Síntese e Avaliação de Tiossemicarbazonas e Tiazolinonas ... · Cardoso, Marcos Veríssimo de...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCOCENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICASPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Síntese e Avaliação de Tiossemicarbazonas e Tiazolinonas como Inibidores da Protease Cruzaína do Trypanosoma cruzi

(TCC)

Marcos Veríssimo de Oliveira Cardoso

Recife, PE2008

Marcos Veríssimo de Oliveira Cardoso+


(TCC)

Orientadora: Profa. Dra. Ana Cristina Lima LeiteCo-orientador: Prof. Dr. Dalci José Brondani

+Bolsista do CNPq

Recife, PE2008

Dissertação submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas do

Centro de Ciências da Saúde da UFPE, como

requisito parcial para obtenção do grau de

Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Cardoso, Marcos Veríssimo de Oliveira Síntese e avaliação de tiossemicarbazonas e tiazolinonas como inibidores da protease cruzaína do Trypanosoma cruzi / Marcos Verísssimo de Oliveira Cardoso. – Recife: O Autor, 2008.

102 folhas: il., fig., tab., quadros, esquema . Dissertação (mestrado) – Universidade Federal

de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2008.

Inclui bibliografia e anexos.

1. Doença de Chagas. 2. Trypanosoma cruzi. 3. Tiossemicarbazonas. 4. Tiazolinonas. I.Título.

615.011 CDU (2.ed.) UFPE615.1 CDD (22.ed.) CCS2008-102

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCOCENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICASPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

LABSINFA – LABORATÓRIO DE PLANEJAMENTO, SÍNTESE E AVALIAÇÃO DE FÁRMACOS


(TCC)

BANCA EXAMINADORA:

Presidente: Profa. Dra. Ana Cristina Lima Leite - UFPE

Membro Interno Titular:Profa.Dra. Maria do Carmo Alves de Lima - UFPE

Membro Externo Titular:Profa. Dra. Valéria Rêgo Alves Pereira – CPqAM / FIOCRUZ

Membros Suplentes: Profa. Dra. Maria Nelly Caetano Pisciottano - UFPEProfa. Dra. Daniela Maria do Amaral Ferraz Navarro - UFPE

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

REITOR

Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins

VICE-REITOR

Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva

PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Prof. Dr. José Tadeu Pinheiro

CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Profa. Dra. Jane Sheila Higino

COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto

VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Profa. Dra. Beate Saegesser Santos

DEDICATÓRIA

A minha Mãe, guerreira, que, sem seus esforços, eu não

seria o que sou hoje;

Ao meu Pai, pelo seu caráter e disciplina;

Ao meu Tio Luíz pelos seus ensinamentos e palavras de

sabedoria, ditas na hora certa.

“O valor das coisas não está no tempo em que elas duram,

mas na intensidade com que acontecem.

Por isso existem momentos inesquecíveis,

coisas inexplicáveis e pessoas incomparáveis”.

Fernando Pessoa

AGRADECIMENTOS

A minha orientadora, Ana Cristina Lima Leite, por toda paciência, confiança, ajuda, ensinamentos, por me “pressionar” nas horas certas, e por toda amizade, além de me mostrar novos horizontes, os quais posso alcançar;

Ao meu co-orientador, Dalci José Brondani pelos conhecimentos compartilhados, por todo apoio e disposição nas horas em que o solicitei e pela confiança e amizade;

Aos meus pais por toda paciência, apoio e determinação me proporcionando um estudo de qualidade, sempre acreditando em mim, como também pelas “broncas”, sem as quais, eu não seria quem eu sou hoje;

Ao meu irmão Eduardo Cardoso (Dudu), pelo apoio, conselhos e pelos churrascos em casas de praia;

A minha família, em especial, os mais próximos, que acompanharam o meu progresso e que sempre me motivaram para sempre querer mais, em especial meu tio Luíz Cardoso Santos (Lula);

A minha namorada, Núbia Alves (Inha), por todo carinho, compreensão, “implicâncias”, paciência, meninice, credibilidade e respeito, além do apoio constante e motivação para a construção de um futuro sólido e próspero;

Ao Prof. Dr. Marcelo Zaldini, pela realização dos trabalhos teóricos;

A Dra. Valéria R. Alves Pereira, do Laboratório de Imunoparasitologia (CPqAM-PE) e Dra. Milena B. P. Soares, do Laboratório de Engenharia Tecidual e Imunologia - LETI (CPqGM-BA), pelas realizações dos ensaios anti-T. cruzi;

Aos professores do DCFAR, em especial a Antônio Rodolfo de Farias, Haroudo Sátiro Xavier e Elba Lúcia;

A todos os integrantes da Central Analítica do DQF, em especial a Ricardo e Eliete;

Aos meus amigos do LABSINFA: Diogo Lucio, Lucas Coelho, Victor Hugo, Lucas Oliveira, e Diego Revoredo pelo ótimo ambiente de trabalho;

Ao Mestre Fabio Fernandes, que, apesar de não estar mais no LABSINFA, me proporcionou apoio constante;

Aos meus amigos de Mestrado: Diogo Lucio, Fred Gouveia, Silvio e Cleiton Diniz, por todo “aperreio” passado no mestrado e momentos de descontração;

Aos meus colegas da graduação: Larissa Babiana, Bárbara Gomes, Renata Mendes, Homero Souza dentre outros por todos os momentos felizes que passamos;

Aos alunos de Química Orgânica 07A, pelas possibilidades de estudarmos e aprendermos juntos;

A todos os funcionários do DCFAR, em especial dona Fátima, Conceição e Iguacy;

Ao CNPq por ter me concedido uma bolsa a qual me proporcionou apoio para o desenvolvimento dos trabalhos e motivação na área acadêmica;

Ao CNPq pelo importante suporte financeiro concedido ao nosso grupo de pesquisa (Edital Universal #471834/2006-8 e #475355/2007-8);

A UFPE, pela reforma de nosso laboratório.

RESUMO

A doença de Chagas ainda é um problema concreto e impactante na América Latina, sob múltiplos aspectos vinculados às questões da iniqüidade social e ao processo de globalização. A enfermidade, a despeito de dificuldades financeiras e políticas, tem sido controlada, restando um horizonte de duas ou três décadas necessárias à consolidação do controle, aperfeiçoamento da vigilância e terapia adequada aos indivíduos já infectados. Desde a descoberta da doença de Chagas, em 1909, a procura por uma terapia efetiva para os dois estágios da doença, fase aguda e, principalmente, a fase crônica, é um desafio para muitos pesquisadores. Nos dias de hoje, somente duas drogas estão em uso para o combate da doença de Chagas, o Nifurtimox e o Benznidazol, conhecidos comercialmente por Lampit® e Rochagan®, respectivamente. Esta atual terapia não é efetiva principalmente na fase crônica da doença além de proporcionar vários efeitos adversos. Atualmente, vários trabalhos relatam que compostos que possuem a porção tiossemicarbazona apresentam uma potencial atividade antichagásica devido a uma possível inibição da enzima cruzaína do Trypanosoma cruzi (TCC). A cruzaína é uma enzima responsável pela replicação intracelular do T. cruzi e, devido a esta função, é um alvo explorado para o desenvolvimento de novas drogas potencialmente antichagásicas. Neste trabalho, objetivou-se a síntese, estudos de “docking” na cruzaína e a avaliação antichagásica de derivados tiossemicarbazônicos e tiazolinônicos. Inicialmente foram sintetizadas aril-4-oxotiazolilhidrazonas onde obtivemos nove compostos. Os produtos obtidos foram submetidos a ensaios de atividade antichagásica in vitro e a estudos de “docking” na TCC. O estudo revelou que os produtos obtidos apresentaram atividade antichagásica e interação com a cruzaína do T. cruzi. Da série obtida, o composto N-(4-oxo-5-etil-2’-tiazolin-2-il)-N’-feniltio-(Z)-etilidenohidrazona (6f) foi o mais promissor, onde mostrou-se ativo em concentrações não citotóxicas às células de mamíferos e apresentou atividade antichagásica comparável com a das drogas de uso padrão utilizadas até hoje, o Nifurtimox e o Benznidazol. Os estudos de “docking” revelaram que há interação do composto 6f com a TCC de modo semelhante ao benzinidazol e ao ligante “186”. Por último, foram sintetizadas novas Aril-4-Oxotiazolil-hidrazonas que foram submetidas à avaliação da atividade antichagásica in vitro. Foram obtidos quatorze compostos, onde o 2-[(p-metilpeniltio-(Z)-etilideno) hidrazona]-5-metil-1,3-tiazol-4(5H)-ona (6f), 2-[(p-bromofeniltio-(Z)-etilideno) hidrazona]-5-etil-1,3-tiazol-4(5H)-ona (6i) e o 2-[(feniltio-(Z)-3-butilideno)hidrazona]-1,3-tiazol-4(5H)-ona (6j) apresentaram as melhores atividades antichagásicas. O composto 6j, em concentração não citotóxica a células de mamíferos, apresentou atividade semelhante a dos padrões utilizados, o Nifurtimox e o Benznidazol. Nossos resultados demandam continuidade e nos leva a concluir que tais compostos são promissores no combate a doença de Chagas.

Palavras-chaves: Doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, Cruzaína, “Docking”,

Tiossemicarbazonas e Tiazolinonas.

ABSTRACT

Chagas disease is still a specific and impressive problem in Latin America, under many aspects linked to questions related to social inequity and globalization process. The disease, in spite of financial and policies difficulties, has been controlled; however, a period of two or three decades remains necessary for the consolidation of control, surveillance improvement and appropriate therapy for individuals already infected. Since the discovery of Chagas disease, in 1909, the demand for an effective therapy for both stages of the disease, acute and chronic phase, is a challenge for many researchers. Nowadays, only two drugs are being used against Chagas disease, the Nifurtimox and the Benznidazole, known commercially as Lampit ® and Rochagan ®, respectively. This therapy, besides causing several adverse effects, is not effective for the chronic stage of the disease. Currently, several studies report that compounds that have the portion thiosemicarbazone have a potential antichagasic activity due to a possible inhibition of the Trypanosoma cruzi cruzain enzyme (TCC). The cruzain enzyme is responsible for replication of intracellular T. cruzi, and due to this function, it’s a target exploited for the development of new drugs potentially antichagasics. The objective of this work was to analyze the synthesis, the studies of "docking" in cruzainand the antichagasic evaluation of thiosemicarbazonics and thiazolinonics derivatives. Initially, aryl-4-oxothiazolilhidrazones were synthesized, resulting in nine different compounds. The obtained products were submitted to in vitro tests of antichagasic activity and to studies of "docking" in the TCC, showing antichagasic activity and TCC interaction. The most promising compound of the group was the N-(4-oxo-5-ethyl-2'-tiazolin-2-yl)-N '-phenilthio-(Z)-etilidenehidrazone (6f), which proved to be active in non-cytotoxic concentrations of mammals cells and presented antichagasic activity comparable to that one verified in drugs nowadays, Nifurtimox and Benznidazole. The studies of "docking" revealed that there is an interaction between the compound 6f and the TCC, similarly to that one occurred between benzinidazole binder and the "186". Finally, new Aril-4-Oxothiazolil-hidrazones were synthesized and submitted to review of in vitro antichagasic activity. Fourteen compounds were obtained; the ones that showed the best antichagasics activity were 2 - [(p-metilphenilthio-(Z)-etilidene) hydrazone hydrochlorid]-5-methyl-1, 3-thiazol-4 (5H)-one (3f), 2 - [(p -bromophenilthio-(Z)-etilidene) hydrazone hydrochlorid]-5-ethyl-1 ,3-thiazol-4 (5H)-one (3i) and 2 - [(phenilthio-(Z)-3-butilidene) hydrazone hydrochlorid] -1, 3-thiazol-4 (5H)-one (3j). The compound 3j, in non-cytotoxic concentration to mammalian cells, presented similar activity to the standards used, the Nifurtimox and the Benznidazole.

Keywords: Chagas Disease, Trypanosoma cruzi, Cruzain, “Docking”,

Thiosemicarbazones and Thiazolinones.

Lista de figuras

Figura 1: Estruturas do Nifurtimox (Nfx) e Benznidazol (Bdz)..................................... 20

Figura 2: Incidência da doença de Chagas na América Latina....................................... 27

Figura 3: Sinal de Romaña. ............................................................................................ 30

Figura 4: Fármacos utilizados no tratamento da doença de Chagas desde 1970............ 32

Figura 5: Estrutura da tiossemicarbazona....................................................................... 33

Figura 6: Relação estrutura-atividade (SAR) proposto por Greenbaum e colaboradores.

........................................................................................................................................ 34

Figura 7: Formas tautoméricas Tiona e Tiol. ................................................................. 34

Figura 8: Exemplos de complexos metálicos com atividade antichagásica (A = OTERO

et al, 2006; B = PÉREZ-REBOLLEDO et al, 2008). ..................................................... 35

Figura 9: Estruturas e diferença pontual entre as tiossemicarbazonas e as

semicarbazonas............................................................................................................... 37

Figura 10: Derivados N4-funcionalizados da Nitrofurazona, relatados como inibidores

da TR. ............................................................................................................................. 39

Figura 11: Compostos 2b, 2h, 2i, e 3h sintetizados por Du e colaboradores (2002)...... 41

Figura 12: Compostos 5-nitrofuril tiossemicarbazonas antichagásicos sintetizados por

Aguire et al. .................................................................................................................... 41

Figura 13: Compostos 5-NT-HMINTSC (R=C6H11), 5-NTBuTSC (R=C4H9) e

Metronidazol................................................................................................................... 42

Figura 14: Composto 6a sintetizado por Bharti e colaboradores (2003)........................ 42

Figura 15: Derivados tiossemicarbazônicos com atividade anti HIV. ........................... 43

Figura 16: Composto 38 obtido por Küçükgüzel et al.................................................... 43

Figura 17: 3-aminopiridina-2-carboxaldeído tiossemicarbazona (3-AP) e seu pró-

fármaco Triapina 3-AP. .................................................................................................. 44

Figura 18: Derivados tiossemicarbazônicos com atividade antitumoral obtidos por Ivica

Ðilović e colaboradores .................................................................................................. 44

Figura 19: Estruturas da tiazolinona (A) e do tiazol (B). ............................................... 45

Figura 20: Compostos mais ativos sintetizados por Leite et al frente à atividade

antitumoral (5a, 2006) e antichagásica (10a, 2006 e 6i, 2007)....................................... 46

Figura 21: Estrutura do núcleo 4-tiazolidinona .............................................................. 47

Figura 22: Diciclohexilcarbodiimida (DCC) e dicicloexiluréia (DCU). ........................ 50

Figura 23: Principais sítios reacionais do anel 4-tiazolidinona. ..................................... 51

Figura 24: Compostos 5a, 5b e 5c sintetizados por Leite et al. ...................................... 54

Figura 25: Compostos 6f e 6i sintetizados por Leite et al (2007) . ................................ 55

Figura 26: Compostos antimicrobianos derivados tiazolidinônicos obtidos por Vicini et

al. .................................................................................................................................... 56

Figura 27: Compostos 7, 10 e 1 com atividade antiviral. ............................................... 57

Figura 28: 3-(4-bromo-2-carbo-xifenil)- 5-metil-4-tiazolidinonas 2-substituídas

sintetizadas por Goel e colaboradores. ........................................................................... 58

Figura 29: Composto 91 sintetizado por Allen e colaboradores (2004)......................... 58

Figura 30: Compostos com atividade antipsicótica........................................................ 59

