STABILITAS KONFORMASI QUADRUPLE MUTAN p53 …... · memberikan akses bagi penulis melakukan...
Transcript of STABILITAS KONFORMASI QUADRUPLE MUTAN p53 …... · memberikan akses bagi penulis melakukan...
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
i
STABILITAS KONFORMASI QUADRUPLE MUTAN p53
M133L/V203A/N239Y/N268D DAN PENGARUH PRIMA-1
TERHADAP WILD TYPE P53
Disusun oleh :
ANITA KUSUMA DEWI
M0303018
SKRIPSI
Diajukan untuk memenuhi sebagian
persyaratan mendapatkan gelar Sarjana Sains Kimia
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
ALAM
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
Februari, 2011
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
ii
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
iii
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi saya yang berjudul ―STABILITAS
KONFORMASI QUADRUPLE MUTAN p53 M133L/V203A/N239Y/N268D
DAN PENGARUH PRIMA-1 TERHADAP WILD TYPE P53 ‖ belum pernah
diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan
sepanjang pengetahuan saya juga belum pernah ditulis atau dipublikasikan oleh
orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan
dalam daftar pustaka.
Surakarta, Februari 2011
ANITA KUSUMA DEWI
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
iv
STABILITAS KONFORMASI QUADRUPLE MUTAN p53
M133L/V203A/N239Y/N268D DAN PENGARUH PRIMA-1
TERHADAP WILD TYPE P53
ANITA KUSUMA DEWI
Jurusan Kimia. Fakultas MIPA. Universitas Sebelas Maret.
ABSTRAK
Quadruple mutan p53 M133L/V203A/N239Y/N268D mampu
meningkatkan stabilitas termodinamika ikatan residu-residu yang mengalami
mutasi [Joerger, A. C., Allen, M.D., and Fersht, A. R., 2004, J. Biochem., 279: pp.
1291-1296]. Selain itu, struktur kristalografi sinar-x quadruple mutan ini mirip
dengan struktur wild type p53 ( kode PDB : wt-p53). Kemiripan struktur ini
melandasi studi dinamika konformasinya. Studi tersebut telah dilakukan dengan
menggunakan simulasi dinamika molekuler. Dinamika konformasi quadruple
mutan (kode PDB : QMT) mengungkap adanya pergeseran struktur yang
ditunjukkan oleh perubahan nilai RMSD selama simulasi 5ns berlangsung.
Pergeseran ini terutama disebabkan oleh fluktuasi pada loop L2 dan loop S7-S8.
Fluktuasi pada loop S7-S8 lebih signifikan dibanding dengan loop L2. Selain itu,
dinamika konformasi residu-residu penting p53 untuk berikatan dengan DNA
(yaitu lysin 120 dan arginin 248) tidak dapat membedakan quadruple mutan dan
wild type p53. Simulasi dinamika molekuler ini juga dapat menunjukkan pengaruh
PRIMA-1 terhadap wild type p53. Berdasarkan hasil dockingnya, PRIMA-1 tidak
cukup spesifik berinteraksi pada wild type p53. PRIMA-1 cukup stabil menempel
pada wild type p53 di area β-sandwich. Keberadaan PRIMA-1 memberikan
dinamika konformasi yang berbeda antara wild type p53 kompleks dan
tunggalnya. Perbedaannya terletak pada residu histidin 116, glysin 245, dan
arginin 248. Menariknya lagi residu 186 yang terletak jauh dari penempelan
PRIMA-1 juga mengalami pergeseran.
Kata kunci : dinamika molekul, mutan p53 QMT, PRIMA-1.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
v
QUADRUPLE MUTAN P53 AND THE EFFECTS OF PRIMA-1
AGAINST WILD TYPE P53
ANITA KUSUMA DEWI
Department of Chemistry. Faculty of Mathematics and Natural Sciences. Sebelas
Maret University.
ABSTRACT
M133L/V203A/N239Y/N268D quadruple mutant p53 was able to
increase the thermodynamic stability of mutated residue bonds [Joerger, A. C.,
Allen, M.D., and Fersht, A. R., 2004, J. Biochem., 279: pp. 1291-1296]. In
additions, x-ray crystallography structure of quadruple mutant similar to the wild
type structure ( PDB code: wt-p53). This similarity was underlying to study its
conformational dynamics. The study was done by means molecular dynamics
simulations. Conformational dynamics of quadruple mutant (PDB code: QMT)
reveal a shifted structure which was demonstrated by RMSD value changes
during 5ns of simulation. This shift was mainly caused fluctuations in L2 loops
and S7-S8 loops. the last was showing more significant fluctuations. In additions,
conformational dynamics of p53 important residues for DNA binding (i.e lysine
120 and arginine 248) could not distinguish quadruple mutant and wild type p53.
This molecular dynamic simulation can also show effects of PRIMA-1 against
wild type p53. According to its docking results, PRIMA-1 was not specific
enough to interact in wild type p53. PRIMA-1 was quite stable against wild type
p53 in β-sandwich area. The existence of PRIMA-1 distinguished conformational
dynamics between un-complex and complex wild type p53. The discrepancy was
located at residues of histidine 116, glycine 245, and arginine 248. Interestingly,
residue of 186 which is far from PRIMA-1 binding site, was also shifted due to
the bind.
Key words : molecular dynamic, mutant p53 QMT, PRIMA-1.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
vi
MOTTO
Setiap kenikmatan akan lebih terasa manakala kita tahu bagaimana rasa pahit.
Untuk itu syukuri setiap pahit yang terasa hari ini untuk nikmat esok hari.
(Anita Kusuma Dewi)
Sebuah kegagalan bisa jadi sebuah keberhasilan menemukan hal baru asal kita
mampu melihat sisi positifnya. (Fajar R. Wibowo)
Sabar dan Syukurlah niscaya Allah akan menambah nikmatmu setiap hari
(Suami tercinta)
Kebenaran bukan untuk dipaksakan tetapi diakui keberadaannya
(Achdiat Kartamihardja)
You do not really understand something unless you can explain it to your
grandmother (Albert Einstein)
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
vii
PERSEMBAHAN
Untuk Allah Yang Maha Cerdas, Maha Bijaksana, dan Maha Segalanya
Untuk Bapak dan Ibu yan paling pengertian
Untuk adik-adikku tersayang
Untuk suami tercinta yang selalu sabar dan support
Dan untuk my baby EZA M.I. AL BARRA…
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
viii
KATA PENGANTAR
Segala puji dan segenap syukur bagi Allah SWT yang telah menunjukkan
jalan yang indah bagi penulis sehingga skripsi ini dapat penulis selesaikan dengan
baik sebagai salah satu persyaratan dalam memperoleh gelar sarjana sains Jurusan
Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas
Maret Surakarta. Atas segala karuniaNya pulalah penulis menyadari bahwa segala
sesuatu memiliki proses dan waktunya masing-masing.
Dalam menyusun skripsi ini penulis menemui berbagai hambatan dan
permasalahan yang beragam. Namun, atas bimbingan, kritikan, saran, dan
dorongan semangat yang bermanfaat dari berbagai pihak, semua hambatan dan
permasalahan tersebut dapat penulis atasi dengan baik. Oleh karena itu, penulis
ingin menyampaikan terima kasih kepada pihak-pihak yang telah membantu
penulis, yaitu sebagai berikut.
1. Prof. Drs. Sutarno, M.Sc. Ph.D. selaku dekan Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta.
2. Prof. Drs. Sentot Budi Rahardjo, Ph.D., selaku ketua Jurusan Kimia Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta.
3. Soerya Dewi Marliyana, M.Si., selaku pembimbing akademik yang dengan
sabar telah membimbing penulis dalam penyelesaian studi di Jurusan Kimia.
4. Dr. rer. nat. Fajar R. Wibowo, M.Si., selaku dosen pembimbing I, yang
dengan penuh kesabaran dan ketulusan membimbing penulis dari titik nol,
membuka mata penulis bahwa segala sesuatu itu memiliki berbagai
kemungkinan dengan alasannya masing-masing.
5. Yuniawan Hidayat, M.Si., selaku dosen pembimbing II, yang dengan
ketulusan membimbing penulis mengenai cara penulisan yang baik dan sesuai
aturan. Atas bimbingan beliau pulalah penulis mendapatkan dorongan
semangat untuk menyelesaikan skripsi ini dengan efektif.
6. I.F. Nurcahyo, M. Si. selaku ketua laboratorium Kimia Dasar yang telah
memberikan akses bagi penulis melakukan penelitian di laboratorium Kimia
Dasar bagian Komputasi Kimia.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
ix
7. Bapak Ibu dosen dan seluruh staf jurusan Kimia yang telah memberikan
fasilitas dan pelayanan yang baik bagi penulis.
8. Teman-teman Kimia berbagai generasi yang menjadi kawan di medan juang.
9. Semua pihak yang tidak dapat penulis tuliskan satu per satu yang telah
memberikan bantuannya.
Penulis menyadari bahwa penelitian dan penyusunan skripsi yang penulis
lakukan masih jauh dari sempurna sehingga membutuhkan saran dan kritik yang
membangun dari para pembaca. Namun, lepas dari semua itu, semoga para
pembaca mendapatkan manfaat setelah membaca skripsi ini.
Surakarta, Februari 2011
Penulis
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
x
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i
HALAMAN PENGESAHAN .............................................................................. ii
HALAMAN PERNYATAAN ............................................................................. iii
HALAMAN ABSTRAK ...................................................................................... iv
HALAMAN ABSTRACT ................................................................................... v
HALAMAN MOTTO ......................................................................................... vi
HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................... vii
KATA PENGANTAR ......................................................................................... viii
DAFTAR ISI ........................................................................................................ x
DAFTAR TABEL ................................................................................................ xiii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xiv
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xvii
BAB I PENDAHULUAN .................................................................................... 1
A. Latar Belakang ..................................................................................... 1
B. Perumusan Masalah ............................................................................. 2
1. Identifikasi Masalah ........................................................................ 2
2. Batasan Masalah ............................................................................ 3
3. Rumusan Masalah ........................................................................... 4
C. Tujuan Penelitian ................................................................................. 4
D. Manfaat Penelitian ............................................................................... 4
BAB II LANDASAN TEORI .............................................................................. 5
A. Tinjauan Pustaka ................................................................................. 5
1. Kanker ............................................................................................. 5
2. Gen Supressor Tumor .................................................................... 5
3. Mutasi p53 ...................................................................................... 8
4. Mutan quadruple M133L/V203A/N239Y/N268D ......................... 9
5. PRIMA-1 … .................................................................................... 10
6. Simulasi Kimia ............................................................................... 11
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xi
7. Simulasi Dinamika Molekuler (DM) .............................................. 12
8. AMBER7 (Assisted Model Building with Energy Refinement) ....... 14
a. Antechamber .............................................................................. 14
b. Parmchk. .................................................................................... 14
c. LEaP. .......................................................................................... 14
d. Sander (Simulated Annealing with NMR-derived Energy
Restraints) .................................................................................. 15
e. Ptraj dan Carnal ........................................................................ 15
9. Root Mean Square Deviation (RMSD) ........................................... 15
10. B-factor .......................................................................................... 16
11. Struktur Protein dan Sudut Dihedral Backbone Protein ................. 16
B. Kerangka Pemikiran ............................................................................ 19
C. Hipotesis .............................................................................................. 20
BAB III METODOLOGI PENELITIAN............................................................. 21
A. Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................. 21
B. Alat dan Bahan yang Dibutuhkan ........................................................ 21
1. Alat .................................................................................................. 21
2. Bahan .............................................................................................. 21
C. Prosedur Penelitian…………………………………………..……. ... 21
1. Parameterisasi PRIMA-1 ................................................................. 21
2. Penentuan Koordinat Awal Sistem ................................................. 22
3. Minimisasi Sistem ........................................................................... 22
4. Equilibrasi Sistem ........................................................................... 22
5. Simulasi Sistem ............................................................................... 23
D. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data ............................................. 23
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 24
A. Parameterisasi PRIMA-1...................................................................... 24
B. Hasil Simulasi ..................................................................................... 24
1. Perbandingan perilaku wild type p53 (wt-p53) dan quadruple
mutan M133L/V203A/N239Y/N268D .......................................... 24
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xii
a. Residu Lisin 120 dan Arginin 248 ...................................... 27
b. Residu Arginin 181, Asam Aspartat 186, dan Glysin 226 .. 30
2. Perilaku PRIMA-1 pada wild type p53 (wt-p53) ............................ 34
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................... 46
DAFTAR PUSTAKA. ......................................................................................... 47
LAMPIRAN-LAMPIRAN .................................................................................. 51
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xiii
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Ringkasan Karakteristik Pergerakan dalam Protein. ............................. 13
Tabel 2. Kode Atom, Tipe Atom, dan Muatan PRIMA-1 yang Diperoleh
dengan RESP ......................................................................................... 24
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xiv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Skema struktur p53 ........................................................................ 6
Gambar 2. Distribusi elemen dan skema ribbon struktur sekunder p53 .......... 7
Gambar 3. Siklus sel ......................................................................................... 8
Gambar 4. Superposisi bentuk stereo dari backbone wt-p53 tanpa DNA, wt-
p53 dengan DNA dan quadruple mutan p53 .................................. 9
Gambar 5. Hasil docking PRIMA-1 pada wt-p53 dan QMT ........................... 10
Gambar 6. Struktur PRIMA-1 ........................................................................... 10
Gambar 7. Struktur Umum Asam Amino ........................................................ 17
Gambar 8. 20 asam amino protein yang dikelompokkan menurut gugus
fungsinya ........................................................................................ 17
Gambar 9. Beberapa struktur protein ................................................................ 18
Gambar 10. Sudut dihedral psi dan phi pada backbone protein ........................ 19
Gambar 11. Struktur PRIMA-1 Terparameterisasi ............................................ 24
Gambar 12. Perbandingan profil RMSD (Å) terhadap waktu (ps) hasil
simulasi DM untuk quadruple mutan QMT_1 (simulasi QMT
yang pertama), QMT_2 (simulasi QMT yang kedua), dan wild
type p53 ......................................................................................... 26
Gambar 13. Perbandingan profil B-factor (Å2) terhadap nomor residu untuk
quadruple mutan QMT_1, QMT_2, rerata QMT_1 dan QMT_2
dan wild type p53 . .......................................................................... 26
Gambar 14. Grafik fluktuasi sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф) residu 118-
123 (melibatkan residu lisin 120) dan perbedaan posisi sudut
dihedral selama simulasi. ................................................................ 28
Gambar 15. Grafik fluktuasi sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф) residu 244-
248 (melibatkan residu arginin 248) dan perbedaan posisi sudut
dihedral selama simulasi ................................................................ 30
Gambar 16. Perbandingan struktur hasil kristalografi sinar-x wt-p53 dan
QMT dalam bentuk stereo dari backbone wild type-p53 tanpa
DNA, wild type p53 dengan DNA dan quadruple mutan p53 ......... 31
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xv
Gambar 17. Profil sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф) residu 179-181, residu
184-188, dan residu 225-230 ......................................................... 33
Gambar 18. Perubahan sudut dihedral selama simulasi backbone residu asam
amino 185-187 ................................................................................ 34
Gambar 19. Perbandingan profil RMSD (Å) terhadap waktu (ps) hasil
simulasi DM untuk wild type p53 wt-p53 dan kompleks p53
dengan PRIMA_1 ............................................................................ 35
Gambar 20. Perbandingan profil B-factor (Å2) terhadap nomor residu hasil
simulasi DM untuk wild type p53 wt-p53 dan kompleks wt-p53
dengan PRIMA-1 ............................................................................. 36
Gambar 21. Perbandingan posisi PRIMA-1 pada p53 selama simulasi .............. 37
Gambar 22. Posisi PRIMA-1 terhadap dua residu yang diperkirakan mampu
membentuk ikatan hidrogen antara keduanya berturut-turut .......... 38
Gambar 23. Profil sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф) residu 114-118
komplekss p53 dengan PRIMA-1 dan perbedaan posisinya
selama simulasi ............................................................................... 39
Gambar 24. Posisi PRIMA-1 terhadap wt-p53 dengan beberapa residu
terdekatnya valin 178, ileusin 157, arginin 248, dan glysin 245. ... 40
Gambar 25. Dinamika perubahan sudut torsi terhadap waktu antara
komplekss p53 dengan PRIMA-1 dengan pembanding wt-p53
sudut Ф dan ψ untuk rentang residu 242-246 yang memuat residu
245 dan rentang residu 244-248 ...................................................... 41
Gambar 26. Dinamika posisi kompleks p53 dengan PRIMA-1 dihimpitkan
dengan wt-p53 sebagai untuk residu 244-249 selama simulasi ..... 42
Gambar 27. Dinamika perubahan sudut torsi terhadap waktu antara
komplekss p53 dengan PRIMA-1 dengan pembanding wt-p53
sudut Ф dan ψ untuk rentang residu 183-187 ................................. 43
Gambar 28. Dinamika posisi komplekss p53 dengan PRIMA-1 dihimpitkan
dengan wt-p53 sebagai pembanding residu 183-187 selama
simulasi ........................................................................................... 44
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xvi
Gambar 29. Gambar keadaan sistem secara umum pada saat penentuan
koordinat awal, minimisasi, equilibrasi, dan simulasi. A, B, C,
dan D berturut-turut adalah keadaan sistem pada saat awal,
setelah disimulasi, setelah diequilibrasi, dan setelah simulasi
berjalan. Warna hitam adalah sistem yaitu protein p53 dan warna
biru adalah molekul air. .................................................................. 51
Gambar 30. Densitas, volume, energi total, dan temperatur sistem selama
proses 500 ps equilibrasi dan 7000 ps simulasi. Dari atas ke
bawah masing-masing adalah grafik densitas, volume, energi
total, dan temperatur sistem saat equilibrasi (A) dan simulasi (B).
