen Aminosäuren zwischen Cdc42 und TC10 wurden zu
Alanin mutiert. Eine erste berechnete composite omit-Elektronendichte wurde dazu
verwendet, die Lage der Aminosäuren zu überprüfen und zu korrigieren. Seitenkettenatome
wurden, wo möglich, eingebaut, ebenso wie Teile der fehlenden Regionen (Switch I und II,
Magnesiumion, Nukleotid und die β2/β3-Region). Das so erhaltene Modell wurde durch
iterative Runden von Verfeinerungen (simulated annealing, CNS; Brünger et al., 1998) und
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 139
Molekül A
Aminosäure
25 35 45 55 65 75 85 95 105
115
125
135
145
155
165
175
185
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40
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Molekül B
Aminosäure
25 35 45 55 65 75 85 95 105
115
125
135
145
155
165
175
185
195
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Elektronendichteinterpretation in O (Jones et al., 1991) vervollständigt. Die letzten Schritte
der Verfeinerung erfolgten durch REFMAC5 (CCP4, 1994). Die Verwendung der TLS
Option, wobei die Moleküle A und B der asymmetrischen Einheit separat behandelt wurden,
resultierte in einer Verringerung des freien R-Faktors. Nach etwa 20 Zyklen wurde ein Modell
erhalten, dessen freier R-Faktor nicht mehr verringerbar war. Tabelle 4.24 gibt einen
Überblick über die Verfeinerung und die geometrischen Eigenschaften des finalen Modells.
Tab. 4.24: Strukturverfeinerung von TC10∆C GDP
StatistikAuflösungbereich (D) 20,0-2,20Anzahl der Reflexe 26573Atome in asymmetrischer Einheit 3087GDP+Mg2+ 58Mg2+ 2Wassermoleküle 237ungeordnetes Lösungsmittel (k, B) (e/D3, D2) 0,802 / 250Rcryst / Rfree (%) 17,3 / 20,9Größe des Testsets (%) 5
Stereochemische ParameterStandardabweichung der Bindungslängen / -winkel (D, °) 0,024 / 2,026<B> Proteinatome 1. Mol / 2. Mol (D2) 27,0 / 28,7<B> GDP+Mg2+ 1. Mol / 2. Mol (D2) 20,6 / 21,3mittlerer Koordinatenfehler nach Luzzati (1952) (D2) 0,303
Beide Moleküle der asymmetrischen Einheit zeigen die Aminosäuren 16 bis 193. Die
Aminosäuren 2 bis 15, sowie die zwei artifiziellen durch die Thrombinolyse am N-Terminus
Abb. 4.50: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheit von TC10∆C·GDP. Aufgetragen sind die gemittelten Temperaturfaktoren der beiden Moleküle A und B der asymmetrischen Einheit gegen die Sequenzposition.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 140
verbleibenden Reste (Gly-Ser) waren in den Elektronendichtekarten nicht interpretierbar. Für
den Switch II Bereich war der Verlauf der Polypeptidkette nur schwierig zu interpretieren, wie
auch an den hohen Temperaturfaktoren zu erkennen ist (Abb. 4.50).
Um die relative Mobilität einzelner Bereiche in der Struktur abzuschätzen wurden die
gemittelten Temperaturfaktoren der Aminosäuren gegen die Sequenzposition aufgetragen
(Abb. 4.50). Die oft sehr mobilen Switch Regionen (Switch I: 43 bis 52, Switch II: 73 bis 86)
zeigen auch in dieser Struktur im Vergleich zum übrigen Protein hohe Werte für den
Temperaturfaktor, ebenso wie die N- und C-terminalen Regionen der jeweiligen Moleküle.
Das endgültige Modell besteht aus zwei Molekülen TC10∆C, die als Liganden jeweils GDP
und ein Magnesiumion (Mg2+) gebunden haben (Abb. 4.51). Der kristallographische R-Faktor
des Modells beträgt 17,3 %, während der freie R-Faktor bei 20,9 % liegt.
Die sterisch sinnvolle Verteilung der φ/ψ-Winkel der beiden Moleküle geht aus dem
nachfolgend dargestellten Ramachandran Diagramm (Abb. 4.52; Ramachandran &
Sasisekharan, 1968; Laskowski et al., 1993) hervor. 93,2 % aller nicht Gly-Reste haben φ/ψ-
Winkel in den bevorzugten Bereichen. 6,5 % der Aminosäuren liegen in zusätzlich erlaubten
Bereichen, während lediglich eine Aminosäure (0,3 %, Met17A) in einem großzügig
erlaubten Bereich anzutreffen ist.
A
B
Abb. 4.51: Ansicht der asymmetrischen Einheit A) und der Kristallpackung B) eines TC10∆C·GDP Kristalls. A Die beiden Moleküle der asymmetrischen Einheit. Deutlich zu erkennen sind die beiden zusätzlichen Magnesiumionen im Schleifenbereich β2/β3. B Projektion der Einheitszelle entlang der z-Achse. Die TC10∆C·GDP Kristallpackung mit der asymmetrischen Einheit in gelb.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 141
TC10∆C GppNHp
Mit der erhaltenen Lösung des molekularen Ersatzes (MOLREP) wurde aus dem Suchmodell
(TC10∆C) die asymmetrische Einheit des TC10∆C·GppNHp Kristalls konstruiert. Als
Startmodell diente die TC10∆C·GDP-Struktur, aus der die beiden Schalterregionen (Switch I
und II), das Magnesiumion und das Nukleotid entfernt wurden. Die Verfeinerung erfolgte
analog zur TC10∆C·GDP-Struktur. Unterschiedlich war hier nur, dass während der gesamten
Verfeinerung die beiden Moleküle der asymmetrischen Einheit durch die NCS eingeschränkt
wurden (siehe Tab. 4.25). Dies ist bedingt durch die niedrigere Auflösung dieser Struktur und
dem daraus resultierenden Observationen/Parameter Verhältnis von 1,2. Dabei sind die
Observationen die Anzahl der gemessenen Reflexe. Die Parameter sind gegeben durch die
Anzahl der Atome in der asymmetrischen Einheit und die vier Parameter für jedes Atom die
anhand der gemessenen Daten verfeinert werden müssen (x, y, z und B). Die letzten Schritte
der Verfeinerung erfolgten durch REFMAC5 (CCP4, 1994) unter Verwendung der TLS
Option und der NCS Einschränkung. Nach etwa 20 Zyklen wurde ein Modell erhalten, dessen
freier R-Faktor nicht mehr verringerbar war. Tabelle 4.25 gibt einen Überblick über die
Verfeinerung und die geometrischen Eigenschaften des finalen Modells.
Das erste Molekül umfasst die Aminosäuren 8 bis 193, genauso wie das zweite Molekül. Die
Aminosäuren 2 bis 7, sowie die zwei artifiziellen durch die Thrombinolyse am N-Terminus
verbleibenden Reste (Gly-Ser) waren in den Elektronendichtekarten nicht interpretierbar.
Abb. 4.52: Ramachandran-Diagramm von TC10∆C·GDP.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 142
Tab. 4.25: Strukturverfeinerung von TC10∆C GppNHp
StatistikAuflösungbereich (D) 19,84 - 2,65Anzahl der Reflexe 11826Atome in asymmetrischer Einheit 2935GppNHp+Mg2+ 66Mg2+ 2Wassermoleküle 13ungeordnetes Lösungsmittel (k, B) (e/D3, D2) 0,614 / 250Rcryst / Rfree (%) 21,0 / 26,0Größe des Testsets (%) 5NCS Gruppierung (Aminosäuren) 10-135 / 136-150 / 151-201
Stereochemische ParameterStandardabweichung der Bindungslängen / -winkel (D, °) 0,018 / 1,755<B> Proteinatome 1. Mol / 2. Mol (D2) 34,28 / 33,73<B> GppNHp+Mg2+ 1. Mol / 2. Mol (D2) 25,31 / 25,84mittlerer Koordinatenfehler nach Luzzati (1952) (D2) 0,507
Um die relative Mobilität einzelner Bereiche in der Struktur abzuschätzen, wurden die
gemittelten Temperaturfaktoren der Aminosäuren gegen die Sequenzposition aufgetragen
(Abb. 4.53). Die oft sehr mobilen Switch Regionen (Switch I: 43 bis 52, Switch II: 73 bis 86)
zeigen auch in dieser Struktur im Vergleich zum übrigen Protein hohe Werte für den
Temperaturfaktor. Die jeweiligen N-Termini der Strukturen werden durch Ausbildung eines
intermolekularen β-Faltblatts (z.B. Gly12B bis Leu16B, β1, mit Tyr54A bis Ser57A, β2)
zwischen den beiden Molekülen der asymmetrischen Einheit stabilisiert. Die ist auch an den
Temperaturfaktoren der N-Termini erkennbar.
Molekül A
Aminosäure
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
110
120
130
140
150
160
170
180
190
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40
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Molekül B
Aminosäure
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
110
120
130
140
150
160
170
180
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Abb. 4.53: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheit von TC10∆C·GppNHp. Aufgetragen sind die gemittelten Temperaturfaktoren der beiden Moleküle A und B der asymmetrischen Einheit gegen die Sequenzposition.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 143
Diese intermolekulare Interaktion der beiden Moleküle der asymmetrischen Einheit ließ
vermuten, dass TC10∆C·GppNHp auch in Lösung als Dimer vorliegen könnte und damit
diese Interaktion auch eine physiologische Bedeutung haben könnte. Durch analytische
Gelfiltrationen konnten jedoch eindeutig gezeigt werden, dass TC10∆C·GppNHp in Lösung
als Monomer vorliegt. Als Referenzen wurden hier TC10∆C·GDP, TC10∆NC·GDP und
Standardmoleküle zur Säulenkalibrierung verwendet.
Das endgültige Modell besteht aus zwei Molekülen TC10∆C, die als Liganden jeweils
GppNHp und ein Magnesiumion (Mg2+) gebunden haben (Abb. 4.54). Der kristallographische
R-Faktor des Modells beträgt 21,0 %, während der freie R-Faktor bei 26,0 % liegt.
Das Ramachandran-Diagramm (Abb. 4.55; Ramachandran & Sasisekharan, 1968; Laskowski
et al., 1993) zeigt, dass 90,9 % aller nicht Gly-Reste φ/ψ-Winkel in den bevorzugten
Bereichen haben. 7,9 % der Aminosäuren liegen in zusätzlich erlaubten Bereichen, während
1,3 % in großzügig erlaubten Bereichen anzutreffen sind.
A
B
Abb. 4.54: Ansicht der asymmetrischen Einheit A) und der Kristallpackung B) eines TC10∆C·GppNHp Kristalls. A Die beiden Moleküle der asymmetrischen Einheit. In der Mitte der Abbildung ist das intermolekulare β-Faltblatt zu erkennen. B Projektion der Einheitszelle entlang der x-Achse. Die TC10∆C·GppNHp Kristallpackung mit der asymmetrischen Einheit in gelb.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 144
TC10∆NC GDP
Anhand des molekularen Ersatzes wurde die asymmetrische Einheit des TC10∆NC·GDP
Kristalls aufgebaut. Die weitere Verfeinerung erfolgte wie für TC10∆C·GDP beschrieben.
Eine Statistik über den Verlauf der Verfeinerung und die geometrischen Eigenschaften des
Modells zeigt Tabelle 4.26.
Tab. 4.26: Strukturverfeinerung von TC10∆NC GDP
StatistikAuflösungbereich (D) 20,0 - 2,2Anzahl der Reflexe 37568Atome in asymmetrischer Einheit 5746GDP+Ca2+ 116Ca2+ 16Wassermoleküle 217ungeordnetes Lösungsmittel (k, B) (e/D3, D2) 0,756 / 250Rcryst / Rfree (%) 19,4 / 24,3Größe des Testsets (%) 5,1
Stereochemische ParameterStandardabweichung der Bindungslängen / -winkel (D, °) 0,02 / 1,78<B> Proteinatome 1. Mol. / 2. Mol. / 3. Mol. / 4. Mol. (D2) 25,9 / 21,5 / 29,2 / 32,7<B> GDP+Ca2+ 1. Mol. / 2. Mol. / 3. Mol. / 4. Mol. (D2) 17,2 / 15,7 / 17,9 / 21,2mittlerer Koordinatenfehler nach Luzzati (1952) (D2) 0,303
Abb. 4.55: Ramachandran-Diagramm von TC10∆C·GppNHp.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 145
Das erste Molekül umfasst die Aminosäuren 15-192, das zweite Molekül die Aminosäuren 16
bis 193, das dritte die Aminosäuren 15 - 192 und das vierte die Aminosäuren 18 - 192.
Bedingt durch die Klonierung und die anschließende Proteasespaltung sind im Protein N-
terminal sechs zusätzliche Aminosäuren enthalten (Gly-Ala-Met-Gly-Gly-Ser). Im Molekül A
und C konnte jeweils das Serin (Aminosäure 14) noch aus der Dichte interpretiert werden. In
den beiden anderen Molekülen sind diese Aminosäuren nicht enthalten, da sie in der
Elektronendichte nicht erkennbar waren. Für die Aminosäuren Glu76 und Asp77 von Molekül
B war die Dichte ebenfalls nicht einwandfrei zuzuordnen, so dass diese Aminosäuren
ebenfalls nicht in das endgültige Modell aufgenommen wurden. Der Switch II-Bereich
(Aminosäuren 76 bis 86) von Molekül D erscheint vollkommen unstrukturiert und wurde
ebenfalls nicht ins das Modell aufgenommen. Ursache hierfür ist vermutlich ein benachbartes
Molekül, das in diesen Bereich hineinragt und dadurch die Ausbildung der Sekundärstruktur
des Moleküls D stört. Der insgesamt höhere Temperaturfaktor des Moleküls D ist ebenfalls
auffällig und könnte seine Ursache wiederum in der zuvor genannten Deformation des Switch
II haben (Abb. 4.56).
Um die relative Mobilität einzelner Bereiche in der Struktur abzuschätzen wurden die
gemittelten Temperaturfaktoren der Aminosäuren gegen die Sequenzposition aufgetragen
(Abb. 4.56). Die oft sehr mobilen Switch Regionen (Switch I: 43 bis 52, Switch II: 73 bis 86)
zeigen auch in dieser Struktur hohe Werte für den Temperaturfaktor. Besonders auffällig ist
hier das Molekül C. Das endgültige Modell besteht aus vier Molekülen TC10∆NC, die als
Liganden jeweils GDP und ein Calciumion (Ca2+) gebunden haben (Abb. 4.57). Der
kristallographische R-Faktor des Modells beträgt 19,4 %, während der freie R-Faktor bei 24,3
% liegt.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 146
Abbildung 4.58 (Ramachandran & Sasisekharan, 1968; Laskowski et al., 1993) zeigt das
Ramachandran-Diagramm der 4 TC10∆NC·GDP Moleküle. 90,1 % aller nicht Gly-Reste
haben Winkel in den bevorzugten Bereichen. 9,1 % der Aminosäuren liegen in zusätzlich
erlaubten Bereichen, während 0,5 % in großzügig erlaubten Bereichen anzutreffen sind. Zwei
Aminosäuren (Glu76A und Gln75C) besitzen nicht erlaubte φ/ψ-Winkel. Diese beiden
Aminosäuren befinden sich jeweils am Anfang der Switch II Region und waren aus der
Elektronendichte nicht anders zu interpretieren.
Abb. 4.56: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheit von TC10∆NC·GDP. Aufgetragen sind die gemittelten Temperaturfaktoren der vier Moleküle A, B, C und D der asymmetrischen Einheit gegen die Sequenzposition. Deutlich zu erkennen sind die in Molekül D im Vergleich zu den anderen drei Molekülen erhöhten B-Faktoren (Aminosäuren 60-170).
Molekül B
Aminosäure
20 30 40 50 60 70 80 90 100
110
120
130
140
150
160
170
180
190
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Molekül A
Aminosäure
20 30 40 50 60 70 80 90 100
110
120
130
140
150
160
170
180
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Molekül C
Aminosäure
20 30 40 50 60 70 80 90 100
110
120
130
140
150
160
170
180
190
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Molekül D
Aminosäure
20 30 40 50 60 70 80 90 100
110
120
130
140
150
160
170
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 147
Abb. 4.58: Ramachandran-Diagramm von TC10∆NC·GDP.
A
B
Abb. 4.57: Ansicht der asymmetrischen Einheit A) und der Kristallpackung B) eines TC10∆NC·GDP Kristalls. A Die vier Moleküle der asymmetrischen Einheit. B Projektion der Einheitszelle entlang der z-Achse. Die TC10∆NC·GDP Kristallpackung mit der asymmetrischen Einheit in gelb.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 148
4.5.7 Vergleich der TC10 Strukturen
Im folgenden Abschnitt werden die drei TC10 Kristallstrukturen untereinander und mit
anderen Mitgliedern der Rho-GTPase Familie (Cdc42 und Rac1) verglichen. Auf der Basis
der Sequenzidentität ist dabei Cdc42 die am nächsten zu TC10 verwandte GTPase.
Gemeinsamkeiten und Unterschiede sollen so herausgearbeitet werden.
4.5.7.1 Gemeinsamkeiten
Das zentrale Bauelement der TC10 Strukturen ist ein β-Faltblatt, das von sieben α-Helizes
flankiert wird (Abb. 4.59). Das β-Faltblatt besteht aus sechs Strängen, von denen fünf
antiparallel und einer parallel verlaufen. Von den sieben Helizes sind α1, α5, α6 und α7
regulär, während zwei kurze 310-helikale Bereiche die Switch II Region (α2) ausbilden. Der
N-terminale Bereich der Insert-Region besteht ebenfalls aus einer kurzen 310 Helix (α4) auf
die die reguläre Helix α5 folgt. Die Helix α3 erscheint als zwei aufeinanderfolgende Helizes,
da sie durch einen Knick, gebildet von den Aminosäuren Glu109, Glu110 und Trp111,
unterbrochen wird.
A
B
Abb. 4.59: Überlagerung der drei TC10 Strukturen. TC10∆C·GDP in rot, TC10∆C·GppNHp in blau und TC10∆NC·GDP in beige eingefärbt. A Ansicht der Überlagerung mit der Switch I-Region im Zentrum. B Überlagerung wie in A aber 90° in der Ebene gegen den Uhrzeigersinn gedreht.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 149
Im Folgenden werden nur noch die jeweiligen Moleküle A der einzelnen Strukturen
miteinander verglichen, da sie am besten definiert sind. Die Unterschiede der einzelnen
Moleküle der asymmetrischen Einheiten untereinander sind gering, wie die mittlere
Abweichung der Cα-Atome zeigt. Für die TC10∆C-GDP Struktur beträgt die mittlere
Abweichung zwischen Molekül A und Molekül B 0,38 Å (177 Cα Atome). Die Moleküle A
und B der TC10∆C·GppNHp Struktur zeigen eine etwas größere mittlere Abweichung der
Cα-Atome von 0,65 Å (185 Cα-Atome), was auf Unterschiede im Bereich der Insert-Region
(Asp135 – Pro150) zurückzuführen ist. Die Unterschiede zwischen den Molekülen der
TC10∆NC-GDP Struktur ist wie folgt: A zu B 0,99 Å (161 Cα Atome), A zu C 0,86 Å, A zu
D 0,78 Å, B zu C 0,52 Å, B zu D 1,21 Å und C zu D 1,18 Å.
