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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
IZTAPALAPA
Servicio Social
"Efecto del cloruro de mercurio sobre la respiración
mitocondrial en la línea celular hepática fetal humana WRL-68"
Norma Edith López Díaz-Guerrero
México, D.F. 1998
. * "Efecto del cloruro de mercurio sobre la respiración mitocondrial en la linea
celular hepática fetal humana WRL-68"
1. INTRODUCCION
1.1 EL MERCURIO Y SUS USOS
El mercurio es un elemento metálico de transición, a temperatura ambiente es un
liquido de color blanco plata, con peso molecular de 200.59, que forma compuestos
monovalentes y divalentes (Microsoft Encarta, 1995). Se encuentra en el lugar 67 de
abundancia en la corteza terrestre y es liberado a la atmósfera en cantidades menores
a una parte por billón. El ciclo natural de circulación del mercurio en la tierra
P :y;\ dispersa a este metal a través de las esferas habitables en cantidades traza que no
ponen en peligro a la vida (Goldwater, 1971). Sin embargo el mercurio elemental e
inorgánico es utilizado en la industria del cloroálcali y en la manufactura de equipo
..',\, eléctrico y cientifico, preparación de amalgamas dentales, catálisis y explosivos (von
I - C 2 desechada a los ríos, mares v atmósfera, entrando al ambiente en tres formas
p Burg, 1995). Como consecuencia del amplio uso de este metal, una gran cantidad es I
'Y i 3 &- posibles: mercurio elemental, sales de mercurio y compuestos organonlercuriales. c iT - 1
4 2 3+ 1.2 BIOMAGNIFICACION DEL MERCURIO i
'U Q El mercurio es un metal persistente y el Único para el que hay evidencia de 3 5 Ln .* -%- J biomagnificación general (Bryan, 1984), esto significa que cuando se encuentra en la - ; & atmósfera el mercurio se deposita en el agua y en el suelo. Algo del mercurio
depositado sobre la tierra se absorbe por l a materia orgánica siendo los musgos y las
2 5 bacterias quienes lo transforman de mercurio inorgánico a metilmercurio lo que
2 -;Z resulta en una fuente continua de mercurio para corrientes y lagos por largos
.J periodos de tiempo, acumulándose tanto el mercurio orgánico como el inorgánico en i ) c 3 E algas y peces. .J>'
x $
, t 9
,J Este metal es tóxico para los microorganismos, plantas, invertebrados y vertebrados,
en donde las formas orgánicas son generalmente más dañinas que las inorgánicas
(von Burg, 1995), particularmente la forma metilada del mercurio es tóxica para los
organismos trófkos superiores (Burger et al., 1992). Los resultados de algunas
investigaciones sugieren que los efectos tóxicos del metilmercurio son debidos a su
capacidad de atravesar más fácilmente las membranas biológicas que el mercurio
inorgánico.
Se han realizado relativamente pocos estudios sistemáticos del efecto del mercurio
Hg(II) inorgánico, sin embargo el efecto de este es similar a los compuestos
mercuriales orgánicos (Weinberg et al., 1982). I& 999'87 rr) S
La ingestión de alimentos contaminados con mercurio, particularmente alimentos de
especies acuáticas son la fuente primaria de exposición humana no ocupacional al
mercurio y han conducido a episodios catastróficos de intoxicación (Konigsberg,
1998), como el sucedido en 1956 en la bahía de Kiushu en Minamata, Japón, donde
muchas personas murieron por envenenamiento al consumir pescado contaminado.
Ante este tipo de sucesos se han acumulado un gran número de datos
epidemiológicos, clínicos y patológicos por intoxicación con metilmercurio (Miura et
al., 1987).
1.3 VIAS DE ABSORCION, EXCRECION Y DISTRIBUCION DEL MERCURIO
El mercurio penetra en el cuerpo humano a través de varias puertas de entrada: es
absorbido por vía digestiva, por la piel, y por inhalación. Los principales órganos
blanco del cloruro de mercurio son el riñón, el sistema nervioso central y el hígado.
Oservándose que en el hígado fetal y la placenta se acumula en concentraciones
mayores (Ashour et al., 1993).
La mayor parte del mercurio iónico es excretado en las heces, la orina, las glándulas
salivales, las glándulas mamarias y la bilis (von Burg, 1995).
Con respecto a la distribución subcelular del mercurio, se ha reportado que el
metilmercurio que se acumula en el cerebro se encuentra en la mitocondria, el
reticulo endoplásmico, el complejo de golgi, la envoltura nuclear y los lisosomas
(Atchison et al., 1994). Omata y col. (1986) reportaron que el metilmercurio se
distribuye principalmente en los lisososmas, los microsomas y las mitocondrias en
hepatocitos de rata, alterando una amplia variedad de procesos celulares y
bioquímicos (Bucio et al., 1995). Nakada e Imura (1983), demostraron que el mercurio
inorgánico reacciona con los dobles enlaces de residuos de ácidos grasos en
fosfolípidos, irrumpiendo primero sobre la función de la membrana plasmática y
moviéndose hacia el interior de las células inhibiendo las funciones celulares.
1.4 EFECTOS CITOTOXICOS DEL MERCURIO
El metilmercurio reacciona por inhibición no competitiva con los grupos sulfhidrilo
presentes en algunos sitios activos de algunas enzimas de la membrana celular, ya
sean óxido-reductoras o de transporte, alterando la distribución de iones y cambios
de potencial eléctrico (Byczkowski et al., 1984). En general, el mercurio interfiere con
la síntesis de proteínas afectando también las funciones de la membrana y el
citoesqueleto (Lachapelle et al., 1993). La síntesis de ADN parece también ser un
blanco primario de la citotoxicidad del cloruro de mercurio (Choi et al., 1984).
