structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului...
Transcript of structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului...
![Page 1: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/1.jpg)
Functiile
proteinelor
structurale
mecanice
Control
pH
canale
pompe
transport
3/4 din capacitatea
totala de
tamponare a
organismului
http://static.fastbleep.com/
http://static.memrise.com/
![Page 2: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/2.jpg)
TipuriStructura cuaternara – 4 subunități
Hemoglobina
Deoxihemoglobina A
PDB 1HBB
HbA 2β2
96% Hb adult
25 % nou-născut
HbA1c 2β2 glicozilată
(subunitatea β NH2-Val)
5% Hb adult sănătos
↑ 5% Hb diabetici
HbA2 2δ2
2-3% Hb adult sănătos
↑ 3% β-talasemia
HbF 22
1% Hb adult
75 % nou-născut
HbF~O2 > HbA~O2
![Page 3: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/3.jpg)
Anemia falciformă (siclemia)
Hemoglobina
http://www.medicalstudent.ro/contravizita/
anemia-falciforma.html
www.chem.wisc.edu
HbS 2β2
β GLU6VAL
acces restrâns al O2 la HbS
Oboseala
https://www.intechopen.com/
![Page 4: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/4.jpg)
Proteine – masa moleculară
https://www.researchgate.net/
http://onlinembr.info
![Page 5: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/5.jpg)
Tehnici de separare si caracterizare
a proteinelor
Studiul proteinelor -obiective
1. Purificarea proteinei
prepararea extractului
precipitarea
centrifugarea
separarea cromatografica
verificarea puritatii
dializa
ultrafiltrarea
![Page 6: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/6.jpg)
1. Purificarea proteinei
1.1. Prepararea
extractuluimicroorganisme
plante
Alegerea sursei
Procariote
(archea, eubacterii)
Eucariote
Drojdii
Fungi
muscată
tutun
Spanac
Arabidopsis thalianaorigine
animală
Ficat, pancreas, creier
http://anatomyofthefoot.com/
![Page 7: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/7.jpg)
1. Purificarea
proteinei
1.1. Prepararea
extractului ultrasonicare
utilizarea presei franceze
cicli inghetare-dezghetare
Ruperea
membranelor
celulare
enzimatic
folosirea detergenților
http://www.mdpi.com/
![Page 8: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/8.jpg)
1.1. Prepararea extractului
ultrasonicare presa franceza
1. Purificarea proteinei
celulele bacteriene P = 20.000 psi (1360 atm)
Vmin= 40mL samples• scumpă
• zgomotoasă
• timp îndelungat funcționare/curățire
celulele procariote
eucariote
țesuturi animale• zgomotoasă
• reproductibilitatea (denaturare)
![Page 9: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/9.jpg)
cicli inghetare-dezghetare distrugerea membranei celulare
1.1. Prepararea extractului
joy-of-bioprocess.blogspot.com
- Utilizarea lizozimului
- Utilizarea detergentilor
www.plospathogens.org
1. Purificarea proteinei
celulele bacteriene
animale
+ ieftină•reproductibilitatea (denaturare)
![Page 10: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/10.jpg)
1.2. Precipitarea proteinelor
A. Precipitarea la pH = pI
Papaina (papaia) pI = 8,85
Ureaza (fasole) pI = 5 - 5,1
B. Precipitarea cu (NH4)2SO4
precipitat
Precipitarea fractiunilor care contin HSA
a) Inainte de adaugarea sarii;
b) Suspensie de precipitat proteic in solutie 85% de sulfat de amoniu;
c) Precipitat proteic rezultat in urma centrifugarii (60 min la 5000 rpm).
