Sintezna in biološka zdravila -...
Transcript of Sintezna in biološka zdravila -...
Pomen encimov in encimskih reakcij v biotehnologiji in
medicini; spreminjanje molekul, biosinteza zdravil.
Sintezna in biološka zdravila
asist. dr. Katja Kristan
Vsebina
• Zdravilo
• Sintezna zdravila
– Racionalno načrtovanje
– Rešetanje visokih zmogljivosti
– Virtualno rešetanje
– Mimetiki
– Naključja, klinična opažanja
• Biološka zdravila
Zdravilo Zdravilo = zdravilna učinkovina + pomožne snovi
Kako učinkovina deluje?
1. Veže se na encim in prepreči njegovo delovanje
(INHIBITORJI)
2. Veže se na receptor in sproži isti biološki odziv kot
endogena molekula (AGONISTI)
3. Veže se na receptor in ne sproži biološkega odziva
(ANTAGONISTI)
4. Sama učinkovina je protein.
Bolezen
Identifikacija in validacija
biološke tarče (2-5 let) Razvoj metod ter
odkritje „zadetkov“
(„hit discovery“)
Pot do novega zdravila
Spojina vodnica
in optimizacija do
končne spojine –
učinkovine (2-5 let)
Predklinične študije
(varnost, toksičnost,
biološka aktivnost) 1-3 leta
Klinične študije
(zdravi prostovoljci, bolniki)
2-10 let
Razvoj
formulacije
(zdravila)
Regulatorni
postopki,
odobritev zdravila
(FDA, posamezne
države, EMEA (2-3
leta))
1. „Racionalno“ načrtovanje
Vir naravne spojine
- listi koke (Erythroxylon coca) 16.st., 1856 izolacija
kokaina (lokalni anestetik)
- kininovec (Cinchona succirubra) (kinin) 17.stoletje
- skorja vrbe (Salix) 1899 acetilsalicilna kislina
- vrtni mak (Papaver somniferum) 16.st., 1804 izolacija
morfina iz opija (analgetik)
- volčja češnja (Atropa Belladonna)
Egipčani, Rimljani, 1831 izolacija
atropina (očesno ozadje)
- Kitajska medicina
- Itd.
1. „Racionalno“ načrtovanje
Načrtovanje na osnovi znane strukture (endogenega) liganda.
morfin fenazocin, 4x močnejši,
ni odvisnosti,
halucinogen
nalorfin
Brez učinka, brez stranskih
učinkov – za predoziranje
morfina in heroina.
metadon
2x močnejši, manj
stranskih učinkov
levorfanol
(5x močnejši)
Opoidni
analgetiki
Str. učinki:
evforija,
pomiritev,
depresija
dihanja,
zaprtje,
odvisnost,
toleranca
heroin
N
OH
Me
Me
OMe
tramadol
srednje močni analgetik
2. Rešetanje visokih zmogljivosti (high-throughput screening (HTS))
• „Screening“ = rešetanje = naključno testiranje (v 90-ih)
• Robotsko podprto iskanje novih spojin vodnic
• Pogoj: zadostna količina
proteina (tarče) in knjižnica
spojin
• Robot z biokemijskimi
metodami preveri aktivnost
spojin na določeni tarči
LabAutoPedia: Automated Storage and Retrieval Systems
2. Rešetanje visokih zmogljivosti
HTS ni prinesel željenih rezultatov (spojine predvsem niso
imele ugodnih lastnosti – absorpcija, distribucija, metabolizem,
eliminacija).
Lipinski je raziskal, katere lastnosti definirajo zdravilne
učinkovine (l. 1997).
S sodelavci je analiziral več kot 2000 znanih učinkovin.
S pomočjo rezultatov so sestavili preprosta pravila, ki veljajo
za večino učinkovin (MW, topnost v vodi in lipidih, št. H-vezi, itd).
3. Virtualno rešetanje
Nadomestek visoko zmogljivega rešetanja.
Zakaj ga sploh potrebujemo?
Knjižnica spojin farmacevtskega podjetja
lahko vsebuje tudi nekaj milijonov spojin,
sam HTS je drag in časovno zahteven.