1.5 EFECTOS DEL MERCURIO SOBRE LA MITOCONDRIA -: n . I
Se ha demostrado que el mercurio inhibe la respiración de las mitocondrias (Inskip et c;; 8 " c. .;I
al., 1985), esto último es importante puesto que todos los seres vivos utilizan dicho 5 '' 2 5 proceso para generar energía metabólica y posteriormente utilizarla para sintetizar el - . -4 i7
ATP requerido para el crecimiento y mantenimiento de múltiples funciones celulares. o
Se ha encontrado que los metales pesados como el mercurio, pueden inhibir oxidasas y !,, T i,)
específicas así como deshidrogenasas, pueden interrumpir y disminuir también la 4 r; 5 2.
fosforilación oxidativa en mitocondria (Omata et al., 1985). Santos y col. (1997) ir .. ( 3 r:;
encontraron in vivo que la presencia del cloruro de mercurio en mitocondria produce
una condición de estrés oxidativo caracterizado por un incremento de
lipoperoxidación y oxidación de las proteínas, así como un cociente disminuido de
GSH/GSSG paralelo a la reducción en la actividad de enzimas del ciclo redox.
El principal efecto tóxico del Hg(1I) surge de las alteraciones en l a integridad
estructural de la membrana interna mitocondrial del riñón de la rata, resultando en la
pérdida de la selectividad normal para cationes, a su vez la cadena respiratoria y las
ATPasas son directamente inhibidas por especies reactivas de oxígeno (Santos et al.,
1997).
Palmeira y col. (1997) reportaron que el cloruro de mercurio promueve una fuerte
perturbación de l a bioenergética mitocondrial en hepatocito de rata, deprimiendo el
:-I1 P c'
IT
"7
estado 3 de la respiración, estimulando el estado 4 y disminuyendo el potencial de
membrana de la mitocondria causando una acción desacoplante. Sone y col. (1984)
reportaron que el transporte de electrones en membrana interna mitocondrial en el
hepatocito de la rata es inhibido por el cloruro de metilmercurio, entre las flavinas
del NADH o succinato-deshidrogenasa y el citocromo b, siendo la fosforilación la
función mitocondrial más afectada. Durante un estudio de citotoxicidad con Hg(1I)
Santos y col. (1997), encontraron que con una concentración de 5 uM de Hg(II), se
afectaba la respiración mitocondrial in vitro, estimulando el estado 4 de la respiración
y disminuyendo l a relación ADP/O, desacoplando así la fosforilación oxidativa. De
manera similar, el cloruro de mercurio a bajas concentraciones suprime la
fosforilación oxidativa en mitocondria aislada de riñón de rata y afecta el
acoplamiento de síntesis de ATP (Southard et al., 1973).
Aunque se han realizado algunos estudios bioenergéticos sistemáticos, estos no son
suficientes (Palmeira et al, 1997), por lo que en el presente trabajo fue de interés
conocer el efecto del cloruro de mercurio sobre la respiración mitocondrial en una
línea celular.
Se usó la línea celular hepática fetal humana (WRL-68) debido a que Gutiérrez y col.
(1994) demostraron que mantiene muchas características de las células hepáticas in
vivo y que por lo tanto son un modelo sensible y una herramienta útil en la
investigación del mecanismo de toxicidad de metales pesados como cadmio y
mercurio (Bucio et al., 1995).
2. OBJETIVO GENERAL
Cuantificar el efecto del HgC12 sobre la respiración en las mitocondrias aisladas de la
línea celular WRL-68.
2.1
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Montar la metodología para aislar mitocondrias activas de la línea celular
W RL-68.
Cuantificar la proteína en cada uno de los pasos del proceso de aislamiento
mitocondrial por el método de Lowry (Lowry, 1951).
Cuantificar el consumo de oxigeno utilizando sustratos d e sitio I e inhibidores
específicos de la cadena respiratoria mitocondrial, de las mitocondrias aisladas
de la linea celular WRL-68 obtenidas de las células tratadas con 5 uM de HgC12
y d e las células control.
Cuantificar el consumo de oxigeno, con sustrato de sitio I1 estimulado con
ADP en presencia de un inhibidor de la fosforilación oxidativa en las
mitocondrias aisladas de la linea celular WRL-68, de las células tratadas con
5uM de HgCl2 y de las células control.
3. METODOLOGÍA
LINEA CELULAR 2 2 2 5 0 7 Las células WRL-68, se obtuvieron del Laboratorio de Fisiología Celular de la
División de Ciencias y de la Salud (UAM-Iztapalapa), las cuales se mantuvieron en
medio esencial Dulbecco (DMEM) con suplemento del 8% de suero de bovino
(Hyclone, Logan, UT, USA), 1% de aminoácidos no esenciales, 100 U/mL de
penicilina y 100 ug/mL de estreptomicina. El medio se reemplazó cada 2 días y a las
células se les tripsinizó y diluyó durante 5 veces cada siete días. Las células crecieron
a 37" C, en una atmósfera con 95% aire y 5% dióxido de carbono.
CELULAS TRATADAS CON CLORURO DE MERCURIO
Las células tratadas se selnbraron de igual forma que las células control, y después
de 48 horas, el medio se suplementó con 5 uM de cloruro de mercurio y se incubaron
por 1 hora.
3.1 Aislamiento mitocondrial.
Debido a que no se tenía un método establecido y montado para el aislamiento
mitocondrial se probaron 5 metodologías, escogiéndose aquella cuyos resultados
fueran los más satisfactorios.
Metodo 1
1. Las células WRL-68 se utilizaron posterior a un cultivo de 24 horas con medio
esencial modificado de Dulbecco (DMEM). Se emplearon 5 cajas de cultivo celular.
2. Al cabo de este tiempo, se desechó el DMEM y se lavaron las células con 500 UL de
una solución de Sacarosa 0.25 M+Tris 10 mM., pH 7.4.
3. Se volvió a desechar la solución y se les agregó otros 200 UL de medio.
4. Se abrieron las cajas con un cuchillo y se rasparon las células con un gendarme de
goma para obtener las células.
5. Este homogenado celular se centrifugó a 3000 rpm durante 10 min a 4" C y el
botón se resuspendió con 2 mL de medio de Sacarosa 0.25 M+Tris 10 mM., pH 7.4
6. Se sonicó con 5 pulsos de 30 seg cada uno con descanso de 1 min entre cada serie
para romper las células; se observó al microscopio que las membranas plasmáticas
estuvieran rotas.
7. Las células rotas se centrifugaron a 2750 rpm por 10 min a 4°C.
8. El sobrenadante se centrifugó a 12500 rpm por 10 min a 4" C y el botón (fracción
mitocondrial) se resuspendió con 1.5 mL de Sacarosa 70 mM+Manitol 220
mM+TEA 5 mM, pH 7.4.
