Sổ tay xét nghiệm và xử lý Tinh dịch đồ người - 2011

Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời 1

PXN Nam Khoa – Khoa Hiếm muộn

SỔ TAY XÉT NGHIỆM VÀ XỬ LÝ

TINH DỊCH NGƢỜI

LƢU HÀNH NỘI BỘ 2011

BỆNH VIỆN HÙNG VƢƠNG

KHOA HIẾM MUỘN

2 Sổ tay xét nghiệm và xử lí tinh dịch ngƣời

http://www.ivfhungvuong.com.vn



Khi khảo sát khả năng sinh sản của một cặp vợ chồng thì tinh dịch đồ (của nam) là

một trong những xét nghiệm cơ bản nhất, quan trọng nhất không thể thiếu. Qua khảo

sát tinh dịch đồ có thể có được những thông tin về tinh trùng của nam giới (có hay

không có tinh trùng).

Xét nghiệm tinh dịch đồ đã được thực hiện từ nhiều năm, với nhiều kỹ thuật,

phương pháp luôn được cải tiến, thay đổi qua thời gian. Sự thay đổi quy trình kỹ thuật

cũng nhằm mục đích đưa ra một đánh giá chính xác khi khảo sát chất lượng mẫu tinh

dịch đồ để có một thái độ xử trí đúng cho từng kết quả đưa ra.

Dưới hướng dẫn của quy trình theo WHO 1999, từ năm 2000 Khoa Hiếm muộn

Bệnh viện Hùng Vương đã thực hiện xét nghiệm tinh dịch đồ nhưng chủ yếu phục vụ

tại Khoa (trung bình 20 – 25 trường hợp/tháng). Hiện nay, bộ phận xét nghiệm của

Khoa Hiếm muộn đã nhận thực hiện xét nghiệm rộng rãi cho cả những đối tượng bên

ngoài vào xét nghiệm, đồng thời cũng nhận đào tạo theo nhu cầu của các đơn vị khác

như: trường Đại học, phòng khám tư nhân, đơn vị Bệnh viện bạn, tuyến y tế cơ sở…

Trên thế giới hiện nay đang chuẩn hóa quy trình xét nghiệm tinh dịch theo WHO

2010, nhân viên phòng xét nghiệm Nam khoa cũng đã được huấn luyện, học tập nhiều

quy trình mới và đã tích lũy nhiều kiến thức, kinh nghiệm. Nhận thấy cần có một tài liệu

theo chuẩn cập nhật của WHO, nhân viên phòng xét nghiệm Nam khoa đã soạn ra tập

tài liệu này, mà qua đó những quy trình, kỹ thuật thống nhất, chính xác được tuân thủ

đúng theo tiêu chuẩn quốc tế sẽ được thực hiện tại Khoa. Tập tài liệu này sẽ được dùng

để hướng dẫn cho học viên ở các nơi khác đến học tập tại Khoa Hiếm muộn – Bệnh

viện Hùng Vương.

Do đây là lần đầu tiên biên soạn, chắc chắn vẫn còn nhiều sai sót cần điều chỉnh,

kính mong quý đồng nghiệp đóng góp ý kiến giúp chúng tôi về nội dung lẫn hình thức.

Xin chân thành cảm ơn!

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Bệnh Viện Hùng Vương đã giúp đỡ chúng tôi

hoàn thành tài liệu này.

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 12 năm 2011

Thay mặt nhóm biên dịch

BS. Nguyễn Thị Ngọc Sương



Bs. Nguyễn Thị Ngọc Sƣơng

Trưởng Khoa Hiếm muộn

Bệnh viện Hùng Vương

Bs. Vũ Đình Tuân

Trưởng Labo IVF


Bs.Tăng Quang Thái

Phòng Khám Nam học


CNSH. Tăng Kim Hoàng Văn

Labo IVF


CNSH. Lâm Sơn Bích Trâm

PXN Nam Khoa


Chịu trách nhiệm chính

Cố vấn chuyên môn

Biên dịch

CNXN. Nguyễn Văn Nghĩa

PXN Nam Khoa




Mục lục MỤC LỤC

PHẦN I: MỞ ĐẦU

PHẦN II: QUY TRÌNH NHẬN MẪU

A. Hƣớng dẫn bệnh nhân làm xét nghiệm ........................ 20

B. Hƣớng dẫn bệnh nhân lấy mẫu ...................................... 20

I. Chuẩn bị lấy mẫu .............................................................................. 20

II. Yêu cầu khi lấy mẫu ......................................................................... 21

III. Thu mẫu tinh dịch cho mục đích chẩn đoán hoặc ................ 21

IV. Thu mẫu vô trùng cho mục đích hỗ trợ sinh sản và ............. 22

V. Thu mẫu tinh dịch tại nhà .............................................................. 23

VI. Thu mẫu tinh dịch bằng bao cao su ............................................ 23

C. Nhận và kiểm tra mẫu tinh dịch ..................................... 24

D. Hẹn thời gian trả kết quả ................................................ 23

PHẦN III: PHÂN TÍCH TINH DỊCH

A. Thời điểm phân tích mẫu ................................................ 28

B. Quy trình phân tích tinh dịch: ........................................ 29

C. Khảo sát đại thể ............................................................... 29

I. Tính chất tổng quát .......................................................................... 29

II. Sự ly giải ............................................................................................... 29

III. Độ nhớt ................................................................................................. 31

IV. Thể tích ................................................................................................. 32

V. pH ........................................................................................................... 33



D. Khảo sát vi thể .................................................................... 24

I. Trộn mẫu ................................................................................................. 34

II. Tạo tiêu bản ướt .................................................................................... 35

III. Đánh giá tổng quát .............................................................................. 36

1. Sự kết đám (aggregation) .............................................................. 36

2. Sự kết dính (agglutination) ............................................................ 37

3. Các tế bào lạ .................................................................................. 39

IV. Đánh giá độ di động của tinh trùng ............................................... 39

1. Phân loại di động của tinh trùng .................................................... 40

2. Cách đánh giá độ di động của tinh trùng ....................................... 40

V. Đánh giá tỉ lệ sống của tinh trùng .................................................. 44

1. Phương pháp nhuộm Eosin – Nigrosin .......................................... 45

2. Phương pháp nhuộm Eosin đơn thuần ........................................... 47

3. HOS test (Hypo-osmotic swelling) ................................................ 48

VI. Đánh giá mật độ tinh trùng .............................................................. 49

1. Chuẩn bị buồng đếm Neubauer cải tiến......................................... 50

2. Chuẩn bị dung dịch đếm mật độ tinh trùng: .................................. 52

3. Chuẩn bị mẫu pha loãng ................................................................ 52

4. Đặt mẫu vào buồng đếm ................................................................ 53

5. Đánh giá mật độ tinh trùng trên buồng đếm .................................. 54

6. Cách tính mật độ tinh trùng và tổng số tinh trùng ......................... 56

7. Đánh giá mẫu có mật độ tinh trùng thấp: ...................................... 57

8. Tính mật độ tế bào lạ ..................................................................... 58

9. Bảo quản buồng đếm ..................................................................... 59

VII.Đánh giá hình dạng tinh trùng ....................................................... 60

1. Quy trình: ....................................................................................... 60

2. Kỹ thuật kéo lame .......................................................................... 61

3. Phương pháp nhuộm Papanicolaou: .............................................. 64

4. Phân loại hình dạng tinh trùng ....................................................... 65



PHẦN IV: QUY TRÌNH LỌC RỬA TINH TRÙNG

A. Giới thiệu ....................................................................................... 74

I. Mục đích ................................................................................................................. 74

II. Chọn lựa phương pháp ..................................................................................... 74

III. Hiệu quả của kỹ thuật phân tách tinh trùng .............................................. 75

B. Quy trình chuẩn bị tinh trùng ....................................................... 76

I. Phương pháp rửa đơn giản (Simple wash) ................................................. 77

II. Phương pháp bơi lên trực tiếp (Direct swim-up) ....................................... 78

III. Phương pháp ly tâm gradient với nồng độ ................................................. 79

IV. Chuẩn bị tinh trùng trong một số trường hợp khác ................................ 81

1. Chuẩn bị tinh trùng đối với trường hợp tinh trùng ..................................... 82

2. Chuẩn bị tinh trùng đối với trường hợp tinh trùng ..................................... 82

3. Chuẩn bị tinh trùng trong trường hợp xuất tinh ngược .............................. 84

PHẦN V: QUY TRÌNH TRỮ LẠNH TINH TRÙNG

A. Giới thiệu ........................................................................................ 88

B. Các lý do trữ lạnh tinh trùng ........................................................ 89

I. Bảo tồn khả năng sinh sản ............................................................................... 90

II. Điều trị vô sinh ..................................................................................................... 90

C. Đánh giá rủi ro của kỹ thuật trữ lạnh và bảo quản ................... 91

I. Nguồn mẫu ........................................................................................................... 91

II. Thiết bị bảo hộ, an toàn đối với nhân viên ................................................. 91

III. Nguy cơ lây nhiễm chéo ................................................................................... 92

IV. Đảm bảo an toàn cho mẫu đông lạnh ......................................................... 73



D. Quy trình đông lạnh – rã đông tinh trùng 92

I. Quy trình đông lạnh tinh dịch 92

1. Quy trình chuẩn 92

2. Quy trình đông lạnh 94

II. Giải đông tinh dịch đông lạnh 95

PHỤ LỤC

A. Trang thiết bị và an toàn thiết bị 98

I. Các thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm 98

1. Các trang thiết bị thông thường 98

2. Các dụng cụ, hóa chất 99

3. Các dụng cụ, hóa chất bảo vệ an toàn 100

II. Các mối nguy trong phòng xét nghiệm 100

III. Các thao tác an toàn cho nhân viên 101

IV. An toàn khi sử dụng các thiết bị 102

V. An toàn khi sử dụng nitơ lỏng 103

B. Cách tính lực ly tâm 104

C. Sử dụng kính hiển vi 106

I. Load mẫu 106

II. Điều chỉnh thị kính 107

III. Điều chỉnh làm rõ nét hình ảnh 107

IV. Lấy nét tại thị kính 108

V. Chỉnh độ sáng 108

VI. Điều chỉnh tâm tụ sáng 87

D. Mẫu kết quả phân tích tinh dịch 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO



PHẦN I : MỞ ĐẦU



Các thông số tinh dịch đồ chuẩn của WHO 2010

Thể tích tinh dịch

pH

Mật độ tinh trùng

Tổng số tinh trùng

Di động:

PR

PR+ NP

Tỷ lệ tinh trùng sống

Hình dạng bình thường

1,5 ml

7,2

15.106/ml

39.106/ml

32 %

40 %

58 %

4 %

Tinh dịch đồ là một xét nghiệm đầu tay giúp đánh giá sơ bộ

khả năng sinh sản của nam giới, bao gồm nhiều thông số như: mật

độ tinh trùng, tổng số tinh trùng, độ nhớt, độ ly giải, phần trăm di

động, phần trăm hình dạng bất thường… Các thông số của tinh dịch

đồ có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán và điều trị vô sinh.



SƠ LƢỢC VỀ QUÁ TRÌNH XUẤT TINH

Tinh trùng trưởng thành được trữ ở mào tinh hoàn. Khi xuất tinh,

tinh trùng được hoà trộn với dịch tiết từ các tuyến phụ sinh dục khác rồi

phóng ra ở dạng sệt. 90% thể tích tinh dịch được tiết ra từ các cơ quan

phụ (Weiske, 1994), chủ yếu là tuyến tiền liệt và túi tinh, phần còn lại được

tiết từ tuyến hành niệu đạo (Cowper’s gland) và mào tinh hoàn.

Khi xét nghiệm tinh dịch, cần quan tâm đến 2 thông số sau:

Tổng số tinh trùng: phản ánh khả năng sản xuất tinh trùng của

tinh hoàn và tình trạng thông suốt của hệ thống ống dẫn tinh.

Tổng thể tích tinh dịch: phản ánh sự tiết dịch của các tuyến.

Các thông số cần quan tâm khác như tỷ lệ sống, độ di động, hình

dạng cũng như các thành phần có trong tinh dịch đóng một vai trò quan

trọng trong chức năng của tinh trùng.

Khi giao hợp, một lượng nhỏ tinh dịch được xuất ra lúc đầu rất giàu

tinh trùng đi thẳng qua âm đạo và đến tiếp xúc với màng nhầy cổ tử cung

(Sobrero & MacLeod, 1962), và phần dịch còn lại bị giữ lại trong âm đạo.

Trong khi đó, với quy trình lấy mẫu tại phòng xét nghiệm, toàn bộ lượng

tinh dịch xuất ra được thu nhận trong một lọ chứa. Khi đó, tinh trùng bị

nhốt trong một khối đông tụ. Sau một thời gian, khối đông tụ này sẽ ly

giải nhờ các enzyme protease do tuyến tiền liệt tiết ra.

Một số nghiên cứu cho thấy chất lượng mẫu tinh dịch phụ thuộc

nhiều vào cách lấy mẫu tinh dịch. Lẫy mẫu bằng cách thủ dâm tại phòng

lấy mẫu ở cơ sở điều trị có thể có chất lượng kém hơn so với lấy mẫu tại

nhà bằng giao hợp có sử dụng bao cao su chuyên dụng (Zavos &

Goodpasture, 1989). Mặt khác, thời gian kích thích để lấy mẫu bằng thủ

dâm cũng ảnh hưởng đến chất lượng tinh dịch (Pound và cs, 2002).

Ngoài ra, chất lượng tinh dịch còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác

như: khả năng sinh tinh của tinh hoàn, dịch tiết của các tuyến phụ, thể



trạng, bệnh tật và thời gian kiêng xuất tinh. Cần ghi nhận thời gian kiêng

xuất tinh để diễn giải kết quả.

Kết quả xét nghiệm tinh dịch tại phòng thí nghiệm phụ thuộc vào

một số yếu tố sau:

Lƣợng mẫu tinh dịch thu đƣợc có trọn vẹn hay không: Khi

xuất tinh, những giọt tinh dịch đầu tiên có chứa rất nhiều tinh

trùng, trong khi phần còn lại chứa chủ yếu là dịch tiết từ túi tinh

(Björndahl & Kvist, 2003). Do đó, khi làm rơi vãi lượng tinh dịch

ban đầu sẽ ảnh hưởng rất lớn đến kết quả phân tích tinh dịch

hơn là làm rơi vãi lượng tinh dịch lúc sau.

Hoạt động của các tuyến phụ sinh dục: Mật độ tinh trùng

không đánh giá được khả năng sản xuất tinh trùng của tinh

hoàn vì nó bị ảnh hưởng bởi chức năng của các cơ quan sinh

dục khác. Tuy nhiên, tổng số tinh trùng được phóng ra (được

tính bằng cách nhân mật độ tinh trùng với thể tích tinh dịch)

phản ánh khả năng sinh tinh của tinh hoàn. Ví dụ: mật độ tinh

trùng trong tinh dịch của người trẻ và người lớn tuổi có thể

giống nhau, nhưng tổng số tinh trùng có thể khác nhau do thể

tích tinh dịch được sản xuất ra giảm theo tuổi (Ng và cs., 2004).

Thời gian kiêng quan hệ tình dục: Khi không xuất tinh, tinh

trùng được trữ trong mào tinh, sau đó tràn vào ống niệu đạo và

theo nước tiểu ra ngoài (Cooper và cs., 1993; De Jonge và cs.,

2004). Hình dạng và nhiễm sắc thể của tinh trùng không bị ảnh

hưởng bởi thời gian kiêng lâu ngày (Tyler và cs., 1982; De Jonge

và cs., 2004) trừ trường hợp có rối loạn chức năng mào tinh

(Correa Perez và cs., 2004).

Khoảng thời gian kiêng trƣớc đó: Dịch từ mào tinh không

hoàn toàn được xuất ra hết trong một lần xuất tinh, một số tinh



trùng vẫn còn lưu lại ở mào tinh kể từ lần xuất tinh trước

(Cooper và cs., 1993). Do đó sẽ ảnh hưởng đến chất lượng của

tinh trùng trong lần xuất tinh tiếp theo (Tyler và cs., 1982). Mức

độ ảnh hưởng của yếu tố này rất khó xác định và ít được quan

tâm đến.

Kích thƣớc tinh hoàn: Ảnh hưởng đến tổng số tinh trùng trong

một lần xuất tinh (Handelsman và cs., 1984; WHO, 1987; Behre

và cs., 2000; Andersen và cs., 2000). Kích thước tinh hoàn phản

ảnh mức độ hoạt động sinh tinh và từ đó ảnh hưởng đến hình

dạng tinh trùng (Holstein và cs., 2003).

Có rất nhiều yếu tố tác động đến kết quả xét nghiệm tinh dịch và

các yếu tố này không thể kiểm soát được vì thành phần tinh dịch của mỗi

người có thể thay đổi mạnh theo thời gian (Baker & Kovacs, 1985; Alvarez

và cs., 2003). Hình 1 cho thấy sự biến động về thành phần tinh dịch theo

thời gian của 5 nam giới tình nguyện trẻ, khoẻ mạnh tham gia vào nghiên

cứu phương pháp tránh thai bằng hormone cho nam (các mẫu tinh dịch

được xét nghiệm theo phương pháp do WHO đề nghị). Từ kết quả nghiên

cứu này, có thể rút ra một số kết luận sau:

Không thể đánh giá chất lượng tinh dịch của một người từ một

mẫu tinh dịch duy nhất.

Nên kiểm tra 2 hoặc 3 mẫu để ước lượng được mức chuẩn của

người đó. (Poland và cs., 1985; Berman và cs., 1996; Carlsen và

cs., 2004; Castilla và cs., 2006; Keel, 2006).

Trong một số nghiên cứu cho thấy không thể xác định khả năng

thụ tinh thông qua các số liệu đánh giá trên tổng tinh trùng trong một lần

xuất tinh.

Do đó, tinh dịch đồ chỉ cung cấp những thông tin cần thiết cho

điều trị lâm sàng đối với từng bệnh nhân. Để có được những dữ liệu có



giá trị và hữu ích thì các bước từ khâu thu mẫu đến phân tích cần phải

được thực hiện đúng theo quy trình chuẩn. Xét nghiệm được mô tả trong

sổ tay này là quy trình đã được chấp nhận bởi Tổ chức Y tế Thế giới

(WHO) và đang được triển khai ở hầu hết các trung tâm hỗ trợ sinh sản

trong và ngoài nước.

Hình 1: Sự biến động về tổng số tinh trùng và mật độ tinh trùng qua

khoảng thời gian 1,5 năm.



PHẦN II : QUY TRÌNH

NHẬN MẪU



Hướng dẫn bệnh nhân làm xét nghiệm

Hướng dẫn bệnh nhân lấy mẫu

Nhận và kiểm tra mẫu thử

Hẹn thời gian trả kết quả

QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM TINH DỊCH ĐỒ

A. Hƣớng dẫn bệnh nhân làm xét nghiệm

Bệnh nhân trước khi làm tinh dịch đồ phải xét nghiệm bilan nhiễm

trùng (các bệnh lây nhiễm: HIV, HbsAg, BW):

Nếu kết quả âm tính, hướng dẫn bệnh nhân lấy mẫu tinh dịch.

Nếu kết quả dương tính, hướng dẫn bệnh nhân gặp bác sĩ tư

vấn.

Ghi thông tin bệnh nhân:

Họ, tên, năm sinh của chồng và vợ

Số ngày kiêng xuất tinh

Cấp phát lọ lấy mẫu cho bệnh nhân

Yêu cầu bệnh nhân kiểm tra tên tuổi được ghi trong lọ.

