Separação de pigmentos de couve por cromatografia em papel
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CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE MINAS GERAIS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA – COORDENAÇÃO DE ENSINO PROFISSIONAL
LABORATÓRIO DE QUÍMICA ORGÂNICA
CROMATOGRAFIA EM PAPEL
- SEPARAÇÃO DE PIGMENTOS DE COUVE -
Professor: Rodrigo Verly
Turma: QUI3A – T2
ALUNOS: Maria Luiza Andrade Aquino e Mariana Gabriela de Oliveira
Belo Horizonte
02 de março de 2011
I. Introdução
Cromatografia é uma técnica de separação e de análise de substâncias em solução,
mediante um processo de adsorção seletiva. Ela funciona de acordo com as interações
entre moléculas de polaridades diferentes, que podem ser ou não arrastadas da fase
estacionária para a fase móvel em diferentes intensidades. A técnica foi descoberta em
1906 pelo botânico russo Mikahail Tswett, mas não foi largamente utilizada até os anos 30.
Tswett separou pigmentos de plantas adicionando um extrato de folhas verdes em éter de
petróleo sobre uma coluna com vários sólidos em pó em um tubo de vidro vertical. Enquanto
a solução percorreu através da coluna, os componentes individuais da mistura migraram
para baixo em diferentes taxas de velocidades e então a coluna apresentou-se marcada
com gradientes de cores. A esse gradiente deu-se o nome de cromatograma.
O exemplo de cromatografia mais clássico é a cromatografia de papel. É uma das técnicas
mais simples e que requer menor instrumentação para realização, porém apresenta
restrições para realização em termos analíticos. Neste tipo de cromatografia, depois de
demarcada a amostra no papel, o eluente flui verticalmente pelo fenômeno de micro
capilaridade, e os componentes da amostra depositam-se em locais específicos. Utiliza-se o
papel de filtro de celulose, por ser altamente hidrófilo, mantendo um revestimento de água
imperceptível. Esse revestimento é a fase estacionária e o solvente utilizado é a fase móvel.
A couve é uma hortaliça que tem sido de fundamental importância desde a antiguidade.
Conhecida pelos celtas e os gregos, foi mencionada nos scripts de dramaturgos como
Epicharmus (S. VI A. C), cujos personagens aconselhavam o seu uso na cura de doenças.
No Império Romano, é mencionado por Cato, em seu livro "De re rustica" como um remédio
para problemas intestinais e pulmonares, e, sobretudo, para aumentar a produção de leite
em mulheres que estão amamentando.
É uma excelente fonte de vitamina C e beta-caroteno, que o corpo humano transforma em
vitamina A. Uma xícara de couve contém o dobro das necessidades diárias desses
nutrientes. Outros nutrientes presentes na couve são vitamina E, folato, cálcio, ferro e
potássio. Além disso, a couve contém mais ferro e cálcio que quase qualquer outra verdura;
seu alto teor de vitamina C aumenta a capacidade de absorção destes minerais pelo
organismo.
As clorofilas são moléculas formadas por complexos derivados da porfirina, tendo como
átomo central o Mg. Esse composto é uma estrutura macrocíclica assimétrica totalmente
insaturada constituída por quatro anéis de pirrol. Esses anéis numeram-se de 1 a 4 ou de “a”
a “d”, de acordo com o sistema de numeração de Fisher (SCHOEFS, 2002). As clorofilas a e
b encontram-se na natureza numa proporção de 3:1, respectivamente, e diferem nos
substituintes de carbono C-3. Na clorofila a, o anel de porfirina contém um grupo metil (-CH3)
no C-3 e a clorofila b (considerada um pigmento acessório) contém um grupo aldeído (-
CHO), que substitui o grupo metil-CH3. A estabilidade da clorofila b deve-se ao efeito
atrativo de elétrons de seu grupo aldeído no C-3 (VON ELBE, 2000).
