SIMPOZIJUM BEZBEDNOST I KVALITET NAMIRNICA …katedre.vet.bg.ac.rs/~namirnice/002...

FAKULTET VETERINARSKI MEDICINE

UNIVERZITET UBEOGRADU

KATEDRA ZA HIGIJENU I TEHNOLOGIJU NAMIRNICA ANIMALNOG

POREKLA

4.

SIMPOZIJUM

BEZBEDNOST I KVALITET NAMIRNICA

ANIMALNOG POREKLA

ZBORNIK RADOVA

Beograd , 6. i 7. novembar 2014.

4. SIMPOZIJUM- BEZBEDNOST NAMIRNICA ANIMALNOG POREKLA

Zbornik radova

Organizatori

Fakultet veterinarske medicine Univerzitet u Beogradu

Katedra za higijenu i tehnologiju namirnica animalnog porekla

Predsednik

Prof. dr Milan Ž. Baltić

Organizacioni odbor

Prof. dr Vera Katić, prof. dr Milan Ž. Baltić, pro.f dr Vlado Teodorović,

prof. dr Neđeljko Karabasil, prof. dr Snežana Bulajić, prof. dr

Mirjana Dimitrijević, doc. dr Dragan Vasilev, mr Radoslva Savić-

Radovanović i mr Silvana Stajković

Naučni odbor

Prof. dr Vera Katić, prof. dr Milan Ž. Baltić, prof. dr Vlado Teodorović

prof. dr Dragan Šefer

Sekretar

Doc. dr Dragan Vasilev

Urednik

Prof. dr Milan Ž. Baltić

Izdavač

Fakultet veterinarske medicine

Kompjuterska obrada

dr Jelena Ivanović

Štampa

“Naučna” Beograd

Tiraž

200 primeraka

PROGRAM

Mesto održavanja Simpozijuma: Fakultet veterinarske medicine u

Beogradu- Amfiteatar Katedre za higijenu i tehnologiju namirnica

11000 Beograd

Ul Bulevar Oslobođenja 18

Četvrtak, 6.11. 2014

Radno predsedništvo: prof. dr Milan Ž. Baltić, prof. dr Vera Katić

930 -1000 Otvaranje simpozijuma, Sedamdeset pet godina od osnivanja

katedre za higijenu i tehnologiju namirnica animalnog porekla,

fakulteta veterinarske medicine

Milan Ž. Baltić, Vera Katić

1000-1030 Hrana izvor zaražavanja u epidemijama salmoneloza

istraživanje jačine dokaza

Nevenka Pavlović, Slavica Maris , Branislava Zlatar, Danka Purtić-Kljajić

1030-1115 Salmonella INFANTIS u lancu proizvodnje mesa živine

Karabasil Neđeljko, Nataša Galić, Jelena Petković, Jelena Krasić, Jelena

Petrović, Mirjana Dimitrijević, Nataša Kilibarda

1115-1130 Diskusija

1130-1145 Pauza

1145-1215 Mikotoksini-hazard u lancu ishrane

Šefer D, Radulović S, Petrujkić B, Marković Radmila, Milka Popović

1215-1245 Monitoring aflatoksina M1 u mleku u republici Srbiji

Vera Katić

1245-1315 Analitičke metode za određivanje aflatoksina u hrani i hrani

za životinje

S. Stefanović, Jelena Nedeljković Trailović, Vera Katić, D. Milićević, S.

Janković, Tatjana Radičević, Mirjana Dimitrijević

1315-1345 Prezentacija sponzora- Superlab- Demostracija screening

metoda za dokazivanje aflatoksina M1 u mleku

1345-1415 Diskusija

1415-1445 Pauza

1445-1745 Radionica- Da li i koliko razumemo deklaraciju i kako je

predstaviti?

Snežana Bulajić, Dragan Vasilev

7.11. 2014.

Radno predsedništvo: prof. dr Mirjana Dimitrijević, prof. dr

Neđeljko Karabasil

900-930 Osnovne karakteristike savremenih materijala za pakovanje

namirnica i opreme za njihovu aplikaciju

M. Milijašević, Jelena Babić

930-1000 Značaj i upotreba nanopakovanja u industriji hrane

Mirjana Dimitrijević, Marija Bošković, M. Baltić, N. Karabasil, V.

Teodorović, D. Vasilev, Vera Katić

1000-1015 Novi pogledi na nalaz Yersinia enterocolitica u mesu svinja-

preživljavanje u modifikovanoj atmosferi i vakuum pakovanju

Jelena Ivanović, Milan Ž. Baltić, Jelena Janjić, Marija Bošković, Marija

Dokmanović, Tatjana Baltić, Vesna Đorđević

1015-1030 Ispitivanje uticaja pakovanja mlevenog mesa u

modifikovanoj atmosferi na rast Salmonella spp.

Jasna Đorđević, Marija Bošković, Marija Dokmanović, Nataša Glamočlija,

Vesna Đorđević, Jelena Petrović, Milan Ž. Baltić

1030-1045 Diskusija

1045-1100 Pauza

1100-1130 Karakterizacija kvaliteta meda i drugih pčelinjih proizvoda u

cilju stvaranja prepoznatljivog brenda na tržištu

Nebojša Nedić, Milan Baltić, Kazimir Matović, Živoslav Tešić, Dušanka

Milojković-Opsenica

1130-1200 Primena molekularnih tehnika dijagnostike u mikrobiološkoj

analizi uzoraka meda

Kazimir Matović, Milan Baltić, Dušan Mišić, Nebojša Nedić, Neđeljko

Karbasil, Lazar Ranin, Jelena Ivanović

1200-1230 Diskusija

SADRŽAJ

Referati

1. SEDAMDESET PET GODINA OD OSNIVANJA KATEDRE ZA

HIGIJENU I TEHNOLOGIJU NAMIRNICA ANIMALNOG POREKLA,

FAKULTETA VETERINARSKE MEDICINE

Milan Ž. Baltić, Vera Katić 1

2. SALMONELLA INFANTIS U LANCU PROIZVODNJE MESA ŽIVINE

Karabasil Neđeljko, Nataša Galić, Jelena Petković, Jelena Krasić,

Jelena Petrović, Mirjana Dimitrijević, Nataša Kilibarda 4

3. HRANA IZVOR ZARAŽAVANJA U EPIDEMIJAMA SALMONELOZA –

ISTRAŽIVANJE JAČINE DOKAZA

Nevenka Pavlović, Slavica Maris, Branislava Zlatar, Danka Purtić-

Kljajić 6

4. MIKOTOKSINI-HAZARD U LANCU ISHRANE

Šefer D, Radulović S, Petrujkić B, Marković Radmila, Milka Popović 19

5. MONITORING AFLATOKSINA M1 U MLEKU U REPUBLICI SRBIJI

Vera Katić 31

6. ANALITIČKE METODE ZA ODREĐIVANJE AFLATOKSINA U HRANI I

HRANI ZA ŽIVOTINJE

S. Stefanović, Jelena Nedeljković Trailović, Vera Katić, D. Milićević, S.

Janković, Tatjana Radičević, Mirjana Dimitrijević 51

7. OSNOVNE KARAKTERISTIKE SAVREMENIH MATERIJALA ZA

PAKOVANJE NAMIRNICA I OPREME ZA NJIHOVU APLIKACIJU

M. Milijašević, Jelena Babić 66

8. ZNAČAJ I UPOTREBA NANOPAKOVANJA U INDUSTRIJI HRANE

Mirjana Dimitrijević, Marija Bošković, M. Baltić, N. Karabasil, V.

Teodorović, D. Vasilev, Vera Katić 81

9. NOVI POGLEDI NA NALAZ YERSINIA ENTEROCOLITICA U MESU

SVINJA- PREŽIVLJAVANJE U MODIFIKOVANOJ ATMOSFERI I

VAKUUM PAKOVANJU

Jelena Ivanović, Milan Ž. Baltić, Jelena Janjić, Marija Bošković, Marija

Dokmanović, Tatjana Baltić, Vesna Đorđević 83

10. KARAKTERIZACIJA KVALITETA MEDA I DRUGIH PČELINJIH

PROIZVODA U CILJU STVARANJA PREPOZNATLJIVOG BRENDA NA

TRŽIŠTU

Nebojša Nedić, Milan Baltić, Kazimir Matović, Živoslav Tešić, Dušanka

Milojković-Opsenica 91

11. PRIMENA MOLEKULARNIH TEHNIKA DIJAGNOSTIKE U

MIKROBIOLOŠKOJ ANALIZI UZORAKA MEDA

Kazimir Matović, Milan Baltić, Dušan Mišić, Nebojša Nedić, Neđeljko

Karbasil, Lazar Ranin, Jelena Ivanović 96

Posteri

1. ISPITIVANJE UTICAJA PAKOVANJA MLEVENOG MESA

U MODIFIKOVANOJ ATMOSFERI NA RAST Salmonella spp.

Jasna Đorđević Marija Bošković, Marija Dokmanović, Nataša

Glamočlija, Vesna Đorđević, Jelena Petrović, Milan Ž. Baltić 110

4. Simpozijum – Bezbednost i kvalitet namirnica animalnog porekla

1

1. SEDAMDESET PET GODINA OD OSNIVANJA KATEDRE ZA

HIGIJENU I TEHNOLOGIJU NAMIRNICA ANIMALNOG POREKLA,

FAKULTETA VETERINARSKE MEDICINE

Milan Ž. Baltić1*, Vera Katić

*

*Fakultet veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu

Zaključak srpskih veterinara donet na Solunskom frontu (31.05.-01.06. 1918.

godine, Vodena, Grčka) da se po oslobođenju zemlje osnuje Visoka veterinarska škola

(fakultet) u Beogradu realizovan je 1936. godine, posle brojnih polemika i podenjenih

mišljenja unutar Jugoslovenskog veterinarskog udruženja i veterinarske službe. Naime,

u Kraljevini Jugoslaviji je već 1919. godine osnovana Visoka veterinarska škola (od

1924. godine Veterinarski fakultet) u Zagrebu, pa je godinama osporavana potreba još

jednog Veterinarskog fakulteta u Kraljevini Jugoslaviji. Konačno, Ministarstvo

prosvete je avgusta 1936. godine donelo uredbu o osnivanju Veterinarskog fakulteta u

Beogradu. Iste godine u prvu godinu studija upisano je 149 studenata.

Uredbom o osnivanju Veterinarskog fakulteta predviđenjo je da se nastava

izvodi u okviru 17 katedara. Jedna od tih katedri bila je i Katedra za higijenu animalnih

proizvoda za ljudsku hranu (higijena mesa i mesnih proizvoda, pregledi živine,

divljači, riba, rakova i školjki, higijena mleka i mesnih proizvoda, nadzor životnih

namirnica biljnog i drugog porekla, hemija životnih namirnica). Nastavnim planom

(prvi nastavni plan studija) Katedra je bila zadužena za izvođenje nastave iz četiri

nastavna predmeta (Higijena mleka i mlečnih proizvoda (VII semestar 2+2), Tržni

nadzor namirnica za život biljnog i drugog porekla (VIII semestar 4+2), Higijena mesa

i mesnih proizvoda (IX semestar 3+2, X semestar 3+2) i Hemija životnih namirnica

(Vsemestar, 3+2).

Naučno-istraživački i stručni rad obavljao se u okviru naučnih instituta i klinika (14

instituta i četiri klinike). Jedan od instituta bio je Institut za higijenu animalnih

1 Autor za kontakt: [email protected]

mailto:[email protected]


2

proizvoda za ljudsku hranu. Institut je počeo sa radom 21, januara 1939. godine, a

odluka o osnivanju Instituta doneta je na sednici Saveta koja je održana sredinom

decembra 1938. godine. Na istoj sednici Saveta za upravnika Instituta izabran je

docent dr Đuro Filipović, koji je bio zadužen za nastavu iz predmeta Higijene mleka i

mlečnih proizvoda i predmeta Tržni nadzor namirnica za život biljnog i drugog

porekla. Prvi nastavnici za nastavu iz predmeta Higijena mesa i mesnih proizvoda bili

su prof. dr hc Antonije Vuković i doc. dr Milivoj Čoporda

Najveći deo nastavnih aktivnosti bio je prekinut sa početkom Drugog svetskog

rata, a posle oslobođenja Fakultet je prolazio kroz različite oblike organizovanja,

odnosno objedinjavanja nastavnog procesa, naučnog i stručnog rada. Posle

reorganizacije Fakulteta koja je usledila 1997. godine objedinjene su Katedra za

higijenu i tehnologiju mesa i Katedra za higijenu i tehnologiju mleka u jednu Katedru

(Katedra za higijenu i tehnočlogiju namirnica animalnog porekla).

Katedra za higijenu i tehnologiju mesa danas je zadužena za organizovanje i

izvođenje nastave na osnovnim studijama, nastave na specijalističkim akademskim

studijama, nastave na užim specijalizacijama, kao i nastave na doktorskim studijama.

Naučno-istraživački rad Katedre za i tehnologiju namirnica animalnog porekla od

osnivanja, pa do danas bio je vezan za praktično sve oblasti higijene i tehnologije

namirnica. Taj rad je realizovan kroz istraživačke projekte koje je uglavnom finansirala

država (ministarstva), a rezultirao je izradom doktorskih disertacija, magistarskih teza i

objavljivanjem radova nastavnika i saradnika u časopisima i zbornicima. Na Katedri je

urađen i veći broj specijalističkih radova doktora veterinarske medicine koji su se

odnosili na praktične i strručne probleme.

Katedra je stalno imala uspešnu višegodišnju naučnu i stručnu saradnju sa

drugim naučnim ustanovama, fakultetima, odnosno institutima u zemlji i inostranstvu,

kao i veterinarskim asocijacijama u zemlji i inostranstvu. Nastavnici Katedre su

učestvovali i učestvuju u radu Rednih grupa Ministarstva za poljoprivredu i životnu

sredinu Republike Srbije koje su radile na pripremi zakonskih propisa ili razmatrale

aktuelne probleme iz oblasti bezbednosti hrane. Pored toga nastavnici Katedre aktivno


3

učestvuju u radu Komisija i stručnih tela na Univerzitetu, Ministarstvu za nauku i

tehnološki razvoj Republike Srbije i Akreditacionog tela Srbije.


4

2. SALMONELLA INFANTIS U LANCU PROIZVODNJE MESA ŽIVINE

Karabasil Neđeljko*1, Nataša Galić

**, Jelena Petković

***, Jelena Krasić

****, Jelena

Petrović*****

, Mirjana Dimitrijević*, Nataša Kilibarda

******

*Fakultet veterinarske medicine, Univerzitet u Beogradu,

**Institut za javno zdravlje

***Veterinarski specijalistički institut Jagodina,

****Naučni institut za veterinarstvo

Zrenjanin,*****

Naučni institut za veterinarstvo Zrenjanin ******

,Veterinarski

specijalistički institut Subotica

Salmonele su i dalje jedan od vodećih uzročnika alimentarnih trovanja. U većini

zemalja Evropske Unije, najčešći nalaz kod gastroenteritisa ljudi, čine S. Enteritidis i S.

Typhimurium. Od ostalih serotipoiva koji se relativno često spominju kao uzročnici

alimentarnih trovanja su: S. Agona, S. Hadar, S. Heidelberg, S. Infantis, S. Newport, S.

Panama, S. Saint-Paul, S. Thompson i S. Wirchow. Prema podacima iz Godišnjeg

izveštaja Instituta za zaštitu zdravlja Srbije „Dr Milan Jovanović Batut“ kod nas je

najzastupljenija S. Enteritidis, koja je u odnosu na ostale serotipove prisutna sa 80 %.

Ovi podaci nisu vezani samo za sojeve izolovane iz kliničkog/humanog materijala

nego i iz namirnica, radnih površina i dr. Ostali serotipovi imaju značajno manju

procentualnu zastupljenost. Na drugom mestu se nalazi S. Typhimurium, zatim slede S.

Infantis i S. Hadar, S. Stanleyville, S. Agona, S. Tompson, S. Virchow.

Poslednjih godina, beleži se veći procenat nalaza S. Infantis kod brojlera.

Kontaminacija salmonelom može biti iz više izvora: hrane, vode, roditeljskog jata,

ostalih životinja, okruženja, glodara, divljih ptica i dr. Prema fiziološkim i

metaboličkim osobinama salmonela, ovi organizmi nisu ograničeni na određeni habitat.

Većina serotipova je široko rasprostranjena i to omogućava transmisiju na čoveka,

biljke, životinje, površine. Salmonele mogu da prežive na različitim površinama kao

što su keramika, staklo, metal pa i na koži čoveka. Stanje u kojem se nalazi prostirka i

šuška (vlažna, suva i td.) može se smatrati indikatorom higijene i upravljanja na farmi.




5

Pregledom fecesa na farmama brojlera ovaj serotip je činio 48,6 % (18/37) od ukupnog

broja izolovanih salmonela u 2011. godini, dok je u 2012. 46,15 % (18/39) i u 2013.

35,2 % (25/71).

Ključne reči: brojleri, salmonela infatis, prevalenca


6

3. HRANA IZVOR ZARAŽAVANJA U EPIDEMIJAMA SALMONELOZA –

ISTRAŽIVANJE JAČINE DOKAZA

Nevenka Pavlović*, Slavica Maris

*1, Branislava Zlatar

*, Danka Purtić-Kljajić

*

*Gradski zavod za javno zdravlje Beograd

Salmonele su vodeći uzrok bakterijskog gastroenteritisa širom sveta. Procenjuje se

da je oko 55,0% slučajeva salmoneloza povezano sa trovanjem hranom. Oko 20-40%

svih obolelih od salmoneloze su oboleli u epidemijskom javljanju bolesti. Cilj ovog

rada bio je da se prikaže istraživanje jačine dokaza povezanosti hrane i zaražavanja

salmonelama u epidemijskom javljanju salmoneloza na teritoriji Beograda za period

2011-2013. godine. U radu je primenjen deskriptivni metod. Za ispitivanje jačine

dokaza povezanosti hrane kao izvora zaražavanja u epidemijskom javljanju

salmoneloza korišćeni su kriterijumi EFSA (European Food Safety Authority) i

Community Outbreak Reporting System (CORS). Kao izvor podataka poslužili su

Godišnji izveštaji o realizaciji Programa zaštite stanovništva od zaraznih bolesti

Gradskog zavoda za javno zdravlje Beograda i informacije o sprovedenim

epidemiološkim istraživanjima epidemija. U periodu 2011-2013.godine na području

Beograda ukupno je prijavljeno 112 alimentarnih epidemija, među kojima 80,4% (90)

epidemija salmoneloza. Od ukupnog broja epidemija salmoneloze 34,4% je bilo sa

čvrstim dokazima i 65,6% sa slabim dokazima hrane kao puta prenosa infekcije. U

54,4% svih otkrivenih epidemija salmoneloze nije utvrđena namirnica koja je poslužila

kao put prenosa uzročnika bolesti. Najčešće dokazane namirnice bile su torte i kolači

(22,2%), jaja (8,9%) i pečena piletina (4,4%). U epidemijama sa čvrstim dokazima

povezanosti sa hranom, na prvom mestu su torte i kolači (48,8%), zatim slede jaja

(12,9%) i pečena piletina (9,7%). U odnosu na mesto izloženosti oko 85,5% epidemija

je bilo u privatnim domaćinstvima, među kojima oko dve trećine sa slabim dokazima.

Dominantan serotip salmonele u epidemijskom javljanju je Salmonella enteritidis

(92,2%). Mogućnost utvrđivanja jačine dokaza povezanosti hrane i zaražavanja




7

salmonelama u epidemijskom javljanju, direktno je povezano sa vremenom otkrivanja i

započinjanja istraživanja epidemije salmoneloze.

Ključne reči: salmoneloze, epidemije, hrana, dokazi

Uvod

Salmoneloze izazvane salmonelama životinjskog porekla su najčešće crevne

bolesti koje se prenose sa životinja na ljude. Po definiciji to su alimentarne toksi

infekcije akutnog toka sa kliničkom slikom gastroenteritisa. U epidemiološkom smislu

javljaju se sporadično ili u vidu manjih ili većih epidemija. Salmonele životinjskog

porekla (u daljem tekstu salmonele) smatraju se vodećim uzrokom bakterijskog

gastroenteritisa širom sveta (Benenson, 2000, Kosek et al., 2003). Danas je poznato

preko 2600 serotipova salmonela (EFSA and ECDC, 2012). Većina (59%) svih

poznatih serotipova pripada Salmonella enterica subsp. enterica. Serotipovi

Salmonella enterica subsp. enterica najčešće pripadaju podvrstama A, B, C1, C2, D, i

E. Sojevi iz pomenutih vrsta uzrokuju približno 99% infekcija salmonelama kod ljudi i

toplokrvnih životinja (Brenner et al., 2000, Su LH et al.,2007). Najčešće izolovani

serotipovi salmonela iz humanog materijala u periodu 2001-2007. godine širom sveta

su S. Enteritidis i S. Typhimurium (Hendriksen et al., 2011).

Rezervoari salmonela su brojne divlje i domaće životinje (svinje, konji, goveda,

mačke, psi, glodari, ptice, živina, kornjače, gmizavci), a izvor njihovi produkti (meso,

mleko, jaja i dr.). Čovek takođe može biti rezervoar i izvor zaraze, i to kao bolesnik ili

kliconoša (Benenson, 2000). Dužina izlučivanja salmonela u ljudi prosečno traje pet

nedelja od inficiranja, s tim što oko 90,0% inficiranih prestaje sa kliconoštvom do

devete nedelje (Čobeljić i sar., 1989). Vodeći put prenošenja salmonela je alimentarni,

preko primarno kontaminiranih namirnica životinjskog porekla (meso, mleko, jaja) ili

sekundarno kontaminirane hrana svih vrsta i porekla (Allos et al., 2004, Linam et al.,

2007, Garotić-Ilić i sar., 2000). Savremeni način ishrane, propusti u termičkoj obradi,

higijenskom režimu obrade sirovih namirnica, čuvanja ili transporta gotovih obroka


8

značajno doprinose zaražavanju ljudi i nastanku obolevanja u epidemijskom obliku

(Todd, 1997). Epidemije salmoneloza najčešće se registruju kao porodične epidemije,

zatim nakon konzumiranja obroka pripremljenog u ugostiteljskim objektima, dečijim

školskim i predškolskim objektima (Garotić-Ilić i sar., 2000, CDC, 2013).

Jedan od osnovnih ciljeva nadzora nad salmonelozama i istraživanja pojave

obolevanja u epidemjskom obliku (kao i svih ostalih oboljenja i epidemija koje se

prenose hranom) je korišćenje dobijenih rezultata za sprečavanje nastanka novih

epidemija i poboljšanje bezbednost hrane. U okviru sistema nadzora i izveštavanja

prikupljaju se i analiziraju podaci o karakteristikam uzročnika, mestu izloženosti, vrsti

hrane/namirnice koja je poslužila kao put prenosa infekcije i svim faktorima koji

doprinose nastanku epidemije. U zemljama Evropske unije od 2011. godine, ovaj

sistem je dodatno unapređen utvrđivanjem jačine epidemioloških i mikrobioloških

dokaza o povezanosti hrane kao puta prenosa uzročnika epidemije. Obe grupe dokaza

o povezanosti konzumiranja određene hrane sa nastankom epidemije, su klasifikovani

na jake i slabe (EFSA, 2011).

Cilj ovog rada bio je da se prikaže istraživanje jačine dokaza povezanosti hrane i

zaražavanja salmonelama u epidemijskom javljanju salmoneloza na teritoriji Beograda

za period 2011-2013. godine.

Materijal i metode

Kao izvor podataka korišteni su podaci Godišnjih izveštaja o realizaciji Programa

zaštite stanovništva od zaraznih bolesti i informacije o obavljenim epidemiološkim

istraživanjima epidemija salmoneloza u periodu 2011-2013.godina. U radu je

primenjen deskriptivni metod, a za ispitivanje jačine dokaza povezanosti hrane kao

puta prenosa u registrovanim epidemijama kriterijumi EFSA (European Food Safety

Authority) i Community Outbreak Reporting System (CORS). Tipovi dokaza koji

podržavaju jaku povezanost sa epidemijama su 1) epidemiološki dokazi analitičke ili

ubedljive deskriptivne epidemiologije i 2) mikrobiološki dokazi predstavljeni sa četiri

moguće kombinacije dokaza uzročnika u hrani, sastojku hrane, lancu proizvodnje i


9

pripreme hrane i životnoj sredini, uzorku mikrobiološkog materijala obolele osobe, sa

pojavom patognomoničnih simptoma bolesti i konzumiranjem inkriminisane

namirnice. Dokazi bazirani samo na nivou deskripcije podataka iz životne sredini se

smatraju slabom podrškom povezanosti hrane kao puta prenosa u alimentarnim

epidemijama.

Rezultati

U periodu od 2011.do 2013.godine u Beogradu je registrovano 112 alimentarnih

epidemija, među kojima 90 (80,4%) epidemija salmoneloza. U epidemijama

salmoneloza obolelo je 685 osoba, što u odnosu na ukupno 1395 prijavljenih slučajeva

salmoneloza u istom periodu čini 49,1% svih obolelih od ove alimentarne

toksiinfekcije (grafikon 1).

0

100

200

300

400

500

600

2011. 2012. 2013.

569

443383

336

170 179

svi oboleli

oboleli u epidemijama

Broj

Grafikon 1. Ukupno oboleli od salmoneloza i oboleli u epidemijama salmoneloza u

Beogradu, 2011-2013.

Najčešće mesto izloženosti obolelih u registrovanim epidemijama bila su individualna

domaćinstva sa učešćem od 85,6%, a daleko ređe različite vrste kolektiva u kojima je

zajedničko za obolele pripremanje i/ili konzumiranje obroka (grafikon 2).


10

Grafikon 2. Procentualna zastupljenost mesta izloženosti obolelih u epidemijama

salmoneloza u Beogradu, 2011-2013.

U 54,4% registrovanih epidemija salmoneloze nije utvrđena namirnica koja je

poslužila kao put prenosa uzročnika obolevanja. Najčešće inkriminisane namirnice za

nastanak epidemija bile su torte i kolači (22,2%), jaja (8,9%) i pečena piletina (4,4%)

(grafikon 3).


11

54,4%22,2%

8,9%4,4%

7,9%

N=90

Nepoznato

Torte i kolači

Jaja

Grafikon 3. Namirnice kao put prenosa u epidemijama salmoneloza u Beogradu,

2011-2013.

U odnosu na dokaze o jačini povezanosti hrane sa nastankom epidemije

salmoneloze u Beogradu od 2011. do 2013. godine, u nešto više od jedne trećine

epidemija salmoneloze (34,4%) utvrđeni su čvrsti dokazi (grafikon 4).


12

0

5

10

15

20

25

2011. 2012. 2013.

15

11

6

2120

17

N=90

Čvsti dokazi

Broj

Grafikon 4. Jačina dokaza povezanosti hrane i zaražavanja salmonelama u

epidemijama salmoneloza u Beogradu, 2011-2013.

Prema podacima o epidemijama sa čvrstim dokazima o povezanosti hrane, kao put

prenosa salmonela najčešće su registrovane torte i kolači (48,4%), jaja (12,9%) i

pečena piletina (9,7%) (grafikon 5).

48,8%

12,9 %

9,7%

28,6%

N=31

Poslastičarski proizvodi

Jaja

Grafikon 5. Namirnice kao put prenosa u epidemijama salmoneloza sa čvrstim

dokazima o povezanosti hrane u Beogradu, 2011-2013.


13

U tabeli 1. prikazani su rezultati analize čvrstih dokaza u epidemijama

salmoneloze u Beogradu u periodu 2011-2013. godine.

Diskusija

Opterećenje zaraznim bolestima koje se prenose hranom još uvek predstavlja

značajan javnozdravstveni problem širom sveta. U cilju što efikasnijeg rešavanja ovog

problema zemlje Evropske unije (EU) su uz primenu modela multisektorske saradnje,

uspostavile sistem izveštavanja i analize obolevanja i epidemija od zoonoza i bolesti

koje se prenose hranom. Ključni elementi analize su trendovi i broj epidemija prema

etiološkom agensu, ozbiljnost ishoda registrovanih oboljenja, učešće vrsta namirnica i

hrane kao puta prenosa uzročnika bolesti i faktori koji doprinose nastanku epidemija.

Dobijeni podaci se koriste za procenu situacije, kontrolu efikasnosti sprovednih mera i

planiranje potrebnih aktivnosti i preventivnih programa (EFSA and ECDC, 2007.).

Prema najnovijim izveštajnim podacima za 2012. godinu, u zemaljama EU

prijavljeno je 5363 alimentarnih epidemija među kojima 1533 epidemije salmoneloza.

U strukturi svih alimentarnih epidemija njihovo učešće je od 2008. godine ispod

30,0%. Broj epidemija varira od države do države, i nije obavezno pokazatelj nivoa

bezbednosti hrane. Smatra se da na ove razlike dobrim delom utiču i različiti sistemi

nadzora i različita senzitivnost nacionalnih sistema za otkrivanje i istraživanje

epidemija. Opadanje broja epidemija salmoneloza u zemljama EU praćeno je i

opadanjem ukupnog obolevanja od salmoneloza. U 2012. godini prijavljena je 91.034

obolela osoba, što je za 4,7% manje u odnosu na prethodnu godinu. Još značajniji

podatak je da se u zemljama EU od 2008. godine, beleži kontinuirani pad obolevanja

od salmoneloza. U odnosu na 2008. godinu broj obolelih je smanjen za oko 25,0%

(2008/120.760 obolelih) (EFSA and ECDC, 2014). Glavni razlozi opadajućeg trenda

obolevanja su intenzivno sprovođenje programa suzbijanja salmoneloza kod živine i

bolje sprovođenje higijenske prakse u lancu proizvodnje hrane (Lahuerta et al., 2011).