B. Hƣớng dẫn bệnh nhân lấy mẫu

I. Chuẩn bị lấy mẫu

Mẫu tinh dịch được thu thập tại một phòng được thiết kế riêng.

Phòng này gần phòng xét nghiệm để hạn chế sự thay đổi nhiệt độ đột

ngột của mẫu và để kiểm soát khoảng thời gian giữa thu nhận mẫu và bắt

đầu phân tích tinh dịch.

Hướng dẫn bệnh nhân cách lấy mẫu bằng lời nói rõ ràng, ngoài ra

yêu cầu bệnh nhân xem các bảng hướng dẫn được treo trong phòng lấy



tinh dịch. Nhấn mạnh với bệnh nhân rằng cần phải lấy trọn vẹn mẫu tinh

dịch được xuất ra, nếu có rơi vãi thì phải báo lại với nhân viên y tế.

Mẫu nên được thu nhận sau khi kiêng xuất tinh tối thiểu là 2 ngày

và tối đa là 7 ngày (tốt nhất là từ 3-5 ngày).

Nếu thời gian kiêng quá ngắn thì mẫu tinh trùng thu được có

khả năng chứa nhiều tinh trùng non, số lượng ít.

Ngược lại, nếu thời gian kiêng quá lâu, mẫu thu được sẽ có số

lượng nhiều nhưng chất lượng kém do chứa nhiều tinh trùng

già yếu và tinh trùng chết.

Chú ý:

Tại thời điểm lấy mẫu, bệnh nhân không bị sốt, không hút thuốc,

không uống rượu, bia.

Số ngày kiêng xuất tinh nên giống nhau ở các lần xét nghiệm tiếp

theo (nếu có).

II. Yêu cầu khi lấy mẫu

Hướng dẫn bệnh nhân thực hiện theo các bước sau đây:

1. Đi tiểu sạch

2. Rửa tay và dương vật với xà phòng, tránh lây nhiễm vi khuẩn trên

da vào mẫu.

3. Rửa sạch lại với nước

4. Lau khô tay và dương vật bằng khăn sử dụng một lần

5. Tự kích thích bằng tay (thủ dâm) và xuất tinh vào lọ vô trùng để lấy

mẫu.

6. Chuyển lọ có chứa mẫu tinh dịch cho nhân viên xét nghiệm.

III. Thu thập mẫu tinh dịch trong chẩn đoán hoặc

nghiên cứu

Mẫu cần được thu nhận bằng thủ dâm và xuất tinh vào trong lọ

chứa sạch. Lọ chứa mẫu cần được giữ ở nhiệt độ từ 20oC đến 37oC, tránh



những thay đổi của nhiệt độ làm ảnh hưởng đến tinh trùng đã được xuất

tinh vào đó.

Ghi lại thời gian xuất tinh và thời gian nhận mẫu.

Đặt lọ chứa mẫu ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ ấm ở 37oC.

Chú ý:

Lọ đựng mẫu phải là lọ tiệt trùng, làm từ chất liệu nhựa đặc biệt,

không gây độc cho tinh trùng, có miệng rộng để thu tinh dịch dễ dàng,

tránh rơi vãi ra ngoài. Chỉ nên sử dụng lọ do phòng xét nghiệm cung cấp

và chỉ sử dụng một lần.

Kiểm tra lọ chứa mẫu có độc cho tinh trùng hay không

Thu nhận nhiều mẫu với mật độ tinh trùng cao và di động tốt. Để một nửa

mẫu trong lọ chuẩn (không độc) và nửa còn lại đựng trong lọ cần được

kiểm tra. Đánh giá độ di động của tinh trùng trong 2 lọ sau mỗi giờ ở

nhiệt độ phòng hoặc ở 37oC, đánh giá trong vòng 4 giờ. Nếu không có sự

khác biệt giữa 2 mẫu (P > 0,05) thì lọ cần kiểm tra đó được coi là không

độc đối với tinh trùng.

IV. Thu mẫu vô trùng cho mục đích hỗ trợ sinh sản và

xét nghiệm sinh hóa

Trong trường hợp này cần phải tránh nhiễm sinh hoá từ các nguồn

lây nhiễm khác (ví dụ: vi khuẩn trên da). Lọ chứa mẫu, đầu tip và pipette

trộn mẫu phải vô trùng. Người thực hiện cần tôn trọng những nguyên tắc

vô trùng. Nếu nghĩ mẫu có nguy cơ nhiễm thì xem như đã nhiễm.



V. Thu mẫu tinh dịch tại nhà

Mẫu có thể được thu nhận tại nhà trong một số trường hợp ngoại

lệ như: bệnh nhân không thể lấy mẫu bằng thủ dâm trong phòng lấy tinh

trùng hoặc không có đủ điều kiện để lấy mẫu gần phòng xét nghiệm.

Hướng dẫn rõ ràng cho bệnh nhân về cách lấy mẫu và vận chuyển

mẫu tinh dịch. Cần nhấn mạnh rằng mẫu phải được thu thập hoàn toàn

vào lọ chứa và bệnh nhân phải báo lại nếu có làm rơi vãi mẫu. Ghi chú vào

phiếu trả kết quả nếu mẫu không được thu nhận hoàn toàn.

Bệnh nhân cần ghi nhận thời gian xuất tinh và chuyển mẫu đến

phòng thí nghiệm trong vòng 1 giờ.

Trong suốt quá trình vận chuyển đến phòng thí nghiệm, mẫu cần

phải được giữ ở nhiệt độ 20oC – 37oC.

Ghi chú vào phiếu trả kết quả là mẫu lấy ở nhà hoặc ở nơi khác

ngoài phòng xét nghiệm.

VI. Thu mẫu tinh dịch bằng bao cao su

Mẫu chỉ có thể được lấy vào bao cao su bằng cách giao hợp trong

những trường hợp đặc biệt như bệnh nhân không thể lấy mẫu bằng thủ

dâm.

Chỉ sử dụng bao cao su được thiết kế riêng để chứa tinh

trùng (khác với các loại bao cao su ngoài thị trường, loại bao

cao su này không có chất kháng tinh trùng).

Hướng dẫn bệnh nhân cách sử dụng bao cao su, đóng gói

và gửi hoặc vận chuyển đến phòng xét nghiệm.

Bệnh nhân cần phải ghi nhận thời gian xuất tinh và chuyển

mẫu tới phòng xét nghiệm trong vòng 1 giờ.

Trong suốt quá trình vận chuyển đến phòng xét nghiệm,

mẫu cần phải được giữ ở nhiệt độ 20oC – 37oC.



Ghi chú vào phiếu trả kết quả những mẫu lấy bằng bao cao su qua

giao hợp ở nhà hoặc ở nơi khác ngoài phòng xét nghiệm.

C. Nhận và kiểm tra mẫu tinh dịch

Kiểm tra tên, tuổi bệnh nhân. Ghi lại nếu không rõ.

Cho bệnh nhân kí tên xác nhận là đã giao mẫu của chính bệnh

nhân.

Kiểm tra thể tích xuất tinh:

Nếu thể tích xuất tinh ≥ 1ml: để mẫu vào tủ ấm chờ ly giải.

Nếu thể tích xuất tinh < 1ml: nếu bệnh nhân có làm rơi vãi

mẫu tinh dịch ra ngoài hoặc những lần xuất tinh trước nhiều

hơn mẫu tinh dịch lấy được thì hẹn bệnh nhân lấy mẫu lại.

Chú ý:

Ghi nhận vào phiếu trả kết quả nếu mẫu bị rơi vãi. Yêu cầu bệnh

nhân nên xét nghiệm lại sau 3 – 5 ngày.

Đề nghị 2:

Không nên thu nhận mẫu tinh dịch bằng phương pháp giao

hợp gián đoạn vì những giọt tinh dịch đầu tiên chứa rất nhiều tinh

trùng nhất có thể bị thất thoát. Ngoài ra, mẫu có thể bị nhiễm tế bào

lạ hoặc vi khuẩn và pH thấp của dịch nhầy âm đạo, có thể ảnh hưởng

đến độ di động của tinh trùng.

Đề nghị 1:

Không được sử dụng bao cao su thông thường để đựng mẫu vì

chúng có chứa các tác nhân ảnh hưởng đến độ di động của tinh trùng

(Jones và cs., 1986).



Ghi nhận những thông tin sau đây vào phiếu trả kết quả:

Họ và tên bệnh nhân, năm sinh, thời gian kiêng, ngày và giờ lấy mẫu, có

lấy mẫu hoàn toàn hay không, khó khăn khi lấy mẫu, và thời gian từ lúc

mẫu được thu nhận đến lúc xét nghiệm.

D. Hẹn thời gian trả kết quả

Hẹn thời gian và trả kết quả đúng hẹn cho Bệnh nhân.

Rơi vãi?

Lần xuất tinh trước?

Kiểm tra thể tích

Nhiều (V ≥ 1 ml) Ít (V < 1 ml)

Để mẫu vào tủ

ấm ở 370C Có Không

Lấy mẫu lại Ít Nhiều (V ≥ 1 ml)

Quy trinh kiêƤm tra thêƤ tich mâu



PHẦN III :

PHÂN TÍCH TINH DỊCH



A. Thời điểm phân tích mẫu

Đặt lọ đựng mẫu trong tủ ấm ở 37oC và theo dõi thời gian ly giải

của tinh dịch. Mẫu tinh dịch được khảo sát cả về số lượng lẫn chất lượng

tại phòng xét nghiệm trong vòng 1 giờ sau khi nhận mẫu.

An toàn khi thao tác trên mẫu

Mẫu thử có thể chứa nhiều tác nhân gây hại như HIV, Hepatitis virus,

BW,…Do đó, nhân viên xét nghiệm cần phải tuân thủ nghiêm ngặt các

thao tác vô trùng. Đây chính là nguyên tắc an toàn cơ bản trong phòng

xét nghiệm (WHO 2004).

B. Quy trình phân tích tinh dịch:

Trong 5 phút đầu:

Đặt lọ chứa mẫu trong tủ ấm (37oC) để ly giải.

Giữa 30 phút và 60 phút:

Quan sát và đánh giá sự ly giải của tinh dịch.

Đo thể tích tinh dịch.

Đo pH của tinh dịch (nếu cần).

Làm tiêu bản ướt để đánh giá độ di động của tinh trùng và

xác định độ pha loãng cần thiết để đánh giá mật độ tinh

trùng.

Đánh giá tỷ lệ sống/chết của tinh trùng (nếu tỷ lệ phần trăm

của các tinh trùng di động tiến tới thấp).

Pha loãng tinh dịch để đánh giá mật độ tinh trùng.

Đánh giá tổng số tinh trùng.

Thực hiện thử nghiệm gắn hạt miễn dịch MAR (Mixed

Antiglobulin Reaction) (nếu cần).



Đánh giá các tế bào có hoạt tính peroxidase (nếu có sự xuất

hiện của các tế bào tròn).

Ly tâm tinh dịch (nếu không tìm thấy tinh trùng trên tiêu bản

ướt).

Trong 3 giờ:

Gửi mẫu đến phòng thí nghiệm vi sinh (nếu cần).

Trong 4 giờ:

Tạo tiêu bản, nhuộm và đánh giá hình dạng của tinh trùng.

Chú ý:

Khoảng thời gian từ lúc lấy mẫu tinh dịch và thời điểm bắt đầu

phân tích không nên kéo dài quá 3 giờ.

C. Khảo sát đại thể

Nên tiến hành phân tích tinh dịch ngay sau khi mẫu ly giải, thường

là 30 phút, nhưng không quá 1 giờ sau khi xuất tinh để tránh hiện tượng

mất nước hoặc sự thay đổi nhiệt độ làm ảnh hưởng đến chất lượng mẫu

tinh dịch.

I. Tính chất tổng quát

Bình thường: Tinh dịch đồng nhất, màu trắng hoặc xám đục.

Tinh dịch màu vàng: mẫu nhiễm trùng, có lẫn nước tiểu hoặc do

đang uống một số loại vitamin.

Tinh dịch màu đỏ nâu hoặc hồng: mẫu có lẫn hồng cầu.

Tinh dịch loãng, trắng trong: thường là thiểu tinh hoặc vô tinh.

Tinh dịch có cặn nhiều: có thể do viêm nhiễm đường tiết niệu.

II. Sự ly giải

Sự ly giải là sự tự hóa lỏng của tinh dịch sau khi xuất tinh. Ngay sau

khi xuất tinh vào lọ chứa, tinh dịch thường ở thể thạch đặc. Vài phút sau



đó ở nhiệt độ phòng, tinh dịch bắt đầu ly giải (trở nên lỏng hơn). Tại thời

điểm này có thể thấy một hỗn hợp các mảnh thạch nhỏ trong tinh dịch.

Khi sự ly giải tiếp diễn, tinh dịch trở nên đồng nhất hơn và lỏng hơn, và

trong giai đoạn cuối thì chỉ còn những vùng thạch nhỏ còn sót lại.

Tinh dịch ly giải là do các enzyme của tiền liệt tuyến tiết ra. Thường

thì sau khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng, tinh dịch sẽ ly giải hoàn toàn,

đôi khi quá trình này cũng có thể kéo dài đến 60 phút hoặc hơn. Thời gian

ly giải kéo dài thường do các bất thường ở tuyến tiền liệt.

Ở mẫu chưa ly giải thường thấy những hạt lợn cợn giống như

thạch ở đáy lọ.

Cách đánh giá:

Đặt lọ đựng mẫu vào tủ ấm 37oC, sau 15 phút kiểm tra sự ly giải

bằng cách lắc nhẹ. Nếu mẫu chưa ly giải hoàn toàn thì tiếp tục ủ ấm thêm

15 phút nữa. Sau 30 phút tinh dịch chưa ly giải thì kiểm tra lại 1 lần nữa

sau 30 phút tiếp theo. Nếu tinh dịch không ly giải hoàn toàn sau 60 phút

thì ghi nhận mẫu không ly giải vào phiếu trả kết quả.

Chú ý 1:

Những mẫu ly giải bình thường có thể chứa các hạt giống thạch

(thể gelatin) không ly giải và không có ảnh hưởng đáng kể trong lâm

sàng.

Chú ý 2:

Quá trình ly giải cũng có thể quan sát được trong khảo sát vi thể

khi thấy tinh trùng bất động có khả năng di động khi tinh dịch ly giải. Do

đó, nếu quan sát thấy hiện tượng này thì cần để thêm một thời gian để

quá trình ly giải diễn ra hoàn toàn.



Chú ý 3:

Trong quá trình ly giải, nếu trộn nhẹ nhàng liên tục hoặc lắc đều

mẫu trong lọ trên máy lắc ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ ấm ở 37oC có

thể thúc đẩy quá trình ly giải mẫu.

Chú ý 4:

Nếu quá trình ly giải không xảy ra trong 60 phút thì chủ động cho

mẫu theo các cách sau:

Thêm một lượng thể tích môi trường sinh lý bằng với thể tích

tinh dịch rồi dùng pipette hút lên xuống nhiều lần.

Dùng bơm kim tiêm 18G (đường kính trong 0,84mm) hoặc 19G

(đường kính trong 0,69mm) hút lên – xuống nhẹ nhàng nhiều

lần (6-10 lần).

III. Độ nhớt

Ngược lại với các mẫu chưa ly giải hoàn toàn, mẫu tinh dịch nhớt là

một dung dịch đồng nhất, kết dính và độ nhớt không thay đổi theo thời

gian. Sau khi ly giải, độ nhớt của tinh dịch được đánh giá bằng cách hút

tinh dịch vào một pipette nhựa dùng một lần (có đường kính khoảng 1.5

mm), rồi để tinh dịch nhỏ giọt theo trọng lực, sau đó quan sát chiều dài

của giọt.

Đề nghị :

Các phương pháp trên có thể ảnh hưởng đến đặc tính sinh hoá,

độ di động và hình dạng của tinh trùng, do đó cần ghi nhận vào phiếu

trả kết quả khi sử dụng các phương pháp này. Khi pha loãng tinh dịch

với môi trường, cần tính đến hệ số pha loãng khi đếm mật độ tinh

trùng.



Bình thường: giọt tinh dịch nhỏ rời rạc từng giọt.

Bất thường: tinh dịch dính chặt vào nhau khi cố dùng pipette hút

lên, giọt tinh dịch kéo dài trên 2cm.

Ngoài ra còn có thể đánh giá độ nhớt bằng cách nhúng que thủy

tinh vào mẫu và quan sát chiều dài giọt tinh dịch rơi ra từ que. Mẫu có độ

nhớt bất thường khi có giọt kéo dài trên 2cm.

Chú ý :

Độ nhớt cao thường do bất thường dịch của các tuyến phụ tiết ra.

Điều này gây khó khăn cho việc đánh giá tỉ lệ di động và mật độ tinh

trùng. Do đó, có thể làm giảm độ nhớt bằng cách xử lí giống như mẫu ly

giải chậm hay không ly giải.

IV. Thể tích

Cần đo lường chính xác thể tích tinh dịch để tính toán tổng số tinh

trùng và tế bào lạ trong một lần xuất tinh. Có 2 cách đo thể tích tinh dịch:

Đo bằng pipette (hay ống nghiệm có chia vạch): Hút mẫu từ lọ

vào pipette, đọc thể tích. Tuy nhiên phương pháp này có thể không

chính xác do tinh dịch còn sót lại trong lọ. Sai lệch thể tích nằm

trong khoảng 0,3 - 0,9ml. (Brazil và cs., 2004a; Iwamoto và cs., 2006;

Cooper và cs., 2007).

Đo bằng cách cân mẫu trong lọ:. Đây là cách đo thể tích tốt nhất,

cách thực hiện như sau:

1. Cân lọ trước khi lấy mẫu

2. Cân lọ có đựng mẫu

3. Trừ cân nặng của lọ

4. Thể tích của mẫu là số gam của tinh dịch. (Khối lượng riêng tinh

dịch dao động trong khoảng 1.043 và 1.102 (Cooper và cs., 2007)).

Giá trị tham khảo của thể tích (chuẩn theo WHO 2010): 1,5 ml.



Chú ý 1:

Lọ đựng mẫu có thể có khối lượng khác nhau, do đó cần cân lần

lượt từng lọ trước khi đưa cho bệnh nhân. Sử dụng bút lông kim không

xóa được để viết lên lọ hoặc lên nhãn. Nếu sử dụng nhãn thì phải dán

nhãn lên lọ, sau đó cân khối lượng của lọ trước khi lấy mẫu.

Chú ý 2:

Thể tích tinh dịch ít có thể do tắc hoặc thiếu ống dẫn 2 bên bẩm

sinh (CBAVD) (de la Taille và cs., 1998; Daudin và cs., 2000; von Eckardstein

và cs., 2000; Weiske và cs., 2000)

Thể tích tinh dịch ít cũng có thể do bệnh nhân làm rơi vãi mẫu, xuất

tinh ngược dòng một phần hoặc do thiếu hụt androgen.

Chú ý 3:

Thể tích tinh dịch nhiều có thể do sự rỉ ứ trong các trường hợp

viêm cơ quan sinh dục phụ hay do thời gian kiêng xuất tinh quá lâu.

V. pH

pH của tinh dịch phản ánh sự cân bằng pH của các dịch tiết từ các

tuyến khác nhau, chủ yếu là dịch tiết túi tinh (baz) và dịch tiết tuyến tiền

liệt (acid). pH nên được đo sau khi ly giải, thường là 30 phút nhưng không

được quá 1 giờ sau xuất tinh vì mẫu bị mất CO2 sau khi xuất tinh, ảnh

hưởng đến đánh giá.

pH được đo vào một thời điểm nhất định trong vòng 1 giờ sau khi

xuất tinh. Đối với mẫu bình thường, sử dụng giấy pH có thang chia độ từ

6.0 đến 10.0:

Trộn đều mẫu.

