Al icai Ale jandro Morales Navarro

Tutora: Dra. Emma Saavedra

Inst i tuto Nacional de Cardio logía «Ignacio Chávez»

PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN

CINÉTICA DE LA ADH BIFUNCIONAL

RECOMBINANTE DE ENTAMOEBA HISTOLYTICA

Se considera la amibiasis como la infección del hombre por E. histolytica, independientemente de que ésta dé lugar o no a manifestaciones clínicas.

INTRODUCCIÓN: AMIBIASIS

Trofozoito de E. histolytica en fresco.

Microbiología y Parasitología Médica (Tomo III), LLop, Valdés-Dapena, Zuazo, Ed. Ciencias Médicas, 1era edición, Ciudad de La Habana 2001, pp. 88, 91.

…afecta a alrededor de 500 millones de personas por año.

…causa 50 millones de casos clínicos de disentería o abcesos hepáticos al año.<1>

…mata a 100,000 personas por año alrededor del mundo. <1>

…se controla principalmente con tratamiento con metronidazol y sus derivados y emetina. <2>

LA AMIBIASIS…

<1> World Health Organization. Weekly Epidemiol Rec 1997;72:97 –100.<2> Martínez-Palomo A. Amibiasis. México: Editorial Médica Panamericana, 1989.

Entamoeba histolytica: CICLO DE VIDA

Gluc

ATPADP

G6P

HK

F-6-P

F-1,6-P2

G-3-P

DHAP

HPI

Ppi-PFK

ALDOTPI

1,3-BPG

PPi Pi

NAD+NADH

3-PG

PGK

GAPDH

GDP

GTP

2-PG

PGAM

AMP + PPi

ATP + Pi

PEP

ENO

Pyr

PPDK

AcCoA

PFOR

NADH

NAD+

Acetaldehído Acetat

o

EtOH

ADH2

AcCoS

ADH2

Glucólisis en amiba

NAD+

NADH

AMP + PPi

ATP + Pi

ANTECEDENTES

Km AcetilCoA = 0.015 mMKm acetaldehído = 0.15 mM

Km etanol = 80 mMKm NAD+ = 0.15 mM

“Enzimas únicas como la EhADH2 son buenos blancos para quimioterapia, ya que son esenciales para el parásito e

inhibidores dirigidos específicamente a esta enzima deben ser no tóxicos para el hospedero.”

ANTECEDENTES

ANTECEDENTES

ANTECEDENTES

ANTECEDENTES

Debido a la presencia de un sitio de unión a Fe2+ en la EhADH2, ésta será

susceptible a inhibición por estrés oxidativo.

HIPÓTESIS

OBJETIVO GENERAL

Estudiar el efecto del estrés oxidativo sobre la EhADH2 recombinante.

Objetivos particulares

Amplificación del gen EhADH2.

Clonación del gen EhADH2 en un vector para sobreexpresión en bacterias.

Purificación de la proteína deseada con un buen rendimiento.

Caracterización cinética.

OBJETIVOS

METODOLOGÍA

PCRClonación

(pJET)Clonación(pET28)

METODOLOGÍA

Sobreexpresión de proteína.

Purificación de proteína.

Determinación de parámetros

cinéticos.

RESULTADOS: AMPLIFICACIÓN DEL GEN

2,500 kbp

3,000 kbp

Mar. 55°C 59°C 64°C

Gel de agarosa con las PCR a diferentes Tm (55, 59 y 64°C).Peso del gen 2.6 kbp.