1. Purificarea proteinei
![Page 11: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/11.jpg)
1.2. Precipitarea proteinelor
C. Precipitarea cu PEG
D. Precipitarea cu solventi organici
Acetona EtOH
1.3. Dializa
Amestec
supus
dializei
Sac de
dializa
A B
Solutie
tampon
Proteina
Molecule mici
difuzie
1. Purificarea proteinei
![Page 12: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/12.jpg)
1.3. Dializa – îndepărtarea sărurilor/solvenților organici
1. Purificarea proteinei
http://www.spectrumlabs.com/
https://www.thermofisher.com/
Saci de dializa
(esteri celuloza)
http://static.coleparmer.com/
https://www.thermofisher.com/
![Page 13: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/13.jpg)
1.4. Ultrafiltrarea (concentrarea probei)
1. Purificarea proteinei
N2 (presiune)
Sticla
sinterizata
Ultrafiltrat
Membrana
Magnet pentru
agitareSolutia de proteina
supusa concentrarii
Agitator magnetic
Membrane semipermeabile
- Acetat de celuloza
- Nylon
- polivinilidena
Mai rapida decat dializa
Concentrarea probei
http://www.sigmaaldrich.com/
![Page 14: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/14.jpg)
1.4. Ultrafiltrarea (concentrarea probei)
Membrane semipermeabile
-presiune-
www.ebay.tv
http://www.emdmillipore.com/
Membrane
semipermeabile/centrifugare
www.fishersci.com
1. Purificarea proteinei
![Page 15: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/15.jpg)
1.5. Centrifugarea
1. Purificarea proteinei
rPrecede alte operatii
sonicare
precipitare
Separarea
M
forma
densitate
natura
solventului
Viteze mici < 6000 rpm
Particule mai mari
nucleu celule
rosii
![Page 16: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/16.jpg)
1.5. Ultracentrifugarea
1. Purificarea proteinei
Viteze mari > 20000 rpm
Organite celulare
mitocondrii reticulul
endoplasmatic
1 Svedberg = 1S = 1 x 10-13 s
Hemoglobina 4,5 S
Mioglobina 1,8 SProcariote Eucariote
http://1.bp.blogspot.com
![Page 17: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/17.jpg)
1.5. Centrifugare vs ultracentrifugarea
1. Purificarea proteinei
http://namrataheda.blogspot.ro
![Page 18: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/18.jpg)
1.5. Ultracentrifugarea
1. Purificarea proteinei
http://image.slidesharecdn.com/
http://www.visionlearning.com/
http://www.biologydiscussion.com/
![Page 19: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/19.jpg)
1.6. Separarea cromatografica
1. Purificarea proteinei
1.6.1. Cromatografie de excludere
Coloana
cromatografica
Amestec
supus
separarii
GelA B
http://www.waters.com/
![Page 20: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/20.jpg)
1.6. Separarea cromatografica
1.6.1. Cromatografie de permeabilitate in geluri
Tipul gelulului Intervalul de
separare
(M, KDa)
Sephadex G-10 < 0.7
Sephadex G-25 1-5
Bio-Gel P-60 3-60
Sephadex G-75 3-70
Sephadex G-100 4-100
Bio-Gel P-100 5-100
Sephadex G-200 30-200
Sephacryl S-300 10-1.500
Sepharose 2B 70-40.000
10
100
1000
0 20 40 60 80 100 120
Volume/ml
MW
/kD
a
Estimarea masei
moleculare relative Mr
![Page 21: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/21.jpg)
1.6. Separarea cromatografica
1.6.1. Cromatografie de permeabilitate in geluri
http://www.ap-lab.com/images/LS_setup.gif
Sistem de purificare cromatografică
http://wolfson.huji.ac.il/purification/
Superdex 200 Increase 10/300 GL
http://www.gelifesciences.com/
![Page 22: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/22.jpg)
1.6. Separarea cromatografica
1.6.1. Cromatografie de permeabilitate
in geluri
Avantaje
Timp scurt de analiză;
Separare bine-definită;
Benzi înguste și sensibilitate bună;
Nu există pierderi ale compusilor separați;
Volum mic de fază mobilă ;
Rată de eluție controlabilă.
