Start. Tema 3. Propiedades de los ácidos nucleicos Métodos de análisis.
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Tema 3. Propiedades de los ácidos nucleicosMétodos de análisis
• Propiedades químicas: vistas en estructura (tema 2)• Propiedades físicas: - absorción luz UV
- desnaturalización - reasociación - viscosidad
• Caracterización: - efecto hipercrómico - curvas Cot
- secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo
- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)
contenido
• Propiedades químicas: vistas en estructura (tema 2) • Propiedades físicas: - absorción luz UV
- desnaturalización - reasociación - viscosidad
• Caracterización: - efecto hipercrómico - curvas Cot
- secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo
- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)
contenido
Absorción de luz ultravioleta (UV)
desnaturalización y reasociación
Viscosidad del DNA en solución
disminuye al -fragmentarse: agitación mecánica, sonicación (ultrasonido)
-desnaturalizarse: calor, baja fuerza iónica, pH alcalino, urea, …
• Propiedades químicas: vistas en estructura (tema 2) • Propiedades físicas: - absorción luz UV
- desnaturalización - reasociación - viscosidad
• Caracterización: - efecto hipercrómico - curvas Cot
- secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo
- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)
contenido
efecto hipercrómico
efecto hipercrómico por desnaturalización del DNA
efecto hipercrómico
• Propiedades físicas: - absorción luz UV - desnaturalización - reasociación - viscosidad
• Propiedades químicas: vistas en estructura• Caracterización: - efecto hipercrómico
- curvas Cot - secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo
- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)
contenido
desnaturalización y reasociación
cinética de reasociación
Curvas Cot
X = a Cot 1/2
1/2 = 1/(1 + k Cot )1/2
Cot1/2 = 1/k
X R = f NX = a Cot 1/2
1/2 = 1/(1 + k Cot )1/2
Cot1/2 puro = f Cot1/2 mezcla
genoma nuclear humano
no todo el DNA codifica proteínas
Britten y Kohne, 60’s
• Propiedades físicas: - absorción luz UV - desnaturalización - reasociación - viscosidad
• Propiedades químicas: vistas en estructura• Caracterización: - efecto hipercrómico
- curvas Cot - secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo
- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)
contenido
rotores y centrífugas
centrifugación
centrifugación diferencial
separación por tamaño
centrifugación zonalgradiente de sacarosa
centrifugación isopícnica
gradiente de CsCl
separación por densidad
0
SeparaciónDNA2c y DNAss
1. centrifugación isopícnica2. tratamiento con nucleasas específicas de DNA2c o DNAss 3. columnas de hidroxiapatito: retienen DNA2c y pasa el DNAss (el DNA2c puede ser eluido aumentando la temperatura o la concentración salina)
4: filtros de nitrocelulosa: unen DNAss y no DNA2c
electroforesis
electroforesis
• Propiedades físicas: - absorción luz UV - desnaturalización - reasociación - viscosidad
• Propiedades químicas: vistas en estructura• Caracterización: - efecto hipercrómico
- curvas Cot - secuenciación (tema 29)• Aislamiento y caracterización: - centrifugación - electroforesis• Detección: - marcaje radiactivo
- hibridación: tipos, FISH, chip, Southern - amplificación (PCR - tema 29)
contenido
marcaje radiactivo
isótopos pesados
- isótopos más usados en biología: N14 y N15; C12 y C13; H y D
- uso en centrifugación isopícnica
desnaturalización y reasociación
hibridaciónmolecular
hibridación DNA/RNA
hibridación en filtro
hibridación en colonia
FISH
telómeros
centrómeros
FISH
cariotipo espectral humano
chips de DNA
microarrays
Southern
pocillos con DNA
electroforesis
esponja
solución salina
gel filtro
gel
la solución sube a través del gelal filtro y a la pila de papeles absorbentes
DNA enel filtro
la sonda hibridacon las secuenciascomplementarias
hibridacióncon una sonda
el filtro se expone auna película o una placa sensibles
transferencia
electroforesis +transferencia +hibridación =Southern
Southern
electroforesis hibridación
Southern (DNA)
Northern (RNA)
Western (proteínas)
1 h de clase: 6-noviembre-2009
capítulo 1
2ª ed.: 14-24 (el 23 no)3ª ed.: 14-23
problemas
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/
Laboratorio virtual en http://learn.genetics.utah.edu/Aislar DNA, PCR, chip DNA y electroforesis y mas….
papelera
satéliteminisatélitemicrosatélite
SINEsLINEstransposones
genoma humano
Estudios con DNA
Análisis
Detección
Aislamiento
hipercromicidadreasociación
hibridaciónPCR
centrifugaciónelectroforesis
PCR
cebadordirecto
cebadorinverso
PCR
Southern
electroforesis +transferencia +hibridación
Southern
electroforesis +transferencia +hibridación
Southern
Northern
Western