Os cloroplastos são organelas vegetais onde ocorrem duas reações vitais para as plantas: a
fotoquímica, nas membranas dos tilacóides e a bioquímica, no estroma do cloroplasto. Tais
organelas, além das clorofilas, contêm outros pigmentos como os carotenóides (carotenos e
xantofilas). As ligações entre as moléculas de clorofilas são muito frágeis (não-covalentes),
rompendo-se com facilidade ao macerar o tecido em solventes orgânicos. O caráter
hidrofílico/hidrofóbico de uma substância influi diretamente na escolha do melhor solvente
para a sua extração. Os solventes polares como a acetona são os mais eficazes para a
extração completa das clorofilas. No caso das clorofilas a e b, o aumento da polaridade da
clorofila b em relação à clorofila a deve-se ao substituinte aldeído (VON ELBE, 2000;
MUSSI, 2003), como observado na Figura 02.
As técnicas cromatográficas são essenciais para a separação de substâncias puras de
misturas complexas e são amplamente utilizadas nas análises de alimentos, drogas,
sangue, produtos derivados de petróleo e produtos de fissão nuclear.
Sendo assim, o objetivo dessa prática é determinar o melhor eluente para a separação das
substâncias responsáveis pelos pigmentos da couve, através da cromatografia de papel e
medir seus Rf.
II. Materiais e Reagentes
- 1 béquer
- 4 Pipetas de Pasteur
- 8 tiras (16x1 cm) de papel poroso
- 8 tubos de ensaio
- Almofariz e pistilo
- Capilar
- estante para tubos de ensaio
- 1 mL de acetato de etila
- 1 mL de álcool etílico
- 1,25 mL de éter etílico
- 2 mL de diclorometano
- 3,20 mL de hexano
- Acetona
- Couve
III. Metodologia e resultados
A separação dos pigmentos da couve, através da técnica de cromatografia, exigiu que fosse
preparado o extrato do vegetal, as tiras de papel poroso (fase estacionária) e que se
escolhesse o eluente (fase móvel) mais adequado para a separação.
Primeiramente, preparou-se o extrato adicionando-se a pequenos pedaços de couve fresca
cerca de 50 mL de acetona. O material foi prensado em almofariz, com um pistilo, obtendo-
se um líquido esverdeado, o qual foi utilizado no processo. A fase estacionária consistiu
numa tira de papel poroso adequado ao recipiente utilizado, no caso, o tubo de ensaio.
Foram cortadas oito tiras de papel de 16 cm de altura e cerca de 1 cm de largura. Em cada
tira, foi marcado 1 cm da extremidade inferior e 1,5 cm da extremidade superior do papel,
que representam respectivamente o volume limite de eluente adicionado ao tubo de ensaio
e a altura limite de eluição.
Na extremidade inferior do papel, no centro da marcação e com o auxílio do capilar, aplicou-
se o extrato de couve, formando uma mancha circular com diâmetro com cerca de 5 mm,
para que o extrato estivesse em maior concentração, facilitando a separação e visualização
dos pigmentos.
Nos tubos de ensaio 1, 2, 3, 4 e 5 adicionou-se, respectivamente, 1 mL de hexano, de
diclorometano, de éter etílico, de acetato de etila e de álcool etílico, observando-se a ordem
de polaridade dos solventes, a fim de facilitar a escolha do mais adequado. Após adição dos
eluentes, introduziram-se as placas de papel em cada tubo de ensaio e observou-se a
eluição. Na placa 1, tendo hexano como eluente, houve separação dos pigmentos verdes
dos amarelos, porém não houve grande eluição, ou seja, a amostra continuou concentrada
no ponto de aplicação. Na placa 2, tendo diclorometano como eluente, observou-se que os
pigmentos verdes eluiram pela placa, acompanhando o solvente, enquanto os amarelos
permaneceram concentrados no ponto de aplicação da amostra. Nas placas 3 e 4, com éter
etílico e acetato de etila, respectivamente, observou-se o mesmo que ocorrido na placa 2,
porém na placa 4 a distância percorrida pelo pigmento verde foi maior. Na placa 5, ambos
os pigmentos percorreram a mesma distância, observando uma “cauda” amarelada na parte
inferior da placa.