9. En cada uno de los pasos durante el aislamiento de mitocondrias, se tomaron
alicuotas de 50 UL para la prueba de Lowry de las siguientes fracciones:
A. Botón celular resuspendido después de centrifugar a 3000 rpm 10 min a 4OC.
B. Botón celular resuspendido y sonicado.
C. Sobrenadante después de centrifugar a 2750 rpm por 10 min a 4°C
D. Botón resuspendido después de centrifugar a 2750 rpm por 10 min a 4OC y
desechado.
E. Sobrenadante después de centrifugar a 12500 rpm 10 min a 4OC y
desechado.
F. Botón resuspendido después de centrifugar a 12500 rpm 10 min a 4°C.
Método 2
1. Se realizaron los mismos pasos que en el método 1, excepto que se sonicó con 5
pulsos de 30 seg cada uno con descansos de 1 min entre cada serie, posteriormente
se introdujeron las células en nitrógeno líquido para ocasionar rompimiento de las
membranas plasmáticas por choque térmico.
Método 3
1. Se realizaron los mismos pasos que en el método 1, pero para el rompimiento de
las membranas celulares se sonicó la muestra con 6 pulsos continuos de 1 min cada
uno con descansos de 2 min entre cada serie.
Método 4
1. Las células WRL-68 se utilizaron posterior a un cultivo de 24 horas con medio
esencial modificado de Dulbecco (DMEM).
2. Al cabo de este tiempo, se desechó el DMEM y se lavaron las células con 500 UL de
Las células WRL-68 se utilizaron posterior a un cultivo de 24 horas con medio una
solución de Sacarosa 250 mM, HEPES 5 mM y EGTA 1 mM (SHE) a pH 7.4.
3. Se volvió a desechar la solución y se agregaron 200 uL de medio SHE.
4. Se abrieron las cajas con un cuchillo y se rasparon las células con un gendarme de
goma para obtener las células.
5. Se centrifugó a 3000 rpm 10 min a 4°C y el botón se resuspendió con 2 mL de
medio SHE.
6. Se tituló el homogenado con 0.01 % de digitonina, dejando incubar por 15 min en
baño de hielo con agitación constante y se observó al microscopio invertido para
asegurarse de que hasta un 70 % de las células tuvieran rotas sus membranas
plasmáticas, cuando el porcentaje de células rotas era menor, se les agregaba otro
0.01% de digitonina hasta lograr la ruptura deseada.
7. Las células rotas se centrifugaron a 2750 rpm por 10 min a 4°C , el botón se
resuspendió con 2 mL de SHE.
8. Se centrifugó a 10000 rpm por 10 min a 4°C y el botón se resuspendió con 2 mL de
SHE.
9. Se centrifugó una vez más y el botón se resuspendió en 1.5 mL de SHE+albúmina
O.l%+ADP 1mM.
10.En cada uno de los pasos durante el aislamiento de mitocondrias, se tomaron
alícuotas de 50 UL para la prueba de Lowry de las siguientes fracciones:
A)Botón resuspendido después de centrifugar a 3000 rpm por 10 min a 4°C.
B) Homogenado con digitonina 0.01% e incubado 15 min.
C)Sobrenadante después de centrifugar a 2750 rpm por 10 min a 4°C.
D)Botón resuspendido después de centrifugar a 2750 rpm por 10 min. a 4°C y
desechado.
E) Sobrenadante después de centrifugar a 10000 rpm 10 min a 4°C y
desechado.
F) Botón resuspendido después de centrifugar a 10000 por 10 min a 4°C.
G)Sobrenadante después de centrifugar a 10000 rpm por 10 min a 4°C y
desechado.
H)Botón resuspendido después de centrifugar a 10000 por10 min a 4°C.
Método 5
1. Las células WRL-68 fueron utilizadas posterior a un cultivo de 24 horas con medio
esencial modificado de Dulbecco (DMEM). Se emplearon 5 cajas de cultivo celular.
2. Al cabo de este tiempo, se desechó el DMEM y se lavaron las células con 500 UL de
solución de Sacarosa 250 mM, HEPES 5 mM y EGTA 1 mM (SHE), pH 7.4.
3. Se volvió a desechar la solución y se agregó otros 200 UL de medio SHE.
4. Se abrieron las cajas con un cuchillo y se rasparon las células con un gendarme de
goma para obtener las células.
5. Se centrifugó a 3000 rpm por 10 min a 4 C y el botón se res-uspendió con 2 mL de
SHE.
6. El botón se resuspendió en 2 mL de medio SHE.
7. El homogenado se tituló con 80 UL de Digitonina (0.2%) en frio, se incubó durante
15 min.
8. Al término se observó otra muestra al microscopio para asegurarnos de que hasta
un 70 % de las células tuvieran rotas sus membranas plasmáticas.
9. Al honlogenado se le agregó 2 mL de medio SHE y centrifugó a 5000 rpm por 5
nlin a 4°C.
10.E1 botón se resuspendió con 2 znL de medio SHE y se centrifugó a 2100 rpm, 5 min
a 4°C esto último se realizó en tres ocasiones, recolectando cada vez los
sobrenadantes.
11.El recolectado se centrifugó a 10000 rpm por 10 min a 4°C.
12.E1 botón se resuspendió e incubó por IO minutos con 2 mL de medio SHE-
albúmina 0.1%-ADP lmM en baño de hielo.
13.Pasado ese tiempo se agregaron 2 mL de medio SHE y se centrifugó a 8500 rpm
por 10 min a 4 C.
14.E1 botón final (fracción mitocondrial) se resuspendió con 1 mL de medio SHE.
15.En cada uno de los pasos durante el aislamiento de mitocondrias, se tomaron
alícuotas de 50 UL para l a prueba de Lowry de las siguientes fracciones:
A. Botón celular resuspendido después de centrifugar a 2750 rpm por 10 min a
4°C. 2 2 2 5 0 7 B. Botón resuspendido después de agregar 0.2% de digitonina e incubado por
15 min, después de centrifugar a 5000 rpm por 5 min a 4°C.