Grafik berwarna hitam, merah, hijau, dan kuning berturut-turut
adalah wt-p53, QMT_1, QMT_2, dan wt-p53 yang berinteraksi
dengan PRIMA-1 ............................................................................. 52
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Gambaran Sistem Secara Umum pada Saat Penentuan Koordinat
Awal, Minimisasi, Equilibrasi, dan Simulasi ................................. 51
Lampiran 2. Densitas, Volume, Energi Total, dan Temperatur Sistem Selama
Proses 500 ps Equilibrasi da n 7000 ps Simulasi ............................ 52
Lampiran 3. Glosarium ........................................................................................ 53
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kanker telah lama menjadi masalah utama dalam bidang kedokteran dan
menjadi fokus penelitian untuk mencari penyebab, mekanisme, sampai cara
pengobatannya. Sofyan (2002) menyebutkan ―kebanyakan kanker bisa disebabkan
oleh salah satu atau lebih dari tiga kategori gen; onkogen, gen yang mengatur
replikasi atau perbaikan DNA , dan gen suppressor tumor. Salah satu produk gen
suppressor tumor dikenal dengan nama p53.
Protein p53 bekerja mencegah replikasi DNA yang rusak dengan
memperbaiki kerusakan yang ada. Protein ini mampu menginduksi kematian sel
terprogram (apoptosis) jika upaya perbaikan tidak dapat dilakukan (Murray et al.,
1998). Adanya mutasi p53 dapat mengakibatkan disfungsi p53. Mutasi p53
menurut Vousden dan Lu (2002) terjadi 95% pada domain inti. Sebanyak 40%
diantaranya ditemukan pada enam hotspot (Arg 175, Gly 245, Arg 248, Arg 249,
Arg 273, dan Arg 282 (Wright dan Lim, 2007).
Banyak studi struktur dasar mutasi p53 dilakukan untuk mengetahui
pengaruh mutasi terhadap stabilitas molekul secara keseluruhan dan perubahan
struktur lokal p53 berikatan dengan DNA. Kebanyakan studi ini melibatkan
quadruple mutan (QMT) p53 M133L/V203A/N239Y/N268D (Joerger et al.,
2006). Joerger dkk (2004) menyatakan quadruple mutan ini sangat stabil
(superstable mutan) pada sistem kristalnya, sedangkan kebanyakan mutasi lain
meyebabkan penurunan stabilitas termodinamika ikatan masing-masing residu
yang mengalami mutasi. Selain itu, kristalografi sinar-x menunjukkan perpaduan
QMT p53 ini hanya mengubah sedikit struktur lokalnya tanpa merubah struktur
global p53 (inti β-Sandwich dan surface ikatan dengan DNA). Melalui fakta diatas
QMT p53 ini dapat dikatakan memiliki kemiripan struktur dengan p53 normalmya
(wild type p53).
Kemiripan struktur QMT p53 dengan wild type p53 (wt-p53) sejalan
dengan studi pengembalian fungsi p53 termutasi yang dilakukan oleh Bykov dkk
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
2
(2002b). Penelitian tersebut menemukan cara pengembalian fungsi p53 termutasi
dengan mengatur konformasi mutan p53 menyerupai wild typenya. Pengaturan
konformasi p53 dilakukan dengan menempelkan molekul kecil atau peptida
pendek pada mutan p53. Peptida pendek yang digunakan adalah PRIMA-1 (p53
Reactivation and Induction Massive Apoptosis). Menindaklanjuti penelitian
Bykov dkk (2002a), Warsino (2008) melakukan docking (penempelan ligan pada
makromolekul protein) antara PRIMA-1 dengan QMT p53 dan wt-p53. Hasil
docking menunjukkan situs potensial PRIMA-1 menempel pada QMT p53 dan wt-
p53. Posisi PRIMA-1 yang paling potensial ditemukan pada area yang sama yaitu
terletak pada daerah loop. Kedua posisi tersebut menghasilkan besar energi
docking yang relatif sama. PRIMA-1 dikatakan tidak cukup spesifik berinteraksi
pada wt-p53 dan QMT p53 karena beda energi saat dilakukan docking awal dan
lanjutan kurang dari 2 kkal/mol sebagai batas residual error autodock (Morris et
al., 1998).
Kemiripan struktur QMT p53 dan wt-p53, serta ketidakspesifikan
PRIMA-1 menempel pada wt-p53 mendorong studi dinamika molekul QMT p53
dan wt-p53 serta dinamika molekul PRIMA-1 menempel pada wt-p53. Sebuah
metode yang sangat tepat untuk mengamati dinamika molekul level atomik adalah
simulasi dinamika molekuler (DM). Simulasi DM cukup baik dalam menentukan
kontribusi dominan terjadinya fluktuasi atomik suatu protein (Pikkemaat et al.,
2002). Ada beberapa karakter dinamika molekul yang dapat diamati melalui
simulasi DM diantaranya adalah; fleksibilitas docking ligan, alur difusi temporal,
konformasi sisi aktif, spesifitas ikatan, transisi allosteric, dll. Tambahan informasi
hasil simulasi DM ini diharapkan dapat menunjang studi karakteristik dinamika
molekul QMT p53 dan wt-p53.
B. Perumusan Masalah
1. Identifikasi Masalah
Sebagian besar kanker pada manusia disebabkan oleh mutasi p53
(Sofyan, 2000). Mutasi p53 95% terjadi pada domain intinya (Vousden et al.,
2002), dan 40% diantaranya ditemukan pada enam hotspot 175, 245, 248, 249,
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
3
273, dan 282 (Wright, 2007). Banyak studi tentang struktur dasar mutasi p53 yang
melibatkan quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D (Joerger et al., 2006)
karena mutan ini dikatakan sangat stabil (superstable mutan) pada kondisi kristal
(Joerger et al., 2004). Selain itu, struktur kristal QMT p53 ini memiliki kemiripan
dengan wt-p53.
Kemiripan struktur QMT dan wt-p53 sejalan dengan hasil docking
PRIMA-1 pada wt-p53 dan QMT. PRIMA-1 menempel pada posisi yang sama
dengan energi yang relatif sama. Namun pengamatan terhadap dinamika molekul
QMT p53 dan wt-p53 serta pengaruh PRIMA-1 terhadap keduanya belum
diketahui. Oleh karena itu simulasi DM dapat dilakukan untuk mengamati lebih
lanjut dinamika molekul QMT dan wt-p53 serta pengaruh PRIMA-1 terhadap
dinamika molekul keduanya.
Ada beberapa karakter dinamika molekul yang dapat dipilih. Beberapa
diantaranya adalah; fleksibilitas docking ligan, alur difusi temporal, konformasi
sisi aktif, spesifitas ikatan, transisi allosteric, dll. Selain pemilihan karakter
langkah berikutnya adalah memilih program simulasi Dinamika Molekuler (DM)
yang sesuai. Berbagai program simulasi DM yang populer seperti AMBER
(Assisted Model Building with Energy Refinement), CHARMM (Chemistry at
HARvard Macromolecular Mechanics), Tinker, GROMOS (Groningen Molecular
Simulation), dan NAMD (NAnoscale Molecular Dynamics) dapat digunakan untuk
perbaikan molekul (Esposito et al., 2006).
2. Batasan Masalah
Simulasi Dinamika Molekuler (DM) terhadap karakter dinamika
konformasi dilakukan untuk tiga sistem. Ketiga sistem tersebut antara lain; mutan
p53 yang memuat quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D, wild type
p53, serta kompleks PRIMA-1 dengan wild type p53. Pemilihan kompleks hanya
untuk PRIMA-1 dengan wild type p53 saja terutama karena kemiripan struktur
yang dimiliki oleh wt-p53 dan QMT p53, serta posisi interaksi PRIMA-1 yang
sama sebagaimana hasil penelitian Warsino (2008). Seluruh protein diambil dari
RSCB Protein Data Bank file.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
4
Simulasi Dinamika Molekuler dilakukan dengan menggunakan program
AMBER7 karena program ini cukup baik untuk simulasi biomolekul protein dan
memiliki kemampuan untuk menggabungkan lebih dari satu force field. Simulasi
dilakukan dalam eksplisit solven dengan sistem periodik jangka waktu 9ns untuk
wild type p53 serta 5ns untuk quadruple mutan p53 dan kompleks PRIMA-1
dengan wt-p53.
3. Rumusan Masalah
a. Bagaimana perbandingan dinamika konformasi wild type p53 dan quadruple
mutan M133L/V203A/N239Y/N268D tanpa ligan PRIMA-1?
b. Apakah terdapat kesamaan karakteristik umum dinamika konformasi wt-p53
dan QMT p53?
c. Bagaimana dinamika konformasi kompleks PRIMA-1 dengan wild type p53?
C. Tujuan Penelitian
1. Mengetahui perbandingan dinamika konformasi wild type p53 pada manusia
dan quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D.
2. Mengetahui apakah terdapat kesamaan umum dinamika konformasi wt-p53 dan
QMT p53.
3. Mengetahui dinamika konformasi kompleks PRIMA-1 dengan wild type p53.
D. Manfaat Penelitian
1. Memberikan informasi tentang dinamika konformasi molekul quadruple mutan
p53 M133L/V203A/N239Y/N268D dengan dinamika konformasi molekul wt-
p53 wt-p53 sebagai pembandingnya.