Observando os resultados obtidos anteriormente, constatou-se que os eluentes que
obtiveram resultados mais satisfatórios foram o hexano (placa 1) e o diclorometano (placa
2). Dessa forma, adicionou-se 1 mL da mistura de hexano e diclorometano 2:1 v/v em outro
tubo de ensaio, a fim de observar a separação promovida por ambos eluentes, atuando
paralelamente. Nessa placa (6), houve separação dos pigmentos amarelos, porém os
verdes eluiram juntos. De acordo com os resultados verificados anteriormente, verificou-se
que a polaridade do eluente deveria aumentar um pouco para que a separação dos
pigmentos verdes ocorresse. Adicionou-se então 1 mL da mistura de hexano e
diclorometano, agora na proporção 1:1 v/v, em outro tubo de ensaio (7), observando-se a
separação dos quatro pigmentos. Os pigmentos verdes (clorofilas) apresentaram maiores
distâncias percorridas.
Figura 01. Cromatograma das separações dos pigmentos da couve utilizando diferentes eluentes
IV.Discussão e conclusão
O eluente mais adequado é aquele que promove a separação dos quatro pigmentos, dois
esverdeados (clorofila-a e clorofila-b) e dois amarelados (carotenóides: carotenos e
xantofilas).
Para constatar que a mistura feita no tubo 7 consistia no eluente mais adequado, adicionou-
se ao tubo de ensaio (8) 1 mL da mistura de hexano e éter etílico 3:1 v/v, sendo o éter mais
polar que o diclorometano. Observou-se a separação dos pigmentos verdes, porém os
amarelos eluiram juntos.
A separação cromatográfica e extração de produtos naturais podem ser utilizadas para
ilustrar vários fenômenos envolvendo interações intermoleculares. Ambos os processos
dependem diretamente dessas interações estabelecidas entre os componentes da mistura e
as fases estacionária e móvel. Na medida em que o solvente (fase móvel) passa pela
mistura, os componentes químicos são arrastados, de forma que a substância que possuir
maior afinidade química com ele será deslocada a uma velocidade maior.
A amostra analisada, obtida por maceração das folhas de couve, tinha pigmentos verdes e
amarelos, sendo, respectivamente, clorofila-a e clorofila-b; e carotenóides (carotenos e
xantofilas). A extração foi feita com a acetona (propanona), porque a água, por exemplo, é
muito polar, sendo necessário utilizar um extrator com grau de polaridade intermediário,
capaz de extrair o máximo possível de pigmentos tanto lipossolúveis quanto hidrossolúveis.
Figura 02. Estrutura das clorofilas a e b
Os carotenos, como o beta-caroteno (Figura 03), são hidrocarbonetos apolares, nos quais
prevalecem interações intermoleculares do tipo Forças de Van der Waals. Esses
hidrocarbonetos devem, portanto, ser eluídos com facilidade por fases móveis de baixa
polaridade e, durante a “corrida” cromatográfica, são os que mais se distanciam do ponto de
aplicação da amostra, no caso de a fase estacionária ser polar, como o papel hidrófilo,
utilizado nesse experimento.
As xantofilas monooxigenadas apresentam apenas um grupamento hidroxila (Figura 03) e
têm moderada afinidade com a fase estacionária utilizada nesse experimento, já que a
hidroxila pode formar ligações de hidrogênio com a água adsorvida no papel. Assim,
apresentam certa tendência à retenção pela fase estacionária e, durante a “corrida”
cromatográfica, distanciam-se moderadamente do ponto de aplicação da amostra.
Figura 03. Estrutura dos carotenóides: beta-caroteno e xantofila
Os eluentes utilizados primeiramente para observação foram, de acordo com a ordem
representada na Figura 01, hexano, diclorometano, éter etílico, acetato de etila, álcool
etílico. O hexano não foi capaz de arrastar com eficiência os quatro pigmentos, porém
observou-se separação das clorofilas dos carotenóides, já que se obteve duas cores
distintas. Dentre todos os solventes utilizados, este apresentava menor polaridade, por isso
foi capaz de arrastar os carotenóides, já que estes são pouco polares, enquanto a fase
estacionária (papel hidrófilo) reteve as clorofilas, já que estas apresentam maior polaridade.
A eluição não foi totalmente eficiente, pois os carotenóides possuem certa polaridade, o que
dificultou a interação com o solvente apolar.
O diclorometano não foi capaz de separar os pigmentos verdes e amarelos, porém
conseguiu arrastar as clorofilas, mostrando-se assim que sua polaridade foi suficiente para
interagir com estas, porém não foi capaz de interagir com os carotenóides.