Prema rezultatima našeg rada, u Beogradu je u periodu 2011-2013. godina


14

registrovano 90 epidemija salmoneloza, koje čine 80,4% svih zabeleženih

alimentarnih epidemija (112). Ovako izrazito visoko učešće epidemija salmoneloza u

strukturi alimentarnih epidemija povremeno smo registrovali i u prethodnim godinama

(2007. i 2009. godine). To su bile godine u kojima je zabeleženo povećanje ukupnog

broja obolelih od salmoneloza, što se uglavnom može objasniti boljim prijavljivanjem

laboratorijski utvrđenih slučajeva oboljenja i intenzivnijim radom epidemiološke

službe. Salmonella enteritidis dokazana je kao uzročnik u 92,2%. registrovanih

epidemija. U posmatranom trogodišnjem periodu u Beogradu je bilo prijavljeno 1395

slučajeva obolevanja od salmoneloze, sa stopom incidencije 34,3/100.000 stanovnika

u 2013. godini i 23,1/100.000 u 2011. godini. Za razliku od zemalja EU i opadajućeg

trenda obolevanja od salmoneloza, kretanje broja obolelih u Beogradu u periodu 2011-

2013. godina je deo karakterističnih nepravilnih oscilacija koje registrujemo

poslednjih desetak godina. Najveći porast obolelih osoba uočen je u 2007. i 2009.

godini i praćen je porastom stope incidencije (31,5/100.000 i 28,3/100.000), a pad

broja prijavljenih slučajeva i pad stope incidencije 2010. godine (20,6/100.000)

(Maris, 2014). Prosečna vrednost ovog pokazatelja obolevanja od salmoneloza u

Beogradu u proteklih deset godina iznosi oko 26,0/100.000 stanovnika. U 90

registrovanih epidemija obolelo je 685 osoba, odnosno 49,1% od svih prijavljenih

slučajeva obolevanja od salmoneloze. Približno slične prosečne vrednosti beleže se i u

drugim delovima naše zemlje, dok su u Hrvatskoj i zemljama EU, ove vrednosti

višestruko manje i kreću se između 11,6% -13,1% svih prijavljenih slučajeva

obolevanja (Petrović i sar., 2005, Ban i sar., 2011, EFSA and ECDC, 2014). U odnosu

na mesto izloženosti najčešće su registrovane porodične epidemije, koje čine 85,6%

svih epidemija salmoneloza. Zajedničko za sve obolele u ovim epidemijama je

konzumiranje inkriminisne hrane/namirnice pripremeljene u istom individualnom

domaćinstvu. Podaci epidemiološkog istraživanja salmoneloza na području Beograda

koje je obuhvatlo dvadestogodišnji period, takođe potvrđuju najveću izloženost u

individualnim domaćinstvima ali sa 20,0% nižim učešćem (63,4%). U zemljama EU

ove vrednosti su još manje, ali im i dalje pripada prvo mesto (49,9%-57,6%). U SAD


15

zastupljene su sa 25,5% učešća u svim epidemijama salmoneloza, i nalaze na drugom

mestu (Maris 2014., EFSA, 2011, EFSA and ECDC, 2014, CDC, 2014). Epidemijsko

javljanje salmoneloza među decom i zaposlenima u školama i predskolskim

ustanovama Beograda registrovano je u periodu 2011-2013.godina u 7,8% svih

epidemija salmoneloze. Približno slične podatke o ovoj izloženosti beležili smo i u

prethodnih deset godina (7,0%), i one su manje u odnosu na dvadestogodišnji prosek

od oko 9,5% (Maris 2014). U zemljama EU epidemije u dečijim kolektivima

zabeležene su u 5,2% svih epidemija salmoneloze (ECDC, 2014, CDC, 2014).

Obzirom da su deca u grupi sa visokim rizikom za razvoj teže kliničke slike i

mogućeg smrtnog ishoda bolesti, objekti i osoblje koje prirema ishrana za njih

zahtevaju najstroži režim pravilnog postupanja u radu i primeni higijenskih mera.

Konzumiranje namirnica pripremljenih u ugostiteljskim objektima, kao mestu

izloženosti, najčešće je u SAD (37,8%) i povezuje se načinim ishrane, odnosno stilom

života. U zemljama EU je na drugom mestu (24,7%-18,7%), a kod nas je poslednje tri

godine uočen pad sa 26,0% na 1,1%.Vrlo je verovatno da jedan deo sporadičnih

slučajeva pripada ovim epidemijama, ali zbog nedostatka podataka, ostanu kao

dispergovani, neprepoznati slučajevi neke epidemije (Ban i sar., 2011, EFSA and

ECDC, 2014).

Od ukupnog broja registrovanih epidemija salmoneloza u periodu 2011-2013.

godina u 54,0% epidemija nije utvrđena namirnica koja je poslužila kao put prenosa

infekcije. Među epidemijama u kojima je u namirnicama dokazano prisustvo

salmonela, procentualno su najzastupljenije torte i kolači (22,2%), jaja (8,9%) i

pečena piletina (4,4%). Međutim, prema podacima o prisustvu salmonela u određenim

vrstama namirnicama u Beogradu unazad dvadeset godina, prisustvo salmonele je

desetostruko češće bilo dokazano u piletini (49,2%), a znatno ređe u tortama i

kolačima (8,8%) (Maris, 2014). U epidemijama salmoneloze u zemljama EU, najčešće

su salmonele utvrđene u jajima i proizvodima od jaja, i to uglavnom termički

neobrađenim ili nedovoljno obrađenim. Njihovo učešće se kreće od 45,2%-50,5%

(EFSA and ECDC, 2014). Slične podatke nalazimo i u analizi epidemija u SAD


16

(48,0%) kao i u rezultatima istraživanja salmoneloza u Novom Zagrebu, u periodu

1990-2009. godine. Procentualno najveće prisustvo salmonela dokazano je u jajima

(32%), kolačima i piletini (po10%) i mlevenom mesu (5%) (Domínguez et al., 2007,

Ban i sar., 2011).

Koristeći kriterijume za utvrđivanje jačine povezanosti hrane/namirnica sa

epidemijom salmoneloza u posmatrane tri godine, čvrsti dokazi su utvrđeni u 36,6%

svih registrovanih epidemija salmoneloza. Ubedljivi deskriptivni i/ili dokazi analitičke

epidemiologije su nađeni u svih 36,6% epidemija. Mikrobiološki nalaz uzročnika u

namirnici koja je poslužila kao put prenosa infekcije, uspešno je obavljena samo u

jednoj epidemiji. Ostale kombinacije čvste povezanosti, koje pre svega

podrazumevaju detekciju salmonela u hrani, sastojku hrane, lancu proizvodnje ili

pripreme hrane, nismo utvrdili. Izolacija salmonele iz materijala obolele osobe je

najčešći i bazični nalaz, koji zajedno sa pojavom patognomoničnih simptoma bolesti u

periodu inkubacije i podatkom o konzumiranju inkriminisane namirnice, uspemo da

dokažemo u svakoj epidemiji. Glavni razlog zbog kojeg izostaje mikrobiološka

potvrda salmonela iz namirnica, je kasno otkrivanja epidemije i nedostatak neophodne

količine inkriminisane namirnice koja bi mogla biti uzorkovana i ispitana, Slična

iskustva opisuju i drugi autori (Ban i sar., 2011, Petrović V i sar., 2005, Lynch et al.,

2009). Kao put prenosa salmonela u ovim epidemijama najčešće su poslužile torte i

kolači (48,8%), jaja (12,9%) i pečena piletina (9,7%).

Poboljšanje prijavljivanja sporadičnih slučajeva salmoneloze i upućivanje

obolelih sa suspektnom kliničkom slikom na mikrobiološku potvrdu dijagnoze, može

doprineti boljem nadzoru nad salmonelozama, kao i ranom otkrivanju epidemija dok

još ima uzoraka inkriminisane namirnice koja bi mogla da posluži za mikrobiološko

ispitivanje. Na taj način bi se povećala mogućnost utvrđivanja jačine dokaza

povezanosti hrane i zaražavanja salmonelama u epidemijskom javljanju, što bi

pomoglo u istraživanju izvora i rezervoara salmonela i preduzimanju mera za

smanjenje rizika za obolevanje ljudi.


17

Literatura

Allos BM, More MR, Grifin PM, Tauxe RV. 2004. Surveillance for sporadic

foodborne disease in the 21st century: The FoodNet perspective. Clin Infect Dis

38(Supl): 115-20. 2. Benenson AS ed. Control of Communicable disease in man. 16th

ed. 2000. (preveo Marko Kovačević). Beograd: CIM (Beograd-Publikum) 2000:432-6.

3.Brenner FW, Villar RG, Angulo FJ, Tauxe R and Swaminathan.2000.Salmonella

Nomenclature. J Clin Microbiol 38(7): 2465-2467. 4.CDC. Division of Foodborne,

Waterborne, and Environmental Diseases .Surveillance for Foodborne Disease

Outbreaks United States, 2012: Annual Report, 2014CDC.Surveillance for foodborne

disease outbreaks—United States, 2009-2010. MMWR 2013. Available at

http://www.cdc.gov/outbreaknet/surveillance_data.html . 5. Domínguez, A., Torner,

N., Ruiz, L., Martínez, A., Bartolomé, R., Sulleiro, E., Teixidó, A., etal. (2007).

Foodborne Salmonella-Caused Outbreaks in Catalonia (Spain), 1990 to2003. Journal

of Food Protection, 70, 209-213. 6. Čobeljić M. Alimentarne toksikoinfekcije.

U:Birtašević B, Đorđević D, Arsić B i sar. Vojna epidemiologija. Beograd:

Vojnoizdavački i novinski centar, 1989; 235-42. 7. EFSA (European Food Safety

Authority) and ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control) 2007.

The Community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic

agents, Antimicrobial Resistrance, and Foodborns Outbreaks in the European Union in

2006. The EFSA Journal 2007 – 130. 8. EFSA (European Food Safety Authority)

2011.Updated technical specifications for harmonised reporting of food-borne

outbreaks through the European Union reporting system in accordance with Directive

2003/99/EC. EFSA Journal 2011;9(4):2101, 26 pp. doi:10.2903/j.efsa.2011. 9. EFSA

(European Food Safety Authority) and ECDC (European Centre for Disease

Prevention and Control) 2012. The European Union Summary Report on Trends and

Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2010. EFSA

Journal 2012;10(3): 2597. 10. EFSA (European Food Safety Authority) and ECDC

(European Centre for Disease Prevention and Control) 2014.The European Union

Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-

http://www.cdc.gov/outbreaknet/surveillance_data.html%20.%205


18

borne Outbreaks in 2012. EFSA Journal 2014;12(2):3547. 11. Garotić-Ilić L,

Dmitrović R, Pavlović N i sar. Uloga namirnica životinjskog porekla u obolevanju od

salmoneloza na području Beograda 1990-1999.U:IV beogradska konferencija o

suzbijanju štetnih artropoda i glodara zbornik radova. Skupština grada Beograda,

2000;13-23. 12. Gradski zavod za javno zdravlje Beograd:Godišnji izveštaji o

realizaciji Programa zaštite stanovništva od zaraznih bolesti, 2011-2013. 13.

Hendriksen RS, Vieira AR, Karlsmose S, Lo Fo Wong DM, Jensen AB, Wegener HC

and Arestrup FM. 2011. Global monitoring of Salmonella serovar distribution from the

World Health Organization Global Foodborne Infections Network Country Data Bank:

results of quality assured laboratories from 2001 to 2007. Foodborne Pathog Dis. 8(8):

887-900. 14. Kosek M, Bern C, Guerrant RL. The global burden of diarrhoeal disease,

as estimated from studies published between 1992 and 2000. Bull World Health Organ.

2003;81(3):197-204. 15.Linam WM, Gerber MA. Changing epidemiology and

prevention of Salmonella infections. Pediatr Infect Dis J 2007; 26: 747-8. 16. Lynch,

M. F., Tauxe, R. V., & Hedberg, C. W. (2009). The Growing Burden of Foodborne

Outbreaks Due to Contaminated Fresh Produce: Risks and Opportunities.Epidemiology

and Infection, 137(Special Issue 03), 307-315.doi:10.1017/S0950268808001969. 17.

Maris S. Epidemiološke karakteristike salmoneloza u populaciji Beograda za period

1994-2013. godine. Magistarska teza. Univerzitet u Beogradu. Medicinski fakultet.

2014. 18. Petrović V, Stefanović S,Đurić P.Epidemiološke karakteristike salmoneloza

u Vojvodini.Med Pregl 2005;LVIII(3-4):136-41. 19. Su LH, Chiu CH. Salmonella:

clinical importance and evolution of nomenclature. Chang Gung Medical Journal

2007;30(3), 210-219. 20. Todd EC. Epidemiology of foodborne disease: a worldwide

review. World Health StatQ.1997;50(1-2):30-50.


19

4. MIKOTOKSINI-HAZARD U LANCU ISHRANE

Šefer D*, Radulović S

*, Petrujkić B

*, Marković Radmila

*1 , Milka Popović

**

*Katedra za Ishranu i botaniku, Fakultet veterinarske medicine Univerziteta u

Beogradu

**Medicinski fakultet, Univerzitet u Novom Sadu

Kratak sadržaj

Mikotoksini su toksični sekundarni metaboliti većeg broja saprofitskih plesni koji

u organizam životinja i ljudi najčešće dospevaju putem kontaminirane hrane infestirane

sporama, konidijama i/ili fragmentima micelijuma. Alimentarnim unošenjem toksina

gljivica u organizam životinja i ljudi nastaju intoksikacije, tzv. mikotoksikoze koje, s

obzirom na to da su vezane za hranu, mogu da poprime široke razmere. Štete u

stočarstvu koje nastaju usled mikotoksikoza mogu da budu velike. Ispoljavaju se u

vidu direktnih gubitaka zbog uginjavanja životinja ili, još češće, nastaju indirektno

usled pada proizvodnih i reproduktivnih sposobnosti životinja. Zbog iskorišćavanja

hranljivih sastojaka substrata, rast gljivica značajno smanjuje sadržaj suve materije

hrane, a smatra se da redukcija masti i ugljenih hidrata, nastala kao posledica prisustva

i razvoja plesni u hrani, izaziva smanjenje količine metaboličke energije. Poseban

problem predstavlja mogućnost da se u organizmu životinja koje su konzumirale hranu

kontaminiranu mikotoksinima mogu da nađu rezidue mikotoksina u različitim

količinama, pa može da dođe do ispoljavanja štetnih efekata i kod ljudi.

Ključne reči: hrana za životinje, mikotoksini, hrana za ljude




20

Uvod

Poslednjih godina na globalnom planu prisutni su značajni klimatski poremećaji

praćeni ekstremno visokim ili niskim temperaturama, pojavama velikih i obilnih kiša

sa poplavama ili pojavama velikih suša. Ovakvi stresogeni uticaji su značajno

doprineli povećanju kontaminacije plesnima i mikotoksinima, pre svega, žitarica a i

drugih hraniva . Posebno se ističe pojava nekih mikotoksina u žitaricama, na

područjima na kojima do sada nisu utvrđivani.

Prema podacima Organizacije za ishranu i poljoprivredu Ujedinjenih nacija (FAO)

danas je od 2,5 milijardi tona žitarica u svetu, 25% zaraženo mikotoksinima.

Procenjuje se da ekonomski gubici izazvani kontaminacijom mikotoksinima iznose na

stotine milijardi dolara.

Bezbednost hrane, sa aspekta humane i veterinarske medicine, predstavlja značajan

problem pa je i velika pažnja usmerena ka bolestima koje su usko vezane za različite

mikotoksikoze. Izveštaji Svetske zdravstvene organizacije (WHO, 1985) pokazuju da

prisustvo mikotoksina, toksičnih metabolita metabolizma plesni, u hrani za ljude ne

opada, a zbog očiglednog porasta broja oboljenja vezanih za mikotoksine kao

potencijalne etiološke faktore čine se ogromni napori da se mikotoksini u hrani za

ljude utvrde i da se izvrši njihova eliminacija.

Mikotoksini u hrani za životinje

Pokvarena hrana za životinje je potencijalno škodljiva, mada ne mora uvek da

ispolji takvo dejstvo. Medicinski aspekt pokvarene hrane ogleda se u postizanju

slabijih proizvodnih rezultata životinja, pojavi metaboličkih poremećaja i oboljenja,

kao i eventualnih uginuća. Kvarenje hrane izazvano je različitim hemijskim, fizičkim i

biološkim faktorima, pri čemu do kvarenja najčešće dovode mikroorganizmi prisutni u

hrani. S obzirom na dvojako delovanje, direktan uticaj na hranljivu vrednost i/ili


21

produkcija mikotoksina, prisustvo plesni u hrani za životinje predstavlja važan

kriterijum u proceni kvaliteta hrane za životinje (Mašić i sar., 2000).

Prisustvo i razvoj plesni u hrani za životinje može biti posledica kontaminacije u

polju i/ili u skladištu. Najčešće prisutne gljivice u hrani za životinje su ''skladišne''

plesni što upućuje na manipulativne greške tokom skladištenja hrane, kao i na

neadekvatne uslove i slabiju kontrolu uslova skladištenja. Pored navedenog, u

uzorcima hrane za životinje često je utvrđeno i povećano prisustvo tzv. ’’poljskih’’

plesni, što situaciju čini još komplikovanijom.

Rast i razvoj gljivica u hrani za životinje vezan je za iskorišćavanje hranljivih

sastojaka hrane, odnosno smanjenje hranljive vrednosti i promenu organoleptičkih

osobina. Prirodna žuta boja kukuruza može da se promeni u belu, ružičastu, crvenu ili

zelenu u zavisnosti od vrste gljivica koje na njemu rastu (Qasem i Christensen, 1958).

Takođe, plesniva hrana poseduje karakterističan zagušljivi miris. Mikotoksini su

toksični sekundarni metaboliti većeg broja saprofitskih plesni koji u organizam

životinja i ljudi najčešće dospevaju putem kontaminirane hrane infestirane sporama,

konidijama i/ili fragmentima micelijuma. Alimentarnim unošenjem toksina gljivica u

organizam životinja i ljudi nastaju intoksikacije, tzv. mikotoksikoze koje, s obzirom

na to da su vezane za hranu, mogu da poprime široke razmere. Štete u stočarstvu koje

nastaju usled mikotoksikoza mogu da budu velike. Ispoljavaju se u vidu direktnih

gubitaka zbog uginjavanja životinja ili, još češće, nastaju indirektno usled pada

proizvodnih i reproduktivnih sposobnosti životinja. Poseban problem predstavlja

mogućnost da se u organizmu životinja koje su konzumirale hranu kontaminiranu

mikotoksinima mogu da nađu rezidue mikotoksina u hrani u različitim količinama, pa

može da dođe do ispoljavanja štetnih efekata i kod ljudi (Sinovec i sar., 2006).

Mikotoksini dospevaju u organizam čoveka:

-direktnim putem, konzumiranjem namirnica biljnog i/ili životinjskog porekla,

kontaminiranih toksinima tokom neadekvatnog tehnološkog procesa proizvodnje

ili skladištenja, i


22

-indirektnim putem, komzumiranjem namirnica animalnog porekla (meso i proizvodi

od mesa, jaja i proizvodi od jaja, riba, školjke, rakovi i njihovi proizvodi, mleko i

proizvodi od mleka), kontaminiranih toksinima preko hrane za ishranu pojedinih

životinja.

Pored navedenog, ne sme se zaboraviti značaj kvaliteta sirovine ili dodataka za

proizvodnju neke namirnice, odnosno upotrebe isključivo onih sirovina u kojima nisu

konstatovane rezidue toksina, čak ni u minimalnim koncentracijama. Jedino sirovina

takvog kvaliteta može biti uslov proizvodnje zdravstveno bezbedne namirnice

(Škrinjar Marija i sar., 2004).

Sa aspekta proizvodnje mikotoksina najinteresantniji su rodovi Aspergillus,

Penicillium i Fusarium, čije su vrste potencijalni proizvođači aflatoksina, ohratoksina,

zearalenona, trihotecena (DON, DAS i dr.) i drugih toksičnih metabolita (Marasas i

sar., 1984; Samson i Ellen van Reenen-Hoekstra, 1988).

Zbog iskorišćavanja hranljivih sastojaka substrata, rast gljivica značajno smanjuje

sadržaj suve materije hrane. Zrnevlje kontaminirano plesnima i skladišteno 30 dana

pri vlažnosti od 18% gubi 4% suve materije, a za 60 dana 8% suve materije. S

obzirom na to da plesni veoma često napadaju klicu zrna, može da se očekuje

smanjenje energetske vrednosti hrane zbog iskorišćavanja masti. Ugljeni hidrati su,

pored masti, izloženi dejstvu plesni što dovodi do daljeg smanjenja energetske

vrednosti hrane. Smatra se da redukcija masti i ugljenih hidrata, nastala kao posledica

prisustva i razvoja plesni u hrani, izaziva smanjenje količine metabolčke energije za

5% (Bartov, 1982), pa čak i do 25%.

Imajući na umu da se u ishrani mladih i visoko proizvodnih životinja koriste

visokoenergetski obroci, dodavanje masti zbog smanjene energetske vredosti obroka

značajno povećava troškove ishrane. Sa druge strane, formulacija obroka na bazi

tabličnih vrednosti, bez uzimanja u obzir promene hranljive vrednosti hraniva

izazvanih prisustvom plesni, može da dovede do pothranjenosti i slabijih proizvodnih

rezultata.


23

Promene u sadržaju proteina i amino kiselina u plesnivoj hrani nisu jasno izražene

kao što je to slučaj sa lipidima i ugljenim hidratima. Relativan sadržaj proteina u

plesnivoj hrani je nešto povećan što je verovatno posledica intenzivnije razgradnje

lipida i ugljenih hidrata nego proteina (Cook, 1994). Međutim, ukupan sadržaj azota u

plesnivoj hrani opada. Posmatrajući sadržaj amino kiselina (Kao i Robinson, 1972), u

plesnivoj hrani opada količina lizina (45%), arginina (50–54%), histidina (49.5%) i

cisteina (74.5%) uz povećanje količine metionina (34.5 – 54.0%).

Tokom perioda u kome vladaju nepovoljni spoljašnji uslovi, plesni su sposobne da

modifikuju metaboličke puteve što se smatra odbrambenim mehanizmom. Na ovaj

način nastaje veliki broj sekundarnih metabolita, odnosno mikotoksina, a samo manji

broj (aflatoksini, ohratoksini, zearalenon i trihoteceni), poreklom pretežno od rodova

Aspregillus, Penicillium i Fusarium, ima veliki negativan nutritivni, medicinski i

ekonomski značaj.

Procena prisustva plesni u hrani za životinje je veoma složena (Šefer i sar., 2004),

posebno ako se u obzir uzme nedovoljno jasna i precizna legislativa u pogledu

kategorija životinja (Sinovec i sar., 2001). Prosečno, smeše za podmladak su

kontaminirane plesnima sa 100-3.400.000 CFU/g pri čemu je čak 35.7% ispitivanih

uzoraka sadrži nedozvoljen broj plesni (Marković i sar., 2005). Sa druge strane, i

pored visoke kontaminacije (i do 8.000.000 CFU/g), svega 7.5% ispitivanih uzoraka

smeša za ishranu odraslih životinja sadrži nedozvoljen broj plesni.

Pri proceni kvaliteta hrane potrebno je uzeti u obzir i mikološku populaciju hrane.

Generalno posmatrano, u hrani za životinje (Marković i sar., 2005) su prisutne plesni

roda Penicillium spp. (28.4%), Aspergillus spp. (26.4%), Mucor spp. (24.7%),

Fusarium spp. (11.3%) i Rhisophus spp. (9.2%). Prisustvo ''poljskih'' plesni zavisi od

primenjenih agrotehničkih mera i klimatskih uslova pojedinih godina, ali pre svega od

primenjenih mera tokom ubiranja letine. Sa duge strane, zabrinjava značajno prisustvo

''skladišnih'' plesni koje ukazuju na greške u manipulaciji i neadekvatne uslove

skladištenja. Posebno zabrinjava prisustvo gljivica roda Mucor spp. i Rhisophus spp.

koje pripadaju flori plesni uznapredovanog kvarenja.


24

Mikotoksini kod ljudi i životinja izazivaju niz štetnih efekata, zavisno od vrste toksina

(Samson i Ellen van Reenen-Hoekstra, 1988) i to: mutagene, teratogene, embrio-

toksične, hepatogene, nefrotoksične, dermatotoksične i kancerogene.

Iz svega napred navedenog proizilazi da je neophodno da se, pri proceni kvaliteta

hrane i uticaja na proizvodne rezultate, promena hranljive vrednosti hrane kao

posledica kontaminacije plesnima uzme u obzir zajedno sa ostalim faktorima. Iako se

glavna uloga negativnog uticaja hrane vezuje za štetne efekte mikotoksina, mnogo

objektivniji pristup je da se oba faktora – promena hranljive vrednosti i prisustvo

mikotoksina – razmatraju zajedno i povezano u odnosu na različite vrste i kategorije

životinja. Navedeno posebno treba uzeti u obzir u slučajevima niske kontaminacije

hrane mikotoksinima.

Mikotoksini u hrani za ljude

Prisustvo mikotoksina u hrani za ljude je problem kojim je čovečanstvo, a

posebno savremeno društvo izloženo mada postoji veoma velika razlika između

razvijenog i nerazvijenog dela sveta, pre svega, u stepenu kontaminacije namirnica

mikotoksinima. U nerazvijenim geografskim regijama ljudi su permanentno izloženi

akutnim ili hroničnim mikotoksikozama, a uzimajući uobzir stalnu potrebu za

dovoljnom količinom hrane u ovim regionima bilo bi nerealno očekivati i rešenje

problema mikotoksikoza. Ljudi u razvijenijim ili veoma razvijenim delovima sveta su

manje izloženi mikotoksikozama pri čemu su geografski i klimatski uslovi svakako

primarni. Pored toga, resursi hrane su veoma izdašni, primenjuje se moderna

tehnologija prerade i skladištenja hrane, uvedena je stroga zakonska regulativa, a

prisutna je i veoma rigorozna kontrola prisustva mikotoksina u namirnicama. Kada se

govori o mikotoksinima, neophodno je napomenuti da se radi o metabolitima izuzetno

otpornim na različite tretmane. Od posebnog je značaja njihova otpornost prema

dejstvu temperatura, kako visokih, koje se upotrebljavaju u prehrambenoj industriji

(režim pasterizacije, režim sterilizacije), tako i niskih (hlađenje, smrzavanje), usled

čega se njihova struktura ili ne razara uopšte ili je razgradnja samo delimično (Marija

Škrinjar i sar., 2004).


25

Aflatoksin B1 i rizik po zdravlje ljudi. Ljudi su najčesce izloženi dejstvu aflatoksina

na tri načina:

-Ingestijom namirnica biljnog porekla (pretežno kukuruza i kikirikija) kontaminiranih

aflatoksinom (pretežno AFB1),

-Ingestijom kontaminiranog mleka i mlečnih proizvoda uključujući sir i mleko u prahu

(pretežno AFM1) i

-Ingestijom rezidua aflatoksina iz mesa i proizvoda od mesa, kao i jaja (u manjem

obimu od prethodna dva načina).

Kao posledica ingestije aflatoksina javljaju se različiti poremećaji zdravlja koji se

po stepenu, karakteru i intezitetu ispoljavaju različito, a u zavisnosti od količine i vrste

unetog aflatoksina, dužine unošenja, opšteg stanja organizma, kao i starosne

kategorije ljudi (Radmila Resanović, 2000). Hepatocelularni karcinom je jedan od

najraširenijih vrsta karcinoma na svetu, a nalazi se na četvrtom mestu kao uzrok

mortaliteta ljudi. U geografskim regijama gde je veoma retka pojava hepatocelularnog

karcinoma sadržaj AFB1 u hrani je veoma nizak. Aflatoksini, posebno AFB1,

ispoljavaju veoma izražen karcinogeni efekat (Eaton i Groopman, 1994).

Internacionalna agencija za istraživanje kancera (IARC, 1993) klasifikovala je AFB1 u

grupu 1 karcinogena, jer je rizik od mogućnosti nastanka primarnog karcinoma jetre

ljudi veoma visok (Henry i sar., 2001). Akutni toksični hepatitis je oboljenje koje je

opisano u mnogim geografskim regionima, ali u Indiji je zabeležena najveća

prevalenca. Kwashiorkor je proteinska deficijencija koja se manifestuje

hipoalbuminemijom, generalizovanim edemima, dermatozom, uvećanom i masnom

jetrom, a povezana je sa geografskim regionima gde je zapažena sezonska pojava

aflatoksina u hrani za ljude. Rejov sindrom je oblik hepatične encefalopatije dece

praćene masnom degeneracijom parenhimatoznih organa. Prva hipoteza o vezi

aflatoksina i pojave ovog sindroma potiče još iz 1963. god. kada je utvrđeno prisustvo

aflatoksina B1 i G2 u serumu pacijenata obolelih i umrlih od Rey-ovog sindroma.

