Spektrální metody NMR I - Univerzita Karlovaweb.natur.cuni.cz/sekce-ch/nmr/NMR1/souhrn.pdf ·...
Transcript of Spektrální metody NMR I - Univerzita Karlovaweb.natur.cuni.cz/sekce-ch/nmr/NMR1/souhrn.pdf ·...
-
Spektrální metody NMR I
opakování
-
Využití NMR• určování chemické struktury – přírodní látky, organická syntéza
konstituce, konformace, konfiguraceověření čistoty
• studium dynamických procesůreakční kinetikachemické a strukturní rovnováhy
• určení prostorové strukturypeptidy a proteinyoligonukleotidy a DNA, RNAkomplexypolysacharidy
• navrhování léčiv – drug designStructure-Activity-Relationship
• fyzika – struktura materiálů
• lékařstvízobrazování měkkých tkání – anatomie, patologiefunkční zobrazováníin vivo spektroskopie
• potravinářstvíquality control – spektroskopie, zobrazovánífalšované potraviny (alkohol, džusy, med,...)
• metabolomika
-
Vlastnosti jader
Jádro hmotnost
magnetický moment
náboj
nukleonové (hmotové) číslo
protonové (atomové) číslo
spin
sudé
sudé
sudé
liché
liché
nulový 0
celočíselný 1, 2, 3, ...
poločíselný 1/2, 3/2, 5/2, ...
I = 0I = 1/2
I = 5/2
I = 3/2I = 3
I = 1
I = 1
-
Jaderný spin a magnetický moment
jaderný moment hybnosti
magnetický moment
průmět do libovolné osy je kvantován
magnetické kvantové číslo
Energie magnetického momentu v magnetickém poli
I = 1/2
m = -1/2
m = +1/2
I = 1
m = -1
m = -1
m = 0E E
-
Jádro v magnetickém poli
magnetický moment spin (moment hybnosti)
Klasický popis
B0 Larmorova precese
smysl otá čení
-
Jádra v magnetickém poliSoubor neinteragujících jader
Magnetizace = součet magnetických momentů
B0B0 = 0
Boltzmanovo rozdělení
velikost magnetizace úm ěrná rozdílu obsazenosti hladin
-
Energie a obsazení hladin
Boltzmanovo rozdělení
NMR je principiáln ě málo citlivá metoda
Magnetizace
- makroskopická veličina
úměrná rozdílu obsazenosti
hladin,
udává intenzitu NMR
signálu
-
Pulsní NMR
90°
excitace detekce
Základní experiment
NMR spektrumsignál volné precese - FID
Fourierovatransformace
Larmorova precese
rezonanční podmínka
radiofrekvenční puls
0BRF γγγγωωωω ====
B1
B0
frekvence ovlivn ěnalokálním magnetickým polem
-
NMR frekvence
0 100 200 300 400 500 600
1H13C 31P15N 19F2H
Chemický posun
14.1 T
-
Chemický posun
Stínění jádra elektrony
lokální magnetické pole
Pozměněná rezonanční podmínka
„holé“ jádro jádro v molekule
E
rezonan čnífrekvence
ppm
parts per milion
-
high δlow field
downfield
paramagnetic shift
deshielding
low δhigh field
upfield
diamagnetic shift
shielding
stínění elektrony
ppm, frekvence
NMR spektrum
-
1H chemické posuny
http://www.chemistry.ccsu.edu/glagovich/teaching/316/index.html
Obecný princip: více elektron ů kolem jádra = nižší δδδδ
-
13C chemické posuny
Obecný princip: více elektron ů kolem jádra = nižší δδδδ
-
Chemický posun a elektronegativita
Obecný princip: více elektron ů kolem jádra = nižší δδδδ
vyšší elektronegativita = vyšší chem. posun (deshielding)
2510-21-2.413C [ppm]
4.253.052.702.160.41H [ppm]
4.03.02.82.52.1Elektronegativita
CH3FCH3ClCH3BrCH3ICH4
pozor na efekt t ěžkého atomu
-
Chemický posun a rezonan ční efekt
Obecný princip: více elektron ů kolem jádra = nižší δδδδ
7.28, 128.5
OCH3
EDG, +M efekt
160 zvýšená e- hustotav ortho a para pozicích6.88, 114
7.26, 129
6.92, 121
upfield shift
HH
H H
HH
H
O
CH3
6.115.29 6.52 HH
H O
CH3
3.74 3.93
EWG EDG
elektron-akceptorní elektron-donorní
121
131 84
-
Chemický posun a anizotropní efekt
+ +
_
nesymetrické rozložení elektron ů stínící efekt není všude stejný
+ vyšší δ- nižší δ
+-
-CC+ +
-
-CC+
-+
+- CC
kruhový proud v aromatickém systému
-
Chemický posun a vliv okolních substituent ů
predikce dle empirických vztahů
(Shooleryho pravidla a pod.)
