UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

Tese

Seleção de oócitos suínos através do corante

Brilliant Cresyl Blue

Elisa Caroline da Silva Santos

Pelotas, Março de 2014.

1

ELISA CAROLINE DA SILVA SANTOS

Seleção de oócitos suínos através do corante Brilliant Cresyl Blue

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biotecnologia da

Universidade Federal de Pelotas, como

requisito parcial à obtenção do título de

Doutor em Ciências (área do

Conhecimento: Biotecnologia da

Reprodução Animal).

Orientador: Thomaz Lucia Junior

Coorientadores: Arnaldo Diniz Vieira

Ligia Margareth Cantarelli Pegoraro

Rafael Gianella Mondadori

Pelotas, Março de 2014.

2

Dados de catalogação na fonte:

Maria Beatriz Vaghetti Vieira – CRB-10/1032 Biblioteca de Ciência & Tecnologia – UFPel

S237s Santos, Elisa Caroline da Silva

Seleção de oócitos suínos através do corante Brilliant Cresyl Blue / Elisa Caroline da Silva Santos. – 69f. : il. – Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia da Reprodução Animal. Universidade Federal de Pelotas. Centro de Desenvolvimento Tecnológico. Pelotas, 2014. – Orientador Thomaz Lucia Junior; co-orientador Ligia Cantarelli Pegoraro, Rafael Gianella Mondadori e Arnaldo Diniz Vieira.

1.Biotecnologia. 2. Suinos. 3. Competência oocitária. 4. BCB. 5. Meios. 6. Toxicidade. 7. Maturação in vitro. I.Lucia Junior, Thomaz. II. Pegoraro, Ligia Cantarelli. III. Mondadori, Rafael Gianella. IV. Vieira, Arnaldo Diniz. V.Título.

CDD: 636.40824

Santos, Elisa Caroline da Silva Seleção de oócitos suínos através do corante Brilliant Cresyl Blue / Elisa Caroline da Silva Santos. – 69f. : il. – Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia da Reprodução Animal. Universidade Federal de Pelotas. Centro de Desenvolvimento Tecnológico. Pelotas, 2014. – Orientador Thomaz Lucia Junior; co-orientador Ligia Cantarelli Pegoraro, Rafael Gianella Mondadori e Arnaldo Diniz Vieira.

1.Biotecnologia. 2. Suinos. 3. Competência oocitária. 4. BCB. 5. Meios. 6. Toxicidade. 7. Maturação in vitro. I.Lucia Junior, Thomaz. II. Pegoraro, Ligia Cantarelli. III. Mondadori, Rafael Gianella. IV. Vieira, Arnaldo Diniz. V.Título.

CDD: 636.40824

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Banca examinadora

Prof. Dr. Thomaz Lucia Junior, Universidade Federal de Pelotas (Orientador).

Prof. Dr. Augusto Schneider, Universidade Federal de Pelotas.

Prof. Dr. Bernardo Garziera Gasperin, Universidade Federal de Pelotas.

Dr. José Carlos Ferrugem Moraes, Embrapa Pecuária dos Campos Sul-Brasileiros.

4

Dedico à minha família e aos meus verdadeiros amigos.

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a Deus pela minha vida e por ser fonte de

inspiração, força, determinação e sabedoria.

Ao meu orientador Thomaz Lucia Junior: agradeço por ter acreditado em

mim e confiado esta responsabilidade. Aos meus coorientadores: Rafael Mondadori,

Arnaldo Vieira e Ligia Pegoraro: agradeço pela ajuda no desenvolvimento dos

trabalhos, ensinamentos prestados, amizade e bons conselhos.

Ao pesquisador Hisataka Iwata e mestrando Daichi Sato, que auxiliaram o

desenvolvimento de parte da tese na Tokyo University of Agriculture.

Aos colegas do ReproPEL, Karina, Fabiana, Raquel, Gustavo Gastal, Zilah,

Kauê, Carlos Eduardo, Carine e à todos os estagiários e professores, pela boa

convivência, ajuda sempre que necessária e pelos bons momentos que passamos!

Aos colegas da Embrapa, Dona Ledi, Giovane, Elisângela, Jorgea, Miriane,

Bruna, Alexander, José, Tainã e Andressa: pela ajuda prestada na condução da

tese, convivência alegre e palavra amiga de sempre. Levo vocês no coração!