Die mittlere Abweichung aller Cα-Atome der drei Strukturen untereinander ist wie folgt und
bezieht sich nur auf die Moleküle A der jeweiligen asymmetrischen Einheiten (jeweils 177
Cα-Atome): TC10∆C·GDP zu TC10∆NC·GDP 1,02 Å, TC10∆C·GDP zu TC10∆C·GppNHp
0,95 Å und TC10∆NC·GDP zu TC10∆C·GppNHp 0,95 Å.
4.5.7.2 GDP/GppNHp-Bindung von TC10
Die Berechnung der ersten Elektronendichten der drei Strukturen erfolgte ohne die
Nukleotidinformation. Die Dichte für das entsprechende GDP bzw. GppNHp Nukleotid war
deutlich erkennbar. Die Abbildung 4.61 zeigt den Ausschnitt einer omit-Elektronendichte der
Nukleotidbindungsstellen von TC10∆C·GDP und TC10∆C·GppNHp, wobei die Berechnung
der Phasenwinkel ohne Nukleotidinformation erfolgte. Eine entsprechende schematische
Abb. 4.60: Überlagerung der beiden Strukturen von TC10·GDP und von Cdc42·GDP. Die beiden TC10 Strukturen sind in blau, während die Cdc42 Struktur in rot dargestellt ist.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 150
Darstellung der Nukleotidbindung mit den möglichen Wasserstoffbrückenbindungen ist in
Abb. 4.62 gezeigt.
Die Guaninbase wird in allen Molekülen von Phe42 kontaktiert (Abb. 4.61). Die Seitenkette
von Phe42 steht senkrecht auf dem aromatischen System der Base und wird durch Leu174 in
ihrer Position durch hydrophobe Wechselwirkungen stabilisiert. Phe42 ist innerhalb der Ras-
homologen Proteine stark konserviert. Auf der gegenüberliegenden Seite von Phe42 wird die
Abb. 4.61: Omit-Elektronendichtekarten des aktiven Zentrums von TC10. A TC10∆C·GDP; B TC10∆C·GppNHp. Dargestellt ist eine 2Fo-Fc Elektronendichtekarte, bei deren Berechnung das Nukleotid entfernt wurde. Die Hauptketten der fünf für die Nukleotidbindung wichtigen Schleifen sind als Coil-Modell wiedergegeben. Das Nukleotid und wichtige an der Nukleotidbindung beteiligte Aminosäuren sind als ball-and-stick-Modelle dargestellt.
A: TC10∆C·GDP
B: TC10∆C·GppNHp
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 151
Nukleobase durch die Methylengruppen von Gln130 kontaktiert. Dies entspricht einer
Degeneration des NKxD-Motivs GTP-bindender Proteine innerhalb der Rho-Familie zu [N,
C, T][K, Q]xD. Die meisten Vertreter der Rho-Familie haben einen Threoninrest anstelle des
Asparagins. Die Cdc42-homologen Proteine (TC10, TCL, Chp und Wrch) haben anstelle des
Lysins einen Glutaminrest (Gln130) parallel zur Base orientiert. Die Seitenketten
Aminofunktion von Gln130 zeigt einen Abstand zwischen 3,1 Å (GDP) und 3,6 Å (GppNHp)
zum O4’ Atom der Ribose in den hier beschriebenen Strukturen, so dass eine schwache
Wasserstoffbrückenbindung möglich ist. Allerdings dürfte die Substitution von Lysin zu
Glutamin zu einer etwas geringeren Nukleotidaffinität beitragen.
Die Spezifität der Nukleotidbindungstasche für Guaninnukleotide wird analog zu allen
anderen kleinen GTP-bindenden Proteinen durch die bidentale Wasserstoffbrücke von
Asp132 sowie durch die Wasserstoffbrücke zwischen dem O6-Sauerstoffatom (Ketofunktion
der Base) und der NH-Gruppe von Ala173 erreicht (Abb. 4.62).
Die Hauptunterschiede zwischen der GDP- und der GppNHp-gebundenen Strukturen von
TC10 zeigen sich in der Art und Weise der Bindung der Phosphatgruppen. Der Vergleich der
beiden GDP-Strukturen zeigt, dass die Bindung der Nukleotide annähernd identisch ist und
wird im Folgenden für das Molekül A der TC10∆C·GDP-Struktur beschrieben. Die in
Klammern angegebenen Reste beziehen sich auf das Molekül A von TC10∆NC·GDP. Die
Koordination des α-Phosphats erfolgt durch die Thiol- und die NH-Gruppe von Cys32. Das
gegenüberliegende Sauerstoffatom wird durch zwei Wassermoleküle W113 und W44 (W5043
und W5002) gebunden. Der Brückensauerstoff zwischen α- und β-Phosphat wird durch die
NH-Gruppe des in der Phosphatschleife liegenden Gly29 koordiniert. Dieselbe Aminosäure
bindet ebenfalls ein Sauerstoffatom des β-Phosphats. Weitere Kontakte zum β-Phosphat
erfolgen durch Lys30, Ala27 und dem Magnesiumion bzw. dem Calciumion in der
TC10∆NC·GDP-Struktur (Abb. 4.62).
Die Kristallisation von TC10∆NC GDP erfolgte in der Anwesenheit von 200 mM CaCl2. Bei
der Strukturverfeinerung wurden FoFc-Elektronendichtekarten verwendet, die zusätzliche
Dichte im Bereich des zunächst eingebauten Magnesiumions zeigte. Da während der
Kristallisation große Mengen an Calcium vorhanden waren und Ca2+ ebenfalls zu einer
oktaedrischen Koordination fähig ist, wurden die Magnesiumionen durch Calciumionen
ersetzt und eine Neuberechnung der Elektronendichten zeigte eine ausgeglichenere
Elektronendichte. Die Liganden des Ca2+ in dieser Struktur zeigen Abstände zwischen 2,1 Å
und 2,4 Å.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 152
Abb. 4.62: Nukleotidbindung von TC10. A TC10∆C·GDP; B TC10∆C·GppNHp; C TC10∆NC·GDP; Die dargestellten Skizzen zeigen die Nukleotidbindung an TC10. Der Cofaktor Mg2+/Ca2+ ist entsprechend hervorgehoben. Wassermoleküle wurden mit einem W gekennzeichnet. Die gestrichelten Linien entsprechen Wasserstoffbrückenbindungen mit den in Å angegebenen Distanzen.
A: TC10∆C·GDP
B: TC10∆C·GppNHp
C: TC10∆NC·GDP
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 153
Die Koordination des Mg2+ bzw. Ca2+-Ions ist in beiden GDP-Strukturen vollkommen
identisch. Das zentrale zweiwertige Ion wird in oktaedrischer Geometrie durch das β-
Phosphat, die Seitenkette von Thr31, die Hauptkettenketofunktion von Thr49 sowie drei
Wasserliganden W10 (W5028), W44 (W5002) und W53 (W5125) koordiniert (Abb. 4.62).
Die beiden apikalen Pole des Oktaeders werden dabei durch die Carbonylgruppe von Thr49
(Switch I) bzw. das β-Phosphat gebildet. Die axialen Positionen werden durch die drei
Wassermoleküle und Thr31 besetzt.
Die Koordination der α- und β-Phosphatgruppen von TC10∆C·GppNHp ist vergleichbar zu
den beiden GDP Strukturen. Die Koordination des Mg2+-Ions unterscheidet sich hingegen,
bedingt durch die zusätzliche γ-Phosphatgruppe. Die Geometrie der Magnesiumkoordination
ist hier verzerrt oktaedrisch. Betrachtet man das β-Phosphat und Thr49 als die apikalen Pole,
so werden die axialen Positionen durch das γ-Phosphat, Thr31, W1 und W2 besetzt. Der
Winkel zwischen Thr49 und β-Phosphat beträgt 131°. Der Winkel zwischen Thr31 und dem
γ-Phosphat beträgt 133°. Das γ-Phosphat wird weiterhin durch die Seitenkette von Lys30
gebunden und befindet sich so genau zwischen β- und γ-Phosphat. Der Kontakt zur Switch II
Region erfolgt durch die NH-Gruppe von Gly74 (Abb. 4.62).
4.5.7.3 Die Switch-Regionen von TC10
Die größten Konformationsänderungen bei der GTP-Hydrolyse sind bei den meisten kleinen
GTPasen auf die Switch-Regionen beschränkt. In Lösung sind sie häufig mobil und in
Kristallstrukturen oft nur wenig geordnet. Die im Folgenden verwendeten Definitionen der
Switch-Regionen beruhen auf einem strukturellen Vergleich der Strukturen von RhoA·GDP
(Wei et al., 1997) und RhoA·GTPγS (Ihara et al., 1998).
In der TC10 ∆C·GDP-Struktur sind die Switch Regionen beider Moleküle der asymmetrischen
Einheit relativ gut geordnet. Der Switch I (Reste Asp40 – Thr49) besitzt in beiden Molekülen
einen niedrigen Temperaturfaktor von 31 Å2. Gleiches gilt für die Switch I Regionen der
TC10∆NC·GDP (mittlere Temperaturfaktor von 20-23 Å2) und der TC10∆C·GppNHp
(mittlere Temperaturfaktor von 35-36 Å2) Moleküle.
Im Bereich des Switch I ist keine direkte Konformationsänderung zwischen der GDP- und der
GppNHp-gebundenen Form des Proteins erkennbar. Die Position der Aminosäuren Val47,
Pro48 und Thr49 ist vollkommen identisch in allen Molekülen. Eine leichte Variabilität in der
Position zeigt sich beim Vergleich der Aminosäuren Glu44, Glu45 und Tyr46, wobei
besonders Glu44 und Glu 45 durch höhere Temperaturfaktoren gekennzeichnet sind.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 154
Die Switch II Regionen (Reste Ala73 – Pro83) verhalten sich hier im Vergleich zu den Switch
I Regionen anders. Sie sind in allen Molekülen schlechter definiert als die Switch I Regionen,
was an den Temperaturfaktoren besonders deutlich wird. Molekül A von TC10∆C GDP
besitzt für diese Region einen mittleren Temperaturfaktor von 41 Å2 (Molekül B: 49 Å2). Für
die GppNHp-Struktur sind es jeweils 48 Å2. Das Molekül A von TC10∆NC·GDP ist in
diesem Bereich am Besten definiert mit einem Temperaturfaktor von 32 Å2. Im Molekül B
(mittlerer B-Faktor von 36 Å2) fehlen die Aminosäuren Glu76 und Asp77 in der
Elektronendichte. Molekül C besitzt in diesem Bereich einen mittleren B-Faktor von 52 Å2.
Das Molekül D dieser GDP-Struktur ist am Schlechtesten definiert (es fehlen die
Aminosäuren 76 - 86).
Die Position von Ala73 ist in allen Molekülen relativ ähnlich. C-terminal dieser Aminosäure
beginnt eine strukturell hypervariable Region (Reste Gly74 – Leu81) mit Abweichungen von
bis zu 7,3 Å in den Cα-Positionen (Glu76) (siehe 5.3.4).
4.5.7.4 Die β2/β3 Region von TC10
Der Vergleich der β2/β3 Region von TC10 mit der Cdc42 Struktur (Rudolph et al., 1999)
zeigt große strukturelle Unterschiede (Abb. 4.60). Dabei zeigt die Schleifenregion zwischen
β2 und β3 (Gly61 - Lys63) die größten Unterschiede mit einem Abstand von 6,2 Å zwischen
den Cα-Positionen von Gly61 (TC10) bzw. Gly47 (Cdc42). Die TC10∆C·GDP Struktur war
die erste TC10-Struktur, die gelöst wurde und zeigte genau in dieser Schleifenregion jeweils
ein zusätzliches Magnesiumion für beide Moleküle der asymmetrischen Einheit (Abb. 4.63).
Somit wurde zunächst vermutet, dass diese für die Verlagerung der β2/β3-Region
verantwortlich sein könnte. Dies konnte aber später durch einen Vergleich mit der
TC10∆NC·GDP-Struktur ausgeschlossen werden. Die beiden zusätzlichen Mg2+-Ionen sind in
keiner der anderen gelösten Strukturen vorhanden.
Beide zusätzlichen Magnesiumionen der TC10∆C GDP Struktur zeigen eine perfekte
oktaedrische Koordination durch jeweils sechs Aquoliganden (Abb. 4.63). Mg1 wird zum
Beispiel durch die Wassermoleküle W8, W49, W72, W140, W196’ und W202 koordiniert.
Die zweite Koordinationsschale besteht dann aus weiteren Wassermolekülen, der Switch I-
Region von zwei symmetrieverwandten Molekülen (Switch I’ und Switch I’’ in Abb. 4.63)
und der Schleifenregion zwischen β2/β3. So bildet die Ketofunktion von Gly62 eine
Wasserstoffbrückenbindung zu W202 aus. Die NH-Gruppe von Gln64 interagiert ebenfalls
über eine Wasserstoffbrückenbindung mit W8.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 155
Um nun einen Einfluss dieser zusätzlichen Magnesiumionen auf die TC10·GDP Struktur
entweder zu verifizieren oder auszuschließen, wurde das TC10∆NC Konstrukt kristallisiert.
Der Vergleich der beiden GDP Strukturen von TC10 (TC10∆C und ∆NC) zeigte, dass nicht
das zusätzliche Magnesiumion in TC10∆C für die veränderte Lage der β2/β3 Region im
Vergleich zu Cdc42 verantwortlich ist. Es müssen folglich andere Unterschiede zwischen der
TC10·GDP und der Cdc42·GDP Struktur die Ursache für diese Konformationsänderung sein
(siehe 5.3.2 und 5.3.4).
Der Vergleich der GDP- und der GppNHp-gebundenen Strukturen von TC10 zeigt deutliche
Unterschiede im Übergangsbereich zwischen den β2/β3-Strängen. Die Distanz zwischen den
jeweiligen Cα-Atomen von Gly61 beträgt hier 4,1 Å. Die strukturellen Unterschiede beginnen
im Bereich des β2 bei Val56 und enden im Bereich des β3-Strangs bei Leu66. Diese
Unterschiede könnten zwei mögliche Ursachen haben: zum einen könnte das GppNHp
Nukleotid über die Switch-Regionen dafür verantwortlich sein, zum anderen die Ausbildung
des intermolekularen β-Faltblatts mit dem zweiten Molekül der asymmetrischen Einheit
(siehe 5.3.4).
Abb. 4.63: Koordination eines der beiden zusätzlichen Magnesiumionen in der TC10∆C·GDP Struktur. Die Hauptketten der drei an der Bindung beteiligten Moleküle sind als Coil-Modell wiedergegeben. Die beteiligten Aminosäuren sind als ball-and-stick-Modelle dargestellt. Das Mg2+-Ion ist entsprechend hervorgehoben. Wassermoleküle wurden mit einem W gekennzeichnet. Die Linien entsprechen Wasserstoffbrückenbindungen mit den in Å angegebenen Distanzen.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 156
4.5.7.5 Oberflächeneigenschaften von TC10 und Cdc42
In Bezug auf die Wechselwirkung mit Interaktionspartnern ist die Verteilung der
Oberflächenladung von Proteinen sehr interessant, da die Interaktion von zwei Proteinen über
ihre Oberflächen stattfindet. Hierbei haben sowohl die hydrophoben, als auch die geladenen
Aminosäuren eine große Bedeutung für die Affinität und Spezifität der Bindung. Der
Vergleich der Oberflächeneigenschaften sollte die Fragestellung, ob Interaktionspartner von
Cdc42 auch mit TC10 interagieren können, beantworten. Weiterhin sollten Unterschiede
zwischen den Oberflächen der GDP und der GTP gebundenen Konformation von TC10
herausgearbeitet werden.
Hierzu wurden die Potentialoberflächen von Cdc42·GDP, TC10∆C·GDP und
TC10∆C·GppNHp berechnet. Abbildung 4.64 zeigt eine entsprechende
Oberflächendarstellung, in der positive Ladungen blau und negative Ladungen rot dargestellt
sind. Die linke Seite der Abbildung zeigt die „Vorderseite“ der jeweiligen GTPase mit Blick
auf die Switch-Regionen und das Nukleotid, während die rechte Seite die „Rückseite“ mit
Blick auf β2/β3 bzw. α5 zeigt. Der Vergleich der beiden TC10 Strukturen zu Cdc42 zeigt
hier, dass TC10 auf dieser Seite eine höhere negative Ladungsdichte aufweist. Dies ist sowohl
im Bereich der Switch-Regionen als auch im Bereich der Insert-Helix der Fall und könnte auf
eine von Cdc42 verschiedene Spezifität bezüglich der Interaktionspartner hinweisen (siehe
5.3.6 und 5.3.7). Ein Unterschied in der Ladungsverteilung zwischen der GDP und der
GppNHp-Struktur von TC10 ist allerdings nicht zu erkennen. Die Rückseite mit Blick auf die
β2/β3-Region der GTPasen zeigt bei Cdc42 im Vergleich zu den TC10 Strukturen einen
stärker positiv geladenen Bereich (Kreise in Abbildung 4.64) hervorgehoben.
Ein weiterer interessanter Unterschied zwischen TC10·GDP und TC10·GppNHp bzw.
Cdc42·GDP ist eine Aushöhlung in der Oberfläche (Pfeile in Abbildung 4.64), die durch die
veränderte Lage der β2/β3-Region in TC10·GDP zu Stande kommt. Hier ist nochmals gut zu
erkennen, dass die TC10·GppNHp Struktur in diesem Bereich sehr stark der Cdc42 Struktur
ähnelt.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 157
4.5.8 Untersuchung der Normalmodi von TC10·GDP/GTP
Da die TC10-Strukturen Unterschiede zueinander und zu der Cdc42-Struktur zeigten, wurden
diese Unterschiede anhand von Molekulardynamik-Simulationen näher charakterisiert. Hierzu
wurde das Programmpaket CHARMm (Brooks et al., 1983) verwendet. Von allen hier
verwendeten Strukturen wurden nur die Kerndomänen einer Analyse unterzogen, so dass die
häufig flexiblen und oft sehr unterschiedlichen N- und C-Termini keinen Einfluss auf die
Analyse haben. Von Cdc42 wurden die Aminosäuren 3 bis 175 und von TC10 die
Aminosäuren 17 bis 192 verwendet. Als erstes wurden alle drei Strukturen bezüglich ihres
Energieinhalts minimiert. Die eigentliche Analyse der Schwingungsmodi der einzelnen
Modelle erfolgte durch die „Vibran“-Funktion von CHARMm (Brooks et al., 1983). Die für
Abb. 4.64: Vergleich der Oberflächeneigenschaften von TC10∆NC·GDP (oben), TC10∆C·GppNHp (mitte) und Cdc42·GDP (unten). Dargestellt ist die Verteilung der Oberflächenladungen der jeweiligen Moleküle. Die Berechnung der Oberflächen und der Ladungsverteilung erfolgte mit dem Programm GRASP (Nicholls et al., 1991). Negative Ladungen sind in rot, während positive Ladungen in blau dargestellt sind. Links ist jeweils die Ansicht von vorne, auf das Nukleotid. Die rechte Ansicht (hinten) erhält man nach einer 180°-Drehung um die Horizontalachse der linken Abbildung. Der Kreis hebt einen positiven Ladungsbereich von Cdc42 im Vergleich zu TC10 hervor. Die Pfeile in der rechten Abbildung weisen auf eine Aushöhlung hin, die durch die zu TC10·GDP veränderte Lage der β2/β3-Region zu Stande kommt.
