Spekter mutacij pri bolnikih s hemofilijo A v Sloveniji · 2012-12-01 · Hemofilija A je genetska...
Transcript of Spekter mutacij pri bolnikih s hemofilijo A v Sloveniji · 2012-12-01 · Hemofilija A je genetska...
Spekter mutacij pri bolnikih s
hemofilijo A v Sloveniji
M. Debeljak, L. Kitanovski, A. Trampuš Bakija, M. Benedik Dolničar
Pediatrična klinika
UKC Ljubljana
Laško, oktober 2012
HEMOFILIJA A
Hemofilija A je X-vezana recesivna dedna bolezen z motnjo v strjevanju krvi.
Hemofilija A se pojavlja pri vseh etničnih skupinah z enako pogostnostjo, 1 / 10.000 rojenih dečkov
Gre za pomanjkanje, odsotnost ali neaktivnost koagulacijskega faktorja VIII, kot posledica mutacij v genu za faktor VIII.
Glede na aktivnost faktorja ločimo:
težko (< 1%),
srednje težko (1-5%) in
lahko obliko bolezni (>5-30%).
Krvavitve pri hemofiliji – sklepi, mišice
1. Hemartroza z vnetjem
2. Kronični proliferativni artritis
3. Kronična hemofilična artropatija
ZDRAVLJENJE: koncentrat FVIII, koncentrat rFVIII, (FVII)
DDAVP-sproščanje FVIII iz celičnih zalog
INHIBITORJI
Pri nekaterih hemofilikih (30% težka oblika HA), ki so zdravljeni z
nadomestnim faktorjem VIII, imunski sistem terapijo zamenja za grožnjo
organizmu.
V odgovor, imunski sistem tvori IgG protitelesa (=inhibitorje), ki napadajo
faktor VIII.
Inhibitorji so zelo resen problem saj preprečujejo ali zavirajo nadomestno
zdravljenje z FVIII in s tem nadzor nad krvavitvijo.
Zdravljenje z nadomestnim faktorjem VII
Nadomestna terapija
FVIII inhibitorji
HEMOSTAZA (= vsi procesi in reakcije, ki prispevajo k
ustavljanju krvi po poškodbi žilne stene)
PRIMARNA reakcija
Kontrakcija žilne stene
Adhezija trombocitov
Nastanek trombocitnega čepa
SEKUNDARNA reakcija
Koagulacijski faktorji
v kompleksni koagulacijski kaskadi
pomagajo pri tvorbi fibrina
Učvrstitev trombocitnega čepa
intrinzična
pot
ekstrinzična
pot
skupna
pot
fibrin (prečno povezan)
Hoffman et al. Blood Coagul Fibrinolysis 1998;9(suppl 1):S61.
FVIII mRNA (9010 bp)
5’UTR FVIII kodirajoča regija + stop kodon 3’UTR
(150 bp) (9010 bp) (1806 bp)
NH2
Arg 372 Arg 740
A1 A2 B C1 A3 C2 COOH
težka veriga lahka veriga
Arg 1689
5’ 3’
1 2-6 7-9 10-12 13 14 15-22 23-25 26
10kb intron 22
FVIII
ORGANIZIRANOST
Kromosom X Xq28
exon 23 exon 22
HEMOFILIJA A
179 bolnikov s hemofilijo A
82 bolnikov s težko obliko HA
18 srednje težko obliko HA
79 lahko obliko HA
Laboratorijska in genetska diagnostika hemofilij
(1998 → ) – 150 bolnikov z opredeljeno mutacijo
Ocena tveganja za tvorbo inhibitorjev
Ugotavljanje prenašalk + prenatalna diagnostika
Debeljak M, Kitanovski L, Trampuš Bakija A, Benedik Dolničar M.. Spectrum of F8 gene mutations in haemophilia A patients from Slovenia.
Haemophilia. 2012 Sep 7. doi: 10.1111/hae.12003. [Epub ahead of print]
Laboratorijski testi
Ugotovitev in opredelitev hemofilije
Presejalni testi koagulacije
(Aktiviran Parcialni Tromboplastinski Čas, Protrombinski Čas, Trombinski Čas, koncentracija fibrinogena)
Aktivnost koagulacijskega faktorja FVIII:C (APTČ)
Enostopenjska metoda
Dvostopenjska metoda
Metoda s kromogenim substratom
FVIII deficitarna plazma
Vzorec – razredčena plazma
Aktivator + fosfolipidi
Dodatek Ca 2+
za tvorbo trombina
-nastanek fibrinskega
strdka v enem koraku.