2. Dengan mengetahui perbandingan dinamika konformasi kompleks PRIMA-1
dengan wt-p53 dan QMT p53 akan memberikan sumbangan bagi ilmu
kesehatan dalam terapi kanker berkaitan dengan selektifitas PRIMA-1 terhadap
target mutasi diluar hotspot.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
5
BAB II
LANDASAN TEORI
A. TINJAUAN PUSTAKA
1. Kanker
Kanker merupakan penyakit yang ditandai dengan pembelahan sel yang
tidak terkendali menjadi sel-sel yang mampu menyerang jaringan biologis
lainnya, baik yang bersebelahan (invasi), atau dengan migrasi sel ke tempat yang
jauh (metastase) (Murray et al., 1998). Mengenai penyebab kanker, Sofyan (2002)
menyebutkan ―kebanyakan kanker bisa disebabkan oleh salah satu atau lebih dari
tiga kategori gen; onkogen, gen yang mengatur replikasi atau perbaikan DNA , dan
gen suppressor tumor―.
Pertumbuhan kanker diawali dengan mutasi berangkai. Mutasi tersebut
terjadi pada gen penekan tumor dilanjutkan dengan mutasi pada gen yang
berfungsi untuk memperbaiki kerusakan DNA (DNA repair gene). Mutasi pada
protoonkogen dapat mengaktifkan onkogen dan menonaktifkan gen penekan
tumor. Beberapa faktor hereditas dapat meningkatkan perubahan mutasi penyebab
kanker, mencakup aktivasi onkogen atau penghambat gen penekan tumor. Fungsi
berbagai gen penekan tumor dan onkogen dapat diganggu pada tahapan berbeda
pertumbuhan tumor (Hadi dan Nurlalila, 2008).
2. Gen Supressor Tumor - p53
Dari ribuan jumlah gen dalam tubuh manusia, secara umum dibagi
menjadi dua kelompok utama yakni onkogen dan gen penekan tumor atau gen
supressor tumor (Syaifudin, 2007). Onkogen adalah versi mutan dari gen normal,
yang memicu pertumbuhan sel. Gen pada sel normal yang dapat berubah menjadi
onkogen aktif akibat mutasi, disebut protoonkogen.
Gen supressor tumor merupakan gen penekan keganasan kanker. Gen ini
mengkode salah satu produk protein p53 yang merupakan phosphoprotein dengan
berat molekul 53kDa (Murray et al., 1998). Protein p53 terdiri dari 393 asam
amino yang terbagi dalam beberapa domain struktur dan fungsinya. Berikut
pembagian domain struktur dan fungsi p53; terminal N terdiri dari Residu 1-42
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
6
sebagai domain terminal amino yang dibutuhkan untuk aktivitas transaktivasi dan
residu 61-94 yang kaya prolin, domain inti residu 102-292 yang dibutuhkan
untuk berikatan dengan DNA, terminal C residu 301-393 terdiri dari domain
oligomerisasi (residu 342-355) dan domain regulator terminal karboksil (residu
363-393), yang disajikan dalam gambar 1 dibawah.
Gambar 1.Skema struktur p53 dengan Arg 175, Gly 245, Arg 248, Arg 249, Arg
273, dan Arg 282 dilaporkan menjadi mutasi hotspot dalam berbagai
penyakit kanker (Bai et al., 2006).
Struktur domain inti p53 terdiri dari dua anti parallel β-sheet dengan
empat dan lima rantai yang membentuk β-sandwich dan terbagi dalam dua loop
besar yaitu loop L2 dan L3 dalam satu loop besar dan daerah loop-sheet-helix
dengan distribusi berbagai residu asam amino sebagaimana tampak dalam gambar
2A dan terlihat lebih jelas dalam bentuk pitanya gambar 2B.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
7
Gambar 2.Struktur p53.A, distribusi elemen-elemen struktur sekunder wild type
p53 dan mutan quadruple M133L/V203A/N239Y/N268D yang
disimbolkan huruf-huruf yang mewakili asam amino (tabel1), empat
titik mutasi ditunjukkan dengan warna yang berbeda.B, skema ribbon
struktur protein p53 dengan β-Sandwich dan dua loop besarnya (Joerger
et al., 2004).
Protein p53 memiliki peranan penting dalam siklus sel manusia. Tahapan
siklus sel (gambar 3) manusia dijelaskan sebagai berikut; terdiri dari keadaan
istirahat (fase G0), pertumbuhan sel dan persiapan kromosom untuk replikasi
(fase G1). Siklus dilanjutkan dengan sintesis DNA (fase S) dan diikuti dengan
persiapan pemisahan sel (fase G2). Siklus disempurnakan dengan mitosis (fase M)
hingga dihasilkan sel-sel belahan yang baru (Enten et al., 2005).
Pada tahapan siklus sel tersebut protein p53 memiliki tiga fungsi utama
yaitu bekerja sebagai aktivator transkripsional dengan mengatur gen tertentu yang
terlibat dalam pembelahan sel, bekerja sebagai kontrol checkpoint G1 siklus sel
bagi kerusakan DNA. Saat terjadi kerusakan yang berlebih dapat meningkatkan
aktivitas dengan menghambat pembelahan sel dan memberikan waktu untuk
perbaikan agar tidak terjadi replikasi DNA yang rusak. Perbaikan DNA dilakukan
dengan menyisipkan mutasi permanen ke dalam genom. Fungsi yang ketiga
adalah p53 berpatisipasi dalam mengawali apoptosis (Murray et al., 1998).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
8
Apoptosis merupakan bentuk kematian sel terprogram yang diperlukan dalam
perkembangan sel, dan dikendalikan oleh berbagai gen (Kresno, 2002).
Gambar 3.Siklus Sel (Mitchison, 1997)
3. Mutasi p53
Mutasi p53 ditemukan pada kurang lebih 50% sel kanker manusia
(Bykov et al., 2002). Sebanyak 90% mutasi p53 terjadi pada domain inti dan 40%
dari seluruh mutasi yang terjadi ditemukan pada enam hotspots (175, 245, 248,
249, 273, dan 282) (Wright dan Lim, 2007), dan yang lain terjadi diluar hotspot.
Berdasarkan dampak struktur domain inti yang berikatan dengan DNA,
Hainaut et al (1997) mengelompokkan mutasi p53 dalam tiga kelas yaitu mutasi
kelas I mempengaruhi residu yang berikatan dengan DNA (Arg 248 dan Arg 273)
dengan menggangu titik kontak residu-residu tersebut untuk berikatan dengan
DNA. Mutasi kelas II domain inti mempengaruhi residu-residu yang penting untuk
orientasi permukaan ikatan DNA (Arg 175, Gly 245, Arg 249, dan Arg 282 yang
terdapat dalam area penghubung scaffold dan permukaan ikatan DNA) terhadap
fleksibilatas protein p53, sedangkan mutasi kelas III mempengaruhi struktur
tersier domain inti dan memberikan sifat fungsional protein yang berbeda.
Pengembalian fungsi p53 termutasi tidak dapat dilakukan dengan
penambahan konsentrasi p53 melainkan dengan mengatur konformasi dari p53
termutasi sehingga menyerupai wild type p53 (Protein p53 yang tidak mengalami
mutasi), melalui penempelan molekul kecil atau peptida pendek pada p53
termutasi. Molekul peptida pendek yang digunakan salah satunya adalah PRIMA-
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
9
1 (p53 Reaktivation and Induction Massive Apoptosis ) (Bykov et al., 2002a).
Studi tentang pemahaman struktur dasar mutasi domain inti p53 yang dilakukan
oleh Joerger et al (2006) selalu disertai mutan quadruple
M133L/V203A/N239Y/N268D.
4. Mutan Quadruple M133L/V203A/N239Y/N268D
Hasil kristalografi sinar-X dalam penelitian Joerger et al (2004)
menunjukkan bahwa mutan ini dikategorikan sebagai superstable mutan dengan
hanya sedikit perubahan struktur lokal tanpa merubah struktur global (inti β-
Sandwich dan permukaan yang berikatan dengan DNA) protein p53 sehingga
menyerupai bentuk wild type-nya sebagaimana ditunjukkan gambar 4. Studi ini
menunjukkan salah satu dampak struktural mutasi yaitu terbentuknya celah besar
untuk akses air atau celah internal hidrofobik tanpa perubahan struktur tapi
menyebabkan penurunan stabilitas termodinamika.
Gambar 4. Superposisi bentuk stereo dari backbone wt-p53 tanpa DNA(rantai
A,biru), wt-p53 dengan DNA(rantai B, jingga) dan quadruple mutan
p53(hitam) (Joerger et al., 2004).
Studi reaktivasi p53 dengan ligan PRIMA-1 telah dilakukan oleh
Warsino (2008) menggunakan metode Docking. Metode Docking dilakukan pada
wild type p53 (wt-p53) manusia (kode PDB:wt-p53) dan tikus, serta beberapa
mutan p53 yakni mutasi pada hotspot 245, mutasi pada 273, serta mutasi diluar
hotspot (kode PDB:QMT). Molekul QMT adalah p53 termutasi melibatkan
quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D.
Pada gambar 5 ditunjukkan situs potensial PRIMA-1 menempel pada
wt-p53 dan QMT. Kedua situs penempelan terletak pada area yang sama yaitu
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
10
pada daerah inti β-sandwich dengan energi docking yang relatif sama sebesar -
6,24 kkal/mol untuk wt-p53 dan -5,92 kkal/mol untuk QMT. PRIMA-1 dikatakan
tidak cukup spesifik berinteraksi pada wt-p53 dan QMT karena beda energi saat
dilakukan docking awal dan lanjutan kurang dari 2 kkal/mol (dibawah residual
error autodock) (Morris et al., 1998).
Gambar 5. Hasil docking PRIMA-1 pada wt-p53 (kiri) dan QMT (kanan). Situs
penempelan PRIMA-1 dengan energi terendah masing-masing
ditunjukkan dengan simbol S.R. Kedua situs potensial tersebut
terletak pada daerah yang sama.
5. PRIMA-1
PRIMA-1 (p53 Reaktivation and Induction Massive Apoptosis) atau
disebut dengan 2,2-bis(Hydroxymethyl)-1-azabicyclo[2.2.2}octane-3-one,
memiliki sebuah gugus karbonil, atom N, dan dua gugus OH. PRIMA-1
(Gambar6) memiliki sifat fisik: Kristal putih dengan m.p. 142-144°C, rumus
molekul C9H15NO, dan berat molekul 185.2 (Bykov et al., 2002b).
Gambar 6. Struktur PRIMA-1 ( Bykov et al., 2002b)
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
11
6. Simulasi Kimia
Sebelum adanya komputer, percobaan untuk melihat interaksi antar
partikel dilakukan dengan model fisika sederhana yang dilakukan oleh Bernal
pada tahun 1962 yaitu dengan mengikat beberapa bola karet menggunakan
pengikat dengan variasi panjang pengikat, kemudian mengamati interaksi yang
terjadi antar bola karet setiap 5 menit sekali. Beberapa percobaan terus
dikembangkan hingga tahun 1998, penghargaan nobel diberikan kepada Walter
Kohn dan John Pople karena mengaplikasikan mekanika kuantum dalam
memecahkan masalah struktur dan reaksi kimia dari molekul kecil (Becker et al.,
2001). Mulai dari eksperimen sederhana, studi simulasi kimia menggunakan
bantuan komputer, yang disebut dengan teknik simulasi kimia terus
dikembangkan sampai saat ini.
Metode simulasi komputer memudahkan kita untuk mempelajari
beberapa sistem dan memprediksikan sifat-sifatnya dengan penggunaan teknik
yang mempertimbangkan replikasi yang kecil dari sistem makroskopik dengan
sejumlah atom atau molekul yang dapat diatur. Simulasi menghasilkan suatu
konfigurasi yang representatif dari replikasi yang kecil ini dalam beberapa cara
yang nilai akurat dari sifat-sifat struktural dan termodinamiknya dapat diperoleh
dengan sejumlah komputasi yang mungkin mudah dikerjakan. Teknik simulasi
juga memungkinkan perilaku bergantung-waktu dari sistem atomik dan molekuler
untuk didekati, menyediakan suatu gambaran yang detail dari cara di mana sistem
berubah dari satu konformasi atau konfigurasi ke yang lain. Teknik simulasi juga
digunakan secara luas dalam beberapa prosedur eksperimental, seperti pendekatan
struktur protein dari kristalografi sinar X (Leach, 2001).
Menurut Leach (2001) ada dua jenis teknik simulasi yang umum dalam
pemodelan molekuler adalah metode Dinamika Molekuler (DM) dan Monte Carlo
(MC). Simulasi DM dan Monte Carlo berbeda dalam berbagai hal. Perbedaan
signifikan adalah dalam hal DM menyediakan informasi mengenai
ketergantungan waktu sifat-sifat sistem sedangkan konfigurasi successive Monte
Carlo dibuat seakan-akan tidak ada hubungan waktu.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
12
Dalam simulasi Monte Carlo pengeluaran dari tiap-tiap percobaan
pergerakan hanya tergantung pada immediate predecessor, sedangkan DM
memungkinkan untuk memprediksikan konfigurasi sistem di setiap waktu di
waktu yang akan datang atau waktu-waktu yang sudah terlewati.
DM memiliki kontribusi energi kinetik terhadap total energi sedangkan
dalam simulasi Monte Carlo total energi ditentukan secara langsung dari fungsi
energi potensial (Leach, 2001). Simulasi DM dari beberapa makromolekul biologi
yang menarik seperti DNA dan kompleks DNA-protein telah terbukti menjadi cara
tepat memahami lebih dalam struktur dan sifat-sifat dinamikanya (Wibowo et al.,
2005).
7. Simulasi Dinamika Molekuler (DM)
Simulasi dinamika molekuler merupakan metodologi untuk model
mikroskopis secara detil dalam skala atomic dengan mengamati proses
ketergantungan waktu sistem molekuler dan secara numeric memecahkan
persamaan gerak hukum Newton. Hasilnya adalah suatu trajektori yang
menspesifikkan bagaimana posisi dan kecepatan partikel di dalam sistem
bervariasi sesuai waktu. Trajektori dihasilkan dengan menyelesaikan persamaan
diferensial yang diwujudkan dalam Hukum Newton 2 (F = ma):
(2.7.1)
Persamaan tersebut menggambarkan pergerakan partikel yang bermassa mi
sepanjang satu koordinat (xi) dengan Fxi merupakan gaya pada partikel dalam arah
tersebut (Leach, 2001).