ERGEBNISSE _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 158
die einzelnen Aminosäuren und Normalmodi (7 – 999) erhaltene Werte wurden aufsummiert
und geben Aufschluss über die Flexibilität der jeweiligen Aminosäure. Abbildung 4.65 gibt
die dabei erhaltenen Daten wieder.
Abbildung 4.65A zeigt, dass sich die drei Moleküle im Wesentlichen sehr ähnlich verhalten.
Allen drei gemeinsam sind höhere Flexibilitäten in den folgenden drei Regionen: Switch I
(Aminosäuren 26-36 für Cdc42 bzw. Aminosäuren 40-50 für TC10), Switch II (Aminosäuren
59-75 für Cdc42 bzw. Aminosäuren 73-89 für TC10) und die Insert-Helix (Aminosäuren 121-
136 für Cdc42 bzw. Aminosäuren 135-150 für TC10). Die größten Unterschiede allerdings
befinden sich interessanterweise in der β2/β3-Region der Strukturen. Für TC10 sind dies die
Aminosäuren 55 bis 68 (Aminosäuren 41 bis 54 in Cdc42). Auch der Vergleich der GDP und
der GTP-Strukturen von TC10 (Abb. 4.65B) zeigt für diese Region sehr große Unterschiede.
TC10·GTP scheint hier aber noch sehr viel flexibler als TC10·GDP zu sein (siehe 5.3.4).
Aminosäure (Cdc42/TC10)
20 40 60 80 100 120 140 160 180
Vibr
atio
n (r
el. E
inhe
iten)
0
4000
8000
12000
16000
20000
24000
Cdc42 GDP TC10 GDP TC10 GppNHp
6 26 46 66 86 106 126 146 166
Aminosäure20 40 60 80 100 120 140 160 180
Quo
tient
0
1
2
3
TC10 GDP / TC10 GppNHp
TC10 GppNHp / TC10 GDP
A) B)
Abb. 4.65: Analyse der Schwingungsmodi von Cdc42·GDP, TC10·GDP und TC10·GTP. A Vergleich der bei der Schwingungsanalyse von Cdc42·GDP, TC10·GDP und TC10·GTP erhaltenen Daten. B Vergleich der für TC10·GDP und TC10·GTP erhaltenen Daten durch Quotientenbildung.
DISKUSSION _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 159
5. Diskussion
5.1 Charakterisierung der Plexin-Proteinfamilie
Semaphorine und ihre Rezeptoren, die Plexin-Proteinfamilie, sind in einer Vielzahl von
unterschiedlichen zellulären Funktionen involviert, wie auch die Komplexität ihrer
Signaltransduktion zeigt. Besondere Rollen spielen sie in der Entwicklung des Nervensystems
und des Immunsystems (Polleux et al., 2000; Bagnard et al., 1998; Delaire et al., 1998; Hall
et al., 1996). In diesem letzteren Zusammenhang ist auch ihr Vorkommen in einigen Viren zu
erklären, da Semaphorine und Plexine dazu beitragen könnten, dass der entsprechende Virus
vom Immunsystem nicht erkannt wird. Weitere interessante Aspekte sind ihre Beteiligung an
der Kontrolle des invasiven Wachstums und der Entwicklung des cardiovaskulären Systems
(Trusolino et al., 2002; Giordano et al., 2002).
Für viele dieser Funktionen ist eine Reorganisation des Aktinzytoskeletts notwendig, so dass
die Tatsache, dass GTPasen der Ras- und Rho-Familien in der Signaltransduktion auf
vielfältige Weise eine Rolle spielen nicht überrascht. Erste Studien konnten eine direkte
Interaktion der zytoplasmatischen Domäne (CPD) mit Rho-GTPasen nachweisen.
Desweiteren legte ein Sequenzvergleich mit RasGAPs eine strukturelle Homologie zu diesen
Abb. 5.1: Modell zur intrazellulären Signaltransduktion der cytoplasmatischen Domäne der Plexin-Proteine. Eine Upstream-GTPase bindet an die GTPase-bindende Domäne GBD der Plexine und aktiviert durch eine Konformationsänderung die intrazelluläre Domäne. Die jetzt GAP-aktive cytoplasmatische Domäne kann eine Downstream-GTPase inaktivieren.
DISKUSSION _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 160
Proteinen nahe. Bisher sind noch keine detaillierten quantitativen biochemischen Daten zu der
Interaktion zwischen den CPDs und den GTPasen bekannt. Ebensowenig ist die molekulare
Funktion dieser Interaktionen bekannt. Eine eingehende Charakterisierung der Struktur-
Funktionsbeziehungen zwischen GTPasen und Plexinen ist demnach von besonderem
Interesse.
Als Arbeitshypothese wurde hierzu das in Abbildung 5.1 gezeigte Modell aufgestellt. Eine
Rho-GTPase (Upstream-GTPase) bindet über die GTPase-bindende Domäne (GBD) und
führt, bedingt durch eine Konformationsänderung der CPD, zu einer Aktivierung der
intrazellulären Domäne. Hierdurch wird eine funktionsfähige GAP-Domäne hergestellt, die
abermals mit einer weiteren GTPase (Downstream-GTPase) wechselwirkt und zu deren
Inaktivierung beiträgt.
5.1.1 Reinigung und Kristallisation der Plexin-Proteine
Für eine spätere qualitative und quantitative Charakterisierung der GTPase-Plexin-Interaktion
war es nötig, die GBDs der zytoplasmatischen Domäne rekombinant zu isolieren. In früheren
Studien konnte diese GBD innerhalb der CPD lokalisiert werden. Sie befindet sich zwischen
den beiden stark konservierten N- und C-terminalen Bereichen der CPD (Driessens et al.,
2001; Hu et al., 2001; Vikis et al., 2000; Jin & Strittmatter, 1997; Jurney et al., 2002; Rohm
et al., 2000; Vastrik et al., 1999; Kuhn et al., 1999). Basierend auf diesen Daten wurden die in
dieser Arbeit verwendeten Konstrukte kloniert und rekombinant in E. coli hergestellt (Abb.
5.2). Für die GBDs von PlexinB1, C1 und D1 war dies mit guter Qualität und in guten
Ausbeuten möglich. Für PlexinA2-GBD zeigte sich allerdings schon als GST-Fusionsprotein
eine gewisse Instabilität und Proteindegradation. Im weiteren Verlauf präzipitierte dieses
Protein sowohl bei der Proteinkonzentrierung als auch bei der Abspaltung des GST-Anteils.
Der Sequenzvergleich der GBD-Konstrukte zeigte, dass für dieses instabilere Verhalten von
PlexinA2-GBD im Vergleich zu den anderen gereinigten GBDs, eine Serin-reiche Insertion
am C-Terminus verantwortlich sein könnte (Abb. 5.2), da hier ein offensichtlicher
Unterschied zu den anderen GBDs vorliegt. Ein weitergehender Sequenzvergleich aller
humanen Plexin-Proteine zeigte, dass diese Serin-reiche Insertion für die Plexine der A-
Klasse spezifisch ist. Ein weiterer Aspekt ist, dass Serin-reiche Regionen bei
Proteinreinigungen häufig problematisch sind. Allerdings befindet sich diese Insertions-
Region nur wenige Aminosäuren von der publizierten Bindungsstelle der GTPasen entfernt,
so dass ein kürzeres Konstrukt nicht in Frage kam (Abb. 5.2; LVP GGA Mutante), da ein
möglicher Bindungsverlust zu befürchten wäre.
DISKUSSION _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 161
Alle vier GBDs wurden in verschiedenen Konzentrationen, Temperaturen und mit allen zur
Verfügung stehenden Screens auf eine Kristallisation hin untersucht, jedoch konnte hierbei
keine Bedingungen gefunden werden, die zu einer strukturellen Information hätten führen
können. Die Gründe hierfür können vielfältig sein. Bei dieser Region der Plexine handelt es
sich im Vergleich zu den beiden stark konservierten N- und C-terminalen Regionen um eine
flexiblere „Linker“-Region, was ebenfalls strukturell zu einer höheren Flexibilität und damit
zu einer schlechteren Kristallisation führen könnte. Basierend auf Sekundärstruktur-
vorhersagen besteht diese Region vornehmlich aus β-Strängen und Schleifenregionen, was
ebenfalls zu dem in PlexinB1 gefundenen CRIB-(Cdc42/Rac interactive binding) Motiv
Abb. 5.2: Sequenzvergleich der GTPase-bindenden Domänen (GBDs) der Plexine. Der Sequenzvergleich wurde mittels der GCG Software erstellt und mit Genedoc modifiziert. Schwarz hinterlegte Bereiche kennzeichnen 100%ige Konservierung, während grau hinterlegte Bereiche 80%ige Konservierung bedeuten. Der schwarze Balken zeigt die für die PlexinA-Familie charakteristische Serin-reiche Insertion. Innerhalb der GBD wurde eine Mutante beschrieben (Position ist durch drei Pfeile hervorgehoben), die die Interaktion der GBD mit den GTPasen inhibiert: LVP GGA.
DISKUSSION _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________
Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 162
passen würde. Die meisten bisher gelösten GTPase/CRIB-Effektor-Komplexe sind mittels
NMR-Technik bestimmt worden (Morreale et al., 2000; Mott et al., 1999; Abdul-Manan et
al., 1999). Eine Ausnahme ist hier der Komplex aus Cdc42 und dem Effektor Par6 (Garrard et
al., 2003). Einer der Gründe für die Verwendung von NMR in diesem Zusammenhang ist
sicherlich die höhere Flexibilität der CRIB-Motiv enthaltenden GBDs. Um die mögliche
höhere Flexibilität der GBDs der Plexine zu umgehen und um Informationen über die Art der
GTPase-Plexin Interaktion zu gewinnen, wurde ein Komplex aus Rnd1 und PlexinB1-GBD
zur Kokristallisation eingesetzt. Aber auch hier konnten keine Kristalle erhalten werden. Um
hier im Weiteren strukturelle Informationen bezüglich der GBDs zu bekommen, könnte nach
weiteren stabilen GBD-Fragmenten gesucht werden. Auch die Kokristallisation weiterer
verschiedener GTPase-Plexin Kombinationen könnte schließlich zu einem Erfolg führen.
Ebenso wäre es angebracht über eine NMR-spektroskopische Untersuchung und
Strukturaufklärung nachzudenken.
Für die Reinigung der vollständigen CPDs der Plexine A2 und B1 war zunächst eine
Expression und Reinigung aus E. coli vorgesehen. Diese gestaltete sich jedoch sowohl für
PlexinB1-CPD wie auch für PlexinA2-CPD als schwierig und war nicht zufrieden stellend.
PlexinB1-CPD aus E. coli war nur schlecht löslich und konnte dementsprechend nur mit
geringer Ausbeute gewonnen werden. Für das 6xHis-modifizierte PlexinA2-CPD-Protein war
eine gute Ausbeute erzielt worden. Bei diesem Protein war allerdings die Monodispersität
begrenzt und weitere Optimierungen führten zu keiner Verbesserung. Die schwierige
Reinigung und die hohe Instabilität dieser Proteine wurde auf Faltungsprobleme im E. coli
Expressionssystem zurückgeführt.
Eine weitere Möglichkeit, die Proteine zu stabilisieren, ist der partielle proteolytische Verdau,
bei dem instabile Regionen von Proteinen abgespalten werden können. Eine α-Chymotrypsin-
Behandlung der PlexinA2-CPD führte zu einer Spaltung im mittleren Bereich des Proteins, da
zwei neue Proteinfragmente ähnlicher Größe (37 bzw. 30 oder 21 kDa) entstanden. Eine
Trennung dieser Fragmente war sogar unter extremen Hochsalzbedingungen (1M NaCl) nicht
möglich, woraus sich schließen lässt, dass die N- und C-terminalen CPD-Fragmente eine
stabile und hochaffine „intramolekulare“ Bindung eingehen. Interessanterweise wurde
kürzlich gezeigt, dass die N- und C-terminalen Domänen miteinander interagieren und diese
Interaktion wahrscheinlich einer Autoinhibition entspricht (Turner et al., 2004). Demnach ist
die Interaktion der N- und C-terminalen Fragmente ein sehr wichtiger autoregulatorischer
Aspekt, der eine wesentliche Rolle bei der Rho-GTPase-vermittelten Signaltransduktion der
Plexine spielen dürfte.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 163
Da eine inkorrekte Proteinfaltung der CPDs in E. coli nicht vollständig ausgeschlossen
werden konnte, wurde ein eukaryotisches Expressionssystem (Sf21-Insektenzellen) zunächst
für PlexinB1-CPD ausgetestet. Hierdurch konnten fast alle Probleme, die bei der Expression
in E. coli zu beobachten waren, umgangen werden, so dass die CPDs der Plexine B1, B2 und
A2 in guten Ausbeuten (mit Ausnahme der B2-CPD) und mit einem hohen Reinheitsgrad
erhalten werden konnte. Die Reinheit von PlexinB2 war zufrieden stellend, jedoch ließ die
Proteinausbeute zu wünschen übrig. Eine weitere Optimierung der Expressionsbedingungen
könnte hier noch möglich sein. Der einzige kritische Aspekt bei der Expression der CPDs in
Sf21-Zellen war eine leichte Proteindegradation, die zu zwei miteinander interagierenden
Fragmenten (36 und 24 kDa) führte, die nicht voneinander bzw. von der nicht-gespaltenen
CPD (66 kDa) getrennt werden konnten. Dies war, wie oben beschrieben, auch bei den aus E.
coli erhaltenen Proteinen zu beobachten und wird auf die physiologisch relevante Interaktion
der N- und C-terminalen Domänen zurückgeführt. Insgesamt gesehen war das
Insektenzellsystem für die Expression und Reinigung der CPDs der Plexine A2 und B1 sehr
gut geeignet.
Für die Kristallisation wurden die aus E. coli erhaltenen Proteine von PlexinA2 und das α-
Chymotrypsin-behandelte PlexinA2, sowie die aus dem Sf21-Insektenzellsystem erhaltenen
Proteine PlexinA2 und PlexinB1 eingesetzt. Bei der Kristallisation von PlexinA2-CPD aus E.
coli wurden Kristalle erhalten, die ein 32 kDa großes Protein enthielten. Anhand der
durchgeführten biochemischen Analysen konnte allerdings nicht zweifelsfrei festgestellt
werden, um welches Protein es sich handelt, so dass erst die Strukturaufklärung es eindeutig
als das Hsp31-Chaperonprotein identifizierte (5.1.4). Die Kristallisation von PlexinB1-CPD
führte ebenfalls zu Kristallen, die reproduziert und optimiert werden konnten. Jedoch wurde
auch nach eingehender Optimierung durch eine Variation der Temperatur, der Salz-, Puffer-
und Präzipitansbedingungen, sowie der Verwendung von Additivien keine Diffraktion für die
Kristalle erhalten. Die erhaltenen Kristalle sind nach wie vor verhältnismäßig klein, was eine
der Ursachen für die mangelnde Diffraktion sein könnte. Weiterhin könnten mobile Regionen
des Proteins für eine schlechte Kristallpackung verantwortlich sein.
Obwohl im Rahmen dieser Arbeit viele Bedingungen für diverse Fragmente der Plexine A2,
B1, C1 und D1 zur Kristallisation eingesetzt wurden, könnte man auch die anderen Mitglieder
der Plexin-Familie miteinbeziehen. Hier ist z.B. an die weiteren Homologen der humanen
Plexine zu denken: Plexin A1, A3, A4 und B3. Auch Orthologe sollten bei der Suche nach
kristallisationsfähigen Proteinen nicht außer Acht gelassen werden. Da zeitbedingt im
Rahmen dieser Arbeit keine Kokristallisation von GTPase (Rnd1, Rnd3 oder Rac1(Q61L))
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 164
mit der aus Insektenzellen gewonnenen B1-CPD möglich war, wäre auch dies ein sehr
interessanter Ansatz.
5.1.2 GTPase-Plexin Interaktion
Die Interaktion von GTPasen der Rho-Familie und der CPD der Plexin-
Transmembranrezeptoren ist mittlerweile vielfach gezeigt worden. Als Nachweismethoden
wurden hier bisher ausschließlich qualitative Methoden wie das Two-Hybrid-System,
Overlay-Assays und Pulldown-Experimente verwendet. Für die CPD von PlexinA1 konnte
eine Interaktion mit Rnd1 und RhoD gezeigt werden, während Rac1 und Rnd1 an PlexinB1
binden (Driessens et al., 2001; Hu et al., 2001; Vikis et al., 2000; Jin & Strittmatter, 1997;
Jurney et al., 2002; Rohm et al., 2000; Vastrik et al., 1999; Kuhn et al., 1999). Für die
zytoplasmatischen Domänen von PlexinC1 und PlexinD1 konnte bisher keine Interaktion mit
GTPasen nachgewiesen werden.
Da vor einer quantitativen Untersuchung der GTPase-Plexin Interaktion zunächst eine
qualitative Spezifitätsuntersuchung geplant war, wurden zunächst rein qualitative Methoden
verwendet, die es ermöglichen, ein breites Spektrum an GTPasen und Plexinen zu
untersuchen. In einem nächsten Schritt sollten dann diese spezifischen Interaktionen
bezüglich ihrer kinetischen bzw. thermodynamischen Parameter untersucht werden.
Dementsprechend wurden für die qualitative Untersuchung native Gelelektrophoresen,
Pulldown-Experimente und der GDI-Assay verwendet. Der GDI-Assay erlaubt in diesem
Zusammenhang sowohl qualitative als auch quantitative Aussagen (Herrmann et al., 1996;
Blumenstein & Ahmadian, 2004; Häusler et al., 2005). Zunächst wurde versucht, die bereits
publizierten Daten bezüglich der GTPase-Plexin-Interaktion zu reproduzieren. Hierfür wurden
die Plexin-GBDs von A2, B1, C1 und D1 und die entsprechenden GTPasen RhoA, Rac1,
Cdc42, Rnd1, Rnd3 und TC10 verwendet. Jedoch war für die Plexin-GBDs mit keiner der
verwendeten GTPasen und keiner der verwendeten Methoden eine Interaktion nachweisbar.
