Sensibilità ai farmaci del micobatterio tubercolare: approccio genotipico con limpiego di microchip...
-
Upload
letizia-scala -
Category
Documents
-
view
219 -
download
1
Transcript of Sensibilità ai farmaci del micobatterio tubercolare: approccio genotipico con limpiego di microchip...
Sensibilità ai farmaci del micobatterio Sensibilità ai farmaci del micobatterio tubercolare: approccio genotipico con tubercolare: approccio genotipico con
l’impiego di l’impiego di microchipmicrochip
Enrico TortoliEnrico Tortoli
Le resistenze del bacillo tubercolareLe resistenze del bacillo tubercolare
cromosomichecromosomichesviluppo spontaneo di mutanti resistenti con sviluppo spontaneo di mutanti resistenti con
frequenza compresa fra 1x10frequenza compresa fra 1x10-5-5 e 1x10 e 1x10-6-6
selezione dei mutanti resistenti in caso di terapie selezione dei mutanti resistenti in caso di terapie incongrueincongrue
MDR-TBMDR-TB
letalità superiore al 40%letalità superiore al 40%altissima incidenza nei paesi in via altissima incidenza nei paesi in via
di sviluppodi sviluppo il genotipo Beijingil genotipo Beijing
L’antibiogramma tradizionaleL’antibiogramma tradizionale
metodo delle proporzionimetodo delle proporzionisu Lowenstein-Jensen: 28-42 ggsu Lowenstein-Jensen: 28-42 ggsu 7H10/11: 10-21 ggsu 7H10/11: 10-21 gg in terreno liquido (radiometrico, MGIT) 5-12 ggin terreno liquido (radiometrico, MGIT) 5-12 gg
I farmaci antitubercolari maggioriI farmaci antitubercolari maggiori
ISONIAZIDE: battericida; attiva sui batteri in rapida ISONIAZIDE: battericida; attiva sui batteri in rapida moltiplicazione; inibisce la sintesi degli ac. micolicimoltiplicazione; inibisce la sintesi degli ac. micolici
RIFAMPICINA: battericida; attiva sia sui batteri in rapida RIFAMPICINA: battericida; attiva sia sui batteri in rapida moltiplicazione che su quelli intracellulari a crescita rallentata; moltiplicazione che su quelli intracellulari a crescita rallentata; inibisce la sintesi proteicainibisce la sintesi proteica
PIRAZINAMIDE: battericida (in associazione con l’isoniazide), a PIRAZINAMIDE: battericida (in associazione con l’isoniazide), a pH acido, sui batteri intracellulari; meccanismo di azione pH acido, sui batteri intracellulari; meccanismo di azione sconosciuto sconosciuto
ETAMBUTOLO: batteriostatico; attivo sui batteri in rapida ETAMBUTOLO: batteriostatico; attivo sui batteri in rapida moltiplicazione; inibisce la sintesi della componente glucidica moltiplicazione; inibisce la sintesi della componente glucidica della paretedella parete
STREPTOMICINA: battericida; attiva solo sui batteri STREPTOMICINA: battericida; attiva solo sui batteri extracellulari in rapida moltiplicazione; blocca la sintesi proteicaextracellulari in rapida moltiplicazione; blocca la sintesi proteica
Mutazioni e resistenzeMutazioni e resistenze
nella grande maggioranza dei ceppi resistenti ai nella grande maggioranza dei ceppi resistenti ai farmaci antitubercolari sono state individuate farmaci antitubercolari sono state individuate mutazioni in determinate regioni genichemutazioni in determinate regioni geniche
per nessun farmaco sono state trovate per nessun farmaco sono state trovate mutazioni associate al 100% delle resistenze mutazioni associate al 100% delle resistenze
in molti casi il meccanismo di resistenza rimane in molti casi il meccanismo di resistenza rimane oscurooscuro
Isoniazide IIsoniazide I
è noto da tempo che, in molti ceppi isoniazide-resistenti, l’attività è noto da tempo che, in molti ceppi isoniazide-resistenti, l’attività catalasica è ridotta o assente catalasica è ridotta o assente
tale difetto nella produzione di catalasi è il risultato di mutazioni nel tale difetto nella produzione di catalasi è il risultato di mutazioni nel gene gene katkatG (gene della catalasi-perossidasi) G (gene della catalasi-perossidasi)
circa il 55% dei ceppi isoniazide-resistenti presentano mutazioni nel circa il 55% dei ceppi isoniazide-resistenti presentano mutazioni nel gene gene katkatGG
l’attività battericida dell’isoniazide si manifesta soltanto in seguito l’attività battericida dell’isoniazide si manifesta soltanto in seguito all’ossidazione del farmaco operata dell’enzima catalasi-perossidasi all’ossidazione del farmaco operata dell’enzima catalasi-perossidasi
circa il 10% dei ceppi isoniazide-resistenti che presentano il gene circa il 10% dei ceppi isoniazide-resistenti che presentano il gene katkatG mutato hanno mutazioni anche nel gene G mutato hanno mutazioni anche nel gene ahpahpC codificante per C codificante per una alchil-idroperossido reduttasi una alchil-idroperossido reduttasi
l’introduzione del gene l’introduzione del gene katkatG G wild-typewild-type in mutanti isoniazide-resistenti in mutanti isoniazide-resistenti ripristina la sensibilità al farmacoripristina la sensibilità al farmaco