A minha família, mãe (Zélia Tavares da Silva), irmãos (Paulo, Patricia,

Gonçalo, Regina), tia (Catarina Tavares) e amigos incondicionais (Cláudia, Ariadne,

Renata, Andressa, Paulo Schmidt) que entenderam minha ausência, minhas falhas,

momentos difíceis, souberam lidar com as distâncias, saudades, sempre com amor.

Ao Frigorífico Castro pela disponibilização dos ovários suínos, especialmente

ao funcionário Nilo, sempre prestativo.

Ao Laboratório de Neurobiotecnologia da UFPel, Professora Luciele

Savegnago e Débora Martinez, pelo auxílio na condução do ensaio cometa.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior (Capes)

pela bolsa concedida durante o Doutorado e ao Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa concedida durante o

Doutorado Sanduiche.

A Universidade Federal de Pelotas e à Pós-Graduação em Biotecnologia,

pelo qualificado curso de Doutorado.

A todos que de alguma forma auxiliaram no desenvolvimento desta tese...

MUITO OBRIGADA !!

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“Para quem tem pensamento forte, o impossível é só questão de opinião”.

Charlie Brown Jr.

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RESUMO

SANTOS, Elisa Caroline da Silva. Seleção de oócitos suínos através de Brilliant Cresyl Blue. 2014. 69f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas. Para a obtenção de embriões suínos produzidos in vitro faz-se necessário que a maturação in vitro (MIV) ocorra de forma eficiente, o que exige a seleção dos complexos cumulus-oócitos (CCOs) mais competentes. O corante Brilliant Cresyl Blue (BCB) permite selecionar os CCOs que completaram seu crescimento, mediante a avaliação dos níveis da enzima G6PDH. Entretanto, existe um possível efeito nocivo relacionado ao processo de seleção com BCB, o qual pode ser devido a uma toxicidade intrínseca do corante ou aos vários fatores relacionados à composição dos meios para a realização do teste. Desta forma, esta pesquisa teve como objetivos: averiguar a existência de toxicidade após exposição ao BCB e avaliar o efeito de diferentes meios para a coloração com BCB sobre a capacidade de suporte ao desenvolvimento oocitário. Na primeira pesquisa, após a coloração com BCB e após a MIV, vários testes foram realizados para avaliar os efeitos de sua potencial toxicidade sobre a atividade e a funcionalidade mitocondrial: análises de espécies reativas de oxigênio (ROS), ATP, potencial de membrana mitocondrial e número de cópias de DNA mitocondrial. Como resultados, obteve-se que oócitos corados com BCB produziram altos níveis de ROS quando comparados com o controle imediatamente após a coloração e após a MIV. O ATP e potencial de membrana mitocondrial apresentaram resultado similar entre os grupos após a coloração, porém, após a MIV oócitos BCB apresentaram menor potencial de membrana e ATP. Não ocorreu diferença no número de cópias do DNAmt nos grupos avaliados. Já, no teste do conteúdo de ATP em embriões iniciais, o ATP foi inferior em oócitos BCB, porém, não ocorreu diferença significativa. Na segunda pesquisa, comparou-se o meio mais utilizado, D-PBS, com um meio mais elaborado para o BCB, chamado de ReproPEL. Os CCOs submetidos aos dois meios foram submetidos à MIV e avaliados quanto à maturação nuclear e citoplasmática, ativação partenogenética e ao teste cometa. Na MIV nuclear, as maiores taxas de MII (P<0,05) foram obtidas no DPBS+ (63,1%), ReproPELc (55,1%) e ReproPEL+ (50,2%). Quanto à densidade dos GC, os grupos com menor área (P<0,05), evidenciando melhor migração, foram ReproPELc, D-PBS+, D-PBS- e ReproPEL+. A ativação partenogenética demonstrou que o meio ReproPEL possui boa capacidade de manutenção oocitária, possibilitando taxas aceitáveis de desenvolvimento até o estágio de blastocisto: ReproPEL+ (13,0%); e ReproPELc (12,7%). Desta forma, o meio ReproPEL pode ser indicado para a manutenção oocitária, porém não foi o meio mais indicado para o corante BCB. Com relação à toxicidade, após a exposição ao BCB e após a MIV, os oócitos BCB apresentaram alterações em nível mitocondrial, devido ao aumento na produção de ROS, diminuição do potencial de membrana e ao comprometimento da produção de ATP. Porém, a função mitocondrial foi restaurada no início do desenvolvimento embrionário. Com tudo isso, conclui-se que o BCB foi responsável por toxicidade em oócitos suínos imaturos, sendo necessários novos estudos para avaliar as alterações causadas pelo BCB em nível embrionário. Palavras chave: Competência oocitária, BCB, meios, MIV, toxicidade, suínos.