C. Sobrenadantes de 3 centrifugaciones a 2100 rpm por 5 min a 4°C cada uno.
D. Botón resuspendido después de centrifugar a 2100 rpm por 5 min a 4°C y
desechado.
E. Sobrenadante después de centrifugar a 10000 rpm por 10 min a 4OC y
desechado.
F. Botón resuspendido después de centrifugar a 10000 rpm 10 min a 4°C e
incubado con SHE+Albúmina+ADP.
G.Sobrenadante después de centrifugar a 85000 rpm 10 min a 4°C y
desechado.
H. Botón resuspendido después de centrifugar a 85000 rpm 10 min a 4°C.
Con este método se obtuvieron los mejores resultados, y por lo tanto es el que se
utilizó para llevar a cabo los experimentos del efecto del cloruro de mercurio sobre
la respiración de las células WRL-68.
3.2 Determinación de proteínas.
1) La determinación de proteínas se realizó por el método de Lowry (Lowry, 1951)
utilizando una curva estándar con albúmina de suero de bovino (BSA) como
referencia y fueron leídas en un espectrofotómetro a 500 nm.
3.3 Consumo de oxígeno.
Se cuantificó el consumo de oxígeno de las mitocondrias aisladas de las células
control y tratadas con un electrodo tipo Clark en una celda cerrada a temperatura
ambiente (Estabrook, 1967).
El medio de reacción para todos los experimentos contenía sacarosa 230 mM, TEA
lOmM, fiP0.I 5 mM, MgC12 3 mM pH 7.4, más 0.5 mL de suspensión mitocondrial y
el agua necesaria para obtener un volumen final de 3 mL.
Se realizaron 2 tipos de experimentos:
1. Expmimlzto con inhibidores de la cadena respiratoria. Se cuantificó el consumo de
oxigeno utilizando como sustrato de sitio I y 11,5 mM de glutamato-malato pH 7.4
y succinato pH 7.4, respectivamente. Como inhibidor de sitio I se utilizó 1 ug/mL
de rotenona y como inhibidor de sitio 111 0.83 mM de KCN. SE agregó también
1mM de ADP para estimular la respiración
2. Experilrrento con zltz irzlzibidor de la ATP sitztetasn. Se cuantificó el consumo de
oxigeno utilizando como sustrato del sitio I1 a 5 mM de Succinato pH 7.4,
estimulado con 1 mM de ADP en presencia de 1 ug/mL de oligomicina.
En el método 1 se observó una muy baja respiración, debido tal vez a que cuando se
hizo l a ruptura de membrana con sonicación de 5 pulsos de 30 seg cada uno, ésto no
fue suficiente.
En el método 2, se observó una respiración casi nula, causado posiblemente por un
rompimiento tan grande de las células que hasta las membranas de los organelos
sufrieron daño.
Con el método 3, se observó una respiración lenta pero sí sensible a sustratos e
inhibidores.
En el método 4, se obtuvo una mejor respiración, sin embargo no eran sensibles a
inhibidores, debido tal vez a que no se lavaron suficientemente las mitocondrias
después de poner la digitonina para el rompimiento de las células.
En el método 5, se observó una respiración mitocondrial sensible a sustratos e
inhibidores, debido posiblemente a que se hicieron lavados consecutivos y
suficientes, así como una incubación por 10 minutos con mrdio SHE-albúmina 0.1%-
ADP posterior al rompimiento de membranas con digitonina (Gráfica 1).
3.4 Análisis estadístico.
Se utilizó la prueba t de student con un nivel de significancia de p< 0.05, para la
evaluación estadística de los valores de todos los experimentos.
4. ACTIVIDADES REALIZADAS
Las actividades fueron desarrolladas en el Laboratorio de Bioenergética (S-251A) y
en el Laboratorio de Fisiología Celular (S-361), ambos de la División de Ciencias
Biológicas y de la Salud de la UAM-Iztapalapa y se realizaron de acuerdo a lo
planeado:
4.1 DURACION Y ETAPAS
Marzo
Revisión Bibliográfica.
Análisis de Resultados.
X Trabajo Experimental.
de LowryLowry.
x Estandarización de la técnica
X Manejo de Aparatos.
X Preparación de soluciones.
X
Elaboración de Informe Final.
Julio 1 Agosto Sept. I
I I X
X
5. OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS
1. Se montó la mejor metodología para aislar mitocondrias activas de l a línea celular
WRL-68.
2. Se cuantificó la cantidad de proteína en cada uno de los pasos del proceso de
aislamiento mitocondrial por el método de Lowry (Lowry, 1951).
3.
a) Se cuantificó el consumo de oxigeno utilizando sustratos e inhibidores de la
cadena respiratoria.
b) Se cuantificó el consumo de oxigeno utilizando un inhibidor de la
ATPsintetasa.
6. RESULTADOS
6.1 Aislamiento mitocondrial.
El aislamiento mitocondrial realizado por el método 1, a pesar de obtener proteína
mitocondrial, se midió un consumo de oxigeno lento. Lo que indica que la sonicación
no fue suficiente, obteniendo en la determinación de proteínas y consumo de
oxígeno, un aparente buen rendimiento pero una muy baja respiración
respectivamente como se aprecia en la tabla 1.
En el método 2, cuando se hizo la ruptura de membrana con sonicación de 5 pulsos
de 30 seg cada uno y choque térmico con nitrógeno líquido, los resultados indican un
rompimiento tan grande que sufrieron daño las membranas de los organelos,
mostrando una determinación de proteína alterada y una respiración nula (tabla 1).
Con el método 3, al hacer la ruptura de membrana con sonicación de 6 pulsos de 1
min cada uno con descanso de 2 min entre cada pulso resultó ser menos perjudicial
teniendo proteína mitocondrial, sin embargo presentó un consumo de oxígeno
disminuido (tabla 1).
En el método 4, la utilización de 0.01% digitonina para el rompimiento de las
membranas celulares y el cambio de la solución amortiguadora, dieron mejores
resultados a diferencia de los métodos anteriores, con obtención de proteína
mitocondrial y una mejor respiración , sin embargo la preparación obtenida no era
sensible a inhibidores, debido tal vez a que no hubieron lavados suficientes después
de poner la digitonina a las células continuando ésta con el rompinliento de las
membranas (tabla 1).