Uzimajući u obzir izvedena ispitivanja u vezi sa Rey-ovim sindromom, smatra se da je

oboljenje multifaktorijalne etiologije, ali da aflatoksin igra značajnu ulogu u


26

etiopatogenezi. T4 limfocitna deficijencija može biti izazvana prisustvom aflatoksina u

hrani za ljude jer je poznato da su aflatoksini mitogeni faktori za T4 limfocite i da

izazivaju simptome vezane za deficijenciju T4 limfocita (Griffitsh i sar., 1996).

Egzaktni podaci o dnevnom unosu aflatoksina ne postoje, ali su na osnovu različitih

modela izračunavanja date određene vrednosti. Prosečan dnevni unos aflatoksina B1

kreće se od 2-77 ng/čovek, odnosno 0.4-0.6 ng AFM1/čovek (SCOOP, 1996).

Ohratoksin A i rizik po zdravlje ljudi. Ohratoksin A (OTA) je mikotoksin za

koji se odavno smatra da izaziva nefropatije i razvoj tumora organa urinarnog trakta

ljudi (Nedeljković-Trailović Jelena, 2000). Visok stepen izloženosti ljudi OTA, visoka

koncentracija u krvnom serumu i dug poluživot OTA (35 dana), kao i deponovanje u

bubrezima ljudi pogoduju ispoljavanju nefrotoksičnosti.

Zearalenon i rizik po zdravlje ljudi. Smatra se da zearalenon i/ili njegovi

derivati, a posebno zearalanol, zbog svoje estrogene strukture dovode do pojave

prevremenog puberteta kod dece uzrasta od 7-8 godina (Painter, 1997). Kod žena F-2

toksin može da izazove estrogenizaciju i pseudotrudnoću, a kod muškaraca inhibiciju

normalnog razvoja testisa. Takođe, dovodi se u vezu i sa pojavom karcinoma prostate

kod muškaraca. Pretpostavlja se da je srednji dnevni unos zearalenona u zemljama

Evrope kreće od 1 do 420 ng/kg TM (EC, 2003).

T-2 toksin i rizik po zdravlje ljudi. Mehanizam toksičnosti trihotecena počiva na

snažnoj inhibiciji sinteze proteina, a to dovodi do niza negativnih efekata na zdravlje

ljudi.

Alimentarna toksična aleukija (ATA) je oboljenje ljudi koje se karakteriše

nekrotičnom anginom, hemoragičnom dijatezom i sepsom, praćenom agranulocitozom

kao posledicom atrofije kostne srži. Oboljenje ima letalni karakter u 80% slučajeva

(Joffe, 1978). Pojava oboljenja je dovedena u vezu sa ingestijom žitarica

kontaminiranih plesnima iz roda Fusarium (F. poae i F. sporotrichoides) iz kojih su

izolovani trihotecenski mikotoksini.

Hrana visokog rizika. S obzirom da ne postoje limiti mikotoksina u hrani koji bi

kontaminiranu hranu označili kao potpuno bezbednu potrebno je poznavati osnovne


27

namirnice koje najčešće mogu biti izvor intoksikacije (Sinovec i Resanović, 2005).

Takve namirnice često organoleptički izgledaju kao potpuno ispravne te se zato

mikotoksini i nazivaju ’’hladnokrvne ubice’’. Najčešće se mikotoksini mogu naći u

zrnastoj hrani, kafi, kakaou, koštunjavom voću i njihovim proizvodima, a zatim i u

namirnicama animalnog porekla u kojoj se nalaze rezidue mikotoksina (mleko, meso,

iznutrice, jaja).

Mleko i mlečni proizvodi. Prisustvo mikotoksina u mleku i proizvodima od mleka

je ozbiljan problem bezbednosti hrane, pre svega za novorođenčad i decu koji su

najosetljiviji na mikotoksine, a ujedno i najizloženiji ovom izvoru trovanja. Sisari koji

ingestijom unesu hranu kontaminiranu aflatoksinom izlučuju aflatoksin putem mleka

u vidu hepatičnog 4 –dihidroksilisanog metabolita poznatog kao ’’mlečni toksin’’, ili

aflatoksin M1. AFM1 je nešto manje toksičan od AFB1, tako da Internacionalna

agencija za istraživanje kancera (IARC, 1993) AFM1 svrstava u potencijalne

karcinogene za ljude. Uzimajući u obzir da se OTA i drugi mikotoksini u rumenu

preživara pod uticajem mikroflore u velikoj meri transformišu, sadržaj drugih

mikotoksina u mleku obično ne predstavlja rizik po zdravlje ljudi.

Mleko u prahu predstavlja još jedan izvor AFM1 za populaciju ljudi, te je zato

regulativa kojoj podleže ovaj proizvod izuzetno rigorozna. Mikotoksini, prvenstveno

aflatoksini, predstavljaju ozbiljan prenatalni problem jer je poznato da pojedini toksini

veoma dobro i lako pasiraju transplacentarnu barijeru i da se mogu naći u fetusu i

embrionu majki koje su konzumirale kontaminiranu hranu. S obzirom na to da se

mikotoksini, po pravilu, izlučuju mlekom najveći rizik od intoksikacije za

novorođenčad je svakako majčino mleko koje predstavlja jedini izvor hrane u prvim

mesecima života.

Meso i proizvodi od mesa. Namirnice poreklom od životinja hranjenih hranom

kontaminiranom mikotoksinima su potencijalna opasnost po zdravlje ljudi. Naravno

meso preživara predstavlja znatno manju opasnost od mesa svinja i živine zbog

fizioloških karakteristika predželudaca preživara i specifične razgradnje većine

mikotoksina u njima.


28

OTA predstavlja poseban problem kontaminacije mesa svinja te je zato u nekim

zemljama Evrope uveden poseban monitoring na klanicama gde se vrši postmortem

ispitivanje na prisustvo OTA (Moussing i sar., 1997)

Jaja. Prisustvo mikotoksina u jajima predstavlja opasnost po ljudsko zdravlje.

Rezidue aflatoksina B1 predstavljaju najveću opasnost jer biotransformacijom AFB1 u

jetri kokošaka nastaje niz hidroksilisanih međuproizvoda koji se mogu naći u jajetu.

Zrnasta hraniva. Uzimajući u obzir da cerealije predstavljaju osnovni izvor

ugljenih hidrata u ishrani ljudi širom cele planete one predstavljaju i osnovni izvor

mikotoksina u hrani za ljude. Cerealije se veoma lako infestiraju gljivicama u

različitim fazama proizvodnje i skladištenja. Kukuruz se smatra najzagađenijom

žitaricom mikotoksinima, zatim su tu šećerna trska, pirinač, ječam i pšenica, a od

semenja uljarica kikiriki, soja i suncokret. Kombinacija više toksina predstavlja izrazit

problem kod detekcije mikotoksina kao i kod praćenja efekata koji oni izazivaju u

organizmu ljudi i životinja.

Treba napomenuti da se mikotoksini mogu pronaći i u vinu, pivu, voću, povrću,

kafi i kakau, začinima (Sinovec i sar, 2006).

Literatura

Bartov I, 1982, The nutritional value of mouldy grains for broiler chicks. Poult. Sci.,

61, 2247-2254. 2. Cook ME, 1994, Prevention of the negative effects that moulds and

mycotoxins have on nutrient value of feeds and nutrient metabolism. Proc. California

Nutr. Conf., 156-165. 3. Eaton DL, Groupman JD, 1994, The Toxicology of

Aflatoxin. Human Healt, Veterinary and Agricultural Significance, Academic Press,

San Diego, California. EC (European Commission), 2003, SCOOP, task 3.2.10.

Collection of occurrence data of Fusarium toxins in food and assessment of dietary

intake by the population of EU Member States. European Commission, Directorate-

General Health and Consumer Protection, Reports on tasks for scientific co-operation,

http://europa.eu.int/comm/food/fs/scoop/task3210.pdf. 4. Griffiths BB, Rea WJ,

Johnson AR, Ross GH, 1996, Mitogenic effects of mycotoxins on T4 lymphocytes,

http://europa.eu.int/comm/food/fs/scoop/task3210.pdf.%20%204


29

Microbios, 86, 127-134. 5. Henry SH, Whitaker T, Rabbani I, Bowers J, Park D, Price

W, Bosch FX, Pennington J, Verger P, Yoshizawa T., van Egmond HP, Jonker MA,

Coker R, 2001, Aflatoksin M1 U: Safety Evaluation of Ceratin Mycotoxins in Food.

Prepared by the 56th meeting of the Joint Fao/WHO Expert Committee on Food

additives (JEFCA), Food and Nutrition Paper 74. Food and Agriculture Organisation

of the United Nations, Rome, Italy. 6. Kao C, Robinson RJ, 1972, Aspergillus flavus

deterioration of grain: its effect on amino acids and vitamins in whole wheat. J. Food

Sci., 37, 261-263. 7. IARC, 1993, Monographs on the evaluation of carcinogenic

risks to humans; vol. 56: Some naturally occurring substances, food items and

constituents, heterocyclic aromatic amines and mycortoxins. International Agency for

Researsh on Cancer, World Health Organisation, IARC Press, Lyon, France, 489-521.

8. Joffe AZ, 1978, Fusarium poae and Fusarium sorotrichoides as principal causal

agent of alimentary toxic aleucia. U: Mycotoxic Fungi, Mycotoxins, Mycotoxicosis:

An Enciclopedic Handbook. Vol 3. Marcel Dekker. Inc., New York, 21-86. 9.

Marasas WFO, Nelson PE, Toussoun TA, 1984, Toxigenic Fusarium species. Identity

and myxotoxicology, The Pennsylvania State University Press, University Park and

London. 10. Marković R, Jovanović N, Šefer D, Sinovec Z, 2005, Kontaminacija

smeša za ishranu svinja i živine plesnima i mikotoksinima, I Naučni skup-Mikologija,

mikotoksikologija i mikoze, Novi Sad, 89-95. 11. Mašic Z, Kljajić R, Bocarov-Stančić

Aleksandra, Škrinjar Marija, 2000, Mikotoksini u stočnoj hrani kao faktor poremećaja

zdravlja životinja. Zbornik radova i kratkih sadrzaja, XII Savetovanje veterinara

Srbije, Vrnjačka Banja, 2000, 64-73. 12. Moussing J, Kyrval J, Jensen TK, Aalbaek

B, Buttenschon J, Svensmark B, Willeberg P, 1997, Meat safety concequences of

implementing visual slaughter pigs. Vet. Rec., 140, 472-477. 13. Jelena Nedeljković-

Trailović, 2000, Značaj ohratoksina u veterinarskoj medicini, Zbornik radova Clinica

veterinaria, II Savetovanje iz kliničke patologije i terapije životinja, Budva, 12-16.jun,

2000. 14. Qasem SA, Christensen M, 1958, Influenece of moisture content,

temperature and time on the detorioration of stored corn by fungi. Phytopath., 48, 554-

549. 15. Resanović Radmila, 2000, Značaj aflatoksina u veterinarskoj medicini,


30

Zbornik radova Clinica veterinaria, II Savetovanje iz kliničke patologije i terapije

životinja, Budva, 12-16.jun, 2000. 16. Samson RA, Ellen van Reenen-Hoekstra,

1988, Introduction to food-borne fungi. Centralbureau voor Schimmelcultures, Baarn,

Delft, The Netherlands. 17. SCOOP, 1996, Scientific co-operation on questions

relating to food: Working document in support of a SCF risk assessment of aflatoxin:

Task 3.2.1 (SCOOP/CNTM/1). Task Co-ordinator, UK. 18. Sinovec S, Ivetić V,

Resanović R, Sefer D, Nedeljkovic-Trailovic J, 2001, Pathomorphological alterations

in liver tissue of broilers treated with aflatoxin B1, T-2 toxin and ochratoxin A, XII

International congress WVPA, 379. 19. Sinovec Z, Resanović Radmila, 2005,

Mikotoksini u hrani za životinje - rizik po zdravlje ljudi, Tehnologija mesa, 46, 394-

400. 20. Sinovec Zlatan, Snežana Sinovec, Radmila Resanović, 2006, Mikotoksini,

pojava, efekti i prevencija, Monografija, Fakultet veterinarske medicine Univerziteta u

Beogradu. 21. Šefer D, Jakić-Dimić D, Sinovec Z, 2004, Procena rizika prisustva

mikroorganizama u hrani za životinje. Savetovanje veterinara Srbije, 25. 22. Škrinjar

Marija, Vengušt A, Sunčica Kocić-Tanackoc, 2004, Mikotoksini u hrani-uzorkovanje,

detekcija, zakonski propisi, Tehnologija mesa, 45, 5-6, 163-169. 23. WHO, 1985,

Guidelines for the Study of Dietary Intakes of Chemical Contaminants, WHO Offset

Publication 87, Geneva.


31

5. MONITORING AFLATOKSINA M1 U MLEKU U REPUBLICI SRBIJI

Vera Katić*1

*Univerzitet u Beogradu, Fakultet veterinarske medicine, Bulevar oslobodjenja 18,

Beograd

Kratak sadržaj

Aflatoksini su mikotoksini koje stvaraju plesni Aspergillus flavus i Aspergillus

parasiticus. Grupa aflatoksina se sastoji od aflatoksina B1, B2, G1 i G2. Dotatno, putem

mleka krava, koje su konzumirale hranu za životinje kontaminiranu aflatoksinom B1,

izlučuje se aflatoksin M1 hidroksi metabolit aflatoksina B1.

Zbog kontaminacije kukuruza aflatoksinom B1 u 2012. godini u Republici Srbiji

u narednoj godini je došlo do porasta aflatoksina M1 u mleku. Leto je bilo ekstremno

toplo i suvo, a A. flavus je veoma kompetitivan u uslovima kada je biljka pod stresom.

Kukuruz se uobičajeno koristi u ishrani muznih krava. Stoga je cilj ovog rada bio da

se prikažu rezultati monitoringa aflatoksina M1 u mleku krajem 2012. godine, tokom

2013. godine i prvih šest meseci 2014. godine.

Na prisustvo aflatoksina M1 u mleku ispitano je primenom ELISA metode 32

uzorka mleka uzeta na prijemu u mlekaru u 2012. godini, 66 uzorka mleka u februaru

2013. godine, 341 uzorak uzetih od marta do decembra 2013. godine i 216 uzoraka

mleka uzetih od januara do avgusta meseca 2014. godine.

Rezultati tih ispitivanja su pokazali da je koncentracija aflatoksina M1 u svim

uzorcima sirovog mleka, ispitanim u decembru 2012. godine, bila ispod 0,05 g/kg.

Sadržaj aflatoksina M1 u mleku se u februaru 2013. godine kretao od 0,062 g/kg do

0,25g/kg. Praćenjem trenda nalaza aflatoksina M1 u mleku od marta do kraja 2013.

godine utvrđen je pad koncentracije aflatoksina M1 u mleku. Prosečna vrednost

aflatoksina M1 u mleku u decembru 2013. godine je bila 0,164 g/kg. Trend




32

smanjenja koncentracije aflatoksina M1 u mleku je nastavljen u 2014. godini i, na

kraju prve polovine 2014. godine prosečna koncentracija flatoksina M1 u mleku je bila

manja od 0,05 g/kg.

Ključne reči: mleko, aflatoksin M1, aflatoksin B1, kukuruz

Uvod

Od 1979. godine u Evropskoj uniji se primenjuje, a od 2002. godine Regulativom

EC 178/2002 je zvanično uspostavljen Sistem brzog obaveštavanja i uzbunjivanja za

hranu i hranu za životinje (Rapid Alert System for Food and Feed- RASFF) za

razmenu informacija o direktnom i indirektnom riziku po zdravlje čiji je uzrok hrana i

hrana za životinje kao i, hitne mere i upravljanje u kriznim situacijama. Prema

podacima RASFF (2012) mikotoksini su druga najvažnija opasnost u lancu hrane, i na

osnovu statističkih podataka, procenjuje se da je u 2012. godini oko 15% odnosno 525

od 3516 ukupno prijavljenih slučajeva hrane koja predstavlja opasnost po zdravlje

ljudi u zemljama EU bila prijava prekoračene granice mikotoksina odmah iza prijave

nalaza patogenih mikroorganizama (17%). U 39% od prijavljenih slučajeva nalaz

mikotoksina iznad granice je bio u orasima, proizvodima od oraha i semenkama, u

oko 6% u žitaricama i pekarskim proizvodima, a skoro u 15 % slučajeva je bila

povećana koncentracija aflatoksina u hrani za životinje. Međutim, pet slučajeva visoke

koncentracije aflatoksina M1 u mleku, prijavljenih u 2012. godini, su povećali

zabrinutost da se u zemljama EU, kao posledica porasta aflatoksina B1 u hrani za

životinje, može dogoditi porast aflatoksina M1 u mleku. Jaka suša koja je u 2012.

godini bila u jugoistočnoj Evropi je imala za posledicu porast koncentracije

aflatoksina u kukuruzu.

Mikotoksini su toksični sekundarni metaboliti većeg broja saprofitskih plesni koji

u organizam životinja i ljudi najčešće dospevaju putem hrane kontaminirane sporama,

konidijama i/ili fragmentima micelijuma plesni. Mikotoksini u lanac hrane mogu da

dospeju direktno kao rezultat razmnožavanja plesni i stvaranja toksina ili indirektno,


33

kao što je na primer slučaj sa mlekom krava koje su konzumirale hranu

kontaminiranu mikotoksinima.

Iako je do danas identifikovano preko 300 mikotoksina, utvrđeno je da je samo

oko 20 mikotiotsina po količini i učestalosti nalaza u harani i hrani za životinje

značajno sa gledišta bezbednost hrane. Najveći broj tih toksina stvaraju plesni iz

rodova Aspergillus, Penicillium i Fusarium (Kurtzman i sar. 1987). Najčešće dokazani

mikotoksini u hrani su aflatoksini (B1, B2, G1, G2 i M1), ohratoksin A, patulin, citrin,

sterigmatocistin i fuzarium toksini označeni kao fumonizini (B1, B2 i B3), zeralenon,

T-2 i HT-2 toksini, nivalenol i deoksinivalenol.

Mikotoksini značajniji sa gledišta bezbednosti hrane su otporni na delovanje

različitih tehnoloških procesa. Tokom procesa proizvodnje hrane plesni mogu da budu

uništene, dok toksini u najvećem broju slučajeva ostaju u hrani. Početkom 2013.

godine u Republici Srbiji zabeleženi su prvi slučajevi porasta aflatoksina M1 u mleku.

Leto je bilo izuzetno toplo i suvo, a zrna kukuruza su bila oštećena kao posledica

velike aktivnosti insekata. Uslovi kada je biljka pod stresom pogoduju razmnožavanju

A. flavus i stvaranju mikotoksina. Kukuruz je na prostorima Republike Srbije

značajno zastupljen u hrani za muzne krave i budući da je došlo do porasta aflatoksina

B1 u kukruruzu posledično tome došlo je i do porasta aflatoksina M1 u mleku. U

narednoj godini primenjene su mere koje su trebale da dovedu do smanjenja

aflatoksima M1 u mleku. Stoga je cilj ovog rada bio da se prikažu rezultati

monitoringa aflatoksina M1 u mleku krajem 2012. godine, tokom 2013. godine i prvih

šest meseci 2014. godine.

Kontaminacija mleka aflatoksinom M1

Aflatoksin M1 predstavlja 4-hidroksi metabolit aflatoksina B1 i od njega se

strukturno razlikuje po prisustvu OH grupe na furanovom prstenu. Pored aflatoksina

M1 mlekom se izlučuju i aflatoksin M2 metabolit aflatoksina B2 i aflatoksin M4 drugi

hidroksi-metabolit aflatoksina B1. Sa gledišta bezbednosti mleka i proizvoda od mleka


34

najznačajniji je aflatoksin M1. Količina aflatoksina M1 u mleku se kreće od 0,3 do 6%

unetog aflatoksina B1 u organizam životinje (Van Egmond i Dragacci, 2001, EFSA,

2004). Prema podacima iz literature aflatoksin M1 se može dokazati u mleku krava

12 do 24 časa od konzumiranja hrane koja sadrži visok nivo aflatoksina B1. Ukoliko

se hrana sa povećanim sadržajem aflatoksina B1 ukloni iz ishrane muznih životinja

nivo aflatoksina M1 u mleku se smanjuje za 1 - 4 dana. Konverzija aflatoksina B1 u

aflatoksin M1 zavisi od proizvodnih karakteristika muznih životinja i veća je kod

krava sa visokom proizvodnjom mleka, pa kod krava sa dnevnom proizvodnjom

mleka do 40 litara može biti i 6,2%.

Kontaminacija kukuruza plesnima može nastati pre berbe i za vreme skladištenja

u silosima (Lewis i sar. 2005; Hall i sar. 1989). Razmnožavanju plesni i stvaranju

mikotoksina pogoduju visoke temperature, sušni periodi kao i velika aktivnost

insekata koji dovode do oštećenja zrna kukuruza. Visoka vlažnost i temperatura u

silosima pogoduju stvaranju aflatoksina tokom skladištenja. Optimalni uslovi za

razmnožavanje plesni koje stvaraju aflatoksine, Aspergillus flavus i Aspergillus

parasiticus, su 14-30% vlage i temperatura od 25C. Ove plesni se slabo

razmnožavaju pri temperaturama nižim od 12 C i višim od 41C. I žitarice kod kojih

plesni nisu vidljive mogu da sadrže visok nivo aflatoksina. U novijim ekološkim

studijama, izvedenim sa Aspergillus flavus, izolovanim iz kukuruza je utvrđeno da se

ova plesan najbolje razmnožava pri temperaturama 25°C i 30°C, a aflatoksin B1 stvara

pri temperaturi od 25°C. Optimalna aktivnost vode (aw), za razmnožavanje plesni i

stvaranje aflatoksina je 0.99, a u uslovima niske aktivnosti vode (0,83) je utvrđeno

samo stvaranje aflatoksina B1 (Pietri and Piva, 2007).

Uticaj aflatoksina M1 na zdravlje ljudi

Ima malo informacija o mogućim negativnim efekatima aflatoksina M1 na

zdravlje ljudi. Sproveden je ograničeni broj ispitivanja na eksperimentalnim

životinjama sa ciljem da se utvrdi toksičnost i kancerogenost aflatoksina M1. Rezultati

iz tih studija su pokazali da aflatoksin M1 ima hepatotoksični i hepatokarcinogeni


35

potencijal. Akutna toksičnost aflatoksina M1 je slična ili nešto manja od toksičnosti

aflatoksina B1, a kancerogeni potencijal aflatoksina M1 je jedan ili dva reda veličine

manji od kancerogenog potencijala aflatoksina B1. Aflatoksin M1 se ne nalazi samo u

mleku životinja koje se stavlja u promet već i u majčinom mleku. Međunarodna

agencija za istraživanje raka (International Agency for Research on Cancer- IACR) je

na osnovu utvrdjenih hepatotoksičnih i kancerogenih efekata klasifikovala aflatoksin

B1 kao kancerogen za ljude (grupa 1) a aflatoksin M1 je zbog ograničenog broja

podataka bio klasifikovan kao mogući karcinogen (grupe 2A) (IARC, 1993). U

novijim istraživanjima je potvrđena sinergistička kancerogena interakcija hronične

infekcije hepatitisa virusa B i aflatoksina M1 u zemljama sa visokom incidencom

hepatokarcinoma (Caloni et al., 2006). Na osnovu tih i drugih istraživanja IARC je

preklaskifikovao aflatoksin M1 iz grupe 2A (mogućih kancerogena) u grupa 1

kancerogena za ljude (IARC, 2002).

Uticaj postupaka prerade mleka u proizvode na nalaz aflatoksina M1

Aflatoksin M1 je otporan na režime toplotne obrade koja se koristi pri preradi

mleka u proizvode (Yousef i Marth, 1989; Galvano i sar, 1996). U pasterizovanom

mleku, gotovo da ne dolazi do smanjenja koncentracije aflatoksina M1. Utvrđeno je

neznatno smanjenje aflatoksina M1 u sterilizovanom mleku nakon dužeg skladištenja

(Galvano i sar. 1996; Martins i Martins, 2000; Tekinsen i Eken, 2008). U više studija

je utvrđeno da je aflatoksin M1 vezan za proteine mleka (Kamkar i sar 2008;

Mendonca i Venancio, 2005; Prandin i sar, 2009), uglavnom kazein, pa je stoga

koncentracija aflatoksina u siru veća nego u mleku upotrebljenom za njegovu

proizvodnju. Koncentracija aflatoksina M1 je 2,5 do 3,3 puta veća u mekim sireva i

3.9 do 5,8 puta veća u tvrdim sirevima nego u mleku od kojeg su sirevi proizvedeni.

Koncentracija aflatoksina M1 u siru zavisi od tipa sira, sadržaja vode u siru i postupka

proizvodnje sira. U mekim sirevima je 2,5 do 3,3 puta veća a u tvrdim sirevima je 3.9

do 5,8 puta veća u nego u mleku od kojeg su sirevi proizvedeni (Bakirci, 2001; López


36

i sar., 2001). Aflatoksina M1 je neravnomerno raspoređen između surutke i grude kao

posledica njegovog vezivanja za proteina mleka. Najveća koncentracija ovog

mikotoksina je u grudi, bez obzira na postupak proizvodnje sira (Colak, 2007; Kamkar

i sar, 2008; Motavee i McMahon, 2009; Deveci i sar. 2007; Manetta i sar, 2009).

Prema rezultatima Motavee i sar. (2009) i Deveci i sar. (2007) približno 60%

aflatoksina M1 iz mleka prelazi u grudu. Kamkar i sar. (2008) su utvrdili da je

koncentracija aflatoksina M1 u grudi tri puta veća nego u surutki. Napred navedeni

rezultati pokazuju da se oko polovina aflatoksina M1 iz mleka prenese u sir (Oruč et

al, 2006; Čolak, 2007).

Zakonska regulativa

Mikotoksini u hrani i hrani za životinje predstavljaju problem u celom svetu, pa

najveći broj zemalja, više od 60 zemalja, ima propisane granične vrednosti za

mikotoksine u hrani (FAO, 2004). Zbog kancerogenog potencijala aflatoksina, njihov

unos putem hrane treba da bude što manji pa su propisi, koji se odnose na aflatoksine

u hrani, postavljeni na principu ALARA (As Low As Reasonable Achievable),

posebno kada je u pitanju hrana za najmlađu populaciju (Völkel i sar. 2011).

Svetska zdravstvena organizacija (SZO) i Organizacija za hranu i poljoprivredu

(Food and Agriculture Organization - FAO) su 2004. godine zatražile od naučnog

savetodavnog tela (The joint Expert Committee on Food Additives -JECFA) da ispita

izloženost aflatoksinu M1 i sprovede kvantitativnu procenu rizika poredeći primenu

dva standarda za kontaminaciju mleka (0,05 g/kg i 0,5g/kg), koji se trenutno

primenjuju u EU i u SAD. Rezultati procene rizika su pokazali u pretpostavci

najgoreg slučaja da je razlika u riziku od pojave raka jetre, kada se koriste granice za

aflatoksin M1 od 0,05 g/kg i 0,5 g/kg veoma mala, i da ne postoji značajna korist za

zdravlje ljudi ako se granica za aflatoksin M1 smanji sa 0,5 g/kg na 0,05 g/kg (Van

Egmond i Konker, 2004).

U Republici Srbiji u Pravilniku o dopuni pravilnika o maksimalno dozvoljenim

količinama ostataka sredstava za zaštitu bilja u hrani i hrani za životinje i o hrani i


37

hrani za životinje za koju se utvrđuju maksimalno dozvoljene količine ostataka

sredstava za zaštitu bilja (Sl. glasnik RS 28/11) data je granična vrednost od

0,05g/kg aflatoksina M1 za mleko, termički obrađeno mleko i mleko namenjeno za

preradu u proizvode koja je upotpunosti bila usaglašena sa Regulation EC

(1881/2006). Kada je nastala kriza nalaza aflatoksina M1 u mleku početkom 2013.

godine povećana je granična vrednost za nalaz aflatoksina M1 u mleku na 0,5 g/kg

(Pravilnik o dopuni pravilnika o maksimalno dozvoljenim količinama ostataka

sredstava za zaštitu bilja u hrani i hrani za životinje i o hrani i hrani za životinje za

koju se utvrđuju maksimalno dozvoljene količine ostataka sredstava za zaštitu bilja

(Sl. glasnik RS 28/11, 20/2013). Na osnovu rezultata monitoringa nalaza aflatoksina

M1 u mleku tokom 2013. godine i u prvoj polovini 2014. godine smanjena je granična

vrednost za aflatoksin M1 u mleku na 0,25 g/kg (Sl. glasnik RS 72/14).

Većina zemalja nema definisane granice za nalaz aflatoksina M1 u proizvodima od

mleka. U zemljama EU i Sjedinjenim američkim državama primenjuje se strategija

koja se zasniva na pretpostavci da će stroga kontrola mleka na prisustvo aflatoksina

M1 sprečiti da se ovaj mikotoksin nadje u proizvodima od mleka. Uspostavljanje i

poštovanje limita za nalaz aflatoksina B1 u hrani za životinje treba da osigura

proizvodnju mleka bezbednog za konzumiranje kada je aflatoksin M1 u pitanju. Neke

zemlje koje imaju dobro razvijenu proizvodnju sira su u cilju zaštite svoje proizvodnje

definisale granice za aflatoksin M1 za različite tipove sira. Većina zemalja je

uspostavila granicu za aflatoksin M1 u siru od 0,25 μg/kg, što odgovara pretpostavci

da je sir napravljen od mleka koje je u skladu sa propisima (npr: kontaminacija mleka

na nivou ispod 0,05 μg/kg), a da se pri tome, zbog dehidracije, koncentracija

aflatoksina M1 poveća do 5 puta. U Italiji da bi zaštitili proizvodnju parmezana

granica za aflatoksin M1 je postavljena na 0,45 μg/kg tvrdog sira (Italian Health

Department, 2004)

Materijal i metode rada


38

Na prisustvo aflatoksina M1 u mleku ispitano je primenom ELISA tehnike 32

uzorka mleka, uzeta na prijemu u mlekaru u 2012 godini, 66 uzorka mleka u februaru

2013. godine, 341 uzorak uzetih od marta do decembra 2013. godine i 216 uzoraka

mleka uzetih od januara do avgusta meseca 2014. godine. Uzorci mleka su poticali iz

različitih delova Republike Srbije.

