Sequenciamento e métodos em metabolômica de proteína
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Universidade Federal de Mato Grosso
Disciplina: Taxonomia de Fungos Filamentosos, com ênfase em Endofíticos
Docente: Profº Dr. Marcos Antônio Soares
Discentes: Mestrando: Adnaldo Brilhante (Pós Graduação em Química).Doutoranda: Ivani Souza Mello (Pós Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade - Rede Pró-Centroeste).
Cuiabá/ MT2015
Ciências ÔmicasPlataformas tecnológicas que visam isolar e
caracterizar biomoléculas.
As mais comuns são a genômica, a trancriptômica a
proteômica e a metabolômica.
A origem etimológica desse termo deriva da
genômica:
3
GENE + CROMOSSOMA = GENOMA GENÔMICA
MetabolômicaVisa as pequenas moléculas que compõem o metabolismo celular – isto é, os metabólitos – tanto para caracterização, quanto buscando uma melhor compreensão dos processos biológicos que estão ocorrendo em seus objetos de estudo.
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Metabólitos
Rotas principais
Primários Secundários
Funções específicas
Gautam et al., (2007).
Conceitos ImportantesCaracterização metabólica:
Isolamento de moléculas alvo e a caracterização de sua via de síntese.
Metabolômica:Isolamento de todos os metabólitos de uma amostra
biológica em condições normais e sob algum tipo de estresse.
Engenharia de metabolismo:Identificação de genes e rotas metabólicas de
determinado composto, visando aumentar, reduzir ou eliminar sua produção.
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Villas-Bôas & Gombert, 2006
Técnicas experimentaisEletroforese 2D
Método para separação e visualização de proteínas;
Separação por carga e massa.
Espectrometria de Massa Análise de alta confiabilidade e
identificação de proteínas; Fragmentação de proteínas; Análise de peptídeos.
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http://www.neobio.com.br/
www.alunonaweb.com.br
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A primeira dimensão
(separação por ponto isoelétrico)Gel com um gradiente de pH imobilizado;Corrente elétrica leva proteínas carregadas a se mover até alcançar o ponto isoelétrico.
2D-SDS PAGE gel
Gautam et al., (2007).
Ponto Isoelétrico (PI)Separação por carga:
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4
5
6
78
9
10
Gradiente de pH estável
Alto pH:
Proteína carregada
-
Baixo pH:ProteínaCarregada
+No ponto isoelétrico, a proteína não tem carga e portanto não migra mais no campo elétrico.
Gautam et al., (2007).
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A segunda Dimensão (separação por massa)pH gel strip e colocado em um gel SDS;SDS desnatura a proteína (movimento somente devido a massa) e elimina carga.
2D-SDS PAGE gel
A primeira Dimensão (separação por ponto isoelétrico)Gel com um gradiente de pH imobilizado;Corrente elétrica leva a proteínas carregadas a mover até alcançar o ponto isoelétrico.
Gautam et al., (2007).
VantagensBoa resolução para proteínas;
Detecção de modificações pós-transcricionais.
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Não funciona bem para proteínas altamente hidrofóbicas
Limitado pelo alcance de pH Difícil detecção de proteínas
pouco abundantes Análise e quantificação são
difíceis
Desvantagens
franquiastop.com.br
Exemplo de experimento 2-D gel19
Protein identification via 2DE and MALDI-TOF PMF
Kim et al., (2007)
O que é Espectrometria de massa?
Ferramenta analítica para determinar a composição
molecular de uma amostra ou os pesos moleculares;
Somente picomolares de concentrações são requeridas;
Acurácia de 0.01%, com somente 5 ppm de pequenas
moléculas orgânicas;
Para 40 kDa, erro de 4 Da;
Pode-se identificar substituições de aminoácidos ou
modificações pós-traducionais.
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Villas-Bôas & Gambert (2006), Wang et al., (2003).
Que tipo de informação é gerada?
Informação estrutural;
Tandem de espectrometria de massa – particularmente, uma sequencia definida;
Fragmentação de amostra – análise de produtos;
Sequenciamento de peptídeos;
Identificação de compostos individuais em misturas complexas;
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Wang et al., (2003); Jewett et al., (2006); Espindola et al., (2010).