Nhỏ 1 giọt tinh dịch lên giấy quỳ.



Đợi màu giấy quỳ đồng nhất (< 30 giây).

So sánh màu của giấy quỳ với thang đo pH và đọc pH.

Theo WHO 2010, mẫu tinh dịch bình thƣờng có pH từ 7,2 trở

lên.

Chú ý 1:

pH tinh dịch tăng theo thời gian do sự giảm dung dịch đệm tự

nhiên, do đó giá trị pH có thể cung cấp một số thông tin hữu ích cho lâm

sàng.

Chú ý 2:

Nếu mẫu tinh dịch có pH < 7,0, cùng với thể tích và số lượng tinh

trùng thấp thì có thể do tắc hoặc thiếu ống dẫn tinh bẩm sinh (de la Taille

và cs., 1998; Daudin và cs., 2000; von Eckardstein và cs., 2000; Weiske và

cs., 2000).

D. Khảo sát vi thể

I. Trộn mẫu

Trước khi lấy một mẫu tinh dịch để đánh giá vi thể cần phải trộn

đều mẫu trong lọ chứa nhưng không được quá mạnh và tránh tạo bọt khí.

Có thể sử dụng pipette nhựa dùng một lần (sử dụng pipette vô trùng nếu

cần) với đường kính đầu ống khoảng 1,5 mm, hút lên xuống khoảng 10

lần.

Ở mẫu tinh dịch có độ nhớt cao, rất khó trộn đều mẫu để tạo tiêu

bản ướt. Nếu mẫu không được trộn kỹ, khi quan sát trên 2 tiêu bản khác

nhau sẽ nhận thấy sự khác biệt về độ di động, tỷ lệ sống, mật độ cũng

như hình dạng tinh trùng.



Chú ý

Không được trộn mẫu bằng máy vortex ở tốc độ cao vì sẽ làm tổn

thương tinh trùng.

II. Tạo tiêu bản ướt

1. Trộn đều mẫu.

2. Hút một thể tích tinh dịch chuẩn (10 μl) nhỏ ngay lên lame sau khi

trộn, không để cho tinh trùng lắng trở lại.

3. Trộn lại một lần nữa khi lấy thêm mẫu tiếp theo.

4. Đậy lame bằng lamelle, tạo thành một buồng đếm có độ sâu

khoảng 20 μm (ví dụ sử dụng lamelle 22mm x 22mm cho giọt tinh

dịch có thể tích là 10 μl). Trọng lượng của lamelle sẽ trải đều mẫu.

5. Cẩn thận, tránh tạo bọt khí giữa lame và lamelle.

6. Đánh giá tiêu bản ướt ngay khi dịch bên trong ổn định (khoảng 60

giây).

7. Đánh giá mẫu ở nhiệt độ phòng (24 - 26oC). Có thể sử dụng kính

hiển vi có bàn ấm ở 37oC để đánh giá.

8. Kiểm tra sự phân bố của tinh trùng trên 2 tiêu bản ướt. Nếu sự

phân bố này là đều, tiến hành đánh giá vi thể. Ngược lại, nếu có

khác biệt lớn giữa 2 tiêu bản thì làm lại 2 tiêu bản mới.

Chú ý :

Nếu độ sâu của buồng thấp hơn 20 μm sẽ kiềm hãm sự di động

của tinh trùng, quá sâu (>20 μm) sẽ khó đánh giá vì tinh trùng di chuyển

vào/ra vùng quan sát ngoài tầm kiểm soát . Nếu các tinh trùng phân bố

không đều trên nhiều vi trường, cần làm lại tiêu bản khác do mẫu thử

chưa được trộn đều hay do ly giải, độ nhớt bất thường hoặc có hiện

tượng kết dính, kết đám.



Độ sâu của tiêu bản ƣớt

Độ sâu của 1 tiêu bản (D, μm) được tính bằng cách chia thể tích mẫu (V,

μl) cho vùng diện tích mẫu bị bao phủ (A, mm2): D = V/A. Ví dụ, với thể

tích 10 μl tinh dịch trải trên lame với lamelle 22mm x 22mm (diện tích

484mm2) tạo ra một buồng có chiều sâu 20,7μm; với thể tích 6,5 μl tinh

dịch trải trên lame với lamelle 18mm x 18mm (diện tích 324mm2) tạo ra

một buồng có chiều sâu 20,1μm.

III. Đánh giá tổng quát

Sử dụng kính hiển vi quang học để đánh giá tinh dịch trên tiêu bản

tươi. Đầu tiên, đánh giá ở độ phóng đại x100 (x10 vật kính và x10 thị kính).

Cách đánh giá này giúp ta quan sát tổng thể về mẫu thử:

Sự hình thành vệt nhầy

Sự kết dính hoặc kết đám của tinh trùng

Sự hiện diện của các tế bào không phải tinh trùng như: tế bào

biểu mô, bạch cầu, tinh trùng non, đầu hoặc đuôi tinh trùng.

Đánh giá độ di động của tinh trùng.

Xác định nồng độ pha loãng cần thiết để đếm mật độ tinh

trùng.

1. Sự kết đám (aggregation)

Khi những tinh trùng di động, tinh trùng bất động cùng với các tế

bào khác hoặc mảnh vụn tế bào tụ lại với nhau thì gọi là sự kết đám,

nguyên nhân của hiện tượng kết đám thường do nhiễm trùng.



Hình 2 Sự kết đám không đặc hiệu của tinh trùng trong tinh dịch

Hình ảnh tinh trùng kết đám với tế bào biểu mô (a), mảnh vụn (b)

hoặc tinh trùng (c,d).

2. Sự kết dính (agglutination)

Kết dính là hiện tượng các tinh trùng di động dính vào nhau: đầu

dính đầu, đuôi dính đuôi hoặc dính cả đầu và đuôi lẫn lộn. Đuôi tinh trùng

thường di động mạnh, lắc mạnh nhưng khi tinh trùng bị kết dính quá chặt

thì cử động của chúng sẽ bị hạn chế.

Loại kết dính chính (phản ảnh mức độ kết dính (từ 1-4) và vị trí kết

dính (A-E) ) cần được ghi nhận trong bảng kết quả (Rose và cs., 1976)

(Hình 3):

Các hình thức kết dính:

A. Đầu – đầu.

B. Đuôi – đuôi (đầu di động tự do).

C. Chóp đuôi – chóp đuôi.

D. Hỗn hợp: đầu – đầu đồng thời đuôi – đuôi.

E. Quấn nhau: đầu và đuôi đan vào thành mạng lưới.

Các mức độ kết dính:

Loại 1 Tách biệt <10 tinh trùng/kết dính, nhiều tinh trùng tự do

Loại 2 Vừa phải 10 – 50 tinh trùng/kết dính, có tinh trùng tự do

Loại 3 Lớn >50 tinh trùng/kết dính, vài tinh trùng tự do

Loại 4 Toàn bộ Tất cả tinh trùng bị kết dính và kết dính nối liền



Loại 1 Loại 2 Loại 3 Loại 4

A

B

C

D

E

Hình 3: Biểu đồ về sự phân loại kết dính

Hiện tượng kết dính xảy ra do nguyên nhân tự miễn, thường gặp

trong trường hợp thắt ống dẫn tinh. Khi hàng rào máu-tinh hoàn được tạo

bởi tế bào Sertoli bị phá vỡ, tinh trùng tiếp xúc với tế bào máu, tạo nên

kháng thể phù hợp kháng nguyên bề mặt tinh trùng. Phản ứng kháng

nguyên – kháng thể sẽ gây ra sự kết dính các tinh trùng di động với nhau.

Tuy nhiên, cưa có đầy đủ chứng cứ ch thấy hiện tượng kết dính do tự

miễn có là nguyên nhân của vô sinh hay không, cần phải thực hiện các thử

nghiệm sâu hơn.



Chú ý :

Tinh trùng di động bị kẹt với các tế bào, mảnh vụn hoặc tinh trùng

không di động dính với nhau là hiện tượng kết đám, không được coi là kết

dính.

3. Các tế bào lạ

Trong tinh dịch, ngoài tinh trùng có thể chứa các tế bào khác. Một

số tế bào này có thể lien quan đến đánh giá lâm sang, bao gồm tế bào

biểu mô từ tuyến niệu sinh dục, vi khuẩn, vi sinh vật, hồng cầu, bạch cầu

và tinh trùng non. Bạch cầu và tinh trùng non còn được gọi là tế bào tròn

(Johanisson và cs., 2000).

Có thể phân loại các tế bào này bằng cách đánh giá trên tiêu bản

nhuộm hoặc sử dụng phản ứng peroxidase để xác định số lượng và phân

biệt rõ hơn.

IV. Đánh giá độ di động của tinh trùng

Độ di động là kết quả khảo sát khả năng di động tự nhiên của tinh

trùng, được thể hiện thành tỷ lệ phần trăm trên tổng số tinh trùng trong

cùng một thể tích. Tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới được cho là liên quan

đến tỷ lệ có thai nên cần đánh giá chính xác.

Đề nghị :

Nên đánh giá độ di động ngay sau khi tinh dịch ly giải hoàn

toàn để hạn chế ảnh hưởng của sự mất nước, thay đổi pH hay nhiệt

độ lên di động của tinh trùng. Thời gian ly giải thường từ 30 - 60 phút

sau xuất tinh.



1. Phân loại di động của tinh trùng

Độ di động của tinh trùng được phân thành 3 loại như sau:

Di động tiến tới (PR_Progessive): Tinh trùng di động tiến tới theo

một đường thẳng hoặc theo 1 vòng lớn.

Di động không tiến tới (NP_Non-Progessive): tinh trùng di

chuyển nhưng không tiến tới như bơi trong vòng nhỏ, di

chuyển khó khăn hoặc chỉ thấy đuôi cử động.

Không di động (IM_Immotile): tinh trùng bất động.

Chú ý :

Khi xem xét, bàn luận về độ di động tinh trùng thì tổng số di động

(PR + NP) hay di động tiến tới (PR) là đại lượng quan trọng

2. Cách đánh giá độ di động của tinh trùng

a. Cách đánh giá độ di động

1. Tạo 2 tiêu bản ướt cho mỗi mẫu với độ sâu khoảng 20μm.

2. Chờ mẫu ổn định (khoảng 60 giây).

3. Đếm tinh trùng ở vùng cách cạnh lamelle 5mm trở lên (hình 4) để

tránh quan sát vùng bị khô.

4. Bắt đầu đánh giá nhanh một vi trường bất kỳ, không đợi tinh trùng

bơi vào vùng đếm.

5. Đánh giá độ di động của tất cả các tinh trùng trong ở cùng một vị

trí trong vi trường.

6. Đếm PR trước, sau đó đếm NP và cuối cùng là IM trong cùng một

phần ô. Khi đã có kinh nghiệm thì có thể đánh giá cả 3 loại tinh

trùng cùng một lúc và đánh giá trên vùng vi trường rộng.

7. Thay đổi vùng đếm liên tục. Tránh chọn những vùng chỉ thấy tinh

trùng di động (phải chọn ngẫu nhiên). Không nên đợi tinh trùng

bơi vào vùng đánh giá mới đếm.



8. Đếm số lượng tinh trùng của mỗi loại bằng máy đếm phòng thí

nghiệm.

9. Đếm ít nhất 200 tinh trùng trong ít nhất 5 vi trường ở mỗi tiêu bản

để hạn chế sai số mẫu, trong khoảng cho phép.

10. Đếm 2 lần trên 2 tiêu bản khác nhau, so sánh kết quả của 2 tiêu

bản. Nếu 2 kết quả có độ sai biệt trong giới hạn cho phép thì lấy

trung bình kết quả đó, nếu độ sai biệt lớn thì làm lại tiêu bản mới.

11. Tính phần trăm trung bình và độ sai biệt giữa 2 tiêu bản.

12. Chọn tỉ lệ trung bình cao nhất trong 3 loại để so với độ sai biệt cho

phép.

13. Nếu độ sai biệt vượt quá số cho phép: tạo tiêu bản khác, đánh giá

lại.

14. Nếu độ sai biệt chấp nhận được: lấy kết quả là tỉ lệ trung bình của

PR, NP, IM (làm tròn đến 0,5%)

Hình 4 Đánh giá độ di động

(a) Thị kính có ô kẻ giúp đếm tinh trùng di động và không di động

dễ dàng hơn

(b) Chọn vi trường đếm tinh trùng, cách mép ít nhất 5mm.



Bảng 1: Tỷ lệ khác biệt cho phép giữa tỷ lệ trung bình và khác biệt giữa 2

lần đếm

Tỷ lệ trung

bình (%)

Khác biệt

cho phép

Tỷ lệ trung

bình (%)

Khác biệt

cho phép

0 1 66 - 76 9

1 2 77 - 83 8

2 3 84 - 88 7

3 – 4 4 89 - 92 6

5 – 7 5 93 - 95 5

8 - 11 6 96 - 97 4

12 - 16 7 98 3

17 - 23 8 99 2

24 - 34 9 100 1

35 - 65 10

Chú ý 1:

Chỉ đếm những tinh trùng còn nguyên vẹn, không đếm tinh trùng

đầu kim di động.

Nếu mật độ tinh trùng nhiều thì đánh giá trên một vùng giới hạn

của vi trường, nếu mật độ ít nên đánh giá trên toàn bộ vi trường. Nếu

đếm hết vi trường mà vẫn chưa đủ 200 tinh trùng thì ta di chuyển sang vi

trường khác cách vi trường vừa đếm khoảng 1,5 vi trường



Chú ý 2:

Khi đếm đủ 200 tinh trùng trước khi tất cả các loại di động còn lại

trong vi trường chưa được đếm hết thì phải tiếp tục đếm, sau đó tính ra

phần trăm các loại di động.

Để tránh đếm thừa tinh trùng di động thì ta đảo thứ tự phân tích

(NP và IM trước), sử dụng thị kính có kẻ ô và tránh đậy lamelle xiên.

Trong một vài trường hợp đặc biệt, với mẫu không đồng nhất, có

sự khác biệt giữa 2 tiêu bản vượt qua giới hạn cho phép mặc dù đã tạo

tiêu bản thứ 3. Lúc này, ta tính trung bình các tiêu bản và ghi chú vào kết

quả.

b. Cách tính sai số

Tỷ lệ phần trăm được làm tròn đến hang đơn vị. Đối với trường hợp

phần thập phân của tỷ lệ phần trăm là 0.5% thì thực hiện làm tròn 0.5%

đến số chẳn gần nhất. Ví dụ: 32,5% làm tròn thành 32% nhưng 3,5% làm

tròn thành 4%. Lưu ý rằng tổng phần trăm làm tròn có thể không bằng

100%.

Nếu sự sai biệt về tỷ lệ phần trăm giữa 2 tiêu bản nhỏ hơn hoặc

bằng số liệu ở bảng 1 thì số liệu đó được chấp nhận và lấy phần trăm

trung bình làm kết quả.

Sự sai biệt lớn hơn cho phép có thể do đếm nhầm hoặc do hút sai,

hay do mẫu chưa được trộn đều. Khi đó phải bỏ tiêu bản này và đánh giá

lại bằng cách tạo tiêu bản mới (Không đếm tiêu bản thứ 3 rồi lấy trung

bình 3 giá trị hoặc lấy trung bình của 2 số liệu gần giống nhau nhất.)

Ví dụ 1: Khi đếm 200 tinh trùng trên 2 tiêu bản khác nhau qua 2

lần đếm ta được kết quả như sau:

Đếm lần 1: PR là 30%, NP là 5% và IM là 65%




Loại chiếm nhiều nhất là IM, ta tính tỷ lệ phần trăm trung bình là

50% ((65% + 35%)/2), và sai khác giữa 2 lần đếm là 30% (65% - 35%). Tra

với số khác biệt cho phép trong bảng 1 ở 50% là 10%. Vậy kết quả này

không chấp nhận được, làm lại tiêu bản khác để đánh giá lại.

Ví dụ 2: Đếm 200 tinh trùng trên 2 tiêu bản khác nhau qua 2 lần

đếm ta được kết quả như sau:



Loại chiếm nhiều nhất là IM, ta tính tỷ lệ phần trăm trung bình là

63%, và sai khác giữa 2 lần đếm là 6%. Tra với số khác biệt cho phép trong

bảng 1 ở 60% là 10%. Vậy sự khác biệt là chấp nhận được, độ di động của

tinh trùng trong trường hợp này là: PR 32%, NP 4%, IM 63%.

V. Đánh giá tỉ lệ sống của tinh trùng

Tỷ lệ tinh trùng sống trong mẫu được đánh giá thông qua tính

nguyên vẹn của màng tế bào tinh trùng.

Tỷ lệ sống của tinh trùng được đánh giá bằng các phương pháp

nhuộm hoặc dùng dung dịch nhược trương. Tinh trùng sống có khả năng

kháng thuốc nhuộm hay căng phồng trong dung dịch nhược trương.

Đề nghị 1 :

Tỷ lệ sống của tinh trùng nên được đánh giá ngay khi mẫu ly

giải xong (từ 30 phút đến 1 giờ sau xuất tinh) để tránh sự ảnh hưởng

của mất nước hoặc thay đổi nhiệt độ lên sự sống của tinh trùng.



Chú ý:

Tỷ lệ sống của tinh trùng rất quan trọng đối với lâm sàng trong

trường hợp tinh trùng bất động hoàn toàn trong mẫu:

Tỷ lệ tinh trùng sống lớn nhưng bất động: có khiếm khuyết cấu

trúc đuôi tinh trùng hoặc bất thường trong quá trình trưởng

thành tinh trùng.

Tỷ lệ tinh trùng chết và bất động lớn: có bệnh lý ở mào tinh

hoặc bất thường trong quá trình sinh tinh.

1. Phƣơng pháp nhuộm Eosin – Nigrosin

a. Nguyên lý của phương pháp nhuộm:

Tinh trùng sống: có màng tế bào còn nguyên vẹn nên không bắt

màu thuốc nhuộm Eosin, khi quan sát trên kính hiển vi cho hình ảnh tinh

trùng màu trắng nổi bật trên nền tím đen.

Tinh trùng chết: có màng tế bào bị tổn thương sẽ bắt màu thuốc

nhuộm Eosin, khi quan sát cho hình ảnh đầu tinh trùng bắt màu đỏ hoặc

màu hồng nhạt.

b. Chuẩn bị thuốc nhuộm:

1. Eosin 1%: 1 g Eosin và 100 ml nước cất.

2. Nigrosin 10% 10g Nigrosin và 100 ml nước cất (Nigrosin cho

hình nền màu tím đen để dễ phân biệt tinh trùng sống chết).

Đề nghị 2 :

Có thể đánh giá tỷ lệ sống một cách thường qui với tất cả các

mẫu, đặc biệt với những mẫu có tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới

<50%. Ngoài ra, tỷ lệ sống này còn được dùng để kiểm tra kết quả

đánh giá tỷ lệ di động: tỷ lệ phần trăm tinh trùng di động không được

cao hơn tỷ lệ phần trăm tinh trùng sống.



3. Đun sôi hỗn hợp, để nguội ở nhiệt độ phòng.

4. Lọc qua màng lọc, bảo quản trong bình tránh sáng ở nhiệt độ

phòng.

c. Quy trình:

1. Trộn đều mẫu

2. Dùng micropipette hút 50 µl tinh dịch đã trộn đều cho vào hộp

Nune.

3. Nhỏ 1 giọt Eosin 1% tương đương 50 µl vào hộp Nune chứa

tinh dịch. Lắc đều hỗn hợp trong 30 giây.