Terdapat empat tahap utama dalam simulasi DM. Pertama penentuan
koordinat awal berkaitan dengan penggunaan solven dan pemilihan kotak
simulasi. Penggunaan solven dalam simulasi DM dapat dilakukan dengan eksplisit
solven maupun implisit solven. Partikel eksplisit solven seperti TIP3P umum
digunakan dalam simulasi biomolekuler (Becker dan Watanabe., 2001). Setelah
menemukan konfigurasi awal sistem, fase penyeimbangan dilakukan untuk
memperoleh sistem yang stabil. Atom-atom makromolekul dan pelarut di
sekitarnya yang mengalami fase relaksasi biasanya menghabiskan 10 atau 100 ps
i
ixim
F
dt
xd
2
2
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
13
sebelum sistem mencapai keadaan stasioner.
Sifat-sifat termodinamik seperti temperatur, energi, dan densitas dipantau
sampai nilainya stabil. Segmen non-stasioner awal dari trajektori akan dibuang
dalam penghitungan sifat-sifat kesetimbangan. Sebelum melakukan simulasi DM,
sistem harus diseimbangkan dengan kontrol volume, tekanan, dan temperatur
untuk menyesuaikan misalnya densitas pelarut untuk nilai eksperimental dan
temperatur sistem untuk temperatur yang dipilih.
Setelah penyeimbangan, fase produksi dimulai, yang akan memproduksi
hasil simulasi aktual dengan simulasi DM berdurasi sekitar 1 ns. Pada dasarnya,
protokol yang sama seperti pada saat tahap akhir penyeimbangan dapat
digunakan. Simulasi DM dapat diteruskan sampai diperoleh konfigurasi
molekuler yang memuaskan. Jalannya produksi DM ditampilkan berada pada
kondisi jumlah partikel (N), volume (V), dan energi (E) konstan yang mewakili
ensembel mikrokanonikal NVE dan memungkinkan pengamatan molekul yang
berinteraksi dengan lingkungannya selama interval waktu yang telah ditentukan
sebelumnya, biasanya dalam orde nanosekon (Molinelli, 2004).
Makromolekul (protein) memiliki range karakteristik pergerakan yang
berbeda-beda.Tipe pergerakan makromolekul menggunakan metode DM menurut
Becker Watanabe (2001) dapat dilihat pada tabel dibawah ini:
Tabel 1. Ringkasan Karakteristik Pergerakan dalam Protein
No Tipe Pergerakan Contoh aplikasi Skala waktu dan
amplitudo
1.
2.
Pergerakan lokal
Fluktuasi atomik
Pergerakan side chain
Pergerakan Skala
Medium
Pergerakan loop
Pergerakan Terminal-
arm
Pergerakan bidang
Fleksibilitas
docking ligan
Alur difusi temporal
Adaptasi
konformasi sisi
aktif
Spesifitas ikatan
Femtosecond (fs) -
picosecond (ps) (10-15
-
10-12
s); kurang dari 1Ǻ.
Nanosecond(ns) -
microseconds(µs)
(10-9
-10-6
s); 1-5 Ǻ.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
14
3.
4.
rigid
Pergerakan Skala
Besar
Pergerakan domain
Pergerakan sub-unit
Pergerakan Global
Transisi Helix-coil
Asosiasi subunit
folding/unfolding
Transisi allosteric
Pergerakan Hinge-
bending
Aktivasi hormon
Fungsionalitas
protein
Microseconds (µs)-
milliseconds (ms)
(10-6
-10-3
s); 5-10 Ǻ.
Milliseconds (ms) - jam
(10-3
- 104s); lebih dari
10 Ǻ.
8. Assisted Model Building with Energy Refinement (AMBER7)
(Case et al., 2002)
DM memiliki beberapa software utama, antara lain AMBER, CHARMM,
dan GROMOS. AMBER (Assisted Model Building and Energy Refinement)
merupakan kelompok medan gaya untuk biomolekul DM. Paket program
AMBER7 terdiri dari 60 program yang beberapa di antaranya dideskripsikan
sebagai berikut:
a. Antechamber
Antechamber merupakan program yang mengotomatisasi proses
pengembangan deskriptor-deskriptor force field khususnya untuk molekul-
molekul organik. Antechamber dihidupkan dari masing-masing arsip PDB
(format PDB), arsip (‗prepin’) baru dengan format yang dapat dibaca dalam
LEaP untuk digunakan dalam pemodelan molekuler. Deskripsi force field yang
dibuat dirancang untuk sesuai dengan force field Amber yang biasa.
b. Parmchk
Parmchk dibaca dalam suatu arsip ‗ac’ atau arsip input ‗prep’
sebagaimana suatu arsip force field. Parameter menuliskan arsip ‗frcmod’
untuk parameter-parameter yang hilang.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
15
c. LEaP
Leap adalah suatu program berbasis X-windows yang disediakan untuk
pembuatan model dasar dan koordinat AMBER dan pembuatan arsip input
parameter/topologi. Program tersebut meliputi editor molekuler yang
memungkinkan pembuatan residu dan memanipulasi molekul.
d. Sander (Simulated Annealing with NMR-derived Energy Restraints)
Sander adalah program utama yang digunakan untuk simulasi DM.
Program ini merelaksasi struktur dengan memindahkan atom-atom secara
iteratif menurunkan gradien energi sampai gradien rata-rata yang cukup
diperoleh. Porsi DM membentuk konfigurasi sistem dengan menggabungkan
persamaan Newtonian tentang gerak. DM akan melakukan sampling ruang
konfigurasional yang lebih banyak daripada minimisasi dan akan
memungkinkan struktur untuk melewati halangan energi potensial yang kecil.
Konfigurasi dapat disimpan pada interval tetap selama simulasi untuk analisis
lebih lanjut, dan perhitungan energi bebas dasar menggunakan integrasi
termodinamik dapat dilaksanakan.
e. Ptraj dan Carnal
Ptraj dan Carnal merupakan program-program untuk menganalisa
trajektori-trajektori DM, menghitung (misalnya Root Mean Square deviation
dari struktur referen), analisis ikatan hidrogen, fungsi korelasi waktu, perilaku
difusional, dan sebagainya (Molinelli, 2004).
1) RMSD (Root Mean Square Deviation)
Pengukuran kesamaan diperlukan untuk perbandingan kuantitatif
suatu struktur dengan lainnya. Kesamaan struktur biasanya diukur dengan
root mean square deviation (RMSD) antara dua konformasi (Becker dan
Watanabe., 2001).
RMSD menyediakan informasi apakah konformasi telah mencapai
suatu keadaan yang stasioner. Deviasi masing-masing frame terhadap
frame pertama dalam trajektori dihitung. Harga ini sangat berguna dalam
mendekati sejauh mana struktur bergeser selama simulasi DM berjalan
(Molinelli, 2004).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
16
Jarak RMS antara konformasi i dan konformasi j dari suatu
molekul didefinisikan sebagai
𝑑𝑖𝑗 = 1
𝑁 𝐫𝑘
(𝑖)− 𝐫𝑘
(𝑗 ) 𝑁
𝑘=1 1/2
(2.8.1)
Di mana N adalah jumlah atom, k adalah indeks atom, dan r(i)k, r(ij)k adalah
koordinat Cartesian dari atom k dalam konformasi i dan j. Harga minimum
dari persamaan di atas diperoleh dengan superposisi optimal dari dua
struktur (Becker, 2001).
2) B-factor
B-factor adalah ukuran termal dari ketidaktentuan (luasan densitas
elektron) untuk struktur sebagai factor fluktuasi suatu molekul. B-factor ini
ditetapkan terhadap tiap-tiap atom dan dapat dihitung untuk tiap-tiap
residu asam amino. Pergerakan termal paling besar biasanya ditemukan
pada rantai samping dan loop (Esposito et al., 2006).
B-factor kristalografik dapat digunakan sebagai indikator mobilitas
konformasional atau fleksibilitas protein. Analisis distribusi B-factor telah
digunakan lebih awal untuk menganalisa karakteristik struktural dan
fungsional protein (Kumar et al., 2009)
Fluktuasi atomik simulasi dapat diperkirakan dengan B-factor yang
persamaannya sebagai berikut.
𝐵𝑖 = 8𝜋2
3< ∆𝑟𝑖 >2 (2.8.2)
Di mana Δri adalah akar pangkat dua fluktuasi posisional atom (Karjiban,
et al., 2009).
3) Struktur Protein dan Sudut Dihedral Backbone Protein
David (2001) dalam buku Lehninger Principles of Biochemistry
menjelaskan tentang protein. Protein adalah molekul besar yang
komplekss, yang terdapat dalam semua sel. Pada dasarnya protein disusun
oleh suatu rangkaian unit asam amino dengan struktur umum sebagai
berikut:
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
17
Gambar 7. Struktur umum Asam Amino dengan gugus R berbeda untuk
masing-masing asam amino (David et al., 2001)
Dua puluh macam asam amino telah teridentifikasi dan dikelompokkan
sesuai dengan gugus R-nya sebagaimana ditunjukkan gambar 8.
Gambar 8. 20 asam amino protein yang dikelompokkan menurut gugus
fungsinya (David et al., 2001)
Struktur protein menurut Jeremy (2007) terbagi dalam empat
kategori, yaitu: struktur primer, sekunder, tertier, dan quartener
sebagaimana ditunjukkan gambar 9.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
18
Gambar 9. Beberapa struktur protein berturut-turut dari kiri ke kanan
adalah struktur primer, sekunder, tertier, dan quartener
(Jeremy et al., 2007).
Struktur primer protein adalah beberapa asam amino yang dihubungkan
oleh ikatan peptida membentuk rantai polipepetida. Struktur sekunder
protein yaitu rantai polipeptida yang dapat membentuk lipatan beberapa
struktur regular seperti alpha helix, beta sheet, serta turn dan loop.
Struktur tertier protein sendiri umumnya protein yang larut dalam air
dan melipat dalam struktur yang padat dengan inti nonpolar. Struktur
quartener disebut juga dengan protein multisubunit.
Dalam masalah prediksi struktur sekunder protein, inputnya adalah
urutan dan outputnya adalah struktur yang diprediksikan (yang juga
disebut konformasi, yang merupakan kombinasi dari alfa heliks, beta
sheet, dan loop). Suatu protein yang khusus mengandung sekitar 32% alfa
heliks, 21% beta sheet, dan 47% loop atau struktur non regular (Branden
dan Tooze, 1991).
Gambar 10 menunjukkan suatu unit peptida. Polipeptida adalah
suatu struktur tak bercabang dari sejumlah urutan asam amino yang terikat
melalui ikatan-ikatan peptida. Satu unit asam amino dalam rantai
polipeptida disebut residu. Rantai polipeptida dimulai pada ujung amino
dan berakhir pada ujung karboksilnya (Branden dan Tooze, 1991).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
19
Gambar 10. Sudut dihedral psi (ψ) dan phi (Ф) pada backbone protein
(Arjunan et al., 2001).
Phi adalah sudut rotasi di sekitar ikatan N–C sedangkan psi
merupakan sudut rotasi di sekitar ikatan C–C. Rotasi-rotasi menentukan
masing-masing struktur protein (seperti alfa heliks, beta sheet, atau loop).
Asam-asam amino yang berada di bagian dalam molekul protein adalah
asam-asam amino golongan hidrofobik sedangkan asam-asam amino yang
bersifat polar berada di permukaan protein dan biasanya memiliki urutan
dan konformasi asam-asam amino yang sama, sehingga memiliki fungsi
dan sifat-sifat yang sama pula (Arjunan et al., 2001).
Konfigurasi backbone protein sepenuhnya ditentukan oleh
spesifikasi sudut dihedral Ф dan ψ. Korelasi sudut dihedral dalam protein
asli dan terdenaturasi sangat penting karena mengandung sumber utama
informasi dalam folding dan stabilitas protein (Keskin, 2004).
B. Kerangka Pemikiran
Studi tentang struktur dasar mutasi hotspot seringkali menyertakan
quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D. Struktur QMT p53 sering
digunakan karena dinyatakan sebagai superstable mutan dan memiliki kemiripan
dengan struktur normal p53. Berdasarkan kemiripan struktur dan stabilitas
struktur yang tinggi, kedua molekul diduga memiliki dinamika konformasi yang
sama. Hal ini berkaitan erat dengan fungsi p53 normal dalam berikatan dengan
DNA. Permasalahan yang muncul disini adalah apakah benar kedua molekul
tersebut tidak berbeda nyata satu sama lain.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
20
Studi tentang penempelan PRIMA-1 pada wt-p53 dan QMT (Docking)
telah dilakukan oleh Warsino (2008). Cara ini terbukti dapat merubah konformasi
mutan p53 menyerupai p53 normal. Namun docking yang telah dilakukan
terhadap wt-p53 dan QMT p53 dikatakan tidak spesifik. Ketidakspesifikan
penempelan PRIMA-1 ditandai dengan ditemukannya situs penempelan yang
sama antara keduanya dan menghasilkan energi docking yang hampir sama antara
keduanya sebelum dan sesudah docking lanjutan. Permasalahan yang muncul
disini adalah belum ada pengamatan dinamika konformasi penempelan PRIMA-1
pada wt-p53 dan QMT p53 untuk menunjukkan kespesifikan penempelan PRIMA-
1.
Permasalahan ada tidaknya perbedaan yang nyata antara molekul wt-p53
dan QMT p53, serta karakter kespesifikan PRIMA-1 menempel pada wt-p53 dan
QMT p53 dapat diselesaikan dengan melihat dinamika konformasi wt-p53, QMT
p53, dan kompleks PRIMA-1 dengan wt-p53 saja dengan asumsi ada kemiripan
struktur antara wt-p53 dengan QMT p53. Pengamatan dinamika konformasi
ketiga molekul tersebut dilakukan dengan simulasi dinamika molekuler (DM)
program AMBER7 kurun waktu 5-9 ns.