Računsko nezahtevno (1000000 spojin v nekaj urah na
povprečnem računalniku)
Omogoča pripravo boljših knjižnic spojin za HTS (obogatitev
knjižnic).
S pomočjo virtualnega rešetanja izločimo spojine, ki skoraj
gotovo niso aktivne.
Rezultat je knjižnica spojin skrčena iz nekaj milijonov na nekaj
1000 spojin, katere lahko potem testiramo v laboratoriju.
3. Virtualno rešetanje
Več oblik:
Filtriranje s pomočjo
osnovnih deskriptorjev (MW, topnost v vodi in lipidih,
ploščina polarne površine,...)
2D rešetanje na osnovi
podobnosti
3D rešetanje na osnovi
podobnosti
Strukturno podprto
virtualno rešetanje
(sidranje)
2D in 3D rešetanje na osnovi podobnosti liganda
Glavni namen – najti spojine, ki so podobe izhodni
spojini ob predpostavki, da imajo spojine s podobno
strukturo podobno aktivnost
Izhodna spojina (predloga): inhibitor, substrat,
agonist, antagonist
Uporabimo, če ni znana struktura tarče na katero
deluje spojina oz. če hočemo dodatno obogatiti
knjižnico za HTS
Strukturno podprto virtualno rešetanje – sidranje (docking)
Glavni pogoj: znana 3D struktura tarče
Tarča: biološka molekula, ki je udeležena
pri nekem patološkem procesu (encim,
receptor, DNA, …)
Poleg 3D strukture tarče, moramo tudi
vedeti, kje na tarči je aktivno mesto
(programu moramo običajno povedati, kje
je aktivno mesto)
3D strukturo dobimo s pomočjo rentgenske kristalografije,
NMR ali homolognega modeliranja.
Večina znanstvenikov jih objavi v Protein Data Bank:
www.pdb.org
Sidranje Ko program postavi spojino v aktivno
mesto, cenilna funkcija oceni vezavno
energijo glede na različne prispevke
(Van der Waalsove interakcije, H-vezi, Elektrostatske interakcije, itd)
Program rangira spojine od tiste, ki ima najboljšo izračunano
vezavno energijo, do tiste, ki ima najslabšo.
Samo najboljše spojine nato potestiramo še in vitro, ne vseh iz
knjižnice.
Prednosti: cena, čas.
Slabosti: Programi delajo napake in slabo predvidijo vezavo oz.
ocenijo vezavno energijo.
Glavni namen sidranja je, da dobimo obogateno knjižnico,
nikakor pa ne moremo pričakovati, da bodo vse spojine aktivne
tudi in vitro
4. Mimetiki
Mimetik (Slovenski medicinski slovar):
- kar vzpodbuja kako funkcijo in pri tem
posnema naravno (agonistično) snov
Peptidomimetik:
- spojina, ki posnema strukturo peptida in
izzove enak biološki odziv kot peptid
Teprotid
- brazilski gad (Bothrops jararaca)
- 1970 več peptidov izoliranih iz
kačjega strupa
- nanopeptid teprotid zniža krvni
tlak
H2N–Glu–Trp–Pro–Arg–Pro–Gln–Ile–Pro–Pro–COOH
1973: znan mehanizem delovanja:
Angiotenzin I (dekapeptid)
Angiotenzin II (oktapeptid)
(zoži žile, poviša se krvni tlak)
angiotenzin-konvertaza
Teprotid se veže na
angiotenzin-konvertazo
in inhibira delovanje
encima!
Načrt:
1. Najprej so postopoma skrajševali nanopeptid.
2. Dobili so aktivni dipeptid Pro-Pro (spojina vodnica).
3. Naredili so spojine, ki so dipeptidu strukturno podobne, NISO pa
peptidi.
Rezultat: ACE-inhibitorji za znižanje povišanega krvnega tlaka (ACE: angiotensin converting enzyme)
enalapril
Glikomimetiki
- posnemajo strukturo sladkornega skeleta.