Lista de esquemas

Esquema 1: Ciclo biológico do T. cruzi ......................................................................... 29

Esquema 2: Reação da obtenção de tiossemicarbazonas................................................ 36

Esquema 3: Mecanismo de inibição na TCC por derivados das aril-tiossemicarbazonas,

propostas por Aguire e colaboradores (2002)................................................................. 39

Esquema 4: Redução do C=N da posição 4.................................................................... 40

Esquema 5: Síntese de Hantzsch. ................................................................................... 45

Esquema 6: Ciclização da tiossemicarbazida. ................................................................ 45

Esquema 7: Mecanismo de obtenção do anel 4-tiazolinona........................................... 46

Esquema 8: Obtenção de 4-tiazolidinonas e 1,3,4-oxadiazóis a partir de éster α-

halogenado por Küçükgüzel e colaboradores (2006). .................................................... 48

Esquema 9: Reação de condensação entre Ác. Mercaptoacético com amina primárias. 49

Esquema 10: Síntese de 4-tiazolidinonas “one-pot” de três reagentes desenvolvido por

Srivastava ....................................................................................................................... 49

Esquema 11: Obtenção de 2-aril-3-tioureido-4-tiazolidinonas. ..................................... 50

Esquema 12: Proposta de síntese para obtenção de novos derivados das

tiossemicarbazonas, semicarbazonas e 4-tiazolinonas, planejadas como novos inibidores

da TCC............................................................................................................................ 98

Lista de quadros e tabela

Quadro 1: As doenças e a abrangência da indústria farmacêutica. ................................ 25

Quadro 2: Compostos 5c e 10a obtidos por Leite et al (2006) ....................................... 54

Tabela 1: Principais reações que ocorrem no anel tiazolidinônico. ............................... 53

Lista de Símbolos e Abreviaturas

BDZ= Benznidazol

Cys= Cisteína

DCC= Diciclohexilcarbodiimida

DCU= Diciclohexiluréia

DNA= Ácido desoxirribonucléico

His= Histidina

HIV= Vírus da imunodeficiência humana

HSV= Vírus herpes simples

IC50= Concentração inibitória em 50%

IV= Infra-vermelho

kg= Kilograma

Lys= Lisina

mg/m2= Miligrama por metro quadrado

mg= Miligrama

NFX= Nifurtimox

nM= Nanomolar

P&D= Pesquisa e desenvolvimento

p= Para

Pd(II)= Paládio II

Phe= Fenilalanina

Pro= Prolina

RMN-1H= Ressonância magnética nuclear de prótons de hidrogênio

RT-HIV- 1= transcriptase reversa do vírus da imunodeficiência humana tipo I

SAR= Relação estrutura-atividade

T. cruzi= Trypanosoma cruzi

TBZs= Tiabendazóis

TCC= Cruzaína do Trypanosoma cruzi

THF= Tetrahidrofurano

TR= Tripanotiona redutase

Ts= Tiossemicarbazida

μM= Micromolar

Sumário

1. INTRODUÇÃO 19

2. OBJETIVOS 22

2.1. Objetivo Geral ............................................................................................................ 22

2.2. Objetivos Específicos ................................................................................................. 22

3. REVISÃO DA LITERATURA 24

3.1. Generalidades da doença de Chagas........................................................................... 24

3.2. Epidemiologia............................................................................................................. 26

3.3. Ciclo biológico do T. cruzi ......................................................................................... 28

3.4. Sintomatologia e tratamento da doença de Chagas .................................................... 30

3.5. Tiossemicarbazonas: aspectos químicos .................................................................... 33

3.5.1. Tiossemicarbazonas e seus complexos metálicos: .............................................34

3.5.2. Obtenção direta das tiossemicarbazonas a partir de tiossemicarbazidas ............35

3.6. Atividades biológicas das tiossemicarbazonas........................................................... 37

3.6.1. Tiossemicarbazonas como agentes antichagásicos.............................................38

3.6.2. Atividade antiprotozoária ...................................................................................42

3.6.3. Atividade antiviral ..............................................................................................43

3.6.4. Atividade antitumoral .........................................................................................44

3.7. 4-Tiazolinonas – aspectos químicos........................................................................... 45

3.8. 4 – Tiazolidinonas: aspectos químicos ....................................................................... 47

3.8.1. Métodos de obtenção de 4-tiazolidinonas...........................................................47

3.8.2. Reação entre acil tiossemicarbazidas e tiossemicarbazonas...............................48

3.8.3. Ácido α-mercaptoacético com aminas e aldeídos...............................................49

3.8.4. Com tiossemicarbazonas ....................................................................................50

3.8.5. Reações no anel 4-tiazolidinona .........................................................................51

3.9. Atividades biológicas das 4-tiazolidinonas e análogos .............................................. 53

3.9.1. Atividade antitumoral .........................................................................................54

3.9.2. Atividade antichagásica ......................................................................................54

3.9.3. Atividade antimicrobiana....................................................................................55

3.9.4. Atividade antiviral ..............................................................................................56

3.9.5. Atividade antiinflamatória ..................................................................................57

3.9.6. Atividade antipsicótica .......................................................................................59

4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 60

5. CAPÍTULO 1 71

6. CAPÍTULO 2 80

7 CONCLUSÕES 96

8 PERSPECTIVAS 98

9 ANEXOS 100

INTRODUÇÃO E OBJETIVOS

19

CARDOSO, M. V. O.

Síntese e Avaliação de Tiossemicarbazonas e Tiazolinonas como Inibidores da TCC.

1. INTRODUÇÃO

No Brasil, estima-se que de 8 a 10 milhões de pessoas estejam infectadas com o

Trypanosoma cruzi, dos quais cerca de dois milhões apresentam a sintomatologia da

doença de Chagas. Em Pernambuco, as estimativas indicam que a doença de Chagas

atinge uma importante área rural do sertão, desde o alto do Pajéu até próximo a zona da

mata litorânea, no qual as condições de moradia precárias que estão associadas à

inexistência de programas de controle vetorial ou assistência farmacêutica geram um

quadro de subdiagnóstico da realidade da doença de Chagas no estado (GAZIN, P. et al,

1999). Portanto, a necessidade de se desenvolver trabalhos relacionados à doença de

Chagas, seja no âmbito de epidemiologia, profilaxia ou quimioterapia, é evidente, como

o conjunto de estratégias que atuem para elucidar e solucionar a questão da doença de

Chagas em Pernambuco assim como em âmbito nacional.

A quimioterapia da doença de Chagas é ainda um problema irresoluto, e a busca

por drogas alternativas continua. Atualmente, somente duas drogas nitroheterocíclicas

estão em uso clínico, estas restringiram severamente sua aplicabilidade em pacientes

crônicos, pelo fato de serem altamente tóxicas (FERREIRA, H. O. et al, 1961). Um

grande número de diferentes compostos tem apresentado caminhos diferentes na terapia,

sendo o mais comum à capacidade de inibir a proliferação da forma epimastigota do

parasito. Entretanto, somente com um conhecimento maior da bioquímica do parasito e

no detalhamento de suas peculiaridades, será possível deslocar a ênfase da pesquisa de

drogas com seleções aleatórias para um fundamento mais racional. Isto é exemplificado

pelos estudos recentes realizados usando derivados da purina e inibidores da

Tripanotiona Redutase.

Apesar do progresso conseguido no estudo da bioquímica e da fisiologia do

Trypanosoma cruzi, em que diversas enzimas cruciais para a sobrevivência do parasito,

ausentes no hospedeiro foram identificadas como alvos potenciais para o projeto de

novas drogas, a quimioterapia utilizada no controle desta infecção parasitária permanece

sem desenvolvimento. A farmacologia é baseada em drogas antigas não - especificas

associadas com tratamentos de longo prazo que apresentam severos efeitos colaterais.

20

CARDOSO, M. V. O.


O Nifurtimox (Figura 1) {4-[(5-nitrofurfurilideno)-amino]-3-metiltil morfolina-

1,1-dióxido} e o Benznidazol (Figura 1) (N-benzil-2-nitro-1-imidazolacetamida) eram

as únicas drogas disponibilizadas para o tratamento clínico desta doença, mas

atualmente o Nifurtimox foi descontinuado devido à alta incidência de efeitos adversos,

onde o Benznidazol apresenta efeitos adversos mais brandos que o Nifurtimox. Embora

o Benznidazol possa diminuir o nível da parasitemia e reduzir os níveis sorológicos, não

é específico a todas as variações do Trypanosoma cruzi e não garante a cura completa

(FERREIRA, H. O. et al, 1961).

Ambas as drogas agem através da redução do grupo nitro. Como exemplo, o

Nifurtimox promove a redução do grupo nitro gerando radicais instáveis do ânion, que

produz espécies reduzidas com o oxigênio altamente tóxicas. O Benznidazol envolve a

modificação covalente das macromoléculas pela redução dos intermediários nitro. Os

efeitos colaterais destas drogas resultam dos danos oxidativos ou redutivos nos tecidos

dos parasitos e são ligados assim a sua atividade antiparasitária (RAVASCHINO, E. L.

et al, 2006).

Para o desenvolvimento de novos fármacos antichagásicos, as pesquisas têm sido

direcionadas para a inibição das enzimas Cruzaína do Trypanosoma cruzi (TCC)

(TRAWICK, M. L. 2006) e a Tripanotiona Redutase (TR) (AUGUSTYNS, K. 2001),

como alvos específicos e promissores. A TCC é a enzima chave da replicação

intracelular do parasito e a TR é a enzima chave do metabolismo anti-oxidativo do

Trypanosoma cruzi.

Du e colaboradores (2002) descreveram inicialmente alguns derivados

tiossemicarbazônicos com potente atividade antichagásica in vitro. Neste mesmo

trabalho, realizou estudos de “docking” na enzima cruzaína do T. cruzi que mostraram

Figura 1: Estruturas do Nifurtimox (Nfx) e Benznidazol (Bdz).

21

CARDOSO, M. V. O.


que o ataque covalente do aminoácido Cys25 (presente na TCC) em um dos compostos

mais ativos é orientado para carbono tiocarbonil, seguido pela transferência do próton

His159 para o enxofre presente na tiossemicarbazida.

Aguire e colaboradores (2004) sintetizaram compostos derivados 5-nitrofuril

com o núcleo tiossemicarbazona em sua estrutura, que tem sido descrito recentemente

como um grupo farmacofórico com potencial atividade anti-T. cruzi, onde apresenta um

duplo mecanismo de ação: a promoção de stress oxidativo (referente ao núcleo nitro) e a

inibição da TCC (referente ao núcleo tiossemicarbazona).

Estudos realizados em nosso laboratório (LEITE et al, 2006, 2007)

comprovaram a atividade antichagásica de compostos aril-tiossemicarbazonas e

tiazolinonas, onde os resultados obtidos dos estudos de “docking” indicaram a

possibilidade de inibição da TCC. Estes estudos comprovaram que a introdução de

grupos polares no anel aromático conectado a porção tiossemicarbazona é um fator

importante para potencializar a atividade antichagásica e a ligação com grupos apolares

da TCC.

Dando continuidade, os trabalhos desenvolvidos por Du et al motivaram nosso

grupo de pesquisa a sintetizar compostos derivados das tiossemicarbazonas e

tiazolinonas.

Este trabalho apresenta a síntese e avaliação da atividade antichagásica de

derivados tiossemicarbazônicos e tiazolinônicos, onde se verificou a possibilidade de

potencializar a atividade antichagásica dos compostos obtidos, assim como avaliar o

perfil de ligação com a TCC através de ensaios de “docking”.

22

CARDOSO, M. V. O.


2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Sintetizar, caracterizar e avaliar a atividade antichagásica frente ao Trypanosoma

cruzi, dos derivados da tiossemicarbazona e da tiazolinona.

2.2. Objetivos Específicos

2.2.1. Sintetizar derivados da tiossemicarbazona e da tiazolinona utilizando

aldeídos e cetonas aromáticas substituídas;

2.2.2. Caracterizar a estrutura química dos compostos obtidos através da

espectroscopia de infravermelho (IV) e de Ressonância Magnética Nuclear de Próton

(RMN-1H) bem como a determinação das propriedades físico-químicas dos compostos

obtidos;

2.2.3. Avaliar a atividade antichagásica dos compostos obtidos;

2.2.4. Realizar estudos teóricos de docking na cruzaína para os compostos

obtidos.

23

CARDOSO, M. V. O.


REVISÃO DA LITERATURA

24

CARDOSO, M. V. O.


3. REVISÃO DA LITERATURA

3.1. Generalidades da doença de Chagas

Em 1909 Carlos Chagas, cientista brasileiro, descobriu um parasito flagelado o

qual ele intitulou Trypanosoma cruzi, que é o agente causador da tripanossomíase

americana, agora conhecida como doença de Chagas. A doença de Chagas afeta cerca

de 24 milhões de pessoas do sul da Califórnia a Argentina e o Chile (CHAGAS, 1909;

WHO, 2002). A mais importante modalidade de transmissão da doença está associada

com as fezes de várias espécies de insetos triatomíneos que são estritamente

hematófagos. A transfusão de sangue também desempenha um papel importante na

transmissão doença de Chagas, uma vez que os testes sorológicos nos bancos de sangue

em áreas onde a doença é endêmica demonstram positividade entre 10 a 50%, e que a

percentagem de cerca de 10% do sangue contém parasitos infecciosos. Esta doença está

presente no continente americano há mais de 9000 anos (AUFDERHEIDE et al, 2004).

Doenças tropicais, como a malária resistente à cloroquina, a leishmaniose

visceral (Calazar), a filaríase linfática, tripanossomíase africana humana, doença de

Chagas e esquistossomose continuam a provocar morbidade e mortalidade

significativas. Juntamente com a tuberculose, essas doenças seriamente desabilitadoras

e ameaçadoras da vida podem ser chamadas coletivamente de doenças negligenciadas

(Quadro 1) (DNDi, 2006).

Estas doenças são negligenciadas pelos mecanismos que asseguram a pesquisa e

o desenvolvimento de novos medicamentos porque os pacientes acometidos por elas

não representam um mercado significativo. Somente 1% dos 1.393 novos remédios

registrados entre 1975-1999 é destinado a doenças tropicais e tuberculose, apesar dessas

doenças constituírem mais de 10% da carga global de doenças. Apenas 10% da despesa

mundial de pesquisa em saúde são gastos em doenças que acometem 90% da carga

global de doenças. As doenças negligenciadas obtêm uma porção ainda menor em

pesquisas. Por exemplo, dos 60-70 bilhões de dólares gastos em pesquisa de saúde no

ano passado, menos de 0,001% foi destinado ao desenvolvimento de novos e urgentes

tratamentos para esta categoria de doenças (DNDi, 2006).

25

CARDOSO, M. V. O.


A crise na pesquisa e desenvolvimento (P&D) de medicamentos para doenças

negligenciadas não é provocada por uma falta de conhecimento científico, já que muito

se sabe e muitas informações são geradas continuamente sobre a biologia, imunologia e

genética dos parasitos que causam a tripanossomíase africana, a leishmaniose e a

doença de Chagas. Na realidade, a crise é mais o resultado da falha do mercado e de

políticas públicas para promover medicamentos para doenças negligenciadas (DNDi,

2006).

A- Doenças Globais como câncer ou doenças cardiovasculares, metabólicas, ósseas e de

articulação afetam pessoas em todo o mundo e constituem o maior foco da indústria

farmacêutica baseada em P&D.