RESULTADOS: CLONACIÓN EN PJET

Digestión de la Miniprep c/NheI y XhoIGel de agarosa al 1.2 %(Top10 transformada c/pJET-EhADH2)

Mar. M1 D1

3,000 kbp2,500 kbp

(EhADH2 pesa aproximadamente 2.6 kbp)

RESULTADOS: DIGESTIÓN EN PJET

Mar. M1 D1 M2 D2 M3 D3 M4 D4 M5 D5 M6 D6

2,500 kbp

3,000 kbp

1,500 kbp

1,000 kbp

500 kbp

NdeI

1309

711

599

Triple digestión de la Miniprep c/NdeI, NheI y XhoI(Top10 transformada c/pJET)

Patrón de restricción de EhADH2:

RESULTADOS: CLONACIÓN EN PET28

3,000 kbp

2,500 kbp

5,000 kbp

Mar. M2 D2

Digestión de la Miniprep c/NheI y XhoI(Top10 transformada c/pET28-EhADH2)

RESULTADOS: CLONAS INDUCIDAS

Clonas transformantes inducidas por 3 h a 25 °C.(Clonas de las A-H, peso aprox. PPDK 100 kDa)

PPDK BL21 A B C D E F G H

TRABAJO SOBRE LA PARTE DE ADH

Transformación de BL21

c/pET28-ADH

Sobreexpresión de proteína.

Purificación de la proteína.

RESULTADOS ADH: TRANSFORMACIÓN BL21

Inducción de clonas transformadas a 25°C.

Sobreexpresión más marcada

HK

PG

K

BL2

1

Clo

na 1

Clo

na 2

Clo

na 3

Clo

na 4

Clo

na 5

Clo

na 6

Tamaño aproximado de la proteína: 52 kDa

Marc

ador

RESULTADOS ADH: INDUCCIÓN A DIFERENTES TEMPERATURAS

Inducción a 35 y 25 °C.

HK

BL2

1

Sn 3

5°C

Pp 3

5°C

Sn 2

5°C

Pp 2

5°C

Inducción a 15 °C.

HK

BL2

1

Sn 1

5°C

Pp 1

5°C

RESULTADOS ADH: INDUCCIÓN CON DIFERENTES TIEMPOS DE

INCUBACIÓN

Inducción a 3 y 6 h (25°C).

HK

BL2

1

Sn 3

h

Pp 3

h

Sn 6

h

Pp 6

h

RESULTADOS ADH: PURIFICACIÓN

Marcha de purificación

HK

Sn B

L21

Pp B

L21

Flow

Lav.

1

Lav.

2

Lav.

3

Pro

t. P

uri

f.

Pp.

Caracterizar parámetros cinéticos (Km, Vmax, Ki,…)

Estudiar los mismos parámetros bajo efectos de estrés oxidante.

Introducir los datos al modelo cinético de glucólisis <3>.

Analizar datos obtenidos por el modelaje matemático para saber más sobre esta vía metabólica en la amiba.

Proponer, con base en MCA, a la enzima EhADH2 como buen blanco de terapia antiamebiana.

PERSPECTIVAS A FUTURO

<3> Kinetic modeling can describe in vivo glycolysis in Entamoeba histolytica.Saavedra E, Marín-Hernández A, Encalada R, Olivos A, Mendoza-Hernández G, Moreno-Sánchez R.

PCR

MÉTODOS: PCR

Electroforesis

MÉTODOS: ELECTROFORESIS EN GEL

- Electroforesis en gel de agarosa- SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis)

Transformación

Alteración genética de una célula resultado de la toma directa, incorporación y expresión de material genético exógeno (DNA exógeno). Es uno de los 3 proceso mediante se puede introducir DNA exógeno a células bacterianas (los otros: conjugación y transducción).

Rastreo de la presencia del plásmido:- Resistencia a antibiótico al que son normalmente

sensibles.- «Screening» azul-blanco (X-gal + Antibiótico)

MÉTODOS: TRANSFORMACIÓN

Importantes herramientas en la genética y la biotecnología, donde son usados para multiplicar o expresar genes/proteínas deseados.

De este modo, el gen que codifica para la proteína deseada es insertado en el plásmido para luego este (el plásmido) ser introducido en la célula (bacteriana principalmente) en la que se obtendrán la sobreexpresión.

Usualmente un plásmido puede aceptar insertos de 1-10 kbp. Para genes más grandes se usan otros vectores de clonación (fagos lambda, cósmidos, cromosomas bacterianos ó de levaduras artificiales…).

MÉTODOS: VECTORES PLASMÍDICOS

IMPORTANCIA DEL PROYECTO