4. Nhỏ 2 giọt Nigrosin 10% tương đương 100 µl vào trong hỗn

hợp trên và lắc đều trong 30 giây.

5. Trộn đều mẫu và tạo tiêu bản, để khô tự nhiên.

6. Quan sát tiêu bản với vật kính dầu 100X.

7. Đếm tinh trùng sống và chết bằng máy bách phân.

8. Đánh giá 200 tinh trùng trên mỗi mẫu.

9. Tính phần trăm tinh trùng sống/chết, tỉ lệ trung bình và tỷ lệ

khác biệt giữa 2 lần đếm.

10. So sánh với tỷ lệ khác biệt cho phép theo Bảng 1.

Nếu khác biệt vượt quá số cho phép: tạo tiêu bản khác, đánh

giá lại.

Nếu khác biệt chấp nhận được: lấy trị số trung bình.

11. Tính phần trăm tinh trùng sống/chết.



Hình 5 Quan sát smear nhuộm eosin-nigrosin dƣới kính hiển vi

Tinh trùng có đầu màu đỏ (D1) hay hồng đậm (D2) được coi là chết

(tổn thương màng), còn tinh trùng có đầu trắng (L) hoặc hồng nhạt được

coi là sống (màng nguyên vẹn).

2. Phƣơng pháp nhuộm Eosin đơn thuần

Đây là phương pháp đơn giản, nhanh, tuy nhiên không thể lưu trữ

được do tiêu bản đánh giá là tiêu bản ướt.

a. Chuẩn bị thuốc nhuộm:

1. NaCl 0,9%: hoà tan 0,9 g NaCl vào 100ml nước cất.

2. Eosin Y 0,5%: hoà tan 0,5 g Eosin Y vào 100ml NaCl 0,9%.

b. Quy trình:


2. 5 μl tinh dịch + 5 μl eosin, trộn đều trên lam bằng đầu tip. Đậy

lamelle, để yên mẫu trong 30 giây. Có thể sử dụng nigrosin để

tăng độ tương phản của nền tiêu bản.



3. Đếm tinh trùng bằng kính hiển vi phản quang (20X hoặc 40X).

Đánh giá 100 tinh trùng. Tinh trùng sống chỉ bắt màu ở một

phần vùng cổ, phần còn lại của vùng đầu không bắt màu.

4. Tính phần trăm tinh trùng sống/chết.

Chú ý:

Nếu tinh trùng bắt màu thuốc nhuộm một phần ở cổ và phần đầu

không nhuộm màu thì được coi là do thủng màng cổ. Đây không phải là

dấu hiệu của tinh trùng chết hay phân huỷ toàn bộ màng nên những tinh

trùng này được coi là sống.

3. HOS test (Hypo-osmotic swelling test)

Phương pháp này được dùng để đánh giá khả năng sống của tinh

trùng thay cho phương pháp nhuộm. Tinh trùng sống sẽ căng phồng và

cuộn đuôi lại. HOS test được sử dụng cho những mẫu tinh trùng bất động

hoàn toàn nhằm chọn tinh trùng sống để ICSI.

Tinh trùng với màng nguyên vẹn căng phồng lên trong 5 phút

trong môi trường nhược trương và đuôi ổn định cân bằng khoảng 30

phút. Theo đó, có thể áp dụng để 30 phút ủ ấm cho chẩn đoán thường

quy nhưng chỉ cần ủ 10 giây cho mẫu dùng trong kỹ thuật ICSI.

a. Chuẩn bị thuốc thử:

1. Pha 50ml môi trường nuôi cấy với nước vô khuẩn theo tỷ lệ 1:1.

2. Trữ trong tủ lạnh 2 – 8oC đến khi sử dụng.

b. Quy trình:

1. Làm ấm 1ml thuốc thử ở 37oC trong 5 phút.

2. Lắc đều mẫu tinh dịch.

3. Cho 100μl tinh dịch vào thuốc thử, trộn đều bằng pipette.

4. Ủ ở 37oC trong 5 – 30 phút. Hút 10 μl đặc lên lame, phủ lamelle

và quan sát dưới kính phản pha (vật kính 20X hoặc 40X).



5. Đếm tinh trùng sống/chết bằng máy bách phân (đếm 200 tinh

trùng).

6. Tính phần trăm tinh trùng sống, chết.

7. So sánh với tỉ lệ khác biệt cho phép theo Bảng 1

Nếu khác biệt vượt quá số cho phép: tạo tiêu bản khác, đánh

giá lại.

Nếu khác biệt chấp nhận được: lấy trị số trung bình.

Hình 6 Sự thay đổi hình dạng điển hình của tinh trùng ngƣời trong dung

dịch nhƣợc trƣơng.

(a) Không thay đổi. (b)-(g) Những kiểu thay đổi của đuôi.

VI. Đánh giá mật độ tinh trùng

Tổng số tinh trùng trong một lần xuất tinh và mật độ tinh trùng

đều liên quan đến tỷ lệ có thai và là cơ sở để tiên đoán khả năng có thai.

Đánh giá tổng số tinh trùng trong một lần xuất tinh dựa trên thể

tích và mật độ tinh trùng. Trong trường hợp xuất tinh bình thường, không

bị bế tắc ống dẫn tinh và thời gian kiêng xuất tinh không quá ngắn thì

tổng số tinh trùng trong một lần xuất tinh tương quan tỷ lệ thuận với thể

tích tinh hoàn. Do đó, có thể ước lượng khả năng sinh tinh trùng của tinh



hoàn cũng như sự thông suốt của ống dẫn tinh từ việc xác định tổng số

tinh trùng trong một lần xuất tinh.

Trong khi đó, mật độ tinh trùng phụ thuộc vào thể tích dịch tiết từ

túi tinh và tuyến tiền liệt. Vì vậy, đây không phải là cơ sở để đánh giá chức

năng của tinh hoàn.

Chú ý:

Về mặt tổng quát, tổng số tinh trùng có thể không phản ảnh đúng

khả năng sản xuất tinh trùng của tinh hoàn trong trường hợp bệnh nhân

lấy mẫu bằng cách kích thích xung điện (do bị tổn thương cột sống),

những bệnh nhân thiếu androgen hoặc mẫu được thu sau 1 khoảng thời

gian dài kiêng xuất tinh hay bị xuất tinh ngược dòng 1 phần.

1. Chuẩn bị buồng đếm Neubauer cải tiến

Hình 7: Buông đêm Neubauer



a. Cấu tạo của buồng đếm Neubauer cải tiến

Buồng đếm được chia làm 2 buồng riêng biệt, mỗi buồng

được khắc trên bề mặt những lưới ô vuông cực nhỏ có kích thước 3

x 3mm, được dùng với lame phủ đặc biệt (dày 0,44mm) dán chặt

trên hai gờ buồng đếm. Mỗi buồng đếm được chia thành 9 lưới ô

vuông kích thước 1 x 1 mm.

Hình 7 minh hoạ cho các vùng sau: tất cả có 9 ô trong

buồng đếm (bên trái); ở giữa là ô số 5 gồm 25 ô vuông lớn; 1 phần

nhỏ của buồng đếm (bên phải) là hình 25 ô vuông của ô số 5, được

bao bọc bởi 3 đường kẻ và chia thành 16 ô vuông nhỏ

Với độ sâu là 100μm thì thể tích mỗi ô vuông là 100nl.

1,3,7,9: mỗi lưới ô vuông có 4 hàng, mỗi hàng chia thành 4 ô

vuông lớn, V = 6,25nl.

2, 8: mỗi lưới ô vuông có 4 hàng, mỗi hàng chia thành 5 ô

vuông lớn, V = 5nl.

4, 6: mỗi lưới ô vuông có 5 hàng, mỗi hàng chia thành 4 ô

vuông lớn, V = 5nl.

5: có 25 ô vuông lớn, 1 ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ. Mỗi ô

vuông lớn được giới hạn bởi 3 đường kẻ song song. Có 5 hàng,

mỗi hàng chia thành 5 ô vuông lớn, V = 4nl.

Mỗi lưới ô vuông số 4, 5, 6 có 5 hàng, Vhàng= 20nl.

b. Dán lamelle lên buồng đếm

Lamelle phủ phải được dán sát để đảm bảo độ sâu của buồng đếm

100μm. Có 2 cách dán lamelle phủ lên buồng đếm:

Dùng nước bôi ướt 2 gờ của buồng đếm rồi đặt lamelle phủ lên.

Hà hơi thở lên 2 gờ của buồng đếm rồi đặt lamelle phủ lên.



2. Chuẩn bị dung dịch đếm mật độ tinh trùng:

1. NaHCO3 50g: tạo pH trung tính và môi trường sinh lý cho tế

bào.

2. Formol 36 – 41% 10 ml: bất động tinh trùng.

3. Tripan blue 0,25g hoặc gential violet 5ml: nhuộm màu tinh

trùng để dễ quan sát hơn.

4. Nước cất vừa đủ 1000ml.

5. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

3. Chuẩn bị mẫu pha loãng

Quan sát dưới kính hiển vi để xác định độ pha loãng phù hợp dựa

theo số lượng tinh trùng trên vi trường 40X (thường chọn độ pha loãng

lúc đánh giá di động). Cách pha loãng được tính theo bảng bên dưới:

Bảng 2: Cách tính hệ số pha loãng

Tinh

trùng/vi

trƣờng

40X

Độ pha

loãng

quy định

Thể tích

tinh

dịch

(μl)

Thể tích dung

dịch pha loãng

(μl)

Vùng đánh giá

(lƣới ô vuông)

> 101 1:20 50 950 5, 4, 6

16 – 100 1:5 50 200 5, 4, 6

2 – 15 1:2 50 50 5, 4, 6

< 2 1:2 50 50 Tất cả 1-9

1. Chỉnh pipette để hút với thể tích thích hợp, hút dung dịch đếm

mật độ tinh trùng vào 2 tube ly tâm đáy tròn (5ml) , độ pha

loãng như nhau.

2. Trộn đều mẫu tinh dịch.

3. Hút tinh dịch với thể tích thích hợp ngay sau khi trộn đều.

4. Lau sạch tinh dịch bên ngoài của đầu tip.



5. Cho tinh dịch vào 2 tube chứa dung dịch pha loãng ở trên.

6. Trộn đều bằng cách hút rửa đầu tip.

7. Trộn đều mẫu đã pha loãng bằng máy vortex trong 10 giây ở

tốc độ tối đa.

Chú ý:

Nếu có quá ít tinh trùng trong vi trường trong mẫu đã pha loãng

thì pha loãng lại với hệ số thấp hơn. Ngược lại, nếu có quá nhiều tinh

trùng chồng chéo nhau trong vi trường thì pha loãng lại với hệ số cao

hơn.

Đối với độ pha loãng 1/20 và 1/5, đếm tinh trùng trong những

hàng của lưới ô vuông số 5 trước, tiếp tục tới lưới ô vuông số 4 và 6 khi

cần thiết.

4. Đặt mẫu vào buồng đếm

1. Sau khi vortex, lấy ngay 10 μl tinh dịch đã được pha loãng để đếm

mật độ, tránh để tinh trùng lắng xuống.

2. Đặt đầu tip chạm vào cạnh dưới của lame phủ buồng đếm.

3. Đẩy từ từ hỗn hợp ra, làm đầy buồng đếm thứ nhất bởi lực mao

dẫn, không quá ít hay đầy tràn, lame phủ không được di chuyển khi

đặt mẫu.

4. Xử lý tương tự đối với mẫu pha loãng thứ hai và đặt vào buồng

đếm thứ hai.

5. Cố định buồng đếm 4 phút ở nhiệt độ phòng. Nên đặt buồng đếm

lên giấy thấm ướt và đậy hộp petri lên để tránh buồng đếm không

bị khô.



5. Đánh giá mật độ tinh trùng trên buồng đếm

a. Cách đếm

Trong 3 đường kẻ, đường kẻ giữa tạo thành ranh giới hình vuông

(đường màu đen, bên trái). Tất cả tinh trùng trong ô vuông này đều được

đếm cũng như những tinh trùng có đầu nằm giữa 2 đường kẻ bên trong

(khoanh tròn màu trắng), nhưng những tinh trùng có đầu nằm giữa 2

đường kẻ ngoài (khanh tròn màu đen) thì không đếm. Một tinh trùng với

hầu hết đầu của nó nằm trên đường kẻ giữa chỉ được đếm khi đường kẻ

đó là đường kẻ dưới, bên trái của ô vuông (khoanh tròn màu trắng, hình

giữa) và không đếm khi nó nằm ở đường kẻ trên, bên phải (khoanh tròn

màu đen, hình bên phải).

Hình 8: Cách đếm tinh trùng trong ô vuông

b. Các bước thực hiện

1. Khảo sát đánh giá với vật kính 40X.

2. Chỉ đếm tinh trùng nguyên vẹn có đầy đủ đầu và đuôi

3. Đếm tinh trùng dựa vào vị trí của đầu tinh trùng. Ranh giới của ô

vuông lớn là đường giữa của 3 đường viền.

4. Đếm tất cả tinh trùng nằm trong ô vuông lớn, đếm tinh trùng có

đầu nằm giữa 2 đường viền bên trong, không đếm tinh trùng có

đầu nằm giữa 2 đường viền bên ngoài.



5. Để tránh đếm lặp lại tinh trùng trong các ô vuông liền kề, đếm tinh

trùng nằm trên đường phân chia giữa 2 ô vuông chỉ được đếm 1

lần: đếm tinh trùng có đầu nằm trên đường phân chia phía trên và

bên trái của ô vuông.

c. Giới hạn đếm tinh trùng trên buồng đếm

1. Đếm ít nhất 200 tinh trùng trên mỗi buồng đếm

2. Đánh giá lưới ô vuông số 5 trước, đếm theo từng hàng

3. Tiếp tục đếm hết hàng dù tổng số tinh trùng hơn 200. Nếu đếm

chưa đủ 200 tinh trùng trong 4 hàng của lưới ô vuông số 5, tiếp

tục đếm những hàng trong lưới ô vuông số 4 và 6.

4. Ghi nhận số hàng đánh giá. Số hàng tương tự sẽ được đếm ở

buồng đếm thứ 2.

5. Đếm buồng đếm thứ 2 tương tự buồng thứ 1.

6. Tính tổng và sự khác biệt của 2 lần đếm.

7. So sánh khác biệt cho pháp theo Bảng 3

Nếu khác biệt vượt quá số cho phép: pha loãng và đánh giá

lại.

Nếu khác biệt chấp nhận được: lấy trị số trung bình, tính mật

độ.

Chú ý:

Không nên đánh giá 2 lần trên cùng 1 buồng đếm hoặc đánh giá 2

buồng với cùng 1 mẫu pha loãng vì có thể dẫn đến sai số khi lấy mẫu, do

pha loãng hoặc do trộn không đều.

Cần ghi nhận nếu có nhiều tinh trùng đầu kim hoặc tinh trùng

không đuôi trong mẫu. Khi cần có thể đánh giá mật độ của chúng giống

như tinh trùng bình thường hoặc đánh giá qua phương pháp nhuộm



Bảng 3 Khác biệt cho phép giữa tổng và hiệu số đếm trên 2 buồng đếm

Tổng số tinh

trùng

Sai số cho

phép

Tổng số

tinh trùng

Sai số cho

phép

144-156 24 329-346 36

157-169 25 347-366 37

170-182 26 367-385 38

183-196 27 386-406 39

197-211 28 407-426 40

212-226 29 427-448 41

227-242 30 449-470 42

243-258 31 471-492 43

259-274 32 493-515 44

275-292 33 516-538 45

293-309 34 539-562 46

310-328 35 563-587 47

6. Cách tính mật độ tinh trùng và tổng số tinh trùng

a. Mật độ

MMậậtt đđộộ:: CC == ((NN//nn)) xx ((11//2200)) xx hhệệ ssốố pphhaa llooããnngg xx 110066 ((ttiinnhh ttrrùùnngg//mmll ttiinnhh

ddịịcchh))

b. Tổng số tinh trùng

TTổổnngg ttiinnhh ttrrùùnngg == MMậậtt đđộộ ttiinnhh ttrrùùnngg xx TThhểể ttíícchh mmẫẫuu

Trong đó:

N: là tổng số tinh trùng đếm được trong 2 buồng đếm

n: là tổng số hàng khảo sát

20: là thể tích của 1 hàng trong lưới ô vuông số 4, 5, 6.

.



7. Đánh giá mẫu có mật độ tinh trùng thấp:

Trường hợp mẫu tinh dịch có số lượng tinh trùng quá ít (0-4 tinh

trùng/vi trường 40X) nếu không cần con số chính xác có thể ước lượng

mật độ:

<4 tt/vi trường 40X Khoảng 1.106 tt/ml

<2 tt/vi trường 40X < 0,5.10 tt/ml

Cần ghi nhận có tinh trùng di động hay không

a. Trường hợp không tìm thấy tinh trùng trên tiêu

bản tươi:

Nếu không thấy tinh trùng trên tiêu bản soi tươi thì có thể nghi

ngờ azoospermia. Thuật ngữ azoospermia chỉ được sử dụng khi không tìm

thấy tinh trùng trong mẫu ly tâm.

1. Trộn đều mẫu. Nếu mẫu nhớt thì phải phá nhớt.

2. Ly tâm toàn bộ mẫu với tốc độ 3000g/15 phút.

3. Bỏ phần dịch nổi phía trên, để lại khoảng 50 μl.

4. Trộn đều cặn, tạo 2 tiêu bản.

5. Khảo sát tiêu bản bằng kính hiển phản pha với độ phóng đại

200 – 250.

6. Khảo sát theo hệ thống (zic zac) toàn bộ tiêu bản.

7. Có tinh trùng trong cặn khảo sát Cryptozoospermia.

8. Không có tinh trùng trong cặn khảo sát Azoospermia.



Chú ý:

Việc có tìm thấy tinh trùng hay không phụ thuộc vào thời gian, tốc

độ ly lâm và cách kiểm tra mẫu. Không thấy tinh trùng di động trong mẫu

kiểm tra không có nghĩa là không có tinh trùng di động trong toàn bộ

mẫu.

Ly tâm 3000g trong 15 phút không làm lắng tất cả tinh trùng trong

mẫu nên phương pháp này không được sử dụng để tính tổng số tinh

trùng.

Sau ly tâm, tinh trùng có thể không còn di động.

b. Kiểm tra mẫu tìm tinh trùng di động không qua

ly tâm

Khi thấy có tinh trùng di động (ví dụ trong mẫu sau khi thắt ống

dẫn tinh) thì tránh pha loãng mẫu hoặc ly tâm với tốc độ cao. Trong

trường hợp này, chỉ cần đánh giá một mẫu không pha loãng.

Trộn đều mẫu.

Nhỏ 15 μl tinh dịch lên lame, phủ lamelle 22mm x 22mm.

Kiểm tra tiêu bản bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại

x40.

Kiểm tra mẫu theo hệ thống zic – zac.

Di chuyển quang trường liên tục và đếm tất cả các tinh trùng hiện

diện trong tiêu bản tươi.

Chú ý:

Không tìm thấy tinh trùng di động trong mẫu kiểm tra không có

nghĩa là không có tinh trùng di động trong lượng mẫu còn lại.

8. Tính mật độ tế bào lạ

Sự hện diện của các tế bào lạ (tế bào tròn) với số lượng lớn trong

tinh dịch thường là dấu hiệu hiệu của tổn thương tinh hoàn, bệnh lý

đường dẫn tinh hoặc viêm nhiễm tuyến phụ sinh dục.