Sendo assim, constatou-se que a polaridade do melhor eluente estaria entre o hexano e o
diclorometano, já que o éter etílico, o acetato de etila e o álcool etílico são mais polares que
o último, tornado-se desnecessária a análise dos resultados obtidos em 3, 4 e 5 (Figura 01).
Testou-se então, uma mistura de hexano e diclorometano 2:1 v/v, acreditando-se que a
apolaridade do hexano separaria os quatro pigmentos, enquanto a polaridade do
diclorometano promoveria o arraste, evidenciando a separação das cores. Porém a
polaridade da mistura não foi suficiente para separar a clorofila b da clorofila a, já que a
primeira é mais polar que a segunda, enquanto a apolaridade foi suficiente para a separação
dos carotenos das xantofilas.
A partir dos resultados obtidos anteriormente, constatou-se que era necessário aumentar a
polaridade da mistura. Desta forma, fez-se uma mistura de hexano e diclorometano na
proporção de 1:1 v/v. Percebeu-se assim a separação dos quatro pigmentos (Figura 01/7). A
clorofila b foi a mais retida, em decorrência de sua maior afinidade com a fase estacionária
(água), já que ela é a mais polar das substâncias em análise, estabelecendo, assim,
ligações de hidrogênio com a água. A clorofila a foi mais arrastada que a clorofila b por
apresentar uma polaridade inferior em relação à última, porém foi retida pela fase
estacionária antes dos carotenóides, por ser mais polar que estes. A xantofila foi retida
acima das clorofilas por possuir uma polaridade um pouco maior que os carotenos, já que
esta possui grupos –OH, que não estão presentes nestes, lhe conferindo essa propriedade.
Por último, têm-se os carotenos, mais apolar das substâncias analisadas que teve uma
maior afinidade pela fase móvel (menos polar que a água).
O resultado acima pode ser conferido através dos Rf’s das amostras, onde a clorofila b teve
um Rf 0,07, a clofofila a 0,48, a xantofila 0,79 e o caroteno 0,89.
Através do Rf também é possível concluir que o solvente não foi o ideal, já que o Rf da
clorofila b ficou muito próximo de 0.
Assim, fez-se uma nova mistura, aumentando a polaridade do solvente para que este
pudesse arrastar mais a clorofila b, afastando-a do ponto de aplicação. Essa mistura foi feita
com hexano e éter etílico na proporção 3:1 v/v. Porém não houve uma separação nítida das
cores, observando que a cauda de uma substância interferiu no ponto de maior
concentração de outra substância. Sendo assim, a mistura que apresentou resultado mais
satisfatório, separação nítida dos quatro pigmentos, foi a de hexano e diclorometano na
proporção de 1:1, sendo essa de média polaridade.
V. Referências bibliográficas
FRACETO, Leonardo Fernandes; LIMA, Sílvio Luís Toledo de. Aplicação da Cromatografia em papel na separação de corantes de pastilhas de chocolate. Química Nova na Escola, São Paulo, nº 18, p. 46-48, nov. 2003.
FONSECA, Sebastião F.; GONÇALVES, Caroline C. S. Separação de pigmentos do espinafre e separação em coluna de açúcar comercial. Química Nova na Escola, São Paulo, nº 20, p. 55-58, nov. 2004.
AGRIZZI, Tiago; NASCIMENTO, Isabella Oliveira; FERRAZ, CECÍLIA. Cromatografia em Papel/ Espectrometria De Absorção Atômica/ Espectroscopia de Ressonância Magnética do Infravermelho. Universidade Federal do Espírito Santo, Centro Universitário Norte do Espírito Santo - Curso de Agronomia. 2009. Disponível em: <http://www.conteudojuridico.com.br/?artigos&ver=2.29699>. Acesso em: 11 mar. 2011
Cromatografia em papel. Pontifica Universidade do Rio Grande do Sul. Disponível em: <http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/CROMA_PAPEL>. Acesso em: 11 mar. 2011
A Separação de Compostos por Cromatografia. Disponível em: <http://alkimia.tripod.com/cromatografia>. Acesso em: 11 mar. 2011.