Primer: - inhibitorji glikozidaz v črevesju
- oseltamivir (Tamiflu)
Mimetiki nukleotidov/nukleinskih kislin
- posnemajo nukleotide in zavirajo sintezo nukleinske kisline
Primeri: inhibitorji DNA-polimeraze, reverzne transkriptaze
5. Naključja, klinična opažanja
Okritje penicilina
• Fleming je opazil inhibicijo bakterijske rasti (Staphylococcus)
na mestu, kjer je bila petrijevka kontaminirana z plesnijo
(Penicillium notatum) (1928).
• Penicilin – beta-laktamski antibiotik (mimetik dipeptida D-Ala-
D-Ala)
Sildenafil
• Sildenafil razvit za zdravljenje hipertenzije in angine pektoris.
• Klinična študija je pokazala nizko aktivnost za zdravljenje
angine pektoris.
• Prostovoljci poročajo o stranskem učinku – povečani erektilni
funkciji.
• FDA izda dovoljenje za uporabo sildenafila za zdravljenje
erektilne disfunkcije (1998)
• Inhibitor cGMP-fosfodiesteraze tip 5
• Zdravilo
• Sintezna zdravila
– Racionalno načrtovanje
– Rešetanje visokih zmogljivosti
– Virtualno rešetanje
– Peptidomimetiki
– Naključja, klinična opažanja
• Biološka zdravila
II. Biološka zdravila
Pod izraz “Biološka zdravila” lahko uvrščamo:
1. Zdravila, pridobljena z izolacijo iz rastlin ali živali (alkaloidi, flavonoidi, kri in krvni proizvodi, živalski in človeški hormoni, antibiotiki, steroidi, cepiva)
2. Biološka zdravila, pridobljena s sintezo: sintezni peptidi (kalcitonin, oksitocin, vazopresin, itd)
3. Rekombinantna biološka zdravila (biotehnološka zdravila):
rekombinantni proteini, rekombinantna monoklonska protitelesa (končnica mab) in rekombinantna cepiva
4. Genske učinkovine: terapevtski geni, vstavljeni v vektor za vnos v organizem s pomočjo virusnega ali nevirusnega vnosa
Preširok pojem??
Rekombinacija:
- Vključevanje delov DNA ali genov enega organizma v genom
drugega organizma.
- Produkt vstavljenega gena je rekombinantni protein.
„GloFish“ – v genom je vstavljen
gen za fluorescentne proteine. Plazmid = krožna ali linearna dvovijačna DNA
Rekombinantna biološka zdravila (biotehnološka zdravila)
Večino sodobnih bioloških zdravil uvrščamo med rekombinantna
biološka zdravila, ki jim pravimo tudi biotehnološka zdravila.
Sem sodijo:
rekombinantna monklonska protitelesa (infliksimab
(zdravljenje revmatidni artritis), rituksimab (zdravljenje
limfoma), ...)
rekombinantne učinkovine (inzulin, epoetini, filgrastim,
somatropin, ...)
rekombinantna cepiva (hepatitis B)
protitelesa
rastni hormon
protitelesa
dejavnik rasti
granulocitne vrste
protitelesa
epoetini
interferoni
Celica (bakterijska, kvasovke, sesalska) in vektor (plazmid)
+
Celična linija
Transfekcija Celična kultura Filtracija, čiščenje
Učinkovina v mediju
Učinkovina Zdravilo
Formulacija/polnjenje
Razvoj celične linije in izbira ustreznega rastnega
medija za rast celic
Rast v bioreaktorju
(5-10 litrov; 100-200
litrov;
2500 litrov)
Čiščenje
Preverjanje ustreznosti produkta
Prizvodnja rekombinantnih zdravil
FILGRASTIM ERITROPOETIN
Št aminokislin 175 193
MW 18,6 kD 18,5 kD
glikozilacija ne 1x O-glikozilacija
3x N-glikozilacija
Celice E. coli CHO
E. Coli – (Escherichia coli) gram negativne enterobakterije
CHO – (Chinese Hamster Ovary) ovarijske celice kitajskega hrčka
Ostale celice oz celične linije:
- Drosophila S2: celice vinske mušice
- S. cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae): kvasovka
- BHK (Baby Hamster Kidney): ledvične celice hrčkovega mladiča
- Sp2/0 (mouse mieloma cell line): mišje mielomske celice
Preveri se: koncentracija, agregati, razgradni produkti, pravilno
zvitje, glikanska analiza, mikrobiološka kontrola, bakterijski
edotoksini, virusi, nukleinske kisline, ...