B- Doenças Negligenciadas como malária e tuberculose afetam principalmente pessoas

de países pobres, apesar de existir um pequeno mercado em países ricos (por ex. para

pessoas que viajam para áreas endêmicas). Portanto, há algum esforço de P&D.

C- Doenças Extremamente Negligenciadas: atingem exclusivamente pessoas em países

em desenvolvimento que são muito pobres para pagar por tratamento e é onde a doença

de Chagas está classificada. Elas não representam um mercado e estão fora do escopo

dos esforços P&D das indústrias.

Z- representa a parte do mercado farmacêutico para produtos direcionados à condições

que não são meramente médicas (como celulite, calvície etc.). Este mercado é altamente

lucrativo em países ricos.

AB

CZ

Doença de

Chagas

Quadro 1: As doenças e a abrangência da indústria farmacêutica.

26

CARDOSO, M. V. O.


3.2. Epidemiologia

Globalização e doença de Chagas são realidades históricas e sociais na América

Latina, estritamente interligadas e com importantes influências e repercussões na

sociedade e entre si. A enfermidade se restringe a esta região que, no seu contexto

político-econômico e social tem sido fortemente marcada por alguns impactos positivos

e muitos negativos da globalização. Ressalta-se a migração rural-urbana e seus

condicionantes, a modernização da produção agro-pecuária, um maior acesso de

pacientes aos serviços médicos e previdenciários e a cooperação internacional pelo

controle, ao lado de deterioração das políticas sociais e de visível enfraquecimento do

Estado (DIAS, 2007; CNBB, 2003; JÖRG, 2002; MACEDO, 1997; SCHMUNIS, 1997;

SCHMUNIS & DIAS, 2000).

De modo geral, a doença de Chagas emerge de um contexto bioecológico

intimamente relacionado à forma de viver e à história natural de seu agente etiológico, o

Trypanosoma cruzi e de seus hospedeiros superiores (mamíferos) e hospedeiros

intermediários (insetos vetores). Ocorre como enzootia há muitos séculos no ambiente

silvestre de larga extensão do Continente Americano, vindo posteriormente a afetar o

ser humano num ciclo particular, doméstico, originário de migrações, de invasão do

ambiente natural e de múltiplas ações de caráter antrópico (DIAS & COURA, 1997;

WHO, 2002).

No seu contexto geral e frente à evolução política e social do continente, a

doença de Chagas humana constitui-se um exemplo particular e característico na

América Latina, pois reflete e sofre as conseqüências da história social e a questão da

eqüidade na região. Nas últimas décadas acentuou-se a urbanização de indivíduos

infectados, aumentando de início os riscos de transmissão por meio de transfusões de

sangue, o que obrigou rigorosa seleção de doadores nas regiões endêmicas. Como

doença caracteristicamente rural, tradicionalmente acomete pessoas de origem

interiorana que habitam ou habitaram casas de baixa qualidade, onde facilmente se aloja

e coloniza o inseto vetor.

A infecção humana pode ser muito grave, com mortalidade significativa em

crianças na sua fase aguda e severo acometimento cardíaco e/ou digestivo em adultos

crônicos (DIAS & MACEDO, 2005). Produz perdas sociais importantes nas áreas

endêmicas, em termos de mortalidade, absenteísmo, incapacidade laboral e custos

27

CARDOSO, M. V. O.


médico-sociais, números esses geralmente ignorados por políticos e governos, tanto em

virtude da evolução crônica e pouca visibilidade da doença como, principalmente, pela

anomia da população exposta ou afetada pelo mal.

Estima-se que ainda existam entre 12 e 14 milhões de infectados na América

Latina, com mais de 60 milhões de pessoas sob risco de transmissão, em cerca de 18

países (figura 2) (WHO, 2002).

A principal forma de controle da doença faz-se através de ações de combate

químico sistemático aos insetos vetores e/ou melhorias habitacionais, complementadas

por rigorosa seleção de doadores de sangue. Não há ainda uma forma de prevenir a

transmissão do parasito por via congênita, sendo consenso que – para esta modalidade –

a melhor estratégia é a detecção precoce do caso e seu pronto tratamento (DIAS &

MACEDO, 2005; SVS, 2005). O tratamento da infecção é efetivo nas fases iniciais e

muito pouco benéfico nas formas crônicas avançadas (WHO, 2002; SVS, 2005). No

contexto da transmissão, atenção e controle da doença de Chagas são perceptíveis em

muitos aspectos pertinentes ao processo de globalização e à ocorrência de iniqüidade. A

enfermidade ameaça e acomete basicamente as regiões pobres da América Latina,

priorizando populações de baixa expressão política, socialmente excluídas, de origem

rural e pouco letradas (DIAS & BORGES, 1979; VIANNA-MARTINS, 1968.). Por

tudo isso, a atenção ao infectado e o controle da transmissão do T. cruzi ao homem

geralmente pressupõem uma ação de Estado, o que gera clara dependência de políticas

públicas conseqüentes e continuadas (ALMEIDA, 2002; DIAS, 1995).

Figura 2: Incidência da doença de Chagas na América Latina.

Doença de Chagas

28

CARDOSO, M. V. O.


A Tripanossomíase Americana ou doença de Chagas é uma das principais

preocupações de saúde pública na América Latina e ocupa o segundo lugar, perdendo

somente para a Malária, na prevalência e mortalidade por doenças associadas a vetores

(WHO, 2002).

Pelo menos 25 milhões de pessoas estão consideradas em risco de exposição à

infecção, com um total estimado de 8 milhões de casos de infecção. Somente o Chile

contribui para este número em presumivelmente 150.000 casos de infecção (WHO,

2002). Além disso, de acordo com relatórios da Organização Mundial de Saúde, a taxa

de mortalidade varia de 8% a 12%, dependendo do país estudado, a idade, os doentes, as

condições sanitárias, bem como o tratamento recebido (WHO, 2002).

Este relatório também afirma que estudos recentes têm mostrado cerca de

200.000 novos casos por ano e destes, 21.000 mortes por ano estão associadas à doença

de Chagas (WHO, 2002).

3.3. Ciclo biológico do T. cruzi

O ciclo biológico do parasito (Esquema 1) inclui três formas fundamentais

caracterizada pela posição relativa do flagelo, citoplasma, e núcleo (PRATA, 2001):

(1) Tripomastigotas: 20 μM de comprimento, fusiformes, cinetoplasto (corpo

basal) subterminal, constituem a forma infectante, e são encontrados no sangue de

mamíferos e na porção caudal (abdômen) dos insetos triatomíneos; eles não se

multiplicam. Em mamíferos eles são disseminados por transmissão de sangue infectado

(PRATA, 2001).

As formas tripomastigotas metacíclicas lembram as formas delgadas dos

tripomastigotas (que não podem evoluir se não penetrarem em hospedeiro vertebrado), e

que exibem capacidade invasiva para atravessar mucosas e conjuntivas e não são

suscetíveis ao soro humano, podendo sobreviver a temperaturas mais elevadas.

(2) Epimastigotas: Também possuem 20 μM de comprimento, cinetoplasto

(corpo basal) anterior ao núcleo, fusiformes. Representam a forma multiplicativa do

parasito no intestino do triatomíneo e é a forma predominante na cultura. Por esta razão,

é a forma mais comumente usada em estudos bioquímicos (PRATA, 2001).

29

CARDOSO, M. V. O.


Os epimastigotas são originários da diferenciação de tripomastigotas sanguícolas

ingeridos pelo vetor durante a picada e multiplicam-se por divisão binária longitudinal

no lúmem do tubo intestinal do inseto.

(3) Amastigotas: Aproximadamente 2 μM de diâmetro, redondo, sem um flagelo

emergente. Eles se multiplicam através de fissão binária dentro de células hospedeiras

nos mamíferos, produzindo sua ruptura, e liberando tripomastigotas pela corrente

sanguínea que podem voltar a invadir qualquer célula nucleada (PRATA, 2001). Elas

podem ser produzidas em cultura de células musculares, fibroblastos e macrófagos

dentre outros (FAÚNDEZ et al., 2005; MORELLO, 1988).

Esquema 1: Ciclo biológico do T. cruzi

Ciclo Biológico do Trypanosoma cruzi

30

CARDOSO, M. V. O.


3.4. Sintomatologia e tratamento da doença de Chagas

A doença tem uma fase aguda, de curta duração, que em alguns portadores

progride para uma fase crônica. A fase aguda é geralmente assintomática, e tem uma

incubação de uma semana a um mês após a picada. No local da picada pode-se

desenvolver uma lesão volumosa, local eritematosa (vermelha) e edematosa (inchada),

lesão conhecida como chagoma. Se a picada for perto do olho é freqüente observado

conjuntivite com edema da pálpebra, também conhecido por sinal de Romaña (figura

3). Outros sintomas possíveis são febre, linfadenopatia, anorexia,

hepatoesplenomegalia, miocardite brandas e mais raramente também

meningoencefalite.

Aproximadamente 20 a 60% dos casos agudos evoluem, em 2 a 3 meses, à

forma crônica da doença, curando-se os restantes. No entanto, em todos os casos, os

sintomas cessam após cerca de dois meses. Muitos mas não todos os portadores do

parasito desenvolvem sintomas devido à doença crônica (ALMEIDA, C. 2002).

O caso crônico permanece assintomático durante dez a vinte anos. No entanto

neste período de bem-estar geral, o parasito está a reproduzir-se continuamente em

baixos números, causando danos irreversíveis em órgãos como o sistema nervoso e o

coração. O fígado também é afetado, mas como é capaz de regeneração, os problemas

são raros. O resultado é apenas aparente após uma ou duas décadas de progressão, com

aparecimento gradual de demência (3% dos casos iniciais), cardiomiopatia (em 30% dos

casos), ou dilatação do trato digestivo (megaesôfago ou megacólon (6%), devido à

destruição da inervação e das células musculares destes órgãos, responsável pelo seu

tônus muscular. No cérebro há freqüentemente formação de granulomas. Neste estágio a

doença é freqüentemente fatal, mesmo com tratamento, geralmente devido à

cardiomiopatia (insuficiência cardíaca). No entanto, o tratamento pode aumentar a

esperança e qualidade de vida.

Figura 3: Sinal de Romaña.

31

CARDOSO, M. V. O.


Há ainda infreqüentemente casos de morte súbita, quer em doentes agudos quer

em crônicos, devido à destruição pelo parasito do sistema condutor dos batimentos no

coração ou danos cerebrais em áreas críticas (WHO, 2002).

Os principais compostos desenvolvidos experimentalmente para o tratamento da

doença de Chagas, logo após a descoberta da enfermidade por Carlos Chagas, em 1909,

foram: atoxil (arsênico), fucsina, antimônio pentavalente, e cloridrato de mercúrio,

desenvolvidos experimentalmente por Mayer e Rocha Lima (1912-1914), mas nenhum

deles apresentou resultados eficazes (RODRIQUES & CASTRO, 2002).

Anos mais tarde, na Alemanha, os laboratórios Bayer e outros laboratórios

desenvolveram as primeiras drogas com atividade antichagásica como Bayer 1957,

fenatridina carbidium sulfato, aminoquinolinas, arsênicos trivalentes e vários compostos

nitrofurânicos. Como conseqüência dos anos de pesquisa, na década de 1960 obteve-se

as drogas clássicas utilizadas até hoje no tratamento da doença de Chagas, Nifurtimox

(Bayer 2502, Lampit®) e Benznidazol (RO7-1051, Rochagam®, Radanil®).

De acordo com os requerimentos da organização mundial de saúde (WHO,

1997) a droga ideal para o tratamento da doença de Chagas deve possuir os seguintes

requerimentos:

1- Cura parasitológica na fase aguda e crônica da doença;

2- Ser efetiva em uma única ou poucas doses;

3- Ser acessível aos pacientes, ou seja, de baixo custo;

4- Não Possuir efeitos colaterais e/ou teratogênicos;

5- Não precisar de internação para o tratamento e;

6- Não induzir resistência.

Desde a descoberta da doença de Chagas, várias drogas foram desenvolvidas

para o seu tratamento, mas, atualmente, as drogas que são utilizadas na terapia da

doença de Chagas são: Nifurtimox (4 [(5-nitrofurfurilideno) amino]-3-

metiltiomorfolina-1 ,1-dióxido), derivado do nitrofurano e Benznidazol (Nbenzil-2-

nitroimidazólico-1-acetamida) (Figura 4), um derivado nitroimidazólico. A dose

recomendada na fase aguda é 8-10 mg/ kg/ dia para Nifurtimox e 5 mg/ kg/ dia durante

90 dias para Benznidazol.

32

CARDOSO, M. V. O.


A duração média do tratamento é de cerca de 60 dias, mas quando doença

crônica é reativada, como em pacientes imunocomprometidos, o tratamento pode durar

5 meses ou mais. Apenas em casos de presumíveis infecções acidentais e, por meio de

um vetor, transfusão de sangue, ou de contaminação em um laboratório, a duração do

tratamento profilático é limitado há 10 dias (RODRIQUES & CASTRO, 2002).

O Nifurtimox e o Benznidazol são agentes tripanocidas a todas as formas do

parasito (COURA & CASTRO, 2002). No entanto, eles podem causar toxicidade

sistêmica e efeitos adversos que incluem anorexia, náuseas, vômitos, dores de cabeça,

depressão do sistema nervoso central ou sintomas de mania, convulsões, vertigens,

polineuropatias periféricas, e dermatite (KIRCHHOFF, 2000). Além disso, há relatos de

mutagênese e danos ao DNA (ZAHOOR et al, 1987). Em grande número de doentes

tratados com estes fármacos, não foram encontrados grandes problemas relacionados a

este último ponto (APT, 1999), e, portanto, o risco parece ser mais teórico do que

clínico.

Figura 4: Fármacos utilizados no tratamento da doença de Chagas desde 1970.

NH

NN

NO2

O

Cetoconazol

Itraconazol

Alopurinol

BenznidazolNifurtimox

33

CARDOSO, M. V. O.


Outro elemento que complica a gestão farmacológica desta doença, e uma das

causas de fracasso do tratamento, é a susceptibilidade de diferentes cepas do parasito a

essas drogas (FILARDI & BRENER, 1987).

3.5. Tiossemicarbazonas: aspectos químicos

As tiossemicarbazonas são compostos de considerável interesse científico,

devido as suas importantes propriedades químicas e biológicas, tais como antichagásica

(LEITE et al, 2006, 2007 ), antitumoral (FEUN et al, 2002), antibacteriana (KASUGA

et al, 2003), antiviral (TEITZ et al, 1994), antiprotozoária (BHARTI et al, 2002),

citotóxica (KARAH, 2002), dentre outras. A estrutura química das tiossemicarbazonas e

a respectiva numeração dos seus átomos segundo a IUPAC (PANICO, POWELL &

RICHER, 1993) é mostrada na Figura 5.

Em 2004, Greenbaum e colaboradores realizaram estudos a cerca de uma série

de tiossemicarbazonas com a capacidade de inibir a proteína Cruzaína do Trypanosoma

cruzi (TCC). Este estudo gerou uma relação estrutura-atividade (SAR) sobre a Cruzaína

em três posições tendo como base o núcleo na figura 6. Os autores constataram que

halogenetos como o bromo e cloro foram tolerados nos carbonos das posições 3 e/ou 5

no anel aril. Além disso, a mudança do substituinte metil na posição 2 teve pouco efeito

e uma mono substituição no nitrogênio da posição 1 e no NH2 da posição 3 foram

deletérios.