Monitoring aflatoksina M1 u mleku u periodu od 2012 do 2014. godine

Planom monitoringa za 2012. godinu je bilo predvidjeno ispitivanje sirovog mleka

i proizvoda od mleka dva puta godišnje na prisustvo aflatoksina M1. Rezultati tih

ispitivanja pokazuju da ni u jednom od 32 uzorka sirovog mleka u mlekari koja

otkupljuje oko 500.000 litara mleka dnevno nije utvrđeno prisustvo aflatoksina M1

iznad 0,05 g/kg (tabela 1).

Tabela. 1. Rezultati monitoringa aflatoksina M1 u mleku krava u decembru 2012.

godine

Datum Linija

dovo

za

Aflatoksin

M1

(g/k)

Datum Linija

dovo

za

Aflatoksin

M1

(g/k)

10.12.2012. 1 0,05 13.12.2012. 17 0,05

10.12.2012. 2 0,05 13.12.2012. 18 0,05

10.12.2012. 3 0,05 13.12.2012. 19 0,05

10.12.2012. 4 0,05 13.12.2012. 20 0,05

10.12.2012. 5 0,05 13.12.2012. 21 0,05

10.12.2012. 6 0,05 13.12.2012. 22 0,05

10.12.2012. 7 0,05 13.12.2012. 23 0,05

10.12.2012. 8 0,05 13.12.2012. 24 0,05

10.12.2012. 9 0,05 13.12.2012. 25 0,05

10.12.2012. 10 0,05 13.12.2012. 26 0,05

10.12.2012. 11 0,05 13.12.2012. 27 0,05

10.12.2012. 12 0,05 13.12.2012. 28 0,05

10.12.2012. 13 0,05 13.12.2012. 29 0,05

10.12.2012. 14 0,05 13.12.2012. 30 0,05

10.12.2012. 15 0,05 13.12.2012. 31 0,05

10.12.2012. 16 0,05 13.12.2012. 32 0,05


39

Budući da je početkom 2013. godine utvrđen porast aflatoksina B1 u kukuruzu

očekivalo se da je povećana količina aflatoksina B1 u hrani za životinje i posledično

tome u mleku. Stoga je započeto sa primenom monitoringa u vanrednim situacijama

što je podrazumevalo da se primenom skrining metoda ispituju svakog dana uzorci

mleka sa svakog sabirnog mesta i iz svakog transportnog vozila. Rezultati određivanja

aflatoksina M1 u mleku u februaru 2013. godine prikazani su u tabeli 2.

Tabela. 2. Rezultati monitoringa aflatoksina M1 u mleku krava u februaru 2013.

godine

Datum Linija

dovo

za

Aflatoksin

M1

(g/kg)

Datum Linija

dovo

za

Aflatoksin

M1

(g/kg)

11.02.2013. 1 0,207 17.02.2013. 1 0,213

11.02.2013. 2 0,201 17.02.2013. 2 0,183

11.02.2013. 3 0,25 17.02.2013. 3 0,25

11.02.2013. 4 0,25 17.02.2013. 4 0,25

11.02.2013. 5 0,25 17.02.2013. 5 0,25

11.02.2013. 6 0,25 17.02.2013. 6 0,25

11.02.2013. 7 0,178 17.02.2013. 7 0,213

11.02.2013. 8 0,234 17.02.2013. 8 0,223

11.02.2013. 10 0,25 17.02.2013. 10 0,209

11.02.2013. 11 0,168 17.02.2013. 11 0,194

11.02.2013. 12 0,122 17.02.2013. 12 0,136

11.02.2013. 13 0,153 17.02.2013. 13 0,25

11.02.2013. 14 0,105 17.02.2013. 14 0,181

11.02.2013. 15 0,083 17.02.2013. 15 0,089

11.02.2013. 17 0,25 17.02.2013. 17 0,25

11.02.2013. 18 0,201 17.02.2013. 18 0,216

11.02.2013. 19 0,194 17.02.2013. 19 0,213

11.02.2013. 20 0,233 17.02.2013. 20 0,25

11.02.2013. 21 0,25 17.02.2013. 21 0,25

11.02.2013. 22 0,25 17.02.2013. 22 0,25

11.02.2013. 25 0,25 17.02.2013. 25 0,25

11.02.2013. 28 0,195 17.02.2013. 28 0,156

11.02.2013. 29 0,198 17.02.2013. 29 0,188

11.02.2013. 30 0,173 17.02.2013. 30 0,173


40

11.02.2013. 31 0,062 17.02.2013. 31 0,078

11.02.2013. 32 0,225 17.02.2013. 32 0,223

11.02.2013. 33 0,25 17.02.2013. 33 0,25

11.02.2013. 34 0,25 17.02.2013. 34 0,25

11.02.2013. 35 0,205 17.02.2013. 35 0,248

11.02.2013. 36 0,25 17.02.2013. 36 0,25

11.02.2013 37 0,186 17.02.2013. 37 0,134

11.02.2013 38 0,151 17.02.2013. 38 0,218

U svaih 76 uzoraka mleka utvrđeno je prisustvo aflatoksina M1 iznad granice

(0,05 g/kg). Sadržaj aflatoksina se kretao od 0,062 g/kg koliko je izmereno u

uzorku 31 do 0,25g/kg koliko je izmereno u 25 (75,76%) uzoraka mleka. Budući

da je sadržaj aflatoksina M1 u svim uzorcima mleka bio iznad granice (0,05 g/kg) u

cilju očuvanja proizvodnje mleka granica za aflatoksina M1 u mleku je pomerena sa

0,05g/kg na 0,5 g/kg. Rezultati ispitivanja uzoraka mleka posle uspostavljanja nove

granice za aflatoksin M1 u sirovom mleku su pokazali da je od marta do decembra

sadržaj aflatoksina M1 bio ispod 0,5 g/kg (grafikon 1).

0,286

0,204

0,4160,446

0,268

0,164 0,176

0,284

0,218

0,154

0,233

0,164

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

0,450

0,500

14.03.2

013.

18.03.2

013.

17.04.2

013.

21.04.2

013.

09.05.2

013.

24.07.2

013.

20.0820

13.

09.09.2

013.

30.09.2

013.

16.10.2

013.

12.11.2

013.

09.12.2

013.

Prosečan sadržaj aflatoksina M1 u sirovom mleku po mesecima za 2013. godinu

Linear (Prosečan sadržaj aflatoksina M1 u sirovom mleku po mesecima za 2013.godinu)


41

Grafikon 1. Prosečan sadržaj aflatoksina M1 u sirovom mleku po mesecima za 2013.

godinu

U cilju smanjenja nalaza aflatoksina M1 u mleku primenjene su mere kao što su:

isključivanje iz ishrane krava hrane sa povećanom koncentracijom aflatoksina B1 i

dodavanje adsorbenata u hranu za životinje. Primena ovih mera dala je rezultate samo

u martu 2013. godine. Povećanje granice za aflatoksine u mleku sa 0,05g/kg na

0,5g/kg je imalo za posledicu nedoslednu primenu predloženih mera i koncentracija

aflatoksina M1 u mleku je u aprilu mesecu ponovo porasla na vrednosti blizu nove

granične vrednosti (0,416 i 0,446 g/kg). Analizom dobijenih rezultata u mlekari je

zaključeno da je potrebno da se nastavi sa primenom mera za smanjenje nalaza

aflatoksina M1 u mleku. Rezultati dobijeni od maja meseca pa do kraja 2013. godine

su pokazali trend smanjenja koncentracije aflatoksina u mleku. Taj trend je nastavljen

i u prvoj polovini 2014. godine (grafikon 2).

0,127

0,053

0,082

0,0610,052

0,068

0,047 0,050

0,000

0,020

0,040

0,060

0,080

0,100

0,120

0,140

Januar Februar Mart April Maj 3.јун 1.јул 1. avgust

Prosečna vrednost aflatoksina M1 µg/kg u sirovom mleku po mesecima

Linear (Prosečna vrednost aflatoksina M1 µg/kg u sirovom mleku pomesecima)

Grafikon 2. Prosečan sadržaj aflatoksina M1 u sirovom mleku po mesecima za 2014.

godinu


42

Od janura 2014. godine do početka avgusta 2014. godine sadržaj aflatoksina M1 u

mleku je smanjen sa 0,127 g/kg na 0,050 g/kg.

Zaključno razmatranje

Nalaz mikotoksina u mleku i proizvodima od mleka može se smanjiti

kombinacijom dobre poljoprivredne prakse, kontrolom uslova skladištenja hrane za

životinje i praćenjem nalaza mikotoksina u svim fazama proizvodnje. Praćenje nalaza

aflatoksina B1 u hrani za životinje i isključivanje iz ishrane muznih krava hrane koja

sadrži veću količinu aflatoksina B1 treba da doprinese smanjenju nalaza aflatoksina

M1 u mleku. Praćenje nalaza aflatoksina M1 u mleku sa farmi i analiza dobijenih

rezultata treba da pomogne u rešavanju problema. U cilju dobijanja što

reprezentativnijih rezultata o nalazu mikotoksina u hrani Komisija Evropske unije je

donela Commission Regulation (EC) No 401/2006 u kojoj su definisane metode

uzimanja uzoraka i ispitivanje hrane za potrebe službene kontrole u okviru koje je

definisano i uzimanje uzoraka mleka i proizvoda od mleka. Međutim, ni u jednom

dokumentu nije propisana učestalost uzimanja uzoraka i ispitivanja. Učestalost

uzorkovanja treba planirati prema proceni verovatnoće nalaza aflatoksina B1 u hrani

za životinje. Praćenjem nalaza aflatoksina M1 u mleku sa farmi i, sprečavanjem

upotrebe mleka sa povećanim sadržajem aflatoksina M1 u daljoj preradi mleka,

osigurava se bezbednost mleka i proizvoda od mleka kada su mikotoksini u pitanju.

Literatura

Bakirci I. 2001. A study on the occurrence of aflatoxin M1 in milk and milk

products produced in Van province of Turkey. Food Control, 12, 47-51. 2. Caloni F,

Stammati A, Friggé G, De Angelis I. 2006. Aflatoxin M1 absorption and cytotoxicity

on human intestinal in vitro model Toxicon Vol. 47, pp. 409–415, ISSN 0041-0101. 3.

Colak H. 2007. Determination of Aflatoxin M1 Levels in Turkish White and Kashar

Cheeses Made of Experimentally Contaminated Raw Milk Journal of Food and Drug

Analysis, Vol. 15, No. 2, pp. 163-168 ISSN 10219498. 4. Commission Regulation

(EC) № 1881/2006 of 19 De- cember 2006 Setting Maximum Levels for Certain Con-


43

Taminants in Foodstuffs, Official Journal of the Euro-pean Union, Series L, No. 364,

2006, 5-24. 5. Deveci O. 2007. Changes in the concentration of aflatoxin M1 during

manufacture and storage of White Pickled cheese. Food Control Vol. 18, 1103–1107,

ISSN 0956- 7135. 6. EFSA. 2004. Opinion of the Scientific Panel on Contaminants in

Food Chain on a Request From the Commission Related to Aflatoxin B1 as

Undesirable Substance in Animal Feed. Request № EFSA-Q-2003-035, The EFSA

Journal, No. 39, 2004, 1-27. 7.

FAO.(2004).http://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=FAO+Worldwide+Regulation

s+for+Mycotoxins+++A+Compendium+&source=web&cd=1&ved=0CFEQFjAA&url

=http%3A%2F%2Fwww.fao.org%2Fdocrep%2F007%2Fy5499e%2Fy5499e0o.htm&;

ei=HzKoT9DIAoav6AHJ8fTCBA&usg=AFQjCNFdDOvQd0_hkjAnqRT8u2o6hP6uS

A. 8. Farkas J, Beczner J. Moh´acsi-Farkas Cs. 2011, Potential impact of the climate

change on the risk of mycotoxin contamination of agricultural products in Southeast

Central Europe. Acta Univ. Sapientiae, Alimentaria, 4, 89–96. 9. Galvano F, Galofaro

V, Galvano, G. 1996. Occurrence and stability of aflatoxin M1 in milk and milk

products: A Worldwide Review. Journal of Food Protection Vol.59, pp. 1079-1090,

ISSN 0362-028X. 10. Hall RF, Harrison LR. and Colvin BM. 1989. Aflatoxico-sis in

Cattle Pastured in a Field of Sweet Corn, Journal of the American Veterinary Medical

Association, Vol. 194, No. 7, 938. 11. Iha Maria Helena, Barbosa Cynara Baltazar,

Barbosa Isaura Akemi Okada, Trucksess W. Mary. 2013. Aflatoxin M1 in milk and

distribution and stability of aflatoxin M1 during production and storage of yoghurt and

cheese. Food Control 29 1-6. 12. International Agency for Research on Cancer. 1993.

Monographs on the evaluation of thecarcinogenic risk of chemicals to humans: some

naturally occurring substances, food items and constituents, heterocyclic aromatic

amines and mycotoxins; Vol. 56, 397-344 IARC, Lyon, France. 13. International

Agency for Research on Cancer. 2002. Monograph on the Evaluation of carcinogenic

risks in humans: Some Traditional Herbal Medicines, Some Mycotoxins, Naphthalene

and Styrene; Vol. 82, pp. 171–274 IARC, Lyon, France. 14. Italian Health Department

(2004) Sampling and analytical methods for aflatoxin detection in cheese (24 August


44

2004) D.G.V.A/IX/25664/f.5.b.b.2/P. 15. Kamkar A, Karim G, Aliabadi FS, Khaksar

R. 2008. Fate of aflatoxin M1 in Iranian white cheese processing. Food and Chemical

Toxicology Vol. 46, 2236–2238 ISSN 0278-6915. 16. Kurtzman CP, Horn BW,

Hesseltine CW. 1987. Aspergillus nomius, a new aflatoxin-producing species related to

Aspergillus flavus and Aspergillus tamarii. Antonie van Leeuwenhoek, 53:147-58. 17.

López, C., Ramos, L. L., Ramadán, SS, Bulacio L C, & Perez, J. (2001). Distribution

of aflatoxin M1 in cheese obtained from milk artificially contaminated. International

Journal of Food Microbiology, 64, 211-215. 18. Lewis L, Onsongo M, Njapau H,

Schurz-Rogers H, Luber G, Kieszak S, Nyamongo J, Backer L, Dahiye AM, Misore

A, DeCock K, Rubin C. and the Kenya Aflatoxico- sis Investigation Group. 2005.

Aflatoxin Contamination of Commercial Maize Products During an Outbreak of Acute

Afla-toxicosis in Eastern and Central Kenya. Environmental Health Perspectives, Vol.

113, No. 12, 1763-1767. 19. Manetta AC, Giammarco M, Di Giuseppe L, Fusaro I,

Gramenzi A, Formigoni A, Vignola G, Lambertini L. 2009. Distribution of aflatoxin

M1 during Grana Padano cheese production from naturally contaminated milk. Food

Chemistry Vol.113, 595–599, ISSN 0308-8146. 20. Martins ML, Martins HM. 2000.

Aflatoxin M1 in raw and ultra high temperature-treated milk commercialized in

Portugal. Food Additives & Contaminants: Part A Vol. 17, No.10, pp. 871- 874, ISSN

0265-203X. 21. Martins ML, Martins HM. 2004. Aflatoxin M1 in yogurts in Portugal.

International Journal of Food Microbiology Vol. 91, No. 3 (March 2004), pp. 315-317,

ISSN 0168-1605. 22. Motawee MM, McMahon DJ. 2009. Fate of aflatoxinM1 during

Manufacture and Storage of Feta Cheese. Toxicology and Chemical Food Safety Vol

74, No. 5, 42-45 ISSN 0278-6915. 23. Pietri Amedeo and Piva Gianfranco. 2007.

Aflatoxins in foods, Italian Journal of Public Health, Vol. 4, No 1, 32-38. 24. Tangni

EK, Pussemier L. and Van Hove F. 2013. Mycotoxin Contaminating Maize and Grass

Silages for Dairy Cattle Feeding: Current State and Challenges. J Anim Sci Adv 2, 3

(10): 492-511. 25. Tekinsen KK, Eken HS. 2008. Aflatoxin M1 levels in UHT milk

and kashar cheese consumed in Turkey. Food and Chemical Toxicology Vol. 46, pp.

3287–3289, ISSN 0278-6915. 26. Van Egmond, H.P.; Dragacci, S .(2001) Liquid


45

Chromatographic Method for Aflatoxin M1 in Milk. In: Methods in Molecular

Biology, Vol 157 Mycotoxin Protocols II. M.W. Trucksess; A.E. Pohland (Ed) 59-69

Humana Press, ISBN 0-89603-623-5, Totowa (NJ), United States. 27. Van Egmond

HP, Konker MA. 2004. Current regulations governing mycotoxin limits in food. In:

Magan N, Olsen M, editors. Mycotoxins in foods. Detection and Control. Cambridge:

Woodhead Publishing Limited, 49-68. 28. Völkel Inger, Schröer-Merker Eva, Czerny

Claus-Peter . 2011. The Carry-Over of Mycotoxins in Products of Animal Origin with

Special Regard to Its Implications for the European Food Safety Legislation. Food and

Nutrition Sciences, 2, 852-867.

MONITORING OF AFLATOXIN M1 IN MILK IN SERBIA

Summary

Aflatoxins are mycotoxins produced by Aspergillus flavus and Aspergillus

parasiticus. The aflatoxin group is comprised of aflatoxin B1, B2, G1 and G2. In

addition, aflatoxin M1 a hydroxylated metabolite of AFB1, is excreted in the milk

of dairy cows consuming an aflatoxin B1-contaminated ration. Because of

aflatoxin B1 contamination of maize in 2012 in the Republic of Serbia in the

following year there was an increase of aflatoxin M1 in milk. The summer was

extremely hot and dry and A. flavus is very competitive under these conditions as

the plants are stressed. Maize grain is normally utilized in the food supply for

dairy cows and as such led to the severe and widespread contamination of milk

with aflatoxin M1.

Therefore, the aim of this paper is to review the results of the monitoring

of aflatoxin M1 in milk at the end of 2012, during 2013 and the first six months of

2014.

The presence of aflatoxin M1 were tested in 32 samples of milk taken at a

reception at the dairy in 2012, 66 samples of milk in February 2013, 341 samples


46

from March to December 2013 and 216 samples of milk taken from January to

August 2014, with the ELISA technique.

All samples analyzed for aflatxin in milk in December 2012. were

compliant according to limit 0,05g/kg . The content of aflatoxin M1 in milk in

February 2013 ranged from 0,062g/kg to 0,25 g/kg ples. By following the

trend findings of aflatoxin M1 in milk from March to the end of 2013 was

determined lack of concentration of aflatoxin M1 in milk. The average value of

aflatoxin M1 in milk in December 2013 was 0,164 g/kg. The trend of decreasing

concentrations of aflatoxin M1 in milk was continued in 2014, and at the end of

the first half of 2014, the average concentration flatoksina M1 in milk was less

than 0,05g/kg.

Key words: milk, aflatoxin M1, aflatoxin B1, maize


47

6. ANALITIČKE METODE ZA ODREĐIVANJE AFLATOKSINA U HRANI I

HRANI ZA ŽIVOTINJE

S. Stefanović*1, Jelena Nedeljković Trailović

**, Vera Katić

**, D. Milićević

*, S.

Janković*, Tatjana Radičević

*, Mirjana Dimitrijević

**

*Institut za higijenu i tehnologiju mesa, Kaćanskog 13, Beograd

**Fakultet veterinarske medicine, Bulevar oslobođenja 18, Beograd

Kratak sadržaj

Aflatoksini predstavljaju grupu hemijski srodnih mikotoksina, sekundarnih

metabolita toksikogenih plesni roda Aspergillus. Uneti u organizam, ovi molekuli

ispoljavaju niz štetnih bioloških aktivnosti, uključujući akutnu i hroničnu toksičnost,

teratogenost, mutagenost i karcinogenost. Stoga su u većini zemalja na snazi propisi

koji postavljaju maksimalno dozvoljene količine za prisustvo aflatoksina u hrani i

hrani za životinje. Međutim, poštovanje ovih propisa ne bi bilo izvodljivo bez

postojanja adekvatnih analitičkih metoda za kvantitativno određivanje aflatoksina u

hrani i hrani za životinje. Cilj ovog rada je kratak osvrt na istorijat, kao i sagledavanje

trenutnog stanja u oblasti analitičke metodologije za određivanje aflatoksina

korišćenjam različitih analitičkih tehnika, poređenje njihovih performansi i

sagledavanje sposobnosti analitičkih alata današnjice da odgovore na rigorozne

zahteve regulatornih tela u pogledu parametara koje metoda mora da ispuni da bi

mogla da se koristi u svrhe službenih kontrola.

Osnovna podela analitičkih tehnika na trijažne i konfirmatorne (potvrđujuće)

predstavlja osnov za racionalnu sistematizaciju i objektivno sagledavanje prednosti i

mana svake od metoda koje se koriste u današnje vreme za određivanje aflatoksina.

Pored hromatografije na tankom sloju, koja danas ima uglavnom istorijski značaj,

posebna pažnja biće posvećena ELISA tehnici sa velikim brojem metoda kao




48

najznačajnijoj trijažnoj tehnici, kao i tečnoj hromatografiji sa fluorescentnom

detekcijom i tečnoj hromatografiji kuplovanoj sa masenom spektrometrijom kao

konfirmatornim tehnikama na kojima se zasniva veoma veliki broj analitičkih metoda

koje se koriste u laboratorijama širom sveta za kvantitativno određivanje aflatoksina.

Uporedni prikaz prednosti i nedostataka svake od navedenih tehnika omogućava

objektivno sagledavanje stanja u analitici aflatoksina u cilju racionalnog odabira

adekvatne metode za određivanje ovih jedinjenja i dobijanja pouzdanih rezultata

analize.

Ključne reči: Aflatoksin B1, Aflatoksin M1, ELISA, HPLC, LC-MS/MS, analitičke

metode

1. Aflatoksini

Aflatoksini predstavljaju grupu hemijski srodnih mikotoksina, sekundarnih

metabolita toksikogenih plesni roda Aspergillus. Ovi organizmi su ubikvitarni i

pretežno se nalaze na hrani i hrani za životinje, razmnožavajući se na poljima ili

tokom njenog skladištenja. Ova jedinjenja ne igraju nikakvu ulogu u sopstvenom

metabolizmu rastu i razvoju plesni (Moss, 1991) – te otuda i naziv “sekundarni”.

Međutim, uneti u organizam životinja ili čoveka, ovi molekuli ispoljavaju niz

bioloških aktivnosti, uključujući akutnu i hroničnu toksičnost, teratogenost,

mutagenost i karcinogenost (McLean i Dutton, 1995). Zato su ova jedinjenja svrstana

u grupu najznačajnijih mikotoksina. Njihovo prisustvo u organizmu životinja i

primarnim proizvodima animalnog porekla uzrokuje direktne i indirektne štete koje se

ogledaju u narušavanju zdravlja, padu produktivnosti i posledično velikim

ekonomskim gubicima. Iako je prema literaturnim podacima (McLean i Dutton, 1995)

u ranijem periodu bilo izolovano 17 jedinjenja koja se prema hemijskoj strukturi

svrstavaju u aflatoksine, taj broj nije konačan; drugi autori prijavljuju preko 20

jedinjenja (Hussein i Brasel, 2001). Ipak, ovaj termin se u praktičnom kontekstu

prevashodno odnosi na četiri jedinjenja koje produkuju plesni A. flavus i A.

parasiticus – aflatoksin B1 (AfB1), aflatoksin B2 (AfB2), aflatoksin G1 (AfG1) i


49

aflatoksin G2 (AfG2), kao i na najznačajniji metabolit AfB1 koji se izlučuje mlekom,

aflatoksin M1 (AfM1). Na osnovu hemijske strukture, ova jedinjenja predstavljaju

dihidro ili tetrahidrofuranske grupe vezane za kumarinski prsten. Aspergillus flavus

proizvodi AfB1 i AfB2 dok je Aspergillus parasiticus odgovoran za produkciju sva

četiri aflatoksina (B1, B2, G1 i G2) (D’ Mello i MacDonald, 1997). Kao i ostala

heterociklična jedinjenja, i aflatoksini imaju sposobnost nativne fluorescencije

(Sargeant i sar, 1963), te poreklo njihovih oznaka vodi iz ove činjenice. Naime, AfB1 i

AfB2 emituju plavu svetlost kada su sami osvetljeni ultraljubičastom svetlošću talasne

dužine od 366 nm (engl. blue = plavo) dok AfG1 i AfG2 fluoresciraju žuto-zelenom

svetlošću (engl. green = zeleno). Ovakve fizičko-hemijske osobine su ujedno bile i

osnova za razvoj većeg broja metoda za kvalitativno i kvantitiativno određivanje

sadržaja aflatoksina u hrani i hrani za životinje.

Imajući u vidu veliki značaj aflatoksina na globalnom nivou, velike direktne i

indirektne materijalne gubitke, kao i neposredno ugrožavanje zdravlja ljudi i životinja,

svedoci smo višedecenijskih napora naučne zajednice i regulatornih tela nacionalnog i

nadnacionalnog karaktera, u cilju utvrđivanje maksimalno dozvoljenih količina AfB1 i

AfM1 u cilju zaštite zdravlja ljudi i životinja. Međutim, bez obzira na adekvatnu

naučnu zasnovanost i obrazloženja regulatornih tela za donošenje MDK vrednosti,

kontrola njihovog poštovanja ne bi bila moguća bez paralelnog razvoja analitičkih

metoda u okviru različitih analitičkih tehnika, a u cilju dobijanja pouzdanih rezultata.

2. Uzorkovanje materijala za ispitivanje na sadržaj aflatoksina

Analitička metodologija za kvalitativno i kvantitativno dokazivanje aflatoksina

predstavlja posebnu naučnu oblast koja, zbog prirode i kompleksnosti problema,

zahteva multidisciplinarni pristup i izuzetno veliku posvećenost naučne zajednice koja

se bavi ovom problematikom. Međutim, pre nego što se posvetimo metodama

određivanja aflatoksina, treba se najpre osvrnuti na dva fundamentalna problema

inherentna aflatoksinima.


50

Osnovni izvor AfB1 u hrani za životinje su kontaminirane žitarice (u prvom redu

kukuruz) a kontaminacija može biti primarna i sekundarna (kontaminacija u polju

tokom rasta biljke i tokom skladištenja u silosima). Međutim, rast plesni, a samim tim i

produkcija AfB1 se odvija krajnje neravnomerno u polju odnosno silosu (Commission

Regulation 401/2006/EC), što je i razlog velikih varijacija u sadržaju AfB1 u istoj

proizvodnoj partiji. Stepen variranja sadržaja AfB1 može da bude (i uglavnom i jeste)

toliko veliki da ponovljena ispitivanja jednog uzorka kukuruza mase 100-200 g mogu

da daju rezultate od negativnih (ispod limita detekcije metode) do visoko

kontaminiranih, nekoliko puta iznad propisane MDK vrednosti. Brojni autori ukazuju

na ovaj problem (Whittaker, 2003; 2006, Bryden, 2012), i smatraju da najveći izvor

greške u analizi mikotoksina uopšte leži u teškoćama vezanim za pribavljanje

reprezentativnog uzorka. Neadekvatna uniformnost sadžaja aflatoksina u biljnom

materijalu je odavno poznata i veoma dobro ilustrovana u radu Hamiltona (1978) koji

je analizirao hranu za životinje uzetu sa različitih mesta u samo jednom silosu.

Tabela 1. Neravnomerna distribucija aflatoksina u silosu za skladištenje hrane za

životinje (izvor: Hamilton, 1978)

Uzorak

br.

Mesto uzimanja

uzorka

Af

(g/kg)

1 Periferija silosa 120

2 Periferija silosa 350

3 Centar silosa 35

4 Centar silosa <20

5 Centar silosa <20

6 Centar silosa <20

Tabela jasno pokazuje varijacije u sadržaju aflatoksina koje su do te mere velike

da analizom samo jednog od ovih šest uzoraka nije moguće dati adekvatnu informaciju

o ispravnosti date hrane za životinje. Imajući u vidu da je u gotovo svim zemljama

sadržaj aflatoksina u hrani za životinje zakonom regulisana kategorija, postaje jasno


51

kakve zakonske i zdravstvene implikacije neadekvatno uzorkovanje nosi sa sobom.