Metode: CD (cirkularni dihroizem), NMR (nuklearna magnetna
resonanca), X-žarkovna analiza, SDS-PAGE (SDS-
poliakrilamidna elektroforeza), glikansko mapiranje, Western blot
analiza, ELISA (encimski imunski test), masna spektrometrija, itd.
Določitev strukture in čistote bioloških molekul
Imunogenost
Biološka zdravila so proteini ali glikoproteini in lahko v organizmu
izzovejo imunski odgovor (tudi do 40 % ljudi ima protitelesa proti
posameznim rekombinantnim proteinom).
• Je hormon, glikoprotein.
• Sladkorne komponente podaljšajo njegovo delovanje, niso ključne za aktivnost.
Primer: eritropoetin (EPO)
N-glikozilacija
Asn-24
Asn-38
Asn83
O-glikozilacija
Ser-126
Disulfidne vezi:
2x
Število izoform:14
• Uravnava nastajanje in zorenje eritrocitov.
• Nastaja v ledvicah (85–90 %) in v jetrih.
• Koncentracija eritropoetina v krvi se poveča ob hipoksiji (krvavitve, zmanjšan pretok krvi skozi ledvica, zmanjšani afiniteti hemoglobina do kisika, višja nadmorska višina, pri kronični obstrukcijski pljučni bolezni, nekatere srčne bolezni)
• Znižana koncentracija eritorpoetina v krvi: kronična odpoved ledvic, avtoimune bolezni, kemoterapija, infekcije, AIDS...
• Povišana koncentracija: tumor, ledvične ciste, kronična višinska bolezen, ...
• 1977: Miyake s sodelavci je izoliral 10 mg čistega EPO iz 2550 litrov urina.
Epoetin
• Epoetin = rekombinantni eritropoetin
• Obstajajo različne kombinacije glikozilacije, uvedena so tudi
nova glikozilacijska mesta, zato obstajajo na trgu različni
pripravki: epoetin alfa, epoetin beta, epoetin delta, epoetin
omega, epoetin zeta, ...
• Dodatna glikozilacijska mesta podaljšajo t1/2 (tudi na 20h).
• Ker jemanje poveča celokupno koncentracijo hemoglobina, se
poveča dostava kisika tkivom => zloraba v športu.
Slika: IEF (izoelektrično fokusiranje) analiza EPO gliko-izoform; a:
komercialni naravni EPO (urinski), b: Neorecormon, c: Eprex, d: urin
kontrolne osebe, e,f: urin pacienti na terapiji z Neorecorminom, g,h: urin
kolesarjev.
Doping kontrola
• Visoka molekulska masa.
• Kompleksna 3D struktura.
• Proizvedeni so v celicah.
Povzetek: Značilnosti biotehnoloških zdravil
Aspirin hGH EPO mAb
180 Da 22 kDa 34 kDa 150 kDa
Da (dalton) = 1 g/mol
mAb (monoclonal antibody
hGh (human growth hormone)
Sintezno
zdravilo
• So pogosto heterogene molekule.
• Zelo težko se jih ovrednoti v celoti s fizikalno-kemičnimi
analitičnimi metodami in določi njihovo biološko delovanje.
• So lahko imunogeni.
• Njihova proizvodnja je zapletena. ($ £ €)
• Ponovljivost njihovega proizvodnega procesa je odvisna od
biološke aktivnosti in hišnih standardov.
Biološko zdravilo različnih proizvajalcev ima lahko različne lastnosti,
mora pa biti zdravilo vedno učinkovito in varno!
Govorimo o bio-podobnih (biosimilars) in bio-boljših (biobetters) zdravilih.
Struktura proteina je odvisna od procesa proizvodnje!