C. Hipotesis
1. Dinamika konformasi QMT p53 tidak berbeda nyata dengan wt-p53 dengan
asumsi adanya kemiripan struktur QMT p53 dan wt-p53.
2. Keberadaan PRIMA-1 pada wt-p53 di situs energi terendah memberikan
pengaruh terhadap stabilitas konformasinya.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
21
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Agustus 2009 sampai Desember 2009,
bertempat di Laboratorium Kimia Dasar bagian Komputasi Kimia jurusan Kimia
FMIPA UNS.
B. Alat dan Bahan yang Dibutuhkan
1. Alat
Seperangkat komputer dengan spesifikasi : CPU berprosesor AMD Athlon
(tm) 64 X2 Dual Core Processor 5200+, 2.60 GHz, RAM 4 GB, dan harddisk
2x250 GB. Perangkat lunak berupa program AMBER7 (Case, et al., 2002),
program Molden (Klinsky et al., 2002), MATLAB7 (MathWorks, 2004),
CHIMERA (Pettersen et al., 2004), dan VMD (Humphrey et al., 1996).
2. Bahan
Struktur p53 wild type pada manusia kode PDB = 1GZH (Derbyshire et al.,
2002), quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D kode PDB = 1UOL
(Joerger et al., 2004), dan PRIMA-1.
C. Prosedur Penelitian
1. Parameterisasi PRIMA-1
Parameterisasi PRIMA-1 dilakukan dengan mengambil terlebih dahulu
struktur PRIMA-1 teroptimasi dari hasil penelitian Warsino (2008). Densitas
elektron (Electrostatic Potensial/ESP) dihitung dengan GAUSSIAN98 (Frisch et
al., 1995) metode ab initio pada level teori HF dan basis set 6-31G*. Populasi
elektron dihitung dengan metode Mulliken. Arsip log yang dihasilkan kemudian
diolah dengan program Antechamber dan parmchk dalam AMBER7 di mana di
dalamnya terdapat RESP untuk metode penghitungannya. Hasilnya berupa arsip
prep dan arsip frcmod sebagai template dan parameter ligan PRIMA-1 yang akan
digunakan dalam proses selanjutnya.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
22
2. Penentuan Koordinat Awal Sistem
Simulasi dilakukan terhadap tiga sistem yaitu wt-p53, QMT, dan kompleks
PRIMA-1 dengan wt-p53. Sistem QMT dilakukan sebanyak dua kali untuk
memperoleh probabilitas kondisi yang lain. Pada semua sistem ion Cl- sebagai
counterion ditambahkan menggunakan modul XLEAP dalam AMBER7. Sistem
kemudian disolvasi dengan penambahan eksplisit solvent berupa model air TIP3P
(Jorgensen, et al., 1983) yang berupa sekumpulan molekul air yang berbentuk
kotak yang melingkupi sistem dengan jarak antara sistem dan model air sebesar
12 Ǻ. Setelah itu, sistem tersebut disimpan dalam format arsip pdb (urutan atom
dan posisinya), arsip prmtop (topologi sistem), dan arsip prmcrd (parameter
sistem) yang nantinya akan digunakan dalam proses minimisasi, penyeimbangan,
dan simulasi.
3. Minimisasi Sistem
Agar proses solvasi sempurna (yaitu jarak model air dekat dengan sistem),
maka dilakukan minimisasi. Minimisasi sistem dilakukan sebanyak 500 step di
mana tiap 100 step besarnya penahanan harmonik pada makromolekul dan
counterion diubah. Pada 100 step pertama, besarnya penahanan harmonik pada
makromolekul dan counterion adalah sama-sama sebesar 25 kcal/mol-1
A-2
. Pada
100 step 2, besarnya penahanan harmonik pada makromolekul tetap 25 kcal/mol-
1A
-2 dan pada counterion hanya sebesar 20 kcal/mol
-1A
-2. Pada 100 step ketiga,
besarnya penahanan harmonik pada makromolekul adalah 20 kcal/mol-1
A-2
dan
pada counterion hanya 15 kcal/mol-1
A-2
. Pada step keempat, besarnya penahanan
harmonik pada makromolekul adalah 15 kcal/mol-1
A-2
dan pada counterion hanya
sebesar 10 kcal/mol-1
A-2
. Pada step kelima, besarnya penahanan harmonik pada
makromolekul adalah 10 kcal/mol-1
A-2
dan pada counterion hanya sebesar 5
kcal/mol-1
A-2
. Minimisasi ini akhirnya dilakukan tanpa adanya restraints.
4. Equilibrasi Sistem
Penyeimbangan dilakukan dengan pemanasan bertahap 50-300 K (sesuai
suhu sistem yang sebenarnya) selama 200 ps di mana makromolekul dan posisi-
posisi ion dijaga konstan dengan penahanan harmonik (harmonic restraint) 25
kcal/mol-1
A-2
. Penahanan harmonik berkurang 5 kcal/mol-1
A-2
setiap 5 ps selama
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
23
25 ps berikutnya, hingga akhirnya kesetimbangan akan berlangsung tanpa adanya
penahanan. Untuk meningkatkan dan menjaga temperatur sistem pada 300 K
digunakan algoritma Berendsen (Berendsen et al., 1984).
5. Simulasi Sistem
Simulasi dijalankan pada temperatur konstan 300 K, tekanan 1 atm, 2 fs
time step, SHAKE constraints 0,00005 Ǻ (mengabaikan vibrasi yang melibatkan
atom hidrogen), nonbonded cutoff 9 Ǻ, dan 0,00001 untuk prosedur particle-mesh
Ewald (PME) (Kawata et al., 2001) yang digunakan untuk menangani interaksi
elektrostatik yang jangkauannya jauh (long-range electrostatic interactions).
Informasi struktural dikumpulkan setiap 500 step (1 ps).
D. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data
Data yang berupa trajektori hasil simulasi DM diolah dengan perangkat
analisis yang terdapat dalam program AMBER7 (ptraj) dan program MATLAB7.
Pengamatan awal dilakukan terhadap perubahan nilai RMSDnya. Faktor fluktuasi
penyebab perubahan nilai RMSD dapat dicari melalui profil B-factornya.
Program CHIMERA dan VMD digunakan untuk menampilkan data secara visual.
Khususnya dinamika konformasi yang terjadi.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
24
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Parameterisasi PRIMA-1
Fungsi parameterisasi PRIMA-1 adalah mendapatkan parameter-
parameter PRIMA-1 yang diperlukan dalam proses minimisasi, equilibrasi, dan
simulasi. Struktur PRIMA-1 diambil dari hasil penelitian Warsino (2008)
sedangkan koordinat atom wt-p53 diambil dari data pdb (kode pdb : wt-p53).
Koordinat hidrogen ditambahkan dengan program XLEAP dalam AMBER7.
Muatan digambarkan sebagai RESP (Restrained ElectroStatic Potensial) dihitung
dengan GAUSSIAN98 pada level teori HF/6-31G*. Hasil parameterisasi PRIMA-1
disajikan pada gambar 11 dan tabel 2 berikut.
Gambar 11. Struktur PRIMA-1
Terparameterisasi
Tabel 2. Kode atom, tipe atom, dan
muatan PRIMA-1 yang
diperoleh dengan RESP.
Kode atom Tipe
atom
Muatan
O1=O2 OH -0.652
H12=H15 HO 0.441
C8=C9 CT 0.096
H10=H11=H13=H14 H1 0.079
C5 CT 0.073
C1 C 0.601
O3 O -0.581
C2 CT 0.029
H5 HC 0.011
C3=C7 CT -0.115
C4=C6 CT -0.007
H1=H2=H6=H7 H1 0.094
N1 NT -0.552
H3=H4=H8=H9 HC 0.050
B. Hasil Simulasi
1. Perbandingan perilaku wild type p53 (wt-p53) dan quadruple mutan
M133L/V203A/N239Y/N268D (QMT)
Setelah minimisasi dan equilibrasi dilakukan, wt-p53 disimulasikan
selama 9 ns sedangkan QMT disimulasikan dua kali masing-masing selama 5 ns.
Hasil simulasi diolah dengan program analisis ptraj. Analisis yang pertama
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
25
dilakukan adalah pengamatan pergesaran posisi rata-rata molekul tiap waktu
terhadap posisi awalnya yang disebut dengan RMSD (Root Mean Square
Deviation).
Hasil simulasi DM berupa profil RMSD total wt-p53, QMT_1 (simulasi
QMT yang pertama), dan QMT_2 (simulasi QMT yang kedua) ditunjukkan oleh
gambar 12. Gambar tersebut menujukkan ketiga sistem sama-sama bergeser naik
dari 1Å ke kisaran 2,3Å diawal simulasi hingga 800 ps. Hal ini menunjukkan
ketiga sistem tersebut masih mengalami tahap equilibrasi artinya masih mencari
posisi stabil sebelum simulasi. Pada saat 1-2 ns perbedaan pergeseran posisi mulai
terjadi antara wt-p53 dan QMT_2 dengan QMT_1. Baik wt-p53 dan QMT_2
keduanya turun dulu baru naik, sedangkan QMT_1 naik dulu baru turun.
Gambaran ini menunjukkan posisi wt-p53 pada saat tersebut bisa dicapai oleh
QMT_2 tetapi QMT_1 tidak bisa.
Rentang waktu berikutnya antara 2-3 ns ketiga sistem bertemu pada
jarak yang sama. Setelah 3 ns QMT_1 sempat naik lagi tapi kembali turun dan
stabil pada jarak 2,5Å hampir sama dengan profil wt-p53 yang naik dulu tapi
kembali lagi dan stabil pada jarak 2,5Å.
Profil QMT_2 relatif terus naik perlahan hingga akhir simulasi namun
jika dibandingkan dengan profil wt-p53 kenaikan QMT_2 masih mendekati wt-
p53 diarea 2,5Å. Pada pertengahan hingga akhir simulasi profil RMSD ketiga
sistem stabil pada jarak yang sama, meski pada rentang waktu 1-2 ns ada
perbedaan pergeseran posisi ketiganya. Perbedaan posisi yang terjadi pada ketiga
sistem berkaitan dengan faktor fluktuasi atomik rata-rata ketiga sistem tersebut.
Oleh karena itu dilakukan analisis ptraj B-factor ketiga sistem untuk menjelaskan
lebih lanjut karakter dinamika ketiga molekul tersebut.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
26
Gambar 12.Perbandingan profil RMSD (Å) terhadap waktu (ps) hasil simulasi
DM untuk quadruple mutan QMT_1 (garis merah), QMT_2(garis
biru), dan wild type p53 wt-p53 (garis hitam).
Hasil simulasi DM yang telah dilakukan untuk QMT dan wt-p53
menunjukkan profil B-factor yang relatif sama meski masih ada fluktuasi yang
lebih tingi untuk QMT. Jika dibandingkan dengan wt-p53 fluktuasi QMT lebih
tinggi pada beberapa residu yang memang lebih fluktuatif dibanding yang lain.
Pada gambar 13 dibawah nilai B-factor QMT hasil simulasi DM menunjukkan
nilai yang lebih tinggi pada daerah tertentu (residu 120, 181, 186, 226, dan 248).
Gambar 13.Perbandingan profil B-factor (Å2) terhadap nomor residu untuk
quadruple mutan QMT_1 (garis merah), QMT_2 (garis biru), rerata
QMT_1 dan QMT_2 (orange) dan wild type p53 wt-p53 (garis hitam).
Perulangan simulasi DM untuk QMT dilakukan untuk memastikan
fluktuasi QMT. Hasil simulasi ternyata menunjukkan profil B-factor yang berbeda
120
181
186
248
226
RMSD
(Å)
Waktu (ps)
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
27
meski dilakukan pada rentang waktu yang sama yaitu 5ns. B-factor QMT_2 yang
ditunjukkan gambar 13 secara keseluruhan tampak lebih mendekati wt-p53 dari
pada B-factor QMT_1 meskipun masih ada beberapa residu yang lebih fluktuatif
(120, 186, dan 248).
Perbedaan profil fluktuasi QMT ini hanya menunjukkan probabilitas
dinamika molekulnya dimana suatu keadaan bisa dicapai seperti QMT_1
sedangkan keadaan yang lain bisa saja dicapai seperti QMT_2. Bahkan hasil rata-
rata B-factor keduanya tidak jauh berbeda dan sangat mendekati wt-p53
sebagaimana ditunjukkan oleh garis orange pada gambar 13. Oleh karena itu
untuk mengamati lebih dalam perbedaan profil B-factor yang ada berbeda nyata
atau tidak dilakukan analisis sudut dihedral Ф (phi) dan ψ (psi) backbone residu
yang penting untuk berikatan dengan DNA dan residu lain yang berbeda cukup
signifikan.
a. Residu Lisin 120 dan Arginin 248
Baik QMT_1 maupun QMT_2 keduanya menunjukkan fluktuasi pada
residu 120 dan 248 yang penting untuk berikatan dengan DNA. Residu 120
adalah asam amino lisin yang merupakan bagian dari loop L1 (Wong et al., 1999)
dan berikatan hidrogen dengan O6 dan N7 dari basa Gua 8 dalam major groove
(lekukan besar) DNA, sedangkan arginin 248 berikatan dengan minor groove DNA
(Wright, 2007).
