Simposio clades
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Virulencia del Virus Dengue Virulencia del Virus Dengue en la evolución del Dengue 2 en la evolución del Dengue 2 en Nicaragua de 2005-2007.en Nicaragua de 2005-2007.
Andrea Núñez, MSc.Andrea Núñez, MSc.
Den
gu
eD
en
gu
eGeneralidadesGeneralidades
Es una enfermedad causada por un virusEs una enfermedad causada por un virus familia familia FlaviviridaeFlaviviridae género género FlavivirusFlavivirus Especie DengueEspecie Dengue
Cuatro serotipos antigénicamente distintos 1, 2, 3 y 4.Cuatro serotipos antigénicamente distintos 1, 2, 3 y 4.
Emerge en regiones tropicales y subtropicales, donde la Emerge en regiones tropicales y subtropicales, donde la humedad, calor y los reservorios naturales representan humedad, calor y los reservorios naturales representan los elementos vitales para el desarrollo del vector y en los elementos vitales para el desarrollo del vector y en consecuencia, la transmisión del virus.consecuencia, la transmisión del virus.
Virus DengueVirus Dengue
Genoma del ARNGenoma del ARN
Poliproteína precursoraPoliproteína precursora
ANCH C - PrM- E- NS1-NS2a-NS2b-NS3- NS4a-NS4b- NS5ANCH C - PrM- E- NS1-NS2a-NS2b-NS3- NS4a-NS4b- NS5
CC MM EE NS1NS1 NS2aNS2a NS2bNS2b NS3NS3 NS4aNS4a NS5NS5
EstructuralesEstructuralesNo estructuralesNo estructurales
NS4bNS4b
Genotipos DengueGenotipos Dengue
– DEN-1: Tres genotipos I, II, y III, algunos DEN-1: Tres genotipos I, II, y III, algunos autores incluyen dos genotipos más autores incluyen dos genotipos más denominados IV y V denominados IV y V
– DENV-2 : Americano, Asiático/Americano, DENV-2 : Americano, Asiático/Americano, Asiático I, Asiatico II y selvático.Asiático I, Asiatico II y selvático.
– DENV-3: I, II, III, IV, algunas clasificaciones DENV-3: I, II, III, IV, algunas clasificaciones incluyen el genotipo V. incluyen el genotipo V.
– DENV-4: I, II, III y Selvático, también exclusivo DENV-4: I, II, III y Selvático, también exclusivo de primates no humanos. de primates no humanos.
FDH/SCD PatogeniaFDH/SCD Patogenia ImmunopatologíaImmunopatología
– Infección secundariaInfección secundaria– Incremento dependiente de anticuerposIncremento dependiente de anticuerpos– Células T con reacción cruzadaCélulas T con reacción cruzada
Acción viral directaAcción viral directa– ApoptosisApoptosis– Infección directa de células Infección directa de células
endoteliales?endoteliales?
Factores viralesFactores virales– Variación genotípica (virulencia)Variación genotípica (virulencia)
Factores del HuéspedFactores del Huésped– Genéticos o adquiridosGenéticos o adquiridos
Nicaragua
Managua
Dos estudios prospectivos de Dengue en Nicaragua
1) Estudio Hospitalario
2) Estudio de cohorte
3900 niños 2 – 12 años
Niños de 6 meses - 14 años
Extensa informacion de los pacientes (150 variables) :Edad, sexo, dia de presentación, historia de enfermedad, uso de
antibiótico, estado nutricional, etc.
FIS
Muestras Longitudinales
3 meses 6 meses 12 meses 18 meses
Estudio Hospitalario
Muestra aguda Muestraconvaleciente
2 semanas
Enrolados al presentarse HIMJR
Año 1
Estudio Cohorte
Año 2 Año 3 Año 4
Muestra anual
Muestraconvaleciente
FIS
MuestraAguda
2005 2006 2007
EstudioCohorte
0% 0%
8%
15%
0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
14%
16%
2004 2005 2006 2007
% D
HF/
DSS
p<0.001
01020304050607080
90
% Tota
l C
ase
sFDFDH/SCD
Incremento en la severidad del Dengue en 2006/2007 en ambos estudios
EstudioHospitalario
4:1 0.7:1 1:1
sintomática:inaparente 1:4.3 1:2.6
Incremento en la severidad no se explica por la introducción de un nuevo serotipo
2005
DENV1DENV2DENV3DENV4
2006 2007
Estudio Hospitalario
Análisis multivariadoAnálisis multivariado
EdadEdad sexosexo Respuesta inmune (primaria vs secundaria)Respuesta inmune (primaria vs secundaria) SerotipoSerotipo Día de presentación al HospitalDía de presentación al Hospital Año de estudio (2005 vs 2006-2007)Año de estudio (2005 vs 2006-2007) alergiaalergia asmaasma Uso de antibióticoUso de antibiótico Estado nutricionalEstado nutricional Ruta de admisión Ruta de admisión
Infección secundaria y año de estudio resultaron estadísticamente asociados a enfermedad severa
Infección secundaria OR 15.7 (95%CI 2.93-84.0)
Año de estudio, OR 2006-7 fue de 6.58 (2.32-18.6)
Que habrá ocurrido?Que habrá ocurrido?