En el método 5, en el aislamiento se utilizó una solución de Sacarosa 250 mM,
HEPES 5 mM y EGTA 1 mM (SHE) como amortiguador, se estandarizó el
rompimiento de las membranas plasmáticas con digitonina calculado un 0.2%, se
realizaron lavados consecutivos y suficientes, así como una incubación por 10
minutos con medio SHE-albúmina O.l%-ADP, se logró obtener proteína mitocondrial
y respiración sensible a sustratos e inhibidores (tabla 1). Por lo que se eligió este
método para aislar las mitocondrias de células tratadas y control.
Método Consumo de oxígeno Proteína mitocondrial
(mg/mL)
1
Sensible a inhibidores 1.96kO. 6 5
No sensible a inhibidores 3.31f1.0 4
Disminuido 6.11k0.9 3
No se registró 8.86H.8 2
Disminuido 3.13f0.8
Tabla 1. Relación entre cada uno de los métodos para el aislamiento mitocondrial en
cuanto a su rendimiento en la obtención de proteína mitocondrial y el consumo de
oxígeno.
6.2 Determinación de proteína.
Método Proteína de extracto Proteína del
homogenado celular mitocondrial
tmg/mL) tn1g/mL)
1
1.96k0.6 4.58f0.8 5
3.31k1 8.29f1.2 4
6.11k0.09 7.54f1.3 3
8.86k1.8 14.72+2 2
1.99k0.6 3.13k0.8
Tabla 2. Relación entre los diferentes métodos para el aislamiento mitocondrial y el
rendimiento en la obtención de proteína total y mitocondrial.
Proteína de homogenado celular
4.84k1.2 mg/mL Proteína de extracto mitocondrial
10.54k1.5 mg/mL
Tabla 3. Determinación de proteína en células incubadas 48 h, utilizada en los
experimentos de respiración.
Se utilizó en los experimentos 5uM de HgC12, teniendo como referencia el trabajo
realizado por Bucio et al. (1995), en el que determinaron que se apreciaba un efecto
sobre la mitocondria al utilizar ésta concentración.
Consumo de oxígeno -
Se realizaron 5 series de experimentos para las mitocondrias control y para las
tratadas con HgC12 5uM:
Expmirfrento con slrstrntos e inhibidores de In cndenn respiratoria. 2 2 2 5 0 7 Control
(natomog/min/mg proteína) (natomog/min/mg proteína)
HgC12 5 UM
Glu-mal
1.36k0.067 1.92-tO.83 ADP
1.3620.067 1.92-tO.83
Rotenona 10.74.+0.40 10.64k0.16
Succinato I2.89-tl.17 13.57k3.33
KCN l o l o I I
Tabla 4. Consumo de oxígeno de mitocondrias aisladas con sustratos e inhibidores de
la cadena respiratoria.
En la respiración con inhibidores de la cadena respiratoria, aunque se ve una
disminución en el consumo de oxigeno en las células control en comparación con las
células tratadas, este no es diferente significativamente (Fig. 1)
CONSUMO DE OXIGENO CON INHIBIDORES DE LA CADENA RESPIRATORIA
S L U - M A L
5.9 natomogo, 1 - 1 rnin
- Mitocondrias control
- - - Mitocondrias tratada5 con HgCI, 5 uM
Contr
HgCl 'O I
2 5uM
Glu- Rotenona Succinato KCN mal+ADP
Fig. l. Consumo de oxigeno de mitocondrias tratadas con HgCI, 5uM y control. El medio de reacción fue sacarosa 230mM, TEA 10 mM, fosfato lOmM, MgCI, 3mM a pH 7.4, aprox. 0.5 mg/mLde suspensión de mitocondrias en un volumen final de 3 mL. Se usó como sustrato de sitio I , activadordel estado 3 e inhibidor de sitio I a glu-mal 5mM, ADP 1 OOuM y rotenona 1 ug/mL respectivamente y sustrato de sitio I I e inhibidor de sitio Ill a succinato 5 mM y KCN respectivamente. Los datos no sonestadísticamente diferentes con p 0.05.
Experinrento con oligolnicina: inhibidor de In fosfmilnción oxidntiva.
Control
(natomog/min/mg proteína) (natomog/min/mg proteína)
HgC12 5 UM
I Succinato 12.16k0.71 12.7350.48
ADP
3.16k0.35 2.29k1.41 Oligomicina
2.8350.32 2.32k0.40
Tabla 5. Consumo de oxígeno de mitocondrias aisladas con sustratos e inhibidor de
la fosforilación oxidativa.
En la respiración con inhibidor de la fosforilación se observa que las mitocondrias
tratadas respiran más que las control después de adicionarles oligomicina (Fig.2).
: t
CONSUMO DE OXIGENO CON INHIBIDOR DE LA FOSFORILACIÓN OXIDATIVA
*SUCCINATO
5.9 natomogo,
1 min
OLlGOMlClNA - Mitocondrias control
- - - Mitocondrias tratada: con HgCI, 5 uM
ADP Oligomicina
Fig. 2. Consumo de oxigeno de mitocondrias tratadas con HgCI, 5uM y control. El medio de reacción fue sacarosa 230mM, TEA 10 mM, fosfato IOmM, MgCI, 3mM a pH 7.4, aprox. 0.5 mg/mLde suspensión de mitocondrias en un volumen final de 3 mL.Se usaron sustrato de sitio II y activador del estado 3 de la respira- ción a succinato 5 mM, ADP 100 uM e inhibidor de la fosforilación oxidativa a oligomicina.Los datos son esta- dísticamente diferentes con p < 0.05.
6.3.4 Análisis estadístico
Se utilizó la prueba t de student con un nivel de significancia del 0.05, en dónde se
observa que no existe una diferencia significativa entre el consumo de oxígeno de las
mitocondrias tratadas y control al utilizar sustratos e inhibidores de la cadena
respiratoria, sin embargo si existe evidencia suficiente para afirmar que existe una
diferencia significativa entre el consumo de oxígeno de las mitocondrias tratadas y
control al utilizar como inhibidor de la fosforilación a la oligomicina.
Prornedio del conslmo de oxígeno en experirlrento con inhibidores de In cndenn respiratorin.