Pada residu lisin 120 profil B-factor QMT tampak sedikit lebih fluktuatif
dari wt-p53. Faktor fluktuasi berasal dari kontribusi fluktuatif sudut torsi phi (Ф4)
yaitu backbone C120:N121:CA121:C121 dari residu lisin 120 dan serin 121 baik
untuk QMT_1 maupun QMT_2. Ada fluktuasi sudut sebesar 50° pada kisaran
1,5ns hingga akhir simulasi namun masih dominan pada sudut -50° yaitu posisi
yang sama dengan wt-p53. Selain itu ada juga perubahan sudut torsi ψ5 backbone
N121:CA121:C121:N122 dari residu serin 121 dan valin 122 sebagaimana
ditunjukkan pada gambar 14A. Perubahan sudut dihedral Ф4 dan ψ5 ini
menyebabkan fluktuasi rantai samping lisin 120 selama simulasi sebagaimana
tampak pada hasil snapshot gambar 14B. Meski tampak fluktuatif namun posisi
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
28
rantai samping wt-p53 masih dominan dapat dicapai oleh QMT_1 atau QMT_2.
Posisi yang sama kita lihat dapat terjadi saat 1,5 ns; 2,5 ns; dan 4 ns.
A
B
Gambar 14. Profil perbandingan fluktuasi sudut dihedral Psi (ψ) pada baris bawah
dan Phi (Ф) pada baris atas residu 118-123 (melibatkan residu lisin
120) antara wt-p53, QMT_1, dan QMT_2 berturut-turut ditunjukkan
dengan warna hitam, merah, dan biru, A. Grafik fluktuasi sudut
dihedral terhadap waktu yang fluktuatif pada Ф4 memuat residu 120
dan 121 dan ψ5 yang memuat residu 121 dan 122. B. Posisi sudut
dihedral selama simulasi dengan backbone residu lisin 120 dan serin
121 digambarkan sebagai stik dan bola sedangkan rantai samping lisin
120 digambarkan sebagai stik.
Lain halnya dengan residu 248, baik wt-p53 dan QMT keduanya
memiliki tingkat fluktuasi yang hampir sama berdasarkan profil B-factornya
namun terdapat perbedaan yang signifikan pada profil sudut torsinya.Perbedaan
terjadi pada sudut dihedral Ф3 yaitu backbone C246:N247:CA247:C247 dari
residu 246 (metionin) dan 247 (asparagin) serta ψ4 backbone
N247:CA247:C247:N248 yang memuat residu 247 (asparagin) dan 248 (arginin)
masing-masing sebesar 100°. Meski berbeda tapi menunjukkan garis yang stabil
dari awal hingga akhir simulasi. Perbedaan ini menjelaskan satu kondisi yang
0 ns 1,5ns 2,5ns
4 ns 5 ns
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
29
berbeda dapat dicapai wt-p53 dan QMT stabil dari awal hingga akhir simulasi 5
ns sehingga dapat dikatakan stabil secara termodinamika sebagaimana
ditunjukkan gambar 15A.
Pada gambar 15B kita melihat adanya perubahan cukup signifikan saat 1
dan 2 ns. Backbone wt-p53 residu 244-246 berubah dari loop menjadi sheet
sedangkan QMT tetap pada struktur loop. Saat 3 ns sheet wt-p53 244-245 berubah
menjadi loop kembali tak lama kemudian berubah kembali saat 4 ns. Gambar 14B
memang menunjukkan fluktuasi konformasi backbone 244-245 tetapi profil grafik
torsi Ф1, Ф2, ψ1, dan ψ2 tampak stabil. Hal ini menunjukkan konformasi sheet
protein sama dengan konformasi loopnya.
Pada backbone residu 246-248 gambar 15A tampak adanya perubahan
sudut permanen sebesar 100°. Perubahan ini nampak pada gambar 15B dimana
kedua molekul QMT menekuk dengan besar sudut yang tetap selama simulasi dan
wt-p53pun menekuk dengan besar sudut yang berbeda dari QMT konstan selama
simulasi. Pergeseran rantai samping arginin 248 terjadi sejak 1 ns tapi hanya
berfluktuasi lalu kembali lagi berhimpit diakhir simulasi.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
30
A
B
Gambar 15. Profil perbandingan fluktuasi sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф)
residu 244-248 (melibatkan residu arginin 248) antara wt-p53, QMT_1,
dan QMT_2 berturut-turut ditunjukkan dengan warna hitam, merah, dan
biru, A. Grafik fluktuasi sudut dihedral terhadap waktu yang fluktuatif
pada Ф3 memuat residu 246 dan 247 serta ψ4 yang memuat residu 247
dan 248. B. Perubahan sudut dihedral selama simulasi dengan backbone
residu 244-249 digambarkan sebagai ribbon sedangkan rantai samping
arginin 248 digambarkan sebagai stik.
Berdasarkan hasil simulasi kedua residu tersebut dapat disimpulkan
quadruple mutan ini tidak berpengaruh signifikan terhadap residu lisin 120 dan
arginin 248. Quadruple mutan ini bisa membuat residu lisin 120 lebih fluktuatif
namun masih dominan pada posisi yang sama dengan wt-p53. Pada residu 248
quadruple mutan ini memang memberikan perubahan signifikan untuk rantai
utamanya namun tidak signifikan karena masih pada posisi yang berdekatan
dengan wt-p53.
b. Residu Arginin 181, Asam Aspartat 186, dan Glysin 226
Pengamatan berikutnya dilakukan pada residu-residu yang lebih
fluktuatif ditandai dengan nilai puncak B-factor yang lebih tinggi dibanding yang
0 ns 1 ns 2 ns 3 ns 4 ns 5 ns
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
31
lain, yaitu daerah residu 181,186, dan 226. Pada dasarnya daerah yang sangat
fluktuatif dari hasil simulasi DM sama dengan hasil kristalografi sinar-x nya yaitu
adanya perbedaan struktur pada daerah loop L1, loop L2, loop L3, dan paling
signifikan terjadi pada loop putaran strand S7 dan S8 (gambar 16); dimana,
residu 181 dan 186 pada loop L2, serta residu 226 terdapat pada loop putaran
S7-S8.
Gambar 16.Perbandingan struktur hasil kristalografi sinar-x wt-p53 dan QMT
dalam bentuk stereo dari backbone wild type-p53 tanpa DNA (rantai
A,biru), wild type p53 dengan DNA(rantai B, jingga) dan quadruple
mutan p53(hitam) setelah dihimpitkan (Joerger,et al, 2004).
Sudut dihedral psi(ψ) dan phi (Ф) untuk backbone residu-residu
fluktuatif pada gambar 17 menunjukkan adanya banyak kontribusi perubahan
sudut dihedral terhadap nilai B-factor residu-residu tersebut. Pada gambar 17A
kita melihat perbedaan profil Ф1 backbone C179:N180:CA180:C180 untuk
QMT_1 dan QMT_2 dibandingkan dengan wt-p53. Meskipun torsi Ф1 dari
QMT_1 dan QMT_2 saling berbeda satu sama lain namun masing-masing kondisi
masih dapat dicapai oleh wt-p53 pada satu waktu tertentu. Sehingga perbedaan
yang ditunjukkan pada dasarnya tidak cukup nyata antara wt-p53 dan QMT.
Lain halnya dengan rentang residu 184-188 pada gambar 17B. Profil torsi
QMT_1 dan QMT_2 untuk Ф2 backbone C184:N185:CA185:C185 dan ψ3
backbone N185:CA185:C185:N186 nampak berbeda dibandingkan dengan wt-
p53. Profil torsi Ф2 untuk QMT_2 saat kisaran 4 ns masih bisa dicapai oleh wt-
p53 akan tetapi kondisi QMT_1 tidak bisa. Kondisi QMT_1 baru bisa dicapai wt-
p53 saat mendekati 5 ns.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
32
Perubahan yang cukup signifikan terjadi pada ψ3 residu serin 185 dan
asam aspartat 186. Backbone kedua residu tersebut mengalami perubahan sudut
hampir 200○ sejak 500 ps hingga 4500 ps. Backbone tersebut sempat kembali
pada kondisi wt-p53 sejenak lalu berubah lagi hingga akhir simulasi. Perubahan
sudut backbone tampak jelas pada gambar 18. Gambar 18 menunjukkan ada
tekukan besar residu serin 185 dan asam aspartat 186 untuk QMT_2 berangsur-
angsur selama simulasi. Sedangkan untuk QMT_1 sendiri sempat ada perubahan
mendekati arah perubahan QMT_2 namun masih dominan pada kondisi wt-p53
yaitu pada sudut 100○.
Residu 226 adalah residu yang sangat fluktuatif ditandai dengan nilai B-
factor paling tinggi dibanding yang lain. Residu ini terletak pada loop putaran S7
dan S8 yang sangat fleksibel. Perbedaan yang nyata antara wt-p53 dan QMT juga
terlihat dari hasil kristalografi sinar-x (gambar 16). Berdasarkan hasil simualsi
DM (gambar 17C) fluktuasi pada residu 226 terjadi karena kontribusi perubahan
torsi residu 225-230 itu sendiri. Meski demikian perubahan tersebut masih
dikategorikan stabil secara kinetika dimana satu kondisi tidak dapat dicapai oleh
mutan namun pada saat tertentu bisa kembali lagi dicapai oleh mutan mengikuti
kondisi wild type nya.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
33
A
Ф1
Ф2
Ф3
Ф4
Ψ1
Ψ2
Ψ3
Ψ4
B
Ф1
Ф2
Ф3
Ф4
Ψ1
Ψ2
Ψ3
Ψ4
C
Ф1
Ф2
Ф3
Ф4
Ф5
Ψ1
Ψ2
Ψ3
Ψ4
Ψ5
Gambar17. Profil sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф), A. Residu 179-181, B.
Residu 184-188, C. Residu 225-230
Hasil pengamatan dinamika molekul wt-p53, QMT_1, dan QMT_2
menunjukkan bahwa ketiga residu fluktuatifnya memiliki karakter fluktuasi yang
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
34
sama secara umum artinya kondisi wt-p53 sebagai pembanding masih dapat
dicapai oleh quadruple mutan meski ada perbedaan namun secara umum dominan
sama dengan wt-p53.
0ns
1ns
2ns
3ns
4ns
5ns
Gambar18. Perubahan sudut dihedral selama simulasi 0-5ns dengan backbone
residu asam amino 185-187 berturut-turut dari atas ke bawah
digambarkan sebagai ribbon sedangkan rantai sampingnya
digambarkan sebagai stik.
Dengan asumsi quadruple mutan tidak berpengaruh cukup signifikan
terhadap residu penting p53 berikatan DNA (lisin 120, glysin 245, arginin 248,
dan arginin 273) dan adanya kesamaan ketiga karakter dinamika konformasi
molekul residu fluktuatif, maka dapat dikatakan quadruple mutan
M133L/V203A/N239Y/N268D QMT tidak berbeda nyata dengan wild type p53
wt-p53. Akan tetapi perlu adanya studi lebih lanjut mengenai interaksi quadruple
mutan M133L/V203A/N239Y/N268D dengan DNA khususnya pada residu 120,
245 dan 248.
2. Perilaku PRIMA-1 pada wild type p53 (wt-p53)
Dengan asumsi bahwa wt-p53 dan QMT tidak berbeda nyata maka
pengamatan dinamika interaksi PRIMA-1 hanya dilakukan pada wt-p53 saja.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
35
Setelah parameterisasi selesai diperoleh, dilakukan penempelan PRIMA-1 pada
wt-p53 dengan XLEAP AMBER7 kemudian minimisasi, equilibrasi dan
selanjutnya simulasi selama 5ns sebagaimana molekul wt-p53 dan QMT tanpa
PRIMA-1 sebelumnya.
Hasil simulasi kemudian diolah dengan analisis ptraj. Analisis yang
pertama dilakukan adalah pengamatan perubahan posisi RMSD wt-p53 dengan
kompleks. Penambahan PRIMA-1 pada wt-p53 memberikan efek perubahan
posisi RMSD jika dibandingkan dengan wt-p53 tunggal. Hal ini terjadi karena ada
penambahan berat molekul PRIMA-1. Meski demikian jika diamati lebih lanjut
dapat dilihat bahwa karakter perubahan posisi yang terjadi antara wt-p53 tunggal
dan kompleks relatif sama sebagaimana ditunjukkan gambar 19 dibawah. Jika
RMSD wt-p53 mulai stabil pada 2.5Å setelah 3 ns, pada interaksinya dengan
PRIMA-1 profil RMSD juga mulai stabil pada posisi 2.5Å setelah 4500ps. Untuk
itu perlu adanya simulasi lanjutan untuk kedua molekul tersebut diatas 5 ns guna
mengamati lebih lanjut perubahan posisi kedua molekul tersebut hingga mencapai
posisi stabilnya.
Gambar 19.Perbandingan profil RMSD (Å) terhadap waktu (ps) hasil simulasi
DM untuk wild type p53 wt-p53 (garis hitam) dan kompleks p53
dengan PRIMA-1.
Pengamatan terhadap salah satu karakter dinamika molekul yaitu
fluktuasi molekul dapat dilihat dari profil B-factor nya sebagaimana ditunjukkan
gambar 20 dibawah. Adanya PRIMA-1 tampak meningkatkan nilai B-factor
beberapa residu asam amino wt-p53 menjadi lebih fluktuatif sedangkan pada
RMSD
(Å)
Waktu (ps)
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
36
residu asam amino yang tingkat fluktuasinya relatif tinggi saat tanpa PRIMA-1
dengan adanya PRIMA-1 justru tidak terpengaruh. Dari grafik dibawah tampak
bahwa nilai B-factor menjadi lebih tinggi pada residu 116, 186, 245, dan 248
setelah ada penempelan PRIMA-1. Fluktuasi yang terjadi pada residu 116 yang
terletak di daerah loop L1 tidak mempengaruhi residu penting p53 untuk berikatan
dengan DNA pada residu 120 terbukti dengan tidak adanya perbedaan profil B-
factor pada residu tersebut. Residu asam aspartat 186 yang terletak di loop L2
tampak mengalami perubahan sangat signifikan kurang lebih sebesar 300 Å2
bahkan lebih tinggi dari QMT. Selain itu dua residu penting p53 berikatan dengan
DNA yang juga mengalami perubahan nilai B-factor adalah residu 245 dan 248.