Stoga je je neophodno posvetiti veliku pažnju samom procesu uzorkovanja i

kodifikovati ga u cilju dobijanja reprezentativnog uzorka. Evropska unija je 2006.

godine donela Pravilnik o metodama uzorkovanja i analize mikotoksina u svrhe

službene kontrole (Commission Regulation EC 401/2006), gde se navodi način

uzorkovanja pojedinih vrsta hrane i hrane za životinje, kao i količina reprezentativnog

uzorka potrebnog za analizu. Pravilnik propisuje način uzorkovanja i uvodi pojmove

pojedinačnog uzorka i zbirnog uzorka koji se sastoji od pojedinačnih i dalje se

homogenizuje u laboratoriji radi dobijanja konačnog uzorka za analizu. Broj i masa

uzetih uzoraka zavise od veličine proizvodne partije (lot) iz koje se uzima uzorak. Za

male proizvodne partije, odnosno male količine uzorka može se uzeti 3-100

pojedinačnih uzoraka ukupne mase 1-10 kg.

Sa druge strane, AfM1 predstavlja metabolit AfB1 koji se nalazi u mleku i

njegova distribucija u mleku jedne životinje je ravnomerna. Međutim, u lancu

proizvodnje i prerade mleka (otkup sa farmi ili od individualnih proizvođača, mešanje

mleka različitog porekla u cisternama) neminovno dolazi do variranja u sadržaju AfM1.

Ove varijacije postaju još manje predvidljive kada se ima u vidu da i u ishrani mlečnih

krava sa jedne farme postoji različita zastupljenost AfB1 usled njegove neravnomerne

zastupljenosti u kukuruzu. Stoga i uzorkovanje mleka mora da se odvija na način da se

obezbedi reprezentativnost uzorka, što je i sadržano u EU propisu u vidu propisanih

količina mleka koje mora da se uzme za jednu analitičku partiju. Pravilnik EU broj

401/2006/EC propisuje minimalan broj pojedinačnih uzoraka i minimalnu masu

zbirnog uzorka za određivanje AfM1 u mleku.

U oba slučaja (kukuruz ili mleko), obavezna je što bolja homogenizacija

dobijenog zbirnog uzorka (na mestu uzorkovanja ili u laboratoriji, u zavisnosti od

raspoloživosti opreme).

Drugi izazov sa kojim se treba suočiti kod određivanja aflatoksina jeste

njihova niska koncentracija u uzorku. AfB1 se u žitaricama nalazi u najvećem broju

slučajeva u koncentracijama do nekoliko desetina g/kg, dok se kod AfM1 u mleku


52

radi o hiljadu puta manjoj koncentraciji. U oba slučaja se radi o kompleksnim

organskim uzorcima (kukuruz, mleko) koji sadrže veliki broj prirodnih sastojaka hrane

(proteini, masti, ugljeni hidrati, enzimi…), i veoma malu količinu toksina. Ovo

praktično znači da je potrebno razviti analitičku metodologiju koja je u stanju da

identifikuje i kvantifikuje količine od 10-10

do čak 10-13

g AfB1 i AfM1 u vrlo

kompleksnim matriksima ako se radi o uzorcima koji toksine sadrže na nivou

propisanih MDK vrednosti.

3. Podela analitičkih metoda za određivanje aflatoksina

Analitičke metode za određivanje aflatoksina se mogu podeliti na dve grupe:

trijažne (engl. screening) i potvrđujuće ili konfirmatorne (engl. confirmatory). Trijažne

metode se koriste za detekciju prisustva supstance na nivou od interesa (Commission

Decision 2002/657/EC) i karakterišu se velikom propustnom moći (velikim brojem

uzoraka koje je moguće obraditi u kratkom vremenskom periodu), a dizajnirane su tako

da ne daju lažno negativne rezultate, dok su lažno pozitivni rezultati mogući. U ove

metode uglavnom spadaju brojni imunoenzimski (ELISA) testovi (Stroka i Anklam,

2002). ELISA metode kombinuju visoku osetljivost biohemijskih enzimskih reakcija

sa specifičnošću imunoloških reakcija (Syndenham i Shepard, 1996). Osetljivost

ELISA metoda u današnje vreme dostiže i 0,005 g/kg što je daleko ispod najniže

MDK vrednosti za AfM1 od 0,05 g/kg u mleku. Isto se može reći i za metode za

detekciju AfB1 u kukuruzu. Ipak, njihova specifičnost i selektivnost nisu apsolutne, što

može dovesti do unakrsnih reakcija sa molekulima koji sadrže iste ili slične haptenske

grupe koje omogućuju imunološku reakciju (Kim i sar, 2000; Rodriguez-Velasco,

2003). Sa druge strane, ELISA metode su brze, jednostavne za izvođenje, osetljive i

dovoljno specifične tako da danas predstavljaju najčešći put za brzu analizu sadržaja

aflatoksina u hrani i hrani za životinje (Magliulo i sar, 2005; Micheli i sar, 2005;

Stroka i Anklam, 2002; Thirumala-Devi i sar, 2002; Van Egmond, 2004). Eventualno

pozitivni nalaz korišćenjem ELISA metode se može naknadno potvrditi korišćenjem

drugih analitičkih tehnika (Markaki i Melissari, 1997).


53

Drugu grupu metoda čine konfirmatorne metode. Ove metode treba da obezbede

informacije o supstanci koje će omogućiti njenu nedvosmislenu identifikaciju i

kvantifikaciju (Commission Decision2002/657/EC). Prema važećim propisima u EU,

konfirmatorna metoda se zasniva na detekciji supstance od interesa koja treba da pruži

informaciju o hemijskoj strukturi analita, a kojoj obavezno prethodni hromatografska

separacija komponenti uzorka. Separacione (hromatografske) tehnike za analizu AfB1 i

AfM1 se mogu podeliti na:

- Hromatografiju na tankom sloju (TLC – engl. Thin Layer Chromatography) i

hromatografiju na tankom sloju visokih performasi (HPTLC – engl. High Performance

Thin Layer Chromatography) sa fluorescentnom detekcijom;

- Tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC – engl. High Performance

Liquid Chromatography) sa ultraljubičastom ili fluorescentnom detekcijom;

- Tečnu hromatografiju visokih performansi sa maseno spektrometrijskom

detekcjom (LC-MS/MS – engl. High Performance Liquid Chromatography/Mass

Spectrometry) i tečnu hromatografiju ultra visokih performansi sa maseno

spektrometrijskom detekcjom (UPLC (UHPLC)-MS/MS – engl. Ultra High

Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry).

Postoje i druge analitičke tehnike koje se zasnivaju na hromatografiji kojima se mogu

dokazivati aflatoksini (gasna hromatografija, tečna hromatografija sa UV

detekcijom…), međutim zbog komplikovane pripreme uzoraka i/ili slabe osetljivosti,

nisu našle mesto u rutinskoj praksi.

Hromatografija na tankom sloju je prva tehnika korišćena za najpre

kvalitativno a potom i kvantitativno određivanje AfB1 i (u manjoj meri) AfM1. Danas

uglavnom ima istorijski značaj u razvijenim zemljama, iako se još uvek zadržala u

zemljama u razvoju zahvaljujući svojim prednostima kao što su relativna lakoća

izvođenja i srazmerno tome prihvatljiva cena, kao i mogućnošću analiziranja više

uzoraka u jednoj analitičkoj partiji (Stroka i Anklam, 2002). Jedna od mana ove

metode je upotreba većih količina hlorovanih organskih rastvarača sa mogućim

negativnim posledicama po analitičare i životnu sredinu, kao i relaivno slaba


54

osetljivost. Krajem XX veka je razvijena i modifikovana TLC metoda koja isključuje

upotrebu organohalogenih rastvarača, ali sa druge strane zahteva upotrebu

imunoafinitetnih kolona za prečišćavanje uzoraka što značajno utiče na cenu izvođenja

analize (Stroka i sar, 2002).

Razvoj HPLC metoda početkom ‘80-ih godina prošlog veka zahvaljujući

napretku ove analitičke tehnike i sve široj dostupnosti instrumentacije za njeno

izvođenje, značajno utiče na porast broja dostupnih metoda za kvantitativno

određivanje AfB1 i AfM1 (Zolner i sar, 2006). Kao što je ranije naglašeno, AfB1 i

AfM1, poseduju sposobnost nativne fluorescencije. Daljom derivatizacijom sa

jedinjenjima halogenih elemenata (jodom ili bromom) intenzitet fluorescencije se

značajno povećava čime je omogućena detekcija do nivoa od 10-12

g toksina (ng/kg) što

zadovoljava sve regulatorne zahteve u pogledu MDK vrednosti (Papp i sar, 2002). Sa

druge strane, sve metode zasnovane na HPLC sa fluorescentnom detekcijom zahtevaju

prečišćavanje uzoraka imunoafinitetnim kolonama što utiče na brzinu izvođenja i cenu

analize (Beltran i sar, 2011). Međutim, može se zaključiti da je ova analitička tehnika

dovoljno dugo u upotrebi i samim tim metode zasnovane na njoj mogu da zadovolje

kako analitičke tako i regulatorne kriterijume koji se danas primenjuju (Jaimez i sar,

2000; Sizoo i van Egmond, 2005).

U poslednjoj deceniji, tečna hromatografija sa masenom spektrometrijom (LC-

MS/MS) postaje tehnika izbora za određivanje mikotoksina uopšte pa i aflatoksina u

hrani i hrani za životinje (Krska i sar, 2008; Zollner i sar, 2006). Gotovo apsolutna

specifičnost i selektivnost koju pruža maseni spektrometar kvadrupolnog tipa u MRM

načinu rada (engl. Multiple Reaction Monitoring – praćenje višestrukih reakcija) preko

merenja prisustva i intenziteta jona celih molekula i njihovih fragmenata, postaje

tehnika izbora za kvantitativno određivanje najvećeg broja rezidua i kontaminenata u

organskim matriksima (Beltran i sar, 2009). Mnogi autori prijavljuju metode za

određivanje AfB1 i AfM1 u kukuruzu i mleku zasnovane na LC-MS/MS tehnici koje

zaobilaze korak prečišćavanja uzoraka i sastoje se od analiziranja sirovih ekstrakata

hrane i hrane za životinje u nekom organskom rastvaraču (Bertran i sar, 2009; Demulle


55

i sar, 2006). Navedeni pristup je moguć zahvaljujući sposobnosti ovakvog tipa

detektora da razlikuje jedinjenja na osnovu njihovih masa i samim tim otkloni

interferirajuće supstance prisutne u uzorku što druge vrste detekcije nisu u stanju.

Prednosti ovakvog pristupa su zanemarljiv gubitak analita tokom pripreme uzorka te

visok prinos metode, redukovanje upotrebe rastvarača i hemikalija na mininum i

značajno povećavanje brzine i propustne moći metode. Međutim, ovakav pristup nije

bio moguć kod određivanja AfM1 u hrani za decu gde je MDK vrednost u EU

propisana na 0,025 g/kg (Commission Regulation (EU) 178/2010) i predstavlja,

izuzimajući dioksine, najnižu MDK vrednost za neki kontaminent ili reziduu uopšte

(Beltran i sar, 2009, Spanjer i sar, 2008).

Razvoj i sve šira dostupnost tečne hromatografije ultra visokih performansi

(UPLC) kuplovane sa masenom spektrometrijom (UPLC-MS/MS) dozvoljava brže

hromatografske separacije što rezultira kraćim vremenom analize (Di Mavungu i sar,

2009; Freinch i sar, 2009). Istovremeno, separacija postaje efikasnija što direktno utiče

na oštrinu i visinu pika sa posledičnim povećanjem osetljivosti i nižim limitima

detekcije i kvantifikacije (Fu i sar, 2008; Ren i sar, 2007).

4. Kriterijumi za analitičke metode za određivanje aflatoksina

Jedan od najkompletnijih zakonskih propisa iz oblasti zahteva za kriterijume

analitičkih metoda jeste dokument EU „Odluka Komisije od 12. Avgusta 2002. godine

za implementaciju Direktive Saveta 96/23/EC u pogledu performansi analitičkih

metoda i interpretaciji rezultata” (2002/657/EC). Iako se ovim propisom regulišu

zahtevi za metode koje se primenjuju u okviru Nacionalnih programa praćenja rezidua

i kontaminenata (Nacionalni monitoring programi), on može da predstavlja univerzalnu

osnovu za definisanje performansi analitičkih metoda iz više oblasti. Metode za

određivanje AfB1 i AfM1 donekle spadaju u korpus metoda koje reguliše Direktiva

2002/657/EC i to u pogledu samog procesa validacije. U zemljama članicama EU

obavezna je validacija metoda shodno kriterijumima iz ovog dokumenta.


56

Numerički kriterijumi koje analitičke metode za AfB1 i AfM1 treba da ispune

sadržani su u „Pravilniku Komisije EC 401/2006. Tabela 2 sumira zahteve ovog

dokumenta u delu za analitičke metode.


57

Tabela 2. Kriterijumi za analitičke metode za određivanje AfB1 i AfM1 (izvor:

401/2006/EC)

Kriterijum

Opseg

koncentracija

Preporučena

vrednost

Maksimalno

dozvoljena

vrednost

Slepa proba Svi opsezi Zanemarljiva -

prinos AfM1 0,01-0,05 g/kg 60-120%

>0,05 g/kg 70-110%

prinos AfB1

<1 g/kg 50-120%

1-10 g/kg 70-110%

>10 g/kg 80-110%

Preciznost u

uslovima

reproducibilnosti

(RSDR)

Prema rezultatu

Horovicove

jednačine

RSDR=2(1-0,5logC)

2* RSDR

Treba naglasiti i da se u tabeli ne navodi limit detekcije imajući u vidu da se svi

kriterijumi formiraju na tačno određenim nivoima koji proističu iz MDK vrednosti.

Vrednost „C” u Horovicovoj jednačini predstavlja odnos masenog udela aflatoksina u

uzorku (npr. za koncentraciju od 100% - 100 g u 100 g, ova vrednost je 1 dok za

koncentraciju od 1 g/kg, ova vrednost je 10-9

odnosno 0,000000001).

Pored navedenih kriterijuma, merna nesigurnost (u), odnosno proširena merna

nesigurnost (U) je jedan od parametara čije je utvrđivanje obavezno pri validaciji

analitičkih metoda za AfB1 i AfM1. Merna nesigurnost se definiše kao uvek pozitivna

vrednost koja se dodeljuje merenoj vrednosti i karakteriše njenu disperziju (EURACHEM,

1995). Prema Pravilniku 401/2006/EC, merna nesigurnost se izvodi prema sledećoj

formuli:

LoD predstavlja

Uf2= (LoD/2)2+ (*C)2


58

limit detekcije metode, „C” predstavlja maseni udeo dos vrednost „” zavisi od

koncentracije na kojoj se metoda validuje. Ove vrednosti su date u tabeli 3.

Tabela 3. Vrednosti “” u zavisnosti od koncentracije AfB1 i AfM1 (preuzeto iz

401/2006/EC)

Koncentracija (g/kg)

<50 0,2

51-500 0,18

501-1000 0,15

1001-10000 0,12

>10000 0,1

5. Zaključak

Na osnovu svega navedenog može se zaključiti da se, paralelno sa saznanjima o

aflatoksinima koji su tokom poslednjih decenija s pravom u fokusu naučne i stručne

javnosti, odvija dinamičan razvoj analitičkih metoda za njihovo tačno i precizno

određivanje. Rapidan razvoj analitičkih tehnika i instrumentacije, postizanje sve većih

osetljivosti, odnosno snižavanje limita detekcije i kvantifikacije, kao i razvoj metoda

baziranih na masenoj spektrometriji koje omogućavaju uvid u hemijsku strukturu

analita od inetersa, a time i njihovu nedvosmislenu identifikaciju, omogućavaju

adekvatno ispunjavanje zahteva koje pred analitičare postavljaju regulatorna tela

širom sveta u pogledu MDK vrednosti za aflatoksine. U tom kontekstu, može se

zaključiti da današnje analitičke metode za kvantitativno određivanje aflatoksina u

hrani, hrani za životinje i mleku u potpunosti zadovoljavaju sve zahteve te

omogućavaju efikasne kontrole i time značajno doprinose očuvanju zdravlja ljudi i

životinja.

Literatura


59

Beltrán, E., Ibá ez, M., Sancho, J. V., & Hernández, F., 2009. Determination of

mycotoxins in different food commodities by ultra-high-pressure liquid

chromatography coupled to triple quadrupole mass spectrometry. Rapid

Communications in Mass Spectrometry, 23(12), 1801–1809. 2. Bryden W.L., 2012.

Mycotoxin contamination of the feed supply chain: Implications for animal

productivity and feed security. Anim Feed SciTech. 173: 134-158. 3. Bryden W.L.,

2012. Mycotoxin contamination of the feed supply chain: Implications for animal

productivity and feed security. Anim Feed SciTech. 173: 134-158. 4. COMMISSION

DECISION No 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive

96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of

results. 5. COMMISSION REGULATION (EC) No 401/2006 of 23 February 2006

laying down the methods of sampling and analysis for the official control of the levels

of mycotoxins in foodstuffs (2006) OJ L 70/12. 6. COMMISSION REGULATION

(EU) No 178/2010 of 2 March 2010 amending Regulation (EC) No 401/2006 as

regards groundnuts (peanuts), other oilseeds, tree nuts, apricot kernels, liquorice and

vegetable oil (2010). L52/32. 7. D'Mello, J.P.F., Macdonald, A.M.C., 1997.

Mycotoxins. Anim. Feed Sci. Technol. 69, 155-166. 8. Delmulle, B., De Saeger, S.,

Adams, A., De Kimpe, N., & Van Peteghem, C. 2006. Development of a liquid

chromatography/tandem mass spectrometry method for the simultaneous

determination of 16 mycotoxins on cellulose filters and in fungal cultures. Rapid

Communications in Mass Spectrometry, 20(5), 771–776. 9. Di Mavungu, J. D.,

Monbaliu, S., Scippo, M.-L., Maghuin-Rogister, G., Schneider, Y.-J., Larondelle, Y.,

et al. 2009. LC–MS/MS multi-analyte method for mycotoxin determination in food

supplements. Food Additives and Contaminants – Part A Chemistry, Analysis,

Control, Exposure and Risk Assessment, 26(6), 885–895. 10. EURACHEM 1995.

Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. Laboratory of the Government

Chemist, London 1995. 11. Frenich, A. G., Vidal, J. L. M., Romero-González, R., &

Aguilera-Luiz, M. d. M. 2009. Simple and high-throughput method for the

multimycotoxin analysis in cereals and related foods by ultra-high performance liquid


60

chromatography/tandem mass spectrometry. Food Chemistry, 117(4), 705–712. 12.

Fu, Z., Huang, X., & Min, S. 2008. Rapid determination of aflatoxins in corn and

peanuts. Journal of Chromatography A, 1209(1–2), 271–274. 13. Hussein S.H. and

Brasel J.M., 2001. Toxicity, metabolism, and impact of mycotoxins on humans and

animals. Toxicology. 167: 101-134. 14. Kim, E. K., Shon, D. H., Ryu, D., Park, J. W.,

Hwang, H. J., & Kim, Y. B. 2000. Occurrence of aflatoxin M1 in Korean dairy

products determined by ELISA and HPLC. Food Additives and Contaminants, 17(1),

59–64. 15. Krska R., Schubert-Ullrich P., Molinelli A., Sulyok M., MacDonald S. and

Crews C., 2008. Mycotoxin analysis: An update. Food Additives & Contaminants:

Part A. 25, 152-163. 16. McLean M., Dutton M.F., 1995. Cellular interactions and

metabolism of aflatoxin: an update. Pharmacol Ther. 65(2), 163-92. 17. Micheli, L.,

Greco, R., Badea, M., Moscone, D., & Palleschi, G. 2005. An electrochemical

immunosensor for Aflatoxin M1 determination in milk using screen-printed

electrodes. Biosensors and Bioelectronics, 21(4), 588–596. 18. Moss, M. O. 1991. The

environmental factors controlling mycotoxin formation. In: Mycotoxins and Animal

Foods, J. E. Smith and R. S. Henderson (Eds.) CRC Press. Boca Raton, Florida. 19.

Papp, E., Otta, K.H. Zaray, G and Mincsovics, E., 2002. Liquid chromatographic

determination of aflatoxins. Microchemical Journal, 73: 39–46. 20. Ren, Y., Zhang,

Y., Shao, S., Cai, Z., Feng, L., Pan, H., et al. 2007. Simultaneous determination of

multi-component mycotoxin contaminants in foods and feeds by ultra-performance

liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A,

1143(1–2), 48–64. 21. Sizoo, E. A., & Van Egmond, H. P. 2005. Analysis of duplicate

24-hour diet samples for aflatoxin B1, aflatoxin M1 and ochratoxin A. Food additives

and contaminants, 22(2), 163–172. 22. Spanjer, M.C., Rensen, P.M., & Scholten,

J.M., 2008. LC–MS/MS multi-method for mycotoxins after single extraction, with

validation data for peanut, pistachio, wheat, maize, cornflakes, raisins and figs. Food

Additives and Contaminants, 25(4), 472–489. 23. Stroka, J. and Anklam, E., 2002.

New strategies for the screening and determination of aflatoxins and the detection of

aflatoxin-producing moulds in food and feed. TrAC Trends in Analytical Chemistry,


61

21(2):90–95. 24. Sydenham, E.W., Shephard, G.S., Theil, P.G., Marasas, W.F.O.,

Stockenström, S., 1991. Fumonisin contamination of commercial corn-based human

foodstuffs. Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 39, no. 11, 1991, p. 2014-

2018. 25. Thirumala-Devi, K., Mayo, M. A., & Hall, A. J., 2002. Development and

application of an indirect competitive enzyme-linked immunoassay for aflatoxin M1 in

milk and milk-based confectionery. Journal of Agricultural and Food Chemistry,

50(4), 933–937. 26. Van Egmond, H. P., 2004. Natural toxins: Risks, regulation and

theanalytical situation in Europe. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 378, 1152–

1160. 27. Van Egmond, H. P., 2004. Natural toxins: Risks, regulation and


1160. 28. Van Egmond, H. P., 2004. Natural toxins: Risks, regulation and


1160. 29. Whitaker T. B., 2006. Sampling Foods for Mycotoxins. Food Addit Contam

23: 50-61. 30. Zöllner, P., & Mayer-Helm, B., 2006. Trace mycotoxin analysis in

complex biological and food matrices by liquid chromatography–atmospheric

pressure ionisation mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1136(2), 123–

169.


62

7. OSNOVNE KARAKTERISTIKE SAVREMENIH MATERIJALA ZA

PAKOVANJE NAMIRNICA I OPREME ZA NJIHOVU APLIKACIJU

M. Milijašević*1, Jelena Babić

*

* Institut za higijenu i tehnologiju mesa, Kaćanskog 13, 11000 Beograd

Kratak sadržaj

Prema tržišnim pokazateljima industrija ambalaže je trenutno jedan od najbrže

rastućih industrijskih sektora, posebno u prehrani, koja se u Evropi označava najvećim

proizvodnim sektorom vrednim 1100 milijardi dolara. Povećani zahtevi potrošača za

proizvodima koji imaju prihvatljivu cenu i adekvatan rok trajanja, kao i sve strožiji

zahtevi u odnosu na kvalitet, higijenu i bezbednost hrane koja će biti što lakša za

pripremu, dovode do toga da proizvođače hrane savremeno društvo stavlja pred

zadatak konstantnog razvoja novih tehnika i metoda pakovanja hrane. Novi trendovi,

globalizacija tržišta, doprineli su da se poveća distribucija hrane na velike razdaljine,

čime je proizvođač uslovljen da proizvodi prehrambene proizvode sa dužim rokom

trajanja i sa manjim rizikom od kvara. Tradicionalni način pakovanja je ograničen u

svom potencijalu da produži rok održivosti hrane. Praktične osobine materijala za

pakovanje kao što su dostupnost, jednostavno rukovanje i odlaganje, vidljivost

upakovanog proizvoda, mogućnost ponovnog zatvaranja i kompatibilnost sa

podgrevanjem u mikrotalasnoj rerni, u velikoj meri utiču na razvoj novih materijala

koji se koriste u prehrambenoj industriji. Pakovanje igra veoma važnu ulogu u

pojednostavljenju pripreme i serviranju hrane kod kuće. Adekvatan izbor tehnologije i

materijala za pakovanje omogućuju održavanje kvaliteta i svežine proizvoda tokom

perioda skladištenja i distribucije. Materijali koji se tradicionalno koriste u

prehrambenoj industriji su staklo, metal (aluminijum, folije i laminirani filmovi,

kalajisani lim), papir, karton i plastika. Danas se, obično, prilikom pakovanja

namirnica kombinuje više različitih materijala pri čemu se kombinuju njihova




63

funkcionalna svojstva. Najvažnije osobine koji proizvođači ambalaže uzimaju u obzir

su ponašanje materijala prilikom transporta i manipulacije, optička svojstva,

mehanička svojstva i podložnost hemijskim reakcijama sa upakovanom hranom. U

radu su opisani materijali za pakovanje koji se u najvećoj meri koriste u prehrambenoj

industriji i oprema za njihovu primenu.

Ključne reči: materijali za pakovanje, hrana, staklo, metal, plastika, papir.

Uvod

Proces pakovanja hrane je sastavni deo svake proizvodne linije i jedan od

najbitnijih koraka u proizvodnji namirnica, a za cilj ima da održi kvalitet upakovane

namirnice tokom transporta i skladištenja, sve do njene konzumacije (Kelsey, 1985).

Tehnološki napredak koji je prisutan na polju proizvodnje i pakovanja hrane, čini

hranu iz godine u godinu sve bezbednijom. Danas tehnologija pakovanja koja se

primenjuje u prehrambenoj industriji omogućava transport namirnica na velike

udaljenosti, od mesta gde su namirnice proizvedene do mesta gde će biti ponuđene

potrošačima. Međutim, tehnologija pakovanja mora da bude u ravnoteži između

očuvanja i bezbednosti upakovane hrane, sa jedne strane, i potrošnje energije, cene

koštanja, zaštite životne sredine, strogim propisima koji se odnose na zagađivače i

odlaganje otpada, sa druge strane.

Prema tržišnim pokazateljima industrija ambalaže je trenutno jedan od najbrže

rastućih sektora, posebno u prehrani, koja se u Evropi označava najvećim

proizvodnim sektorom vrednim 1100 milijardi dolara. Generalno, poslovanje vezano

za ambalažu iz godine u godinu postaje sve veći biznis, za 2007. godinu njegova

vrednost je procenjena na 470 milijardi dolara sa prosečnom stopom rasta od 3,5

procenata godišnje. Procenjuje se da će u 2014. godini vrednost tržišta ambalaže

dostići skoro 600 milijardi dolara (Kuzmanović, 2013).

Povećani zahtevi potrošača za proizvodima koji imaju prihvatljivu cenu i

adekvatan rok trajanja, kao i sve strožiji zahtevi u odnosu na kvalitet, higijenu i

bezbednost hrane koja će biti što lakša za pripremu i spremanje, dovode do toga da


64

proizvođače hrane savremeno društvo stavlja pred zadatak konstantnog razvoja novih

tehnika i metoda pakovanja hrane. Novi trendovi, globalizacija tržišta, doprineli su da

se poveća distribucija hrane na velike razdaljine, čime je proizvođač uslovljen da

proizvodi prehrambene proizvode sa dužim rokom trajanja i sa manjim rizikom od

kvara (Kuzmanović, 2013). Tradicionalni način pakovanja je ograničen u svom

potencijalu da produži rok održivosti hrane. Osnovni princip pakovanja hrane je

sledeći: izbegavanje kontaminacije, odlaganje kvara, omogućavanje pojedinih

enzimskih reakcija koje pospešuju mekoću proizvoda, smanjenje gubitka na masi i

osiguranje zadržavanja organoleptičkih svojstava namirnice (Danielli i sar., 2008;

Kerry i sar., 2006; Murcia i sar., 2003). Kroz istoriju, ljudi su se konstantno trudili da

razvijaju sredstva i načine kojima će zaštititi hranu od dejstva vremena i uticaja

okoline. Rani čovek je konzumirao hranu na mestu gde je i nalazio i nije postojala

potreba za skladištenjem hrane ili njenom daljom distribucijom. Ipak, tokom vremena,

čovek je naučio mnogo efikasnije da lovi, pa je time pronašao i metode da zaštiti

hranu od kvarenja. U tu svrhu, prvo je počeo da koristi prirodne posude (drvene,

kamene, od tikvi, listova, papirusa, školjki, kože životinja, rogova i mokraćne bešike).

Veruje se da je pronalazak i upotreba ovakvih posuda za hranu, doveo do pronalaska

posuda od drveta, stakla i keramike, koje su okarakterisale naredni period u istoriji

pakovanja hrane (Kuzmanović, 2013).

Početkom dvadesetog veka, inovacije u načinu pakovanja su se odnosile na

čvrstinu i fleksibilnost materijala za pakovanje. Prva aluminijumska folija je

napravljena na početku, a celofan nepropusan za vlagu dvadesetih godina 20. veka.

White je 1929. godine razvio metodu, kojom je omogućio stvaranje vakuuma u

posudama u kojima se drži hrana, uvođenjem kondenzovane vodene pare u prostor

ispunjen gasovima, a iznad sadržaja hrane upakovane u staklenu ili metalnu ambalažu

(Cornforth i sar., 2008). Drugi svetski rat je ubrzao razvoj PVC (polivinilhlorida),

PVDC (polivinildienhlorida) i polietilena. Šezdesetih i sedamdesetih godina prošlog

veka, najveći napredak u pakovanju hrane bio je razvoj plastičnih tegli, boca, filmova

napravljenih od polivinila, polietilena, vinildena, vinilhlorida i najlona. Tih godina,


65

proizvedeni su i jestivi omotači za hranu od sojinih proteina, hitina, celuloze, proteina

mleka i skroba, prolamina iz kukuruza (Cornforth i sar., 2008).