Isoniazide IIIsoniazide II
circa il 30% dei ceppi isoniazide-resistenti presentano mutazioni circa il 30% dei ceppi isoniazide-resistenti presentano mutazioni nel gene nel gene inhinhA che codifica per un enzima coinvolto nella sintesi A che codifica per un enzima coinvolto nella sintesi degli acidi micolici; il prodotto del gene degli acidi micolici; il prodotto del gene inhinhA potrebbe essere il A potrebbe essere il bersaglio dell’isoniazide; le mutazioni sono responsabili di over-bersaglio dell’isoniazide; le mutazioni sono responsabili di over-espressione del geneespressione del gene
mutazioni del gene mutazioni del gene kaskasA, codificante una proteina che regola A, codificante una proteina che regola l’allungamento degli acidi grassi, sono presenti nel 15% dei l’allungamento degli acidi grassi, sono presenti nel 15% dei ceppi isoniazide-resistenti. La proteina suddetta potrebbe essere ceppi isoniazide-resistenti. La proteina suddetta potrebbe essere il bersaglio dell’isoniazideil bersaglio dell’isoniazide
MECCANISMO DI AZIONE: inibizione della biosintesi degli ac. MECCANISMO DI AZIONE: inibizione della biosintesi degli ac. micolicimicolici
RifampicinaRifampicina
oltre il 97% dei ceppi resistenti alla rifampicina oltre il 97% dei ceppi resistenti alla rifampicina presentano mutazioni presentano mutazioni missensemissense nel gene nel gene rporpoB B codificante per la subunità codificante per la subunità della RNA-polimerasi della RNA-polimerasi
le alterazioni nella RNA-polimerasi, conseguenti alle le alterazioni nella RNA-polimerasi, conseguenti alle mutazioni, non consentono il legame della rifampicina mutazioni, non consentono il legame della rifampicina che non può quindi interferire nella trascrizione del che non può quindi interferire nella trascrizione del rRNA rRNA
EtambutoloEtambutolo
il 50% circa dei ceppi resistenti all’etambutolo il 50% circa dei ceppi resistenti all’etambutolo presentano mutazioni nel gene presentano mutazioni nel gene embembB, uno dei geni del B, uno dei geni del locus locus embemb che codifica per varie arabinosil-transferasi che codifica per varie arabinosil-transferasi
le arabinosil-transferasi, che consentono la le arabinosil-transferasi, che consentono la polimerizzazione dell’arabinano nei polisaccaridi della polimerizzazione dell’arabinano nei polisaccaridi della parete, costituiscono il bersaglio dell’etambutolo; in parete, costituiscono il bersaglio dell’etambutolo; in caso di mutazione si ha over-espressionecaso di mutazione si ha over-espressione
PirazinamidePirazinamide
la pirazinamide viene trasformata, dalla la pirazinamide viene trasformata, dalla pirazinamidasi, in acido pirazinoico che ne pirazinamidasi, in acido pirazinoico che ne costituisce il principio attivo; la maggior parte dei costituisce il principio attivo; la maggior parte dei ceppi resistenti alla pirazinamide mancano di ceppi resistenti alla pirazinamide mancano di pirazinamidasi pirazinamidasi
oltre l’80% dei ceppi pirazinamide-resistenti oltre l’80% dei ceppi pirazinamide-resistenti presentano mutazioni nel gene presentano mutazioni nel gene pncpncA codificante A codificante per la pirazinamidasiper la pirazinamidasi
StreptomicinaStreptomicina
alcuni ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel alcuni ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel gene gene rpsrpsL che codifica per la proteina ribosomiale S12 L che codifica per la proteina ribosomiale S12
altri ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel altri ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel gene gene rrsrrs che codifica per il rRNA 16S che codifica per il rRNA 16S
le suddette mutazioni, che si ritrovano complessivamente nel le suddette mutazioni, che si ritrovano complessivamente nel 70% circa dei ceppi resistenti, impediscono il legame 70% circa dei ceppi resistenti, impediscono il legame dell’antibiotico al 16S rRNA e bloccano quindi il meccanismo dell’antibiotico al 16S rRNA e bloccano quindi il meccanismo con cui la streptomicina inibisce la sintesi proteicacon cui la streptomicina inibisce la sintesi proteica
nessuna mutazione risulta per il momento associata al nessuna mutazione risulta per il momento associata al rimanente 30% dei ceppi streptomicina-resistentIrimanente 30% dei ceppi streptomicina-resistentI
Metodi genotipici di ricerca delle resistenzeMetodi genotipici di ricerca delle resistenze
ricerca delle mutazioni associate con le resistenzericerca delle mutazioni associate con le resistenze sequenziamento genicosequenziamento genico Single Strand Conformation PolymorphismSingle Strand Conformation Polymorphism Restriction Fragment Lenght PolymorphismRestriction Fragment Lenght Polymorphism ibridizzazione in fase solidaibridizzazione in fase solida formazione di formazione di eteroduplexeteroduplex