R1,R2,R3,R4 = H, Alquil ou Aril

Figura 5: Estrutura da tiossemicarbazona.

34

CARDOSO, M. V. O.


3.5.1. Tiossemicarbazonas e seus complexos metálicos:

Tiossemicarbazonas complexadas com metais apresentam um amplo espectro de

aplicações terapêuticas (WEST et al, 1993). Devido às suas propriedades biológicas, as

tiossemicarbazonas são extensamente estudadas na química medicinal.

As atividades biológicas concernentes as tiossemicarbazonas resultam da

habilidade de formar quelatos com íons metálicos. Elas existem nas formas

tautoméricas Tiona e Tiol (Figura 7). A forma Tiona atua como ligante neutro

bidentado enquanto a forma Tiol se desprotona e atua como um ligante aniônico.

(KURUP & JOSEPH, 2003).

Figura 6: Relação estrutura-atividade (SAR) proposto por Greenbaum e colaboradores (2004).

R1,R2,= H, Alquil e Aril

Figura 7: Formas tautoméricas Tiona e Tiol.

Substituições alquílicas toleradas

Substituição emNH2 geralmente

não é bom

Saturação em

C=N não é bom

C=O, semicarbazona

não é bom

Substituintes benéficasno anel:

Mono: Br, CF3, ClBi: 3,4 Cl2; 3,5 (CF3)2;

Substituições em C2 e C4 não é bom

35

CARDOSO, M. V. O.


Do ponto de vista da química medicinal, a complexação de ligantes bioativos

com metal de transição (Figura 8) pode resultar em algumas vantagens, a saber: (i)

incremento da atividade biológica, quando comparado somente ao ligante; (ii)

modificação no perfil farmacodinâmico e farmacocinético, (iii) habilidade em mimetizar

substratos endógenos. No entanto, é observado que alguns complexos metálicos

apresentam pobre solubilidade em solventes orgânicos, no entanto, a inserção de

substituintes orgânicos (por exemplo: 1,4-ciclooctadiêno e ciclopentadiêno) ligados

diretamente ao metal de transição tem sido aplicado com sucesso para minimizar este

problema (KALINOWSKA-LISA et al., 2008).

3.5.2. Obtenção direta das tiossemicarbazonas a partir de tiossemicarbazidas

As tiossemicarbazonas são compostos amplamente explorados na síntese

orgânica e podem ser adquiridas comercialmente. A síntese é descrita pela condensação

equimolar de um derivado carbonilado, do tipo aldeído ou cetona, com

tiossemicarbazidas em meio alcoólico sob refluxo e quantidades catalíticas de ácido

(Esquema 2) (HOLLA et al, 2003; SARODNICK et al, 2003; SOMOGLY, 1991;

WEISTOCK & CHENG, 1979).

Do ponto de vista sintético, as tiossemicarbazonas apresentam como

característica principal, sua versatilidade de obtenção, assim como sua vasta aplicação

como intermediários de muitos núcleos importantes. Em geral, estas moléculas

apresentam baixo custo de síntese, além de grande economia de átomos, uma vez que,

com exceção da água que é liberada na sua síntese, todos os outros átomos dos

compostos reagentes estarão presentes na molécula final (DU et al, 2002).

A B

Figura 8: Exemplos de complexos metálicos com atividade antichagásica (A = OTERO et al, 2006; B = PÉREZ-REBOLLEDO et al, 2008).

36

CARDOSO, M. V. O.


Esta reação é bastante conhecida por sua alta quimiosseletividade, versatilidade

e rapidez, apresentando geralmente altos rendimentos (HANG & BERTOZZI, 2001;

BENBROOK et al, 1997; RODRIGUEZ, MARCAURELLE & BERTOZZI, 1998).

O mecanismo reacional é semelhante ao de formação de iminas. Inicia-se com a

protonação do oxigênio da carbonila para formar o intermediário íon oxônio, seguida de

ataque nucleofílico do nitrogênio N-1 da tiossemicarbazida para formar o intermediário

hemiaminal protonado (Esquema 2). Este perde uma molécula de água e, após

neutralização, forma-se a tiossemicarbazona (COSTA et al, 2003; SOLOMONS &

FRYHLE, 2002).

As tiossemicarbazonas são geralmente obtidas como misturas de isômeros E e Z

no estado sólido (LEMKE et al, 1977). Em solução, há isomerização da configuração Z

para E, devido a sua maior estabilidade termodinâmica (OTA et al, 1998). A

isomerização é extremamente influenciada pela presença de ácido e pela natureza dos

grupos substituintes ligados ao carbono azometina, bem como pelos substituintes

ligados ao nitrogênio da tioamida (N-4).

Karabatsos e colaboradores (1964) mostraram, em estudos utilizando a técnica

de RMN-1H, que os hidrogênios azometínicos de tiossemicarbazonas na configuração E

ressonam a campo magnético baixo em relação à tiossemicarbazonas em configuração

Z, mesmo em diferentes solventes. Resultado semelhante foi obtido por Antonini e

Esquema 2: Reação da obtenção de tiossemicarbazonas

R= H ou metil;R1 e R2= H, Aril ou Alquil

Isômero e Isômero z

Ion oxônio

Hemiacetalprotonado

Ts=

Ts

37

CARDOSO, M. V. O.


colaboradores (1977) alguns anos depois. Como regra geral, as tiossemicarbazonas

derivadas de aldeídos tendem a formar preferencialmente o isômero E,

termodinamicamente mais estável, enquanto que nas derivadas de cetonas assimétricas a

proporção entre E e Z depende da estrutura dos substituintes ligados à carbonila (OTA

et al, 1998).

3.6. Atividades biológicas das tiossemicarbazonas

Tiossemicarbazonas e semicarbazonas (Figura 9) apresentam um amplo perfil

farmacológico e constituem uma importante classe de compostos cujas propriedades

têm sido extensivamente estudadas na Química Medicinal e, particularmente, na

Química Medicinal Inorgânica, em razão de sua capacidade quelante e do papel da

coordenação no seu mecanismo bioquímico de ação. Apesar da ampla versatilidade

farmacológica desses compostos como uma classe, especificidades estruturais podem

levar à manifestação de atividades específicas. De modo geral pode-se dizer que

tiossemicarbazonas e semicarbazonas agem, seja como inibidores de enzimas, através

da complexação de metais endógenos ou através de reações de redox, seja através de

interações com o DNA e da inibição da síntese do DNA. Além disso, alguns complexos

metálicos desses ligantes apresentam a habilidade de mimetizar a ação de certas

enzimas (BERALDO, H. 2004).

Greenbaum e colaboradores (2004) sugeriram que o mecanismo de ação das

tiossemicarbazonas é ainda complexo e deve acontecer através da inibição de múltiplos

alvos. Neste sentido, as tiossemicarbazonas apresentam-se como ligantes versáteis

tanto na forma neutra quanto na forma aniônica, podendo formar ligação coordenada

R1,R2,R3,R4 = H, Alquil e Aril

Figura 9: Estruturas e diferença pontual entre as tiossemicarbazonas e as semicarbazonas.

38

CARDOSO, M. V. O.


com metais através do átomo de enxofre e do átomo de nitrogênio azometina (C=N)

(BHARTI et al, 2003; SHAILENDRA et al, 2003). Esta capacidade de formar ligação

coordenada é aumentada se houver grupos doadores de elétrons ligados ao carbono da

função azometina (CASAS, TASENDE & SORDO, 2000). É conhecido que as

tiossemicarbazonas e seus complexos metálicos apresentam uma gama de atividades

biológicas dentre os quais se destacam as antichagásica, antiprotozoária, antiviral, e

antitumoral.

3.6.1. Tiossemicarbazonas como agentes antichagásicos

Vários estudos têm evidenciado a importância de derivados das semicarbazonas

e tiossemicarbazonas para a obtenção de agentes antiparasitários (DU et al, 2002)

adicionar mais fontes.

Diversos inibidores irreversíveis, baseados em peptídeos têm sido

desenvolvidos como potentes substratos para a TCC, tais como cetonas halometil,

diazometanos, derivados epoxisuccinil e vinil sulfonas, pseudopeptídeos entre outros.

Entretanto, uma desvantagem para estes compostos é sua alta reatividade enzimática, e,

portanto, pobre seletividade para a TCC (ROUSH et al, 2000).

Para o desenvolvimento de fármacos antichagásicos, as pesquisas têm sido

direcionadas para a inibição das enzimas Cruzaína do Trypanosoma cruzi (TCC)

(TRAWICK et al, 2006) e a Tripanotiona redutase (TR) (AUGUSTYNS et al, 2001),

como alvos específicos e promissores. A TCC é a enzima chave da replicação

intracelular do parasito e a TR é a enzima chave do metabolismo antioxidativo do

Trypanosoma cruzi. Compostos sintetizados que apresentam uma porção

tiossemicarbazona em sua estrutura têm sido descritos como um grupo farmacofórico

que apresentam uma potencial atividade inibitória da enzima cruzaína, e 5-nitrofuril no

grupo reconhecido, um promotor de stress oxidativo (AGUIRE et al, 2004).

Du e colaboradores (2002) descreveram que alguns derivados das

tiossemicarbazonas exibem potente atividade frente à enzima TCC bem como atividade

antiparasitária in vitro. Segundo estes mesmos autores, a interação ‘ligante-TCC’ ocorre

via ataque covalente do resíduo Cys25 (da TCC) em direção ao carbono tiocarbonilado

e transferência de um próton do resíduo His159, formando um derivado tetraédrico

39

CARDOSO, M. V. O.


sulfídrico (Esquema 3). Este mecanismo mostra que a diferença de potência entre as

aril-tiossemicarbazonas e aril-semicarbazonas é resultado do volume atômico C=S

como parâmetro crucial para o ataque covalente do resíduo Cys25 na TCC.

Diante destes resultados, Fujii e colaboradores (2004) exploraram a obtenção de

aril-tiossemicarbazonas contendo diversas substituições em C1. Os resultados

demonstraram que a substituição por grupo fenil, p-metil-fenil, e alquílicos lineares

incrementam a potência desta classe de compostos frente aos ensaios anti-T. cruzi,

entretanto, a simples ramificação ou substituição de fenil por ciclohexil diminuem

drasticamente a potência destes derivados, inativando-as.

Já Chung e colaboradores (2003) mostraram que o derivado obtido N-

hidroximetil da Nitrofurazona atua como um pró-fármaco, mais potente que o protótipo

e com menor potencial mutagênico, demonstrando que a N-funcionalização constitui-se

como importante modificação molecular para a otimização de Nitrofuranos (Figura 10).

Esquema 3: Mecanismo de inibição na TCC por derivados das aril-tiossemicarbazonas, propostas por Du e colaboradores (2002).

Figura 10: Derivados N4-funcionalizados da Nitrofurazona, relatados como inibidores da TR.

Aguire et al

40

CARDOSO, M. V. O.


Em 2006, Leite e colaboradores constataram que a atividade tripanocida tem

sido atribuída a derivados heterocíclicos-hidrazonas e aril-tiossemicarbazonas. Esta

atividade é originária da inibição da enzima Cruzaína do Trypanosoma cruzi (TCC).

Os resultados dos estudos de “docking” realizados Leite e colaboradores (2006,

2007) comprovaram a afinidade das moléculas obtidas com a enzima TCC, revelando a

capacidade de moléculas com o núcleo tiossemicarbazona em inibir a TCC,

ocasionando a atividade anti-T. cruzi.

Du e colaboradores (2002) sintetizaram mais de 100 compostos derivados

tiossemicarbazônicos dentre os quais 45 apresentaram atividade antichagásica, onde

avaliaram a eficácia dos compostos em inibir a TCC. Eles observaram que propriedades

físico-químicas oferecem vantagens a ação anti TCC da porção tiossemicarbazona

como: baixo peso molecular, C log P compatível, capacidade de doação e formação de

pontes de hidrogênio além de apresentar uma rota sintética fácil e econômica. Usaram o

derivado tiossemicarbazônico 1i como base para modificações estruturais onde o

composto apresentou IC50 igual a 100nM frente à TCC do T. cruzi e verificaram que o

simples fato de reduzir o C=N da posição 4 diminuiu a eficácia do composto até o grau

de duas ordens de grandeza (Esquema 4).

Dentre os vários compostos sintetizados, Du e colaboradores (2002) obtiveram

resultados interessantes aonde chegou a alcançar IC50 frente à TCC igual a 20nM. Os

compostos mais ativos foram os: 2b, 2h, 2i, e 3h com as respectivas IC50: 50nM, 20nM,

20nM, e 50nM (Figura 11).

NaBH4, MeOH

Refluxo, “overnight”

Composto 1i Composto 7aIC50 = 100nM IC50 = 10µM

70% de rendimento

Esquema 4: Redução do C=N da posição 4.

41

CARDOSO, M. V. O.


Aguire e colaboradores (2004) sintetizaram uma série de compostos 5-nitrofuril

tiossemicarbazonas (Figura 12) e constataram atividade antichagásica dos mesmos,

onde os compostos 6, 8, 10, 12 apresentaram atividade tripanocida superior a droga em

uso atualmente na terapia antichagásica, Nifurtimox.

A atividade antichagásica dos compostos sintetizados por Aguire et al foi

atribuída a inibição da enzima Cruzaína do T. cruzi e a promoção do estresse oxidativo

ocasionado pela porção 5-nitrofuril, similarmente ao composto nitroderivado Nfx.

Composto R R1 R2 R3 IC50/nM

2b CH2CH3 H H CF3 50

2h CH2CH3 CF3 H CF3 20

2i CH2CH3 H Cl Cl 20

3h CH3 H Cl Cl 50

Composto N R

6 1 H

8 1 Me

10 1 Et

12 1 Ph

Figura 11: Compostos 2b, 2h, 2i, e 3h sintetizados por Du e colaboradores (2002).

N

Figura 12: Compostos 5-nitrofuril tiossemicarbazonas antichagásicos sintetizados por Aguire et al (2004).

42

CARDOSO, M. V. O.


3.6.2. Atividade antiprotozoária

Em 2002, Bharti e colaboradores realizaram testes antiprotozoários de alguns

derivados tiossemicarbazônicos e obtiveram bons resultados biológicos frente à

Entamoeba histolytica e Trichomonas vaginalis, utilizando Metronidazol como fármaco

de referência.

A substância 5-nitro-tiofeno-2-carbaldeído-N(4)-hexametilimina

tiossemicarbazona (5-NT-HMINTSC) (Figura 13) apresentou, em concentrações de

1,71μM, inibição de 50% do crescimento (IC50) de Entamoeba histoltica, em

comparação com a concentração de 2,10μM de Metronidazol necessários para igual

inibição (IC50). Outro derivado, o 5-nitrotiofeno-2-carbaldeído-N(4)-butil

tiossemicarbazona (5-NTBuTSC) (Figura 13) apresentou IC50 de 1,49μM em atividade

tricomonicida, onde o Metronidazol apresentou IC50 de 1,92μM para a mesma atividade.

Bharti e colaboradores (2003) também relataram atividade antiamoebicida de

tiossemicarbazonas complexadas com Pd(II) e constataram que os complexos obtidos

apresentavam uma melhor ação antiamoebicida do que os compostos com o núcleo

tiossemicarbazona livre e também uma ação melhor que o fármaco de escolha para esta

doença, o Metronidazol, que apresenta uma IC50 de 2,05, onde a IC50 do composto 6a

(Figura 14) é de apenas 0,81.

Figura 13: Compostos 5-NT-HMINTSC (R=C6H11), 5-NTBuTSC (R=C4H9) e Metronidazol.