Xác định số lượng tế bào tròn trong mẫu bằng cách pha loãng và

đếm tương tự như đếm tinh trùng. Tuy nhiên, việc pha loãng sẽ làm giảm

mật độ tế bào lạ, do đó kết quả không được chính xác. Có thể đánh giá

mật độ tế bào tròn trong tinh dịch dựa trên sự tỷ lệ của chúng với tinh

trùng (đếm song song cùng với đếm tinh trùng).

Nếu mật độ tế bào tròn vượt quá 1.106/ml, cần phân biệt bạch cầu

và tinh trùng non qua phản ứng peroxidase (nhuộm leukoscreen) hoặc

phân biệt qua cấu trúc của nhân bạch cầu và tinh trùng non trên tiêu bản

nhuộm.

Mật độ tế bào lạ:

N: Số tế bào tròn đếm được trong cùng số vi trường 100 tinh

trùng

S: mật độ tinh trùng

C: mật độ tế bào tròn

9. Bảo quản buồng đếm

Rửa sạch buồng đếm và lamelle với nước, lau khô bằng giấy lau

mềm sau khi sử dụng. Nếu rửa không sạch, cặn khô sót lại có thể gây khó

khăn khi đặt mẫu vào lần sau (mẫu pha loãng không tràn đều vào buồng

đếm). Lau sạch bề mặt buồng đếm trước khi sử dụng.

Ngâm buồng đếm và lamelle qua đêm để tẩy sạch những tác nhân có khả

năng lây nhiễm từ tinh dịch

Sx N

C=

100



VII. Đánh giá hình dạng tinh trùng

Hình dạng tinh trùng rất đa dạng. Những nghiên cứu đánh giá hình

dạng tinh trùng để đưa ra chỉ số bình thường được xác định căn cứ vào

hình dạng của các tinh trùng lấy từ cơ quan sinh dục nữ, đặc biệt là từ

chất nhầy cổ tử cung sau giao hợp hoặc từ bề mặt màng trong suốt của

trứng.

Hình dạng tinh trùng là một thông số rất quan trọng giúp dự đoán

khả năng thụ tinh khi đánh giá theo tiêu chuẩn nghiêm ngặt (Strict

Criteria). Tỷ lệ tinh trùng có hình dạng bình thường đánh giá theo Strict

Criteria liên quan đến tỷ lệ phát triển của thai, khả năng có thai tự nhiên

hay có thai khi điều trị bằng các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản. Ở những đàn

ông có khả năng sinh sản bình thường và không có khả năng sinh sản, tỷ

lệ này vào khoảng 0 – 30% (Menkveld và cs., 2001). Tỷ lệ này tiệm cận đến

ngưỡng 3 – 5% trong nghiên cứu thụ tinh trong ống nghiệm, IUI và thụ

tinh tự nhiên.

1. Quy trình:

1. Làm sạch lame bằng cồn 70o, để khô tự nhiên (chuẩn bị ít nhất 2

lame).

2. Dùng bút chì ghi nhãn trên phần nhám để phân biệt các mẫu.

3. Tạo phiến phết tinh dịch.

4. Để khô tự nhiên, cố định và nhuộm phiến phết bằng phương pháp

Papanicolaou.

5. Khảo sát tiêu bản nhuộm dưới kính hiển vi độ phóng đại x1000, có

phủ dầu.

6. Đánh giá phân loại tinh trùng bình thường và bất thường.

7. Đánh giá.

8. So sánh sự khác biệt của 2 tiêu bản: nếu chấp nhận được thì ghi

nhận kết quả; nếu không thì đọc lại tiêu bản.



9. Đánh giá 2 tiêu bản, mỗi tiêu bản khoảng 200 tinh trùng/tiêu bản,

xác định phần trăm tinh trùng có hình dạng bình thường .

10. Tính phần trăm hình dạng bình thường.

2. Kỹ thuật kéo lame

Chất lượng phiến phết phụ thuộc vào thể tích giọt tinh dịch và mật

độ tinh trùng cũng như độ nghiêng của lame kéo và tốc độ kéo lame. Độ

nghiêng càng thấp thì phiến phết càng mỏng, tốc độ kéo càng nhanh thì

phiến phết càng dày.

Nếu mật độ tinh trùng > 20.106/ml nhỏ 5 – 10 μl tinh dịch để

kéo lame.

Nếu mật độ tinh trùng < 20.106/ml nhỏ 10 – 20 μl tinh dịch để

kéo lame.

Chú ý:

Không được để giọt tinh dịch trên lame quá lâu trước khi trải.

Đặt lame kéo phía trước giọt tinh dịch, không được kéo tinh dịch từ

phía sau.

a. Kéo đều (feathering method)

Nhỏ một giọt tinh dịch lên gần cuối lame thứ nhất, dùng cạnh của

lame thứ hai chạm vào giọt tinh dịch, nghiêng 30 – 45o kéo giọt tinh dịch

dọc theo bề mặt của lam thứ nhất.

Kỹ thuật này tạo phiên phết mỏng và đều, đảm bảo tất cả tinh

trùng cùng nằm trên một mặt phẳng, không chồng lên nhau, độ tương

phản và màu nền của tiêu bản sau khi nhuộm tốt hơn, dễ nhận biết sự

khác biệt về đường nét của tinh trùng bình thường và bất thường. Tuy

nhiên, kỹ thuật này không thích hợp đối với mẫu tinh dịch có độ nhớt cao.



Hình 9: Kỹ thuật kéo lame đều

b. Kéo bằng pipette Pasteur

Kỹ thuật này thích hợp cho những mẫu tinh dịch có độ nhớt cao.

Rửa mẫu tinh dịch rồi nhỏ một giọt dung dịch tinh dịch sau khi rửa

lên lame, sau đó dùng pipette Pasteur đặt nằm ngang để trải mẫu lên

lame.

Hình 10: Kỹ thuật trải mẫu để đánh giá hình dạng

(a) Kỹ thuật kéo lame đều đối với tinh dịch không pha loãng. Trải giọt

tinh dịch (S) từ đầu lame đến cuối lame bằng lame thứ 2.

(b) Kỹ thuật kéo lame bằng pipette pasteur đối với mẫu đã được rửa.

Trải giọt dung dịch chứa tinh trùng (SS) trên bề mặt lame bằng cách kéo

ngang pipette (P).

c. Kéo lame với mẫu tinh dịch có độ nhớt cao

Đặt giọt tinh dịch vào giữa lame thứ nhất, đặt lame thứ 2 chồng lên

giọt tinh dịch đến khi tinh dịch trải đều giữa hai lame, kéo nhẹ nhàng hai

lame tách thành 2 tiêu bản. Tuy nhiên, độ nhớt của tinh dịch hay cặn và



các thành phần không phải tinh trùng trong tinh dịch làm độ dày của

phiến phết không đều nhau, gây khó khăn khi đánh giá phân loại tinh

trùng. Do đó, nên pha loãng và ly tâm mẫu tinh dịch trước khi tạo phiến

phết. Phần cặn được pha với thể tích thích hợp để có mật độ tinh trùng

cao nhất nhưng không quá 50.106/ml. Cần ghi nhận vào phiếu trả kết quả

là mẫu ly tâm để kéo lame vì hình dạng tinh trùng có thể bị ảnh hưởng

bởi phương pháp này.

Tạo phiến phết

1. Pha loãng 0,2 – 0,5 ml tinh dịch với 10ml nước muối sinh lý.

2. Ly tâm 800g trong 10 phút, hút bỏ dịch nổi, để lại khoảng 20 - 40

μl.

3. Trộn đều cặn, lấy 5 -10 μl làm phiến phết trên lame bằng pipette

Pasteur.

4. Quan sát tổng quan tiêu bản với độ phóng đại x400, cần có ít nhất

40 tinh trùng trên một vi trường, tinh trùng không tập trung từng

đám hoặc xếp chồng lên nhau.

5. Nếu mật độ tinh trùng vẫn quá dày thì làm lại tiêu bản với thể tích

ít hơn hoặc tăng độ pha loãng.

6. Để phiến phết khô tự nhiên và cố định tuỳ phương pháp nhuộm.

d. Kéo lame với những mẫu có mật độ ít

(<2x106/ml)

1. Ly tâm toàn bộ mẫu ở 600g trong 10 phút.

2. Loại bỏ dịch nổi phía trên.

3. Trộn đều cặn.

4. Nhỏ mẫu có mật độ cao lên lame kéo (không quá 50x106).

5. Tạo phiến phết nhuộm.

6. Để khô tự nhiên và cố định tuỳ phương pháp nhuộm.



3. Phƣơng pháp nhuộm Papanicolaou:

Phương pháp này được dùng rộng rãi nhất ở các phòng xét nghiệm

Nam khoa. Đây là cách nhuộm tinh trùng và các tế bào khác rất tốt. Với

phương pháp nhuộm này, cực đầu tinh trùng có màu xanh nhạt, vùng sau

cực đầu xanh đậm, phần giữa đỏ, đuôi màu xanh hoặc đỏ nhạt, bào tương

màu hồng hoặc đỏ.

QUY TRÌNH NHUỘM PAPANICOLOU

1. Ethanol 80o 30 giây


3. Rửa nƣớc 30 giây

4. Haematoxylin 4 Phút

5. Rửa nƣớc 30 giây

6. Acidic ethanol Nhúng lên xuống 4- 8 lần



9. Ethanol 95o Ít nhất 15 phút

10. OG6 1 phút



13. EA50 1 phút







Bảng 6: Tác dụng của các hoá chất trong phƣơng pháp nhuộm

Papanicolaou

Hoá chất Công dụng

Ethanol Cố định tế bào

Nƣớc cất Loại bỏ ethanol trước khi nhuộm heamatoxylin và loại

bỏ thành phần không bắt màu.

Haematoxylin Nhuộm nhân tế bào (xanh)

Acidic ethanol Tẩy sạch thành phần không bắt màu haematoxylin.

OG6, EA-50 Nhuộm tế bào chất, bào tương bắt màu hồng

4. Phân loại hình dạng tinh trùng

a. Tinh trùng bình thường:

Có đầu, cổ, phần giữa và đuôi đều bình thường, đầu tinh trùng sau

nhuộm có kích cỡ nhỏ hơn đầu tinh trùng sống mặc dù hình dạng không

khác nhiều.

Đầu hình oval cân đối với màng ngoài nhẵn. Phần đầu có vùng

acrosome chiếm 40 – 70% diện tích đầu. Vùng acrosome không có không

bào lớn hoặc không quá 2 không bào nhỏ và không chiếm quá 20% thể

tích vùng đầu. Vùng nhân không chứa không bào.

Hình 11: Tinh trung binh thƣơng



Phần giữa thon, chiều dài bằng chiều dài đầu, gắn thẳng trục với

đầu. Bào tương sót lại < 1/3 thể tích đầu bình thường

Đuôi đều, thon hơn phần thân, có thể cuộn vòng nhưng không bị

gấp gãy, dài khoảng 45 μm (gấp khoảng 10 lần chiều dài đầu).

Hình 11: Tinh trùng có hình dạng bình thƣờng

Chú ý

Tất cả tinh trùng không có hình dạng như trên đều coi là tinh trùng

bất thường. Phân loại hình dạng tinh trùng giúp ước đoán phần nào giá trị

thành công trong IVF.



b. Tinh trùng bất thường

Tinh trùng ở người có rất nhiều dạng dị tật khác nhau mà nguyên

nhân chủ yếu do bất thường trong sinh tinh hay bệnh lý về mào tinh

hoàn. Bất thường hình dạng thường ở dạng hỗn hợp. Khả năng thụ tinh

của tinh trùng bất thường thấp hơn so với tinh trùng bình thường và phụ

thuộc vào loại bất thường. Bất thường hình dạng tinh trùng thường liên

quan đến sự phân mảnh DNA, bất thường nhiễm sắc thể, thoi vô sắc và đa

bội.

Hình 11: Một số hình dạng bất thƣờng của tinh trùng ngƣời.

Sau đây là những bất thường cần lưu ý:

Bất thường đầu:

Đầu to, nhỏ, hình lê, hình nến, đầu tròn, đầu có hình dạng bất định,

có không bào (nhiều hơn 2 không bào hay không bào lớn hơn 20% vùng

đầu), không bào ở vùng sau cực đầu, cực đầu nhỏ quá hoặc lớn quá…



Tinh trùng có bề mặt bất thường Tinh trùng bất định

Tinh trùng đầu nhọn

Tinh trùng đầu hình quả tạ

Tinh trùng Acrosome lớn

Tinh trùng có cực đầu ít

Tinh trùng có không bào Tinh trùng đầu tròn

Hình 12. Tinh trung bât thƣơng

phần đầu



Bất thường cổ và phần giữa:

Cổ gập, phần giữa nối với đầu bị lệch, dày, không đều.

Bất thường đuôi

Đuôi ngắn, gãy, cong, nhiều đuôi, chiều rộng đuôi không đều, đuôi

cuộn (>360o).

Tinh trùng

cổ gập

Tinh trùng phần giữa dày Tinh trùng có

bào tương cổ

Hình 13: Tinh trung bât thƣơng phần giƣa

Tinh trùng đuôi gãy Tinh trùng

đuôi cuộn

Tinh trùng

hai đuôi

Hình 13: Tinh trung bât thƣơng phần đuôi



Bào tương cổ

Bào tương còn sót lại thường nằm ở phần giữa, có kích thước lớn

hơn 1/3 thể tích đầu.

Tinh trùng chưa trưởng thành:

Đầu tròn, to hoặc kéo dài, nhân tròn, đã mọc đuôi hoặc chưa mọc

đuôi.

Đầu kim:

Tinh trùng không có phần đầu, chỉ có đuôi tự do. Tinh trùng đầu

kim không được xếp vào loại bất thường đầu mà chỉ ghi nhận (vì chúng

không có nhiễm sắc thể).

c. Tế bào lạ

Trong mẫu tinh dịch bình thường cũng có thể có nhiều loại tế bào

khác:

Bạch cầu:

Bình thường không có trong tinh dịch, nếu có chỉ với số lượng rất ít

(<1.106). Nếu mật độ bạch cầu cao cho thấy biểu hiện bệnh lý, thường bắt

nguồn từ tuyến tiền liệt hoặc dịch túi tinh.

Hình 14: Tinh trung đâu kim



Hồng cầu:

Bình thường không hiện diện trong tinh dịch, nếu có thì chỉ với số

lượng rất ít nhưng không mang ý nghĩa bệnh lý.

Tinh trùng non:

Tế bào mầm chưa trưởng thành, có nhiều trong tinh dịch chứng tỏ

có rối loạn chức năng của ống sinh tinh (thường gặp trong bệnh giãn tĩnh

mạch tinh).

Tế bào biểu mô:

Xuất hiện ở hầu hết các mẫu tinh dịch với số lượng rất ít. Tuy

nhiên, nếu hiện diện trong mẫu với số lượng lớn cũng không nói lên tình

trạng nhiễm trùng hay rối loạn chức năng sinh sản. Nếu mẫu lấy bằng

giao hợp gián đoạn sẽ có nhiều tế bào biểu mô âm đạo, trường hợp mẫu

lấy bằng bao cao su chuyên dụng sẽ có nhiều tế bào biểu mô từ niệu đạo.

Bào tương từ biểu mô ống sinh tinh

Tế bào lớn, không nhân (lớn hơn đầu tinh trùng được cho là tế bào

tròn, nếu nhỏ hơn thì xem như mảnh vụn).

Vi khuẩn và vi sinh vật đơn bào:

Bình thường không có trong tinh dịch, nhưng nếu có với số lượng

lớn sẽ biểu hiện tình trạng nhiễm trùng đường sinh dục.

Cặn:

Trong tinh dịch bình thường có thể có nhiều cặn. Cần phân biệt cẩn

thận mảnh vụn và vi khuẩn.



Một số thuật ngữ sử dụng trong tinh dịch đồ

Aspermia Không có tinh dịch

Hypospermia Thể tích tinh dịch nhỏ hơn 0,5 ml/lần xuất tinh

Hyperspermia Thể tích tinh dịch lớn hơn 6 ml/lần xuất tinh

Oligospermia Thể tích xuất tinh nhỏ hơn 1,5 ml

Oligozoospermia Mật độ tinh trùng ít (< 15.106/ml)

Asthenozoospermia Tinh trùng yếu (PR < 32%)

Teratozoospermia Tinh trùng dị dạng

Oligo-astheno

teratozoospermia

Tinh trùng ít, yếu, dị dạng

Azoospermia Tinh dịch không có tinh trùng

Globozoospermia Tinh trùng đầu tròn, không cực đầu

Hematospermia Tinh dịch có hồng cầu

Cryptozoospermia Vài tinh trùng trong mẫu



PHẦN IV: QUY TRÌNH

LỌC RỬA TINH TRÙNG



A. Giới thiệu

Tinh trùng cần được tách khỏi tinh tương để sử dụng với nhiều

mục đích khác nhau như: (1) thử nghiệm chẩn đoán chức năng của tinh

trùng và (2) điều trị vô sinh thông qua các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (ART).

Với mục đích thứ nhất, tinh trùng cần phải được tách ra khỏi tinh tương

trong vòng 1 giờ sau khi xuất tinh nhằm hạn chế tối đa các tổn hại đến

tinh trùng do các sản phẩm của các tế bào lạ (không phải tinh trùng) gây

ra.

I. Mục đích

Trong giao hợp tự nhiên, tinh tương giúp tinh trùng thâm nhập vào

chất nhầy cổ tử cung (Overstreet và cs, 1980). Tuy nhiên, trong điều trị vô

sinh bằng các kỹ thuật ART (IUI, IVF), khi rào cản tự nhiên bị phá vỡ thì

một số thành phần của tinh tương (như kẽm, prostaglandins) lại gây trở

ngại cho việc có thai.

Mục đích của việc phân tách tinh trùng người khỏi tinh dịch là thu

được mẫu cô đặc, chứa tỷ lệ phần trăm tinh trùng di động và hình dạng

bình thường cao, đồng thời loại bỏ các mảnh vỡ, tế bào lạ và các tinh

trùng chết.

Đối với những mẫu tinh dịch bình thường chỉ cần pha loãng tinh

dịch với môi trường nuôi cấy và ly tâm. Tinh trùng chuẩn bị theo phương

pháp này thường được dùng trong IUI (Boomsma và cs, 2004). Tuy nhiên,

khi mẫu có một hoặc vài thông số bất thường trong tinh dịch đồ thì cần

sử dụng phương pháp ly tâm trên thang nồng độ không liên tục hoặc

swim-up trực tiếp.

II. Chọn lựa phương pháp

Dựa trên chất lượng mẫu tinh dịch của người chồng, ta có thể lựa

chọn phương pháp chuẩn bị tinh trùng thích hợp (Canale và cs, 1994). Ví



dụ, kĩ thuật swim-up trực tiếp thường sử dụng khi các mẫu tinh dịch có

nhiều thông số bình thường, trong trường hợp mẫu là oligozoospermia,

teratozoospermia hay asthenozoospermia thì sử dụng kỹ thuật ly tâm trên

thang nồng độ để tăng hiệu suất thu hồi tinh trùng di động.

III. Hiệu quả của kỹ thuật phân tách tinh trùng khỏi

tinh dịch và các VSV lây nhiễm.

Hiệu quả của kỹ thuật chọn lọc tinh trùng thể hiện ở độ sạch, số

lượng tinh trùng thu hồi, tổng số tinh trùng di động, hoặc khả năng thu

hồi tinh trùng di động có hình dạng bình thường. Phương pháp swim-up

thường cho tỷ lệ thu hồi tinh trùng di động dưới 20%, thấp hơn phương

pháp ly tâm trên thang nồng độ (>20%). Hai phương pháp này có tác

dụng làm giảm bớt các thành phần khác có trong tinh dịch trong mẫu sau

lọc rửa.