Qué diferencia existe entre los años?
Qué diferencia existe entre los años?
Genome Resources in Dengue Consortium Genome Resources in Dengue Consortium (GRID)(GRID)
Broad NIAID Microbial Sequencing Center
Nicaragua Eva Harris
Angel Balmaseda
VenezuelaIrene Bosch
Diane Schmidt David Kulp (Amherst)
Puerto Rico & Caribbean Jorge MunozKate McElroy
Gilberto Santiago
Vietnam, Cambodia& Singapore
Cameron SimmonsJeremy Farrar
Phillip Buchy
•Selección coordinada, prep muestras y análisis de >4500aislamientos•Datos clínicos estandarizados Reportados
•Creación de capacidades a Lab colaboradores
Secuencia del genoma completo del virus(Broad NIAID Microbial Sequencing Center) 163 cepas del
serotipo 2 del dengue
Nicaragua
Broad
STRUCTURAL NON-STRUCTURAL
Hubo cambios en la secuencia viral entre estos años?
Analisis Filogenetico de Genomas Analisis Filogenetico de Genomas CompletosCompletos
DatosDatos 163 cepas Nicaraguenses DENV-2 163 cepas Nicaraguenses DENV-2
15 cepas Leitmeyer et al. (1999) J. of Virology15 cepas Leitmeyer et al. (1999) J. of Virology
13 cepas America Central & SurAmerica (NCBI)13 cepas America Central & SurAmerica (NCBI)
NCBI secuencias de Referencias DENV-1, DENV-3, y DENV-4NCBI secuencias de Referencias DENV-1, DENV-3, y DENV-4
Modelo de sustitucion NucleotidosModelo de sustitucion Nucleotidos
General Time-Reversible (GTR +I +General Time-Reversible (GTR +I +4))
Análisis de máxima similitud (bootstrap = 1000)Análisis de máxima similitud (bootstrap = 1000)
Neighbor Joining Tree AnalysisNeighbor Joining Tree Analysis (bootstrap = 1000)(bootstrap = 1000)
All Tree Topologies All Tree Topologies
Nicaragua
“Asia Americano”
“Asiático”
“Americano”
Cepas Nicaraguense más relacionados al
genotipo asiático americano DENV2
DENV-2 Nicaragua: Rápido reemplazo de los clades
Asiático
Americano/Asiático
NI-1a
NI-2a
NI-2b
Año de aislamiento y Clade significantemente
relacionados
(Pearson’s Chi-Square p<0.0001)
% G
enom
es
YearN
icara
guense
Correlación con enfermedad severa
Asiático
Americano/Asiático
NI-1
NI-2a
NI-2b
Correlación con enfermedad severa
(DF/DHF/DSS) Pearson’s Chi-Square p=0.046
Nic
ara
gua 2
1
DHF/DSSDF
Cohorte
Hospital
9 Amino Acidos propuestos para el reemplazamiento de Clade
NI-2a
NI-2b/c
NI-1a
Cap:K97RNS1:R869KNS3:T1720PNS4:N2488S
CAP ENV NS1 NS1 NS3 NS4B NS5 NS5 NS597 772 869 1054 1720 2488 2691 2781 2892
E:M772VNS1:L1054FNS5:K2691QNS5:T2781I
NS5:R2892K
Env E
Mukhopadhyay/Rossman Nature Reviews 2005M772V
La mutación E es localizada en C-terminal
Tres mutaciones en NS5 están expuesta a la superficie
NS5
Clade 1
Clade 2
1° human1° humanMDDCsMDDCs
Son los Clade 2 virales mas virulentos?? (MDDC)?
Nicaragua
X 2p
41 2b,c
Clade
1
10
100
1000
10000
DV33 DV34 DV37 DV128 DV172 DV174
pfu
/ml
1 2 3 5 6 7 8 91
10
100
1000
10000
0
pfu
/ml
Clade 1 Clade 2
p = 0.0298 (Wilcoxon)
Clade 1
Clade 2U937
/DC-SIGN
Son los virus Clade 2 “inherently” more fit (U937 #1)?