Figura 14: Composto 6a sintetizado por Bharti e colaboradores (2003).

43

CARDOSO, M. V. O.


3.6.3. Atividade antiviral

Em 1994, Teitz e colaboradores relataram atividade anti HIV para

tiossemicarbazonas, onde foram estudadas duas tiossemicarbazonas dotadas de tal

atividade: a N-metilisatina-4’:4’-dietiltiossemicarbazona (M-IBDET) e a N-alilisatina-

4’:4’-dialiltiossemicarbazona (A-IBDAT) (Figura 15). Ambas demonstraram atuar

sobre a síntese de proteínas estruturais do HIV.

Genova e colaboradores (2004), por outro lado, compararam a atividade

inibitória da benzil bis (tiossemicarbazona) e seu respectivo complexo metálico de

paládio (II) sobre linhagens de vírus do tipo HSV 1 e 2 (herpes simples 1 e 2) e

observaram que o complexo metálico exibe melhora significativa na atividade antiviral

em comparação com a tiossemicarbazona livre .

Recentemente, Küçükgüzel e colaboradores (2008) sintetizaram uma vasta série

de derivados da tiuréia onde obtiveram 19 compostos os quais foram submetidos a

testes de atividade antiviral contra o vírus zoster varicella (VZV). Dentre os compostos

obtidos, o composto 38 foi o mais ativo (Figura 16).

N

NNH

NS

O

M-IBDET

N

NNH

NS

O

A-IBDAT

Figura 15: Derivados tiossemicarbazônicos com atividade anti HIV.

Figura 16: Composto 38 obtido por Küçükgüzel et al (2008).

44

CARDOSO, M. V. O.


3.6.4. Atividade antitumoral

Em 1998, Li e colaboradores desenvolveram um pró-fármaco da 3-

aminopiridina-2-carboxaldeído tiossemicarbazona (3–AP) (Figura 17), uma das

principais substâncias orgânicas no combate a tipos específicos de células tumorais, tais

como carcinoma de fígado M-109, carcinoma de ovário humano A-2780 e leucemia L-

1210, sintetizada inicialmente por Liu e colaboradores (1992), Onde realizou a inclusão

do grupamento bezoil fosfato, com objetivo de melhorar as propriedades

farmacocinéticas e, também, sua utilidade terapêutica frente a células tumorais M-109,

dando origem ao composto triapina – 3-AP (Figura 17).

Atualmente, Ivica Ðilović et al (2008) sintetizaram uma série com 8 derivados

da tiossemicarbazona e testaram a atividade antitumoral dos compostos obtidos frente a

seis linhagens de células tumorais. Dos 8 compostos obtidos, os compostos 3 e 4

(Figura 18) apresentaram a maior porcentagem inibitória das células tumorais das

linhagens, onde o composto 4 apresentou boa atividade inibitória nas seis linhagens e o

composto 3 apresentou boa atividade em três linhagens, MiaPaCa-2 (carcinoma

pancreático), MCF-7 (câncer de mama) e WI 38 (fibroblastos diplóides).

Figura 17: 3-aminopiridina-2-carboxaldeído tiossemicarbazona (3-AP) e seu pró-fármaco Triapina 3-AP.

N

N

HN

S

NH

O

NH2

O

(NaO)2(O)PO

Triapina 3-AP

N

N

HN

S

H2N NH2

3-AP

N NH

NH2OH

S

Composto 3 Composto 4

Figura 18: Derivados tiossemicarbazônicos com atividade antitumoral obtidos por Ivica Ðilović e colaboradores (2008).

45

CARDOSO, M. V. O.


3.7. 4-Tiazolinonas – aspectos químicos

As tiazolinonas são substâncias derivadas de uma importante classe de

compostos, os tiazóis, e são constituídas por um anel de cinco membros, contendo um

átomo de enxofre e outro de nitrogênio, assim como uma carbonila na posição 4 do anel

(Figura 19).

A primeira síntese dos tiazóis foi descrita em 1887, por Hantzsch (Esquema 5),

a partir da ciclização de compostos carbonílicos α-halogenados e seus derivados

levando a obtenção de tiazolinonas 2,5-bis-substituídas.

Chabrier e Pallu, em 1945, sintetizaram as primeiras tiazolinonas, fazendo-se

reagir em meio alcoólico um ácido α-halogenado com a tiossemicarbazida (Esquema

6). Esta classe de moléculas foi obtida em função dos trabalhos realizados com a

tiouréia, constatando-se que a mesma reagia muito facilmente com os ácidos α-

halogenados.

A análise dos dados descritos na literatura a respeito do mecanismo de ciclização

para 4-tiazolinonas a partir de aril-tiossemicarbazonas, como também os recentes

trabalhos de Klika et al (2006) e Metwally, Abdel-Latif & Bondock (2007) sugerem um

mecanismo reacional de ciclização em poucas etapas, iniciado pela S-alquilação e

desprotonação da tioamida, com posterior ataque nucleofílico do nitrogênio N-4 na

carbonila do ácido carboxílico, levando a ciclização deste intermediário (Esquema 7).

R= metila, etilaR1= OHR2= alquil, aril, NR2, X= Br, Cl

Figura 19: Estruturas da tiazolinona (A) e do tiazol (B).

Esquema 6: Ciclização da tiossemicarbazida.

Esquema 5: Síntese de Hantzsch.

A B

46

CARDOSO, M. V. O.


Em 1990, Leite e colaboradores sintetizaram tiazolinonas a partir de

tiossemicarbazonas derivadas de aldeídos e cetonas com ácidos α-halogenados e, dando

continuidade ao trabalho, Leite sintetizou diversos derivados tiazolidônicos (2006,

2007) onde os mesmos apresentaram atividades biológicas, como antitumoral (2006) e

antichagásica (2006, 2007) (Figura 20).

Figura 20: Compostos mais ativos sintetizados por Leite et al frente à atividade antitumoral ( 2006) e antichagásica (2006 e 2007).

NNH

NR2

S

R1

OH

X O

NNH

NR2

S

R1

CO2H

NNH

NR2

S

R1

CO2H

H

H

H

H

H

H

O

O

O

O

NNH

NR2

S

R1 H

O

OH

-AcOH -AcOH

-OHR2 NNH

N

S

O

HR1

AcO+

R2 NNH

N

S

O

R1

NNH

NR2

S

R1 H

O

O H

H

-H2O

Esquema 7: Mecanismo de obtenção do anel 4-tiazolinona.

Antitumoral, 2006

Antichagásica,,2006

Antichagásica,,2007

GrupoProtetor

47

CARDOSO, M. V. O.


3.8. 4 – Tiazolidinonas: aspectos químicos

Em geral, as 4-tiazolidinonas (Figura 21) podem ser produzidas, com bons

rendimentos, através de reações de ciclização envolvendo ácido α-haloacético ou ácido

α-mercaptoacético como descrito em revisões desenvolvidas por Brown, em 1961, e

Singh e colaboradores, em 1981. Estas publicações são consideradas referências

fundamentais para o estudo de 4-tiazolidinonas e por isso são freqüentemente citadas

por diversos autores.

3.8.1. Métodos de obtenção de 4-tiazolidinonas

Dentre os processos de síntese de 4-tiazolidinonas descritos na literatura,

destacam-se as reações de ciclização envolvendo ácidos α- haloacéticos ou derivados

destes com tiouréias (LAURENT et al, 2004), acil-tiossemicarbazidas (BONDE &

GAIKWAD, 2004) e tiossemicarbazonas (ERGENÇ et al, 1999); reações de cicloadição

do ácido α-mercaptoacético com tiossemicarbazonas (YADAV, VAISH & SHARMA,

1994); reações de condensação entre ácido α-mercaptoacético, aminas primárias e

aldeídos (HOLMES et al, 1995) e, reações de ciclização entre moléculas que

apresentam ligação dupla ou tripla conjugada com o grupo carbonila, como anidrido

maléico ou acetilenodicarboxilato de dimetila e compostos que apresentam a função

tioamida, como as tiossemicarbazonas (BROWN, 1961; BERSENEVA et al, 1998;

TENÓRIO et al, 2005; AQUINO et al, 2006).

Entre os métodos de obtenção de 4-tiazolinonas, destacamos os métodos

reacionais entre aciltiossemicarbazidas e tiossemicarbazonas e a reação entre o ácido α-

mercaptoacético com aminas e aldeídos e com tiossemicarbazonas.

S N

O

R

R1

R e R1= aril ou alquil.

Figura 21: Estrutura do núcleo 4-tiazolidinona

48

CARDOSO, M. V. O.


3.8.2. Reação entre acil tiossemicarbazidas e tiossemicarbazonas

Reações entre ácidos α-haloacéticos com tiossemicarbazonas e

aciltiossemicarbazidas para a obtenção de 4-tiazolinonas são bastante descritas na

literatura (BERSENEVA et al, 1998; GÜRSOY, TERZIOGLU & ÖTUK, 1997;

ABBADY et al, 2003). Küçükgüzel e colaboradores (2006) obtiveram em trabalhos

recentes, 2- imino-4-tiazolidinonas a partir de reações envolvendo acil

tiossemicarbazidas e α-bromoacetato de etila (Esquema 8, Equação a).

Todavia, esta metodologia não forneceu os derivados 4- tiazolidônicos esperados

quando se tentou condensar as respectivas aciltiossemicarbazidas substituídas, contendo

grupos volumosos em R2, como fenil, p-metoxi-fenil e cicloexil; fornecendo por outro

lado 1,3,4-oxadiazóis como principais produtos (Esquema 8, Equação b).

Esquema 8: Obtenção de 4-tiazolidinonas e 1,3,4-oxadiazóis a partir de éster α-halogenado por Küçükgüzel e colaboradores (2006).

EtOH

R1=

R1

HN

NH

NH

R2

O

S

BrCH2CO2C2H5

AcONa

R2= CH3 ou CH2CH2CH3

B

A

R3= C6H5 ou C6H4OCH3

49

CARDOSO, M. V. O.


3.8.3. Ácido α-mercaptoacético com aminas e aldeídos

Reações de condensação envolvendo ácido α-mercaptoacético com aminas

primárias ou ésteres de aminoácidos e aldeídos formando 4-tiazolidinonas 2,3-

dissubstituídas são extensamente descritas na literatura (Esquema 9) (BARRECA et al,

2001, 2002, 2003; RAO et al, 2004; DIURNO et al, 1993; GUDUDURU et al, 2004).

Estas são denominadas reações de condensação de três componentes “one-pot”,

processos em que três substâncias são colocadas para reagirem diretamente em um

único balão, facilitando a purificação e o isolamento do composto formado. Ocorrem

geralmente em tolueno ou benzeno seco sob refluxo, com tempos de reação variando

entre 2 h e 48 h, alcançando bons rendimentos.

Srivastava e colaboradores (2002) utilizaram outra metodologia, envolvendo

reações de condensação de três componentes “one-pot”, para obtenção de novas 4-

tiazolidinonas onde foi utilizado como solvente o tetraidrofurano (THF) e

dicicloexilcarbodiimida (DCC) a 0º C como agente de acoplamento, reagente que atua

diretamente na formação do anel tiazolidinônico (Esquema 10).

Esquema 9: Reação de condensação entre Ác. Mercaptoacético com amina primárias.

Esquema 10: Síntese de 4-tiazolidinonas “one-pot” de três reagentes desenvolvido por Srivastava e colaboradores.


AminaPrimária

ÁcidoMercaptoacético Aldeído 4-tiazolidinona

2,3-disubstituída

S N

O

R

R1

+ +

Ác. α-mercaptoacético Aldeídos

4-Tiazolidinonas

Aminas ou ésteres de aminoácidos


50

CARDOSO, M. V. O.


Durante a reação a dicicloexilcarbodiimida (DCC) é transformada em

dicicloexiluréia (DCU) (Figura 22) que pode ser facilmente removida por filtração,

uma vez que a DCU é completamente insolúvel em THF. Os tempos médios de reação

ficaram em torno de 1h, bem menores que aqueles observados nas reações realizadas em

tolueno ou benzeno seco, atingindo bons rendimentos, entre 59 a 95%, principalmente

quando a adição de DCC foi realizada a 0 ºC.

3.8.4. Com tiossemicarbazonas

El-Gendy e colaboradores (1990) demonstraram que reações envolvendo ácido

α-mercaptoacético com tiossemicarbazonas, em benzeno seco, levam à formação de 3-

tioureido-4-tiazolidinonas (Esquema 11).

C

N

N

C

HN

HN

O

DCC DCU

Figura 22: Diciclohexilcarbodiimida (DCC) e dicicloexiluréia (DCU).

Ariltiossemicarbazonas Ácido α-mercaptoacético

Esquema 11: Obtenção de 2-aril-3-tioureido-4-tiazolidinonas.

51

CARDOSO, M. V. O.


3.8.5. Reações no anel 4-tiazolidinona

Pelo fato do núcleo 4-tiazolidinona possuir heteroátomos que funcionalizando-o

e, estes sendo enxofre, nitrogênio e oxigênio, tornam o anel 4-tiazolidinona passível de

reações quimiosseletivas (Tabela 1) como a oxidação (JOHNSON et al, 1983), que

ocorre na posição 1 (enxofre), reações de N-alquilação (GRACIET et al, 1996) e de

Mannich (SINGH et al, 1981), que ocorrem no nitrogênio (posição 3), reações de

tionação (ANDRADE et al, 2002) na carbonila da posição 4 e reações de condensação

com aldeídos (VICINI et al, 2006), cetonas ou com com sais de diazônio (BROWN,

1961) no carbono metilênico, na posição 5. (Figura 23).

Figura 23: Principais sítios reacionais do anel 4-tiazolidinona.

12

3

45

Reações de TionaçãoCondensações com cetonas

ou aldeídos;Reações com sais de

diazônio

Reações de oxidação

N-alquilações;Reações de Mannich

S NH

O

52

CARDOSO, M. V. O.


Reações Esquemas

Oxidação

N alquilação

Mannich

CondensaçãoCom

Aldeídos

+ ArCHO

R = Heterociclo ou Aril

R = H ou Aril

R’ = Alquil ou Acil

O

O

R = F, H, ou CH3

R1 = F ou H1,1-dioxo-4-tiazolidinonas

R=

N-2-bromoacetil-4-tiazolidinonas

ou CH3

53

CARDOSO, M. V. O.


Sais de

Diazônio

Tionação

3.9. Atividades biológicas das 4-tiazolidinonas e análogos

O anel 4-tiazolidinona per si não apresenta atividade biológica. No entanto,

compostos contendo esse heterociclo possuem grande interesse científico, pois diversos

trabalhos relatam um amplo espectro de atividades biológicas dos seus diferentes

derivados (ANDRES et al, 2000; KÜÇÜKGÜZEL et al, 2006; BERSENEVA et al,

1998; SIDDIQUI, SINGH & SINGH, 2003; DING et al, 1995). Como visto

anteriormente, o anel 4-tiazolidinona possui vários sítios de substituição, o que leva a

um grande número de análogos estruturais. Portanto, as diferentes atividades biológicas

podem ser atribuídas a grupos substituintes nas posições 2, 3 e 5 do anel, onde

promovem modificações nos parâmetros físico-químicos e estruturais (lipofílicos,

eletrônicos, polares e estéricos) das moléculas. Serão descritas, a seguir, as principais

atividades biológicas apresentadas por esses compostos.

Tabela 1: Principais reações que ocorrem no anel tiazolidinônico.