Uloga pakovanja hrane

Yokoyama (1985) je, kao osnovne karakteristike dobrih materijala za pakovanje,

definisao mogućnost masovne proizvodnje, efikasnost samog materijala koji se

koristi, pogodnost njegove strukture i forme, praktičnost upotrebe i uticaj upotrebe

datog materijala na životnu sredinu. Sposobnost materijala da namirnici omogući

zaštitu od spoljnih uticaja i praktičnost njegove primene su svakako bitne osobine,

međutim, prilikom razvoja novih materijala se u obzir mora uzeti i njegovo odlaganje

tj. mogućnost reciklaže. Ovo je jedan od izazova sa kojim će se u budućnosti susretati

industrija za proizvodnju ambalažnih materijala.

Osnovne uloge pakovanja hrane je da se upakovani proizvod zaštiti od spoljnih uticaja

i da potrošačima pruži informacije o namirnici koju konzumiraju (Coles, 2003).

Pakovanje sprečava kvar hrane i napitaka koji nastaje pod uticajem faktora spoljašnje

sredine, a takođe doprinosi efikasnijoj distribuciji, prodaji i konzumaciji (Restuccia i

sar., 2010). Robertson (2005) je definisao četiri osnovne uloge materijala za

pakovanje: da omogući hermetičko zatvaranje namirnice kao i zaštitu namirnice od

spoljašnjih uticaja, da je praktičan za primenu i da omogućava komunikaciju između

proizvođača i potrošača.

Hermetičko zatvaranje namirnice.

Ovo je jedna od osnovnih uloga svakog materijala za pakovanje. Hermetičnost

pakovanja je veoma važan preduslov za efikasan transport, skladištenje i

distribuciju gotovih proizvoda.

Zaštita namirnica od spoljnih uticaja.

U slučaju hrane, ovo je, bez sumnje, najvažnija uloga pakovanja. Upotrebljeni

materijal za pakovanje predstavlja barijeru između upakovane namirnice i fizičkih,

hemijskih i bioloških faktora koji mogu dovesti do njenog kvara. Na ovaj način


66

pakovanje utiče na produžetak roka održivosti i održavanje, ili čak povećanje,

kvaliteta i bezbednosti hrane.

Zaštita od hemijskih uticaja smanjuje promene u sastavu namirnice koje mogu biti

izazvane spoljnim uticajima kao što je izlaganje gasovima (naročito kiseoniku), vlazi

(povećanje ili smanjenje procenta vlage u namirnici) ili svetlosti (vidljiva, infracrvena

ili ultraljubičasta svetlost). Svetlost manjih talasnih dužina ima veću energiju i

ostvaruje katalitičko dejstvo na početak fotohemijskih reakcija. Samo propuštena

svetlost i svetlost koja je došla u kontakt sa namirnicom ima štetno dejstvo. Pravilnim

odabirom ambalažnih materijala može se uspešno izvršiti zaštita sadržaja od uticaja

svetlosti. Različiti materijali za pakovanje mogu obezbediti različite nivoe zaštite.

Staklo i metal predstavljaju gotovo totalnu barijeru za hemijske uticaje. Plastični

materijali, takođe, imaju dobra barijerna svojstva ali, ipak, imaju veći stepen

propustljivosti nego staklo i metal.

Biološka zaštitna uloga materijala za pakovanje je da obezbedi barijeru za

mikroorganizme (patogene i mikroorganizme kvara), insekte, glodare i ostale

životinje, i na taj način spreči prenošenje bolesti i kvar hrane. Takođe, materijal za

pakovanje obezbeđuje uslove za zrenje određenih namirnica, pri čemu se poboljšavaju

njihove nutritivne i senzorne karakteristike.

Fizička zaštitna uloga pakovanja je veoma bitna kod namirnica koje su osetljive na

udarce i vibracije, npr. jaja i sveže voće. U ovom slučaju, najčešće se koristi

kartonska ambalaža pomoću koje se ove namirnice mogu transportovati i

skladištiti bez opasnosti od nastanka oštećenja.

Praktičnost primene materijala za pakovanje

Praktične osobine materijala za pakovanje kao što su dostupnost, jednostavno

rukovanje i odlaganje, vidljivost upakovanog proizvoda, mogućnost ponovnog

zatvaranja i kompatibilnost sa podgrevanjem u mikrotalasnoj rerni, u velikoj meri

utiču na razvoj novih materijala koji se koriste u prehrambenoj industriji. Pakovanje

igra veoma važnu ulogu u pojednostavljenju pripreme i serviranju hrane. Adaptacija

veličine pakovanja prema potrebama određene grupe konzumenata (porodično


67

pakovanje, individualno pakovanje) je jedan od načina da prehrambena industrija

iskoristi potencijale upotrebljenih ambalažnih materijala i da, na taj način, osvoji

potencijalne kupce.

Komunikacija između proizvođača i potrošača

Pakovanje predstavlja lice proizvoda i uglavnom je jedini način da proizvođač

pruži informaciju potrošačima o namirnici. Količina informacija koja se štampa na

ambalaži u koju je upakovana hrana se konstantno povećava. Tekst i grafički prikazi

se koriste za identifikaciju i promociju proizvoda i brenda. Na ambalaži su prisutni

podaci o sastojcima, neto težini, nutritivnoj vrednosti, datumu proizvodnje i roku

trajanja kao i ceni proizvoda, a pored njih se nalaze i bar kodovi i ostali podaci koji su

neophodni za sledljivost datog proizvoda u okviru sistema čiji je zadatak da osigura

bezbednost hrane.

Ove činjenice ukazuju na veoma brzi napredak industrije ambalaže i u tehničkom

smislu. Neprekidno se pronalaze novi načini pakovanja, koji ispunjavaju sve strožije

zahteve kupaca. Neophodno je sačuvati upakovani proizvod od nastanka kvara, ali i

obezbediti što manje izlaganje hrane nepoželjnim promenama u toku procesa

proizvodnje. Ovo je moguće samo ako su sve tačke proizvodnog procesa strogo

kontrolisane, pri čemu i sam proces pakovanja predstavlja jednu od kritičnih faza

procesa dobijanja zdravstveno bezbednog proizvoda. S druge strane, teži se postići što

duža trajnost proizvoda bez negativnog uticaja na kvalitet. Proširuju se i funkcionalne

osobine ambalaže. Tako na svetskom tržištu sve veću primenu imaju inteligentna i

aktivna pakovanja.

Materijali koji se koriste za pakovanje hrane

Adekvatan izbor tehnologije i materijala za pakovanje omogućuju održavanje

kvaliteta i svežine proizvoda tokom perioda skladištenja i distribucije. Materijali koji

se tradicionalno koriste u prehrambenoj industriji su staklo, metal (aluminijum, folije i

laminirani filmovi, kalajisani lim), papir, karton i plastika. Poslednjih par decenija

veliki broj plastičnih materijala je uveden u tehnologiju pakovanja hrane u formi


68

čvrstih i fleksibilnih folija. Danas se, obično, prilikom pakovanja namirnica

kombinuje više različitih materijala pri čemu se kombinuju njihova funkcionalna

svojstva. Hemijski sastav i fizičke osobine materijala određuju njegovu sposobnost da

ispuni različite zahteve koji se očekuju od pakovanja. Najvažnije osobine koji

proizvođači ambalaže uzimaju u obzir su ponašanje materijala prilikom transporta i

manipulacije, optička svojstva, mehanička svojstva i podložnost hemijskim

reakcijama sa upakovanom hranom.

Staklo

Staklo ima izuzetno dugu istoriju kao materijal koji se koristi za pakovanje hrane.

Najstariji pronađeni stakleni predmet koji se koristio za ovu namenu datira iz perioda

3000 godina pre naše ere (Marsh i sar., 2007). Najčešći sastav stakla koje se koristi u

prehrambenoj industriji je 68-73% SiO2, 12-15% Na2O, 10-13% CaO i ostalih oksida

u manjim procentima (Robertson, 1993). Staklene posude se tokom proizvodnje

presvlače tankim zaštitnim slojem koji obezbeđuje lubrikaciju prilikom prolaska kroz

proizvodnu liniju. Ovaj zaštitni sloj, takođe, povećava snagu staklene posude i

smanjuje mogućnost lomljenja. Povećana otpornost na lomljenje omogućava

proizvođačima staklene ambalaže da koriste tanje staklo, što smanjuje masu same

ambalaže i na taj način olakšava njeno odlaganje i transport (McKown, 2000). S

obzirom da nema miris i da je hemijski inertno u odnosu na sve vrste prehrambenih

proizvoda, staklo ima određene prednosti nad ostalim materijalima koji se koriste za

ovu namenu. Ono je totalno nepropusno za gasove i vlagu, tako da duži vremenski

period održava svežinu proizvoda, bez uticaja na ukus i miris. Osobina stakla da

izdržava visoke temperature termičke obrade, kako baznih tako i kiselih namirnica, ga

izdvaja u odnosu na ostale materijale. Prozirnost stakla omogućava kupcu da vidi

upakovani proizvod, a varijacije u boji stakla omogućavaju zaštitu sadržaja koji je

osetljiv na veću količinu svetlosti. Ovaj materijal je ekološki pogodan jer je u

potpunosti podložan reciklaži. Kao i svaki drugi materijal, i staklo ima svoje mane.

Uprkos naporima da se proizvede što tanje staklo, njegova masa povećava troškove

transporta.


69

Metal

Metal je veoma svestran materijal za pakovanje. On pruža kombinaciju odlične

fizičke zaštite i dekorativnog potencijala, podložan je reciklaži i veoma prihvatljiv za

kupca. U prehrambenoj industriji se uglavnom koriste aluminijum i čelik.

Aluminijum se obično koristi za proizvodnju konzervi, folija, laminiranog papira i

laminiranih plastičnih pakovanja. Aluminijum je veoma lak metal, koji se dobija iz

rude boksita, gde se nalazi u kombinaciji sa kiseonikom. Magnezijum i mangan se,

često, dodaju aluminijumu da pojačaju njegovu čvrstoću (Page i sar., 2003). Za razliku

od mnogih metala, aluminijum je otporan na različite vidove korozije. Sloj

aluminijum oksida na njegovoj površini čini veoma efikasnu zaštitu od vazduha,

temperaturnih uticaja, vlage i hemijskih reakcija. Pored toga što obezbeđuje odličnu

zaštitu od vlage, vazduha, svetlosti, mirisa i mikroorganizama, aluminijum ima dobru

fleksibilnost, prilagodljivost i pruža mogućnost formiranja različitih oblika pakovanja.

On je, takođe, idealan materijal za racikliranje jer je lak za skupljanje i pretvaranje u

nove proizvode. Osnovna mana aluminijuma, kao materijala za pakovanje, je cena

njegovog koštanja, koja je nešto veća nego što je to slučaj sa ostalim metalima.

Aluminijumske folije se prave od čistog aluminijuma njegovim valjanjem u

veoma tanke listove koji se zatim prekaljuju. Aluminijumske folije su dostupne u

velikom opsegu debljine, pri čemu se tanke folije koriste za obmotavanje namirnica, a

od debljih folija se prave posude u koje se stavlja hrana. Kao i aluminijum, folije

predstavljaju odličnu barijeru za vlagu, vazduh, mirise, svetlost i mikroorganizme.

Inertne su prema kiseloj hrani i ne zahtevaju dodatnu zaštitu.

Laminirani filmovi se dobijaju vezivanjem aluminijumskih folija za papirne ili

plastične filmove a u cilju poboljšanja barijernih svojstva tih materijala. S obzirom da

je laminirani aluminijum veoma skup materijal, obično se koristi za pakovanje

namirnica sa visokom cenom koštanja.

Metalizirani filmovi su plastični materijali koji sadrže tanak sloj aluminijuma

(Fellows i sar., 2002). Ovi filmovi imaju visoko barijerna svojstva prema vlazi,

uljima, vazduhu i mirisima, a njihova sjajna površina je primamljiva za kupce. Ovi


70

materijali su fleksibilniji nego laminirani filmovi i koriste se, uglavnom, za pakovanje

grickalica.

Kalajisani lim se dobija kada se čelik sa niskim sadržajem ugljenika presvuče

tankim slojem kalaja. Presvlačenje se obavlja tako što se čelične ploče uranjaju u

rastopljeni kalaj (hot-dipped tinplate) ili tako što se vrši elektrodepozicija kalaja na

čeličnim pločama (elecrtolytic tinplate). Posude koje su napravljene od kalajisanog

lima se premazuju posebnim lakovima u cilju dobijanja inertne barijere između metala

i upakovanog proizvoda. Pored toga što je odlična prepreka za gasove, vlagu, svetlost

i mirise, kalajisani lim je podložan hermetičkom zatvaranju i termičkoj obradi

namirnice, tako da je pogodan za proizvodnju sterilnih proizvoda. Ovaj materijal je

pogodan i za litografsku štampu, pa tako omogućava grafičku dekoraciju proizvoda.

Ima relativno malu težinu a veliku čvrstoću što ga čini lakim za skladištenje i

transport. Kalajisani lim se može reciklirati mnogo puta bez ikakvog gubitka na

kvalitetu.

Plastika

Ovo je, kvantitativno i kvalitativno, najvažnija grupa materijala za pakovanje,

kako namirnica tako i ostalih proizvoda (Miltz, 1992; Jenkins i sar., 1991). Postoji

velika raznovrsnost plastičnih materijala za pakovanje. Oni mogu biti fleksibilni ili

čvrsti, providni ili neprozirni, termoreaktivni ili termoplastični. Od njih se mogu

napraviti plastični filmovi ili posude različitih oblika i veličina. Plastični materijali su

mnogo jeftiniji u odnosu na staklene i metalne. Oni su i veoma pogodni za primenu

naprednih tehnologija pakovanja kao što su pakovanje u modifikovanu atmosferu,

aktivno i inteligentno pakovanje. Za razliku od stakla i metala, plastični materijali su

propustljivi za male molekule u manjem ili većem stepenu. Upravo zbog ove

činjenice, plastični materijali su propustljivi za gasove i vlagu, i dozvoljavaju

migraciju molekula niske molekulske mase iz pakovanja u hranu. Migracija pojedinih

komponenti plastičnih materijala u hranu i njihov uticaj na zdravlje čoveka, kao što je

bisfenil A, su ispitivani u velikom broju istraživanja. Međutim, uprkos bezbednosnim


71

aspektima, upotreba plastičnih materijala je sve više prisutna u prehrambenoj

industriji zbog cene koštanja i funkcionalnih karakteristika (Lopez-Rubio i sar., 2004).

Poliolefine čine dve grupe plastičnih materijala koje imaju najširu primenu u

tehnologiji pakovanja, to su polietileni i polipropileni. Ove dve gupe materijala

odlikuje fleksibilnost, čvrstoća, prozirnost, nepropusnost za vlagu i gasove, a takođe

su pogodni za reciklažu i ponovnu upotrebu.

Polietilen teraftalat (PET), polikarbonat i polietilen naftalat (PEN) čine grupu

plastičnih materijala koja se označava kao poliestri. Polietilen teraftalat je dobra

barijera za gasove i vlagu, otporan je na spoljne uticaje i našao je široku primenu u

pakovanju gaziranih pića (van Willige i sar., 2002). Polikarbonat je našao primenu u

proizvodnji plastičnih čaša. Ono što je značajno napomenuti za ovaj materijal je to da

se njegovim tretiranjem jakim deterdžentima može osloboditi bisfenol A koji može

predstavljati opasnost po zdravlje potrošača (vom Saal i sar., 2005). Polietilen naftalat

je materijal koji ima jaka barijerna svojstva prema mirisima pa se, u novije vreme, sve

više koristi za proizvodnju plastične ambalaže za pivo.

Polivinil hlorid (PVC) je čvrst, težak, amorfan i providan plastičan materijal. Ima

odličnu otpornost ka hemikalijama (kiselinama i bazama), mastima i ulju, kao i

stabilne električne osobine. PVC je podložan termoformiranju pa se ta njegova

osobina koristi prilikom pakovanja proizvoda od mesa.

Polistiren je krt, lomljiv plastičan materijal sa relativno niskom tačkom topljenja.

Koristi se za proizvodnju pakovanja za jaja, escajga za jednokratnu upotrebu,

poklopaca, šolja, plastičnih tanjira, boca i ostalih posuda za hranu.

Poliamid, poznat još i kao najlon, je materijal koji se prvenstveno koristio u

tekstilnoj a, danas, je svoju primenu našao i u prehrambenoj industriji. On pruža dobru

zaštitu od hemijskih uticaja, čvrstoću i slabu propustljivost za gasove.

Etilen vinil alkohol (EVOH) je polimer etilena i vinil alkohola. On je odlična

barijera za ulja, masti i kiseonik. Međutim, ovaj materijal je veoma osetljiv na vlagu

pa se zbog toga isključivo koristi u višeslojnim materijalima, pri čemu je uvek

orijentisan tako da ne dolazi u kontakt sa tečnostima.


72

Plastični materijali se mogu proizvoditi kao filmovi od pojedinačnih materijala ili

kao kombinacija više materijala u jednom filmu. Postoje dva načina spajanja dva ili

više različitih materijala u jedinstven film, to su laminacija i koekstruzija. Laminacija

predstavlja spajanje dva ili više filma koji su napravljeni od različitih plastičnih

materijala ili njihovo spajanje sa sa aluminijumom i papirom. Laminacija više

materijala se može postići upotrebom različitih adhezivnih sredstava kao i upotrebom

lasera (Kirwan i sar., 2003). Koekstruzija predstavlja stapanje dva ili više različita

plastična filma u jedan. Ovaj proces je brži ali zahteva upotrebu materijala čije

termalne karakteristike dozvoljavaju koekstruziju.

Papir i karton

Upotreba papira i kartona za pakovanje hrane datira iz 17-og veka, pri čemu je

ova tehnologija pakovanja nagli razvoj doživela u 19-om veku (Kirwan, 2003). Papir i

karton su materijali koji se sastoje od isprepletane mreže celuloznih vlakana koja se

dobija iz drveta uz upotrebu sulfata i sulfita, a zatim tretiraju hemikalijama u cilju

izbeljivanja. Običan papir se ne koristi za pakovanje i zaštitu hrane na duži vremenski

period zbog toga što ima slaba barijerna svojstva i ne obezbeđuje hermetičnost

pakovanja. Kada se koristi kao primaran materijal za pakovanje (kada je u kontaktu sa

hranom) papir se gotovo obavezno laminira ili impregnira različitim materijalima, kao

što su voskovi ili lakovi, da bi mu se poboljšala funkcionalna i protektivna svojstva.

Karton je materijal deblji od papira, sa većom masom, i obično se sastoji od većeg

broja slojeva. Obično se koristi za pravljenje kartonskih kutija i retko je u direktnom

kontaktu sa hranom (Soroka, 1999).

Mašine za punjenje ambalažnih materijala

Mašine za punjenje ambalaže su, obično, najvažniji delovi proizvodnih linija u

pogonima prehrambene industrije. Mašine za punjenje obavljaju dve veoma bitne

funkcije. One mere unapred određenu količinu namirnice koja se zatim pakuje u

ambalažnu jedinicu. Ovi uređaji mere namirnice prema njihovoj zapremini ili prema

masi. Mnoge mašine za punjenje se mogu podesiti da pune različite vrste proizvoda.


73

Volumetrijske mašine za punjenje i pakovanje mere određenu zapreminu

proizvoda za svaku jedinicu ambalaže. Klipni punjači su najčešća vrsta volumetrijskih

punjača. Ova vrsta mašina radi u dva takta, u prvom taktu izvlačenje klipa iz cilindra

za merenje sadržaja automatski u njega, iz rezervoara kroz centralni ventil, uvlači

određenu količinu sadržaja koji se, zatim, u drugom taktu, uvlačenjem klipa u cilindar

izbacuje u ambalažnu jedinicu. Dijafragmatski punjači rade na sličnom principu kao i

klipni, uz to da umesto klipa i cilindra oni imaju fleksibilnu dijafragmu, čijom

promenom oblika se istiskuje unapred određena količina sadržaja. Kod protočnih

punjača, tečan proizvod se konstantnom brzinom kreće kroz cev određene dužine, a

količina upakovane namirnice zavisi od vremena tokom koga se ambalažna jedinica

nalazi na poziciji za punjenje. Svrdlasti punjači predstavljaju široko upotrebljavan

oblik volumetrijskih punjača u prehrambenoj industriji. Koriste se za pakovanje suvih

proizvoda i proizvoda u obliku gustih pasta.

Težinski punjači se koriste za pakovanje proizvoda koji nemaju homogenu

gustinu, pri čemu oni mere masu proizvoda koji ide u ambalažnu jedinicu. Postoje dva

tipa težinskih punjača, oni koji mere neto i oni koji mere bruto masi.

Zaključak

S obzirom na veličinu sredstava koja se ulažu u industriju ambalaže, možemo

očekivati veoma brz dalji napredak sistema pakovanja. Međutim, iako je tehnologija

pakovanja danas veoma razvijena i pruža brojne mogućnosti, svako pakovanje hrane

mora da ispuni one osnovne funkcije, a to je da održi bezbednost i kvalitet namirnice

tokom roka trajanja. Mnogi postupci konzerviranja i dalje umnogome zavise od

kvaliteta ambalaže. Napredak u razvoju ambalažnih materijala u smislu smanjenja

troškova proizvodnje mora biti pažljivo uravnotežen. Uporedo sa unapređenjem

osnovne uloge materijala koji se koriste u ove svrhe, u budućnosti će se sve više

pažnje posvećivati ekologiji jer je ambalažni otpad jedan od velikih problema

modernog društva. Osnovi zahtevi u ovom pogledu usmereni su na mogućnost


74

reciklaže i višekratne upotrebe ambalaže, kao i na mogućnost njenog biološkog

razgrađivanja.

Literatura

Coles R. Introduction. In: Coles R, McDowell D, Kirwan MJ. Food packaging

technology. London, Blackwell Publishing. 2003: 1-31. 2. Cornforth D, Hunt M.

Low-Oxygen Packaging of Fresh Meat with Carbon Monoxide. Meat Quality,

Microbiology and Food Safety. The American Meat Science Association. White paper

series, 2; 2008. 3.Danielli D, Gontard N, Spyropoulos D, Zondervan-van den Beuken

E, Tobback P. Active and intelligent food packaging: legal aspects and safety

concerns. Review in trends in Food Science & Technology 2008; 19: 99-108. 4.

Fellows P, Axtell B. Packaging materials. In: Fellows P, Axtell B, editors.

Appropriate food packaging: materials and methods for small businesses. Essex, UK.

ITDG Publishing. 2002: 25-77. 5. Jenkins WA, Harrington JP. Packaging Food with

Plastics. Technomic Publishing Co, Lancaster, 1991. 6. Kelsey RJ. Packaging in

Today`s Society, third ed. Technomic, Lancaster, 1985.7. Kerry JP, O Grady MN,

Hogan SA. Past, current and potential utilization of active and intelligent packaging

systems for meat and muscle – based products: A review. Meat Science 2006; 74:

113-30. 8. Kirwan MJ, Strawbridge JW. Plastics in food packaging. In: Coles R,

McDowell D, Kirwan MJ. Food packaging technology. London, Blackwell

Publishing. 2003: 174-240. 9.Kirwan MJ. Paper and paperboard packaging. In: Coles

R, McDowell D, Kirwan MJ. Food packaging technology. London, Blackwell

Publishing. 2003: 241-281. 10. Kuzmanović J. Ispitivanje činilaca od značaja za rast

različitih sojeva Listeria monocytogenes u filetima hladno dimljene pastrmke.

Doktorska disertacija. Univerzitet u Beogradu, 2013. 11.Lopez-Rubio A, Almenar E,

Hernandez-Munoz P, Lagaron JM, Catala R, Gavara R. Overview of active polymer-

based packaging technologies for food application. Food Reviews International, 2004;

20: 357-87. 12.Marsh K, Bugusu B. Food packaging: roles, materials and

environmental issues. Journal of Food Science 2007; 72: 39-55. 13.McKown C.


75

Containers. In: Coeting on glass-technology roadmap workshop. 2000 jan 18-19.

Livemore, California: Sandia National Laboratories report 2000: 8-9. 14.Miltz J. Food

packaging. In: Heldman DR, Lund DB. Handbook of Food Engineering. Marcel

Dekker, New York. 1992. 15.Murcia MA, Martinez-Tome, Nicolas MC, Vera AM.

Extending the shelf-life and proximate composition stability of ready to eat foods in

vacuum or modified atmosphere packaging. Food Microbiology 2003; 20: 671-79. 16.

Page B, Edwards M, May N. Metal cans. In: Coles R, McDowell D, Kirwan MJ. Food

packaging technology. London, Blackwell Publishing. 2003: 121-51. 17.Restucia D,

Gianfranco Spizzirri U, Parisi OL, Cirillo G, Curcio G, Iemma F. New EU legislation

aspects and global market of active and intelligent packaging for food industry

application. Food Control 2010; 21: 1425-35. 18. Robertson GL. Food Packaging,

Principles and Practice, first ed. Marcel Dekker, New York, 1993. 19. Robertson GL.

Food packaging, Principles and Practice, second ed. CRC Press, New York, 2005. 20.

Soroka W. Paper and paperboard. In: Emblem A, Emblem H, editors. Fundamentals

of packaging technology. 2nd ed Herndon. 1999: 95-112. 21. van Willige RWG,

Linssen JPH, Meinders MBJ, van der Steger HJ, Voragen AGJ. Influence of flavour

absorption on oxygen permeation through LDPE, PP, PC and PET plastics food

packaging. Food Additives and Contaminants, 2002; 19: 303-13. 22. vom Saal FS,

Hughes C. An extensive new literature concerning low-dose effects of bisphenol A

shows the need for a new risk assessment. Environmental Health Perspectives, 2005;

113: 926-33. 23. Yokoyama Y. Materials in packaging. In: Hashimoto S. (Ed.),

Package Design in Japan, vol. 1. Rikuyo-sha Publishing, Tokyo, Japan. 1985: 113-15.


76

8. ZNAČAJ I UPOTREBA NANOPAKOVANJA U INDUSTRIJI HRANE

Mirjana Dimitrijević*1, Marija Bošković

*, M. Baltić

*, N. Karabasil

*, V. Teodorović

*,

D. Vasilev*, Vera Katić

*

*Katedra za higijenu i tehnologiju namirnica animalnog porekla, Fakultet veterinarske

medicine Univerziteta u Beogradu

Kratak sadržaj

U cilju zadovoljenja sve većih potreba za proizvodnjom hrane koja će do

potrošača stići u bezbednom stanju, a istovremeno zadovoljiti njihova očekivanja u

pogledu kvaliteta, industrija pakovanja se konstantno razvija i teži ka implementaciji

novih tehnologija u koje spada i nanotehnologija. Aplikacijom nanočestica i drugih

nanomaterijala različitih organskih i neorganskih jedinjenja u standardne materijale za

pakovanje omogućava se poboljšanje osobina pakovanja kao što su fleksibilnost,

čvrstina, propustljivost za gasove, vlažnost i svetlost, termalna i hemijska stabilnost i

biorazgradivost. Takođe, primena nanopolimernih materijala omogućava konstantan

monitoring uslova u pakovanju i na taj način konzerviranje sveže hrane, produžavanje

održivosti namirnice, kao i poboljšanje kvaliteta i bezbednosti. Upotreba

nanopakovanja na tržištu je dosta usporena i onemogućena nedostatkom podataka o

potencijalnom riziku po zdravlje ljudi i uticaju na životnu sredinu, kao i nedostatkom

zakonskih regulativa. Ovi nedostaci utiču i na opštu sliku koju potrošači imaju o

upotrebi nanotehnologije, ali kada se ovi problemi jednom prevaziđu upotreba

nanopakovanja obećava da postane nezamenjiv deo industrijske proizvodnje hrane.

Ključne reči: nanotehnologija, pakovanja, antibakterijske osobine, meso

Abstract

In order to satisfy increasing demand for food production which will reach the

consumers in a safe condition, and at the same time meet their expectations in terms of

quality, the packaging industry is constantly developing and strives to implement new

technologies which include nanotechnology. Application of nanoparticles and other

1Autor za kontakt: [email protected]



77

nanomaterials various organic and inorganic compounds in standard packaging

materials improve the packaging properties of the polymer-flexibility, gas barrier

properties, temperature/moisture/ light stability, thermal and chemical stability and

biodegradability. Moreover, the use of polymer nanotechnology allows constant

monitoring of packaging conditions, allowing preservation of fresh food, extending

the shelf life of foods, as well as improving quality and safety of products. Use of

nanopackaging on the market is slowed by a lack of data on potential risk to human

health and environmental impact, as well as the lack of legislation. These

shortcomings affect the public perception of nanotechnology, but when these

problems are overcome application of nanopackaging promises to become an

irreplaceable part of industrial production of food.