Separare cromatografica
HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200HEPES 50 mM pH 7.4 +50 mM NaCl)
Zaharia, M. & Gradinaru, R.,
J. Appl. Spectrosc.,
82 (2), 285-292 (2015)
Etapă finală la purificarea proteinelor
![Page 23: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/23.jpg)
1.6. Separarea cromatografica
1. Purificarea enzimei
1.6.3. Cromatografie prin interactii hidrofobe
www.pall.com
http://www.jncamericany.com/
Cromatografie mixtă – hidrofobă + ionică
http://www.genengnews.com/
![Page 24: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/24.jpg)
1.6. Separarea cromatografica
1. Purificarea proteinei
1.6.2. Cromatografie de schimb ionic
– –– –––
–Proteina
Schimbator
anionicIoni din
tampon
–
–––
––
–
A B
![Page 25: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/25.jpg)
1.6. Separarea cromatografica
1. Purificarea proteinei
1.6.2. Cromatografie de schimb ionic
https://www.chromacademy.com/
ww.bio-rad.com/webroot
![Page 26: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/26.jpg)
Schimbatori anionici Gruparea functionala Taria
schimbatorului
Dietil-amino-etil (DEAE) -O-CH2-CH2-N+( CH2CH3)2 slaba
Cuaternara aminoetil
(QAE)
-O-CH2-CH2-N+( C2H5)2- CH2-CH2OH-CH3 puternica
Cuaternara amoniu (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 puternica
Schimbatori cationici Gruparea functionala Taria
schimbatorului
Carboximetil (CM) -O-CH2-COO- slaba
Sulfopropil (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2- CH2- CH2-SO3- puternica
Sulfonat de metil -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2- CHOH- CH2-SO3- puternica
Grupări functionale ale schimbatorilor de ioni
1.6. Separarea cromatografica
1. Purificarea proteinei
1.6.2. Cromatografie de schimb ionic
![Page 27: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/27.jpg)
1.6. Separarea cromatografica
1. Purificarea proteinei
1.6.4. Cromatografie de afinitate
https://www.creative-biostructure.com/
![Page 28: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/28.jpg)
1.6. Separarea cromatografica
1. Purificarea proteinei
1.6.4. Cromatografie de afinitate
ADN cu secventa suplimentara
Insertie in
bacterii (E coli)
Distrugerea
membranelor
proteina cu
secventa
adiacenta
alte
proteine
legare
Ma
trice d
e a
finita
te
Spalare
Elutie
Indepatare
secventa
suplimentara
= ligand
![Page 29: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/29.jpg)
1.6. Separarea cromatografica
1. Purificarea proteinei
1.6.4. Cromatografie de afinitate –aplicații
Purificarea acizilor nucleici
Purificarea proteinelor membranare
Purificarea enzimelor
Purificarea anticorpilor
Purificarea receptorilor (pentru hormoni)
Purificarea proteine neurotransmiţătoare
![Page 30: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/30.jpg)
10
100
1000
0 10 20 30
distance/mm
MW
/kD
a
97 kDa
45 kDa
30 kDa
20 kDa
66 kDa
14 kDa
1.6. Verificarea puritatii - electroforeza
1. Purificarea proteinei
![Page 31: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/31.jpg)
1.6. Verificarea puritatii – SDS electroforeza
1. Purificarea proteinelor
Avantajele SDS electroforezei
SDS (detergent) solubilizeaza aproape
toate proteinele;
Izoproteinele nu apar sub forma unor benzi
diferite;
Micelele de SDS-proteina, fiind puternic incarcate
negativ, poseda o mobilitate electroforetica;
Lanturile polipeptidice sunt despachetate
separarea = f(dimensiune a porilor, M);
www.pnas.org
Dezavantaje
Proteinele separate prin SDS-electroforeza -
leaga bine colorantul.