An toàn khi thao tác trên mẫu

Mẫu tinh dịch có thể chứa những tác nhân lây nhiễm, do đó nhân

viên xét nghiệm cần hết sức cẩn thận khi thao tác. Các kỹ thuật chuẩn bị

tinh trùng không thể đảm bảo loại bỏ 100% các tác nhân lây nhiễm trong

tinh dịch. Tuyệt đối phải tuân theo các hướng dẫn an toàn nêu trong phụ

lục. Thực hiện thao tác thí nghiệm tốt là nguyên tắc cơ bản đảm bảo an

toàn thí nghiệm (WHO 2004).



B. Quy trình chuẩn bị tinh trùng

Phƣơng pháp Simple

wash

Swim up Gradient

Số lần ly tâm 2 – 3 1 – 2 2

Tốc độ ly tâm (g) 300 – 500 300 – 400 300 – 650

Thời gian ly tâm 10 – 15 5 – 10 15 – 30

Tổng thời gian thực hiện* 20 – 40 70 – 90 40 – 70

Hiệu suất thu hồi tinh trùng di động

sau lọc rửa (%)

90 – 95 10 – 20 20 – 40

Chi phí Thấp Thấp Cao

Ghi chú: *Tổng thời gian thực hiện không bao gồm thời gian lấy mẫu và ly

giải của tinh dịch.

C

Ó

C

Ó C

Ó

Có Không

Không

Có Có

Không Có

Hủy bỏ

IUI

TMS >5 x 106

Simple wash

Swim-up

Ly tâm trên

thang nồng độ

IUI

Thảo luận với bác

sỹ điều trị

Simple wash

TMS <10 x 106

Mẫu tinh dịch Đánh giá sơ bộ tinh trùng

TMS >10 x 106

Lựa chọn

phương pháp

Lấy thêm mẫu

(Nếu có thể)



Có 3 kỹ thuật cơ bản trong lọc rửa tinh trùng được mô tả trong

phần này. Môi trường được khuyến cáo sử dụng là dung dịch muối cân

bằng bổ sung protein và môi trường đệm thích hợp để đánh giá tinh

trùng. Trong các phương pháp hỗ trợ sinh sản (như là ICSI, IVF, AI hoặc

chuyển giao tử vào vòi trứng), albumin huyết thanh người phải có độ tinh

khiết cao và không chứa các virus, vi khuẩn cũng như các tác nhân lây

nhiễm khác. Các albumin này hiện nay đã có sẵn trên thị trường.

Nếu tủ ấm chỉ chứa không khí bình thường ở nhiệt độ 37oC, nên sử

dụng đệm HEPES hoặc các dung dịch đệm tương tự và đậy chặt nắp của

ống tube. Nếu không khí trong tủ ấm có chứa 5% CO2 ở nhiệt độ là 37oC,

môi trường nên được đệm với dung dịch natri bicacbonat hoặc dung dịch

đệm tương tự, để lỏng nắp của ống tube để không khí có thể lưu thông.

Điều này sẽ đảm bảo pH tối ưu cho sự sống của tinh trùng. Bên cạnh đó,

mục đích sử dụng tinh trùng cũng sẽ quy định môi trường đệm sử dụng

thích hợp. Ví dụ, trong thử nghiệm chuẩn đoán chức năng của tinh trùng,

môi trường sử dụng cần phải hỗ trợ cho sự hoạt hóa tinh trùng, và do đó

phải chứa natri bicacbonat (25mmol/l).

Chú ý

Tinh dịch nên được thu thập trong điều kiện vô trùng (thao tác và

vật liệu điều phải vô trùng), đặc biệt là khi chuẩn bị tinh trùng cho mục

đích điều trị.

I. Phương pháp rửa đơn giản (Simple wash)

Phương pháp rửa đơn giản giúp thu được số lượng tinh trùng cao

nhất và thích hợp với những mẫu tinh dịch có chất lượng tốt. Phương

pháp này thường được sử dụng để chuẩn bị tinh trùng cho IUI.




2. Pha loãng toàn bộ mẫu tinh dịch với môi trường theo tỷ lệ 1: 1 để

loại bỏ tinh tương.

3. Chia mẫu pha loãng vào các ống ly tâm, tối đa là 3 ml/ống.

4. Ly tâm 300 – 500 g trong 5 – 10 phút.

5. Hút bỏ dịch nổi một cách cẩn thận.

6. Hòa cặn với 1 ml môi trường mới.

7. Ly tâm lặp lại ở 300 – 500g trong 3 – 5 phút.

8. Hút bỏ dịch nổi.

9. Hòa cặn với môi trường nuôi cấy để được 0,3 ml.

10. Đánh giá mật độ, tổng số tinh trùng di động và di động tiến tới của

mẫu sau lọc rửa.

Chú ý

Có thể giảm số lần rửa bằng cách dùng ít ống nghệm hơn và tăng

thể tích môi trường trong từng ống nghiệm. Tăng tốc độ ly tâm và thời

gian ly tâm (500 – 600 g trong 8 – 10 phút) sẽ thu được nhiều tinh trùng

hơn.

II. Phương pháp bơi lên trực tiếp (Direct swim-up)

Tinh trùng được chọn lọc dựa trên khả năng tự bơi ra khỏi tinh dịch

để vào môi trường nuôi cấy. Cách làm này được gọi là kỹ thuật “swim-up”.

Kỹ thuật swim-up trực tiếp được thực hiện bằng cách đặt lớp môi trường

nuôi cấy lên trên lớp tinh dịch hay đặt lớp tinh dịch dưới môi trường nuôi

cấy. Sau đó, các tinh trùng di động sẽ tự bơi vào trong lớp môi trường

nuôi cấy. Không nên pha loãng và ly tâm tinh dịch trước khi swim-up vì có

thể gây hiện tượng peroxide hóa, làm tổn thương màng tế bào tinh trùng.

Phương pháp này cho số lượng tinh trùng thấp hơn phương pháp

rửa đơn giản, nhưng chọn lọc được những tinh trùng di động tốt và thích



hợp cho các mẫu tinh dịch có tỷ lệ phần trăm tinh trùng di động thấp sử

dụng cho IVF hoặc ICSI.

Môi trường sử dụng: Ferticult Flushing (Fertipro, Bỉ)

Quy trình thực hiện:


2. Cho 1,2 ml môi trường vào ống ly tâm đáy tròn 15 ml vô trùng, cẩn

thận đặt 1 ml tinh dịch xuống đáy ống nghiệm. (Cũng có thể đặt 1

ml tinh dịch vào ống ly tâm trước, sau đó nhẹ nhàng đặt 1,2 ml môi

trường nuôi cấy lên trên.)

3. Đặt ống nghiệm nghiêng 45oC để tăng bề mặt tiếp xúc giữa lớp

tinh dịch và môi trường nuôi cấy, ủ trong tủ cấy 1 giờ ở 37oC.

4. Nhẹ nhàng đặt ống ly tâm thẳng đứng trở lại và hút khoảng 1 ml

môi trường ở phía trên, chứa nhiều tinh trùng di động.

5. Sau khi hút, chuyển vào 1,5 – 2 ml môi trường mới.

6. Ly tâm 300 – 500 g trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi.

7. Hòa môi trường vào cặn lắng để được 0,3 ml tinh trùng.

8. Đánh giá mật độ, tổng số tinh trùng di động và tinh trùng di động

tiến tới.

III. Phương pháp ly tâm gradient với nồng độ không

liên tục

Phương pháp gradient trên thang nồng độ không liên tục được sử

dụng để chọn lọc tinh trùng có chất lượng tốt, loại bỏ hầu hết các tác

nhân lây nhiễm, bạch cầu, các tế bào lạ cũng như các mảnh vụn tế bào,

đặc biệt hiệu quả đối với những mẫu có độ nhớt cao. Phương pháp này

dễ chuẩn hóa hơn phương pháp swim-up trực tiếp nên kết quả thường ổn

định hơn và thường được sử dụng để chuẩn bị tinh trùng cho IVF hoặc

ICSI.



Trong phương pháp này, tinh dịch được ly tâm trên thang nồng độ

chứa các hạt silica dạng keo được bao phủ bởi silane, chính các hạt này

giúp phân tách các tinh trùng dựa trên tỷ trọng của chúng. Ngoài ra, trong

quá trình ly tâm, các tinh trùng di động cũng tích cực bơi xuyên qua các

lớp dung dịch và kết thành cặn ở đáy ống ly tâm.

Người ta thường sử dụng thang nồng độ 2 lớp: 40% ở trên và 80%

ở dưới để tạo thang nồng độ không liên tục.

Môi trường chuẩn bị:

SilSelect 90% (Fertipro. Bỉ)

SilSelect 45% (Fertipro. Bỉ)

Ferticult Flushing (Fertipro. Bỉ)


1. Chuẩn bị môi trường gradient trên thang nồng độ trong ống

falcon: đặt 1 ml môi trường gradient 40% ở trên và 1 ml 80% ở

dưới.


3. Đặt 1 ml tinh dịch lên lớp môi trường lọc. Ly tâm 300 – 400g trong

15 – 30 phút. Có thể sử dụng nhiều hơn 1 ống ly tâm/ 1 mẫu tinh

dịch nếu cần thiết.

4. Loại bỏ phần dịch nổi, chừa lại cặn.

5. Chuyển cặn lắng vào 4ml môi trường rửa và ly tâm ở 200g trong 4

– 10 phút.

6. Rửa lại lần 2 (lặp lại bước 4, 5).

7. Hút bỏ phần trên, chừa lại 0,3 ml, đánh giá mật độ, độ di động của

cặn thu được.



Có

300 – 500g / 15 – 30 phút

IV. Chuẩn bị tinh trùng trong một số trường hợp khác

Bỏ dịch nổi

Mẫu TT

SS 45%

SS 90%

SS 45%

Nhiều TT Ít TT Rất ít TT

Ly tâm trên

thang nồng độ

Nhiều

Mẫu tinh dịch Tìm tinh trùng TESE Không

Có

Vài tinh trùng Lựa chọn

phương pháp Simple wash

Ly tâm 300g/10 phút

1

2

3

4

5

PVP + tinh trùng

Noãn

1

ICSI

0,2ml cặn

G-MOPS

2ml Sperm preparation

Chuyển cặn

Lặp lại lần 2

Mẫu PESA



1. Chuẩn bị tinh trùng đối với trƣờng hợp tinh

trùng thu từ mào tinh

Kỹ thuật thu nhận tinh trùng từ mào tinh (PESA, MESA) thường

dùng trong trường hợp không có tinh trùng do tắc nghẽn hơn là do rối

loạn chức năng tinh hoàn. Thông thường, có thể thu được một lượng lớn

tinh trùng phục vụ cho mục đích điều trị. Tinh trùng thu được trong

trường hợp này thường ít lẫn hồng cầu và các tế bào không phải tinh

trùng, do đó có thể phân lập và chọn lựa tinh trùng di động dễ dàng.

Nếu số lượng tinh trùng thu được nhiều thì sử dụng phương pháp

gradient không liên tục, ngược lại nếu lượng tinh trùng thu được thấp (chỉ

tìm thấy vài tinh trùng trong mẫu) thì nên sử dụng phương pháp rửa đơn

giản.

a. Chuẩn bị tinh trùng bằng phương pháp gradient

trên thang nồng độ không liên tục


Sil Select 90%

Sil Select 45%

G-IVF đã làm ấm trước ở 37oC, CO2 5% ít nhất 2 giờ.


1. Thực hiện các bước chuẩn bị tinh trùng bằng phương pháp

Gradient ở trên từ bước 1 đến bước 4.

2. Cặn tinh trùng được trộn với 3 – 4ml môi trường G-IVF, ly tâm ở

300 – 400g trong 5-10 phút.

3. Hút bỏ dịch nổi, chừa lại khoảng 0,3 ml cặn tinh trùng.

4. Để tube chứa tinh trùng ở 37oC, CO2 5% ít nhất 15 phút để tinh

trùng di động bơi ra khỏi cặn.

5. Hút khoảng 0,2 ml dịch nổi chứa tinh trùng di động sang ống ly

tâm mới (vô trùng).



6. Kiểm tra tinh trùng thu được dưới kính hiển vi đảo ngược để

đánh giá mật độ và đi động của tinh trùng sau khi chuẩn bị.

7. Để tube này trong tủ thao tác cho đến khi chuẩn bị làm ICSI.

b. Chuẩn bị tinh trùng bằng phương pháp rửa đơn

giản

Phương pháp rửa đơn giản giúp thu được số lượng tinh trùng cao

nhất, thích hợp với những mẫu tinh dịch chỉ có vài tinh trùng để sử dụng

cho ICSI. Những mẫu này thường là crypto, mẫu thu nhận từ PESA hay

TESE.


G-IVF làm ấm ít nhất 2 giờ ở 37oC, CO2 5% trước khi sử dụng.

Quy trình thực hiện


2. Pha loãng toàn bộ mẫu tinh dịch với môi trường theo tỷ lệ 1:1

trong ống ly tâm vô trùng đáy nhọn 15ml (ống falcon) (mẫu

cryptozoospermia). Đối với mẫu PESA và TESE thì tiến hành ly tâm,

không cần pha loãng.

3. Cho toàn bộ mẫu vào tube ly tâm đáy nhọn vô trùng.

4. Ly tâm gom mẫu ở 300 – 500 g trong 5 – 10 phút.

5. Hút bỏ dịch nổi một cách cẩn thận, chừa lại khoảng 0,3ml cặn.

6. Chuyển cặn sang tube ly tâm đáy tròn 5ml có sẵn 3ml môi trường

mới.

7. Ly tâm lặp lại ở 300 – 500g trong 3 – 5 phút.

8. Hút bỏ dịch nổi.

9. Chừa lại khoảng 0,2 ml cặn và trộn đều.

10. Lặp lại bước 7 và 8 với 2ml môi trường mới.

11. Kiểm tra tinh trùng thu được dưới kính hiển vi đảo ngược để đánh

giá mật độ và đi động của tinh trùng sau khi chuẩn bị.



12. Để tube này ở trong tủ thao tác cho đến khi chuẩn bị làm ICSI.

Chú ý

Có thể tăng tốc độ và thời gian ly tâm để thu được nhiều tinh trùng

hơn. Điều này tùy thuộc vào kinh nghiệm của người thao tác.

2. Chuẩn bị tinh trùng đối với trƣờng hợp tinh

trùng thu từ tinh hoàn

Tinh trùng trong tinh hoàn được thu nhận bằng kỹ thuật sinh thiết

mở (TESE). Tinh trùng thu nhận từ kỹ thuật này có lẫn các tế bào mầm và

rất nhiều hồng cầu, do đó cần phải làm sạch mẫu để trước khi áp dụng

các phương pháp chuẩn bị tinh trùng thông thường. Để tăng lượng tinh

trùng thu được từ các ống sinh tinh, mẫu cần phải được xử lý bằng

phương pháp cơ học:

1. Dùng lamelle ép mô tinh hoàn vào đáy đĩa petri để thu dịch tiết ra

từ mô tinh hoàn.

2. Dùng kim nhọn hay kẹp để xé nhỏ mô tinh hoàn, cắt đứt các ống

sinh tinh để thu tinh trùng trong đĩa chứa môi trường nuôi cấy.

Mẫu tinh trùng thu nhận từ phương pháp TESE cũng được chuẩn bị

tương tự như mẫu thu nhận tinh trùng từ PESA hoặc MESA.

3. Chuẩn bị tinh trùng trong trƣờng hợp xuất tinh

ngƣợc dòng

Ở một số nam giới, tinh dịch đi vào bàng quang khi xuất tinh, kết

quả là không có tinh dịch hoặc không xuất tinh rõ ràng. Điều trị xuất tinh

ngược dòng bằng thuốc không hiệu quả, do đó tinh trùng vẫn có thể

được tìm thấy trong nước tiểu. Nước tiểu có pH acid gây ảnh hưởng xấu

đến tinh trùng, do đó nên kiềm hoá nước tiểu trước khi lấy mẫu. Có thể

kiềm hóa nước tiểu bằng cách cho bệnh nhân uống sodium bicarbonate,



để gia tăng cơ hội thu được tinh trùng từ trong nước tiểu mà vẫn duy trì

được đặc tính di động của tinh trùng (Mahadevan và cs, 1981).

Tại phòng xét nghiệm, bệnh nhân được yêu cầu:

1. Uống sodium bicarbonate trong 24 giờ trước khi lấy mẫu

2. Tại thời điểm lấy mẫu, bệnh nhân đi tiểu nhưng không tiểu hết.

3. Xuất tinh vào lọ vô trùng bằng cách thủ dâm.

4. Đi tiểu vào lọ vô trùng thứ 2 có chứa môi trường nuôi (nhằm kiềm

hoá nước tiểu).

Xử lí mẫu

1. Ly tâm 500 g trong 8 phút để cô đặc mẫu tinh trùng từ nước tiểu.

2. Chuẩn bị tinh trùng bằng phương pháp gradient trên thang nồng

độ không liên tục.

Đề nghị:

Có thể điều chỉnh quy trình ly tâm trên thang nồng độ với

những mẫu khác nhau như: giảm thể tích dung dịch gradient để rút

ngắn quãng đường di chuyển của tinh trùng hoặc tăng thời gian ly

tâm đối với những mẫu có độ nhớt cao nhằm tăng tối đa hiệu suất thu

hồi.



PHẦN V: QUY TRÌNH

TRỮ LẠNH TINH TRÙNG



A. Giới thiệu

Trữ lạnh tinh trùng là một phần việc quan trọng của phòng xét

nghiệm có phân tích tinh dịch, liên quan đặc biệt đến vô sinh lâm sàng.

Kỹ thuật này ra đời vào cuối thập niên 1940, từ việc khám phá ra vai

trò của glycerol giúp bảo vệ tinh trùng chống lại những tổn thương do

quá trình hạ nhiệt độ để bảo quản tinh trùng người trong nước đá khô ở -

79oC (Polge và cs, 1979, Bunge & Sherman, 1953; Bunge và cs., 1954). Sau

đó, nitơ lỏng được sử dụng trong đông lạnh tinh trùng và kỹ thuật này

phát triển nhanh chóng ở nhiều quốc gia trên thế giới (Perloff và cs., 1964;

David và cs., 1980; Clarke và cs., 1997; Leibo và cs., 2002).

Có nhiều quy trình trữ lạnh tinh trùng và chất bảo quản đông lạnh

khác nhau. Tỷ lệ sống sót của tinh trùng sau đông lạnh, rã đông phụ thuộc

phần lớn vào việc giảm thiểu sự hình thành tinh thể nội bào. Để ngăn

chặn được sự hình thành của tinh thể nội bào cần phải sử dụng chất bảo

quản và tốc độ làm lạnh và làm ấm phù hợp (Sherman, 1990; Keel &

Webster, 1993; Watson, 1995). Khi trải qua giai đoạn trên -130oC (nhiệt độ

chuyển tiếp hình thành tinh thể đá), đặc biệt trong giai đoạn rã đông, có

thể xảy ra sự tái hình thành tinh thể đá nội bào, điều này gây tổn thương

đến khả năng sống của tinh trùng sau rã đông.

Tinh trùng người có thể chịu được sự thay đổi nhiệt độ (làm lạnh,

làm ấm). Tinh trùng ít nhạy cảm đối với nhiệt độ, do đó chúng ít bị tổn

thương trong quá trình trữ lạnh, rã đông so với các loại tế bào khác.

