Seminario 3 - OPE I

Universidad Nacional del SantaFacultad de CienciasE.A.P. Biotecnología

INTEGRANTES:

• CAMPOS COBIÁN, César• ESPÍRITU ÁNGELES, Christopher• MENDOZA RAMOS, Smit• JIMÉNEZ AGUIRRE, Elar Alonzo• NOLASCO CASTILLO, Yosselin Liliana• SILVA PEREDA, Luz Marzella• VÁSQUEZ RODRÍGUEZ, Jhazmín• VELÁSQUEZ COLQUE, Bryan Oliver

EFECTO DEL TIEMPO DE ESTERILIZACIÓN EN LA PRODUCCIÓN DE PENICILINA G Y

UTILIZACIÓN DEL PRECURSOR EN FERMENTACIÓN BATCH

• La operación unitaria más importante para una fermentación satisfactoria es la esterilización del medio.

• Se emplea para mantener la pureza del cultivo durante la fermentación.

• El medio puede esterilizarse por:• Calor• Filtración• Irradiación• Vibración sónica• Exposición a agente químicos.

• En la industria de la fermentación, el calentamiento por vapor es el método más empleado para esterilizar, ya que es confiable y fácil de controlar.

• Aunque se usa para erradicar microbios indeseados, puede llevar a un cambio en la composición de nutrientes.

INTRODUCCIÓN:

• Los metabolitos secundarios son compuestos orgánicos que se producen en sistemas biológicos y, aunque no estarían involucrados directamente en el crecimiento o reproducción del organismo, no son producidos sin razón.

• Entre ellos, la penicilina es el antibiótico más comercial en los últimos 50 años. El mercado de antibióticos β-lactámicos representa más del 65% del mercado de los antibióticos del mundo y se estima en unos 15 millones de dólares.

• En la producción industrial de penicilina-G, el rendimiento se ve aumentado por la adición de un precursor como el Ácido fenilacético (PAA) o ácido fenoxiacético (POAA), aunque éste debe agregarse en pequeñas cantidades constantemente.

• El modo de fermentación de la penicilina es el fed batch, añadiendo el precursor ácido fenoxiacético (POAA) durante todo el proceso a fin de evitar la inhibición por sustrato.

• Para una óptima producción los otros parámetros fueron monitoreados y controlados por programas del controlador.

• Tras formular el medio, éste fue esterilizado antes de la inoculación del cultivo deseado.

• Una vez que el medio de cultivo se sometió a autoclave a 15 psi de presión durante 15 minutos, se extendió el vapor bajo una corriente continua durante 3 días, lo que aumento la hidrolisis de la maltosa y lactosa, para poder obtener el máximo aprovechamiento del medio por los microorganismos.

• Cultivo y Productos Químicos:

• El cultivo empleado en este estudio fue una cepa de Penicillium Chrysogenum productora de Penicilina G de la división farmacéutica SPIC, Kudikadu Village, Cuddalore, India, proporcionada en ampollas, a las que se les agregó 1 ml de agua estéril en condiciones estériles.

• Se sembró 0,1 ml de la dilución en placas LCSB (Lactose Corn Steep Broth) y se mantuvieron en incubación durante 13 – 15 días.

• Se tomó 1 mL de esta muestra y se prepararon diluciones seriadas hasta 10 ⁶.ˉ

• La selección de colonias se basó en las siguientes características morfológicas: color verde, 3-12 mm de diámetro, esporulación uniforme, circular ligeramente alargado con centro levantados, margen blanco.

MATERIALES Y MÉTODO:

• Preparación de la Suspensión F1:

• La colonia seleccionada se diluyó en 2 ml de agua estéril, y se añadió la suspensión en un matraz cónico que contenía 100 g de arroz.

• Se mantuvo durante 13 días en incubación a 25º C con 60 a 65% de humedad relativa. Para la suspensión anterior, se añadieron 200 ml de Tween 60 0,05% (polisurbirato 60) y se mezcló.

• A continuación, la cepa fue recogida junto con Tween 60 por sedimentación del arroz.

• El tensoactivo Tween 60 fue empleado para separar las esporas del arroz. Los 100 ml de esta suspensión se tomaron como la F1.

• Prueba de Viabilidad:

• Se tomó 1 mL de la suspensión F1 y se realizó diluciones seriadas hasta 10-6 en solución Tween 60.

• Se colocó en un medio de recuento de viabilidad y después se incubó a 25 º C durante 5 días.

• Se realizó un recuento de colonias para analizar la actividad de las esporas.

• La suspension F1 que mostró un recuento de viabilidad de 1,5 a 2 x 108 células / mL fue tomada para la etapa F2.

• Las placas con recuento de viabilidad menor de 1,5 x 108 células / mL no fueron tomadas en cuenta, ya que el número de colonias en las placas reflejarían la actividad de la cepa.

• Medio de Siembra y Fermentación:

• Los medios de siembra usados en este trabajo contienen harina de semilla de algodón 10 (g / l); polvo de maíz remojado 20 (g / l); sacarosa 40 (g / l); sulfato de amonio 2 (g / l); KH2PO4 0,5 (g / l); CaCO3 5 (g / l); (pH 6,3) y se esterilizó a 121 º C durante 15 min.