experiment (ppm)
základ pro CH2
-
J vazbaNepřímá spin-spinová interakce scalar coupling
interakce zprost ředkovaná vazebnými elektrony
jádro „cítí“ spinový stav okolních jader
I S
ννννS
ννννS ννννI
ννννI
ννννIννννS ννννIννννS
ννννS+J/2
ννννS-J/2
ννννI+J/2
ννννI-J/2I S
EJ = h J mI mS
příspěvekk energii
J J
-
m = -1/2
m = +1/2
dublet triplet kvartet
1 : 1 1 : 2 : 1 1 : 3 : 3 : 1
J vazba v 1H spektrechsignály jsou štěpeny vodíky, které jsou „různé“
O
OH
H
H
H
H
H
H
H
1.05.0 2.04.0 3.0
„stejné“ vodíky se navzájem neštěpí
Štěpení jedním vodíkem dvěma vodíky třemi vodíky
-
J vazba a systém št ěpeníŠtěpení n ekvivalentními vodíky
1 singlet s
1 1 dublet d
1 2 1 triplet t
1 3 3 1 kvartet q
1 4 6 4 1 pentet p
n
1
2
3
4
Pascalův trojúhelník
J1 = J2 J1 > J2 J1 >> J2
J1 J1
J2
t dd dd
-
J vazba - dosah
C
H
H
X
Y
C C
H
H
R
R
2JHHGeminální
5 – 20 Hz 0 – 2 Hz
CR
H
C
R
H
RR
3JHHVicinální
6 – 8 Hz
bez konforma čnípreference
H
H
R
R
H
R
H
R14 – 18 Hz 7 – 12 Hz
trans cis
„long range“přes více vazeb
-
Karplusova k řivka
závislost 3JHH na dihedrálním úhlu
-
Analýza št ěpení
Určete strukturu a konformaci,zapište spektrum
C4H7Cl
CH3 CH2 Cl
H H
1.58 (d, J=7.5Hz, 3H)4.00 (d, J=8.5Hz, 2H)5.45 (dq, J=10.1, 7.5Hz, 1H)6.29 (dt, J=10.1, 8.5Hz, 1H)
-
Řád spektra
∆ν∆ν∆ν∆ν >> J
∆ν∆ν∆ν∆ν = 0 A2
AA’
AB
AX spektrum 1. řádu
spektrum vyššího řádu
„pseudo-první řád“
stříškový efekt
-
I OH
O rozdíl chem. posuvů 0.11 ppm
J vazba 7 Hz
-40 -20 0 20 40
-40 -20 0 20 40
-40 -20 0 20 40
-40 -20 0 20 40
-40 -20 0 20 40 60
30 MHz
60 MHz
120 MHz
300 MHz
600 MHz
J vazba – velikost štěpení nezávisí na B0
rozdíl chemických posunů roste s B0
Vliv magnetického pole
-
J interakce s jinými jádry
R F
H
H
HF
2JHF = 44-81 Hz
3JHF = 3-25 Hz
4JHF = 0-4 Hz
3JHF = 6-10 Hz
4JHF = 5-6 Hz
5JHF ≈ 2 Hz
orto
meta
para
3JPH
1JPH
2JPH
CHCl3 1H
208 Hz
1H-19F
1H-31P 1H-13C
-
Spinový systém
úplná množina NMR aktivních jader, ve které jsou členové provázáni J-interakcemi
CH3
CH2O
CH2CH2
CH3
CH3 NHCH NH
CH3
O
O
H2C
-
Chemická ekvivalence
Jádra jsou chemicky ekvivalentní, pokud existuje operace symetrie,
která je na sebe převádí
CH3 vodíky jsou ekvivalentní díky rychlé rotaci
Chemicky ekvivalentní jádra mají stejný chemický posun
HD
Ph Ph
HH
Ph Ph
DH
Ph Ph
vodíky jsou homotopické
-
HD
Ph CH3
HH
Ph CH3
DH
Ph CH3
vodíky jsou enantiotopické
jsou chemicky ekvivalentní
∗∗∗∗ ∗∗∗∗
HH
Ph
NH2
O
OHH
HD
Ph
NH2
O
OHH
DH
Ph
NH2
O
OHH
vodíky jsou diastereotopické
nejsou chemicky ekvivalentní
∗∗∗∗ ∗∗∗∗∗∗∗∗ ∗∗∗∗
∗∗∗∗
Chemická ekvivalence
různé chemické posuny
-
Magnetická ekvivalenceJádra jsou magneticky ekvivalentní, pokud
jsou chemicky ekvivalentní