Für die vollständige PlexinB1-CPD aus Insektenzellen war allerdings eine schwache
Interaktion mit GST-Rnd1 und GST-Rac1(Q61L) nachweisbar. Diese Resultate zeigten, dass
die CPDs sehr wahrscheinlich eine höhere Affinität für die GTPasen besitzen als die GBDs.
Ein Grund hierfür könnte in einer höheren strukturellen Integrität der vollständigen CPD
gegenüber der GBD sein. Ein weiterer Aspekt ist, dass die GBD zwar eine Minimaldomäne
für die Bindung von GTPasen darstellen könnte, aber weitere Regionen der CPD (außerhalb
der GBD) mit der GTPase interagieren und so für eine höhere Affinität sorgen.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 165
Die Bindungsaffinitäten für die Interaktion von PlexinB1-GBD mit Rac1(Q61L), Rnd1 und
Rnd3 wurden mittels Isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) bestimmt. Die ermittelten
Dissoziationskonstanten KD waren 13,4, 12,0 und 10,3 µM für die jeweilige GTPase, was im
Vergleich zu anderen Effektorinteraktionen einer schwachen Bindung entspricht. Es ist
wichtig zu betonen, dass im Gegensatz zu der konstitutiv-aktiven Rac1(Q61L)-Mutante keine
Interaktion zwischen der PlexinB1-GBD und Rac1-Wildtyp festgestellt werden konnte. Diese
Mutante wurde bei den meisten publizierten Arbeiten eingesetzt. Eine biochemische
Charakterisierung hat gezeigt, dass die QL-Mutation zu einer drastischen Erhöhung der
GTPase-Affinität (25-120-fach) für die Interaktionspartner führt (Owen et al., 2000; Dvorsky
& Ahmadian, 2004). Es ist also davon auszugehen, dass die tatsächliche Affinität der
PlexinB1-GBD für Rac1 viel niedriger sein könnte, als es im Rahmen dieser Arbeit bestimmt
wurde.
Diese insgesamt nur schwache Bindung zwischen PlexinB1-GBD und den verwendeten Rho-
GTPasen erklärt aber gleichzeitig, die Ergebnisse der nativen Gelelektrophoresen und
Pulldown-Experimente.
5.1.3 Sind die zytoplasmatischen Domänen der Plexine GAPs?
Die CPDs der Plexine zeigen Sequenzhomologien zu der Proteinfamilie der Ras-spezifischen
GTPase-aktivierenden Proteine (GAPs) (Abb. 1.7). Auf der Basis der Sequenzhomologie
handelt es sich dabei um eine geteilte Domäne. In der dazwischen liegenden GBD von
PlexinB1 konnte weiterhin ein Cdc42/Rac interactive binding- (CRIB-) Motiv lokalisiert
werden (Abb 5.2). Naheliegend ist demnach, dass Rho-GTPasen als „Upstream“ und Ras-
verwandte GTPasen als „Downstream“ GTPasen in Frage kommen könnte (Abb. 5.1). Dieses
Modell wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht.
Da, wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, die N- und C- terminalen Domänen
miteinander interagieren (siehe 4.3.3) und für die CPD keine GAP-Aktivität auf eine Reihe
von GTPasen (RhoA, Rac1, Cdc42, R-Ras und H-Ras) gezeigt werden konnte (siehe 4.3.9),
kann man schlussfolgern, dass die CPD möglicherweise autoinhibiert vorliegt. Es war daher
wichtig zu testen, ob die Zugabe von GppNHp-gebundenen RhoGTPasen, als upstream-
GTPase, zur Herstellung der GAP-Struktur und folglich zur Aktivierung der GAP-Domäne
führen kann. Hierzu wurde zunächst der Einfluss von rekombinanter PlexinB1-CPD auf R-
Ras in der Anwesenheit von Rho-GTPasen (Rac1(Q61L)·GTP bzw. Rnd1·GTP), als
aktivierende GTPasen, untersucht. Es konnte keine Beschleunigung der GTP-Hydrolyse von
R-Ras gemessen werden (siehe 4.3.9). In einer vor kurzem erschienen Veröffentlichung
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 166
konnte die GAP-Aktivität der PlexinB1-CPD auf R-Ras nach Stimulation durch den
extrazellulären Liganden Sema4D gezeigt werden. Hierzu war zusätzlich die Bindung von
Rnd1 an die GBD von PlexinB1 erforderlich (Oinuma et al., 2004). Hauptunterschied zu den
in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimenten ist zum einen die Verwendung von
Membranfraktionen aus COS7 Zellen und zum anderen die Stimulierung durch den
extrazellulären Liganden (für PlexinB1-CPD, siehe 4.3.9). Dies erklärt jedoch nicht nicht,
warum PlexinA1 unter Verwendung von Membranfraktionen aus COS7-Zellen keine
Aktivität auf R-Ras zeigte (siehe 4.3.9), da Oinuma et al. (2004) ebenfalls eine Involvierung
von R-Ras im PlexinA1/Sema3A-Signalweg zeigen konnten. Da es sich bei Oinuma et al.
(2004) jedoch nur um einen indirekten Nachweis handelte, kann man annehmen, dass R-Ras
möglicherweise nicht direkt durch PlexinA1 inaktiviert worden ist.
Die vorliegende Arbeit hat gezeigt, dass PlexinB1 in der Küvette unter Verwendung
gereinigter rekombinanter Proteine keine GAP-Aktivität besitzt. Ursache kann hier eine durch
den extrazellulären Liganden induzierte Konformationsänderung sein, aber auch eine
posttranslationale Modifikation sollte in Betracht gezogen werden. Da eine Interaktion der
Plexine mit Tyrosinkinasen (Met) gezeigt werden konnte, wären z.B. Phosphorylierungen
nahe liegend. Da die hier verwendete rekombinante PlexinB1-CPD zunächst für die
Kristallisation eingesetzt werden sollte wurde das Protein während der Reinigung
dephosphoryliert. Ein interessanter Aspekt wäre hier die gleichen Experimente nochmals
durchzuführen, jedoch ohne das Protein zu dephosphorylieren.
5.1.4 Hsp31-Struktur
Hsp31 (heat shock protein 31) ist ein homodimeres Hitze-Schock-Protein, dass ursprünglich
bei Transcriptom-Analysen von thermisch gestressten Zellen entdeckt wurde und von dem
später gezeigt wurde, dass es Chaperon- und Protease-Aktivität besitzt (Richmond et al.,
1999; Malki et al., 2003; Sastry et al., 2002). Weitere hochkonservierte orthologe Proteine
sind in verschiedenen Pathogenen vorhanden (Sastry et al., 2002). Weiterhin besitzt Hsp31
strukturelle Homologie zu den PfpI-Peptidasen aus Archaen (Quigley et al., 2003) und zu
dem humanen DJ-1 Protein, das mit der Parkinson-Erkrankung in Verbindung gebracht wird
(Honbou et al., 2003; Huai et al., 2003; Lee et al., 2003; Tao & Tong, 2003; Wilson et al.,
2003). Hsp31 besitzt eine katalytische Triade (Quigley et al., 2003; Lee et al., 2003; Quigley
et al., 2004; Zhao et al., 2003), die nur wenig Lösungsmittel-exponiert ist. Das Hsp31-Protein
zeigt nur sehr geringe Aktivität gegenüber großen Proteinsubstraten, kann jedoch Fluorophor-
gekoppelte Monopeptide spalten, weshalb die physiologische Funktion dieser katalytischen
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 167
Triade bisher noch unklar ist (Lee et al., 2003). Genetische Evidenzen weisen auf der anderen
Seite darauf hin, dass es als eine Art Halterchaperon für das DnaK-DnaJ-GrpE-System dienen
könnte (Mujacic et al., 2004).
Das Hsp31-Protein wurde in dieser Arbeit als eine in der SDS-PAGE nicht sichtbare
Verunreinigung kristallisiert und mittels multiplen isomorphen Ersatzes gelöst. Der
rückblickende Vergleich zeigt, dass die durch die erste N-terminale Sequenzierung erhaltene
Sequenzinformation mit der durch die Struktur erhaltenen Information übereinstimmt. Eine
der möglichen Interpretationen der Sequenzierung stimmt mit dem N-Terminus von Hsp31
überein: X-V-Q-T-S-K-N-P (aus X - V/I - Q/F - N/T - D/S - D/K - N/I – P). Allerdings war
diese Sequenz vor der Strukturaufklärung, auch nach einer Suche in Datenbanken, nicht
eindeutig zuzuordnen.
Die in dieser Arbeit gelöste Struktur von Hsp31 zeigt 15 α-Helices und 16 β-Stränge, die
zwei α-β-Domänen ausbilden. Der Vergleich mit anderen kürzlich publizierten Hsp31-
Strukturen (Quigley et al., 2003; Lee et al., 2003; Zhao et al., 2003) zeigt eine hohe
strukturelle Ähnlichkeit: so beträgt die Abweichung der Cα-Atome (root mean square
deviation, r.m.s.d.) zu der am Besten aufgelösten Struktur von Hsp31 aus E. coli (1.6 Å;
Quigley et al., 2003) nur 0,56 Å (276 Cα-Atome). Hsp31 besitzt zwei Domänen, wobei die
als „A“-Domäne bezeichnete Region (Aminosäuren 46-56; 74-209; 229-283) in beiden
Strukturen vollkommen identisch ist (Abb. 4.25). Unterschiede sind allerdings in der als „P“-
Domäne bezeichneten Region zu erkennen. Die strukturell unterschiedlichen Aminosäuren
bilden den aus zwei β-Faltblattsträngen und einer α-Helix bestehenden N-Terminus
(Aminosäuren Thr5 – Tyr29) sowie die α-helikale Region von Ala213 bis Pro224. Die
Ursache für die Veränderungen sind zwei Aspekte: zum einen ist es die Kristallpackung zu
drei symmetrieverwandten Molekülen und zum anderen ein Malonatmolekül (Bestandteil der
Aufbewahrungslösung), das in einem direkt benachbarten hydrophoben Bereich in die
Struktur eingelagert ist.
Die N-terminalen Aminosäuren (Thr5 – Tyr29) sind an Kristallkontakten zu allen drei
symmetrieverwandten Molekülen beteiligt. Das Malonat-Ion ist ebenfalls in diesem Bereich
lokalisiert und wird von Tyr29, Phe209, Tyr222, Ile247, Pro263 und Phe264 kontaktiert.
Weiterhin sind zwei Wassermoleküle (W62 und W64) an der Bindung beteiligt.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 168
Interessanterweise entspricht genau diese veränderte Region einer als flexiblen Linker
beschriebenen Region, der eine funktionelle Bedeutung zugeschrieben wird (Sastry et al.,
2002). Diese Linker-Region könnte für die hochaffine Substratbindung bei erhöhten
Temperaturen verantwortlich sein. Ein weiterer interessanter Aspekt ist, dass das Malonat-Ion
weniger als 7 Å von Cys185 entfernt ist und sich somit in direkter Nähe zum aktiven Zentrum
der katalytischen Triade von Hsp31 befindet. Da vermutet wird, dass Hsp31 kleine Peptide
bindet (Quigley et al., 2003; Sastry et al., 2002), könnte dies darauf hindeuten, dass das
Malonat-Ion in einer Substrat-ähnlichen Art und Weise gebunden wird. Das in dieser Struktur
vorhandene zusätzliche Malonat-Ion könnte auch für die größere Isomorphie der Malonat-
Datensätze im Vergleich zu den unter Ammoniumsulfat-Bedingungen erhaltenen
Datemsätzen verantwortlich sein. Das Malonat-Ion bindet in einem flexibleren Bereich und
stabilisiert diesen, wie auch die Packung an die benachbarten Moleküle im Kristall.
Abb. 5.3: Die Koordination des Malonat-Ions (MLI). Die Abbildung zeigt die Koordination des zusätzlichen Malonat-Ions in der Bindungsspalte der P-Domäne. Als ball-and-stick-Modell hervorgehoben sind die dem Malonat-Ion (MLI) direkt benachbarten Aminosäuren und Wassermoleküle.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 169
5.2 Kristallstrukturen von Rac1b∆C
Rac1 ist die derzeit am Besten charakterisierte Isoform der Rac-ähnlichen Proteine und
reguliert die Genexpression, Zellzykluskontrolle und die Reorganisation des Aktinzytoskeletts
(Michiels&Collard, 1999). Rac1b wurde als alternative Splicevariante von Rac1 in humanen
Tumoren entdeckt und besitzt eine 19 Aminosäuren lange Insertion (zwischen den
Aminosäuren 75 und 76) am Ende der Switch II-Region (Jordan et al., 1999; Schnelzer et al.,
2000). Abbildung 5.4 zeigt die Lage und Sequenz der Insertion im Vergleich zu Rac1. Als
Funktion dieser 19 Aminosäuren-Insertion wurde die Generierung einer neuen
Effektorbindungsstelle vorgeschlagen und somit zu Signalwegen beitragen könnte, die mit
den neoplastischen Veränderungen der intestinalen Mucosa in Verbindung stehen (Jordan et
al., 1999, Singh et al., 2004). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Rac1b nicht mit Rho-
GDI und PAK1 interagiert (Matos et al., 2003). Ebenso ist Rac1b nicht an der Ausbildung
von Lamellipodien beteiligt; kann aber den Transkriptionsfaktor NF-κB aktivieren (Matos et
al., 2003).
Der Einfluss der 19 zusätzlichen Aminosäuren auf die Struktur und Funktion von Rac1b war
im Rahmen dieser Arbeit von zentralem Interesse. Hierzu wurden die Kristallstrukturen von
Rac1b im GDP- und GppNHp-gebundenen Zustand mit einer Auflösung von jeweils 1,75 Å
gelöst. Weiterhin wurden in unserer Arbeitsgruppe die Nukleotidbindung, die GTP-
Hydrolyse, die Regulation durch das RacGEF Tiam1 und p50RhoGAP, sowie die Interaktion
mit dem Effektor PAK untersucht. Rac1b besitzt eine sehr viel geringere Nukleotidaffinität
und GTP-Hydrolyse als Rac1 (Fiegen et al., 2004). Diese drastischen Änderungen in den
Abb. 5.4: Die 19-Aminosäuren lange Insertion von Rac1b. Die Insertion befindet sich am Ende der Switch II-Region zwischen den Aminosäuren 75 und 76 von Rac1. Hervorgehoben sind der Switch I, Switch II und die Insert-Helix.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 170
biochemischen Eigenschaften von Rac1b gegenüber Rac1 können durch die beiden Rac1b
Strukturen erklärt werden. Die strukturellen und biochemischen Daten zeigen, warum Rac1b
als vornehmlich GTP-gebundene Form von Rac1 verstanden werden kann.
5.2.1 Rac1b·GDP/GppNHp zeigen eine konservierte Struktur
Beide Rac1b Strukturen kristallisierten als kristallographisches Dimer, also mit zwei
Molekülen pro asymmetrischer Einheit. Die Kontaktfläche zwischen den jeweiligen
Molekülen ist vergleichsweise groß und beträgt 1347 Å2. Die an der Interaktion beteiligten
Strukturelemente sind die Faltblattstränge β1 bis β3, die α1-Helix sowie die Switch I-
Regionen der beiden Moleküle. Allerdings konnte durch Gelfiltrationsexperimente gezeigt
werden, dass dieses Dimer nicht physiologisch ist, da Rac1b in Lösung ein monomeres
Verhalten zeigte.
Beide Moleküle der asymmetrischen Einheit sind sehr ähnlich, wie die geringe Abweichung
der Cα-Atome von 0,45 Å (165 gemeinsame Cα-Atome) zeigt. Abbildung 5.5 zeigt die
Sekundärstrukturelemente von Rac1b·GDP und Rac1b·GppNHp überlagert mit der GppNHp-
gebundenen Rac1 Struktur (Hirshberg et al., 1997). Die Gesamtstruktur beider Nukleotid-
gebundenen Formen von Rac1b ist zueinander sehr ähnlich, aber auch im Vergleich zu
Rac1·GppNHp (Hirshberg et al., 1997), RhoA·GTPγS (Ihara et al., 1998) und Cdc42·GDP
(Rudolph et al., 1999). Diese nur geringen Unterschiede in der Gesamtstruktur lassen sich
besonders gut an den niedrigen Abweichungen für die Positionen der Cα-Atome erkennen:
Abb. 5.5: Vergleich der Rac1 und Rac1b Strukturen. Darstellung der Sekundärstruktur-elemente von Rac1b GDP (purpur) und Rac1b GppNHp (rot), überlagert mit Rac1 GppNHp (braun) (Hirshberg et al., 1997). Die Switch II-Region ist in Orange hervorgehoben. Das Nukleotid von Rac1b GppNHp und das Magnesiumion sind als ball-and-stick wiedergeben.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 171
für Rac1·GppNHp sind es 0,67 Å (156 gemeinsame Cα-Atome), für RhoA·GTPγS 0,80 Å
(155 gemeinsame Cα-Atome) und für Cdc42·GDP 0,81 Å (151 gemeinsame Cα-Atome).
5.2.2 Der hoch mobile Switch II und die Insertion
Trotz der sehr guten Übereinstimmung der Gesamtstrukturen sind zwei Regionen in Rac1b im
Vergleich zu Rac1 drastisch verändert. Dies sind, wie Abbildung 5.5 zeigt, die Switch I und
die Switch II-Region. Da der Switch II für die Rac1b Strukturen nicht sichtbar war, ist in
Abbildung 5.5 der Switch II von Rac1 zur besseren Orientierung in orange hervorgehoben. In
den meisten Strukturen von GppNHp-gebundenen GTPasen ist die Switch II-Region
verhältnismäßig gut geordnet (Menetrey & Cherfils, 1999), was darauf hinweist, dass die
Insertion von Rac1b zu einer höheren Flexibilität des Switch II beiträgt. Dies könnte somit die
Ursache für die beeinträchtigte GTP-Hydrolyse-Reaktion von Rac1b sein (Fiegen et al.,
2004): die katalytisch essentielle Aminosäure Gln61 (57DTAGQ-Motiv) ist dann sehr flexibel
und kann somit das nukleophile Wassermolekül für den Angriff auf das γ-Phosphat nicht
ausreichend stabilisieren. Wie schon vorher mehrfach gezeigt wurde, führt eine Mutation von
Gln61 sowohl zu einer verringerten intrinsischen als auch GAP-stimulierten GTP Hydrolyse
Reaktion (Scheffzek et al., 1998; Xu et al., 1997; Hwang et al., 1996; Ahmadian et al., 1999).
p50RhoGAP kann die GTP Hydrolyse von Rac1b beschleunigen (Fiegen et al., 2004),
wodurch gleichzeitig indiziert wird, dass die Switch-Regionen von Rac1b in einer GTP
Hydrolyse-kompetenten Art und Weise stabilisiert werden können.