Sustratos e inhibidores Células tratadas Células control
(natomg 02/min/mg prot.) (natomg 02/min/mg prot.)
GI u-mal 1.36 1.92
ADP
0.64 0.74 Rotenona
1.36 1.92
I I
Succina to 3.57 2.89
Ho= no existe diferencia entre los promedios
Ha= existe diferencia entre los promedios
nl= 4 X= 1.87 SI= 0.ss S21= 0.77
n2= 4 X= 1.74 S2= 1.26 S+ 1.60
Sp2= 1.19
tz 0.172
tO.o5,6= 2.44
2.44> 0.172
Se acepta Ho en que no existe evidencia. suficiente para afirmar que los consumos de
oxígeno entre las células control y las tratadas son significativamente diferentes con
p< 0.05.
7. DISCUSION Y CONCLUSIONES
Se lograron aislar a las mitocondrias de la linea celular fetal humana WRL-68 por el
método 5, el factor determinante fue el rompimiento de las membranas, que se logró
con digitonina al 0.2% con lavados consecutivos para eliminar restos de este sustancia
y evitar que siguiera teniendo efecto sobre las membranas.
El consumo de oxígeno de mitocondrias de la linea celular WRL-68 fue de 5.9
natomog 02/min/mg proteína, a diferencia de lo observado en mitocondrias de
hígado de rata con 111 natomog 02/min/mg proteína (Konigsberg, 1993) o de
mitocondrias de riñón de rata con 50 natomog Oz/min/mg proteína (Santos et al.,
1996).
Sin embargo nunca se logró obtener un control respiratorio en el que la velocidad de
consumo de oxigeno estuviera controlada por la concentración de ADP, debido a que
el metabolismo energético de las líneas celulares in vitro ocurre principalmente por
glucólisis y no por respiración mitocondrial (Freshney, 1983).
En los experimentos de respiración en donde se utilizaron sustratos e inhibidores de
la cadena respiratoria, se encontró que estadísticamente no hubo diferencia entre la
respiración de las mitocondrias tratadas y las mitocondrias control, esto conduce a
suponer que el efecto del cloruro de mercurio no es directo sobre la cadena
respiratoria, lo anterior es apoyado por Santos y col. (1997), que encontraron que a
menor concentración de cloruro de mercurio y/o menor periodo de incubación, no se
afecta la cadena respiratoria.
Sin embargo en los consumo de oxígeno de las mitocondrias tratadas y expuestas a
oligomicina, se observó que respiraron más. Esto sugiere que posiblemente el fracaso
de la oligomicina para inhibir la estimulación respiratoria producida en el consumo
de oxígeno de las mitocondrias tratadas por el mercurio es consistente con la
hipótesis de que la estimulación de la actividad de ATPasa es una consecuencia del
efecto del mercurio que causa permeabilidad de H+ en la membrana interna de las
mitocondrias tratadas expuestas a oligomicina, teniendo como consecuencia el
desacoplamiento de l a fosforilación oxidativa.
La unión preferente del metal a grupos sulfhidrilo de proteínas es ya conocido, en
dónde el efecto del mercurio sobre las funciones mitocondriales depende no sólo de
la concentración del inhibidor sino también de la cantidad de proteína mitocondrial
unida. Bucio y col. (1995), encontraron que la distribución subcelular del mercurio
fue: 48% en mitocondria, 38% en núcleo, 8% en la fracción citosólica y 7% en los
microsomas.
Estos resultados están en consonancia con reportes previos donde el HgC12 muestra
depresión del potencial de membrana asociado con actividad desacoplante
promoviendo el paso de H+ a través de la membrana mitocondrial, que normalmente
es impermeable a dichos iones. El hecho de que las mitocondrias se encuentren
desacopladas puede deberse también a una disfunción mecánica, como el
rompimiento o deterioro d e la membrana (Konigsberg, 1997). Por lo anterior es
posible que el cloruro de mercurio actúe alterando la estructura de la membrana por
la gran afinidad que tiene por los grupos tioles de las proteínas.
Santos y col. (1997) encontraron in vitro que a concentraciones relativamente bajas o
tiempos cortos de incubación con Hg(I1) la fosforilación oxidativa se desacopla y a
concentraciones mayores o tiempos largos de incubación se afecta marcadamente la
cadena respiratoria.
Otra posibilidad es que el cloruro de mercurio haya afectado la ATPsintetasa.
Estudios previos por Yagi y col., (1987), descubrieron que el complejo de ATP- sintetasa de mitocondria de corazón de bovino contiene un grupo esencial de tioles o
ditioles en el sector Fo de la membrana y que la modificación por mercuriales resulta
en desacoplamiento e inhibicion de la actividad de este complejo.
Palmeira y col. (1997) encontraron que los efectos del cloruro de mercurio en
mitocondria de hígado de rata it2 vifro deprime el estado 3 de la respiracion a
diferentes concentraciones, sugiriendo un fuerte efecto de este metal a nivel del
sistema de fosforilación. También estimula el estado 4 de la respiracion y disminuye
el potencial d e membrana sugiriendo una acción desacoplante. Ellos proponen que el
desacoplamiento puede ser causa de algunas interacciones del cloruro de mercurio
con el sistema molecular mitocondrial por:
1. Permeabilización de la membrana a H', ya sea por un efecto caotrófico o por
apertura de poros que contengan grupos -SH bloqueados por mercurio.
2. Pérdida del rendimiento de la bomba de protones, reduciendo la fuerza
protomotríz con subsecuente liberación de la velocidad de. oxidación de sustratos
no controlados eficientemente por un gradiente de protón adecuado.
3. Interacción en el nivel de la transición de permeabilidad del poro, facilitando s u
apertura o retardando su cierre.
Otra propuesta es que el mercurio puede inhibir a un transportador de ADP en la
mitocondria y el ATP fuera de ella (Weinberg et al., (1982).
Por todo lo anterior puede decirse, que tanto las mitocondrias control como las
tratadas fueron sensibles a inhibidores como la rotenona y el cianuro, lo que indica
que se aisló una cadena respiratoria viable. Siendo l a respiración más lenta en las
rnitocondrias tratadas. Sin embargo, no se pudo cuantificar el control respiratorio
debido a que el metabolismo energético de las células en cultivo es glucolítico.