Nicaragua
X 2p
1 2a 2b 2c
Clade
0
10
20
30
40
50
33 34 37 6740
10 187
174
191
306
694
128
% Infe
ctio
n
p = 0.056 (Mann-Whitney)
1.00E+02
1.00E+03
1.00E+04
1.00E+05
33 34 37 67 4010 187 174 191 306 694 128
GE/µ
L -
HI
Clade 2 virus pueden replicar mejor que los Clade 1 virales.
qRT-PCRqRT-PCR
11 22aa
2b/c2b/c
1.00E+02
1.00E+03
1.00E+04
1.00E+05
33 34 37 67 4010 187 174 191 306 694 128
pfu/
mLPlaque assayPlaque assay
11 22aa
2b/c2b/c
Ensayo Particulas Virales Reporteras
Structural Proteins
GFP Replicon
co-transfect
Single-round RVP (Particulas
de Virus reportero)
infect GFP+
C prM/M E C prM/M E
Clade 2
Clade 1
+ suero DenV2 0
50100150200250300350
1 2
PR
NT5
0
T.C. Pierson, NIH
ConclusionesConclusiones
Incremento en la severidad en la estación de Dengue 2006/2007 en ManaguaIncremento en la severidad en la estación de Dengue 2006/2007 en Managua Estudio HospitalarioEstudio Hospitalario Estudio cohorte basado en la comunidadEstudio cohorte basado en la comunidad
Los cambios no son explicados por factores clínicos y epidemiológicosLos cambios no son explicados por factores clínicos y epidemiológicos Análisis de 163 genomas completos indicanAnálisis de 163 genomas completos indican
Dos clades diferentes en cepas nicaraguenses de DENV 2Dos clades diferentes en cepas nicaraguenses de DENV 2 Significante correlación genética temporal (2005 vs 2006/7)Significante correlación genética temporal (2005 vs 2006/7) Asociación significante con severidad de la enfermedad.Asociación significante con severidad de la enfermedad.
Análisis funcional Análisis funcional in vitroin vitro Mayor replicación de Clade 2 en células humanas y de mosquitosMayor replicación de Clade 2 en células humanas y de mosquitos Anticuerpos neutralizan mejor a Clade 1Anticuerpos neutralizan mejor a Clade 1
Hipótesis para explicar incremento de la severidad
A) “inherente al virus”
B) “Inmunidad pre existente”
Incremento de la infeccion dependiente de Acs (ADE)?Disminucion de la neutralizacion o evasion de los Acs neutralizantes?
AgradecimientosAgradecimientosCentro de Salud Centro de Salud
Socrates Flores VivasSocrates Flores Vivas*Guillermina Kuan*Guillermina Kuan
Oscar OrtegaOscar OrtegaMiguel ReyesMiguel ReyesLeyla SaenzLeyla Saenz
Nery SanchezNery SanchezSergio OjedaSergio Ojeda
Magaly AmadorMagaly AmadorZoila OrozcoZoila Orozco
Carolina FloresCarolina Flores
Hospital La MascotaHospital La Mascota*Crisanta Rocha*Crisanta Rocha
Maria de los Angeles Maria de los Angeles PérezPérez
*Sheyla Silva*Sheyla SilvaJavier SilvaJavier Silva
Federico NarváezFederico NarváezRafael CentenoRafael CentenoCintia SaboríoCintia SaboríoGerardo MejiaGerardo Mejia
Departamento de Departamento de Virología, CNDRVirología, CNDR*Angel Balmaseda*Angel Balmaseda
*Andrea Nuñez*Andrea Nuñez*Douglas Elizondo*Douglas Elizondo
*Yolanda Tellez*Yolanda Tellez*Tangni Gomez*Tangni Gomez*Yara Saboria*Yara Saboria
*Magelda Montoya*Magelda MontoyaLeonel PérezLeonel Pérez
Juan Carlos MercadoJuan Carlos MercadoJuan Carlos MatuteJuan Carlos Matute
Celia MachadoCelia MachadoMaria José VargasMaria José Vargas
Sonia ArguelloSonia Arguello
Sustainable Sciences Sustainable Sciences InstituteInstitute
William AvilésWilliam AvilésKate StandishKate Standish
Mirtha MonterreyMirtha Monterrey
University of CA, University of CA, Berkeley Berkeley Eva HarrisEva Harris
Aubree GordonAubree GordonMolly OhAinleMolly OhAinle
MINSA NicaraguaMINSA NicaraguaGuillermo GonzalezGuillermo Gonzalez
SILAIS ManaguaSILAIS ManaguaMaritza CuanMaritza Cuan
Dir. de EpidemiologíaDir. de EpidemiologíaEdmundo SánchezEdmundo Sánchez
CNDR, MINSACNDR, MINSAAlcides GonzálezAlcides González
Broad InstituteBroad InstituteMatthew HennMatthew HennNiall LennonNiall LennonBruce BirrenBruce Birren
ThanksThanks!!GraciasGracias!!
Funding:Funding:NIAID/NIH NIAID/NIH Pediatric Dengue Vaccine Initiative, Pediatric Dengue Vaccine Initiative, TDRTDR