Key words: nanotechnology, packaging, antibacterial properties, meat


78

9. NOVI POGLEDI NA NALAZ YERSINIA ENTEROCOLITICA U MESU

SVINJA- PREŽIVLJAVANJE U MODIFIKOVANOJ ATMOSFERI I

VAKUUM PAKOVANJU

Jelena Ivanović1*

, Milan Ž. Baltić*, Jelena Janjić

*, Marija Bošković

*, Marija

Dokmanović*, Tatjana Baltić

**, Vesna Đorđević

**

*Katedra za higijenu i tehnologiju namirnica animalnog porekla, Fakultet

veterinarske medicine, Univerzitet u Beogradu

** Institut za higijenu mesa, Kaćanskog br.13, Beograd

Kratak sadržaj

Prema podacima Svetske zdravstvene organizacije (WHO), bolesti prenosive

hranom predstavljaju narastajući problem javnog zdravlja u zemljama u razvoju,

zemljama u tranziciji, ali i u razvijenim zemljama. Najčešći izazivači alimentarnih

infekcija poreklom iz mesa su: Salmonella spp., Campylobacter spp., Yersinia

enterocolitica, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium

botulinum, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Shigella. Jersinioza ljudi je

oboljenje koje se dovodi u vezu sa svinjskim mesom i proizvodima od svinjskog

mesa. U okviru ovog rada je ispitivana promena broja Y. enterocolitica u mlevenom

svinjskom mesu koje je pakovano u dve različite modifikovane atmosfere (20% O2,

50% CO2 i 30% N2-MAP 1 i 20% O2, 30% CO2 i N2 -MAP 2) i vakuum pakovanje. Za

potrebe ovog ispitivanja mleveno meso svinja je kontaminirano referentnim sojem

Y.enterocolitica (ATCC 9610). Intenzivniji porast broja bakterija Y. enterocolitica kod

eksperimentalno kontaminiranih uzoraka svinjskog mesa, u MAP 2, zapažen je posle

šestog dana skladištenja.

Ključne reči: svinjsko meso, Yersinia enterocolitica, pakovanje




79

Uvod

Y. enterocolitica je treći najčešći uzročnik bolesti koji se prenosi hranom (EFSA,

2012). U 2010. godini prijavljeno je ukupno 6776 slučajeva jersinioze u Evropskoj

uniji, što je 1,58 slučajeva na 100.000 stanovnika. U većini slučajeva glavni uzročnik

bolesti je bila Y. enterocolitica dok je samo mali broj članica zemalja Evropske Unije

izvestio da je uzročnik Y. pseudotuberculosis (EFSA, 2012). Prema podacima Instituta

za javno zdravlje Srbije ”Dr Milan Jovanović Batut” broj obolelih sa simptomima

gastroenteritisa i dijareje u periodu 2012. godine iznosio je 8810. Najčešće oboljenje

koje se dovodi u vezu sa hranom je bila salmoneloza, gde je broj obolelih iznosio

1494, za 2012. godinu. Posle salmoneloze, kampilobakterioza je najzastupljenija sa

315 potvrđenih slučajeva u toku 2012. godine. Broj potvrđenih slučajeva u periodu

2012. godine obolelih od jersinioze bio je 22. Prema ovim statističkim podacima,

jersinioza je na trećem mestu u odnosu na sve alimentarne infekcije.

Zbog psihrotrofnih karakteristika Y.enterocolitica ima sposobnost umnožavanja

tokom skladištenja mesa i proizvoda od mesa. Međutim, sposobnost da opstane, pored

velikog broja psihrotrofnih mikroorganizama koji se nalaze uobičajeno u mesu, pri

odgovarajućoj pH vrednosti, jeste mala, posebno pri niskim temperaturama. Na višim

temperaturama (>5 ºC) i u mesu sa većom pH vrednošću, Y.enterocolitica se može

umnožavati. Ovaj patogen nema sposobnost preživljavanja pasterizacije i kuvanja.

Sposobnost razmožavanja na temperaturi frižidera u vakuum pakovanjima sa

produženim rokom trajanja (Bercovier i Mollaret, 1981) jeste od velikog značaja u

higijeni namirnica. Unakrsna kontaminacija trupova svinja sa Y. enterocolitica je

moguća u objektima za proizvodnju u preradu mesa (Ivanović i sar., 2013). Najčešće

su izvori kontaminacije usna duplja i creva. Takođe unakrsna kontaminacija je

moguća i na temperaturi frižidera, što se posebno odnosi na “ready-to-eat“ hranu

(Jackson i sar., 2007).

U Evropi, svinje su najčešći asimptomatski nosioci za ljude patogenih sojeva

Y.enterocolitica, posebno soja biotipa 4 (serotipa O:3) i ne tako učestalog biotipa 2


80

(serotip O:9 i O:27). Uzročnici su najčešće lokalizovani u oralnoj duplji, posebno u

tonzilama, submaksilarnim limfnim čvorovima, crevima i fecesu (Fondrevez i sar.,

2010; Gutler i sar., 2005). Postoje izveštaji da je učestalost Y.enterocolitica čak preko

80% zapata svinja (Grahek-Ogden i sar., 2007). Od 30% do 80% uzoraka tonzila

svinja utvrđeno je kao pozitivno, oko 25% fekalnih kliconoša i 10-25% trupova svinja

bilo je pozitivno nakon klanja. Tokom klanja, trupovi svinja mogu lako da budu

kontaminirani ovim patogenom putem fekalne kontaminacije i iz usne duplje, pa se

sojevi biotipa 4 (serotip O:3) mogu često naći na površinama trupova svinja

(Fredriksson-Ahomaa i sar., 2007). Tehnika klanja i sama higijena klanja imaju veliki

uticaj na učestalost kontaminacije. Fekalna kontaminacija može biti značajno

redukovana podvezivanjem rektuma, pri evisceraciji. Postupci sa glavom tokom

obrade trupa (uklanjanje tonzila, razdvajanje trupova i post mortem inspekcija) može

da dovede do širenja Y.enterocolitica koje se nalaze na ovom delu trupa.

Preživljavanje i rast mikroorganizama u mesu, u velikoj meri, zavise od sastava

gasova u pakovanju (Doulgeraki i sar., 2012). Poznato je da skladištenje mesa u

aerobnim uslovima može da ubrza kvar usled brzog rasta Pseudomonas vrsta, dok

vakuum i MAP (Modified atmosphere packaging) pakovanje favorizuju dominaciju

fakultativno anaerobne populacije, uključujući bakterije mlečne kiseline i Brochothrix

thermosphacta (Lambropoulou i sar., 1996). Unutar vakuum pakovanja, rezidualni

kiseonik se koristi za tkivnu respiraciju i zamenjuje CO2, zbog čega dolazi do

inhibicije rasta Pseudomonas, Acinetobacter i Moraxella vrsta i produženja održivosti

proizvoda. Ove aerobne bakterije troše sav rezidualni kiseonik, a kao posledica toga

dolazi do rasta Brochothrix thermosphacta i bakterija iz familije Enterobacteriaceae,

kao fakultativnih anaeroba. Na kraju dolazi do rasta Gram pozitivnih bakterija,

odnosno bakterija mlečne kiseline.

Enterobakterije iz roda Serratia, Enterobacter, Pantonea, Klebsiella, Proteus i

Hafnia često doprinose kvaru mesa, kao i kvaru vakuum upakovanog mesa. Bakterije

mlečne kiseline su važan kompetitor drugim bakterijama kvara u vakuumu ili

modifikovanoj atmosferi (Nychas i Scandamis, 2005). Bakterije mlečne kiseline, kao


81

slabi proteoliti, ne proizvode velike količine amina i sulfita i promene koje nastaju u

mesu usled njihovog rasta nisu toliko drastične.

Cilj ovog rada je bio ispitivanje mogućnosti rasta Y.enterocolitica u svinjskom

mesu u pakovanjima sa modifikovanom atmosferom (različite smeše gasova) i

vakuumu.

Materijal i metode

Sirovo mleveno meso svinja preuzeto je iz lokalne klanice i savlemeno na mašini

za mlevenja mesa promer, otvora na ploči 4 mm. Mleveno meso je zatim

kontaminirano sa 40 ml inokuluma koji sadrži kulturu Y. enterocolitica ATCC 9610

(8-9 log10

CFU/ml). Ovako pripremljeno mleveno svinjsko meso je pakovano u

vakuum pakovanje (prva grupa), modifikovanu atmosferu 1 (druga grupa) i

modifikovanu atmosferu 2 (treća grupa). Odnos gasova u pakovanju u modifikovanoj

atmosferi je iznosio 20% O2, 50% CO2 i 30% N2 (MAP 1), a u drugom pakovanju

odnos gasova je bio 20% O2, 30% CO2 i 50% N2 (MAP 2). Za pakovanje uzoraka

upotrebljena je mašina za pakovanje „Variovac“ (Variovac Primus, Zarrentin,

Nemačka). Kao materijal za pakovanje korišćena je folija OPA/EVOH/PE

(orijentisani poliamid/etilen vinil alkohol/polietilen, Dynopack, Polimoon,

Kristiansand, Norveška) sa niskom propustljivošću za gas (stepen propustljivosti za

O2 – 3,2 cm3/m

2/dan pri 23 °C; za N2 – 1 cm

3/m

2/dan pri 23 °C; za CO2 – 14

cm3/m

2/dan pri 23 °C i za vodenu paru 15 g/m

2/dan pri 38 °C). Masa svakog

pakovanja je iznosila 100 g. Nakon pakovanja uzorci su čuvani tokom dvanaest dana,

pri temperaturi frižidera od 4±1 °C. Mikrobiološka ispitivanja su vršena 0, 3, 6, 9 i 12

dana skladištenja.

Određivanje Y. enterocolitica vršeno je prema BS EN ISO 10273:2003,

Mikrobiologija hrane i hrane za životinje - Horizontalna metoda za otkrivanje

Yersinia enterocolitica.

Statistička analiza dobijenih rezultata urađena je u statističkom paketu GrapfPad

Prism 5.00 (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com). Za


82

statističku obradu podataka korišćeni su deskriptivni statistički parametri. Za

ispitivanje značajnih razlika korišćen je grupni test ANOVA. Dobijeni rezultati su

prikazani tabelarno i grafički.

Rezultati i diskusija

Meso može da bude značajan izvor bolesti prenosivnih hranom. U cilju smanjenja

mogućnosti kontaminacije mesa patogenim mikroorganizmima i u cilju očuvanja

kvaliteta i održivosti mesa i proizvoda od mesa, većina proizvođača se odlučuje za

različite vrste pakovanja hrane. Pakovanje mesa je danas najdinamičnije područje

tehnologije mesa, koji ostvaruje stalni napredak u prehrambenoj industriji. Vakuum

pakovanja i pakovanja sa modifikovanom atmosferom se sve češće mogu zapaziti u

supermarketima i lancima maloprodajne mreže mesa. Pored toga što ova pakovanja

čuvaju kvalitet i održivost mesa, imaju povoljne uticaje i na senzorne karakteristike

mesa, koje kod potrošača imaju veliki značaj (Ivanović, J., 2014).

Rezultati promene prosečnog broja bakterija Yersinia enterocolitica u mlevenom

svinjskom mesu tokom dvanaest dana skladištenja prikazani su u tabeli 1.

Tabela 1 Promena prosečnog broja Y. enterocolitica u oglednim uzorcima svinjskog mesa

u toku skladištenja (log CFU/g)

Grupa Dani skladištenja (X ± Sd)

0. 3. 6. 9. 12.

OI 6,34±0,21 6,52AB±0,05 6,67A±0,04 6,81AB±0,04 7,56Aa±0,06

OII 6,34±0,21 6,11AC±0,05 6,64B±0,05 6,61AC±0,07 7,32AB±0,07

OIII 6,34±0,21 5,81BC±0,04 7,10AB±0,03 7,67BC±0,05 7,47aB±0,04

Napomena: Ista slova A, B, C- p<0,01; Isto slovo a- p<0,05

Legenda: OI- Ogledni (kontaminiran) uzorak pakovan u vakuum

OII- Ogledni uzorak pakovan u MAP 1

OIII- Ogledni uzorak pakovan u MAP 2


83

U uzorcima mlevenog mesa pre inokulacije nije utvrđeno prisustvo Y.

enterocolitica. Prosečan broj bakterija Y.enterocolitica rastao je od nultog do

dvanaestog dana kod OI grupe od 6,34±0,21 log CFU/g do 7,56±0,06 log CFU/g, kod

OII grupe 6,34±0,21 log CFU/g do 7,32±0,07 log CFU/g i kod OIII grupe od

6,34±0,21 log CFU/g do 7,47±0,04 log CFU/g (tabela 1). Između poređenih dana

ispitivanja kod sve tri grupe uzoraka u većini slučajeva između prosečnih brojeva

Y.enterocolitica utvrđena je statistički značajna razlika (p<0,01, p<0,05).

Prema našim rezultatima prosečan broj Y. enterocolitica na početku skladištenja

bio je 6,34±0,21 log CFU/g. Do dvanaestog dana skladištenja prosečan broj Y.

enterocolitica je bio najveći u uzorcima pakovanih u vakuum (7,56±0,06 log CFU/g),

zatim u uzorcima pakovanih u MAP 2 (7,47±0,04 log CFU/g) a najmanji u uzorcima

koji su pakovani u MAP 1 (7,32±0,07 log CFU/g). Najmanji porast Y. enterocolitica u

uzorcima pakovanih u MAP 1 (gde je bila najveća koncentarcija CO2) se može

objasniti činjenicom da CO2 ima antibakterijski efekat na pomenutog patogena

(grafikon 1).

Grafikon 1. Trend rasta prosečnog broja Y.enterocolitica u različitim pakovanjima

svinjskog mesa tokom ispitivanja

Do sličnih zaključaka su došli Conte- Junior i sar. (2010). U njihovim

istraživanjima Y. enterocolitica nije rasla u uzorcima pakovanih u MAP sa 100% CO2.

Isto je primećeno od strane Bodnaruk Draughon (1998) i Tassou i sar. (2004). Ovi


84

autori su proučavali svinjsko meso i različite proizvode od mesa kao i temperature

skladištenje, koji mogu da potvrde bakteriostatski efekat 100% CO2 na Y.

enterocolitica. U oglednim uzorcima koji su pakovani u 100% N2, uočen je rast Y.

enterocolitica. Shenoi i Murano (2006) su takođe detektovali rast ovog patogena u

mlevenom svinjskom mesu pakovanom u različitoj koncentraciji kiseonika i ugljen

dioksida čuvanog pri 4 oC.

Strotmann i sar. (2008) u svom istraživanju su prikazali rast Y. enterocolitica pri

različitim smešama i koncenracijama gasova. Međutim, rast Y. enterocolitica nije

detektovan u pakovanju sa 100% CO2 na temperaturi skladištenja od 4 oC. Takođe,

rezultati ovih istraživača pokazuju da je rast Y. enterocolitica bio smanjen u

pakovanjima sa visokom koncentracijom kiseonika. Slične rezultate su dobili Viana i

sar. (2005). Smanjenje rasta Y. enterocolitica se može dovesti u vezu sa povećanjem

ukupnog broja bakterija. Ovo se objašnjava pre svega stvaranjem uslova sa

nepovoljnom pH vrednosti za rast Y. enterocolitica kao i deficitu hranljivih materija

neopodnih za rast ovog patogena. Prema preporuci Strotmanna i sar. (2008)

najprihvatljivija mešavina gasova koja će inhibirati rast Y. enterocolitica, a neće

uticati na senzorna svojstva mesa i proizvoda od mesa je 30%CO2/70%O2.

Y. enterocolitica može da raste u pakovanjima sa 100% kiseonika i u MAP

pakovanju sa 100% N2, na temperaturi skladištenja 4±1oC (Manu – Taviah, 2003).

Rast Y. enterocolitica može da bude uočen u MAP pakovanjima sa 20%CO2/80%N2,

ali je suprimiran dejstvom niske temperature skladištenja (ispod 4 o

C) (Manu –

Taviah, 2003). Van Den Elzen i sar. (2004) primetili su veoma mali rast ovog

patogena u svinjskom mesu, u MAP pakovanju sa 25%CO2/65%O2/10%N2, na

temperaturi skladištenja od 3 oC. Kombinacija CO2 i O2 teži da inhibira rast ovog

patogena, što može da objasni razlike između rezultata do kojih su došli navedeni

autori.

Shenoi i Murano (2006) su uočili rast Y. enterocolitica u MAP pakovanju sa

smešom gasova u odnosu 50% CO2/50%N2. Hudson i sar. (1994) su naveli da je za


85

inhibiciju rasta Y.enterocolitica potrebna atmosfera sa više od 75% CO2 i potpuno

odsustvo O2. Ova zapažanja potvrđuju bakteriostatski efekat CO2.

Infektivna doza Y. enterocolitica u hrani koja je pakovana u MAP je i dalje

nepoznata (Long i sar., 2010). Međutim, raniji radovi pokazuju (Bhaduri i Tarner,

1993) da je ipak očuvana virulentnost Y. enterocolitica čak i u anaerobnim uslovima i

u smešama sa CO2, pa može da bude uzročnik bolesti prenosive hranom. Ispitivanje

opstanka Y.enterocolitica u vakuum i MAP pakovanju postaje značajna sa aspekta

zdravlja ljudi, posebno zbog mogućnosti prisustva i rasta u tim uslovima.

Napomena

Ovaj rad je finansiran sredstvima projekta broj TR 31034 Ministarstva prosvete,

nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije.

Spisak literature

Anon., EFSA. 2010.The European Union Summary Report on Trends and Sources

of Zoonoses, Agents and food-borne Outbreaks in 2010. EFSA Journal 10 (3):2597. 2.

Bhaduri S, Turner-Jones C. 1993.The effect of anaerobic atmospheres on the stability

of the virulence-related characteristics in Yersinia enterocolitica. Food Microbiology,

10:239-242. 3. Bercovier H, Mollaret H H, Alonso J M, Brault J, Fanning G R,

Steigerwalt A G, Brenner, D J. 1981.In Validation of the publication of new names

and new combinations previously effectively published outside the IJSB. List no.

7.Int. J. Syst. Bacteriol. 31, 382–383. 4. Conte-Junior C A, Macedo B T, Lopes M M.

2010. “Effect of modified atmosphere packaging on the growth/survival of Yersinia

enterocolitica and natural flora on fresh poultry sausage,” in Book Current Research,

Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial

Biotechnology, A. Mendaz-Vilas, Ed., 1217–1223. 5. Doulgeraki A I, Ercolini D,

Villani F, Nychas G. J E. 2012. Spoilage microbiota associated to the storage of raw

meat in different conditions. International Journal of Food Microbiology, 157, 130–

141. 6. Fredriksson-Ahomaa M, Stolle A, Stephan R. 2007. Prevalence of pathogenic


86

Yersinia enterocolitica in pigs slaughteredat a Swiss abattoir. Int. J. Food Microbiol.

119, 207–212. 7. Grahek-Ogden D, Schimmer B, Cudjoe K S, Nyg°ard K, and

Kapperud G. 2007. “Outbreak of Yersinia enterocolitica serogroup O:9 infection and

processed pork, Norway,” Emerging Infectious Diseases, 13 (5): 754–756. 8. Gutler

M, Alter T, Kasimir S, Linnebur M, Fehlhaber K. 2005. Prevalenceof Yersinia

enterocolitica in fattening pigs. Journal of Food Protection, 68(4):850-854. 9. Hudson

A J, Mott S J, Penney N. 1994. Growth of Listeria monocytogenes, Aeromonas

hydrophila, and Yersinia enterocolitica on vacuum and saturated carbon dioxide

controlled atmosphere-packaged sliced roast beef. Journal of Food Protection.

57:204-208. 10. Ivanović J, Baltić M Ž., Karabasil N, Dimitrijević M, Antić N, Janjić

J, Đorđević J. 2013. Ispitivanje mikrobiološke kontaminacije površina koje dolaze u

kontakt sa mesom u objektu za preradu mesa Tehnologija mesa, 54 (2): 110-116. 11.

Ivanović J. 2014. Ispitivanje uticaja različitih načina pakovanja na rast Yersinia

enterocolitica u mesu svinja, Doktorska disertacija, Beograd. 12. Jackson V, Blair I,

McDowell D, Kennedy J, Bolton D. 2007. The incidence of significant foodborne

pathogens in domestic refrigerators. Food Control, 18(4):346-351. 13. Fondrevez M,

Labbe A, Houard E, Fravalo P, Madec F. and Denis M. 2010. A simplified method for

detecting patthogenic Yersinia enterocolitica in slaughtered pig tonsils. Journal of

Microbiological Methods, 83, 244-249. 14. Long C, Jones T F, Vugia D J, Scheftel J,

Strockbine N, Ryan P, Shiferaw B, Tauxe R V, Gould LH. 2010. Yersinia

pseudotuberculosis and Y. enterocolitica infections, FoodNet, 1996–2007. Emerging

Infectious Diseases. 16:566-567. 15. Manu-Tawiah W, Myers D J, Olson D G, Molins

R A. 1993. Survival and growth of Listeria monocytogenes and Yersinia

enterocolitica in pork chops packaged under modified gas atmospheres. Journal of

Food Science. 58:475-479. 16. Nychas G J E, Skandamis P. 2005. Fresh meat

spoilage andmodifi ed atmospherepackaging (MAP). In: Sofos, J.N.(Ed.), Improving

the Safety of Fresh Meat. CRC/Woodhead Publishing Limited, Cambridge, 20461–

502. 17. Lambropoulou K A, Drosinos E H, Nychas G J E. 1996. The effect of

glucose supplementationon the spoilage microflora and chemical composition of

http://scindeks.ceon.rs/article.aspx?query=RELAAU%26and%2612538&page=1&sort=1&stype=0&backurl=%2fRelated.aspx%3fartaun%3d12538

http://scindeks.ceon.rs/article.aspx?query=RELAAU%26and%2612538&page=1&sort=1&stype=0&backurl=%2fRelated.aspx%3fartaun%3d12538


87

minced beefstoredaerobically or under a modifi ed atmosphere at 4°C. International

Journal of Food Microbiology, 30, 281–291. 18. Shenoy K, Murano E A. 2006. Effect

of storage conditions on growth of heat-stressed Yersinia enterocolitica in ground

pork. Journal of Food Protection. 59:365-369. 19. Strotmann T, Mueffling V, Klein G

and Nowak B. 2008. Effect of different concentration of carbon dioxide and oxygen

on the growth of pathogenic Yersinia enterocolitica 4/O:3 in ground pork packaged

under modified atmospheres. Journal of Food Protection, 71, 845-849. 20. Tassou C

C, Lambropoulou K, Nychas G J E. 2004. Effect of prestorage treatments and storage

conditions on the survival of Salmonella enteriditis PT4 and Listeria monocytogenes

on fresh marine and freshwater aquaculture fish. Journal of Food Protection. 67:193-

198. 21. Van den Elzen A M G, Houben J H, Snijders J M A. 2004. Effect of modified

atmosphere packaging on the survival of pathogens on artificially contaminated pork.

Proceedings of the 40th International Congress of Meat Science Technology. The

Hague, Holland. 22. Viana E S, Gomide L, and Vanetti M C D. 2005. Effect of

modified atmospheres on microbiological, color and sensory properties of refrigerated

pork. Meat Sci. 71:696-705. 23. Bodnaruk P W and Draughon F A .1998. Effect of

packaging atmosphere and pH on the virulence and growth of Yersinia enterocolitica

on pork stored at 4 ºC. Food Microbiology, 15:129-136.


88

10. KARAKTERIZACIJA KVALITETA MEDA I DRUGIH PČELINJIH

PROIZVODA U CILJU STVARANJA PREPOZNATLJIVOG BRENDA NA

TRŽIŠTU

Nebojša Nedić*1, Milan Baltić

**, Kazimir Matović

***, Živoslav Tešić****,

Dušanka Milojković-Opsenica****

*Univerzitet u Beogradu, Poljoprivredni fakultet,

**Univerzitet u Beogradu, Fakultet

Veterinarske medicine, ***Veterinarski specijalistički institut »Kraljevo«,

Kraljevo, ****

Univerzitet u Beogradu, Hemijski Fakultet

Godišnja proizvodnja meda u svetu iznosi oko 1,63 miliona tona. U Evropskoj

uniji proizvede se značajna količina meda, a najveća pojedinačna proizvodnja

ostvaruje se u Španiji (34.000 t), Nemačkoj (25.831 t) i Rumuniji (24.127 t). I pored

velike proizvodnje, procenjuje se da je u 2012. godini EU uvezla oko 149.248 tona

meda.

Razlike u pogledu određivanja kvalitativnih parametara meda između zemalja

članica EU dovele su do usaglašavanja i stvaranja jedinstvenog Pravilnika za ocenu

kvaliteta meda (Council Directive 2001/110/EC). Uporedo sa ovim procesom

Međunarodna komisija za med (International Honey Commission) radila je na

upoređenju različitih metoda za analizu meda i sačinila pregled harmonizovanih

metoda.

U cilju usaglašavanja domaćeg zakonodavstva sa regulativom Evropske unije,

usvojen je i počeo je sa primenom Pravilnik o kvalitetu meda i drugim zahtevima za

med, druge pčelinje proizvode, preparate na bazi meda i drugih pčelinjih proizvoda (Sl.

list SCG br.45/2003). Iako je Pravilnik većim delom usaglašen sa regulativom EU,

postoje određene razlike koje se trebaju usaglasiti. Domaćim Pravilnikom (Sl. list SCG

br. 45/2003) nisu prestale da važe odredbe Pravilnika o kvalitetu meda i drugih




89

pčelinjih proizvoda i metodama za kontrolu kvaliteta meda i drugih pčelinjih proizvoda

(Sl. list br. 4/85) a koje se odnose na metode za kontrolu kvaliteta meda i drugih

pčelinjih proizvoda. Pored standardnih analiza za osnovne pokazatelje kvaliteta meda i

drugih pčelinjih proizvoda u svetu su razvijane i složenije metode analize koje bi

ukazale na autentičnost porekla proizvoda.

Zahvaljujući prirodnim uslovima i tehnologiji pčelarenja u Srbiji je u 2013. godini

proizvedeno 8.600 tona meda od čega je rekordnih 3.371 tona plasirano na inostrano

tržište. Stvaranjem jedinstvenih kriterijuma i metoda za ocenu kvaliteta domaćeg meda

i drugih pčelinjih proizvoda usaglašenih sa regulativom Evropske unije, pruža se

mogućnost da se na odgovarajući način istaknu komparativne prednosti domaćih

pčelinjih proizvoda i afirmišu na domaćem i inostranom tržištu kroz formiranje

prepoznatljivog brenda sa dodatnom vrednošću.


90

11. PRIMENA MOLEKULARNIH TEHNIKA DIJAGNOSTIKE U

MIKROBIOLOŠKOJ ANALIZI UZORAKA MEDA

Kazimir Matović*11, Milan Baltić

**, Dušan Mišić

**, Nebojša Nedić

***, Neđeljko

Karbasil**

, Lazar Ranin****

, Jelena Ivanović**

*Veterinarski specijalistički institut Kraljevo,

**Fakultet veterinerske medicine

Univerziteta u Beogradu, ***

Poljoprivredni fakultet Univerziteta u

Beogradu, ****

Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu

Kratak sadržaj

U cilju kvalitativno kvantitativnog utvrđivanja prisustva mikroorganizama, u

uzorcima meda, koriste se klasiče i međunarodno priznate, standardne (ISO) metode

izolcije, identifikacije, kvantifikacije i determinacije.

Početkom dvadesetprvog veka a u cilju dobijanja brzih i pouzdanih rezultata

laboratorijskih ispitivanja pristupa se izvođenju molekularinih metoda u utvrđivanju

prisustva mikroorganizama u uzorcima meda. Navedene metode koristile su se za

potvrdu i determinaciju mikroorganizama već izolovanih klasičnim i standardnim

mikrobiološkim metodama ali i za direktno utvrđivanje prisustva mikroorganizama u

ispitivanim uzorcima. U navedena ispitivanja uključena su ponovljena ispitivanja

zbog fizičko-hemijskih karakteristika meda odnosno neravnomerne raspoređenosti

mikroorganizama u ispitivanim uzorcima i mogućnosti dobijanja lažno negativnih

rezultata. Molekularni pristupi u dijagnostici uključivali su osetljive i specifične

testove lančane reakcije polimeraze (PCR), lančane reakcije polimeraze u realnom

vremenu (Real-Time PCR) i metode gel-elektroforeze u pulsirajućem električnom

polju (Pulse-Field Gel Elektrophoresis–PFGE).

11

Autor za kontakt: [email protected]



91

Detekcija mikroorganizama direktno iz neobrađenih uzoraka meda nije

moguća. Zbog prisustva malog broja mikroorganizama, uglavnom spora,

neophodna je priprema uzoraka meda koja mora uključiti postupak dilucije,

predobogaćenja, centrifugovanja i membranske filtracije. Ovako dobijeni

sadržaj koristi se za izolaciju ciljanih mikroorganizama klasičnim i standardnim

metodama laboratorijske dijagnostike, odnosno za prečišćavanje i ekstrakciju

nukleinskih kiselina za molekularne metode dijagnostike.

U cilju detekcije mikroorganizama, u uzorcima meda, primenom

molekularnih metoda dijagnostike, za svaki ispitujući uzorak moraju se izvoditi

višestruka ponovljena ispitivanja zbog neravnomerne raspoređenosti

mikroorganizama/spora i mogućnosti dobijanja lažno negativnih rezultata.

U uzorcima meda kontaminiranim referentnim sojevima mikroorganizama,

molekularnim metodama može da se dokaže prisustvo jedne ćelije/spore

mikroorganizma u jednom gramu meda dok je to nemoguće dokazati

klasičnim/standardnim metodama. Klasične i standardne metode mikrobiološke

dijagnostike nisu podesne za detekciju mikroorganizama u uzorcima meda jer ove

metode zbog niske osetljivosti daju lažno negativne rezultate.