Nguyên nhân có thể là do màng tế bào tinh trùng là màng lipid kép, được

cấu tạo từ các acid béo không bão hoà nên tính thấm cao (Clarker và cs,

2003). Hơn nữa, lượng nước chứa trong tế bào tinh trùng thấp hơn (50%)

so với các tế bào khác nên khả năng chịu đựng với quá trình đông lạnh

cũng cao hơn. Tuy nhiên, quá trình đông lạnh gây tổn hại đến chức năng

của tinh trùng, đặc biệt là khả năng di động. Tỷ lệ sống trung bình của



tinh trùng sau trữ lạnh, rã đông khoảng 50% (Keel và Webster, 1993). Việc

tối ưu hoá quy trình trữ lạnh giúp giảm thiểu tổn thương lên tế bào tinh

trùng và làm tăng tỷ lệ thai lâm sàng (Woods và cs, 2004).

Tỷ lệ có thai sau khi thực hiện các kỹ thuật thụ tinh nhân tạo với

tinh trùng đông lạnh hiến có liên quan đến quá trình giải đông, thời gian

bơm tinh trùng, và các yếu tố khác như tuổi của người nhận, tiền sử có

thai và các rối loạn khác về buồng trứng và tử cung (Le Lannou & Lansac,

1993). Nếu tinh trùng được lưu trữ trong điều kiện thích hợp, chất lượng

tinh trùng sẽ ít bị ảnh hưởng theo thời gian. Đã có trẻ được sinh ra bằng

kỹ thuật thụ tinh với trứng từ tinh trùng được trữ lạnh trên 28 năm.

(Feldschuh et al, 2005;. Clarke và cs, 2006.)

B. Các lý do trữ lạnh tinh trùng

Tinh dịch của người bình thường được đông lạnh để sử dụng về

sau. Những người này cũng có thể hiến tinh trùng cho các trung tâm điều

trị hoặc ngân hàng tinh trùng, mẫu được lưu trữ dưới dạng vô danh. Tinh

trùng của người hiến tặng sử dụng trong AI, IUI, IVF hoặc ICSI cho các

mục đích sau:

Cho vợ của một người nam vô sinh, không có tinh trùng sống

hay tinh tử thích hợp cho ICSI, hoặc đã điều trị thất bại hay chi

phí cho điều trị quá cao.

Ngăn ngừa lây truyền một số bệnh do rối loạn di truyền.

Ngăn ngừa thai thiếu máu tán huyết do không tương thích

nhóm máu;

Sau khi sẩy thai tái phát, nếu sử dụng tinh trùng hiến có thể

giúp mang thai thành công;

Cho những phụ nữ độc thân muốn có con.



I. Bảo tồn khả năng sinh sản

Tinh dịch có thể được thu nhận và bảo quản trước khi nam giới

chuẩn bị phẫu thuật hay điều trị một số bệnh mà có thể ảnh hưởng đến

khả năng sinh sản của họ, như là:

Thắt ống dẫn tinh (Trong trường hợp thay đổi hôn nhân trong

tương lai hay muốn có thêm con).

Điều trị với các tác nhân gây độc tế bào hoặc xạ trị, mà có thể

ảnh hưởng quá trình sinh tinh vĩnh viễn (Meseguer và cs, 2006;.

Schmidt và cs, 2004.)

Thực hiện nhiệm vụ nguy hiểm. Ví dụ: trong quân đội. Ở nhiều

nước việc có con với tinh trùng của người chết được sự chấp

nhận của pháp luật.

II. Điều trị vô sinh

Tinh trùng của chồng được trữ lạnh để sử dụng cho vợ bằng thụ

tinh nhân tạo với tinh dịch của chồng (AIH), IUI, IVF hoặc ICSI trong các

trường hợp:

Có quá ít tinh trùng di động trong tinh dịch sau nhiều lần thử

tinh dịch đồ. (Lưu trữ để dành cho ICSI) (Bourne và cs, 1995.)

Điều trị vô sinh trong một thời gian dài nhưng vẫn chưa khỏi,

chẳng hạn như phẫu thuật do tắc nghẽn đường sinh dục hoặc

điều trị gonadotrophin ở hội chứng giảm gonadotropin ở vùng

dưới đồi-tuyến yên;

Thu nhận mẫu trong trường hợp đặc biệt, như xuất tinh có hỗ

trợ cho bệnh nhân chấn thương cột sống, tinh trùng xuất tinh

ngược dòng trong nước tiểu, hoặc phẫu thuật thu nhận tinh

trùng từ đường sinh dục;

Người chồng không thể lấy mẫu tươi vào ngày thực hiện quy

trình ART.



Chú ý

Khi đông lạnh mẫu tinh dịch bình thường để dự trữ hoặc điều trị

hiếm muộn, cần dự trữ ít nhất 03 mẫu nhằm đảm bảo cơ hội có thai. Với

mẫu tinh trùng bất thường, việc chia nhỏ mẫu cho AIH chưa được chứng

minh là có tác dụng tốt hơn.

Trong kỹ thuật ICSI thì chỉ cần một tinh trùng cho một tế bào

trừng, do đó đông lạnh mẫu có bất kỳ tinh trùng sống nào cũng đều có ý

nghĩa.

Trữ lạnh tinh dịch trước khi thực hiện kỹ thuật hỗ trợ sinh sản có

giá trị tâm lý đáng kể. Nó tạo hy vọng làm cha cho bệnh nhân.

Đối với bệnh nhân chuẩn bị điều trị bằng các nhân tố alkyl hóa

hoặc xạ trị cần thu nhận tinh trùng trước khi điều trị vì trong quá trình

điều trị, tinh trùng có thể bị đột biến. Những bệnh nhân này cần được tư

vấn để trữ lạnh tinh dịch.

C. Đánh giá rủi ro của kỹ thuật trữ lạnh và bảo quản

tinh dịch ngƣời

I. Nguồn mẫu

Đảm bảo tình trạng vật lý của các ống lưu trữ, mẫu tinh dịch và

phòng lưu trữ để giảm nguy cơ mất mẫu do trộm cắp hoặc cháy

nổ, hư hỏng ống trữ đông, hoặc thiếu nitơ lỏng.

Sự dụng các thiết bị đúng với mục đích sử dụng.

Hệ thống chứa và thay nitơ.

II. Thiết bị bảo hộ, an toàn đối với nhân viên

Thiết bị bảo vệ cá nhân.

Hệ thống báo động phát hiện lượng nitơ lỏng và oxy trong

không khí thấp.



III. Nguy cơ lây nhiễm chéo

Để giảm nguy cơ lây nhiễm chéo của các mẫu lưu trữ (ví dụ như lây

truyền HIV, viêm gan B hoặc C trong cung một bình trữ lạnh), cần chú ý

đến:

Loại dụng cụ chứa: cọng rạ hay straw và phương pháp hàn kín

các ống này (nhiệt hoặc polymer);

Quy trình lưu trữ và bảo quản: nitơ lỏng hoặc hơi nitơ .

Quy trình và phương pháp lưu trữ những mẫu có nguy cơ lây

nhiễm cao (mẫu biết hoặc nghi ngờ có chứa virus).

IV. Đảm bảo an toàn cho mẫu đông lạnh

Chia nhỏ mẫu và lưu trữ ở các vị trí khác nhau để làm giảm

nguy cơ mất mẫu hoàn toàn.

Kiểm tra chéo 2 lần tên tuổi của mẫu ở mỗi bước.

Sử dụng nhãn tốt và ghi mã số nhận diện mẫu.

Có thủ tục kiểm kê thường xuyên các vật liệu và các mẫu còn lại

trong bồn chứa đông.

D. Quy trình đông lạnh – rã đông tinh trùng

I. Quy trình đông lạnh tinh dịch

1. Quy trình chuẩn

a. Chuẩn bị chất bảo quản đông lạnh và ống đông

Sử dụng môi trường Sperm Freeze (FertiPro – Bỉ). Chia nhỏ môi

trường thành tube nhỏ trong ống ly tâm có thể tích 5ml và cất trong tủ

lạnh ở nhiệt độ 2 – 8oC cho đến khi sử dụng.

b. Chuẩn bị cryotube

Chuẩn bị số cryotube cần thiết để đông tinh trùng.



Ghi các thông tin lên cryotube: họ tên bệnh nhân, năm sinh, số

CMND; ngày trữ đông, mã số đông.

Chú ý

Tất cả các quy trình liên quan đến việc xác định mẫu của bệnh nhân

hay người cho (bao gồm việc nhận mẫu, chuẩn bị, ghi ký hiệu, đặt mẫu

vào bình chứa, rã đông,…) được kiểm tra chéo bởi 2 người và ký tên xác

nhận.

Chỉ thực hiện mỗi lần một mẫu để tránh nhầm lẫn.

c. Chuẩn bị trước khi đông

1. Để tube môi trường Sperm Freeze ở nhiệt độ phòng trong khoảng

10 phút trước khi sử dụng.

2. Ghi các thông tin lên cryotube: họ tên bệnh nhân, năm sinh, số

CMND; ngày trữ lạnh, mã số đông.

3. Đánh giá sơ bộ tinh trùng, đo thể tích tinh dịch, đánh giá độ di

động và mật độ tinh trùng trước khi thực hiện trữ đông.

4. Cho toàn bộ tinh dịch vào tube 14ml đáy tròn.

5. Nhỏ từ từ từng giọt chất bảo quản đông và tube chứa tinh dịch

theo tỷ lệ: 0,7 : 1.

6. Sau khi hoàn tất, nhỏ một giọt tinh dịch lên lame để đánh giá độ di

dộng của tinh trùng trước khi trữ đông.

7. Đậy chặt nắp, để mẫu ổn định trong 5 phút ở nhiệt độ phòng trước

khi tiến hành trữ đông.

8. Chuyển hỗn hợp vào cryotube.



Chú ý

Glycerol nồng độ cao có thể gây hại cho tinh trùng, vì vậy nên nhỏ

từng giọt chất bảo quản kết hợp với lắc đều hỗn hợp.

Thể tích hỗn hợp không chiếm quá 90% thể tích cryotube.

d. Thực hiện đông tinh trùng

Quá trình đông tinh trùng được thực hiện bằng máy theo hướng

dẫn của nhà sản xuất qua các bước sau:

1. Đặt cryotube vào giá đựng.

2. Đổ nitơ lỏng bồn chứa nitơ (cryobath) của máy.

3. Lắp đặt hệ thống theo hướng dẫn.

4. Khởi động máy và vặn núm chỉnh tốc độ quạt ở chế độ 500 vòng

trong 6 phút

5. Chuyển sang chế độ 1000 vòng trong 20 phút.

6. Thả giá đựng có gắn cryotube vào bồn nitơ lỏng.

7. Gắn cryotube lên thanh nhuôm (cane) và đặt trong khay chứa trong

bình nitơ lỏng và trữ đông cho đến khi sử dụng.

2. Quy trình đông lạnh dành cho các mẫu tinh trùng

ít và tinh trùng thu nhận bằng phẫu thuật

a. Đối với mẫu tinh dịch chỉ có ít tinh trùng di

động, hay tinh trùng được thu nhận từ tinh hoàn hay

mào tinh, có thể được trữ lạnh cho ICSI:

Khi cần thiết, ly tâm tinh dịch 1500g trong 10 phút để cô đặc tinh

trùng trong thể tích nhỏ (0,5ml), bổ sung chất bảo quản lạnh và xử lý theo

quy trình bình thường.

b. Đối với dịch mào tinh, dịch ly trích từ tinh hoàn

hoặc các dịch huyền phù tinh trùng khác :



Xử lý bằng phương pháp swim-up hoặc gradient, sau đó cho vào

môi trường dành cho chuẩn bị tinh trùng có các chất bảo quản đông lạnh

thương mại có chứa albumin người rồi đông lạnh theo quy trình bình

thường.

c. Quy trình thực hiện

1. Nếu thể tích mẫu lớn hơn 2.0 ml, và có quá ít tinh trùng di động, ly

tâm ở 1500g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.

2. Loại bỏ phần nổi, chừa lại khoảng 1ml và lắc đều để hòa cặn. Xác

định tỷ lệ phần trăm tinh trùng di động, nếu ít tinh trùng di động,

ước đoán mật độ di động trực tiếp trên lame.

3. Thực hiện đông và trữ đông tinh trùng như quy trình chuẩn ở trên.

II. Giải đông tinh dịch đông lạnh

1. Trước khi sử dụng, lấy cryotube chứa tinh trùng đông lạnh cần rã

đông ra khỏi bình nitơ lỏng, đặt trên giá hoặc khăn giấy cho đến

đến khi đạt đến nhiệt độ phòng (khoảng 10 đến 20 phút).

2. Đánh giá độ di động tinh trùng sau rã đông (đánh giá trên tiêu bản

ướt).

3. Loại bỏ chất bảo quản đông lạnh bằng cách pha loãng và rửa với

môi trường. Thực hiện rửa nhiều lần, mỗi lần với thể tích nhỏ.



PHỤ LỤC



A. Trang thiết bị và an toàn thiết bị

I. Các thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm

Nam khoa

1. Các trang thiết bị thông thƣờng trong phòng xét

nghiệm

Bàn làm việc, với mặt bàn không thấm nước.

Tủ thao tác

Tủ lạnh

Máy ly tâm.

Máy ly tâm phải đạt 300 – 500g (đối với các mẫu tinh

trùng thường quy và nước tiểu)

Máy ly tâm tốc độ cao hơn, đạt 1500g (đối với mẫu nghi

ngờ azoospermia).

Máy vortex: dùng để pha loãng tinh dịch.

Tủ ấm (37oC), thường có 5% (v/v) CO2 (nếu cần).

Kính hiển vi quang học và vật kính: dùng để đếm mật độ tinh

trùng với độ nhạy cao và để xét nghiệm phản ứng cực đầu).

Máy bách phân bạch cầu

Đồng hồ bấm giờ: dùng cho chuẩn bị mẫu mẫu quản lý chất

lượng.

Tủ hút để trữ và làm việc với các hoá chất hoặc thuốc nhuộm.

Thùng rác:

Thùng bỏ các vật sắc, nhọn.

Thùng chứa rác nguy hiểm.

Máy vi tính: lưu trữ, in ấn kết quả xét nghiệm

Bồn rửa tay.



2. Các dụng cụ, hóa chất dùng trong xét nghiệm

tinh dịch:

a. Dụng cụ

Găng tay dùng 1 lần.

Lọ đựng mẫu tinh dịch: Lọ dùng một lần có miệng rộng và có

vạch chia thể tích.

Giấy lọc, 90g/m2 (dùng để lọc thuốc nhuộm).

Giấy đo pH (đo được trong khoảng 6 – 10).

Buồng đếm hồng cầu: buồng đếm Neubauer cải tiến, có lamelle

phủ dày (độ dày số 4, 0.44mm).

Lame:

Lame làm bằng thuỷ tinh, có thiết kế bề mặt nhám và

lamelle phủ (độ dày số 1.5, 0.16 – 0.19mm).

Lame trơn dùng để kéo trải giọt tinh dịch trên lame khác

để tạo tiêu bản

Đầu col: vàng, xanh

Micropipette: 1-10µl, 10-100µl, 100-1000µl

Pipette

Pipette Pasteur với ống nhỏ giọt bằng nhựa, pipette

chuyển bằng nhựa dùng một lần hoặc pipette tự động

dùng để trộn tinh dịch.

Pipette loại bỏ khí.

Pipette đo từ 10 - 100μl.

Bút bi/bút chì:

Dùng để viết trên phần mờ của tiêu bản (phần nhám); chỉ

cần một cây bút chì có độ mềm HB.

Bút chì đánh dấu



Đĩa Nune 4 giếng: dùng cho xét nghiệm eosin-nigrosin.

Khăn giấy: không có xơ vải.

b. Hoá chất

Môi trường đông lạnh (nếu cần).

Môi trường gradient.

Thuốc nhuộm Papanicolaou.

Thuốc nhuộm eosine-nigrosine

Dung dịch đếm mật độ tinh trùng

3. Các dụng cụ, hóa chất bảo vệ an toàn trong

phòng xét nghiệm

Dụng cụ sơ cứu.

Xà phòng hoặc dung dịch sát khuẩn da.

Cồn 70o

Cồn 90o

Thuốc rửa mắt.

Dung dịch sodium hypochlorite 1% (v/v) trong nước tinh khiết.

Cẩm nang an toàn sinh học phòng thí nghiệm (WHO, 2004).

Bảng báo cáo kết quả xét nghiệm tinh dịch.

II. Các mối nguy trong phòng xét nghiệm Nam khoa

Tinh dịch có khả năng truyền nhiễm bệnh, nên mọi thao tác phải

hết sức cẩn thận. Đối với phòng xét nghiệm Nam khoa, những vi sinh vật

có khả năng lây nhiễm từ tinh dịch là HIV, hepatitis B và C (HBV và HCV).

Nhân viên phòng xét nghiệm nên coi tất cả các mẫu tinh dịch là mẫu có

nhiễm bệnh và phải thật cẩn thận khi thực hiện các xét nghiệm với mẫu.



III. Các thao tác an toàn cho nhân viên phòng thí

nghiệm

Tất cả nhân viên phòng xét nghiệm nên được tiêm ngừa viêm

gan siêu vi B.

Không được ăn uống, hút thuốc hoặc cất trữ thức ăn trong

phòng xét nghiệm Nam khoa.

Không hút pipette bằng miệng. Sử dụng pipette cơ học để hút

tinh dịch.

Tất cả nhân viên phòng xét nghiệm nên mặc đồ phòng thí

nghiệm hoặc mặc áo choàng dùng một lần trong phòng thí

nghiệm và cởi bỏ khi ra khỏi phòng thí nghiệm.

Nhân viên phòng xét nghiệm nên đeo găng sử dụng một lần

(bằng bao su, nhựa hoặc vinyl, có bột hoặc không bột), nhất là

khi cầm mẫu tinh dịch tươi hoặc đông, hay tinh tương hoặc các

mẫu sinh học khác. Phải bỏ găng tay khi rời khỏi phòng hoặc

khi dùng điện thoại hay máy vi tính và không được sử dụng lại

găng này.

Nhân viên nên rửa tay thường xuyên, nhất là trước khi rời khỏi

phòng thí nghiệm, sau khi xét nghiệm mẫu và sau khi gỡ bỏ áo

choàng và găng.

Nhân viên nên tránh bị thương bởi các vật sắc nhọn để tránh

nhiễm bệnh từ tinh dịch, tránh để da, vết thương tiếp xúc trực

tiếp với tinh dịch.

Tránh làm đổ mẫu tinh dịch, máu hoặc nước tiểu.

Nên để các vật sắc nhọn (kim, dao) trong một hộp đựng riêng

sau khi sử dụng. Niêm phong hộp này trước khi đầy và loại bỏ

như các vật nguy hiểm khác.



Tất cả các thứ có khả năng độc hại (găng tay, lọ chứa mẫu) nên

được thu gom và loại bỏ một cách hợp lý.

Tất cả nhân viên nên đeo khẩu trang thường hoặc khẩu trang

phẫu thuật khi làm các xét nghiệm có khả năng tạo giọt hoặc

sol khí, ví dụ như vortex và ly tâm trong các vật chứa không đậy

nắp. Không nên đẩy mạnh những giọt cuối của mẫu tinh dịch ra

khỏi pipette vì nó có thể tạo ra sol khí.

Nhân viên nên đeo kính bảo hộ, găng tay và giày kín khi cần

thiết, ví dụ như khi sử dụng nitơ lỏng.

IV. An toàn khi sử dụng các thiết bị phòng xét nghiệm

Bề mặt bàn làm việc và các dụng cụ được sử dụng lại nên được

rửa sạch và tiệt trùng. Cần thực hiện các quy tắc an toàn sau:

Hằng ngày, sau khi xét nghiệm xong phải:

Lau sạch chỗ làm việc bằng thuốc tẩy như sodium hypochlorite

0,1% (1g/l) hoặc những chất tẩy rửa tương tự, đợi ít nhất 1 giờ

(hoặc qua đêm) rồi rửa lại bằng nước.