In einer früheren Veröffentlichung wurde vorgeschlagen (Jordan et al., 1999), dass die
Insertion zusammen mit dem Switch II eine neue funktionelle Domäne aus zwei β-
Faltblattsträngen ausbilden könnte. Aufgrund der beobachteten hohen Flexibilität dieser
Region hat sie dementsprechend keine Sekundärstruktur, so dass die Ausbildung einer
zusätzlichen Domäne unwahrscheinlich ist.
5.2.3 Die offene Konformation des Switch I
In den Rac1b Dimeren weicht der Verlauf der Cα-Atome im Kontaktbereich des Dimers
(Aminosäuren Ala28 - Asn39) von dem Verlauf in den Strukturen von RhoA·GDP und
Rac1·GppNHp ab. Dies ist einer der auffälligsten Unterschiede zwischen den beiden Rac1b-
Strukturen und der Rac1·GppNHp Struktur. Weiterhin ist in beiden Rac1b-Strukturen der
Abstand des Switch I zum Nukleotid sehr viel größer als in Rac1. So beträgt die Distanz
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 172
zwischen Mg2+-Ion und dem Cα-Atom von Thr35 etwa 8,3 Å, in Rac1·GppNHp allerdings
nur 4,2 Å, so dass in Rac1 das Nukleotid durch den Switch I vollkommen verdeckt ist.
Ein Grund für diese offene Konformation des Switch I könnte die fehlende Interaktion
zwischen Switch I und Switch II sein. In der Rac1·GppNHp Struktur liegt Phe37 (Switch I) in
einer hydrophoben Tasche, die durch Thr58, Tyr64, Leu67 und Arg68 (Switch II) gebildet
wird. Bedingt durch die hohe Mobilität des Switch II in den Rac1b Strukturen kann diese
Interaktion nicht stattfinden und führt somit zu einer Destabilisierung des Switch I. In Bezug
auf die Kristallpackung wird die offene Konformation des Switch I durch hydrophobe
Interaktion der Phe37 Seitenketten von zwei benachbarten Molekülen stabilisiert. Dennoch
besitzt der Switch I erhöhte Temperaturfaktoren (B = 45 Å2) im Vergleich zum Gesamtprotein
(B = 22-24 Å2, Tab. 4.14). Dies lässt vermuten, dass der Switch I in Lösung ebenfalls sehr
flexibel ist.
Eine der Konsequenzen der offenen Switch I-Konformation ist der Verlust der Interaktion
zwischen dem invarianten Thr35 (Hauptketten NH-Gruppe), dem γ-Phosphat und dem Mg2+-
Ion (OH-Gruppe der Seitenkette). Dies könnte wiederum eine Erklärung für die schnelle
Nukleotiddissoziation von Rac1b sein (Fiegen et al., 2004). Ein ähnliches Verhalten wurde
für die T35A Mutation in Ras gezeigt, die ebenfalls zu einer drastischen Verringerung der
Nukleotidaffinität führt. Grund ist hier der Verlust der Mg2+-Koordination (John et al., 1993;
Spoerner et al., 2001). Auch der Tiam-katalysierte Nukleotidaustausch, wie die
Kristallstruktur des nukleotidfreien Rac1·Tiam1 Komplexes gezeigt hat, basiert auf einer
Verschiebung der Switch I und der β2-Region (Aminosäuren 27-45) um bis zu 2,7 Å
(Worthylake et al., 2000). Als Folge der Interaktion mit der DH-Domäne von Tiam1 wird
durch die Verschiebung die Thr35-Mg2+ Interaktion zerstört und erlaubt so die Dissoziation
des GDP (Vetter & Wittinghofer, 2001; Worthylake et al., 2000). Da in Rac1b die Kontakte
des P-Loop sowohl mit GDP als auch mit GppNHp konserviert und die erhöhten
Dissoziationsraten für GDP und GTP vergleichbar sind (Fiegen et al., 2004), ist es
vorstellbar, dass die 19 Aminosäuren lange Insertion von Rac1b einen zu Tiam1 ähnlichen
Effekt auf den Switch I ausübt.
Besonders auffallend war die hohe Dissoziationsrate von GppNHp (~10-fach höher als für
GDP/GTP, Fiegen et al., 2004). Ursache hierfür ist vermutlich die fehlende Interaktion
zwischen der Amino-Funktion von Ala13 (P-Loop) und der β,γ-Iminogruppe des GppNHp.
Eine vergleichbare Beobachtung wurde auch schon für Ras·mantGppNHp gemacht (Schmidt
et al., 1996).
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 173
Cdc42·GDP (Rudolph et al., 1999) zeigt im Switch I Bereich eine ähnlich offene
Konformation wie die Rac1b-Strukturen. Hier ist höchstwahrscheinlich ebenfalls der fehlende
Kontakt zwischen Thr35 und dem Magnesiumion die Ursache.
5.2.4 Interaktion von Rac1b mit Regulatoren und Effektoren
Um die Interaktion von Rac1b mit Regulatoren und Effektoren strukturell zu untersuchen,
wurden folgende Komplexstrukturen verwendet: der nukleotidfreie Rac1·Tiam1-Komplex
(Worthylake et al., 2000), RhoGDI im Komplex mit Rac1, Rac2 und Cdc42 (Grizot et al.,
2001; Scheffzek et al., 1997; Hoffman et al., 2000), der Übergangszustandskomplex aus
RhoA und p50RhoGAP (Rittinger et al., 1997), der Rac1·GppNHp·PAK-Komplex (Morreale
et al., 2000) und der Komplex aus Rac1(Q61L)·GTP·p67PHOX (Lapouge et al., 2000).
Zusätzlich zu der β2/β3/β4-Region im Falle von Tiam1, der β4/α3-Region für RhoGDI bzw.
der α1/α5-Region für PAK-GBD interagieren alle diese Proteine, außer p67PHOX, mit den
Switch-Regionen der GTPasen. p67PHOX bindet ausschließlich an die α1, β2 und α5 Regionen
von Rac.
Eine Überlagerung des GDI-Komplexes mit Rac1b zeigte, daß bei einer Bindung von GDI an
die Switch II und α3-Region von Rac1b ausreichend Raum für die Insertion bleiben würde.
Kürzlich wurde allerdings gezeigt, dass GDI nicht an Rac1b bindet (Matos et al., 2003). Es
wurde zuvor bereits gezeigt, dass die α3-Helix für eine Interaktion mit dem GDI-Protein
essentiell ist, da eine H103A Mutation zu deren Verlust führt (Haeusler et al., 2003). Die
Struktur der α3-Helix von Rac1b ist im Vergleich zu Rac1 nicht verändert, so dass man davon
ausgehen kann, dass die Insertion die GDI Bindung sterisch verhindert.
Die Assoziation von Tiam1 an Rac1b wurde kürzlich durch Immunpräzipitationsexperimente
gezeigt (Matos et al., 2003). Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass die strukturellen
Anforderungen für eine Interaktion zwischen Tiam1 und Rac1b durch die 19 Aminosäuren
lange Insertion nicht gestört werden. Allerdings konnte im Gegensatz zur Rac1b·p50GAP-
Interaktion, die zu einer Stimulation der GTP-Hydrolyse führte, sogar durch einen 50-fachen
Überschuß von Tiam1 DHPH keine Beschleunigung der Dissoziation erreicht werden (Fiegen
et al., 2004). Im Allgemeinen ist es akzeptiert, dass sowohl GEFs als auch GAPs eine
Aktivierung und Membranrekrutierung benötigen, um ihre regulatorische Funktion in der
Zelle wahrzunehmen. Dies zusammen mit der Tatsache, dass Rac1b in COS7 Zellen ohne
extrazelluläre Stimuli GTP-gebunden vorliegt (Fiegen et al., 2004), deutet darauf hin, dass
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 174
Rac1b unabhängig von seinen Regulatoren ist und intrinsisch einen aktivierten Zustand
aufrechterhalten kann.
Die biochemischen Daten bezüglich der Effektorbindung führen zu der Annahme, dass PAK-
GBD die sehr mobilen Switch-Regionen stabilisieren muss und deshalb eine 7-fach geringere
Affinität im Vergleich zu Rac1 besitzt. Da full length-PAK eine noch geringere Affinität
besitzt, konnte keine Bindung dieses Proteins nachgewiesen werden (Fiegen et al., 2004).
Folglich kann Rac1b im zellulären Kontext nicht mit PAK interagieren. Die Bindung eines
weiteren Rac-Effektorproteins, p67PHOX, wurde bisher noch nicht untersucht und kann, da die
Bindungsstelle auf Rac1b strukturell konserviert ist, nicht ausgeschlossen werden.
Die Tatsache, dass Rac1b mit GAP und PAK-GBD interagieren kann, zeigt, dass (i) die sehr
mobilen Switch-Regionen von Rac1b durch verschiedene Domänen erkannt und dass (ii) die
Insertion nicht notwendigerweise zum vollständigen Verlust der Bindung führen muss.
Allerdings ist bei einer Bindung eine stäkere Stabilisierung der Switch-Regionen als in Rac1
nötig und führt offensichtlich zu einer Verringerung der Bindungsaffinität relativ zu Rac1,
wie für PAK-GBD gezeigt werden konnte.
5.2.5 Rac1b im zellulären Kontext
Die präsentierten Daten zusammen mit der Veröffentlichung von Matos et al. (Matos et al.,
2003) ermöglichen es, ein Konzept für die Regulation und die Interaktion von Rac1b mit
Effektoren aufzustellen (Abb. 5.6). Die fehlende Regulation durch GDI-Proteine führt zu
einem konstitutiv membrangebundenen Rac1b. Bezieht man die im Vergleich zu Rac1
ungewöhnlichen intrinsischen Eigenschaften von Rac1b mit ein, so könnte man vermuten,
dass eine Regulation durch GEFs und GAPs nicht nötig ist. Rac1b kann zwar durch GAPs
effektiv inaktiviert werden, tritt aber sofort durch das „eingebaute GEF“, d.h. die 19
Aminosäure-Insertion, in einen neuen GTPase-Zyklus ein. GEFs können hier sogar zu einem
noch schnelleren Nukleotidaustausch führen. Die Selbstaktivierung von Rac1b, zusammen
mit der langsameren GTPase Reaktion und der Insensitivität gegenüber GDIs führen zu einer
Akkumulation von GTP-gebundenem Rac1b in der Zelle (Fiegen et al., 2004).
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 175
Abb. 5.6:.Der selbstaktivierende Mechanismus von Rac1b. Rac1b GTP akkumuliert an der Membran, bedingt durch die fehlende GDI-Regulation, dem schnellen intrinsischen Nukleotidaustausch und die beeinträchtigte GTP-Hydrolyse. Ein GEF (z.B. Tiam1) könnte die Aktivierung von Rac1b weiter beschleunigen, während ein GAP (z.B. p50GAP) die Inaktivierung katalysiert. Die weitere Signaltransduktion ist von PAK unabhängig, könnte aber neben anderen bisher noch nicht identifizierten Effektoren (?) auch p67PHOX involvieren. Die Pfeile zeigen effektive (fett), ineffektive (dünn), mögliche (gestrichelt) oder keine Interaktionen (durchgestrichen).
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 176
5.3 Kristallstrukturen von TC10
TC10 ist ein Mitglied der Rho-GTPase Familie und ist dem Zweig der Cdc42-ähnlichen
Proteine zuzuordnen. Die höchste Sequenzidentität besteht zwischen TC10 und TCL mit
72%, gefolgt von Cdc42 mit 59%, Rac1 mit 56% und RhoA mit 46% (Abb. 5.7).
Im Gegensatz zu den am Besten untersuchten Mitgliedern der Rho-Familie, RhoA, Rac1 und
Cdc42, ist die Funktion von TC10 noch nicht genau bekannt. Ein Teil dieser Arbeit sollte der
strukturellen Charakterisierung von TC10 dienen, um die biochemischen Eigenschaften dieses
Schaltermoleküls erklären zu können und die Funktionsweise besser zu verstehen. Die
Strukturaufklärung des GDP- und des GppNHp-gebundenen Zustands, mit einer Auflösung
Abb. 5.7: Sequenzvergleich ausgewählter Rho-GTPasen. Der Sequenzvergleich wurde mittels der GCG Software erstellt und mit Genedoc modifiziert. Schwarz hinterlegte Bereiche kennzeichnen 100%ige Konservierung, während rot hinterlegte Bereiche 80%ige Konservierung bedeuten. Die schwarzen Balken zeigen die Konsensusmotive der GTPasen: P-Loop, Switch I, Switch II, TQID- und SAL-Motiv.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 177
von 2,1 Å bzw. 2,65 Å, sollte sowohl Aufschluss über den Schaltermechanismus dieser
GTPase als auch über die Regulation und Signaltransduktion geben.
5.3.1 Die TC10 Strukturen im Vergleich
Die relativ hohe Sequenzhomologie unter allen Mitgliedern der Rho-Familie lässt eine
ähnliche Topologie der Proteine erwarten. Eine Überlagerung bestätigt die nur geringen
Unterschiede in den Positionen der Cα-Atome. Die mittlere Abweichung der Cα-Atome
zwischen TC10∆C·GDP und Cdc42·GDP (162 Cα Atome) beträgt 0,80 Å. Die Abweichung
zwischen TC10∆C·GppNHp und Cdc42·GDP (167 Cα Atome) beträgt ebenfalls nur 0,86 Å.
Für Rac1·GppNHp sieht der Vergleich zu TC10 ähnlich aus. Hier sind die mittleren
Abweichungen zu TC10∆C·GDP 0,99 Å (166 Cα Atome) und zu TC10∆C·GppNHp 1,11 Å
(163 Cα Atome). RhoA ist bezüglich der Sequenzidentität (46%) weiter von TC10 entfernt.
Dies findet sich auch in den mittleren Abweichungen der Cα-Atome wieder, wie der r.m.s.d.-
Wert von 1,37 Å für 173 Cα-Atome zeigt (TC10∆C·GppNHp im Vergleich zu RhoA·GTPγS;
Ihara et al., 1998). Obwohl die mittlere Abweichung der Cα-Atome zwischen den TC10 GDP
Strukturen und Cdc42 GDP (Rudolph et al., 1999) nur gering sind, zeigen die Abbildungen
(Abb. 4.60; Abb. 5.9) deutliche Unterschiede im Bereich der Switch I und der β2/β3 Region
(4.5.7.3 und 4.5.7.4).
Abb. 5.8: Überlagerung aller TC10 Strukturen. Als Überlagerung sind hier alle Moleküle der asymmetrischen Einheiten von TC10∆C·GDP (2 Moleküle, grün), TC10∆NC·GDP (4 Moleküle, blau) und TC10∆C·GppNHp (2 Moleküle, rot). Deutlich zu erkennen ist die ähnliche Konformation des Switch I und die hohe Mobilität in der β2/β3-Schleife und der Switch II-Region.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 178
5.3.2 Das zusätzliche Mg2+-Ion im β2/β3-Bereich von TC10∆C·GDP
Die TC10∆C·GDP-Struktur war die erste gelöste Struktur in dieser Arbeit. Zum Ende der
Strukturverfeinerung wurde deutlich, dass sich im Übergangsbereich zwischen den β-
Faltblattsträngen β2/β3 ein zusätzliches, durch Wasserliganden koordiniertes Mg2+-Ion
befindet (Abb. 4.63). Der Vergleich zu Cdc42 (Rudolph et al., 1999) verdeutlichte, dass hier
strukturelle Unterschiede vorliegen (Abb. 5.9). Es stellte sich demnach die Frage, ob die
strukturelle Abweichung auf das zusätzliche Magnesiumion zurückzuführen ist, oder für
TC10 charakteristisch ist. Dazu wurde eine zweite GDP-Struktur (TC10∆NC·GDP) mit einer
anderen Raumgruppe aufgeklärt. Diese Struktur zeigt interessanterweise trotz fehlenden
zusätzlichen Magnesiumions die gleiche strukturelle Abweichung in der β2/β3 Region wie
die erste Struktur (Abb. 5.9 und Abb. 5.8). Das zusätzliche Magnesiumion bei TC10∆C·GDP
hat folglich keinen direkten Einfluss auf die Struktur von β2/β3, sondern stabilisiert nur die
schon vorhandene Konformation. Die offensichtlichen Unterschiede in der TC10∆C·GDP
Struktur sind nicht nur in Bezug auf die Cdc42 Struktur interessant, sondern ebenfalls in
Bezug auf die TC10·GppNHp Struktur (siehe unten).
5.3.3 Die Nukleotidbindung von TC10
An der Nukleotidbindung von TC10 sind, wie in anderen GTPasen auch, Abschnitte beteiligt,
die durch insgesamt fünf konservierte Sequenzmotive charakterisiert werden können (Abb.
5.7). Die Sequenz 24GDGAVGKT31 umfasst die Phosphat-bindende Schleife, die auch als P-
Abb. 5.9: Stereo-Überlagerung der β2/β3-Regionen. Überlagerung der β2/β3-Regionen von TC10∆C·GDP (grün), TC10∆NC·GDP (beige), TC10∆C·GppNHp (rot) und Cdc42·GDP (blau). Deutlich zu erkennen sind die Unterschiede zwischen TC10 und Cdc42 am N-Terminus von β2, die durch die offene Switch I-Konformation von Cdc42 zustande kommen. Ebenso wird die hohe konformationelle Flexibilität der β2/β3-Schleife veranschaulicht.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 179
Loop bezeichnet wird (Saraste et al., 1990). Der Switch I enthält die für die Bindung des
Mg2+-Ions wichtige Aminosäure Thr49. Die Switch II-Region besteht aus den Aminosäuren 71DTAGQEDYDRL81 und enthält das für die GTP-Hydrolyse essentielle Gln75. Ebenfalls
wichtig für die Nukleotidbindung sind die Sequenzmotive 129TQID132 und 172SAL174.
Die Phosphat-bindende Schleife ist in allen drei TC10-Strukturen sehr gut definiert. Die
Amid-Protonen der Hauptkette sind für die Koordination des α- und β-Phosphats
verantwortlich. Die terminale Aminogruppe von Lys30 wechselwirkt in der TC10·GDP-
Struktur nur mit dem β-Phosphat, während es in der GppNHp-Struktur zwischen β- und γ-
Phosphat lokalisiert ist. Die Elektronendichte für das γ-Phosphat ist in der GppNHp-Struktur
gut erkennbar und klar definiert.
Für die Bindung des Magnesiumions (bzw. Ca2+ in TC10∆NC·GDP) sind drei der oben
angesprochenen konservierten Schleifenregionen, sowie das β-Phosphat in der GDP-Struktur
und die β- und γ-Phosphatgruppen in der GppNHp-Struktur verantwortlich. Aus diesen drei
Regionen ist jeweils eine Aminosäure für die Mg2+-Koordination von besonderer Bedeutung.