tutte le tecniche richiedono la preventiva tutte le tecniche richiedono la preventiva amplificazione delle sequenze in cui si ricercano le amplificazione delle sequenze in cui si ricercano le mutazionimutazioni
MicroarrayMicroarray
sistemi miniaturizzati in cui su un supporto solido sistemi miniaturizzati in cui su un supporto solido sono immobilizzate, legate alle singole postazioni di sono immobilizzate, legate alle singole postazioni di una matrice, catene di ac. nucleicouna matrice, catene di ac. nucleico
microchipmicrochip: : microarraymicroarray commerciale, commerciale, preconfezionato, in cui le singole postazioni preconfezionato, in cui le singole postazioni possono, o meno, essere controllate possono, o meno, essere controllate elettronicamente elettronicamente
identificazione, in fasi successive, delle eventuali identificazione, in fasi successive, delle eventuali mutazioni presenti in una determinata regione mutazioni presenti in una determinata regione geniche di vari ceppi (geniche di vari ceppi (amplicon downamplicon down))
identificazione di una specifica mutazione in molti identificazione di una specifica mutazione in molti ceppi contemporaneamente (ceppi contemporaneamente (capture downcapture down))
Amplicon downAmplicon down
mancata ibridizzazione = probabile mancata ibridizzazione = probabile resistenzaresistenza, da confermare cimentando in , da confermare cimentando in successione sonde con differenti mutazioni successione sonde con differenti mutazioni fino al raggiungimento dell’ibridazione fino al raggiungimento dell’ibridazione (possibilità di usare coppie di sonde (possibilità di usare coppie di sonde marcate con differenti fluorocromi)marcate con differenti fluorocromi)
legame, a vari microelettrodi, degli legame, a vari microelettrodi, degli amplificati della regione in esame ottenuti amplificati della regione in esame ottenuti da altrettanti ceppi da altrettanti ceppi
ibridizzazione = ibridizzazione = sensibilitàsensibilità
aggiunta di una sonda aggiunta di una sonda wild-typewild-type marcata marcata
impiego di numerose sonde per ciascuna regione da monitorare
Capture downCapture down
legame ai vari microelettrodi di varie legame ai vari microelettrodi di varie sonde, ciascuna specifica per una sonde, ciascuna specifica per una diversa mutazione della regione diversa mutazione della regione genica di interessegenica di interesse
aggiunta dell’amplificato in esameaggiunta dell’amplificato in esame aggiunta di una nuova sonda aggiunta di una nuova sonda
(marcata), specifica per un tratto (marcata), specifica per un tratto privo di mutazioni della regione privo di mutazioni della regione amplificataamplificata
rivelazione dell’amplificazione rivelazione dell’amplificazione grazie alla grazie alla marcaturamarcatura
impiego di numerosi microelettrodi per ciascuna regione da monitorare
EteroduplexEteroduplex legame, a ciascun microelettrodo, legame, a ciascun microelettrodo,
dell’amplificato di un ceppo in esamedell’amplificato di un ceppo in esame aggiunta di una sonda aggiunta di una sonda wild-typewild-type
aggiunta una proteina di aggiunta una proteina di E. coli,E. coli, implicata nei meccanismi di riparazione implicata nei meccanismi di riparazione del DNA, che ha la caratteristica di del DNA, che ha la caratteristica di legarsi alle doppie catene di ac. legarsi alle doppie catene di ac. nucleico che presentano nucleico che presentano mismatchmismatch legame = legame = eteroduplexeteroduplex = resistenza = resistenza assenza di legame = assenza di legame = duplexduplex omogeneo = omogeneo =
sensibilitàsensibilità
impiego di una sola sonda e di un singolo microelettrodo per ciascuna regione da monitorare
ConclusioniConclusioni
la determinazione genotipica delle resistenze permette la determinazione genotipica delle resistenze permette di ottenere risultati con un mese di anticipo rispetto ai di ottenere risultati con un mese di anticipo rispetto ai metodi tradizionalimetodi tradizionali
i i microarraymicroarray sono attualmente l’unica tecnologia con sono attualmente l’unica tecnologia con potenzialità di monitorare l’intero spettro delle potenzialità di monitorare l’intero spettro delle mutazioni associate a resistenze nel bacillo tubercolare mutazioni associate a resistenze nel bacillo tubercolare
la sensibilità genotipica deve sempre essere la sensibilità genotipica deve sempre essere confermata dal test fenotipicoconfermata dal test fenotipico false sensibilità: in caso di resistenze non associate a false sensibilità: in caso di resistenze non associate a
mutazioni notemutazioni note false resistenze: in presenza di una proporzione di mutanti false resistenze: in presenza di una proporzione di mutanti
resistenti al disotto della soglia del 1% resistenti al disotto della soglia del 1%