mají stejné geometrické postavení k ostatním NMR aktivním jádrům(mají s nimi stejnou J vazbu)
a zároveň
Cl Cl
CH3
H
H
H
mezi magneticky ekvivalentními jádry se ve spektru neprojevuje
J vazba
H H
CH3
H
Cl
H
spektra chemicky ekvivalentních a magneticky neekvivalentních jader nelze
analyzovat dle pravidel 1. řádu
-
Informace v 1H spektrech
4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
4.10
1.20
CH3 O CH3
O
• Počet signálů
• Chemický posun
• Intenzita signálů
• Systém štěpení
-
150 100 50
21.61
61.2568.79
173.07
O OCH3
CH3OH
13C spektrum a dekapling
• Počet signálů
• Chemický posun
90°
excitace detekce
CW nebo WALTZ161H:
13C:
saturace
nukleární Overhauser ův efekt
rychlé p řeskoky
efektivn ě nulový spin
NE kvantitativní kvůli NOE a obvykle nedostatečné relaxaci kvartérních uhlíků
-
Multiplicita uhlíkových signál ů= rozlišení uhlíků podle úpočtu navázaných vodíků
Spektrum bez 1H dekaplingu(nebo off-resonance)
APT experiment
DEPT experiment
C, CH2
CH, CH3
CH2
CH, CH3
O OCH3
CH3OH
!!!
-
NMR spektrometr
supravodivý magnet
konzole s rf elektronikou
řídící počítač
-
NMR spektrometr – schema
RFsyntetizátor
programátorpulsní sekvence
ADC
brána zesilovač
duplexer
přijímač/mixer
počítač
sonda
zesilovač
(komplexní FID)
kvadraturnídetekce
rozlišení znaménkaprecese
-
Digitální detekce a spektrumNyquistovo kritérium
Počet bodů
Spektrální rozlišení
spektrální šířka
Akviziční dobaoffset pulsu
spektrální šířka
absorp ční signál
reálná část imaginární část
disperzní signálLorentzova křivka
Fázová korekce – optimalizace tvaru spektra do absorpčního signálu
-
NMR vzorekRozpoušt ědlo - deuterované Standardy chemického posunu – TMS, DSS
Stabilita a homogenita magnetického poleField-frequency lock Shim
stabilita v čase homogenita přes vzoreksledování
„nezávislého“ jádra
- deuterium
Koherentní st ředování
-
NMR relaxace
obnovení z-ové složky vymizení x,y složek
změna energie ztráta koherence
prodleva mezi m ěřeními šířka čáry
T1 T2podélná (spin-mřížková) příčná (spin-spinová)
B0 B0
Příčina - interakce s okolímfluktuující lokální magnetické pole
přímá dipól-dipólová interakceanizotropie chemického stín ění
přeskoky mezi E hladinami různé Larmorovy frekvence
Bloc = B + B
inversion recovery: 180-t-90-acq spinové echo: 90-t/2-180-t/2-acq
T1 T2≥
-
Interpretace NMR relaxací
fluktuující lokální
magnetické pole
a relaxace
přímá dipól-dipólová interakceanizotropie chemického stín ění
pohyb molekul
nebo jejich částí+ =
rychlémalé
vysoké
pohybymolekulyteploty
pomalévelkénízké
C
H
„model-free“ analýza
globální pohyb[ns]
lokální pohyb[ps]
(Lipari-Szabó)
-
Dynamické procesy