In der P-Schleife ist dies Thr31, im Switch I Thr49 und am N-Terminus des Switch II Asp71.
Bedingt durch die niedrigere Auflösung von 2.65Å der TC10·GppNHp-Struktur ist die
Magnesiumbindungsstelle schlechter aufgelöst als in beiden GDP-Strukturen war jedoch als
solche eindeutig in der Elektronendichte identifizierbar. Interessanterweise erfolgt die
Koordination des Mg2+-Ions durch Thr49 in den GDP-Strukturen wie auch in der GppNHp-
Struktur jeweils durch die Keto-Funktion der Hauptkette, was im Vergleich zu anderen GTP-
gebundenen Strukturen einen Unterschied darstellt (Hirshberg et al., 1997; Ihara et al., 1998).
In der zu TC10 homologen GDP Struktur von Cdc42 (Rudolph et al., 1999) ist die Position
des Carbonylsauerstoffs von Thr49 durch ein Wassermolekül besetzt und führt bei dieser
Cdc42-Struktur zu einer offeneren Konformation der Switch I-Region. Die homologe Struktur
von RhoA·GDP (Wei et al., 1997) hingegen zeigt eine sehr ähnliche Koordination des Mg2+-
Ions wie in den TC10 Strukturen. In der GTP-gebundenen Form von RhoA (Ihara et al.,
1998) hingegen ist es die Seitenkette von Thr37, die das Mg2+-Ion stabilisiert.
Die Ribose des Nukleotids wird von TC10 nicht kontaktiert. Allenfalls Gln130 (Q116 in
Cdc42) des TQID-Motivs koordiniert mit der Aminofunktion der Seitenkette das O4’ Atom
der Ribose schwach (Abstand 3,5Å). Allerdings ist in der GppNHp-Struktur die
Elektronendichte für die Seitenkette dieser Aminosäure nur partiell vorhanden. Diese Aussage
gilt jedoch nicht für die TC10∆C·GDP Struktur, da hier Gln130 sehr gut durch die
Elektronendichte definiert ist. Gln130 ist spezifisch für die Cdc42-ähnlichen Proteine (Cdc42,
TC10, TCL, Chp und Wrch-1; Abb. 5.7). Die meisten anderen Rho-GTPasen, aber auch die
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 180
der Ras-Familie haben in dieser Position ein Lysin, dessen ε-Aminogruppe das O4’-Atom der
Ribose kontaktiert. Welchen Einfluss die fehlende positive Ladung sowie die fehlende
Methylengruppe auf die Nukleotidbindung haben, ist noch unklar. Die intrinsische
Nukleodissoziation von TC10 ist sehr langsam und liegt im Vergleich zu den anderen Rho-
GTPasen in der gleichen Größenordnung (L.-C. Häusler, 2004). Interessanterweise wurde für
die Nukleotidassoziation von TC10 eine 100-fach langsamere Reaktion im Vergleich zu
RhoA, Rac1 und Cdc42 gemessen (A. Eberth, persönliche Mitteilung; L.-C. Häusler, 2004).
Die Ursache für diesen Umstand ist jedoch anhand der Kristallstrukturen nicht eindeutig
erklärbar. Es ist demnach davon ausgehen, dass mehrere kleine, sich aufsummierende Effekte
hierfür verantwortlich sein müssen.
5.3.4 Die Switch-Regionen von TC10
Ein Vergleich der GDP- und GTP-gebundenen Strukturen verschiedener RhoGTPasen zeigt,
dass zwei Regionen, Asp28 – Thr37 und Ala61 – Pro71 in RhoA sowie Phe28 – Asn39 und
Ala59 – Leu67 in Rac1 und Cdc42, Nukleotid-abhängige Konformationsänderungen
eingehen. Daher werden diese Regionen als Switch I bzw. Switch II bezeichnet. Diese
Regionen spielen eine zentrale Rolle bei der Mg2+-Koordination, Nukleotidbindung, GTP-
Hydrolyse sowie für die Interaktion mit Regulatoren und Effektoren (Vetter & Wittinghofer
2001; Dvorsky & Ahmadian, 2004). Die entsprechenden Regionen in TC10 sind Asp40 –
Thr49 und Ala73 – Pro83 (Abb. 5.7).
Interessanterweise zeigen die TC10·GDP und TC10·GppNHp Strukturen die gleiche
Konformation in der entsprechenden Switch I-Region, die mit dem GDP-gebundenen Zustand
von Rac, Cdc42 und RhoA übereinstimmt (Abb. 5.10). Die Positionen der Cα-Atome von
Val47 bis Thr49 sind in TC10·GDP und GppNHp nahezu identisch. Kleinere Unterschiede
sind für die Aminosäuren Ala38 bis Tyr46 erkennbar, wobei diese auf einer leicht veränderten
Kristallpackung beruhen könnten. In beiden Strukturen (TC10∆C·GDP und
TC10∆C·GppNHp) sind es zwei Switch I-Regionen benachbarter symmetrieverwandter
Moleküle, die eine Interaktionsfläche ausbilden. In der TC10·GDP-Struktur sind es die
Seitenketten von Tyr46, Phe51, Met35, Thr49 und Asp52, die über van-der-Waals bzw.
Wasserstoffbrückenbindungen miteinander wechselwirken. In der TC10·GppNHp Struktur ist
das Interface der symmetrieverwandten Moleküle in diesem Bereich kleiner. Hier sind nur die
Seitenketten der Aminosäuren Tyr46 und Pro48 (Tyr32 und Pro34 in Cdc42) an hydrophoben
Interaktionen beteiligt. Thr49 (Thr35 in Cdc42 bzw. Thr37 in RhoA) ist in allen GTPasen die
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 181
essentielle Aminosäure des Switch I, da sie als Sensor für den Nukleotid-gebundenen Zustand
der GTPase dient. Interessanterweise besteht in beiden Nukleotidzuständen von TC10 kein
Unterschied in der Koordination des Mg2+-Ions durch Thr49 (Abb. 5.10). In beiden Strukturen
erfolgt die Koordination des Mg2+-Ions durch die Ketofunktion der Hauptkette, so dass auch
die TC10·GppNHp Struktur im Switch I-Bereich eher dem GDP-gebundenen Zustand der
GTPase ähnelt (Abb. 5.10). Daraus leitet sich die Frage ab, ob die Switch I-Definition, wie sie
für RhoA getroffen wurden, auch für TC10 gilt. Auf der Basis der zur Verfügung stehenden
Daten, scheint der Switch I in TC10 unabhängig vom Nukleotid-gebundenen Zustand der
GTPase zu sein. Allerdings liefern die Strukturen keinen eindeutigen Hinweis darauf, warum
sowohl im GDP, als auch im GppNHp gebunden Zustand die Koordination des Mg2+-Ions in
der gleichen Art und Weise erfolgt. Es gibt hier nur zwei mögliche Ursachen für diese GDP-
ähnliche Konformation in der TC10·GppNHp-Struktur: zum einen könnte die Kristallpackung
die GDP-Konformation der TC10·GppNHp-Struktur bevorzugen, zum anderen könnten
einzelne Aminosäuresubstitutionen diesen Zustand verursachen. Da man für die GTP-
gebundene Konformation einen vergleichsweise stabilen Zustand erwarten würden, so wie er
in anderen GTP-gebundenen GTPase-Strukturen beobachtet wurde, sollte man diesen
Zustand, wenn er denn stabiler ist, auch für TC10·GppNHp erwarten. Dies ist jedoch nicht der
Fall. Das Interface der beiden Switch I-Regionen der symmetrieverwandten Moleküle ist sehr
klein und scheint eher eine Konformation zu stabilisieren, die schon vorher vorhanden war.
Auch in anderen GTP-gebundenen GTPase-Strukturen werden Interaktionen der Switch I-
Region mit symmetrieverwandten Molekülen beobachtet: So interagiert z.B. in der
RhoA·GTPγS-Struktur Phe39 mit dem Switch II eines benachbarten Moleküls (Ihara et al.,
1998). Extensive Kontakte zum Switch I (Tyr32 und Pro34) durch benachbarte Moleküle sind
ebenfalls in der Ras·GppNHp Struktur (Scheidig et al., 1999) zu beobachten. In beiden
Strukturen ist trotz der Switch I-Kontakte die GTP-Konformation für den Switch zu
beobachten, so dass zu vermuten ist, dass wenn diese Konformation auch in TC10 stabiler
wäre, sie entsprechend in einer Kristallstruktur beobachtet werden könnte. Somit sind
wahrscheinlich Aminosäuresubstitutionen im Bereich des Switch I für diese Konformation
verantwortlich. Hierfür in Frage kommen Met35, Glu44 und His53. Met35 z.B. ist ein
besonderes Merkmal von TC10. Die entsprechende Aminosäure in Cdc42 und Rac1 ist Ile21.
In der GDP-Konformation ist die Seitenkette von Ile21 an einer hydrophoben Interaktion mit
Phe37 (Phe51 in TC10) beteiligt und stabilisiert so zusätzlich die GDP-Konformation. Der
Einfluss des im Vergleich großen Schwefelatoms von Met35 auf die hydrophobe Packung ist
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 182
nur schwer abzuschätzen, könnte aber eine der Ursachen für den beobachteten Unterschied
sein.
Es ist bekannt, dass im GTP-gebundenen Zustand der Switch I in einem Gleichgewicht aus
zwei Konformationen vorliegt (Spoerner et al., 2001). In TC10 scheint dieses Gleichgewicht
zur GDP-Konformation für den Switch I verschoben zu sein. Ebenfalls in diese Richtung
deutet die schwächere Effektorbindung von TC10 (siehe unten). Um die GDP-ähnliche
Konformation der TC10·GppNHp-Struktur zu bestätigen bzw. auszuschließen, könnten
Mutationsstudien (Thr49 Ala) unter Beobachtung der Veränderung der Nukleotidaffinität
bzw. der Hydrolysereaktion weitere mechanistische Einblicke ermöglichen.
Abb. 5.10: Der molekulare Switch I der Rho-GTPasen im Vergleich. Dargestellt ist die jeweilige Switch I-Region der GTPasen TC10, Cdc42, Rac und RhoA im GDP- (schwarz) und GppNHp- (grau) gebundenem Zustand. Die zentralen Aminosäuren des Switch I sind als ball-and-stick-Modell hervorgehoben: Tyr46 (grün), Val47 (rot), Pro48 (orange) und Thr49 (blau).
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 183
Vergleicht man die TC10 und Cdc42·GDP Strukturen (Rudolph et al., 1999), so sind hier
deutliche Unterschiede im Bereich des Switch I zu erkennen. Ursache für die offene Switch I-
Konformation und die unterschiedliche Koordination des Magnesiumions in der Cdc42·GDP-
Struktur sind starke Interaktionen von symmetrieverwandten Molekülen mit der Switch I-
Region. Der Carbonylsauerstoff von Thr49 koordiniert in TC10 das Magnesium, während
Thr35 in Cdc42 nicht an der Bindung beteiligt ist. Verwendet man hingegen den
Cdc42·GDP·GDI-Komplex (Hoffman et al., 2000) als Vergleichsstruktur zu TC10, so zeigen
sich hier nur marginale Unterschiede. Die Cα-Positionen der Aminosäuren Val47 bis Thr49
sind vollkommen identisch. Die Region Pro43 bis Tyr46 scheint sowohl in Cdc42 als auch in
TC10 strukturell variabler zu sein. Auf dieser Basis ist der Cdc42·GDP·GDI-Komplex
(Hoffman et al., 2000) die bessere Referenz für den GDP-gebundenen Zustand von TC10.
Die Sequenz der Switch II-Region ist für die meisten Mitglieder der Rho-Familie annähernd
identisch (Abb. 5.7; Ausnahme ist die Rnd-Familie) und enthält das für die GTP-Hydrolyse
essentielle Gln61. Die Sekundärstruktur von Switch II ist in den hier diskutierten TC10
Strukturen im Vergleich zu den anderen bekannten RhoGTPase-Strukturen unverändert und
zeigt ebenfalls zwei aufeinanderfolgende 310-helikale Sekundärstrukturelemente. Der
Vergleich der TC10·GDP mit der TC10·GppNHp Struktur zeigt aufgrund des Vorhandenseins
des γ-Phosphats im Bereich des Switch II Veränderungen. Durch die zusätzliche Interaktion
von Gly74 (Gly60 in Cdc42) mit dem γ-Phosphat nähert sich der Bereich von Ala73 bis
Leu81 an das γ-Phosphat an. Diese zusätzliche Interaktion könnte zu einer Stabilisierung des
Switch II führen. Die biochemischen Daten für TC10 zeigen eine 5-fach niedrigere
intrinsische GTP-Hydrolyserate (Neudauer et al., 1998; A. Eberth, persönliche Mitteilung)
verglichen mit anderen Rho-GTPase Mitgliedern (z.B. RhoA, Cdc42 und Rac1). Aufgrund
der hohen Sequenz- und Struktur-Homologie des Switch II innerhalb der Rho-Familie müsste
die Ursache für diesen Unterschied anderweitig zu suchen sein. Auffällig ist in diesem
Zusammenhang die höhere Sequenz- und Strukturvariabilität der Switch I-Region, die je nach
GTPase eine leicht veränderte Mikroumgebung im Bereich des γ-Phosphats schaffen könnte.
Weiterhin wurde, wie oben beschrieben, in TC10 eine GDP-ähnliche Konformation für den
Switch I beobachtet, wobei das Mg2+-Ion durch die Ketofunktion der Hauptkette von Thr35
koordiniert wird. Die fehlende Konformationsänderung nach GTP-Bindung könnte folglich
der Grund für die langsamere GTP-Hydrolysereaktion sein. Eine vergleichbare Situation, die
ebenfalls zu einer 5-fach langsameren GTP-Hydrolyse führt, wurde bei einer Thr35Ala-
Mutation in Ras gefunden (John et al., 1993). Bei dieser Mutation in Ras kann
dementsprechend nur noch die Ketofunktion von Thr35 an der Mg2+-Bindung beteiligt sein.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 184
Ein weiterer Aspekt bezüglich der langsameren GTP-Hydrolyse von TC10 ist die fehlende
Koordination des γ-Phosphats durch Tyr46. In der RhoA·GTPγS-Struktur (Ihara et al., 1998)
ist z.B. die Seitenketten-Hydroxylfunktion von Tyr34 an der Koordination des γ-Phosphats
beteiligt, ebenso wie Tyr32 in der Rac1·GppNHp-Struktur (Hirshberg et al., 1997). In der hier
beschriebenen TC10·GppNHp Struktur ist eine zu RhoA und Rac1 vollkommen veränderte
Position für das entsprechende Tyr46 und keine Beteiligung an der Nukleotidbindung zu
erkennen. Für Ras oder Rap scheint allerdings die γ-Phosphat Koordination durch die
Hydroxylgruppe von Tyr32 keinen Einfluss auf die GTP-Hydrolyse zu haben, da durch eine
Mutation zu Phenylalanin keine Verringerung der Hydrolyserate zu beobachten war
(Yamasaki et al., 1994). Im Fall von Rap konnte zusätzlich anhand der GTP- und der GTPγS-
Strukturen gezeigt werden, dass das Vorhandensein bzw. Nicht-Vorhandensein einer Bindung
zwischen Tyr32 und dem γ-Phsophat keinen Einfluss auf die Struktur des Switch I hat
(Menetrey & Cherfils, 1999).
Neben der hier beschriebenen Veränderung im Switch II-Bereich gibt es eine weitere Region,
die sich in der GDP-gebundenen und der GppNHp-gebundenen Struktur von TC10
unterscheidet. Dies ist die Schleifenregion zwischen den β2/β3-Faltblättern und befindet sich
somit genau zwischen beiden Switch-Regionen. Die für TC10·GppNHp zusätzlich sichtbaren
N-terminalen Aminosäuren bilden mit dem zweiten Molekül der asymmetrischen Einheit ein
intermolekulares β-Faltblatt aus. Diese Interaktion endet genau vor bzw. hinter dem Bereich
der veränderten β2/β3-Region (Aminosäuren Ser57 bis Tyr65). Es stellt sich demnach die
Frage, ob diese Interaktion die Struktur im β2/β3-Bereich beeinflusst. Es wäre hier zum
Beispiel eine konformationelle Einschränkung vorstellbar. Die Bindung des N-Terminus des
benachbarten Moleküls scheint die Struktur der Schleifenregion zwischen β2/β3 stark zu
beeinflussen. Da analytische Gelfiltrationen gezeigt haben, dass TC10·GppNHp kein
physiologisches Dimer ist, kann eine biologische Relevanz ausgeschlossen werden. Die
beobachtete Struktur in diesem Bereich ist demnach auf die Kristallpackung zurückzuführen.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 185
Weiterhin ist die Schleifenregion zwischen β2/β3 stark Lösungsmittel-exponiert. In vielen
Strukturen der Rho-GTPasen besitzt diese Region im Vergleich zum Proteinkern erhöhte
Temperaturfaktoren, wie z.B. in Cdc42·GDP (Rudolph et al., 1999), RhoA·GDP (Wei et al.,
1997) und RhoA·GTPγS (Ihara et al., 1998). In der Rac1·GppNHp Struktur hingegen wird
diese Region sowohl durch intermolekulare Kristallkontakte als auch durch intramolekulare
Interaktionen stabilisiert (Hirshberg et al., 1997). Die Carboxylgruppe von Asp47 in Rac1
bildet mit der Guanidiniumgruppe von Arg174 Wasserstoffbrückenbindungen aus.
Vergleichbar interagiert Lys49 mit der Ketofunktion von Cys178 (Hirshberg et al., 1997).
Auch die Analyse der Normalmodi (4.5.8) zeigt für diese Region eine erhöhte Flexibilität,
besonders auffallend für Cdc42. Die Werte für die Vibration von TC10·GDP und GppNHp
sind hier deutlich niedriger, weisen aber zueinander ebenfalls Unterschiede auf.
TC10·GppNHp ähnelt sowohl in der Konformation der Schleifenregion wie auch in der
Vibration eher Cdc42. TC10·GDP zeigt die niedrigsten Werte für die Vibration in diesem
Bereich, was auf die schon beschriebene hydrophobe Packung des β2-Strangs mit dem
Abb. 5.11: Sequenzvergleich der Rho-GTPasen für die β2/β3-Region. Der Sequenzvergleich wurde mittels der GCG Software erstellt und mit Genedoc modifiziert. Schwarz hinterlegte Bereiche kennzeichnen 100%ige Konservierung, während dunkelgrau hinterlegte Bereiche 80%ige Konservierung und hellgrau hinterlegte Bereiche 60 %ige bedeuten. Die in der Schleifenregion zwischen β2/β3 vorkommenden Glycine sind gelb hervorgehoben.