![Page 32: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/32.jpg)
Tris-Tricine SDS PAGE (Schaegger)
• 16.5% 2-25 kDa
Sisteme de electroforeza folosite (cu detergent)
1.6. Verificarea puritatii - electroforeza
1. Purificarea proteinei
Tris-glycine SDS PAGE (Laemmli)
• 7.5% 40-400 kDa
• 12.5% 20-100 kDa
• 20% 3-25 kDa
Sisteme de electroforeza nativa
- fara SDS
- agenti reducatori (DTT)
![Page 33: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/33.jpg)
Sisteme de electroforeza folosite
1.6. Verificarea puritatii - electroforeza
1. Purificarea proteinei
![Page 34: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/34.jpg)
Mecanism de polimerizare
1.6. Verificarea puritatii – SDS - electroforeza
1. Purificarea proteinei
![Page 35: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/35.jpg)
Acril-
amida
(%)
Intervalul
de separare
(KDa)
15 15-45
12,5 15-60
10 18-75
7,5 30-120
5 60-210
1.6. Verificarea puritatii – SDS - electroforeza
1. Purificarea proteinei
Mecanism de polimerizare
http://www.gelifesciences.com/
![Page 36: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/36.jpg)
Reducerea puntilor disulfidice
1.6. Verificarea puritatii – SDS - electroforeza
1. Purificarea proteinei
http://www.crc.dk/yeast/
![Page 37: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/37.jpg)
Reducerea puntilor disulfidice
1.6. Diagnoză - electroforeza
1. Purificarea proteinei
https://www.researchgate.net/topic/Sickle-Cell-Disease
![Page 38: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/38.jpg)
1.6. Verificarea puritatii – electroforeza bidimensională
1. Purificarea proteinei
http://www.bio-rad.com
![Page 39: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/39.jpg)
1.6. Separarea proteinei - HPLC verificarea puritatii
1. Purificarea proteinei
elte.prompt.hu
dionex.com
![Page 40: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/40.jpg)
1.6. Spectrometria de masa – determinarea masei moleuclare
1. Puritatea proteinei / complecsi
![Page 41: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/41.jpg)
1.6. Verificarea puritatii – spectrometria de masa (MALDI-TOF)
1. Puritatea proteinei / complecsi
www.atdbio.com
http://www.kcl.ac.uk/
![Page 42: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/42.jpg)
1.6. Verificarea puritatii – spectrometria de masa (ESI-MS)
1. Puritatea proteinei
![Page 43: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/43.jpg)
1.6. Verificarea puritatii – spectrometria de masa (ESI-MS)
1. Purificarea peptidelor/proteinelor
![Page 44: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/44.jpg)
Proba
Sursă de
ionizareMS1 Fragmentare
(cameră de
coliziune)
MS2
Spectru
de masă 1
Spectru
de masă 2
EI, ESI
MALDI
Detector
1.6. Verificarea puritatii – spectrometria de masa in tandem
1. Analiza proteinei
![Page 45: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/45.jpg)
1.6. Verificarea puritatii – spectrometria de masa in tandem
1. Purificarea proteinei
AA M (Da) AA M (Da) AA M (Da) AA M (Da)
Ala, A 71.0 Gln, Q 128.1 Leu, L 113.1 Ser, S 87.0
Arg, R 156.1 Glu, E 129.0 Lys, K 128.1 Thr, T 101.0
Asn, N 114.0 Gly, G 57.0 Met, M 131.0 Trp, W 186.1
Asp, D 115.0 His, H 137.1 Phe, F 147.1 Tyr, Y 163.1
Cys, C 103.0 Ile, I 113.1 Pro, P 97.1 Val, V 99.1
![Page 46: structurale mecaniceDrojdii Fungi muscată ... Purificarea proteinei 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare Ruperea membranelor](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022040512/5e60885e7216476e6774e635/html5/thumbnails/46.jpg)
Aplicatiile MS
Identificarea proteinelor
(2D gel)
Caracterizarea proteinelor
recombinate
Modificarile postranslationale
ale proteinelor
1.6. Verificarea puritatii – spectrometria de masa (ESI-MS)
1. Purificarea proteinei
Expert Protein Analysis
System ExPASy
1- si -globine ( 12 KDa); 2- -actine ( 12 KDa)
3- acetil colin esteraza; 4- spectrine cu lant -actine
Proba din ficatul uman
Determinarea masei moleculare