Vsebina
• Zdravilo
• Sintezna zdravila
– Racionalno načrtovanje
– Rešetanje visokih zmogljivosti
– Virtualno rešetanje
– Mimetiki
– Naključja, klinična opažanja
• Biološka zdravila – rekombinantna (biotehnološka)
zdravila
Pomen proteinov v medicinski diagnostiki in pri zdravljenju
www.medindia.net/Patients/patientinfo/tumor
Tumorski označevalci so različni proteini
Zdravila ciljajo različne proteine
Encimi so tudi zdravila
Približno 10% genov ali njihovih produktov lahko predstavlja tarče za zdravila
A.L. Hopkins, C.R. Groom. The druggable genome. Nature Reviews Drug Discovery, September 2002
Zbirka človeških proteinov, ki vežejo spojine vodnice, imenujeno “genom, ki ga lahko
zdravimo” (“druggable” genome).
“Genom, ki ga lahko zdravimo”
Funkcionalni razredi makromolekul kot tarč za zdravila
A.L. Hopkins, C.R. Groom. The druggable genome. Nature Reviews Drug Discovery, September 2002
Večina tarč predstavljajo proteini, med proteini pa encimi.
Zdravila ciljajo tudi DNA
Proteini, vključeni
v biosignaliziranje
- Ključ za izboljšanje odkrivanja zdravil je v organizaciji verige funkcijskih raziskav
- Informacije se morajo pretakati iz osnovnih raziskav analize genoma, proteinov, metabolitov,
kemijskih spojin, itd., do stopnje kliničnih raziskav in sprostitve zdravila na trg.
- Združevanje tako različnih področjih naravoslovnih in matematično-informatičnih znanosti
predstavlja še vedno velik izziv.
- Potrebni so mostovi, ki pomagajo raziskovalcem enega področja pri komunikaciji z drugimi
raziskovalci interdisciplinarnih skupin. V TO VERIGO MORAJO BITI VKLJUČENI TUDI
ZDRAVNIKI !!
Obstoječi izzivi razvoja zdravil
www.ncrisproteins.org/
Problem terapije: individualnost posameznikovega genoma; interakcije
med zdravili
European Perspectives in Personalised Medicine Brussels, Belgium 12-13 May 2011
- Le 30 – 60% terapij je uspešnih
ZAKAJ??
Ni le ene Alzheimerjeve bolezni, enega raka na prsih,enega revmatoidnega artritisa,
enega AIDS, itd……..
To spoznanje le počasi prihaja v zavest in bo v prihodnjem desetletju pomembno
vplivalo na razvoj medicine.
Vstopamo v medicino po-genomskega obdobja, kjer moramo upoštevati
individualnost posameznikovega genoma.
Encimi v medicinski praksi
Encimi kot tarča zdravil
Encimi kot diagnostični indikatorji (označevalci, markerji)
- zmanjšana aktivnost holinesteraz pri zastrupitvi z organofosfati (pesticidi, bojni strupi...)
- ala-transaminaza (ALT) in asp-transaminaza (AST)– razpad jeter (ciroza, rak...)
- alkalna fosfataza v krvi – kostne in jetrne bolezni
- kisla fosfataza v krvi – rak prostate
- specifični srčni encimi (LDH, CPK, AST) – infarkt
- lipaza in amilaza – pankreatitis
- Etc., etc…………..
Encimi kot zdravila
- streptokinaza, aktivator plazminogena za razgradnjo strdkov v krvi
- Asparaginaza razgrajuje Asp, ki ga nujno rabi ‘levkemično tkivo’ za rast
- Dodajanje encimov zaradi pomanjkanja (genske napake, itd.)
- Etc.
mitochondrijska AST 1 h
LDH-5 (M4) 12 h
CK 18 h
citoplazemska AST 1 dni
ALT 2 dni
LDH-1 (H4) 5 dni
Razpolovne dobe izoencimov
Časovni potek encimske aktivnosti po infarktu
Določanje kreatinske kinaze (CK), ala- in asp-transaminaz (ALT, AST) in laktatne
dehidrogenaze (LH) v serumu po infarktu
tehnična kontrola
normalni vzorec
infarkt
Obolenje jeter
infarkt
2 dni po infarktu
1 dan po infarktu
Zastoj srca, poškodba
CK
vzorec
pro2services.com/.