54

CARDOSO, M. V. O.


3.9.1. Atividade antitumoral

Leite e colaboradores (2006) sintetizaram uma série de compostos com o anel 4-

tiazolinona, análogo da tiazolidinona (Figura 24), onde obtiveram bons resultados em

inibir o crescimento do tumor sarcoma 180. Todos os compostos obtidos inibiram o

sarcoma 180 em mais de 50%, que é o requerimento mínimo exigido pelo Instituto

Nacional do Câncer. Foram obtidos 5 novos compostos, onde os mais potentes são: 5a,

5c, e 5b, derivados peptideomiméticos respectivamente da fenilalanina, prolina e lisina.

3.9.2. Atividade antichagásica

Em 2006, Leite e colaboradores sintetizaram uma série de compostos com o anel

4-tiazolinona com atividade antichagásica (Quadro 2), onde alguns compostos

conseguiram inibir o crescimento do T. cruzi em concentrações não citotóxicas nas

células do hospedeiro (mamífero) e também realizaram estudos de “docking” dos

compostos obtidos na enzima Cruzaína do T. cruzi. Os compostos que apresentaram

melhores atividades antichagásicas foram os 5c e 10a. Ambos apresentaram atividade

antichagásica menor que a droga padrão (Nifurtimox).

Composto R % de inibição

5a Phe 805b Lys 715c Pro 78

Grupo protetorAnálogo

tiazolidinônico

Figura 24: Compostos 5a, 5b e 5c sintetizados por Leite et al (2006).

Quadro 2: Compostos 5c e 10a obtidos por Leite et al (2006)

Composto 5c Composto 10a

NH

HN

N

SN

O

OBOC

55

CARDOSO, M. V. O.


Dando continuidade ao trabalho desenvolvido em 2006, Leite e colaboradores

(2007) sintetizaram recentemente uma série de compostos aril-4-oxotiazolilhidrazonas

onde avaliaram a atividade antichagásica e estudos de “docking” para os compostos

obtidos. Dentre os compostos obtidos, destacam-se os compostos 6i e 6f (Figura 25),

onde os mesmos apresentaram atividade antichagásica comparável com a atividade das

drogas padrão utilizadas na terapia da doença de Chagas.

3.9.3. Atividade antimicrobiana

Em 2006, Vicini e colaboradores relataram a atividade antimicrobiana de

compostos 2-tiazolilimino-5-arilideno-4-tiazolidinonas, obtendo a análise de 11

compostos que apresentaram atividade antimicrobiana bastante satisfatória. Os testes

antimicrobianos foram realizados frente aos microrganismos: Bacillus subtilis (Gram+),

Staphylococcus aureus (Gram+), Escherichia coli (Gram-) e Haemophilus influenzae

(Gram-, isolado clinicamente). Dos 11 compostos obtidos, o composto 4j (Figura 26)

foi o mais potente da série.

Visando o aprimoramento do trabalho desenvolvido em 2006, Vicini et al (2008)

sintetizaram uma série de 33 compostos 2-Heteroarilimino-5-benzilideno-4-

tiazolidinonas, com o pressuposto de obter novos análogos 2-tiazolilimino-5-arilideno-

4-tiazolidinonas mais potentes. Realizaram a atividade antimicrobiana dos mesmos

onde vários compostos apresentaram notáveis resultados, alguns sendo superior ao

padrão utilizado, ampicilina, para as bactérias Staphylococcus aureus penicilina

Composto % Inibição IC50

6f 75 0,36i 100 3,2

Bzn 100 1,8Nfx 100 1,9

S

N

NHN

O

S

Figura 25: Compostos 6f e 6i sintetizados por Leite et al (2007) .

Composto 6f Composto 6i

56

CARDOSO, M. V. O.


resistente (SAR) e Staphylococcus epidermidis penicilina resistente (SER). Dentre os

vários compostos, destacam-se os 2b e 2d (Figura 26), mas nenhum destes conseguiu

superar a potência do análogo 4j, obtido em 2006.

Composto SAR SER

2b 3 62d 6 64j 0,7 1,5

AMP 25 25

3.9.4. Atividade antiviral

Diversos trabalhos relatam uma potencial inibição da enzima transcriptase

reversa do vírus da imunodeficiência humana tipo I (RT-HIV- 1), promovida por

compostos não-nucleosídeos contendo o anel 4-tiazolidinona. Barreca e colaboradores

(2003) demonstraram que 4-[tiazolidinonas]2,3-diaril-substituídas contendo em C-2

grupos 2’,6’- di-halofenil possuem uma maior ação inibitória seletiva frente a RT-HIV-

1 e menor citotoxicidade, in vitro, em células MT-4 infectadas, que os derivados 1-aril-

1H,3H-tiazolo[3,4-α]benzimidazóis (TBZs) (Figura 27), potentes agentes supressores

Composto 4j (2006)

Composto 2b (2008) Composto 2d (2008)

Ampicilina

Figura 26: Compostos antimicrobianos derivados tiazolidinônicos obtidos por Vicini et al.

57

CARDOSO, M. V. O.


não nucleosídeos da RT-HIV-1, utilizados como referência. O composto 7 (Figura 27)

apresentou a melhor atividade da série sintetizada por Barreca (2003).

Rao e colaboradores, em 2004, realizaram estudo semelhante com análogos 2-

(2,6-di-halofenil)- 3-(pirimidin-2-il)-1,3-tiazolidin-4-onas, resultando na síntese do

composto 10 (Figura 27),que apresentou elevado nível de atividade inibitória sobre a

RT-HIV-1.

Estudo realizado por Rawal e colaboradores (2005), utilizando derivados 2-aril-

3-furfuril-4-tiazolidinonas, indicou que apenas os compostos contendo, em C-2, grupos

2’,6’-di-halofenil -onde o composto 1 da série foi o mais ativo- (Figura 27) possuem

ação inibitória relevante sobre a RT-HIV-1.

3.9.5. Atividade antiinflamatória

A atividade antiinflamatória tem sido descrita em diversos trabalhos referentes a

4-tiazolidinonas. Em 1991, Walsh e colaboradores descreveram a ação antiinflamatória

e patentearam processos de síntese envolvendo mais de 80 derivados contendo o

heterociclo 4-tiazolidinona, relatando a atuação destes compostos como inibidores das

enzimas cicloxigenase e 5-lipoxigenase.

Compostos EC50 (µM) HIV-1

1 0.204±0.07 0.030±0.013

10 0.017±0.004TBZ 0.352±0.14

NS

O

Cl Cl

N

N

N

NS

F

F

Rawal et al, 2005.

TBZ

Composto 1Composto 7 Composto 10

Rao et al, 2004.Barreca et al, 2003.

Figura 27: Compostos 7, 10 e 1 com atividade antiviral.

58

CARDOSO, M. V. O.


Em 1999, Goel e colaboradores obtiveram bom resultado para uma das 3-(4-

bromo-2-carbo-xifenil)- 5-metil-4-tiazolidinonas 2-substituídas (figura 28) testadas

sobre a redução de edema (induzido por carragenina) em ratos albinos, utilizando como

fármaco padrão a fenilbutazona.

Já em 2004, Allen e colaboradores desenvolveram novas 4-tiazolidinonas 2,3,5-

trisubstituídas com potencial ação antagonista de receptores de quemoquinas CCR4, os

quais são responsáveis pela migração de células T ao local da inflamação, que

desempenham papel principal na condução de processos inflamatórios alérgicos, onde,

entre as moléculas mais ativas, temos o composto 91 (Figura 29).

Composto R % açãoAntiinflamatória

6 H 38,40

7 2-OCH3 26,70

fenilbutazona - 34,56

Figura 28: 3-(4-bromo-2-carbo-xifenil)- 5-metil-4-tiazolidinonas 2-substituídas sintetizadas por Goel e colaboradores (1999).

Figura 29: Composto 91 sintetizado por Allen e colaboradores (2004).

59

CARDOSO, M. V. O.


3.9.6. Atividade antipsicótica

Hrib e colaboradores (1989, 1990, 1991) patentearam um processo de síntese

envolvendo 4-(3-(4-oxotiazolidinil)butinilaminas-4-tiazolidinonas (Figura 30-a) e 3-

[4(4-piperazinil-1-il)butil]-4-tiazolidinonas (Figura 30-b), relatando a ação dos

primeiros compostos como analgésicos e antihipertensivos, e dos segundos como

analgésicos, ansiolíticos, anticonvulsivantes e antipsicóticos. A ação antipsicótica é

determinada pela afinidade destes compostos por receptores 5-HT2 (serotonina) e D2

(dopamina).

R= H, Alquil ou ArilR1= H, Alquil ou ArilR2= H ou AlquilR3= H ou Alquiln= 0, 1 ou 2X= Aril ou Heteroaril

R= R1= R2= R3= R4= H ou Alquil

Composto a Composto b

Figura 30: Compostos com atividade antipsicótica.

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71

CARDOSO, M. V. O.


5. CAPÍTULO 1

ARTIGO 1

Síntese, “Docking” na Cruzaína e estudos in vitro de

Aril-4-oxotiazolilhidrazonas contra Trypanosoma

cruzi

Artigo Publicado na Revista ChemMedChem.

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CARDOSO, M. V. O.


6. CAPÍTULO 2

ARTIGO 2

Estudos e Otimização Estrutural de Aril-4-

Oxotiazolil-hidrazonas como Potentes Agentes

Anti-Trypanosoma cruzi.

Artigo a ser submetido na Revista ChemMedChem.

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CARDOSO, M. V. O.


Studies Toward the Structural Optimization of Aryl-4-Oxothiazolyl-

hydrazones as Potent Anti-Trypanosoma cruzi Agents

Ana Cristina Lima Leite,*[a] Diogo Rodrigo de M. Moreira, [a] Dalci José Brondani, [a]

Marcos Veríssimo de O. Cardoso, [a] Marcelo Zaldini Hernandes,[b] Boaz Galdino de

Oliveira, [b] Luiza de Campos Reis, [c] Marina de Assis Souza, [c] and Valéria R. Alves

Pereira [c]

[a] Prof. Dr. A. C. L. Leite, D. R. de M. Moreira, Prof. Dr. D. J. Brondani, M. V. de O.

Cardoso

Laboratório de Planejamento, Avaliação e Síntese de Fármacos – LABSINFA,

Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Rua

Prof. Artur Sá S/N, Cidade Universitária, 50740-520, Recife, PE (Brazil). Phone/Fax:

(+55) 81 2126 8511, E-mail: [email protected][b] Prof. Dr. M. Z. Hernandes, Boaz Galdino de Oliveira

Laboratório de Química Teórica Medicinal – LQTM - Departamento de Ciências

Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Rua Prof. Artur Sá S/N, Cidade

Universitária, 50740-520, Recife, PE, (Brazil)[c] Prof. Dr. v. R. A. Pereira, L. de C. Reis, M. de A. Souza

Departamento de Imunologia, CPqAM / FIOCRUZ, 50670-420, Recife, PE, (Brazil)

82

CARDOSO, M. V. O.


Abstract

Aryl-thiosemicarbazones and analogs are highly active compounds against Trypanosoma

cruzi, and have become a core structures for the design and development of new

trypanocidal agents via the inhibition of T. cruzi cruzain (TCC) enzyme. Thus, we

investigated a focused library of 14 aryl-thiosemicarbazones and aryl-4-oxo-thiazolyl-

hydrazones for the activity against T. cruzi cell cultures, using an in vitro assay. The

activity against epimastigotes and trypomastigotes forms of the parasite are remarkable,

such as compounds 3f and 3j, whereas toxicity against mouse spleen cell cultures is very

low. These compounds are non-nitrated but showed similar trypanocidal activity when

compared with current drug, Benznidazole (Bdz) and with two TCC inhibitors previously

known.

Keywords: Trypanosoma cruzi - 4-thiazolidones – thiosemicarbazones - cysteine

protease - cruzain.

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CARDOSO, M. V. O.


Introduction

Chagas’ diseases, caused by protozoan parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi),

affect hundreds of millions of people in Latin American and result in significant

mortality, devastating social and economic consequences. Even though the enforcement

of public health programs towards vector elimination in some Latin American countries

has decreased the incidence of new infections, the disease is still endemic in many large

areas.[1] Also, the drugs available to treat this disease, Benznidazole (Bdz) and

Nifurtimox (Nfx) (Figure 1), are decades old and are frequently limited in efficacy,

plagued by severe side effects, impractical dosing regimens and hamstrung by drug

resistance. Thus in view of the background above, there is an urgent need for new

selective and safer drugs for treatment of Chagas’ disease.[2-3]

Development of broad spectrum antiprotozoal agents acting against multiple

protozoan parasites has attracted considerable attention, since the discovery of

biological targets present in different parasite. Among such targets, the Cysteine

Proteases (for T. brucei, T. cruzi, Plasmodium falciparum and Leishmania) [4,5] and the

disulfide oxidoreductases [Trypanothione Reductase (TRyR), for T. brucei, T. cruzi and

Leishmania) [6,7] are attractive targets for the development of antiparasitic chemotherapy

due to the key role they play at various stages in the life cycle of the parasites. [8]

The Cys-protease T. cruzi cruzain (TCC) is essential for replication of the

intracellular parasite and for this reason, much attention has been paid to the synthesis

and design of TCC inhibitors, mainly for thiosemicarbazones and its bioisoster 2-

pyrazoline, that have shown potent inhibitory activity against TCC in enzymatic studies

as well as endowed with tripanocidal properties in cell cultures. [9] Consequently, the

thiosemicarbazones scaffold and 2-pyrazoline scaffold are promising leads for the

development of others effective parasiticidal agents (against Plasmodium falciparum,

Toxoplasma gondii, Leishmania major and Trichomonas vaginalis) [10] and to improve

the potency and selective toxicity of the compounds based on both scaffolds, the

transition metal complexes with these ligands also have been achieved, such as copper,

vanadium, palladium and ruthenium. [11]

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CARDOSO, M. V. O.


Figure 1: Benznidazole (Bdz), Nifurtimox (Nfx) and the structure of two potent aryl-thiosemicarbazones

(TCC-01 and TCC-02) previously described as TCC inhibitors.

In this scope, some works has described the ability of non-nitrated and non-peptidic

compounds derived from 1,3-thiazoles, [12] imidazoles [13] and analogues heterocyclic in

inhibit the growth of T. cruzi culture cells in high potency and with low cytotoxicity to

mammalian cell lines, and this produce significant results in terms of development of

new antichagasic prototypes.

Based on all the above, we have previously described the synthesis of two series of

thiosemicarbazones [14] and their non classical bioisosteres 4-thiazolidones, [15] and their

in vitro anti-T. cruzi activities. The results obtained by us showed that some compounds

were effective in inhibit the T. cruzi at non-cytotoxic concentration. All of our most

potent anti-T. cruzi agents were able to inhibit the epimastigote form but only with low

activity against trypomastigote (other clinically relevant form) and thus, it is necessary

the optimization of biological properties for this class of compounds.

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CARDOSO, M. V. O.


Design

The synthesis and Structure–Activity Relationships (SAR) of substituted aryl-4-

oxo-thiazolyl-hydrazones were performed, and the structure of the two more active

compounds previously described by us (Figure 2) were used to guide the structural

design of new optimized trypanocidal agents. In order to compare and validate the

character pharmacophoric of heterocyclic 4-thiazolidone and its trypanocidal activity,

we decided to compare the biological activity of some aryl-thiosemicarbazones and

their similar cyclical aryl-4-thiazolidone. Also, changing the thioether by ethylenic or

ethyl groups were considered, that eventually could to result in difference for

trypanocidal activity due to impact on the conformation. These compounds are shown in

Scheme 1. By application of this strategy, we aimed to find lead structures for the

development of non-nitrated compounds of high potency against the aforementioned

parasite.