Ngâm các buồng đếm và lamelle phủ trong xà phòng có

sodium hypochlorite 0,1% (1g/l) hoặc các chất tẩy khác qua

đêm. Rửa lại bằng nước.

Khi làm đổ mẫu:

Nếu bên ngoài lọ đựng mẫu bị dơ thì rửa với chất tẩy rửa,

sodium hypochlorite 0,1% (1g/l) hoặc các chất tẩy tương tự, sau

đó rửa lại bằng nuớc.

Nếu quá trình thao tác làm đỗ mẫu: phải rửa lại bàn làm việc

bằng chất tẩy rửa (Ví dụ sodium hypochlorite 1% (10g/l) hoặc

các chất tẩy rửa tương tự, đợi ít nhất 4 giờ rồi rửa lại bằng

nước).



V. An toàn khi sử dụng nitơ lỏng

Nitơ lỏng rất nguy hiểm, phải cẩn thận khi sử dụng và chỉ sử

dụng những bình chứa chuẩn, không được dán kín miệng bình

chứa. Dùng kẹp để lấy mẫu từ nitơ lỏng ra ngoài.

Đeo mặt nạ bảo vệ hoặc kính bảo hộ để bảo vệ mắt. Sử dụng

bao tay làm bằng da hoặc vật liệu cách điện khô, rộng vừa phải

để bảo vệ tay. Mang giày kín để bảo vệ chân.

Khi nitơ lỏng đổ trên một bề mặt thì nó có xu hướng tràn trên

khắp bề mặt và làm lạnh một vùng rộng. Những vật mềm và

dẻo ở nhiệt độ phòng thường trở nên cứng và giòn ở nhiệt độ

của nitơ lỏng. Nhiệt độ cực thấp có thể tạo ra những vết thương

nghiêm trọng. Nếu bị nhỏ lên da thì da có triệu chứng như bị

bỏng. Khí từ nitơ lỏng rất lạnh, những vùng mô mỏng manh

như mắt có thể bị tổn thương do khí này mặc dù nó không ảnh

hưởng đến da mặt hoặc da tay.

Đứng tránh xa khi nitơ lỏng sôi và bắn ra ngoài, và tránh cả hơi

nitơ lạnh. Khi sử dụng một bình chứa ấm hoặc khi nhúng một

vật nào đó vào nitơ lỏng thì sẽ xảy ra hiện tượng sôi và bắn

tung toé. Phải luôn thao tác chậm để hạn chế tối đa hiện tượng

này. Tránh chạm những ống dẫn không cách điện. Không được

chạm bất kỳ phần cơ thể không được bảo vệ nào vào ống hoặc

bình chứa nitơ lỏng. Kim loại ở nhiệt độ cực lạnh có thể dán

dính nhanh và thịt có thể bị xé ra khi cố tách nó ra khỏi kim loại

này.

Làm việc trong khu vực thông thoáng. Một lượng nitơ lỏng nhỏ

có thể hình thành một lượng khí lớn (ở nhiệt độ phòng nó tạo

ra một lượng khí có thể tích nhiều gấp 9 lần so với thể tích

lỏng). Nếu khí nitơ bốc hơi trong phòng kín thì phần trăm oxy



trong không khí có thể sẽ thấp và có thể gây ngạt. Nên sử dụng

đầu dò đo oxy ở nơi trữ nitơ lỏng, đầu dò sẽ phát báo động khi

mực oxy dưới 17% (v/v).

Chỉ sử dụng ống tube và cọng rạ được thiết kế dành riêng cho

đông lạnh trong nitơ lỏng. Phải luôn luôn cẩn thận vì những vật

này có thể nổ khi chúng được làm ấm.

B. Cách tính lực ly tâm

Tinh trùng phải chịu một áp lực trong quá trình ly tâm và độ lớn

của lực này phụ thuộc vào tốc độ quay (N, vòng/phút, r.p.m) và khoảng

cách từ tâm rotor đến đáy tube ly tâm (nơi đo lực ly tâm) (radius, R, cm).

Lực ly tâm được tính theo công thức: 1,118 x 10-5R x N2. Ví dụ, với bán

kính là 8,6cm, ly tâm ở 5000 r.p.m thì lực ly tâm là 2404g; với bán kính

13.5cm, ly tâm ở 3900 r.p.m thì lực ly tâm là 2296g.



Giản đồ xác định lực ly tâm từ bán kính rotor và tốc độ quay

Nối một đường thẳng từ cột bán kính rotor (cm, cột bên trái) với

tốc độ quay (r.p.m, cột bên phải) và cắt cột giữa ở lực ly tâm. Ví dụ, với

bán kính rotor là 8cm và tốc độ quay là 2500r.p.m thì lực ly tâm ở khoảng

550g. (giá trị tính được là 559g).



C. Sử dụng kính hiển vi

Để đánh giá tinh dịch theo phương pháp được giới thiệu trong cẩm

nang này cần có một một kính hiển vi phản pha. Kính hiển vi này phải có

công suất bóng đèn tối thiểu là 50W, có 2 thị kính, một tụ sáng và các vật

kính với độ phóng đại x10, x20 (hoặc x25) và x40 (hoặc x63) (dùng cho các

đánh giá tổng quan, độ di động, tỷ lệ sống và đếm tinh trùng, và tìm tinh

trùng trong mẫu ly tâm), một vật kính dầu x100 (dùng cho đánh giá hình

dạng và tỷ lệ sống).

Quy trình mô tả dưới đây sẽ đảm bảo cho hình ảnh tốt nhất khi

quan sát kính hiển vi. Nếu đường chiếu ánh sáng được sắp thẳng hàng

và điều chỉnh thì hình ảnh sẽ rõ, sinh động và hầu như không làm mỏi

mắt. Cần thực hiện quy trình sau khi sử dụng một kính hiển vi mới

hoặc khi hình ảnh quan sát trên kính không tốt.

I. Load mẫu

1. Đặt 10μl tinh dịch lên lame, phủ lamelle 22mm x 22mm (độ dày

1.5; 0,17mm) và đặt tiêu bản lên bàn kính. Bạn cũng có thể sử

dụng một trắc vi vật kính thay cho lame tinh dịch để điều chỉnh

kính hiển vi.

2. Bật đèn và chỉnh cường độ sáng cho độ tương phản cao nhất

mà mắt vẫn cảm thấy thoải mái.

3. Chọn vật kính pha dương x10. Quay bánh điều chỉnh tụ sáng

đúng với độ phóng đại của vật kính.



Chú ý

Nếu kính hiển vi là loại có 3 thị kính (trong đó 1 thị kính được dành

cho máy quay phim để chụp hình hoặc quay phim) thì máy sẽ có một nút

chỉnh độ lệch sáng, thường nằm ở bên phải thị kính. Nút này có 3 chế độ

chỉnh: một chế độ cho phép tất cả ánh sáng đi qua thị kính, một chế độ

cho phép tất cả ánh sáng đi tới camera và cái thứ 3 chia nửa ánh sáng qua

thị kính và nửa tới camera.

II. Điều chỉnh thị kính

Điều chỉnh khoảng không giữa thị kính tới mắt bằng cách

kéo ra, đẩy vào.

III. Điều chỉnh làm rõ nét hình ảnh

1. Quay ốc sơ cấp để di chuyển bàn kính lên gần vật kính x20 hoặc

x40. Quan sát vật kính và bàn kính ở trước hoặc 2 bên khi quay

nút vặn, không nhìn qua thị kính, để tránh làm vỡ vật kính và

tiêu bản. Sử dụng ốc sơ cấp để điều chỉnh độ cao của bàn kính

cho đến khi tiêu bản gần đụng vào vật kính.

2. Quan sát qua thị kính, từ từ vặn ốc sơ cấp để dịch chuyển bàn

kính ra xa vật kính cho đến khi quan sát thấy mẫu. Vặn ốc vi cấp

đến khi quan sát rõ mẫu.

Chú ý

Nếu không quan sát được mẫu thì thử lấy nét ở cuối tiêu bản để

đạt khoảng cách gần với mặt phẳng lấy nét đúng.

IV. Lấy nét tại thị kính

Với một số kính hiển vi, 2 thị kính có thể được điều chỉnh riêng

biệt. Với một số khác khi điều chỉnh 1 thị kính thì thị kính kia

cũng tự động được điều chỉnh theo.



Những thị kính có thể điều chỉnh được thường được thước đo

“+ / 0 / -“. Để thị kính ở vạch “0” trước khi điều chỉnh.

Đối với kính hiển vi điều chỉnh 1 thị kính thì chỉ nhìn qua thị kính

điều chỉnh (nhắm hoặc che mắt kia đi).

Lấy nét hình ảnh của mẫu bằng ốc vi cấp. Nên quan sát một vật

không di động ví dụ như tinh trùng chết, cặn hoặc lưới ô micro

trên tiêu bản.

Lấy nét ở thị kính điều chỉnh bằng cách nhìn qua nó và nhắm

hoặc che mắt kia. Quay vòng điều chỉnh ở dưới thị kính đến “+”

hoặc “-“ cho đến khi quan sát rõ vật.

V. Chỉnh độ sáng

Đóng màng chắn sáng (che nguồn sáng ở chân kính).

Tăng hoặc giảm độ sáng bằng nút vặn ở bên trái hoặc phải tụ

sáng cho đến khi tụ sáng tập trung rõ nét nhất, lúc này vòng

ánh sáng sẽ nhỏ và rõ, thường là khi tụ sáng ở vị trí cao nhất.

Rìa ngoài ánh sáng có thể thay đổi từ xanh qua đỏ khi tụ sáng

được chỉnh đúng (quang sai màu sắc), và rìa ngoài tụ sáng sẽ

hơi mờ. Ánh sáng có thể có hoặc không có tâm.

Chú ý

Nếu độ mở vi trường không có màng iris thì tập trung vào một vật

rõ nét (ví dụ như điểm chấm bút chì) đặt trên nguồn sáng.

VI. Điều chỉnh tâm tụ sáng

Lấy tâm màng chắn sáng bằng cách chỉnh các nút vặn điều

chỉnh tâm tụ sáng. Thường có 2 nút vặn chéo nhau ở đằng

trước hoặc bên dưới tụ sáng.

Khi hình ảnh ánh sáng được centred thì mở màng chắn sáng để

ánh sáng chiếu vào vi trường. Không được mở máng sáng dưới

điểm này.



Đóng dần độ mở của tụ sáng cho đến khi không còn chói nữa.

Chú ý

Ngay bên dưới bên phải nút vặn chỉnh tâm tụ sáng có thể có

những nút vặn khoá vị trí của tụ sáng. Cẩn thận không được vặn chúng

khi đang điều chỉnh tâm tụ sáng vì khi những nút này bị lỏng thì tụ sáng

sẽ bị rơi ra khỏi kính hiển vi.



D. Mẫu kết quả phân tích tinh dịch



TÀI LIỆU THAM KHẢO



1. Alvareaz C và cs. (2003). Biological variation of seminal parameters

in healthy subjects. Human Reproduction, 18:2082-2088.

2. Andersen AG và cs. (2000). High frequency of sub-optimal semen

quality ini an unselected population of young men. Human

Reproduction, 15:366-372.

3. Baker HW, Kovacs GT (1985). Spontaneous improvement in semen

quality: regreeion towards the mean. International Journal of

Andrology, 8:421-426.

4. Behre HM và cs. (2000). Diagnosis of male infertility and

hypogonadism. In: Neischlag E, Behre HM, eds. Andrology, mail

reproductive health and dysfunction. Berlin, Springer: 92.

5. Berman NG và cs. (1996). Methodological issues in the analysis of

human sperm concentration data. Journal of Andrology, 17:68-73.

6. Boomsma CM và cs. (2004). Ssemen preparation techiniques for

intrauterine insemination. Cochrane Database of Sustematic

Reviews, CD004507.

7. Boure H và cs. (1995). Sperm preparation for intracytoplasmic

injection: methods and relationship to fertilization results.

Reproduction, Fertility, Development, 7:177-183.

8. Brazil C và cs. (2004a). Standardized methods for semen evaluation

in a multicenter research study. Journal of Androlody, 25:635-644.

9. Bunge RGT, Sherman JK (1953). Fertilizing capacity of frozen human

spermatozoa. Nature, 172: 767-768.

10. Bunge RG et al. (1954). Clinical use of frozen semen: report of four

cases. Fertility and Sterility, 5:520-529.

11. Canale D và ds. (1994). Inter- and intra-individual variability of

sperm morphology adter selection with three different techniques:



layering, swimup form pellet and Percoll. Journal of

Endocrinological Investigation, 17:729-732.

12. Carlsen E và cs. (2004). Effects of ejaculatory frequency and season

on variations in semen quality. Fertility and Sterility, 82:385-366.

13. Castilla JA và cs. (2006). Influence of analytical and biological

variation on the clinical interpretation of seminal parameters.

Human Reproduction, 21:847-851.

14. Clarke GN et al. (1997). Artificial insemination and in-vitro

fertilization using donor spermatozoa: a report on 15 years of

experience. Human Reproduction, 12:722-726.

15. Clarke GN et al. (2003). Improved sperm cryopreservation using

cold cryoprotectant. Reproduction, Fertility, Development, 15:377-

381.

16. Clarke GN et al. (2006). Recovery of human sperm motility and

ability to interact with the human zonapellucida after more than 28

years of storage in liquid nitrogen. Fertility and Sterility, 86:721-722.

17. Cooper TG et al. (1993). Effects of multiple ejaculations after

extended periods of sexual abstinence on total, motile and normal

sperm numbers, as well as accessory gland secretions, from healthy

normal and oligozoospermic men. Human Reproduction, 8:1251-

1258

18. Cooper TG et al. (2007). Ejaculate volume is seriously

underestimated when semen is pipetted or decanted into cylinders

from the collection vessel. Journal of Andrology, 28:1-4.

19. Correa-Perez JR et al. (2004). Clinical management of men

producing ejaculates characterized by high levels of dead sperm

and altered seminal plasma factors consistent with

epididymalnecrospermia. Fertility and Sterility, 81:1148-1150.



20. De Jonge C et al. (2004). Influence of the abstinence period on

human sperm quality. Fertility and Sterility, 82:57-65.

21. de la Taille A et al. (1998). Correlation of genitourinary

abnormalities, spermiogram and CFTR genotype in patients with

bilateral agenesis of the vas deferens. Progress in Urology, 8:370-

376.

22. Daudin M et al. (2000). Congenital bilateral absence of the vas

deferens: clinical characteristics, biological parameters, cystic

fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations,

and implications for genetic counseling. Fertility and Sterility,

74:1164-1174.

23. David G et al. (1980). The success of A.I.D. and semen

characteristics: study of 1489 cycles and 192 ejaculates.

International Journal of Andrology, 3:613-619.

24. Feldschuh J et al. (2005). Successful sperm storage for 28 years.

Fertility and Sterility, 84:1017.

25. Handelsman DJ et al. (1984). Testicular function in potential sperm

donors: normal ranges and the effects of smoking and varicocele.

International Journal of Andrology, 7:369-382.

26. Holstein AF et al. (2003). Understanding spermatogenesis is a

prerequisite for treatment. Reproductive Biology and

Endocrinology, 1:107.

27. Iwamoto T et al. (2006). Semen quality of 324 fertile Japanese men.

Human Reproduction, 21:760-765.

28. Johanisson E et al. (2000). Evaluation of “round cells” in semen

analysis: a comparative study. Human Reproduction Update, 6:404-

412.

29. Jones DM et al. (1986). Immobilization of sperm by condoms and



their components. Clinical Reproduction and Fertility, 4:367-372.

30. Keel BA (2006). Within- and between-subject variation in semen

parameters in infertile men and normal semen donors. Fertility and

Sterility, 85:128-134

31. Keel BA, Webster BW (1993). Semen cryopreservation methodology

and results. In: Barratt CLR, Cooke ID, eds. Donor insemination.

Cambridge, Cambridge University Press: 71-96.

32. Le Lannou D, Lansac J (1993). Artificial procreation with frozen

donor semen: the French experience of CECOS. In: Barratt CLR,

Cooke ID, eds. Donor insemination. Cambridge, Cambridge

University Press: 152-169.

33. Leibo SP et al. (2002). Cryopreservation of human spermatozoa. In:

Vayena E et al., eds. Current practices and controversies in assisted

reproduction. Geneva, World Health Organization: 152-165.

34. Meseguer M et al. (2006). Sperm cryopreservation in oncological

patients: a 14-year follow-up study. Fertility and Sterility, 85:640-

645.

35. Ng KK et al. (2004). Sperm output of older men. Human

Reproduction, 19:1811-1815

36. Overstreet JW et al. (1980). In-vitro capacitation of human

spermatozoa after passage through a column of cervical mucus.

Fertility and Sterility, 34:604-606.

37. Perloff WH et al. (1964). Conception with human spermatozoa

frozen by nitrogen vapor technique. Fertility and Sterility, 15:501-

504.

38. Poland ML et al. (1985). Variation of semen measures within normal

men. Fertility and Sterility, 44:396-400.



39. Polge C et al. (1949). Revival of spermatozoa after vitrification and

dehydration at low temperatures. Nature, 164:626-627.

40. Pound N et al. (2002). Duration of sexual arousal predicts semen

parameters for masturbatory ejaculates. Physiology and Behavior,

76:685-689.

41. Rose NR et al. (1976). Techniques for detection of iso- and auto-

antibodies to human spermatozoa. Clinical and Experimental

Immunology, 23:175-199.

42. Schmidt KL et al. (2004). Assisted reproduction in male cancer

survivors: fertility treatment and outcome in 67 couples. Human

Reproduction, 19:2806-2810

43. Sherman JK (1990). Cryopreservation of human semen. In: Keel BA,

Webster BW, eds. CRC handbook of the laboratory diagnosis and

treatment of infertility. Boca Raton, CRC Press: 229-259.

44. Sobrero AJ, MacLeod J (1962). The immediate postcoital test.

Fertility and Sterility, 13:184-189.

45. Tyler JP et al. (1982a). Studies of human seminal parameters with

frequent ejaculation.

46. vonEckardstein S et al. (2000). Seminal plasma characteristics as

indicators of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

(CFTR) gene mutations in men with obstructive azoospermia.

Fertility and Sterility, 73:1226-1231

47. Watson PF (1995). Recent developments and concepts in the

cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-

thawing function. Reproduction Fertility and Development, 7:871-

891.



48. Weiske WH (1994). Minimal invasive

VasektomiemittelsFulgurationstechnik. Erfahrungenbei 1000

Patienten in 12 Jahren. Urologe, B34:448-452

49. Weiske WH et al. (2000). Clinical findings in congenital absence of

the vasa deferentia. Andrologia, 32:13-18.

50. WHO (1987). (prepared by Comhaire F et al.) Towards more

objectivity in diagnosis and management of male infertility.

International Journal of Andrology, (Suppl. 7): 22-24.

51. WHO (2004). Laboratory biosafety manual, 3rd ed. Geneva, World

Health Organization.

52. WHO (2010). Laboratory manual for the examination and

processing of human semen, 5rd ed. Geneva, World Health

Organization

53. Woods EJ et al. (2004). Fundamental cryobiology of reproductive

cells and tissues. Cryobiology, 48:146-156.

54. Zavos PM, Goodpasture JC (1989). Clinical improvements of specific

seminal deficiencies via intercourse with a seminal collection device

Sổ tay xét nghiệm và xử lý Tinh dịch đồ người - 2011

Documents

Transcript of Sổ tay xét nghiệm và xử lý Tinh dịch đồ người - 2011