Melalui pengamatan terhadap torsi residu fluktuatif dapat diketahui karakter
dinamika komplekss p53 dengan PRIMA_1 lebih lanjut.
Gambar 20.Perbandingan profil B-factor (Å2) terhadap nomor residu hasil
simulasi DM untuk wild type p53 wt-p53 (garis hitam) dan komplekss
wt-p53 dengan PRIMA-1.
Berdasarkan hasil docking yang dilakukan Warsino (2008) penempelan
PRIMA-1 pada situs dengan energi docking terendah, yaitu pada daerah inti β-
sandwich dikatakan tidak spesifik berinteraksi dengan DNA artinya bahwa
PRIMA-1 tidak cukup berpengaruh terhadap wt-p53 karena perubahan energi
docking awal dan lanjutannya tidak lebih dari 2 kkal/mol. Melalui hasil simulasi
DM PRIMA-1 tampak cukup stabil menempel pada situs tersebut sebagaimana
ditunjukkan pada gambar 21A dibawah. Dari awal hingga akhir simulasi 5 ns
116
186
248
245
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
37
PRIMA-1 stabil berikatan dengan p53 pada area β-sandwich yaitu daerah inti p53
antara residu leusin 111, arsinin 268, dan phenylalanine 270 yang ditunjukkan
gambar 21B.
A
0ns 1ns 2ns
3ns 4ns 5ns
B
Gambar 21. Perbandingan posisi PRIMA-1 pada p53 selama simulasi. A.PRIMA-
1 (digambarkan sebagai spherical magenta) yang berinteraksi
dengan p53 (digambarkan sebagai pita hijau) di situs energy
terendah hasil docking Warsino (2008) selama simulasi 0-5ns, B.
PRIMA-1 (digambarkan sebagai stik magenta) yang menempel pada
p53 (digambarkan sebagai pita abu gelap) di area β-sandwich antara
leusin 111 (hijau gelap), asparagine 268 (hijau muda), dan
phenylalanine 270 (ungu).
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
38
Dengan mengukur jarak antar atom tertentu yang diperkirakan akan
membentuk ikatan hydrogen antara PRIMA_1 dengan residu 111 dan 268
sebagaimana ditunjukkan pada gambar 22, tampak bahwa kemungkinan
terbentuknya ikatan hidrogen lebih besar terjadi antara PRIMA-1 dengan leusin
111 dengan asumsi bahwa jarak ikatan atom H residu 111 dengan O3 PRIMA-1
relatif stabil pada 2Å meski kadang kala terjadi fluktuasi pada waktu tertentu
namun akan kembali lagi pada posisi 2Å. Sedangkan untuk residu arsinin 268
dengan PRIMA-1 kemungkinan terbentuknya ikatan hydrogen lebih kecil karena
jarak atom H1D2 residu 268 dengan O3 PRIMA-1 dominan pada 4Å (melewati
jarak maksimal ikatan hydrogen 2-2,5Å) namun pada satu waktu tertentu kisaran
1-2 ns dan 3-4 ns ikatan hydrogen kemungkinan bisa saja terbentuk.
A B
C
Gambar 22. Posisi PRIMA-1 terhadap dua residu yang diperkirakan mampu
membentuk ikatan hydrogen antara keduanya berturut-turut A dan B
adalah leusin 111 dan asparagine 268. C.menunjukkan jarak atom
yang terlibat dalam bentuk grafik jarak ikatan (Å) terhadap waktu
(ps) dimana jarak atom H residu 111 dengan O3 PRIMA-1
ditunjukkan oleh garis merah muda dan jarak atom H1D2 residu 268
dengan O3 PRIMA-1 ditunjukkan oleh garis coklat.
H1D2
O3
H
O3
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
39
Penempelan PRIMA-1 antara residu leusin 111 dan arsinin 268
memberikan pengaruh terhadap perubahan torsi rentang residu 114-118
sebagaimana ditunjukkan grafik gambar 23A. PRIMA-1 yang diperkirakan
mampu berikatan hydrogen dengan leusin 111 menggeser rantai utama
disebelahnya yaitu residu 114-118 (phenilalanine-leusin-histidin-serin-glysin)
sehingga menjadi lebih fluktuatif dibanding wt-p53 saat tanpa PRIMA-1. Pada 1-2
ns PRIMA-1 menarik residu-residu tersebut sedangkan pada 3-5 ns mulai
mendorong residu tersebut menjauhi PRIMA-1 sebagaimana tampak pada gambar
23B dibawah.
A
Ф1
Ф2
Ф3
Ф4
Ψ1
Ψ2
Ψ3
Ψ4
B
Gambar 23. A.Profil sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф) residu 114-118 dimana
kompleks p53 dengan PRIMA-1 ditunjukkan sebagai garis hijau dan
wt-p53 ditunjukkan sebagai garis hitam, dan B.Posisi kompleks p53
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
40
dengan PRIMA-1 yang ditunjukkan sebagai pita hijau terhadap wt-p53
sebagai pita hitam berturut-turut dari kiri ke kanan diambil saat
1,2,3,4,dan 5 ns.
Selain residu 114-118 keberadaan PRIMA-1 juga mempengaruhi residu
glysin 245 dan arginin 248 yang penting berikatan DNA dengan adanya
pergeseran rantai utama residu isoleusin 251 yang cukup besar. Pergeseran ini
kemungkinan terjadi karena pengaruh pergeseran rantai utama valin 272 dengan
asumsi jarak rantai samping valin 272 dan isoleusin 251 yang berdekatan ikut
terpengaruh manakala ada pergeseran rantai utama valin 272. Pergeseran rantai
utama valin 251 itu sendiri bisa jadi dipengaruhi oleh adanya PRIMA-1.
Visualisasinya dapat dilihat dari hasil snapshot gambar 24 dibawah.
Gambar 24. Posisi PRIMA-1 yang ditunjukkan sebagai spherical merah terhadap
wt-p53 yang ditunjukkan sebagai pita merah muda dan kompleks p53
yang ditunjukkan sebagai pita hijau dengan beberapa residu
terdekatnya nomor 1, 2, 3, dan 4 berturut-turut adalah valin 272,
isoleusin 251, arginin 248, dan glysin 245 yang ditunjukkan sebagai
stik.
Oleh karena itu adanya PRIMA-1 dikatakan dapat mempengaruhi residu
glysin 245 dan arginin 248 dengan merubah sudut torsi sekitarnya. Hal ini nampak
pada gambar 25A untuk residu glysin 245 dengan adanya perubahan sudut torsi
Ф4 residu 245-246 sebesar 50○
pada kisaran 1,5ns sampai dengan 3,5 ns
kemudian kembali lagi dan bertahan selama 1 ns lalu berfluktuasi kembali.
Begitupula dengan residu arginin 248 pada gambar 25B dibawah nampak adanya
1
2 3
4
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
41
perubahan sudut torsi Ф2 untuk residu 245-246 sebesar 50○ dan Ф3 untuk residu
246-247 sebesar 100○ pada 2,5 ns dan bertahan sampai akhir simulasi, serta
sempat terjadi sedikit perubahan torsi ψ3 residu 246-247 sebesar 50○
namun
kembali perlahan ke arah wt-p53. Perubahan ψ4 cukup signifikan terjadi sebesar
100○ mulai 2,5 ns sampai akhir simulasi.
A
B
Gambar 25. Dinamika perubahan sudut torsi terhadap waktu antara kompleks p53
dengan PRIMA-1 yang ditunjukkan oleh garis hijau dengan
pembanding wt-p53 yang ditunjukkan sebagai garis hitam untuk baris
atas merupakan sudut Ф berturut-turut dari kiri ke kanan Ф1, Ф2, Ф3,
dan Ф4 sedangkan baris bawah adalah sudut ψ berturut-turut dari kiri
ke kanan ψ1, ψ2 , ψ3, dan ψ4 untuk A. Rentang residu 242-246 yang
memuat residu 245, dan B. Rentang residu 244-248.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
42
Dari hasil snapshot residu 244-249 gambar 26 dapat dilihat pada 1ns mulai ada
pergeseran glysin 245 kompleks p53 dengan wt-p53 dan perubahan konformasi
glysin 245 wt-p53 dari loop ke sheet yang bertahan hingga 2ns kembali lagi pada
3ns ke konformasi loopnya dan muncul lagi pada 4 ns namun kembali lagi pada
konformasi loopnya di akhir simulasi. Dengan membandingkan konformasi glysin
245 untuk kompleks maupun tunggalnya, p53 tunggal lebih fluktuatif mengalami
perubahan konformasi dibandingkan kompleksnya yang terus dalam bentuk
loopnya dari awal hingga akhir simulasinya. Perubahan yag cukup signifikan
terjadi pada 3ns karena perubahan sudut torsi residu 246-248 sebagaimana
dijelaskan pada gambar 25B diatas hingga akhir simulasi 5ns.
Gambar 26. Dinamika posisi kompleks p53 dengan PRIMA-1 yang ditunjukkan
oleh pita hijau yang dihimpitkan dengan wt-p53 sebagai pembanding
ditunjukkan sebagai pita merah muda residu 244-249 selama 5 ns.
Atom masing-masing residu ditunjukkan sebagai wire dan atom residu
248 sendiri ditunjukkan sebagai stik sedangkan residu 245
ditunjukkan sebagai pita orange.
PRIMA-1 juga mempengaruhi asam aspartat 186 yang terletak di loop L2
menjadi lebih fluktuatif dilihat dari profil b-factor gambar 20 diatas. Faktor
fluktuasi yang mempengaruhi adalah perubahan sudut torsi pada rentang residu
0ns 1ns 2ns 3ns
4ns 5ns
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
43
serin 183, as.aspartat 184, serin 185, as.aspartat 186, dan glysin 187 sebagaimana
ditunjukkan gambar 27 dibawah. Ditemukan perubahan Ф2 residu 184-185
sebesar 100○
saat 2ns berangsur berkurang 50○ hingga akhir simulasi. Akan tetapi
kondisi inipun masih bisa dicapai oleh wt-p53 sebagaimana tampak dalam gambar
pada saat 4-4,5ns. Perubahan Ф3 residu 185-186 terjadi sebesar 100○ saat 2-2,5ns
kemudian kembali lagi hingga akhir simulasi. Lain halnya dengan perubahan ψ3
residu 185-186 sebesar 150○ saat 2,5ns hingga akhir simulasi yang tidak dapat
dicapai oleh wt-p53.
Gambar 27. Dinamika perubahan sudut torsi terhadap waktu antara kompleks p53
dengan PRIMA-1 yang ditunjukkan oleh garis hijau dengan
pembanding wt-p53 yang ditunjukkan sebagai garis hitam untuk baris
atas merupakan sudut Ф berturut-turut dari kiri ke kanan Ф1, Ф2, Ф3,
dan Ф4 sedangkan baris bawah adalah sudut ψ berturut-turut dari kiri
ke kanan ψ1, ψ2 , ψ3, dan ψ4 untuk rentang residu 183-187.
Visualisasi perubahan sudut torsinya dapat dilihat pada gambar 28
dibawah. Mulai 2ns sudah ada perputaran rantai utama 185 sebagaimana telah
dijelaskan diatas karena perubahan sudut Ф2 residu 184-185. Perputaran ini
nampak bertahan hingga akhir simulasi menyebabkan perbedaan posisi rantai
utama yang cukup signifikan terjadi bahkan mulai 4ns hingga akhir simulasi juga
terdapat perubahan konformasi dari loop menjadi sheet residu 183-184. Meskipun
letak PRIMA-1 yang berikatan dengan p53 pada area β-sandwich cukup jauh dari
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
44
residu 186 berbeda dengan residu lain 116, 245, dan 248 yang relatif lebih dekat,
PRIMA-1 memberikan pengaruh terhadap perubahan signifikan residu asam
aspartat 186 yang terletak di area loop L2 p53. Namun belum diketahui pengaruh
perubahan signifikan residu ini terhadap fungsi p53 dalam berikatan dengan DNA
atau terhadap monomer p53 yang lain dalam bentuk tetramer p53 untuk berikatan
dengan DNA.
Gambar28. Dinamika posisi kompleks p53 dengan PRIMA-1 yang ditunjukkan
oleh pita hijau yang dihimpitkan dengan wt-p53 sebagai
pembanding ditunjukkan sebagai pita merah muda residu 183-187
selama 5 ns. Atom residu selain 186 ditunjukkan sebagai wire
sedangkan atom residu 186 ditunjukkan sebagai stik.
Secara keseluruhan PRIMA-1 cukup stabil menempel pada p53 di area β-
sandwich dan spesifik berinteraksi p53 dengan asumsi adanya perubahan yang
cukup permanen yang terjadi pada residu sekitar penempelan (116, 245, dan 248)
dan residu yang jauh dari situs penempelan PRIMA-1. Untuk itu perlu adanya
studi lebih lanjut mengenai interaksi PRIMA-1 dengan p53 pada situs yang sama
terlebih dalam kaitanya dengan interaksi DNA.
0ns 1ns 2ns
3ns 4ns 5ns
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
45
Studi terhadap struktur protein paling mudah dilakukan dengan cara
mengkristalkannya. Begitu pula studi mutan p53 penyebab kanker. Kristalisasi
terhadap mutan p53 sulit dilakukan karena mutan p53 sangat tidak stabil. QMT
yang menyertai mutan p53 mampu menstabilkan struktur mutan p53 sehingga
dapat dikristalkan.