Chemická reakce – sledování in situ, změny spektra v čase jak reakce probíhá
Chemická vým ěna
jakýkoli proces při kterém dané jádro mění svůj stav / okolí a NMR charakteristiky
• chemický posun• J vazba• relaxa ční čas• transla ční difuze
+k1
k-1
k1
k-1
Keq Kassoc
Intramolekulární (konformační) výměna Intermolekulární výměna
Transla ční difuze
pomocí NMR lze stanovit difuzní koeficient a tak i „efektivní“ velikost molekul
experiment DOSY – rozdělení spekter směsi podle velikosti molekul
-
Chemická vým ěna
dimethylformamide
2
νπ ∆=k
ν∆k
pomalá
rychlá
koalescence
vážený průměrchemických posunů
• analýza tvaru spektra
• titrační experiment
-
2D NMR spektroskopie
příprava
vývoj
směšování
2Ddetekce
2D FT
contour plot
homonukleární
heteronukleární
COSY, NOESY
HSQC, HMQC, HMBC
Korelace
po chemických vazbách
přes prostor
COSY, HSQC, HMQC, HMBC
NOESY
-
2D NMR spektroskopieCOSY
HSQC a HMQC
HMBC
NOESY
homonukleární 1H-1H korelace přes obvykle 3 chem. vazby
korelační pík se objeví pokud existuje J-interakce mezi danými vodíky
přiřazení vodíkových signálů
heteronukleární 1H-13C korelace přes jednu chem. vazbu
založeno na 1JCH okolo 140 Hz
přiřazení uhlíků nesoucích vodík
heteronukleární 1H-13C korelace přes 2 a více vazeb
založeno na 2,3JCH okolo 8 Hz
přiřazení kvartetních uhlíků, spojení fragmentů
homonukleární 1H-1H korelace přes prostor
korelační pík pro vodíky vzdálené do 5 Å
založeno na přímé dipól-dipólové interakci – NOE
určení prostorové struktury
-
Řešení NMR spektra
Postup
• identifikovat signály, jejich počet, pozici a intenzitu
• rozdělit vodíky do skupin
• analyzovat jemné štěpení, identifikovat jaké skupiny budou vedle sebe
• dokončit identifikaci funkčních skupin s přihlédnutím k chem. posunům
a dalším informacím (13C spektrum, APT/DEPT)
• spojit funkční skupiny do molekuly
• znovu ověřit, zda molekula odpovídá spektru
-
C3H6O2
1 23
triplet(štěpení od 2 vodík ů)
kvartet dublet ů(štěpení od 3 vodík ů + 1 další)
J vazba= sousední skupiny
kvartet(3 navázané vodíky)
triplet(2 navázané vodíky)
dublet(1 navázaný vodík)
posun typický pro karboxyl
(zřejmě NE aldehyd, ten bývá okolo 190ppm)
CH
CH2
CH3
CH3CH2
zřejmě CH
zřejmě J vazba
posun typický pro vodík vedle kyslíku
typický posunmethylu
posun typickýpro uhlík
s kyslíkem
H-C=OO
O
O
CH3 O O
H
malé Jpřes 4 vazby
-
Písemná zkouška
2x řešení spektra 2 x 15 bodů
4 otázky 4 x 5 bodů
Celkem 50 bodů
analýza integrace 1 bod
analýza štěpení 5 bodů
identifikace funkčních skupin 5 bodů
konečné řešení a jeho vysvětlení 4 body
Celkem 15
1 43 – 50
2 37 – 42.9
3 30 – 36.9
X < 30
Celkové hodnoceníHodnocení spekter