• Tras autoclavar a 121 ° C durante 15 min, el medio de siembra se inoculó con 10 ml de inóculo que contenía 9x105 esporas por ml y el cultivo se incubó en un agitador rotatorio a 25 ° C y 230 rpm durante 54 horas.

• Los Medios de fermentación contenían la composición siguiente de nutrientes: ácido fenoxi acético 10 (g / l); sulfato de potasio 5 (g / l); KH2PO4 1,5 (g / l); sulfato de amonio 12 (g / l); polvo de maíz remojado 27,5 (g / l); lactosa 120 (g / l); CaCO3 10 (g / l) y 10 ml de aceite de maíz.

• El pH del medio se ajustó a 6,5.

• Esterilización:

• Las autoclaves verticales empleadas para la esterilización de medios fue de acero inoxidable y que pueden soportar una presión de hasta 22 psi, equipado con visualizador de temperatura y presión (Macro Scientific Works Pvt Ltd). Los matraces de los medios fueron cubiertor con algodón y papel aluminio, y se esterilizaron como lotes a diversos intervalos de tiempo: 25, 30, 35, 40, 45, 50 y 55 min a una presión constante de 22 psi.

• Inoculación y Fermentación:

• Medios esterilizados (pH 6,5) en tres matraces batch fueron inoculados con 3 ml de inóculo, bajo un flujo de aire laminar y se mantuvieron en incubadora de agitación orbital (REMI Instruments) a 220 rpm durante 164 horas.

• Mediciones Analíticas:

• Las muestras de los 3 lotes de matraces fueron examinados a los 41, 82, 123 y 164 minutos para analizar el nivel de actividad de la producción de penicilina G, mediante RP-HPLC (Shimadzu Corporation).

• La columna utilizada en el análisis fue C18-Hypersil Octadodecyl silano (longitud 25 cm, diámetro 0,46 cm). La fase móvil polar contenía ortofosfato dihidrógeno de potasio y 45% de acetonitrilo (80:20) a pH 4,6 y la velocidad de flujo utilizada fue 1,4 ml / min.

• En el caso de procedimientos de fermentación estándar se utilizó metanol como fase móvil secundaria en lugar de acetonitrilo (60:40).

• El detector utilizado fue detector UV. El detector era de tipo fijo y la fuente luminosa era una lámpara D2 (deuterio).

• En la fermentación de la Penicilina, los medios se esterilizan a 121 ° C durante 30 min; pero en nuestro estudio, el medio se esterilizó a 121 ° C durante diversos intervalos de tiempo entre 25 y 55 minutos y el análisis se realizó a varios intervalos de tiempo de fermentación: 41, 82, 123 y 164 minutos, respectivamente.

• El análisis incluyó la detección de la producción de penicilina G y utilización de precursor ácido fenoxiacético (POAA) en los medios.

• Los medios esterilizados a 121 ° C durante 45 minutos han mostrado la máxima producción de penicilina G y la utilización de POAA en todo momento (41, 82, 123 y 164 minutos) de análisis.

• El análisis se llevó a cabo en HPLC y el pico de elución para POAA se obtiene alrededor del tercer minuto y el pico de elución para la Penicilina G alrededor del decimoquinto minuto.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

• Análisis al Minuto 41:

• El set de 5 lotes de fermentación que contienen medios esterilizados a diferentes tiempos, se tomó del agitador en el minuto 41 y se analizó el nivel de actividad de penicilina G y la cantidad de POAA no utilizado presente. El medio esterilizado 45 minutos muestra 9,63% más actividad que el de 30 min (tiempo de esterilización habitual). Más allá de los 45 min de esterilización, hasta los 55 min, hay un descenso en la actividad. La actividad mostrada por el medio esterilizado 55 min era sólo 32,39% en comparación con la actividad del medio de 45 min. El contenido residual del precursor POAA fue mayor en el medio esterilizado 25 minutos, lo que decreció sostenidamente hasta el medio esterilizado 45 min. Los frascos esterilizados por encima de 45 minutos mostraron un aumento en la acumulación de POAA. El medio esterilizado 45 minutos mostró 98.3% menos POAA acumulado al compararse con el POAA residual presente la fermentación en medio esterilizado 55 minutos.