Figure 2. Two aryl-4-oxo-thiazolyl-hydrazones previously reported by our research group as potent anti-trypanosomal compounds.

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CARDOSO, M. V. O.


SO

R

R1

n

SN

R

R1

n

HN NH2

S

SN

R

R1

n

HN

N

S

O

R2

a)

b)

3a-j

X NNH

NH2

R

S

X NNH

N

S

R

O

a)

b)

1

23

4

5

Chemistry

Synthesis

Thiosemicarbazones belonging to series 1 and 2 (Scheme 1) possessing different lateral

chains were synthesized by traditional condensation of aldehydes or ketones with

thiosemicarbazide as described in reference [16], affording the crystalline products in

very good yields. After, to obtain the products 4 and 5, the corresponding aryl-

thiosemicarbazones were treated with α-bromocarboxylic acids, anhydrous sodium

acetate and ethanol in reflux temperature, achieving moderate to good yields of the

products. The chemical structure of this product was established using NMR (1H and 13C) and IR spectral. NOESY experiments and two-dimensional experiments such as

COSY and HMBC previously described by us have suggested the Z configuration for

the 4-thiazolidone derivatives.

Scheme 1. Synthesis of the N1-[phenylthio-(E)-ethylidene]tiosemicarbazides and aryl-4-oxo-thiazolyl-(Z)-hydrazones derivatives (3a-j). Reagents and conditions: a) thiosemicarbazide, H2O, AcOH, ultrasound irradiation, 30 min; b) α-chlorocarboxilic acids, AcONa, EtOH, reflux, 8 h.

2: R= R1=H R2= n=13a: R=Br R1=H R2=H n=13b: R=Cl R1=H R2=CH3 n=23c: R=H R1=H R2=CH3 n=13d: R=CH3 R1=CH3 R2=C2H5 n=13e: R=Cl R1=CH3 R2=C2H5 n=13f: R=CH3 R1=H R2=CH3 n=13g: R=H R1=CH3 R2=C2H5 n=13h: R=Cl R1=H R2=H n=13i: R=Br R1=H R2=C2H5 n=13j: R=H R1=H R2=CH3 n=24a: R=H X= HC=CH4b: R=H X= H2C-CH2

5a: R=H X= HC=CH

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CARDOSO, M. V. O.


Cytotoxicity and Anti-Trypanosoma cruzi activity

Cytotoxicity was evaluated in spleen culture cell lines and the values expressed

as the highest concentration tested that was not cytotoxic for the mammalian cells, and

then was used in subsequent assays to evaluate their anti-T. cruzi activity. All

compounds were assayed to determine the antiproliferative activity against the culture

of epimastigote (Y strain) and bloodstream form (Y strain trypomastigote) of T. cruzi.

Table 1 shows the percentage of inhibition at 40 M and the IC50 for compounds

synthesized. A subset of compounds was tested for time-dependent activity against

epimastigotes (Table 2). Bdz were used a reference drug and potency was compared

with those of the TCC inhibitors previously described in literature,[8a] 3’-

bromoacetophenonethiosemicarbazone and 3’,4’-

dichloroacetophenonethiosemicarbazone, named here as TCC-01 and TCC-02,

respectively (depicted in Figure 2).

Table 1. In vitro effects of compounds on the proliferation of T. cruzi Y strain and mammal cytotoxicity.

Compdepimastigotes

inhibition [%][a] IC50[b]

trypomastigotesIC50

[b] Cytotoxicity (g mL-1)[c]

2 NT[d] 13.4 158 5 (22 M)3a (1041) 31.5 42.9 0 > 1003b (1020) 10 32.1 NT > 1003c (1014) 4 166.9 44.2 > 1003d (1047) 40 45.1 76.9 > 1003e (1044) 24 62.9 148.1 > 1003f (1016) 97 6.7 84.8 > 1003g (1046) 41 40.8 54.6 > 1003h (1023) 8 43.9 82.4 > 1003i (1043) 77 26.9 nd > 1003j (1032) 100 2.91 10 > 1004a (1060) NT 7.30 7.40 < 1.04b (1074) NT 3.7 3.7 < 1.05 (1073) NT 2.3 10.1 < 1.0TCC-01 NT 15.4 11.1 1.0 (3.6 M)TCC-02 NT 8.5 39.5 1.0 (3.8M)

Bdz 97 6.6 5.0 ND[e]

[a] Percent growth inhibition determined for each compound at 40 M. [b] Calculated from seven concentrations using data obtained from at least three independent experiments.[c] Expressed as the highest concentration tested that was not cytotoxic for the Balbc mice splenocytes. [d] NT = not tested. [e] ND = not determined.

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CARDOSO, M. V. O.


Results and Discussion

The analysis of biological results allowed us to evidence that the most active

compounds were the derivatives 1016 and 1032, that were able to reduce remarkably the

parasite, in potency comparable with Bdz. For both compounds, efficacy against

trypomastigote was more remarkable when compared with the aryl-4-oxo-thiazolyl-

hydrazones previously described by us.

The thiosemicarbazones 2, 4a and 4b exhibited high activity when compared to

aryl-4-thiazolidone 3j, but thiosemicarbazones showed cytotoxicity at low doses,

indicating in this case the relevance of the thiocarbonyl moiety to make the unspecific

cytotoxicty for both parasitical and mammalian cells. This hypothesis could be

confirmed when compared the trypanocidal properties of thiosemicarbazones TCC-01

and TCC-02. Last ones were strong potent to inhibit the parasitic proliferation (with

IC50 in low micromolar levels), but also were very cytotoxic to splenocytes cells, and

thus, with selectivity index (SI) lower than <1.0.

Table 2. Time-dependent growth inhibition of the T. cruzi Y strain for compounds 3f, i and j.

[a] Percent growth inhibition determined for each compound at 40 µM.

The biological importance of aryl-4-oxo-thiazolyl-hydrazones containing ethyl

substituent in heterocyclic subunit was specially studied. The p-bromophenyl derivative

1043 exhibited good activity against the epimastigote, but was ineffective to inhibit the

trypomastigote. By comparison, the potency for the derivatives p-methylphenyl (1047)

and its corresponding p-chlorophenyl analogue (1044) gives a twofold decreased

against trypomastigote when compared with epimastigote. This profile is in agreement

with that observed for the non-substituted analogue (3i, figure 2) described previously

by us.

Compd.Inhibition [%]

Epimastigote [a]

15 h 7 days3f 85 973i 0 613j 75 100

Bdz 43 85

89

CARDOSO, M. V. O.


However, it is interesting to note that 1046, differ from molecule 1047 by having

an methyl attached to the imine group instead of an methyl at phenyl ring without loss

of activity against trypomastigote form of the T. cruzi, Also, for this compound,

inhibition of epimastigote replication was observed at 7 days of incubation, with IC50 =

21.9 M, presenting significative inhibition (57.2 % of at dose of 40 M) against

epimastigote when it was compared with Bdz (43.0 %).

Conclusions

New aryl-4-oxothiazolylhydrazones were synthesized using accessible

methodologies where returned to 13 new compounds. Some derivatives exhibited

significant in vitro activity against epimastigote T. cruzi, particularly the compounds 3f

and 3j, which showed antichagasic activity comparable with the standard drug used

actually, the Benznidazole. Most of the compounds showed antichagasic activity in non-

cytotoxic concentrations to mammalian cells, with the exception of compounds 2, 4a, 4b

and 5, were showed cytotoxicity in mammalian cells at low concentrations.

Experimental Section:

Chemistry

All common laboratory chemicals were purchased from commercial sources and used

without further purification. Melting points were determined using a Thomas Hoover

apparatus and are uncorrected. IR spectra were obtained using KBr pellets. 1H-NMR and13C-NMR spectra were measured on a Varian UNITYplus-300 NMR spectrometer (at 300

MHz for 1H and 75.5 MHz for 13C) using [D6]DMSO as solvent and TMS as an internal

standard. Elemental analyses were performed on a PE-2400 instrumental for C, N, H and

the results were in acceptable range (within ±0.4%). Thin-layer chromatography (TLC)

was carried out on silica gel plates with a fluorescence indicator of F254 (0.2 mm, E.

Merck); the spots were visualised in UV light. Column chromatography was performed on

silica using Kiesegel 60 (230-400 Mesh, E. Merck). All reagents used in the present study

were of analytical grade.

90

CARDOSO, M. V. O.


Starting materials

The phenylthioacetaldehydes diethyl acetal were prepared according to ref A, and

subsequently deprotected to form the respective aldehydes using the procedure

described in ref [B]. Then, the preparation of intermediates 2 were achieved according

to reported procedure [C] except with a reaction time of 40 min. instead of 20 min.

Purification was carried out by recrystallization with water\ethanol (1:1).

Syntheses:

General procedure for preparation of products 3a-j: The respective intermediate 2 (1.0

g, 4.3 mmol) was diluted with EtOH (20 mL) and anhydrous AcONa (0.7 g, 8.5 mmol)

was added and the mixture stirred for 15 min, then -bromobutyric acid (0.62g, 5.0

mmol) was added and the reaction stirred at reflux for 4 h, then ice was added (15 g)

and the precipitate formed was filtered and washed with 0.1 M KHSO4, brine and water,

to obtain pure respective 3(a-j).

Yield, melting point, recrystallization solvent, IR and NMR spectroscopic data and

analytical results are listed for each of the following compounds:

N1-[phenylthio-(E)-ethylidene]thiosemicarbazide (2): 90% yield, mp 116-17 ºC (from

water); Rf = 0.4 (ethyl acetate); 1H-NMR ([D6]DMSO, 300 MHz) 3.78 (d, J = 2.5

Hz, 2H, CH2S); 7.21 (t, J = 2.5 Hz, 1H, CH=N); 7.28 – 7.39 (m, 4H, Ar); 7.56 (s, 1H,

NH2); 8.10 (s, 1H, NH2); 11.20 (s, 1H, NH); The 7.56, 8.10 and 11.20 disappear after

adding D2O; 13C-NMR ([D6]DMSO, 300 MHz ): 33.51 (CH2S); 126.06; 128.37;

129.05; 134.57; 141.51(CH=N); 177.84 (C=S). IR (KBr, cm-1) ν =3392 (NH2). 3248

(NH); 1596 (C=N), 1531 (C=C); 1284 (C=S). anal. calcd for C9H11N3S2: C 47.97, H

4.92, N 18.65; found: C 49.76, H 4.81, N 17.98.

2-[(p-bromophenylthio-(Z)-ethylidene)hydrazone]-1,3-thiazol-4(5H)-one (3a):

2-[(p-chlorophenylthio-(Z)-3-propylidene)hydrazone]-5-methyl-1,3-thiazol-4(5H)-one

(3b):

2-[(phenylthio-(Z)-ethylidene)hydrazone]-5-methyl-1,3-thiazol-4(5H)-one (3c): 14%

yield, mp 135-6 ºC (from water); 1H-NMR ([D6]DMSO, 300 MHz) 1.63 (d, 3H,

CH3), 3.80(d, 2H, CH2), 4.00(m, 1H, CH), 7.38 (m, 5H, aromatic), 8.03 (t, 1H, CH). IR

(KBr, cm-1) ν = 2990 (NH); 1640 (C=N), 1725 (C=O); 1610 (C=N, het.).

91

CARDOSO, M. V. O.


2-[(p-methylphenylthio-(Z)-2-propylidene)hydrazone]-5-ethyl-1,3-thiazol-4(5H)-one

(3d ): 19% yield, mp 95-7 ºC (from water); 1H-NMR ([D6]DMSO, 300 MHz) 0.70 (t,

3H, CH3), 1.80 (m, 2H, CH2), 2.03 (s, 3H, CH3), 2.20 (s, 3H, CH3), 3.13 (m, 1H, CH),

3.56 (s, 2H, CH2), 7.06 (m, 4H, aromatic). IR (KBr, cm-1) ν = 3030 (NH), 1725 (C=O),

1630 (C=N), 1580 (C=N, het.).

2-[(p-methylphenylthio-(Z)-2-propylidene)hydrazone]-5-ethyl-1,3-thiazol-4(5H)-one

(3d ): 19% yield, mp 95-7 ºC (from water); 1H-NMR ([D6]DMSO, 300 MHz) δ 0.70 (t,

3H, CH3), 1.80 (m, 2H, CH2), 2.03 (s, 3H, CH3), 2.20 (s, 3H, CH3), 3.13 (m, 1H, CH),

3.56 (s, 2H, CH2), 7.06 (m, 4H, aromatic). IR (KBr, cm-1) ν = 3030 (NH), 1725 (C=O),

1630 (C=N), 1580 (C=N, het.).

2-[(p-chlorophenylthio-(Z)-2-propylidene)hydrazone]-5-ethyl-1,3-thiazol-4(5H)-one

(3e): 50% yield, mp 140-2 ºC (from water); 1H-NMR ([D6]DMSO, 300 MHz) δ 0.83 (t,

3H, CH3), 1.09 (s, 3H, CH3), 2.03 (m, 2H, CH2), 3.76 (s, 2H, CH2), 4.00 (m, 1H, CH),

7.30 (m,4H, aromatic). IR (KBr, cm-1) ν = 3050 (NH), 1725 (C=O), 1630 (C=N), 1590

(C=N, het.).

2-[(p-methylphenylthio-(Z)-ethylidene)hydrazone]-5-methyl-1,3-thiazol-4(5H)-one (3f):

62% yield, mp 130-1 ºC (from water); 1H-NMR ([D6]DMSO, 300 MHz) δ 1.51 (d, 3H,

CH3), 2.30 (s, 3H, CH3), 3.82 (d, 2H, CH2),4.24 (m, 1H, CH),7.30 (m, 4H,

aromatic),7.71 (t, 1H, CH). IR (KBr, cm-1) ν = 3100 (NH), 1750 (C=O), 1670 (C=N),

1630 (C=N, het.).

2-[(phenylthio-(Z)-2-propylidene)hydrazone]-5-ethyl-1,3-thiazol-4(5H)-one (3g): 61%

yield, mp 140-1 ºC (from water); 1H-NMR ([D6]DMSO, 300 MHz) δ 0.93 (t, 3H, CH3),

2.03 (s, 3H, CH3), 2.53 (m, 2H, CH2), 3.43 (m, 1H, CH), 3.93 (s, 2H, CH2), 7.56 (m,

5H, aromatic). IR (KBr, cm-1) ν = 3030 (NH), 1720 (C=O), 1630 (C=N), 1580 (C=N,

het.).

2-[(p-chlorophenylthio-(Z)-ethylidene)hydrazone]-1,3-thiazol-4(5H)-one (3h): 43%

yield, mp 148-9 ºC (from water); 1H-NMR ([D6]DMSO, 300 MHz) δ 1.90 (s, 3H, CH3),

3.70 (s, 2H, CH2), 3.76 (s, 2H, CH2), 7.30 (m, 4H, aromatic). IR (KBr, cm-1) ν = 2990

(NH), 1710 (C=O), 1640 (C=N), 1600 (C=N, het.).