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 186
Proteinkern zurückzuführen sein könnte. Betrachtet man den dargestellten Sequenzvergleich
eines Teils der Rho-GTPasen für die β2/β3-Region (Abb. 5.11) so fällt auf, dass nur die
Cdc42 ähnlichen Proteine (Cdc42, TC10 und TCL) in der Mitte der β2/β3-Schleife zwei
aufeinanderfolgende Glycine (Gly47 und Gly48 in Cdc42) besitzen. Da Glycine im Vergleich
zu allen anderen Aminosäuren mehr Bewegungsfreiheit haben, könnte diese Abweichung eine
der möglichen Ursachen für die beobachteten Unterschiede sein und zu einer erhöhten
Flexibilität dieser Region führen. Bei der β2/β3-Region scheint es sich folglich um eine
hochflexible Region zu handeln, die allerdings keine Strukturänderung abhängig vom
Nukleotidgebundenen Zustand der GTPase aufweist.
5.3.5 Die Insert-Helix
Einer der Hauptunterschiede zwischen den Proteinen der Ras- und der Rho-Familie ist das
Vorhandensein der Insert-Helix. Dies ist ein Bereich von 13 Aminosäuren Länge, der
zwischen dem β5-Strang und der Helix α4 eingefügt ist. Eine Bindung von Effektoren und
Regulatoren der Rho-GTPasen an diesen Bereich wird derzeit vielfach diskutiert. Eine
Interaktion mit den GDI-Proteinen (Wu et al., 1997) konnte gezeigt werden. Weiterhin ist sie
an der Bindung der p67PHOX-Untereinheit der NADPH-Oxidase beteiligt (Freeman et al.,
1996). Durch den Vergleich der Strukturen von RhoA·GDP (Wei et al., 1997) und
RhoA·GTPγS (Ihara et al., 1998) konnte gezeigt werden, dass sie ihre Struktur nicht
nukleotidabhängig verändert.
Die Insert-Helix (Aminosäuren Asp124 bis Gln136, RhoA, Ihara et al., 1998) zeigt auch in
den TC10 Strukturen die gleiche Sekundärstruktur (Abb. 5.8), eine 310-Helix gefolgt von
einer senkrecht dazu stehenden α-Helix. Vergleicht man die TC10-Strukturen untereinander
durch eine Überlagerung aller Moleküle der asymmetrischen Einheiten, so erkennt man eine
hohe Variabilität in dieser Region, die durch die stärkere Lösungsmittelexposition zustande
kommt (Abb. 5.8). Erhöhte Temperaturfaktoren für den Bereich der Insert-Helix wurden auch
in der Kristallstruktur von Rac1·GppNHp (Hirshberg et al., 1997) beobachtet. In der
RhoA·GDP-Struktur (Wei et al., 1997) hingegen wird diese Helix durch Kristallkontakte mit
symmetrieverwandten Molekülen stabilisiert und damit ihre Beweglichkeit eingeschränkt.
Eine ähnliche Situation wurde in der Kristallstruktur von Rnd3 (Fiegen et al., 2002)
beobachtet, wo ebenfalls Kristallkontakte zu einer Stabilisierung der Sekundärstruktur führen.
Die Mobilität der Insert-Helix ist aber auch in Lösung erhöht, wie NMR-Studien an
Cdc42·GDP (Feltham et al., 1997) zeigen. Die resultierenden Modelle zeigen für diesen
DISKUSSION _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 187
Bereich keine Sekundärstruktur, was im Falle von Cdc42 darauf hindeuten könnte, dass dieser
Bereich erst durch Bindung anderer Proteine strukturiert wird.
5.3.6 Die Oberflächen im Vergleich
Sowohl TC10·GDP als auch TC10·GppNHp zeigen eine sehr ähnliche Oberfläche und
Ladungsverteilung, was aufgrund der nur geringen strukturellen Unterschiede auch zu
erwarten ist. Lediglich für einige Seitenketten sind auf der Oberfläche unterschiedliche
Konformationen erkennbar. Der in der Elektronendichte von TC10·GppNHp interpretierbare
N-Terminus ist im Vergleich zu der Oberfläche von TC10·GDP leicht auszumachen (Abb.
5.12). TC10·GppNHp zeigt ähnlich wie Cdc42 eine Aushöhlung (‚Groove’) zwischen der
Switch I-Region und dem N-Terminus, die durch eine Verlagerung der β2/β3-Region
zustande kommt. Da die TC10·GDP-Struktur im β2/β3-Bereich eine näher zum Proteinkern
ausgerichtete Konformation zeigt, ist hier diese Aushöhlung nicht vorhanden. In der GTP-
Konformation von Cdc42 ist diese Aushöhlung für die Erkennung und Bindung des CRIB-
Motivs von PAK, ACK und WASp verantwortlich.
Der Vergleich der Oberflächen von TC10 und Cdc42 zeigt in einigen Bereichen Unterschiede
bezüglich der Ladungsverteilung (Abb. 5.12 und Abb. 4.64). Besonders auffallend sind hier
die Insert-Helices, die an einer Position jeweils entgegengesetzte Ladungen aufweisen. So
entspricht Asp145 von TC10 Lys131 in Cdc42. Glu127 von Cdc42 entspricht in TC10
hingegen einer hydrophoben Aminosäure (Ala141). Die positive Ladung von Lys138 in TC10
entspricht in Cdc42 hingegen einer polaren Aminosäure (Ser124). Den beiden negativ
geladenen Aminosäuren Glu49 und Glu178 von Cdc42 konnte bereits eine Funktion
bezüglich der Assoziation an WASp zugeordnet werden (Hemsath et al., 2005). Da die
entsprechenden Aminosäuren in TC10 entweder eine positive Ladung besitzen (Lys63) oder
ungeladen (Thr192) sind, funktioniert der für die Cdc42/WASp Assoziation beschriebene
Mechanismus der elektrostatischen Steuerung für TC10 und WASp nicht.
Weitere auffällige Unterschiede in TC10 sind die Aminosäuren Asp40 (Asn26 in Cdc42) und
Lys116 (Thr102). In Cdc42 sind dies hingegen die Aminosäuren Lys27 (Ala41 in TC10),
Glu143 (Gln157) und Lys153 (Cys167).
DISKUSSION _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 188
5.3.7 Interaktion von TC10 mit Regulatoren und Effektoren
Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEFs)
GEFs spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation von kleinen GTPasen. Sie stabilisieren
den Nukleotidfreien Zustand und ermöglichen so die Nukleotiddissoziation. Durch die höhere
GTP-Konzentration in der Zelle bindet anschließend GTP im aktiven Zentrum. Für den
katalytischen Mechanismus der Aktivierung von GTPasen durch GEFs sind auf beiden Seiten
meist hochkonservierte Strukturmotive verantwortlich. Neben diesen mechanistisch
Abb. 5.12: Vergleich der Oberflächeneigenschaften von TC10∆NC·GDP (oben), TC10∆C·GppNHp (mitte) und Cdc42·GDP (unten). Dargestellt ist die Verteilung der Oberflächenladungen der jeweiligen Moleküle. Die Berechnung der Oberflächen und der Ladungsverteilung erfolgte mit dem Programm MSMS. Negative Ladungen (Asp und Glu) sind in rot, positive Ladungen (Lys und Arg) in blau, während vornehmlich hydrophobe Aminosäuren (Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp und Tyr) in olive dargestellt sind. Links ist jeweils die Ansicht von vorne, auf das Nukleotid. Die rechte Ansicht erhält man nach einer 180°-Drehung um die Horizontalachse der linken Abbildung. Einzelne, zwischen den Molekülen unterschiedliche Aminosäuren sind markiert und benannt.
DISKUSSION _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 189
interessanten Bereichen, vornehmlich Switch I und Switch II auf Seiten der GTPase, sind
weitere zusätzliche Regionen für eine spezifische Erkennung der GTPase durch das GEF
verantwortlich. Für die Interaktion mit den Dbl-homologen GEFs spielt hier die β1/β2/β3-
Region der GTPasen eine besondere Rolle (Karnoub et al., 2001; Snyder et al., 2002). Diese
Aminosäuren sind Thr3 (Met17 in TC10), Ala41 (Ala55), Thr43 (Ser57), Thr52 (Leu66),
Gly54 (Gly68) und Phe56 (Tyr70) bei Cdc42 und dem GEF ITSN (Snyder et al., 2002).
Die biochemischen Daten zeigten, dass die DHPH-Domänen von einigen typischen RhoGEFs
keine Aktivität bezüglich TC10 zeigen. So waren Tiam1, p190, p115, Asef, hPEM, Cdc24, α-
Pix, β-Pix und Abr inaktiv auf TC10 (L.-C. Häusler, 2004; A. Eberth, persönliche
Mitteilung). Auch gegenüber Dbl scheint TC10 insensitiv zu sein (Hart et al., 1994 JBC). Der
Grund hierfür sind die zuvor angesprochenen sechs Spezifitätsdeterminanten. Tyr70 in TC10
(Phe56 in Cdc42) wird z.B. eine der Ursachen dafür sein, dass Tiam1-DHPH keine Aktivität
auf TC10 zeigt, da Tiam1 in der Lage ist, kleine Unterschiede auf Seiten der GTPase zu
erkennen. Spezifitätsuntersuchungen mit Rac1 und Cdc42 haben gezeigt, dass eine einzige
Aminosäure (W56) ausreicht, um die Erkennung von Trio, GEF-H1 und Tiam zu
gewährleisten (Gao et al., 2001; Karnoub et al., 2001; Karnoub et al., 2004). Eine Mutation
von F56W in Cdc42 reicht zwar nicht aus, um die Spezifität des Tiam1-GEFs von Rac1 auf
Cdc42 zu verändern, allerdings ist dies für die umgekehrte Mutation in Rac, W56F, bezüglich
des Cdc42-GEFs Intersectin möglich (Karnoub et al., 2001; Gao et al., 2001).
Das bakterielle Toxin SopE, das als GEF von RhoGTPasen (Cdc42 und Rac1) fungiert, zeigt
interessanterweise Austauschaktivität bezüglich TC10 (A. Eberth, persönliche Mitteilung).
Daher wurden die TC10·GDP Strukturen mit dem Cdc42·SopE-Komplex (Buchwald et al.,
2002) überlagert und verglichen. Neben den Switch I und Switch II Regionen von Cdc42, die
mechanistisch eine wichtige Rolle spielen, sind auch der N-Terminus des β2-Strangs und der
C-Terminus des β3-Strangs für die Interaktion zwischen GEF und GTPase wichtig. Im
Bereich der β2/β3-Stränge der GTPase sind es vornehmlich folgende Aminosäuren die mit
SopE interagieren: Asp38 (Asp52 in TC10), Tyr40 (Tyr54), Ala41 (Ala55) und Phe56
(Tyr70). Fast alle beteiligten Aminosäuren in den an der Interaktion beteiligten Regionen
(Switch I, Switch II und β2/β3) sind auf der Basis von Sequenz und struktureller Topologie
konserviert. Es ist anzunehmen, dass die Hydroxygruppe des Tyr70 von TC10 (Phe56 von
Cdc42) zusätzlich noch Wasserstoffbrückenbindungen mit den Keto-Gruppen der
Aminosäuren Ile177 und Ser178 von SopE eingehen könnte.
Eine GEF-vermittelte TC10-Aktivierung in der Zelle wird auf der Basis der Resultate dieser
Arbeit vorausgesetzt, da die Nukleotiddissoziation von TC10 sehr langsam ist und da diese
DISKUSSION _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 190
Reaktion durch das bakterielle Toxin (SopE) beschleunigt werden kann. Es ist daher
anzunehmen, dass unter den 69 verschiedenen GEFs der Dbl-Familie (Rossman et al., 2005)
TC10-spezifische Proteine existieren. Struktur- und Sequenzvergleiche kombiniert mit
anschließenden biochemischen Analysen sollten zur Identifizierung eines TC10-GEFs führen.
Weiterhin zeigt die Austauschaktivität von SopE auf TC10, dass diese Aktivität im zellulären
Kontext eine wichtige Rolle bei der bakteriellen Pathogenese spielen könnte.
GTPase-Aktivierende Proteine (GAPs)
Die Interaktion der GAP-Proteine, wie z.B. p50GAP, erfolgt vornehmlich über die Switch I,
Switch II und die α3-Regionen der GTPasen, was anhand von GAP·GTPase
Komplexstrukturen gezeigt werden konnte (Rittinger et al., 1997; Nassar et al., 1998).
Vergleicht man die Struktur von TC10∆C·GppNHp mit der Übergangszustandsstruktur des
Cdc42·GDP·AlF3·p50GAP-Komplexes (Nassar et al., 1998), so zeigen sich die größten
Unterschiede im Bereich des Switch I. Dies ist bedingt durch die GDP-ähnliche Struktur
dieser Region in TC10·GppNHp. p50GAP müsste demnach eine Hydrolyse-kompetente
Konformation im Switch I zunächst induzieren. Der Switch II hingegen ist in beiden
Strukturen sehr ähnlich und zeigt vergleichbare Konformationen. Bezieht man die
Sequenzinformation mit ein, so sind alle Aminosäuren, die im Switch I bzw. II an der
Ausbildung des Interface beteiligt sind, konserviert. Im Bereich der α3 gibt es bezüglich der
Sequenz nur eine interessante Abweichung: Glu110 (Lys96 in Cdc42). Das Glutamat in TC10
könnte hier sogar für eine höher affine Bindung sorgen, da es Wasserstoffbrückenbindungen
mit Thr310 und Arg314 auf Seiten des p50GAP eingehen könnte, die mit Lys96 von Cdc42
nicht möglich sind.
Auf der Basis der strukturellen Daten und der Sequenzinformation ist eine Interaktion mit
p50GAP sehr wahrscheinlich und wird auch durch biochemische Daten bestätigt. p50GAP
zeigt, was TC10 betrifft, eine zu anderen Rho-GTPasen vergleichbare Beschleunigung der
intrinsischen GTP Hydrolyse (Neudauer et al., 1998; A. Eberth, persönliche Mitteilung).
Guanin-Nukleotid-Dissoziationsinhibitoren (GDI)
Die Kristallstruktur des RhoGDI·Cdc42·GDP Komplexes zeigt als Bindungsepitope die
Switch I, Switch II und die dem Switch II benachbarte α3-Helix (Hoffman et al., 2000). Ein
vergleichbares Interface ist auch in den RhoGDI·Rac2·GDP und RhoGDI·RhoA·GDP
Komplexen identifiziert worden (Scheffzek et al., 2000; Longenecker et al., 1999). Auf Seiten
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 191
der GTPase sind im Switch I die Aminosäuren Thr35 (Thr49 in TC10) und Val36 (Val50 in
TC10) an der Interaktion mit dem GDI-Protein beteiligt. Der N-terminale Bereich des Switch
II erscheint für die Interaktion besonders wichtig und ist mit folgenden Aminosäuren beteiligt:
Ala59 (Ala73), Tyr64 (Tyr78) und Leu67 (Leu81 in TC10) des Switch II bilden zusammen
mit Leu41, Tyr51, Leu55 und Leu56 von RhoGDI einen hydrophoben Cluster. Die
Seitenkette von Tyr64 (Tyr78) wird weiterhin durch Wasserstoffbrückenbindungen zu Asp42
und Lys52 von RhoGDI stabilisiert. An der Ausbildung der Interaktionsfläche beteiligt sind
weiterhin die Aminosäuren Asp63 (Asp77), Arg66 (Arg80), Leu70 (Leu84), Ser71 (Ser85)
und Pro73 (Pro87 in TC10). Im Bereich der α3-Helix sind es vornehmlich die Aminosäuren
Glu100 (Glu114), His103 (Glu117) und His104 (Tyr118) die hydrophobe Wechselwirkungen
und Wasserstoffbrückenbindungen eingehen. Besonders auffallend ist hier die
Wasserstoffbrücke zwischen His103 (Cdc42) und Asp184 (RhoGDI).
Betrachtet man die TC10·GDP-Struktur bezüglich einer Interaktion mit dem GDI-Protein, so
zeigt sich eine deutliche strukturelle Konservierung. Keines der beteiligten
Sekundärstrukturelemente zeigt besondere Auffälligkeiten. Auch auf der Sequenzebene sind
im Switch I- und Switch II-Bereich alle beteiligten Aminosäuren konserviert. Die einzigen
Abweichungen sind in der α3-Helix zu beobachten. Zwei der für die Interaktion wichtigen
Aminosäuren sind substituiert: His103 (Glu117 in TC10) und His104 (Tyr118). Die
Substitution von Histidin nach Tyrosin in Position 104 scheint, unter Berücksichtigung der
RhoGDI·RhoA·Struktur, nur einen geringfügigen Einfluss zu haben, da RhoA an dieser
Position ein Phenylalanin besitzt. Ob die Substitution von His103 nach Glutamat zu einer
elektrostatischen Abstoßung mit Asp184 (RhoGDI) führt, ist nicht auszuschließen.
Berücksichtigt man allerdings, dass für die hochaffine GDI-Bindung die C-terminale
Modifizierung verantwortlich ist und wahrscheinlich einen deutlich größeren Beitrag zur
Bindung liefert (Nomanbhoy & Cerione, 1996; Hori et al., 1991; Platko et al., 1995;
Longenecker et al., 1999), wird dies für eine Bindung zwischen TC10 und GDI sehr viel
wichtiger sein.
ACK
ACK (activated Cdc42-associated kinase) ist eine Nicht-Rezeptor Tyrosinkinase und ein
Cdc42 spezifischer Effektor (Yang & Cerione, 1997; Eisenmann et al., 1999). Anhand von
strukturellen Studien des Cdc42·GBD Komplexes konnte vorgeschlagen werden, dass Val42
und Leu174 von Cdc42 mit der GBD-Domäne von ACK interagieren (Mott et al., 1999).
Diese Aminosäuren sind in TC10 allerdings konserviert (Val56 von TC10) bzw. konservativ
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 192
substituiert (Ile188 von TC10) und können nicht dafür verantwortlich gemacht werden, dass
TC10 nicht an ACK bindet (Neudauer et al., 1998). Eine kürzlich veröffentlichte Studie an
Cdc42-TC10 Chimären konnte die β2/β3-Region als Spezifitäts-determinierende Region für
die Bindung an ACK ausmachen (Gu et al., 2004). Interessanterweise ist dies genau die
Region in TC10, die strukturelle Unterschiede zu Cdc42 aufweist. Acht Aminosäuren
(39NYAVTVMIGGEPYTLGLF56 in Cdc42 und 53HYAVSVTVGGKQYLLGLY70 in TC10;
Fett hervorgehoben) sollen demnach in Cdc42 für die Bindungsspezifität an ACK
verantwortlich sein. Diese Region ist in allen Rho-GTPasen vergleichsweise gering
konserviert und könnte demnach idealerweise für die unterschiedlichen Effektor-
Bindungsspezifitäten verantwortlich sein. Die vorliegenden strukturellen Daten von TC10
zusammen mit den angeführten Mutationsstudien (Gu et al., 2004) weisen auf eine wichtige
Rolle der β2/β3-Region bezüglich der Effektorbindung und Spezifität hin. Interessanterweise
sind nur die Aminosäuren der β2-Region direkt an der Interaktion mit ACK beteiligt (Mott et
al., 1999). Man würde demnach nicht unbedingt einen Einfluss der β3-Aminosäuren auf die
Interaktion erwarten. Da aber auf der anderen Seite die NMR-Struktur von Cdc42 und ACK
nur die GBD-Domäne enthält, könnten im full length-ACK weitere Spezifitäts-
determinierende Bereiche vorhanden sein, die auch den β3-Bereich der GTPase
miteinbeziehen.