S. No

Tiempo de esterilización

del medio (minutos)

Actividad de Penicilina(1µ/mL)

POAA residual(mg/mL)

1 25 1021 8.01

2 30 1329 4.52

3 35 1406 2.191

4 40 1438 2.005

5 45 1457 0.331

6 50 911 10.04

7 55 472 16.76

Tabla 1: Actividad de Penicilina y contenido residual de POAA en varios tiempos de esterilización tras 41 minutos de fermentación

Cuadro 1: Actividad de Penicilina y contenido residual de POAA en varios tiempos de esterilización tras 41 minutos de fermentación


• El set de 5 viales donde se llevó a cabo la fermentación conteniendo medios con diferentes tiempos de esterilización fue retirado del agitador tras el minuto 82 y se analizó el nivel de actividad de Penicilina y la cantidad de POAA no utilizado. El medio esterilizado 45 minutos mostró 14,16% más actividad que el medio esterilizado 30 minutos (tiempo usual de esterilización). Tras 45 de esterilización hasta 55 minutos se produjo una caída en la actividad de Penicilina G. La actividad mostrada por el medio esterilizado 55 minutos fue solo 32,74% al compararse con la actividad del medio 45 minutos. El contenido residual del precursor POAA fue mayor en el medio esterilizado 25 minutos, el cual fue disminuyendo sostenidamente hasta los 45 minutos. Los frascos esterilizados más de 45 minutos mostraron un incremento en la acumulación de POAA. El medio esterilizado 45 minutos mostró 87.24% menos POAA acumulado al compararse con el POAA residual presente en el medio esterilizado 55 minutos.

S. No


del medio (minutos)



1 25 10682 6.32

2 30 14019 3.62

3 35 14883 1.65

4 40 15812 1.38

5 45 16004 0.221

6 50 9912 6.71

7 55 5178 10.81



• El set de 5 matraces que contiene medios esterilizados a diferentes tiempos fueron tomados de agitador después de minutos 123 y se analizó el nivel de actividad de la penicilina y la cantidad de POAA no utilizado presente. El medio esterilizado 45 minutos mostró una actividad de 5,332% más que la actividad en 30 minutos (tiempo de esterilización habitual). Después de 45 minutos hasta 55 minutos se da una caída en la actividad de penicilina G. La actividad mostrada por el medio esterilizado 55 minutos fue sólo 24.74% al compararse con el medio de 45 minutos. El contenido residual de POAA fue más en el medio esterilizado 25 minutos, lo que disminuyó de manera constante hasta 45 minutos. Los frascos esterilizados más de 45 minutos mostraron aumento en la acumulación POAA. El medio esterilizado 45 minutos mostró 97,89% menos POAA acumulado, al compararse con el POAA residual presente en el medio esterilizado 55 minutos.

S. No


del medio (minutos)



1 25 29081 5.213

2 30 37791 2.91

3 35 38934 1.33

4 40 39195 1.1

5 45 39806 0.171

6 50 19861 5.15

7 55 9851 8.12


• Análisis al Minuto 164:• El set de 5 frascos de fermentación con medio esterilizado a

diferentes tiempos fue retirado del agitador tras 164 minutos y se analizó los niveles de actividad de penicilina y la cantidad de POAA no utilizado. El medio esterilizado por 45 minutos mostró una actividad de 8.315% más que la actividad a 30 minutos (tiempo usual). Tras 45 minutos, la esterilización prolongada hasta 55 minutos llevó a un declive en la actividad. La actividad mostrada por el medio esterilizado 55 minutos fue solo de 26,24% al compararse con la actividad del medio esterilizado 45 minutos. El contenido residual de POAA fue mayor en el medio esterilizado 25 minutos, el cual disminuyó sostenidamente hasta los 45 minutos. Los frascos esterilizados más de 45 minutos mostraron un incremento en la acumulación de POAA. El medio esterilizado 45 minutos mostró 97,74% menos POAA acumulado al compararlo con el POAA residual presente en el medio de 55 minutos. La máxima fermentación de Penicilina G se obtuvo en el medio esterilizado 45 minutos, mientras que el medio esterilizado más de 45 minutos mostró un declive en la fermentación de Penicilina G.

S. No


del medio (minutos)



1 25 35071 4.21

2 30 45291 2.32

3 35 48195 1.05

4 40 48954 0.91

5 45 49057 0.14

6 50 30672 4.02

7 55 12876 6.21


• A fin de mantener una correcta fermentación, el medio debe estar libre de microorganismos antes de la inoculación de P. chrysogenum.

• La esterilización con vapor es uno de los mejores métodos para esterilización de medios en escala industrial.

• El número y tipo de reacciones químicas que pueden tener lugar en un medio de fermentación durante la esterilización por calor son demasiado complejas para definirse.

• El perfil de temperatura y tiempo del proceso de esterilización podría, teóricamente, afectar las concentraciones resultantes de componentes.

• Un excesivo tiempo de esterilización también tiene un impacto negativo en algunos casos de producción; también pueden generarse productos inhibitorios o carbonización del medio, lo que lleva a reducir la formación del producto de fermentación.

• Los estudios demostraron que incrementar el tiempo de esterilización ha incrementado la producción de Penicilina G en 30% hasta 30 minutos, y por encima de 30 minutos el incremento en el tiempo de esterilización no aumentó demasiado la producción de Penicilina G aunque sí hubo un pequeño incremento.

• Más allá, se observó que a pesar que la productividad de Penicilina G aumentó como efecto del incremento en el tiempo de esterilización, el costo involucrado en el incremento de la duración del tiempo de esterilización fue mayor que el costo del producto.

• Por lo tanto, actualmente se está trabajando en un enfoque alternativo más barato para aumentar la duración del tiempo de esterilización sin afectar la calidad del producto y obtener mayores beneficios del proceso productivo de Penicilina G.

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