Simulasi DM terhadap dinamika konformasi quadruple mutan p53
menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata dengan karakter dinamika
konformasi wild typenya. Selain itu, dinamika konformasinya juga tidak
menunjukkan perubahan signifikan pada residu lisin 120 dan arginin 248 yang
penting berikatan dengan DNA. Oleh karena itu penggunaan quadruple mutan p53
dalam berbagai studi kanker yang melibatkan quadruple mutan ini bisa
digunakan. Sedangkan untuk penempelan ligan PRIMA-1 yang umum digunakan
sebagai salah satu cara reaktivasi mutan p53 dalam studi terapi kanker
memerlukan kajian ulang, karena berdasarkan hasil pengamatan dinamika
konformasinya pada wild type p53 menunjukkan adanya perubahan konformasi
yang cukup signifikan pada residu yang penting untuk berikatan dengan DNA
yaitu glysin 245 dan arginin 248.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
46
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Quadruple mutan QMT tidak berpengaruh signifikan terhadap residu penting
p53 berinteraksi dengan DNA khususnya lisin 120 dan arginin 248. Adanya
quadruple mutan ini juga memiliki kesamaan karakter dinamika konformasi
residu fluktuatifnya dengan wt-p53. Oleh karena itu QMT dikatakan tidak
berbeda nyata dengan wt-p53.
2. PRIMA-1 cukup stabil menempel pada p53 di area β-sandwich dan spesifik
berinteraksi p53 dengan asumsi adanya perubahan yang cukup signifikan
terjadi pada residu sekitar penempelan (116, 245, dan 248) dan residu yang
jauh dari situs penempelan PRIMA-1 (186).
B. Saran
Meskipun wt-p53 dan QMT telah diketahui tidak berbeda nyata, namun
perlu adanya studi lanjut dinamika konformasi kompleks PRIMA-1 dengan QMT
karena PRIMA-1 juga menempel pada posisi yang sama dengan mutasi N268D.
Penelitian lanjutan sebaiknya dilakukan dengan rentang waktu yang lebih panjang
karena pada rentang waktu 5 ns belum diperoleh RMSD QMT yang cukup lama
stabil.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
47
DAFTAR PUSTAKA
Arjunan, S. N. V., Deris, S., and Illias, R. M. D., 2001, Prediction of Protein
Secondary Structure. Jurnal Teknologi, 35, page : 81–90.
Bai, L. and Zhu, W., 2006, p53: Structure, Function and Therapeutic
Applications, Journal of Cancer Molecules Vol. 2, No. 4, Hal. 141-153.
Becker, O. M., 2001, Computational Biochemistry and Biophysics, Chapter 4.
Marcel Dekker, Inc, New York
Becker, O. M. and Watanabe, M., 2001, Computational Biochemistry and
Biophysics, Chapter 3, Marcel Dekker, Inc, New York.
Berendsen, H. J. C., Postma, J. P. M., van Gunsteren, W. F., DiNola, A. & Haak,
J. R., 1984, Molecular Dynamics with Coupling to An External Bath, The
J. Chem. Phys, 81, 3684-3690.
Branden C., and J. Tooze., 1991, Introduction to Protein Structure, Garland
Publishing, Inc. 3–29.
Bykov, V. J. N., Issaeva, N., Selivanova, G., and Wiman, K. G., 2002a, Mutant
p53-Dependent Growth Suppression Distinguishes PRIMA-1 From Known
Anticancer Drugs: A Statistical Analysis of Information In The National
Cancer Institute Database, Carcinogenesis, Vol. 23, No. 12, Hal. 2011–
2018.
Bykov, V. J. N., Issaeva, N., Shilov, A., Hultcrantz, M., Pugacheva, E., 2002b,
Restoration of the Tumor Suppresor Function to Mutant p53 by A Low-
Molecular Weight Compound, Nat. Med., Vol. 8, No. 3, Hal. 282 – 288.
Case, D. A., Pearlman, D. A., Caldwell, J. W., Cheatham, T. E. III, Wang, J., et
al., 2002, AMBER7, University of California, San Fransisco.
Derbyshire, D., Basu, B., Serpel, L., Joo, W., date,T., Iwabuchi, K., and Doherty,
A., 2002, Crystal Structure of Human 53BP1 BRCT Domains Bound to
p53 Tumour Suppressor, EMBO J., 21: pp. 3868.
Enten, J. and Monson, M., 2005, DNA Cell Cycle Analysis with 4′, 6-Diamidino-
2-Phenylindole (DAPI) or Propidium Iodide (PI) Nuclear Stains, Cellular
Analysis Business Center, Beckman Coulter, Miami.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
48
Esposito, E. X., Tobi, D., and Madura, J. D., 2006, Reviews In Computational
Chemistry, Vol. 22, Chapter 2, Page: 57&133, JohnWiley&Sons, New
Jersey.
Frisch M. J., Trucks G. W., Schlegel H. B., Scuseria G. E., Robb M. A., et al.,
1995, Gaussian98 (Revision A.1), Gaussian, Inc., Pittsburgh PA.
Hadi, M dan Nurlaila, I., 2008, Pemodelan Nonlinier Reaksi Difusi Pertumbuhan
Kanker, Diakses 18 Oktober 2008 dari
http://www.nano.lipi.go.id/utama.cgi?cetakartikel&1203647897.
Hainaut P., Montesano R. , Wild C.P., 1997, Hepatocellular carcinoma:from gene
to public health, J Natl cancer Inst, Vol.9, No.2, 148-153
Humphrey, W., Dalke, A., and Schulten, K., 1996, VMD—Visual Molecular
Dynamics, J. Mol. Graphics 14, 33–38 (1996).
Joerger, A. C., Ang, H.C., and Fersht, A. R., 2006, Structural Basis for
Understanding Oncogenic p53 Mutantion and Designing Rescue Drugs,
Proc. Nat. Acad. Sci., 103: pp. 15056–15061.
Joerger, A. C., Allen, M.D., and Fersht, A. R., 2004, Crystal Structure of a
Superstable Mutant of Human p53 Core Domain, The Journal of
Biochemistry., 279: pp. 1291-1296.
Jorgensen, W. L., Chandrasekhar, J., Madura, J. D., Impey, R. W., and Klein, M.
L., 1983, Comparison of Simple Potential Functions for Simulating Liquid
Water, J. Chem. Phys., 79, 926-935.
Karjiban, R. A., Rahman, M. B. A., Basri, B., Salleh, A. B. Jacobs, D. et al., 2009,
Molecular Dynamics Study of the Structure, Flexibility and Dynamics of
Thermostable L1 Lipase at High Temperatures, Protein J. 28:14–23.
Kawata, M. and Nagashima, U., 2001, Particle Mesh Ewald Method For Three-
Dimensional Systems With Two-Dimensional Periodicity, Chemical
Physics Letters Volume 340, Issues 1-2.Pages: 165-172.
Keskin, O., Yuret, D., Gursoy, A., Turkay, M., and Erman, B., 2004,
Relationships Between Amino Acid Sequence and Backbone Torsion
Angle Preferences, Proteins 00:000–000.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
49
Klinsky A., Weib–Greiler P., Buchbauer G., et al., 2000, Ab Initio Molecular
Electrostatic Potential Grid Maps for Quantitative Similarity Calculations
of Organic Compounds, Journal of Molecular Modelling, Vol.6, 425-432.
Kumar, A. and Krishnaswamy, S., 2009, Structural Analysis of Outer Membrane
Beta-Stranded Porins Using B-factor, School of Biotechnology, Madurai
Kamaraj University, Madurai, Tamilnadu India: Poster.
Leach, A. R., 2001, Molecular Modelling, Principles and Applications, Chapter 6
and 7, Prentice-Hall, USA, pp. : 303, 307, 353, 367.
MathWorks, Inc., 2004, Natick, Massachusetts, USA.
Molinelli, A., 2004, Molecularly Imprinted Polymers : Towards a Rational
Understanding of Biomimetic Materials, Georgia Institute of Technology,
Georgia.
Morris, G. M., Goodsell, D.S., Huey, R., 1998, Automated Docking Using a
Lamarckian Genetic Algorithm and an Empirical Binding Free Energy
Function, Journal of Computational Chemistry, Vol. 19, No. 14, 1639-
1662.
Murray, R. K., Granner, D. K., Mayes, P. A., and Rodwell, V. W., 1998, Harpers
Biochemistry, 62: 779-800, Prentice-Hall International, USA.
Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., et
al., 2004, UCSF Chimera - A Visualization Sistem for Exploratory
Research and Analysis., J. Comput. Chem., 25: pp. 1605–12.
Pikkemaat M.G., Linssen A.B.M., Berendsen H.J.C., et al., 2002, Molecular
dynamics simulations as a tool for improving protein stability, oxford
journals, Vol.15, No.3, p185-192
Sofyan, R., 2002, Terapi Kanker pada Tingkat Molekuler, Cermin Dunia
Kedokteran, 127: pp 5-10, Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi
Nuklir Batan, Jakarta.
Syaifudin M., 2007, Gen Penekan Tumor p53, kanker, dan radiasi pengion,
Buletin Alara, Vol. 8, No.3, 119-128
Vousden, K.H. and Lu, X., 2002, Nat Rev Cancer,Vol.2, No.8, 594-604
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
50
Warsino, 2008, Interaksi Spesifik PRIMA-1 dengan p53 Untuk Kemoterapi
Kanker Melalui Reaktivasi p53 Termutasi, Jurusan Kimia Universitas
Sebelas Maret Surakarta, Surakarta: Skripsi.
Wibowo, F. R., 2005, Indirect Readout Mechanism is Conducted by DNA
Hydration and DNA Backbone Conformations. Leopold-Franzens-
University of Innsbruck, Austria: Dissertation.
Wright, J. D. and Lim, C., 2007, Mechanism of DNA–Binding Loss Upon Single-
Point Mutation in p53, J. Biosci., 32(5): 827–839.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
51
LAMPIRAN-LAMPIRAN
Lampiran 1. Gambaran Sistem Secara Umum pada Saat Penentuan Koordinat
Awal, Minimisasi, Equilibrasi, dan Simulasi.
Gambar 29. Gambar keadaan sistem secara umum pada saat penentuan koordinat
awal, minimisasi, equilibrasi, dan simulasi. A, B, C, dan D berturut-
turut adalah keadaan sistem pada saat awal, setelah disimulasi,
setelah diequilibrasi, dan setelah simulasi berjalan. Warna hitam
adalah sistem yaitu protein p53 dan warna biru adalah molekul air.
A
C
B
D
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
52
Lampiran 2. Densitas, Volume, Energi Total, dan Temperatur Sistem Selama
Proses 500 ps Equilibrasi dan 7000 ps Simulasi.
Gambar 30. Densitas, volume, energi total, dan temperatur sistem selama proses
500 ps equilibrasi dan 7000 ps simulasi. Dari atas ke bawah masing-
masing adalah grafik densitas, volume, energi total, dan temperatur
sistem saat equilibrasi (A) dan simulasi (B). Grafik berwarna hitam,
merah, hijau, dan kuning berturut-turut adalah wt-p53, QMT_1,
QMT_2, dan wt-p53 yang berinteraksi dengan PRIMA-1.
A B
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
53
Lampiran 3. Glosarium
Alur Difusi Temporal
AMBER
Apoptosis
B-factor
CHARMM
Checkpoint
Counterion
Error Autodock
Folding
Force Field
Gen suppressor tumor
GROMOS
Helix
Hotspot
Immediate predecessor
Loop
NAMD
Onkogen
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
Gerakan berpindah suatu zat dari bagian yang
berkonsentrasi tinggi ke bagian berkonsentrasi
rendah pada waktu tertentu.
Assisted Model Building with Energy Refinement
Mekanisme biologi yang merupakan salah satu
jenis kematian sel terprogram untuk membuang sel
yang sudah tidak diperlukan oleh tubuh.
Ukuran termal dari ketidaktentuan (luasan densitas
elektron) untuk struktur sebagai factor fluktuasi
suatu molekul.
Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics
Titik pengontrolan yang kritis dimana sinyal
berhenti dan sinyal terus dapat mengatur siklus.
Ion pusat yang menahan molekul.
Referensi kesalahan pada program autodock.
Pelipatan protein.
Medan gaya di sekitar molekul yang menjaga
molekul tersebut pada posisi tertentu.
Gen penekan tumor
Grӧningen Molecular Simulation
Struktur tiga dimensi lokal dari berbagai pada
protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen
berupa pilinan rantai asam amino berbentuk seperti
spiral.
Residu asam amino yang sering mengalami mutasi.
Konfigurasi sebelumnya.
Struktur protein yang terbentuk dari deret lurus
beberapa residu asam amino.
NAnoscale Molecular Dynamics
Gen yang termodifikasi sehingga meningkatkan
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
54
Protein p53
Protoonkogen
Quadruple Mutan
Reaktivasi
Root Mean Square
Deviation
Sheet
Topologi
Tinker
Transisi Allosteric
Wild Type p53
Β-sandwich
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
keganasan sel tumor.
Phosphoprotein dengan berat molekul 53 KDa yang
berperan menjaga sel dari mutasi genetik akibat
kerusakan DNA.
Gen normal yang dapat menjadi onkogen bila
mengalami mutasi.
Protein p53 yang mengalami mutasi pada empat
residu asam amino pada motif yang dipertahankan.
Pengaktifan kembali mutan p53 menjadi p53
normal.
Pergesaran posisi rata-rata molekul tiap waktu
terhadap posisi sebelumnya.
Struktur tiga dimensi lokal dari berbagai pada
protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen atau
tiol berupa lembaran-lembaran lebar.
Peta semua partikel dalam ruang simulasi.
Program pemodelan molekul untuk dinamika
molekuler dan mekanika molekuler dengan
beberapa fitur khusus biopolimer.
Perubahan struktur dan fungsi protein.
P53 normal yang tidak mengalami mutasi.
Struktur protein yang dibentuk dari sheet anti
parallel sehingga menyerupai sandwich.