2-[(p-bromophenylthio-(Z)-ethylidene)hydrazone]-5-ethyl-1,3-thiazol-4(5H)-one (3i):

58% yield, mp 165-7 ºC (from water); 1H-NMR ([D6]DMSO, 300 MHz) δ 0.78 (t, 3H,

CH3), 1.75 (m, 2H, CH2), 3.40 (m, 1H, CH), 3.50 (m, 2H, CH2), 7.45 (m, 4H, aromatic),

92

CARDOSO, M. V. O.


7.60 (t, 1H, CH). IR (KBr, cm-1) ν = 3020 (NH), 1710 (C=O), 1645 (C=N), 1610 (C=N,

het.).

2-[(phenylthio-(Z)-3-butylidene)hydrazone]-1,3-thiazol-4(5H)-one (3j): 44% yield, mp

130-1 ºC (from water); 1H-NMR ([D6]DMSO, 300 MHz) δ 1.55 (d, 3H, CH3), 2.51 (m,

2H, CH2), 3.21 (t, 2H, CH2), 4.20 (m, 1H, CH), 7.40 (m, 5H, aromatic), 7.81 (t, 1H,

CH). IR (KBr, cm-1) ν = 3170 (NH), 1730 (C=O), 1640 (C=N), 1600 (C=N, het.).

N1-[3-phenyl-2(E)-propylidene]tiosemicarbazide (4a): 85% yield, mp 136 ºC (from

water); 1H-NMR ([D6]DMSO, 300 MHz) 6.72 - 6.95 (m, 1H, CH); 6.91 (d, J = 10

Hz, 1H, CH); 7.48 – 7.59 (m, 3H, Ar); 7.56 - 7.73 (d, 2H, Ar); 7.60 (s, 1H, NH2); 7.90

(d, J = 7.0 Hz, 1H, CH=N); 13C-NMR ([D6]DMSO, 75.5 MHz): 40.34 (CH3) 129.01;

131.98; 133.04; 134.91; 138.02; 143.06 (CH=N); 176.00 (C=S). IR (KBr, cm-1) ν 3409

(NH2); 1597 (C=N); 1283 (C=S); anal. calcd for C11H13N3S: C 60.25% H 5.97% N

19.16; found: C 60.60, H 5.81, N 19.38.

2-[(phenyl (Z)-butylidene)hydrazone]1,3-thiazol-4(5H)-one (4b):

N1-[(3-phenyl-2(E)-propylidene)hydrazone]-1,3-thiazol-4(5H)-one (5): 90% yield, mp

116-17 ºC (from water); 1H-NMR ([D6]DMSO, 300 MHz) 3.78 (d, J = 2.5 Hz, 2H,

CH2S); 7.21 (t, J = 2.5 Hz, 1H, CH=N); 7.28 – 7.39 (m, 4H, Ar); 7.56 (s, 1H, NH2);

8.10 (s, 1H, NH2); 11.20 (s, 1H, NH); The 7.56, 8.10 and 11.20 disappear after adding

D2O; 13C-NMR ([D6]DMSO, 300 MHz ): 33.51 (CH2S); 126.06; 128.37; 129.05;

134.57; 141.51(CH=N); 177.84 (C=S). IR (KBr, cm-1) ν =3392 (NH2). 3248 (NH); 1596

(C=N), 1531 (C=C); 1284 (C=S). anal. calcd for C9H11N3S2: C 47.97, H 4.92, N 18.65;

found: C 49.76, H 4.81, N 17.98.

93

CARDOSO, M. V. O.


In vitro cytotoxicity Assays.: The cytotoxicity of the compounds was determined using

BALB/c mice splenocytes (5x106 cells.well-1) cultured in 96-well plates in Dulbecco’s

Modified Eagle’s Medium (DMEM, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)

supplemented with 10 % of fetal calf serum (FCS; Cultilab, Campinas, SP, Brazil) and

50 µg mL-1 of gentamycin (Novafarma, Anápolis, GO, Brazil). Each compound was

evaluated in three concentrations (1, 10 and 100 μg mL-1), in triplicate. Considering an

averaged molecular weight of 300 g mol-1, these concentrations correspond to 325, 32.5

and 3.25 M, respectively. Cultures were incubated in the presence of 3H-thymidine (1

μCi well-1) for 24 h at 37º C and 5% CO2. After this period, the content of the plate was

harvested to determine the 3H-thymidine incorporation using a beta-radiation counter

(β-matrix 9600, Packard). The toxicity of the compounds was determined comparing the

percentage of 3H-thymidine incorporation (as indicator of cell viability) of drug-treated

wells in relation to untreated wells. Non-cytotoxic concentrations were defined as those

causing a reduction of 3H-thymidine incorporation below 10% in relation to untreated

controls.

In vitro antiproliferative activity: Epimastigotes of T. cruzi (Y strain) were cultivated

at 26 °C in Liver Infusion Tryptose medium (LIT) supplemented with 10% fetal calf

serum, 1% hemin, 1% R9 medium and 50 µg mL-1 gentamycin. Parasites (106 cells mL-

1) were cultured in a fresh medium in the absence or in the presence of the compounds

being tested (from stock solution in DMSO). Cell growth was determined after 15 h, 7

and 11 days of culture by counting viable forms in a hemacytometer. The compounds

were prepared from a stock solution in DMSO. To determine the IC50, cultures of Y

strain epimastigotes in the presence of different concentrations of the compounds were

evaluated after 11 days as described above. IC50 calculation was carried out using non-

linear regression on Prism 4.0 GraphPad software. Y strain T. cruzi trypomastigotes

were obtained from culture supernatants of LCC-MK2 cell line at 37º C and placed in

96-well plates (4x105well-1) in DMEM medium supplemented with 10% FCS and 50 µg

mL-1 gentamycin. Compounds were added at non-cytotoxic concentrations, in triplicate.

Viable parasites were counted in a hemacytometer 24 hours after addition of compounds

by way of trypan blue exclusion. The percentage of inhibition was calculated in relation

to untreated cultures. The same procedure was performed for Bdz (reference drug) and

vehicle alone, DMSO as blank.

94

CARDOSO, M. V. O.


ACKNOWLEDGEMENTS

This work is supported by grants from the Brazilian National Research Council (CNPq)

and Oswaldo Cruz Foundation (FIOCRUZ). D.R.M.M is supported by CAPES, B.G.O

by a CAPES-PRODOC (PhD) and MVOC by CNPq fellowship. Our thanks are also to

the Department of Chemistry at the UFPE, for recording the NMR and IR spectra and

elemental analyses of all compounds.

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95

CARDOSO, M. V. O.


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96

CARDOSO, M. V. O.


7 CONCLUSÕES

Capítulo 1

Sintetizaram-se derivados acilhidrazínicos, aril-4-oxotiazolilhidrazínicos e

aciltiazolidinônicos onde apresentaram rendimentos razoáveis;

O aumento da distância entre o heterociclo e o anel aromático aumentou a

potencialidade dos compostos, como observado entre o composto 6f para o 6i, onde o 6i

apresenta maior potência;

A substituição do halogeneto bromo, na posição para, pelo cloro, visto nos

compostos 6a e 6e, duplicou a potência do composto;

O composto 6i mostrou uma boa atividade antichagásica, sendo esta comparável

com a droga de referência, o Benznidazol;

Testes de “docking” revelam que o composto 6f se apresenta mais potente do

que as drogas utilizadas na enfermidade da doença de Chagas, o Benznidazol e o

Nifurtimox.

Prévios resultados de REA mostram que alquilação em N-1 ou ciclização para a

formação do anel 2-pirazolina-1-tiocarboxamida, nas ariltiossemicarbazonas, mostram

ser benéficas para a atividade antichagásica;

A formação do anel 4-tiazolinona, A partir da ciclização do grupo tioamida

amina, aumentou a atividade antichagásica dos compostos.

NS

HN

N

S

O

NS

HN

N

S

O

NS

Cl

HN

N

S

O

NS

Br

HN

N

S

O

6f 6i

6a 6e

97

CARDOSO, M. V. O.


Capítulo 2

Foram obtidos 13 novos compostos utilizando metodologias acessíveis, onde

alguns compostos exibiram significante atividade antichagásica in vitro frente à forma

epimastigota, principalmente os compostos 3j e 3f;

No contesto geral, observou-se que a substituição na posição para do anel

aromático encontrado nos compostos obtidos não melhorou a atividade antichagásica

sendo que, nos compostos em que houve a substituição, os compostos substituídos com

uma metila foram mais potentes do que os substituídos por bromo e cloro,

respectivamente.

O aumento da cadeia carbônica principal em um carbono, observado no

composto 3j em relação ao 3c, aumentou significantemente a potência inibitória à forma

epimastigota do parasito e também aumentou razoavelmente a potência frente à forma

tripomastigota do T. cruzi.

A adição de uma etila na posição 5 do anel tiazolinona aumentou imodicamente

a atividade frente a forma epimastigota do parasito, como visto na comparação entre os

compostos 3a e 3i;

SN

NH

N

S

ONNH

N

S

OS

SN

NH

N

S

ON

NH

N

S

OS

SN

NH

N

S

O

Br

SN

NH

N

S

O

Br

3f 3j

3j 3c

3a 3i

98

CARDOSO, M. V. O.


8 PERSPECTIVAS

Capítulo 1

Dando continuidade à síntese de aril-4-oxotiazolilhidrazonas desenvolvidas

tanto no artigo 1 como no artigo 2, que já demonstraram atividade anti-T. cruzi, estamos

desenvolvendo a síntese de novos aldeídos derivados do fenol, com o objetivo de obter

modernas aril-4-oxotiazolilhidrazonas, diferenciando das oriundas do artigo descrito no

capítulo 1, onde serão obtidas a partir de novos aldeídos derivados do fenol, já que as

descritas no capítulo 1 foram originárias de aldeídos derivados do tiofenol, com isso,

pretendemos obter uma nova série de aril-4-oxotiazolilhidrazonas -derivadas do fenol-

com potencial atividade anti-T. cruzi.

X()n R'

R1

O

X()n N

R1

R'

HN

X

NH2 X()n N

R1

R'

HN

N

S

O

R2

X()n N

R1

R'

N

N

S

O

R2

R4

X()n N

R1

R'

N

O

NH

R3

1

2 3

5

A

B

C D

R4

4

R1= Cl, Br, F, CF3, NO2, NH2, CH3, OCH3, O-Fenil, t-butil, SO2Cl;R'= H, CH2CH3, Fenil, t-butil;R2= H, CH2CH3, Fenil;R3= H, n-butil, n-pentil;R4= H, n-butil, n-pentil;X= S, O;N= 0, 1, 2.

Esquema 12: Proposta de síntese para obtenção de novos derivados das tiossemicarbazonas, semicarbazonas e 4-tiazolinonas, planejadas como novos inibidores da TCC.

99

CARDOSO, M. V. O.


Capítulo 2

Caracterização por RMN-13C e conclusão dos estudos de “docking” na cruzaína do T.

cruzi dos compostos obtidos;

Realização de atividade antichagásica in vivo dos compostos obtidos.

100

CARDOSO, M. V. O.


9 ANEXOS

TRABALHOS PUBLICADOS DURANTE A GRADUAÇÃO

E MESTRADO

ARTIGOS CIENTÍFICOS

1. LEITE, A. C. L.; CARDOSO, M. V. O.; HERNANDES, M. Z.; MOREIRA, D. R. M.; PEREIRA, v.; SOARES, M. B. P. Synthesis, Cruzain Docking and in vitro Studies of Aryl-4-Oxo-Thiazolyl-Hydrazone Against Trypanosoma cruzi. ChemMedChem, v. 2, p. 1-8, 2007.

2. LEITE, A. C. L.; BRITO, A. C. G.; CARDOSO, M. V. O.; HERNANDES, M. Z.; LIMA, R. S.; MOREIRA, D. R. M.; SOARES, M. B. P. Design, synthesis andbiological evaluation of new acyl-hidrazones and Thiazolinones derivatives as anti-Trypanosoma cruzi agents. Bioorganic & Medicinal Chemistry. v. 14, p. 3749-3757, 2006.

3. LEITE, A. C. L.; CARDOSO, M. V. O.; FERNANDES, F. B.; LIMA, R. S.; MOREIRA, D. R. M.; SANTOS, L. M. F.; SOUZA, I. A. Synthesis of aminoacyl thiazolidones as potential antitumour agents. Biomedicine & Pharmacotherapy. v.60, p. 121-126, 2006.

TRABALHOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSOS

1. Synthesis, Antiinflammatory and low Cytotoxicity Activity of New N-Phthalimide Carboxilic Acids Derivatives. In: 3° Simpósio Brasileiro em Química Medicinal, 2006, São Pedro. 3° Simpósio Brasileiro em Química Medicinal.

2. Aryl-Hydrazino-4-thiazolidones Derivatives: A new Family of Trypanocidal Agents with Low Cytotoxicity. In: 3° Simpósio Brasileiro em Química Medicinal, 2006, São Pedro. 3° Simpósio Brasileiro em Química Medicinal.

101

CARDOSO, M. V. O.


3. Trypanocidal Agents With Low Cytotoxicity to Mammalian Cells: The 4-Thiazolidones Derivatives. In: 3º Simpósio Brasileiro em Química Medicinal, 2006, São Pedro. 3º Simpósio Brasileiro em Química Medicinal.

4. Synthesis, Antiinflammatory and Low Cytotoxicity Activity of New N-Phthalimide Carboxilic Acids Derivatives. In: 3° Simpósio Brasileiro em Química Medicinal, 2006, São Pedro. 3° Simpósio Brasileiro em Química Medicinal.

5. Avaliação da atividade Genotóxica do 1,2,4-oxadiazol e seus derivados peptídeomiméticos pelo SOS Cromoteste. In: Congresso Brasileiro de Carcinogênese e Teratogênese, 2005, Natal. VII Congresso Brasileiro de Carcinogênese e Teratogênese, 2005.

6. Avaliação da atividade antitumoral e toxicidade aguda de derivados da hidroquinona. In: Congresso Brasileiro de Carcinogênese e Teratogênese, 2005, Natal. VII Congresso Brasileiro de Carcinogênese e Teratogênese, 2005.

7. Contribuição do grupo nitro para a atividade anti-Trypanosoma cruzi de derivados. In: 28ª Reunião anual da Sociedade Brasileira de Química, 2005, Poços de Caldas. 28ª Reunião anual da Sociedade Brasileira de Química, 2005.

8. Síntese de Novos derivados 6-nitro-benzodioxolo-N-hidrazônico com potencial anti-Trypanosoma cruzi. In: 28ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2005, Poços de Caldas. 28ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2005.

9. derivados da Tiossemicarbazida e Tiazolinona com atividade Tripanomicida. In: Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2005, Poços de Caldas. 28ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2005.

10. Desenho Molecular e síntese e caracterização de aminoacil derivados da hidroquinona. In: XLIV Congresso Brasileiro de Química - CBQ, 2004, Fortaleza. Anais do XLIV Congresso Brasileiro de Química - CBQ, 2004.

102

CARDOSO, M. V. O.


11. Síntese do derivado da Primina a partir da hidroquinona In: XLIV Congresso Brasileiro de Química - CBQ, 2004, Fortaleza. Anais do XLIV Congresso Brasileiro de Química - CBQ, 2004.

12. Obtenção de peptidil derivados da Ftalimida. In: XLIV Congresso Brasileiro de Química, 2004. Anais do XLIV Congresso Brasileiro de Química, 2004.

13. Síntese e atividade antimicrobiana de derivados pseudopeptídicos da sulfanilamida.

In: XLIV Congresso Brasileiro de Química - CBQ, 2004, Fortaleza. Anais do

XLIV Congresso Brasileiro de Química - CBQ, 2004.

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