Kjučne reči: Med; Dijagnostika; Klasične/standardne metode; Molekularne

metode

Uvod

Bezbednost i kvalitet su najvažniji elementi kontrole hrane u

proizvodnji, preradi i prometu. Oni predstavljaju suštinski uslov za otkrivanje

neželjenih materija (toksini/opasne materije) i patogenih mikroorganizama

(bakterije, virusi, kvasci i plesni) u hrani (Songh i sar., 2012). Klasične metode

mikrobiološke dijagnostike predstavljaju tehnike koje počinju prečišćavanjem,

izolacijom, identifikacijom i tipizacijom mikroorganizama u različitim

neselektivnim, selektivnim medijumima i hranjivim podlogama. Po dobijanju


92

čistih kultura tehnikama bojenja, biohemijskim i/ili serološkim testovima

identifikacije i determinacije može se doći do prisutnog patogena u hrani.

Detekcija, identifikacija i kvantifikacija patogenih mikroorganizama, koji se

prenose hranom, vrlo često je otežana malim brojem prisutnih ćelija kao i

njihovom interferencijom sa matriksom hrane iz koje se izoluju.

Standardnim mikrobiološkim tehnikama nekada može biti detektovan i

izuzetno mali broj mikroorganizama. Međutim, često su za pouzdanu i potpunu

identifikaciju ciljnog mikroorganizama neophodna višestruka ponovljena

ispitivanja i primena više metoda na različitim medijumima kultivisanja. Sve to

zahteva posebne dugotrajne pripreme i procedure, specifične uslove

opremljenosti i ambijenta laboratorije kao i visoko kvalifikovano osoblje.

(Rodriguez- Lazaro i sar., 2009).

U savremenom procesu proizvodnje hrane neophodno je kontinuirano

praćenje patogena u svim fazama proizvodnje, prerade i prometa, uspostavljanje

analize rizika i kontrola kritičnih tačaka (HACCP) (Songh i sar., 2012).

Kao i ostale namirnice, med može biti kontaminiran mikroorganizmima

(Snowdon i Cliver, 1996). Izvori kontaminacije meda mikroorganizmima mogu

se podeliti na primarne i sekundarne. Primarni izvori kontaminacije meda

mikroorganizmima mogu biti polen, digestivni trakt pčela, prašina, vazduh,

zemlja. Kontaminacija poreklom iz ovih izvora ne može se kontrolisati, s

obzirom da ona potiče "od medonosne pčele". Sekundarni izvori kontaminacije

meda predstavljaju košnice, oprema, pčelari, unakrsna kontaminacija i vazduh.

Kontaminacija u ovim slučajevima nastaje najčešće zbog nepravilnih postupaka

u toku i posle vađenja, vrcanja i pakovanja meda iz košnica.

Za razliku od primarnih izvora, kontaminaciju meda, poreklom iz

sekundarnih izvora je moguće kontrolisati, i to pre svega principima dobre

proizvođačke prakse (GMP).


93

Priroda, poreklo, sastav i fizičko-hemijske karakteristike meda značajno

otežavaju pripremu, obradu i korišćenje uzoraka meda, kako u primeni klasičnih

tako i molekularnih metoda laboratorijske dijagnostike.

Zbog svega navedenog postojala je potreba za razvojem novih,

alternativnih, brzih i pouzdanih tehnologija u detekciji patogena hrane

uključujući i med (Cocolin i sar., 2011). Upravo iz tih razloga, a u cilju

detekcije i enumeracije mogućih patogena u sirovinama i krajnjim proizvodima,

u dijagnostici dolazi do primene molekularnih tehnika (Juste i sar., 2008;

Postollec i sar., 2011). Navedene tehnike molekularni biolozi razvijaju za

karakterizaciju, izolaciju i manipulaciju molekularnih komponenti ćelija i

organizama kao što su dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) i ribonukleinska

kiselina (RNK) (Rassmanith i Wagner, 2011; Taormina i sar., 2001).

Molekularne komponente omogućavaju izbegavanje pojedinih aktivnosti u

izolaciji i kultivisanju mikroorganizama. Korišćenjem jedinstvenih komponenti

DNK ćelije, na jednostavniji, pouzdaniji i brži način mogu se dobiti specifične

informacije o ćeliji na taksonomskom nivou, što dovodi do povećanja

osetljivosti i specifičnosti molekularnih metoda.

Med- elementi kvaliteta i bezbednosti

Med predstavlja visokovrednu namirnicu izuzetnog sastava i svojstava.

Kodeks standard za med (Codex stan 12-1981) definiše med kao prirodni

slatki proizvod koga proizvode medonosne pčele (Apis mellifera) od nektara

biljaka ili od sekreta živih delova biljaka, ili biljnih ekskreta koje izbacuju

insekti na žive delove biljaka, koji pčele skupljaju, transformišu i kombinuju sa

specifičnim vlastitim proizvodima, odlažu, dehidruju, skladište i ostavljaju u

ćelije saća da odstoji i sazri (Codex Alimentarius, 2001; Anon., 2002).

Navedenim formulacijama definisano je praktično dvostruko poreklo meda kao

namirnice biljnog i životinjskog porekla.

Navedena prirodna supstanca uglavnom je sastavljena od različitih šećera,

najviše od monosaharida fruktoze i glukoze, kao glavnih komponenti u


94

ukupnom učešću od 45-70%. (Anon., 2002; White, 1978) Pored fruktoze i

glukoze u medu je prisutno i preko 20 različitih disaharida odnosno

oligosaharida u procentu od oko 10-12%. Posle ugljenih hidrata voda je drugi

najzastupljeniji sastojak meda i njen udeo je najviše do 25%. (Anon., 2002)

Ostatak meda, sa oko 0,5-1,5%, u malim količinama čine druge supstance, kao

što su proteini, vitamini, minerali, enzimi, organske kiseline, antioksidansi,

flavonoidi i hidroksimetilfurfural (HMF). Različite vrste meda, kao i medovi

unutar jedne vrste razlikuju se po svom sastavu u zavisnosti od geografskog i

biljnog porekla meda, klimatskih uslova pčelarenja, rase pčela i sposobnosti

pčelara da doradi i skladišti med (White, 1978).

Sadržaj vlage u kvalitetnom medu je uglavnom od 15-18%, i ne bi smeo

prelaziti 20% izuzev medova od vrijeska i deteline do 25% (Anon., 2002). Nivo

HMF-a, koji govori o starosti i uslovima čuvanja meda odnosno eventualno

termičkim tretmanima meda, ne sme prelaziti 40 mg/kg, izuzev meda

proizvedenog u tropskim oblastima, gde je najviši dozvoljeni nivo HMF-a 80

mg/kg (Codex Alimentarius, 2001, Anon., 2002). Zbog velikog viskoziteta,

niske aktivnosti vode (0.5-0.6) i malih pH vrednosti, oko 3.9, med je nepodesan

medijum za razvoj i rast mikroorganizama (White, 1978) Inhibitorna aktivnost

meda protiv različitih bakterijskih uzročnika do sada je objavljena u više studija

(Alnaqdy i sar.,2005; Badawy i sar., 2004; Cocolin i sar., 2011; Lusby i sar.,

2005; Mundo i sar., 2004; Taormina i sar., 2001). Imajući u vidu inhibitorna

svojstava meda (Tabela 1), mikroorganizmi koji se najčešće mogu naći u medu

su kvasci, plesni i sporulirajuće bakterije (Snowdon i Cliver, 1996). Pored spora

kvasaca i plesni, spore bakterija roda Bacillus su gotovo redovan nalaz u medu,

a spore klostridija, odnosno i spore C. botulinum se takođe mogu naći u medu

(Nevas i sar., 2005, Sinacori i sar., 2014, Snowdon i Cliver, 1996). Sa

povećanjem sadržaja vode preko 20% stvaraju se uslovi za klijanje spora

kvasaca i plesni koji mogu dovesti do fermentacije i kvara meda, a to su i jedini

mikroorganizmi koji mogu rasti u medu (Snowdon i Cliver, 1996).


95

Tabela 1. Faktori antimikrobne aktivnosti meda

- Visoka osmotski pritisak kao posledica visokog sadržaja šećera

- Niska aktivnost vode (0.5-0.6)

- Nizak sadržaj belančevina

- Niska pH vrednost (3.9)

- Nizak redoks potencijal, zbog velikog broja redukujićih šećera

- Veliki viskozitet

- Glukoza oksidaza sistem učestvuje u formiranju H2O2

- Ostali antimikrobni principi kao što su flavonoidi, lizozim, fenolna kiselina,

terpentin, eterična ulja

Molekularne tehnike dijagnostike u mikrobiološkoj analizi meda

U cilju kvalitativno kvantitativnog utvrđivanja prisustva mikroorganizama,

u uzorcima meda, koriste se klasiče i međunarodno priznate, standardne

(ISO) metode izolcije, identifikacije, kvantifikacije i determinacije. Od

standardnih mikrobioloških metoda u rutinskoj dijagnostici se najčešće

koriste metode za utvrđivanje prisustva/broja spora bakterija roda Bacillus i

Clostridium odnosno metode za utvrđivanje prisustva/broja spora kvasaca i

plesni.

Početkom dvadesetprvog veka a u cilju dobijanja brzih i pouzdanih rezultata

laboratorijskih ispitivanja pristupa se izvođenju molekularinih metoda u

utvrđivanju prisustva mikroorganizama u uzorcima meda (Juste i sar., 2008;

Nevas i sar., 2002, 2005, 2006). Navedene metode koristile su se za potvrdu

i determinaciju mikroorganizama već izolovanih klasičnim i standardnim

mikrobiološkim metodama ali i za direktno utvrđivanje prisustva

mikroorganizama u ispitivanim uzorcima (Nevas i sar., 2002, 2005, 2006;

Sinacori i sar., 2014). Zbog prisustva malog broja, uglavnom spora

mikroorganizama u kontaminiranim uzorcima meda i njihove velike


96

otpornosti u aerobnim uslovima, pre izvođenja klasičnih/standardnih ali i

molekularinih metoda dijagnostike primenjivani su postupci dilucije,

predobogaćenja, centrifugovanja i membranske filtracije (Nevas i sar.,

2002, 2005, 2006; Rossmanith i Wagner, 2011). U navedena ispitivanja

uključena su i ponovljena ispitivanja zbog fizičko-hemijskih karakteristika

meda odnosno neravnomerne raspoređenosti mikroorganizama u

ispitivanim uzorcima i mogućnosti dobijanja lažno negativnih rezultata

(Matović, 2013, Nevas i sar., 2002, 2005, 2006).

Molekularni pristupi u dijagnostici uključivali su osetljive i specifične

testove lančane reakcije polimeraze (PCR), lančane reakcije polimeraze u

realnom vremenu (Real-Time PCR) i metode gel-elektroforeze u

pulsirajućem električnom polju (Pulse-Field Gel Elektrophoresis–PFGE)

(Ingrid, 2008, Nevas i sar., 2005).

U uzorcima meda u kojima je kvalitativno, molekularnim metdama,

utvrđeno prisustvo ciljnih mikroorganizama rađena su i kvantitativna

ispitivanja ukupnog broja mikroorganizama (De Man, 1993; Hielm i sar.,

1996).

U pripremi uzoraka meda za dokazivanje prisustva mikroorganizama,

primenom molekularnih metoda, rađena su razređenja, predobogaćenja,

centrifugovanje i membranska filtracija (Lindstrom i sar., 2002; Nevas i

sar., 2002, 2005). Iz navedenog sadržaja izvođeno je prečišćavanje i

ekstrakcija nukleinske kiseline za metode molekularne dijagnostike

(Lindstrom i sar., 2002; Nevas i sar., 2002, 2005).

U cilju detekcije DNK mikroorganizama primenjivane su metode

detekcije PCR-om i/ili multipleks PCR-om uz korišćenje odgovarajućih

prajmera (Lindstrom i sar., 2002; Nevas i sar, 2002, 2005). PCR ciklusi su

započinjani inicijalnom denaturacijom, u termalnom sajkleru na temperaturi

95 oC, u vremenskom periodu od 3-5 minuta u okviru od 30-40 ciklusa.

Denaturacija sa odvijala na temperaturi od 95 oC u vremenskom periodu od


97

30 s, vezivanje prajmera (annealing) na temperaturi od 60 oC u trajanju od

30 s, kopiranje DNK lanaca (elongacija) na temperturi od 72 oC i vremenu

od 90 s i na kraju finalna elongacija u vremenu trajanja 5 minuta na

temperaturi od 72 oC (Matović, 2013; Nevas i sar., 2002, 2005).

Razdvajanje fragmenata DNK molekula dobijenih PCR proizvoda izvođena

su metodom horizontalne elektroforeze u agaroza-gelu i preporučenom

vremenu. Očitavanja rezultata obavljana su prosvetljavanjem agaroza-gela u

komori za fotografisanje gela, uz primenu UV zraka.

Real-Time PCR metoda podrazumevala je detekciju PCR amplifikacije

tokom rane faze reakcije, upotrebom specifičnih ili obeleženih prajmera što

je omogućuavalo praćenje toka reakcije i kvantifikaciju proizvoda. Merenje

kinetike reakcije u ranoj fazi PCR amplifikacije, predstavljalo je prednost u

odnosu na klasičnu PCR detekciju gde je PCR amplifikat detektovan

naknado pomoću agaroznog gela (Ingrid, 2008).

U dijagnostici prisutnih mikroorganizama korišćeni su i gel-

elektroforeza u pulsirajućem električnom polju (PFGE). PFGE je korišćena

za identifikaciju, karakterizaciju i dodatnu diskriminaciju prisutnih tipova

mikrorganizama u ispitivanim uzorcima meda. (0) Metoda PFGE se

zasnivala na razdvajanju (fragmenataciji) cirkularne bakterijske DNK nakon

digestije restriktivnim enzimima. Po dobijanju većeg broja fragmenata

različitih dužina, neophodno je bilo njihovo razdvajanje. Kako su ovi

fragmenti isuviše veliki da bi se razdvojili klasičnom elektroforezom u

agaroznom gelu, primenjivana je metoda pulsirajućeg električnog polja. U

navedenom električnom polju koje menja pravac i dužinu trajanja, manji

fragmenti su se brže kretali kroz agarozu od većih tako da je nakon digestije

i PFGE elektroforeze dolazilo do profilisanja bakterija na jedan ili više

klonova (Nevas i sar., , 2005).

Zbog bioloških i biohemijskih karakteristika, stepena i načina

disperzije, prirode matriksa u kom se nalazi, utvrđivanje prisustva


98

mikroorganizama, u uzorcima meda oduvek je predstavljalo problem

(Midura i sar., 1979). Na to ukazuju i rezultati dosadašnjih ispitivanja

(Matović, 2013; Mundo i sar., 2004).

Razlozi nemogućnosti detektovanja mikroorganizama u uzorcima meda,

metodama klasične/standardne pa i molekularne mikrobiološke dijagnostike

leže u činjenici da je med po svojoj prirodi, sastavu i fizičko-hemijskim

svojstvima inhibitorni matriks kako za održavanje vegetativnih oblika i

spora mikroorganizama, tako i za laboratorijsku obradu uzoraka (Nevas i

sar., 2002; Snowdon i Cliver, 1996). Veliki viskozitet meda, usled visokog

sadržaja šećera i malog sadržaja vode, dovodi do neravnomernog

raspoređivanja eventualno prisutnih mikroorganizama/spora što značajno

otežava pripremu, obradu i korišćenje uzoraka meda, kako u primeni

klasičnih/standardnih tako i molekularnih metoda laboratorijske

dijagnostike (Anon., 2002; Midura i sar., 1979; Nevas i sar., 2002, 2005,

2006; Snowdon i Cliver, 1996). Sve to u laboratorijskim ispitivanjima može

dovesti do lažno negativnih rezultata kako u primeni klasičnih/standardnih

tako i molekularnih metoda ispitivanja što je potvrđeno u radovima više

autora (Matović, 2013; Midura i sar., 1979; Nevas i sar., 2002; 2005; 2006).

U svim namerno kontaminiranim uzorcima meda, uključujući i uzorke vrlo

niskog nivoa konataminacije, primenom molekularnih metoda (PCR), uz

prethodno razređenje, predobogaćenje, centrifugovanje i membransku

filtraciju, utvrđeno je prisustvo mikroorganizama (Matović, 2013; Nevas i

sar., 2002). Molekularne metode dijagnostike pokazale su se kao značajno

osetljivije za detekciju mikroorganizama u uzorcima meda ali se primenom

i ovih metoda mogu dobiti lažno negativni rezultati (Matović, 2013; Nevas i

sar., 2002). Neravnomerna distribucija mikroorganizama, u uzorcima meda,

otežava i kvantitativna ispitivanja tako da i u ovim ispitivanjima možemo

očekivati pojavu lažno negativnih rezultata (Midura i sar., 1979).


99

Sve ovo ukazuje na to da klasične i standardne metode

mikrobiologije nisu adekvatne za izolaciju mikroorganizama iz uzoraka

meda jer nisu dovoljno osetljive i mogu da daju lažno negativne rezultate,

posebno u uzorcima niskog stepena kontaminacije. (Rodriguez-Lazaro i

sar., 2009).

Određivanjem broja spora, primenom MPN tehnike dokazana je i

neravnomerna raspoređenost prisutnih spora u uzocima meda. To je 1979.

godine, u svojim ispitivanjima, potvrdio i Midura sa saradnicima (1979).

Imajući ovo u vidu, kod uzoraka meda sa niskim i neravnomernim nivoom

kontaminacije postoji mogućnost da za ispitivanje bude uzet deo uzorka koji

ne sadrži mikroorganizme. Zbog toga je kada je med u pitanju, u ispitivanje

neophodno uključiti veći broj subjedinica istog uzorka u odnosu na vrstu i

prirodu drugih uzoraka (Matović, 2013).

Zaključak

Detekcija mikroorganizama direktno iz neobrađenih uzoraka meda nije

moguća. Priprema uzoraka meda za dokazivanje prisustva mikroorganizama

mora uključiti postupak dilucije, predobogaćenja, centrifugovanja i

membranske filtracije. Ovako dobijeni sadržaj koristi se za izolaciju ciljanih

mikroorganizama klasičnim i standardnim metodama laboratorijske

dijagnostike, odnosno za prečišćavanje i ekstrakciju nukleinskih kiselina za

molekularne metode dijagnostike.

U cilju detekcije mikroorganizama, u uzorcima meda, primenom

molekularnih metoda dijagnostike, za svaki ispitujući uzorak moraju se

izvoditi višestruka ponovljena ispitivanja zbog neravnomerne raspoređenosti

mikroorganizama/spora u uzorcima i mogućnosti dobijanja lažno negativnih

rezultata.U uzorcima meda kontaminiranim referentnim sojevima

mikroorganizama, molekularnim metodama može da se dokaže prisustvo

jedne ćelije/spore mikroorganizma u jednom gramu meda. Za dokazivanje


100

prisustva mikroorganizama standardnim mikrobiološkim metodama potreban

je znatno veći broj ćelija/spora dok je primenom klasičnih metoda praktično

nemoguće dokazati prisustvo ciljnog mikroorganizma. Klasične i standardne

metode mikrobiološke dijagnostike nisu podesne za detekciju

mikroorganizama u uzorcima meda jer ove metode zbog niske osetljivosti

daju lažno negativne rezultate.

Literatura

Alnaqdy A., Al-Jabri A., Al Mahrooqi Z., Nzeako B., Nsanze H. Inhibition

effect of honey on the adherence of Salmonella to intestinal epithelial cells

in vitro. Int J Food Microbiol 2005: 103: 347-51. 2. Badawy O.F.H., Shafii

S.S.A., Tharwat E.E., Kamal A.M. Antibacterial activity of bee honey and

its therapeutic usefulness gainst Escherichia coli O157:H7 and Salmonella

typhimurium infection. Rev sci tech Off int Epiz. 2004: 23 (3): 1011-22. 3.

Cocolin L., Rajkovic A., Rantsiou K., Uyttendaele M. The challenge of

merging food safety diagnostic needs with quantitative PCR platforms.

Trends in Food Science & Technology 2011: 22 (1): 30-8. 4. Codex

Alimentarius. Revised Codex standard for honey. Codex Stan 12-1982:

Rev. (1987), Rev. 2. (2001) 7. 5. Council Directive 2001/110/EC. Official

Journal of the European Communities 2002): L10: 51–2. 6. de Man J.C.,

MPN tables (corrected). Eur J Appl Biotechnol 1983: 17: 301-5. 7. Hielm

S., Hyytia E., Ridell J., Korkeala H. Detection of Clostridium botulinum in

fish and Environmental samples using polymerase chain reaction. Int J of

Food Microbiol 1996: 31: 357-65. 8. Ingrid A. Real-time PCR for diagnosis

of botulism and quantification of neurotoxin gene expression in Clostridium

botulinum. Academic thesis, Faculty of Veterinary Medicine: 2008,

University of Helsinki, Helsinki. 9. Justé A., Thomma B.P.H.J., Lievens B.

Recent advances in molecular techniques to study microbial communities in

food-associated matrices and processes. Food Microbiology 2008: 25(6):


101

745-61. 10. Lindstrom M., Nevas M., Korkeala H. Detection of

Clostridium botulinum by Multiplex PCR in Foods and Feces. In: Methods

in Biotechnology: Food-Borne Pathogens, Methods and Protocols: 21: 37-

45. 11. Lusby P.E., Coombes A.L., Wilkinson J.M. Bactericidal activity of

different honeys against pathogenic bacteria. Arch. Med Res 2005: 36: 464-

7. 12. Matović K. Utvrđivanje prisustva Clostridium botulinum u uzorcima

meda i medonosnih pčela. Doktorska disertacija. Fakultet veterinarske

medicine: 2013, Beograd. 13. Midura T.F., Snowden, S., Wood R.M.,

Arnon S.S. Isolation of Clostridium botulinum from honey. J Clin Microbiol

1979: 9: 282-3. 14. Mundo M.A., Padilla-Zakour O.I., Worobo R.W.

Growth inhibition of foodborne pathogens and food spoilage organisms by

select raw honeys. Int J Food Microbiol 2004: 97: 1-8. 15. Nevas M.,

Hielm S., Lindstrom M., Koivulehto K., Horn H., Korkeala H. High

prevalence of Clostridium botulinum types A and B in honey samples

detected by polymerase chain reaction. Int J of Food Microbiol 2002: 72:

45–52. 16. Nevas M., Lindstrom M., Hautamaki K., Puoskari S., Korkeala

H. Prevalence and diversity of Clostridium botulinum types A, B, E and F in

honey produced in the Nordic countries. Int J of Food Microbiol 2005: 105:

145–51. 17. Nevas M., Lindstrom M., Hielm S., Bjorkroth K.J., Peck M.W.,

Korkeala H. Diversity of Proteolytic Clostridium botulinum Strains,

Determined by a Pulsed-Field Gel Electrophoresis. Approach Appl Environ

Microbiol 2005: 71: 1311–7. 18. Nevas M., Lindstrom M., Horman A.,

Keto-Timonen R., Korkeala H. Contamination routes of Clostridium

botulinum in the honey production environment. Environ Microbiol 2006:

8: 1085–94. 19. Postollec F., Falentin H., Pavan H., Combrisson J., Sohier

D. Recent advances in quantitative PCR (qPCR) applications in food

microbiology. Food microbiology 2011: 28(5): 848-61. 20. Rodríguez-

Lázaro D., Cook D., D'Agostino M., Hernández M. Chapter 14 - Challenges

in Molecular Diagnostics in Food Microbiology. In: Global Issues in

http://www.sciencedirect.com.proxy.kobson.nb.rs:2048/science/article/pii/S0740002011000505






102

Food Science and Technology. 2009: 211-28. 21. Rossmanith P., Wagner

M. Aspects of systems theory in the analysis and validation of innovative

molecular-biological based food pathogen detection methods. 2011: Trends

in Food Science & Technology: 22(2-3): 61-71. 22. Sinacori M., Francesca

N., Alfonzo A., Cruciata M., Sannino C., Settanni L., Moschetti G.

Cultivable microorganisms associated with honeys of different geographical

and botanical origin. Food Microbiology 2014: 38: 284-94. 23. Singh A.,

Singh M.P., Sharma V., Verma H. N., Arora K. CHAPTER 13 – Molecular

Techniques. Chemical Analysis of Food: Techniques and Applications.

Valencia: 2012: 407-61. 24. Snowdon J.A., Cliver D.O. Microorganisms

in honey. Int J of Food Microbiol 1996: 31: 1– 26. 25. Taormina P.J.,

Niemira B.A., and Beuchat L.R. Inhibitory activity of honey against

foodborne pathogens as influenced by the presence of hydrogen peroxide

and level of antioxidant power. Int J Food Microbiol 2001: 69: 217-25. 26.

Uyttendaele M., Rajkovic A., Ceuppens S., Baert L., Coillie E.V., Herman

V, Jasson V., Imberechts H.. PCR Applications in Food Microbiology. In:

Encyclopedia of Food Microbiology (Second Edition). New York, 2014:

1033-41. 27. White J.W.Jr. Honey. Adv Food Res 1978: 24: 288-374.


103

Posteri

1. ISPITIVANJE UTICAJA PAKOVANJA MLEVENOG MESA

U MODIFIKOVANOJ ATMOSFERI NA RAST Salmonella

spp.

Jasna Đorđević* Marija Bošković

*, Marija Dokmanović

*,

Nataša Glamočlija*, Vesna Đorđević

**, Jelena Petrović

***, Milan Ž.

Baltić*

Bolesti prenosive hranom predstavljaju veliki zdravstveni i

ekonomski problem u mnogim zemljama. Više od polovine bolesti koje

se prenose hranom izazvane su patogenim bakterijama. Kao jedan od

najčešćih uzroka trovanja hranom, bakterije Salmonella spp. spadaju u

značajnije patogene mikroorganizme. Radi sve većih zahteva za

bezbednost mesa i proizvoda od mesa, produženja održivosti proizvoda

u maloprodaji i zadovoljenja očekivanja potrošača vezanih za

praktičnost i kvalitet, sveže meso se pakuje i na taj način sprečava

kontaminacija i odlaže kvar. Pakovanje u modifikovanoj atmosferi

predstavlja jedan od načina produženja održivosti i očuvanja kvaliteta

svežeg usitnjenog mesa, zbog čega je sve zastupljeniji način pakovanja

mesa za maloprodaju u poslednje dve decenije.

Cilj istraživanja bio je utvrđivanje uticaja modifikovane

atmosfere na rast bakterija Salmonella spp. Mleveno meso korišćeno za

eksperiment kontaminirano je sojevima Salmonella Enteritidis (ATCC

13076), Salmonella Typhimurium (ATCC 14028), Salmonella Arizone

(ATCC 13314) i Salmonella Infantis (ATCC 51741). Svi uzorci

pakovani su u vakuum (EI), modifikovanu atmosferu sa 20% О2/50%

CO2/30% N2 (EII) i modifikovanu atmosferu sa 20% О2/30% CO2/50%


104

N2 (EIII). Nakon pakovanja, uzorci su čuvani 13 dana pri temperaturi

frižidera od 3±1 °C.

U toku skladištenja prosečan broj bakterija Salmonella spp.

opadao je u uzorcima EI grupe od nultog (8,77±0,39 log CFU/g) do

trinaestog dana (7,43±0,11 log CFU/g), kod EII grupe do 6,93±0,02 log

CFU/g i kod EIII grupe do 7,13±0,08 log CFU/g. Kod svih ispitivanih

uzoraka zapaženo je statistički značajno smanjenje (p<0,01) broja

bakterija Salmonella spp. od nultog do trinaestog dana skladištenja u

uzorcima mlevenog mesa. Najznačajnije smanjenje broja bakterija

Salmonella spp. zabeleženo je kod uzoraka pakovanih u modifikovanu

atmosferu.

Na osnovu rezultata ovog istraživanja zaključeno je da

pakovanje mlevenog mesa u modifikovanoj atmosferi ima prednosti u

odnosu na pakovanje u vakuumu.

Napomena

Ovaj rad je finansiran sredstvima projekta broj TR 31034

Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije.


105

CIP - Каталогизација у публикацији

Народна библиотека Србије, Београд

637.04/.07(082)

664:658.56(082)

614.31(082)

СИМПОЗИЈУМ Безбедност и квалитет намирница

анималног порекла (4 ; 2014 ; Београд)

Zbornik radova / 4. simpozijum Bezbednost

i kvalitet namirnica animalnog porekla,

Beograd, 6. i 7. novembra 2014. ;

[organizator] Fakultet veterinarske medicine

Univerziteta u Beogradu, Katedra za higijenu

i tehnologiju namirnica animalnog porekla ;

[urednik MIlan Ž. Baltić]. - Beograd :

Fakultet veterinarske medicine, 2014 (Beograd

: Naučna). - 102 str. : ilustr. ; 24 cm

Tiraž 200. - Bibliografija uz svaki rad. -

Summaries.

ISBN 978-86-81043-89-9

1. Факултет ветеринарске медицине

(Београд). Катедра за хигијену и технологију

намирница анималног порекла

a) Животне намирнице - Контрола квалитета -

Зборници b) Животне намирнице - Хигијена -

Зборници c) Ветеринарска хигијена -

Зборници

COBISS.SR-ID 210962444

SIMPOZIJUM BEZBEDNOST I KVALITET NAMIRNICA …katedre.vet.bg.ac.rs/~namirnice/002...

Documents

Transcript of SIMPOZIJUM BEZBEDNOST I KVALITET NAMIRNICA …katedre.vet.bg.ac.rs/~namirnice/002...