Como funciona um espectrômetro?
3 partes fundamentais: fonte de ionização, o analisador e o detector
Amostras fáceis de manipular se ionizadas
Separação no analisador de acordo com a razão massa-carga (m/z)
Detecção de íons em separado e abundância relativa
Sinais enviados ao sistema de dados e apresentados em um espectro m/z
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Esquematização de um espectrômetro
O analisador, o detector e o ionizador estão em vácuo, para evitar movimento indesejado de íons;
A operação está sob completo controle de sistema.
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Moraes & Lago (2003).
Introdução da amostra e IonizaçãoIonização direta ou via cromatografia para separação de componentes (HPLC, GC, eletroforese capilar);
Ionização pode resultar em íons positivamente carregados (proteínas) ou negativamente carregados (sacarídeos e oligonucleotídeos).
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http://uab.ifsul.edu.br/tsiad/conteudo/modulo1/fis/fis_ua/at1/img/pag03-img03.gif
Metodologias de IonizaçãoPressão atmosférica Ionização Química (APCI);Ionização Química (CI);Impacto de Elétron (EI);Ionização por Eletro spray (ESI);Bombardeamento Atómico Rápido (FAB);Dessorção de Campo / campo de ionização (FD/FI);Matriz Laser Assistida por Dessorção de Ionização (MALDI);
Ionização por Termo spray.
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Detecção dos ÍonsO detector monitora o íon, amplifica seu sinal e o transmite
para o sistema
Detectores comuns: fotomultiplicador, eléctron multiplicador chapa de micro canal
29
altered-states.net prezi.com
Espectrometria de massas é uma metodologia poderosa para analisar a estrutura de compostos orgânicos, mas tem algumas limitações:
Nada pode ser caracterizado se não estiver em uma solução DEVIDAMENTE LIMPA;
A técnica não tem habilidade de apresentar uma análise seletiva de uma mistura complexa;
Para moléculas grandes, resultados são difíceis de interpretar.
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Tandem MS ou MS/MS tem 2 espectro de massa em série:
O primeiro (MS1) é usado para selecionar, de uma fonte primária de íons, aqueles que possuem um m/z particular, o qual passa para a região de fragmentação, onde ocorrerá a dissociação. No segundo (MS2), haverá a análise dos íons gerados. Na verdade, MS1 é uma fonte de íons para MS2.
MS2MS1
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Sequenciamento de peptídeos
Peptídeos de 2.5 kDa ou menos dão melhores resultados.
Proteínas retiradas de géis 2-D e digeridas;
Peptídeos fragmentados nas ligações peptídicas na Tandem da espectrometria de massa;
Alguns peptídeos geram informações para uma sequência completa, enquanto a maioria gera sequencias parciais de 4-5 aa;
Geralmente essas “tag” de sequencias são suficientes para identificação por database.
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Identificação de proteínas por MS
Espectro
artificial
Tripsinizado
artificialmente
Database desequências(ex. SwissProt)
Spot removido do gel
Fragmentação
com tripsina
Espectro dos
Fragmentos
MATCH
Libr
ary
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Como funciona o sequenciamento de proteínasTandem MS: dois analisadores de
massa em série com uma célula de colisão no meio;
Célula de colisão: um local aonde os íons colidem com um gás (He, Ne, Ar) resultando em fragmentação do íon;
A fragmentação dos petídeos na células de colisão ocorre de maneira previsível, principalmente nas ligações peptídicas;
Os íons resultantes tem massas que são consistentes com uma database de pesos moleculares de dipeptídeos, tripeptídeos, tetrapeptídeos.
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Ser-Glu-Leu-Ile-Arg-Trp
Célula de colisão
Ser-Glu-Leu-Ile-Arg
Ser-Glu-Leu
Ser-Glu-Leu-Ile
Etc…
VantagensDeterminação de peso molecular e sequencia de aa;
Detecção de modificações pós-transcricionais;
Alta confiabilidade.
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Alto custo Requer sequencia de
peptídeos em database.
Desvantagens
franquiastop.com.br
Etapas da MetabolômicaFatores que influenciam as análises metabolômicas durante a seleção do organismo a ser analisado:
Tratamento;
Idade;
Tamanho.