Stopenjska diagnostika
↓ faktorja / inhibitorji
test 50:50 Inhibitorji
(LA, inh. FVIII
inh. drugih F
intrinzične poti)
pomanjkanje F FIX, XI, XII, V
vWD, DIK, ↓fib, ↓ FXIII
Težka
<1%
Srednje težka
1-5% Lahka
>5%
FVIII:C
<30%
HEMOFILIJA A
APTČ ↑
PČ, TČ – N
Zapiralni čas – N
Štev. trombocitov - N
Težka
<1%
Srednje težka
1-5%
Lahka
>5%
Prenašalka
30 - 50%
presejalne metode
PCR/SSCP, DGGE, dHPLC
sekvenciranje F8
(26 eksonov – eksoni, 5'UTR, 3'UTR,
promotorji, odseki izrezovanja
Inverzija
int 22
Inverzija
Int 1
+ -
-
PRENATALNA DIAGNOSTIKA
neznana znana
+
qter
qter
Faktor VIII gen
26
F8A
dist.
F8A
proks.
qter
F8A
znotraj introna 22
1 26
22 1 23 26
1
F8A
dist.
F8A
proks.
F8A
znotraj introna 22
Inverzija introna 22 50 % težkih hemofilij A, v Sloveniji 48%, 40 bolnikov
Intrakromosomska rekombinacija med F8A (int 22) in telomernim identičnim genom
Inverzija de novo nastane 1/10.000 mejoz pri moških
Inverzija introna 22
P
Q A
B
int22h1
Int22h2&3
10 kbp
ni prenaš. hemofilik prenaš. prenaš. M
PQ AQ PB AB
Mutacije gena F8
Podatkovna banka -
HGMD - the Human Gene Mutation Database (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/all.php), HaMSTERS
2517 opisanih mutacij
Točkovne mutacije (1492 različnih zamenjav enega baznega para, 165 pri izrezovanju intronov).
Delecije 223 primerov večjih (2-210 kb) in 419 manjših (1-23 bp).
Insercije 131 primerov insercij; večinoma 1bp.
Izolacija DNA iz levkocitov periferne krvi (odvzem z EDTA), horionske resice
pri prenatalni diagnostiki
PCR pomnoževanje posameznih eksonov
Matrica: genomska DNA
Par oligonukleot. začetnikov + dNTP
Enako dolgi fragmenti
Agarozna elektroforeza
Sekvenčna reakcija
Matrica: pomnožen fragment DNA
En oligonukl. začetnik + dNTP + ddNTP
Vse dolžine fragmentov
Kapilarna elektroforeza
Analiza kromatogramov
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
Genetska diagnostika hemofilije A
Metode, mutacije v 26 – pregled vseh eksonov z
eksonsko/intronskimi regijami gena F8
179/149 bolnikov; 126/95 družin
81/82 težka obl. HA, 15/18 srednja, 53/79 lahka
54 različnih mutacij; 21 mutacij samo pri Slovencih
Pri 43% bolnikih je dedna osnova negativna
En bolnik z lahkim fenotipom ima 2 različni mutaciji
TIP MUTACIJE TEŽKA OBL. SREDNJA
OBL.
LAHKA OBL.
INVERZIJA INTRONA 22 40 0 0
INVERZIJA INTRONA 1 0 0 0
MAJHNE DELECIJE 9 0 0
MAJHNE INSERCIJE 4 0 0
MAJHNE DUPLIKACIJE 2 0 0
INSERCIJE-DELECIJE 1 0 0
VELIKE DELECIJE 0 0 0
DRUGAČNO-SMISELNE 11 13 52
MUTACIJE IZREZOVANJA
INTRONOV
3 2 0
NESMISELNE MUTACIJE 11 0 0
5'UTR 0 0 1
Inhibitorji in mutacije
222 (98) bolnikov med 1977-2011
15 inhibitorje, 12 težka obl. HA, 3 lahka obl. HA
Prevalenca 6,7% za celotno kohorto, 12,2% za težko obliko
HA
Mutacije pri lahki obliki HA: p.Arg593Cys in p.Arg2307Gln
Mutacije pri težki obliki HA:
inv 22 (6)
delecija p.Glu1801fs (3)
nesmiselne p.Arg1696X in p.Arg602X (2)
splicing c.6273+2T>C
Sklepi
Hemofilija A je genetska bolezen z uspešnim nadomestnim zdravljenjem za bolnike.
Hemostaza je proces ustavitve krvavitve po poškodbi žilne stene. FVIII je kofaktor v intrinzičnem delu koagulacije. Okvara proteina povzroča hemofilijo A.
V Sloveniji se vsakemu bolniku določi stopnjo hemofilije z laboratorijsko diagnostiko.
Večina slovenskih bolnikov ima določeno genetsko mutacijo
Ugotavljanje prenašalk
Prenatalna diagnostika