Reakcija kreatinske kinaze CK reakcija laktat dehidrogenaze LDH
Določanja izoencimov kreatin kinaz (CK) in laktat dehidrogenaz
(LDH) v serumu z elektroforezo
Izoencimi (izocimi)
- Katalizirajo isto reakcijo, a se razlikujejo v aminokislinskem zaporedju.
- So značilni način uravnavanja v različnih tkivih in razvojnih stanjih.
- Pogosto so oligomerni proteini, sestavljeni iz različnih polipeptidnih verig.
- Imajo drugačne kinetične parametre in odgovarjajo na različne signale.
- Primer I: laktat-dehidrogenaza
H izocim LDH je izražen v srcu. M izocim je izražen v mišici. H – aerobni pogoji; M –
anaerobni pogoji.
H in M imata 75% aminokislin enakih (75% identičnost)
CK1 (BB) je pogosta v možganih in gladkih mišicah (je praktično no v serumu)
CK2 (MB) je pogosta v srčni mišici in nekaterih skeletnih mišicah (je praktično no v serumu)
CK3 (MM) je pogosta v skeletnih mišicah in srčni mišici (predstavlja skorajda 100% serumske CK)
Primer II izoencima je kreatin kinaza
Reakcija kreatinske kinaze CK – regenerira ATP v progasti mišici
Kot zdravila se uporabljajo:
- tkivni plazminogenski aktivator tPA (serinska proteinaza)
- streptokinaza (SK), and
- urokinaza (UK).
•Streptokinaza je hemolitični encim bakterije iz rodu Streptococcus
• Je aktivator plazminogena in sodeluje v razgradnji strdkov v krvi
•--------------------------------------------------
•Medicinska uporaba - razgradnja krvnih strdkov, npr. pri akutnem miokardnem infarktu
•Stranski učinki – notranje krvavitve zaradi proteolize.
razgradni produkti
Encimi kot zdravila: trombolitična (fibrinolitična) sredstva
Terapija kroničnih vnetij – inhibicija proteolitičnih encimov z
anti-proteinazami
Zdravljenje raka z biološkimi zdravili– zgodba o Herceptinu
- Gen HER2 kodira receptor človeškega epidermalnega rastnega faktorja EGFR
(receptor s tirozinkinazno aktovnostjo)
- HER2 je človeški onkogen, ki je prekomerno izražen pri cca 25% rakov na prsih.
- Herceptin je eno od prvih bioloških zdravil (Ulrich Axel, Max Planck inštitut).
Trastuzumab (komercialno ime Herceptin) je monoklonsko protitelo, ki
reagira z HER2 receptorjem. Zelo drago zdravilo.
Pomen laboratorijskega testiranja: le ženske, ki imajo povečano izražanje tega onkogena
je smiselno zdraviti s Herceptinom (določevanje s qPCR)
Herceptin: Cena zdravljenja: nekaj 10 000 eur/pacientko…………
Mehanizem delovanja Herceptina
Roche Diagnostics
Herceptin se veže na HER2 receptor. S tem prepreči, da bi se na HER2 vezal
epidermalni rastni faktor EGF. Zato ne pride do prenosa signala, ki ga posreduje EGF –
celice se ne delijo.
Dodajanje encimov v krvni obtok – intravenska uporaba
Zdravljenje pomanjkanja encimov zaradi genetskih okvar:
Problem predstavlja tudi imunogenost dodanih encimov……
Pomen proteinov v medicinski praksi - povzetek
- Pomembne tarče številnih zdravil. Pomembnejši razredi so se GPCR, kinaze, jedrni
receptorji….Pristopi funkcijske genomike pomembno prispevajo k razvoju novih učinkovin.
- So lahko diagnostični indikatorji (označevalci, markerji) – za njihovo detekcijo v telesnih
tekočinah so na voljo diagnostični kompleti.
- Encimi in drugi proteini so vse pomembnejši kot zdravila (biološka zdravila)
Poleg proteinov je lahko tarča terapij tudi DNA.