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www.bagozzi.edu.br novosinsolitos.blogspot.com
Etapas da Metabolômica
Fatores que influenciam as análises metabolômicas
durante o preparo da amostra:Quantidade de amostra;Maceração;Horário de coleta.
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Villas-Bôas & Gombert (2006).
Etapas da Metabolômica Fatores que influenciam as análises metabolômicas durante o pré fracionamento:
Escolha do solvente mais adequado;
Evitar interferência nos equipamentos;
Evitar reações indesejadas entre o solvente e a amostra.
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Etapas da MetabolômicaRequisitos básicos para realizar análises metabolômicas:
Grande capital para investimento;
Espaço físico adequado;
Profissionais capacitados.
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http://aston.chem.purdue.edu/research/metabolomics
Etapas da Metabolômica
Fator que influencia as análises metabolômicas durante a conversão de valores:
Colocar os resultados obtidos por diferentes
técnicas de fracionamento em uma linguagem
comum.
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www.nextidea.com.brMorgenthal (2005); Espindola et al., (2010)
Etapas da Metabolômica
Principal metodologia de análise estatística:Análise de Componente Principal (ACP):
Identificação de componentes mais abundantes;Organização hierárquica dos componentes identificados.
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Morgental (2005)
Aplicabilidade da MetabolômicaAplicações em diversas áreas:
Farmacologia;
Nutrição;
Ecologia;
Evolução;
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Villas-Bôas & Gombert (2006); Weckwerth & Fiehn, 2002..
Metabolômica na farmacologia48
Seleção Síntese Industrialização
Ensaios de toxicidade in vitro e in vivo
Busca de marcadores de
toxicidade
Mecanismos de toxicidade
Villas-Bôas & Gombert (2006); Weckwerth & Fiehn, 2002..
Metabolômica na nutriçãoConhecer as modificações causadas pela alimentação no metaboloma do indivíduo:
49
Villas-Bôas & Gombert (2006); Weckwerth & Fiehn ( 2002).
www.scielo.br
Alimento
Nutrientes Não-nutrientes
FitoquímicosInsumos agrícolas
Micro-nutrientes
Macro-nutrientes
Contaminantes Defensivos
Metabolômica na nutrição50
Metabolômica na ecologiaObservar diferenças imprevistas entre cultivares selvagens e modificadas geneticamente:
Glutamato desidrogenase em Nicotiana tabacum (Mungur et al.,
2005):
+ de 350 compostos alterados;
9 compostos carcinogênicos;
14 fármacos em potencial.
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Metabolômica na ecologiaIdentificar metabólitos comuns e diferenciais entre plantas resistentes e susceptíveis a uma determinada praga:
Já realizado pela transcriptômica e
pela proteômica;
Poucos trabalhos utilizando a
metabolômica (Forst, 2006).
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br.freepik.com
Metabolômica na ecologia Diferenciação de populações a partir de RMN de biofluidos:
Haliotis rufescens (mariscos) – (Viant et al., 2003);
Organização evolutiva a partir da presença de determinados metabólitos: Streptomyces – (Challis & Hopwood, 2003);
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Perspectivas para a MetabolômicaDeterminação de um protocolo padrão;
Desenvolvimento de ferramentas para um melhor aproveitamento dos dados gerados;
Integração das ômicas (Biologia de Sistemas).
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Considerações finais
Ômica mais nova e bastante promissora;
Grupo de moléculas muito diverso;
Necessita de padronização e melhoramento das técnicas.
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Referências• Kim, Y., Nandakumar, M. P., & Marten, M. R. (2007). Proteome map of Aspergillus nidulans during osmoadaptation. Fungal
Genetics and Biology,44(9), 886-895.• Moraes, M. C. B., & do Lago, C. L. (2003). Espectrometria de massas com ionização por" electrospray" aplicada ao estudo
de espécies inorgânicas e organometálicas. Química Nova, 26(4), 556-563.• Espindola, F. S., Calábria, L. K., de Rezende, A. A. A., Pereira, B. B., Santana, F. A., Amaral, I. M. R., ... & de Araújo, T. G.
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Scale Metabolomics Reveals A Complex Response of Aspergillus nidulans to Epigenetic Perturbation.ACS chemical biology.
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