WASp
Kürzlich konnte gezeigt werden, dass TC10 mit WASp und N-WASp interagieren kann,
wobei diese Interaktion bis zu 800-fach schwächer ist, als für Cdc42 (Hemsath et al., 2005).
Ile21, Thr24 und Thr25 von Cdc42 (Met35, Ala38 und Asn39) sind die einzigen
Aminosäuren, die sich dabei im GTPase-WASp Interface unterscheiden. Mutationsstudien
haben gezeigt, dass diese Unterschiede in Bezug auf die kinetischen Daten keinen Einfluß
haben (Hemsath et al., 2005). Es ist jedoch beschrieben, dass neben den Aminosäuren, die
direkt an der Bindung beteiligt sind auch komplementär geladene Regionen auf beiden
Proteinen in der Nähe der Bindungsstelle wichtig für die Spezifität und effiziente
Komplexbildung verantwortlich sein können (Schreiber, 2002). Dieser elektrostatische
Steuerungsmechanismus ist bekanntermaßen für eine Erhöhung der
Assoziationsgeschwindigkeit der Protein-Protein-Interaktion verantwortlich (Kiel et al., 2004;
Sheinerman et al., 2000; Sinha & Smith-Gill, 2002).
DISKUSSION _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 193
Durch die TC10 Kristallstrukturen, sowie durch bioinformatische Analysen und
Mutationsstudien konnte bewiesen werden, dass die basische Region von WASp und zwei für
Cdc42 spezifische Glutamate (Glu49 und Glu178) für einen elektrostatischen
Steuermechanismus (electrostatic steering) verantwortlich sind (Hemsath et al., 2005). Diese
Glutamate sind in TC10 nicht vorhanden (Lys63 und Thr192), so dass dieser
Steuermechanismus für eine TC10-WASp Interaktion nicht funktioniert (Abb. 5.12).
Zusammen mit der Tatsache, dass die TC10·GppNHp Struktur eine GDP-ähnliche
Konformation für den Switch I aufweist, müsste WASp als Effektor zunächst die typische
GTP-Konformation im Switch I induzieren, was mit einem Affinitätsverlust einhergehen
könnte. Beide angesprochenen Effekte zusammen könnten folglich die bis zu 800-fach
geringere Affinität von WASp an TC10 erklären. Ob TC10 im zellulären Kontext mit WASp
als Effektorprotein interagiert und WASP-vermittelte Aktinpolymerisation induzieren kann,
muss genauer untersucht werden.
PAK1
PAK1 bindet genauso wie WASp und ACK unter Ausbildung eines intermolekularen β-
Faltblatts an die β2-Region der GTPasen Cdc42 und Rac. Das Interface zwischen GTPase und
PAK in diesem Bereich ist vornehmlich durch hydrophobe Interaktionen geprägt und
zwischen Cdc42, Rac und TC10 relativ gut konserviert. Dies ist möglicherweise der Grund,
warum PAK einen unspezifischen Effektor darstellt.
Die 10-fach geringere Affinität von PAK für TC10 (Hemsath et al., 2005) könnte ähnlich wie
bei WASp darauf hindeuten, dass PAK zunächst eine GTP-Konformation im Switch I
induzieren muss, um in typischer Art und Weise an TC10 zu binden.
ZUSAMMENFASSUNG _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 194
6. Zusammenfassung
Die kleinen GTPasen der Ras- und Rho-Familien und die Transmembranproteine der Plexin-
Familie sind in der Tumorprogression und Metastasierung involviert. Die zytoplasmatischen
Domänen (CPDs) der Plexinrezeptoren (66 kDa) besitzen bemerkenswerte strukturelle
Eigenschaften: (i) ein mittlerer variabler Sequenzabschnitt (200 Aminosäuren), wird als
GTPase-bindende Region (GBD) bezeichnet und wird für die Bindung von kleinen GTPasen
verantwortlich gemacht; (ii) die N- (170 Aminosäuren) und C-terminalen (180 Aminosäuren)
konservierten Domänen, die durch die GBD unterbrochen werden, zeigen
Sequenzhomologien zu den Ras-spezifischen GTPase-aktivierenden Proteinen (RasGAPs).
Während die Funktion der GTPasen als molekulare Schalter gut erforscht ist, ist ihre
Regulation durch die Plexine bzw. der Einfluss dieser Membranrezeptoren auf die GTPasen
noch weitgehend unklar. Gegenstand dieser Dissertation war es, die Struktur-
Funktionsbeziehung dieser zwei Proteinfamilien zu untersuchen.
Für die rekombinante Expression der Plexine konnten verschiedene Proteinfragmente
kloniert, in E. coli exprimiert und gereinigt werden. Die GBD-Domänen von PlexinB1, C1
und D1 konnten in hoher Reinheit und guter Ausbeute erhalten werden. PlexinA2-GBD stellte
sich als instabil heraus. Die Reinigung der CPDs von PlexinA2 und B1 aus E. coli war nur
unter Vorbehalt möglich, da hier eine Fehlfaltung des Proteins nicht auszuschließen ist. Die
Expression und Reinigung der CPDs aus dem eukaryotischen Sf21-System hingegen erfolgte
mit großer Reinheit und in guten Ausbeuten.
Die Interaktion der Rho-GTPasen mit den GBDs konnte qualitativ mittels nativer
Gelelektrophorese, Pulldown-Experimenten und GDI-Assay nicht gezeigt werden. Allerdings
konnte eine Interaktion von PlexinB1-GBD mit Rac1(Q61L), Rnd1 und Rnd3 durch ITC-
Experimente nachgewiesen werden. Aus den thermodynamischen Parametern kann ein
niedrigaffiner 1:1 Komplex aus GTPase und PlexinB1-GBD postuliert werden. Die niedrigen
Affinitäten im mittleren mikromolaren Bereich (10 - 15 µM) erklären, warum die Interaktion
in den qualitativen Experimenten nicht nachzuweisen war. Weiterhin konnte für Rnd1 und
Rac1(Q61L) qualitativ eine Interaktion mit der rekombinant hergestellten CPD von PlexinB1
ermittelt werden.
Für die rekombinante CPD von PlexinB1 im Komplex mit Rnd1 oder Rac1(Q61L) war keine
GAP-Aktivität auf R-Ras messbar. Ebenso konnte keine Beschleunigung der GTP-Hydrolyse
von R-Ras oder H-Ras durch PlexinA1 gemessen werden. Als mögliche Ursachen kommen
hier in Frage, dass die Plexin-Transmembranrezeptoren zunächst durch einen extrazellulären
ZUSAMMENFASSUNG _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 195
Liganden aktiviert werden müssen, bzw. dass eine intrazelluläre posttranslationale
Modifikation (z.B. Phosphorylierung) nötig ist, um GAP-Aktivität zu zeigen.
Bei der Kristallisation von PlexinA2-CPD (66 kDa, E. coli) wurden Kristalle für ein 32 kDa
großes Proteinfragment erhalten. Trotz eingehender biochemischer Untersuchungen konnte
nicht eindeutig geklärt werden, ob es sich um ein Fragment von PlexinA2 handelt, so dass die
Struktur mittels multiplen isomorphen Ersatzes (MIR) gelöst wurde. Die Struktur mit einer
Auflösung von 2.1 Å zeigte, dass es sich bei dem kristallisierten Protein um eine
Verunreinigung, das Chaperonprotein Hsp31, gehandelt hat. Für die CPD von PlexinB1
(Sf21) konnten nadelartige Kristalle erhalten werden, die jedoch trotz intensiver Optimierung
keine Diffraktion zeigten.
Rac1b ist eine Spleissvariante von Rac1 und besitzt eine 19 Aminosäuren lange Insertion am
Ende der Switch II-Region. Der Einfluss dieser Insertion auf die Struktur der GTPase sollte in
dieser Arbeit untersucht werden. Dazu wurde das C-terminal verkürzte Rac1b (Rac1b∆C) in
zwei verschiedenen Nukleotidzuständen (GDP und GppNHp) kristallisiert. Die
dreidimensionalen Strukturen konnten durch molekularen Ersatz unter Verwendung des
Programms AMoRe gelöst werden. Die finale Auflösung der beiden Strukturen beträgt 1.75
Å. Der Vergleich dieser Strukturen zeigte interessanterweise, abgesehen vom gebundenen
Nukleotid, keinen Unterschied. Die Switch I-Regionen beider Strukturen sind gut definiert,
zeigen jedoch keine Beteiligung an der Nukleotidbindung, da sie eine offene Konformation
besitzen. Für die Switch II-Regionen und die C-terminal liegenden 19 Aminosäuren-
Insertionen konnte keine Elektronendichte beobachtet werden. Dies ist auf eine hohe
Mobilität der Insertion und eine dadurch erhöhte Mobilität der Switch II-Regionen
zurückzuführen. Diese strukturellen Veränderungen erklären, warum Rac1b eine höhere
Nukleotiddissoziation und GTP-Hydrolyserate hat. Die Insertion scheint, durch eine
Veränderung der Dynamik der Switch-Regionen, einem intrinsischen GEF zu ähneln.
Rac1b·GTP akkumuliert an der Membran, bedingt durch die fehlende GDI-Regulation, dem
schnellen intrinsischen Nukleotidaustausch und die beeinträchtigte GTP-Hydrolyse. Ein GEF
(z.B. Tiam1) könnte die Aktivierung von Rac1b weiter beschleunigen, während ein GAP (z.B.
p50GAP) nach wie vor die Inaktivierung katalysieren könnte. Die weitere Signaltransduktion
ist von PAK unabhängig, könnte aber neben anderen bisher noch nicht identifizierten
Effektoren auch p67PHOX involvieren.
ZUSAMMENFASSUNG _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 196
TC10 zeigte im Vergleich zu Cdc42 und anderen Rho-GTPasen unterschiedliche
Eigenschaften. Unsere Untersuchungen konnten zum einen bisher keinen zellulären
Austauschfaktor für diese GTPase identifizieren. Zum Anderen besitzt TC10 im Vergleich zu
Cdc42 eine 1000-fach niedrigere Bindungsaffinität für das Wiskott-Aldrich syndrom protein
(WASp). Daher war es von größter Wichtigkeit, das Cdc42-homologe TC10-Protein
strukturell zu charakterisieren. Hierzu konnte TC10∆C im GDP und GppNHp gebundenen
Zustand kristallisiert werden. Weiterhin wurde ein zusätzlich N-terminal verkürztes Protein
(TC10∆NC) im GDP-gebundenen Zustand kristallisiert. Die Phaseninformation konnte durch
molekularen Ersatz für alle drei Strukturen angenähert werden. Die Auflösung der
TC10∆C·GDP Struktur beträgt 2,2 Å, die der TC10∆C·GppNHp Struktur 2,6 Å und die der
TC10∆NC·GDP Struktur 2,2 Å.
Der Vergleich der beiden Nukleotid-gebundenen Zustände (GDP und GppNHp) zeigte
interessanterweise keine Unterschiede für den Switch I-Bereich, während der Switch II, die für
Rho-GTPasen typische Konformationsänderung zeigt. In allen drei Strukturen wird das Mg2+-
Ion (bzw. Ca2+-Ion für TC10∆NC·GDP) durch die Ketogruppe der Hauptkette koordiniert und
entspricht somit im Fall des GppNHp-gebundenen TC10 einer GDP-ähnlichen Konformation.
Diese Daten erklären die veränderten biochemischen Eigenschaften von TC10 im Vergleich
zu anderen Rho-GTPasen (Rac, Rho und Cdc42) bezüglich Nukleotidbindung, GTP-
Hydrolyse und Effektor-Interaktion.
Anhand der TC10-Strukturen konnten zwei wichtige Aspekte bezüglich der Aktivierung und
der Interaktion mit den Effektoren erklärt werden. Eine Beschleunigung der sehr langsamen
Nukleotiddissoziation durch GEFs ist essentiell, konnte jedoch mit den bisher untersuchten
GEFs der Dbl-Familie in vitro nicht gezeigt werden. Dass dies im Prinzip möglich ist, zeigten
die Experimente mit dem bakteriellen SopE-GEF. Andererseits haben die TC10·GppNHp
Struktur und Modellanalysen gezeigt, dass die WASP-bindende Region zwischen TC10 und
Cdc42 keine signifikanten Unterschiede besitzen und dass die 1000-fach unterschiedlichen
Affinitäten zwischen TC10 und Cdc42 von Aminosäuren abseits der WASP-Bindefläche
herrühren, die an einem Mechanismus beteiligt sind, der als „electrostatic steering“ bekannt
ist.
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DANKSAGUNG _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 218
Danksagung
Zum Gelingen dieser Arbeit haben sehr viele Personen beigetragen. Ihnen möchte ich an
dieser Stelle für Ihre Hilfe und Ihr Verständnis danken.
An erster Stelle Prof. Dr. Wittinghofer für die Möglichkeit diese Arbeit in seiner Abteilung
anfertigen zu können, für die Übernahme des Erstgutachtens, sowie seine Bereitschaft als
Erstprüfer in der Promotionskommission zu fungieren.
Danken möchte ich weiterhin Prof. Dr. Heumann für die Übernahme des Korreferats und
Prof. Dr. Weingärtner für die Übernahme der Drittprüfer-Funktion in der Promotions-
kommission.
Besondere Anerkennung gilt PD Dr. Reza Ahmadian für die interessante Thematik dieser
Arbeit, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes in seiner Arbeitsgruppe, die gute Betreuung, die
vielen Vorschläge und Ideen sowie die stete Diskussionsbereitschaft.
Ebenso möchte ich mich bei Dr. Ingrid Vetter für Ihre Bereitschaft mich im
kristallographischen Bereich dieser Arbeit zu betreuen. Ihr Ideenreichtum und Ihre tiefe
Einsicht in Strukturbiologische Zusammenhänge werden für mich auch in Zukunft ein
Leitfaden sein.
Mein ganz besonderer Dank gebührt Patricia Stege für die hervorragende Einarbeitung und
ihre Hilfsbereitschaft, die ganz wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.
Weiterhin möchte ich mich in aller Form auch bei meinen Laborkollegen Lars Blumenstein,
Ulrike Herbrand, Lars-Christian Häusler, Lars Hemsath, Alexander Eberth, Katja Gotthardt,
Benjamin Reinartz und Radovan Dvorsky bedanken, die mit ihrer Kollegialität und
Unterstützung ganz wesentlich zu einem ausgezeichneten Arbeitsklima beigetragen haben.
Eine weitere Danksagung für ihre Hilfsbereitschaft geht an die Mitarbeiter in Prof.
Wittinghofers Arbeitsgruppe, vor allem Doro Kühlmann.
DANKSAGUNG _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 219
Bei allen Mitarbeiter/Innen des MPI Dortmund möchte ich mich bedanken; im Besonderen
bei der Abteilung Strukturelle Biologie und der X-Ray Gemeinschaft für die außergewöhnlich
angenehme Arbeitsatmosphäre. All denen, I. Schlichting, W. Blankenfeldt, M. Weyand, Ö.
Yildiz und A. Scheidig, die durch Sammeln von Datensätzen zum Gelingen dieser Arbeit
beigetragen haben, möchte ich meinen Dank bekunden.
Ein besonderer Dank gebührt meinen Eltern und meiner Schwester, die mich stets in jeder
Hinsicht unterstützt und mir in allen Lebenslagen viel Verständnis entgegengebracht haben.
Ein weiterer persönlicher Dank gilt allen Freunden, die in diesen drei Jahren außerhalb der
Arbeit für mich da waren.
LEBENSLAUF _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 220
Lebenslauf
Persönliche Daten Name: Dennis Fiegen Geburtsdatum: 11.01.1977 Geburtsort: Kleve Familienstand: ledig
Promotion 03/2002 – 06/2005 Dissertation am Max-Planck-Institut für Molekulare Physiologie, Thema: „Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien“ 06/2002 – 06/2004 Stipendium des Fonds der chemischen Industrie (FCI)
Diplom-Biochemie 10/1997 – 01/2002 Studium der Biochemie an der Ruhr-Universität Bochum Abschluss: Diplom-Biochemiker Note: sehr gut mit Auszeichnung 07/2001 – 01/2002 Diplomarbeit am Max-Planck-Institut für Molekulare Physiologie Thema: „Strukturelle Aspekte der Rho-Familie und ihrer Interaktionspartner“
Zivildienst 10/1996 – 11/1997 Institut für Humangenetik in Bonn
Schullaufbahn und Abitur 06/1996 allgemeine Hochschulreife, Note: 1,5 08/1987 – 06/1996 Freiherr-vom-Stein-Gymnasium Kleve
LISTE DER PUBLIKATIONEN _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 221
Liste der Publikationen
Haeusler, L.C., Hemsath, L., Fiegen, D., Blumenstein, L., Herbrand, U., Dvorsky, R., Vetter, I.R. and Ahmadian, M.R. (2005) Purification and biochemical properties of Rac 1, 2, 3 and the splice variant Rac1b (A. Hall, editor), submitted to Methods in Enzymology Hemsath, L., Dvorsky, R., Fiegen, D., Carlier, M.F. and Ahmadian, M.R. (2005) A novel mechanism of Cdc42 recognition by Wiskott-Aldrich Syndrome Proteins (submitted to Mol. Cell.) Fiegen, D., Dvorsky, R. and Ahmadian, M.R. (2005) Structural Principles of Ras interaction with Regulators and Effectors. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands (C.J. Der, editor), in press Fiegen, D., Haeusler, L.C., Blumenstein, L., Herbrand, U., Dvorsky, R., Vetter, I.R. and Ahmadian, M.R. (2004) Alternative splicing of Rac1 generates Rac1b, a self-activating GTPase. J. Biol. Chem. 279(6), 4743-4749. Fiegen, D., Blumenstein, L., Stege, P., Vetter, I.R. and Ahmadian, M.R. (2002) Crystal structure of Rnd3/RhoE: functional implications. FEBS Lett. 525 (1-3), 100-104. Brondijk, T.H.C., Fiegen, D. and Cole, J.A. (2002) Roles of NapF, NapG and NapH, subunits of the Escherichia coli periplasmic nitrate reductase, in ubiquinol oxidation. Mol Microbiol. 44(1), 245-255.
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