Los efectos del mercurio sobre l a respiración, fueron causados posiblemente por la 71 P 5 2
unión de este metal a grupos tioles de proteínas de la membrana mitocondrial, más r O
que por inhibición enzimática directa, causando posiblemente desacoplamiento de l a 9 ' 7 4 ~,~
fosforilación por permeabilidad de H' en la membrana mitocondrial afectando la 0 a::
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V) * E !!?
. i
ATPsintetasa rica en grupos tioles o alterando la estructura de la membrana
8. RECOMENDACIONES
Como apoyo a los resultados obtenidos del efecto del cloruro de mercurio en la
respiración mitocondrial de la línea celular hepática fetal humana WRL-68, se
recomienda realizar los siguientes ensayos:
1. Actividad de la ATPasa mitocondrial, así como la determinación de fosfato Pi
(Konigsberg, 1997).
2. Formación de H202, lipidoperoxidación y glutatión; para cuantifiacar la inhibición
de la cadena respiratoria por especies reactivas productos de la presencia del
cloruro de mercurio (Lund et al., 1993).
3. Reversibilidad del efecto del cloruro de mercurio (el cual muestra gran afinidad
por grupos sulfhidrilo) utilizando ditioeritritrol (Weinberg et al., 1982).
4. Ensayo con atractilósido que es un inhibidor de la fosforilación oxidativa
(Weinberg et al., 1982).
10. BIBLIOGRAFIA
1. Ashour, H., Abde1,-Rahman, M., Khodiar, A. (1993) The mechanism of
methylmercury toxicity in isolated rat hepatocytes; Toxicol. Lett. 69: 87-96.
2. Atchison, W .D., Hare, M.f. (1994) Mechanismsof methylmercury-induced
neurotoxicity; FASEB 1. 624(8): 622-628.
3. Beatti, J.H.,Marion, M., Smith, J.P., Denizau, F. (1990) The citotoxic effects of
cadmium chloride mixtures in rat primary hepatocytes cultures, Toxicol. 62: 161-
173.
4. Bucio, L., Souza, V., Albores, A., Sierra, A., Chávez, E., Cárabez, A., Gutiérrez-
Ruíz, M.C. (1995) Cadmium and mercury toxicity in human fetal hepatic cell line
(WRL-68 cells), Tosicol. 102: 285-299.
5. Burger , J., Cooper, K., Saliva, J., Gochfeld, D., Lipski, D., Gochfeld, M. (1992)
Mercury bioacumulation in organisms from three Puerto Rican estuaries, Environ.
Monif. Asses 22: 181-197.
6. Byczkowski, J., Sorenson, J.R. (1984) Effects of metal compounds on mitochondrial
function: A review, Tlle Science of the total Environ. 37: 133-162.
7. Carty, A.J., Mallone, S.F. (1979) The chemistry of mercury in biological systems. In
the Biogeochemistry of mercury in the Environment, de. J.O. Niagu, pp. 433-479.
New York: Elsevier/North Holland.
8. Coquery, M., Welbourn, P.M. (1994) Mercury uptake from contaminated water
and sediment by the rooted and submerged aquatic macrophyte Eriocnulon
seytnrzgrrlnre, Arch. Environ. Xcontam. Toxicol. 26: 335-341.
9. Cuvin-Aralar, M.L.A., Aralar, E.V. (1993) Effects of long-term exposure to a
mixture of cadmium, zinc and inorganic mercury on two strains of tilapia
Oreocllrorrris niloticrls, Bull. Environ. Contam. Toxicol. 50: 891-897.
lO.Chávez, E., Zazueta, C., Díaz, E., Holquín, J.A. (1989) Characterization by Hg+2 of
two different pathways for mitochondrial Ca+2 release, Biochivr. Bioplzys. Actn. 986:
27-32.
ll.Choi, B.H., Kim, R.C. (1984) The comparative effects of methylmercury chloride
upon DNA synthesis in mouse fetal astrocytes in vitro, Exp. Mol . Pathol. 41: 371-
376.
12.Denizot, F., Lang, R. (1986) Rapid colorimetric assay for cell growth and survival,
1. inmr~.nol. Meth. 89: 271-277.
13.Estabrook1 R.W. (1967) Mitochondrial respiratory control and the polarographic
measurements of ADP:O ratios, Meth. Enzi~rrol. Vol. X: 41-47.
14.Goldwater, L.J. (1971) Mercury in the environment, Scientific American. 224: 15-
21.
15.Gutiérrezr M.C., Bucio, L., Souza, V., Gómez, J. J., Campos, C., Cárabez, A.
Expression of some hepatocyte-like functional properties of WRL-68 cells in
culture, In Vitro Cell. Deu. Biol. 30", 366-371.
lb.Inskip, M.J., Piotrovski, J.K. (1985) Review of the health effects of methylmercury,
1. Appl. Tosicol. 5, 11 3. ' y .* . ! 3 " . ,+-?&
17.Ki111, E.Y., Murakami, T., Saeki, K., Tatsukwa, R. (1996) Mercury levels and its i chemical form in tissues and organs in seabirds, Arch. Emiron. Contam. Toxicoi. 30: F
~. tj: 7
259-266. . - I .
lS.Konigsberg, M. (1993). Poliéteres corona como herramienta para detectar metales. I: ! -
Estudio comparativo entre: a) Cadena respiratoria mitocondrial b) Cadena ~~
fotosintética de cloroplasto. Tesis para obtener el grado de maestría en Biología :-) .
Experimental, UAM-Iztapalapa.
. .
!' 1
r; ; - , 1 .. _ "
19.Konigsberg M. (1998) El sombrerero loco y la contaminación por mercurio. Casa ~
del Tiempo. Vol. XTV, época 11, No. 75.
20.Konigsberg, M. (1997) Manual de prácticas de temas selectos d e Biofísica. UAM-
Iztapalapa.
21.Lachapelle, M.J., Guertin, F., Marion, M., Fournier, M, Denizau, F. (1993) Mercuric
Chloride affects protein secretion in rat primary hepatocytes cultures: a
biochemical ultraestructural and gold in~munocytochen~ical study, I. Toxicol.
Environ. Health. 38: 343-354.
22.Levintow, L., Eagle, H. (1961) Biochemistry of cultured mammalian cells, Ann.
Rev. Biod1etjl. 30: 605-640.
23.Liu, J., Kershaw, W.C., Klaasen, C.D. (1991) The protective effect of
metallothioneina on the toxicity of various metals in rat primary hepatocyte
culture, Toxicol. Appl. Pllnrrrlncol. 107: 27-34.
24.Lowry, O.H., Rostebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951) Protein
measurement with the folin phenol reagent, J. Bid. Clze~lr. 193: 256-275.
25.Lund, B., Miller, D., Woods, J.S. (1993) Studies on HG (11)-induced H202
formation and oxidative stress in vivo and in vitro in rat mitochondria, Biochem.
P ~ W I M U C O ~ . 45(1 O): 2017-2024.
26.Microsoft Encarta 1995. Mercury Element.
27.Miura, K., Imura, N. (1987) Mechanism of methylmercury citotoxicity, CRC Critical
R C V ~ ~ U S in TOX~CO~. !8(3): 161-188.
28.Murray, R.K., Granner, D.K., Mayes, P.A., Rodwell, V. (1988) Bioquímica de
Harper, Editorial El Manual Moderno S.A. pp. 107-117.México D.F.
29.Nakada, S., Imura, N. (1983) Susceptibility of lipids to mercurials, J. Appl. Toxicol.
3,131.
30.Nakada, S., Nomoto, A., Imura, N. (1980) Effect of methylmercury and inorganic
mercury of protein synthesis in mammalian cells, Ecotosicol. Emirorz. S a . 4,184.
31.Nielsen, J.B., Andersen, O. (1995) A comparison of the lactational and
transplacental deposition of mercury in offspring from methylmercury exposed
mice. Effect of seleno-L-methionine, Toxicol. Lett. 76: 165-171.
32.0mata, S., Kasama, H., Hasegawa, H., Hasegawa, K., Ozaki, K., Sugano, H. (1986)
Species difference between rat and hamster in tissue accumulation of mercury
after administration of methylmercury, Arch. Toxicol. 59: 249-254.
33.Palmeira, C.M., Madeira, V. M. (1997) Mercuric chhloride toxicity in rat liver
mitocondria and isolated hepatocytes, Env. Toxicol. Pharmacol. 3: 229-235.
34.Santos, A.C., Uyemura, S.A.,Santos, N.A., Mingatto F.E., Curti, C. (1997) Hg(I1)-
induced renal cytotoxicity: in vitro and in vivo implications for the bioenergetic
and oxidative status of mitochondria, Mol. Cell. Biocllemi. 177: 53-59.
35.Schintu, M., Jean-Caurant, F., Amiard, J.C. (1992) Organomercury determination
in biological reference materials: Application to a study on mercury speciation in
marine mammals of the Faroe Islands, Ecofox. Envirorl. Safe. 24: 95-101.
36.Smith, J.C., Farris, F. (1996) Methylmercury pharmacokinetics in man: A
reevaluation, Toxicol. Ayyl. Phnrwncol. 137: 245-252.
37.Sone, N., Lrsstuvold, M.K., Kagawa, Y. (1977) Effect of methylmercury on
phosphorilation, transport and oxidation in mammalian mitochondria, J. Biodreln.
82: 859-868.
38.Southard, J.H., Nitisewojo, P. (1973) Loss of oxidativephosphorilation in
mitochondria isolated from kidneys of mercury poisoned rats, Bioclzeln. Bioylrys.
Resendl Cortrrtr. 52(3):921-927.
39.von Burg, R. (1995) Toxicology update, 1.Ayyl. Toxico7. 15(6):483-493.
40.Weinbe1-g~ J.M., Harding, P.G., Hulnes, H.D. (1982) Mitochondrial bioenergetics
during the iniciation of mercuric chloride-induced renal injury, J. Bid. Clzenr.
257(1): 60-67.
41.Yagi, T., Hatefi, Y. (1987) Thiols in oxidative phosphorylation: thiols in the Fo of
ATP synthase essential for ATPase activity, Arch. Bioclrertl. Bioylrys. 254(1): 102-109.
Nombre: Norma Edith López Díaz-Guerrero
Matrícula: 89341746
Licenciatura: Biología Experimental
Título del Proyecto: "EFECTO DEL CLORURO DE MERCURIO SOBRE LA
RESPIRACIóN MITOCONDRIAL EN LA LíNEA CELULAR
HEPATICA FETAL HUMANA WRL-68"
Registro del S.social: BE.005.98
Fecha de terminación: 3 de Octubre de 1998
Nombre del Asesor: Mina Konigsberg Fainstein
Puesto y Adscripción: Prof. Asociado "D" Tiempo Completo. Departamento de
Ciencias de la Salud.
RESUMEN
Los objetivos principales del proyecto de servicio social fueron cuantificar el consumo de
oxigeno utilizando sustratos e inhibidores de la cadena respiratoria y cuantificar el consumo
de oxigeno utilizando un inhibidor de la ATPsintetasa, en las mitocondrias aisladas de la
lííea celular WRL-68, control y tratadas con 5 uM de cloruro de mercurio. Se observó que no
existe una diferencia significativa entre el consumo de oxígeno de las mitocondrias tratadas y
control al utilizar sustratos e inhibidores de la cadena respiratoria, sin embargo si se observó
evidencia suficiente para afirmar que existe una diferencia significativa entre el consumo de
oxígeno de las mitocondrias tratadas y control a l utilizar corno inhibidor de la fosforilación a
la oligomicina, siendo la respiración más lenta en las mitocondrias tratadas. Sin embargo, no
se pudo cuantificar el control respiratorio debido a que el metabolismo energético de las
células en cultivo es glucolítico. Los efectos del mercurio sobre la respiración, fueron
causados posiblemente por la unión de este metal a grupos tioles de proteínas de l a
membrana mitocondrial, más que por inhibición enzimática directa, causando posiblemente
desacoplamiento de la fosforilación por permeabilidad de H+ en la membrana mitocondrial
afectando la ATPsintetasa rica en grupos tioles o alterando la estructura de la membrana
mitocondrial por disfunción mecánica o por inhibición del transportador de ADP en la
mitocondria.