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ABSTRACT

SANTOS, Elisa Caroline da Silva. Selection of swine oocytes through Brilliant Cresyl Blue. 2014. 69f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas. The production of swine embryos in vitro requires efficient in vitro maturation (IVM), which can be achieved by selection the most competent cumulus-oocyte complexes COC).The Brilliant Cresyl Blue (BCB) dye allows the selection of COC with complete growth by assessing their levels of the G6PDH enzyme. However, there is a possible negative effect of selection with BCB. This effect may be due to its intrinsic toxicity or to factors related to the composition of the media used during the test. This research had the objectives: to determine potential toxicity after exposure to BCB and to evaluate the effect of different medias for BCB staining on the ability to support oocyte development. On the first research, after BCB staining and after IVM, several tests were performed to evaluate the effects of their potential toxicity on mitochondrial activity and functionality: reactive oxygen species (ROS), ATP, mitochondrial membrane potential and the number of copies of mitochondrial DNA. The results showed that oocytes stained with BCB produced high levels of ROS, compared with control immediately after staining and after the IVM. The ATP and mitochondrial membrane potential showed similar results between groups after staining, however, after IVM oocytes BCB showed lower membrane potential and ATP. There was no difference in the number of copies of mtDNA in the evaluated groups. Already, on test of ATP content in early embryos, ATP was lower in BCB oocytes, however, there was no difference statistical. In second study, the most commonly used media, D-PBS, was compared with a more elaborate media for BCB called here: ReproPEL. The COC’s submitted to both media were submitted to nuclear and cytoplasmatic maturation, parthenogenetic activation, and to the comet test. The great rates of nuclear IVM (P<0.05) were obtained for DPBS+ (63.1%), ReproPELc (55.1%) and ReproPEL+ (50.2%). The group with smaller area of CG (P<0.05), showing better migration, were ReproPELc, D-PBS+, D-PBS- and ReproPEL+. The parthenogenetic activation indicated that ReproPEL media presented satisfactory capacity of oocyte maintenance, resulting in acceptable rates of development to blastocyst stage: 13.0% for ReproPEL+; and 12.7% for ReproPELc. So, the ReproPEL media can be used for maintenance of swine oocytes, but it was not the most appropriate media for BCB staining. Moreover, after exposure to BCB and after IVM, BCB oocytes presented high toxicity at mitochondrial level, due to increased production of ROS, decreased membrane potential and compromised ATP production. However, the mitochondrial function was restored in early embryonic development. In conclusion, BCB was responsible for toxicity in immature swine oocytes, nevertheless, further studies must be performed to evaluate the changes caused by BCB in the embryonic level. Keywords: Oocyte competence, BCB, media, IVM, toxicity, porcine.

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ATP- Adenosina tri-fosfato

BCB- Brilliant Cresyl Blue (Azul de Cresyl Brilhante)

BCB(+) Oócito com baixos níveis da G6PDH, corado com Brilliant Cresyl Blue

BCB(-) Oócito com altos níveis da G6PDH, não corado com Brilliant Cresyl Blue

CO2 - Gás carbônico

COCs- Complexo Cumulus-Oophorus

DNAmt- DNA mitocondrial

GC- Grânulos corticais

GSH- Glutationa

G6PDH- Glicose- 6- fosfato - desidrogenase

m-DPBS- Salina tamponada com Fosfato segundo Dulbecco’s

MIV- Maturação in vitro

MII- Metáfase II

NaDPH- Fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina

NCSU23- Meio 23 da Universidade da Carolina do Norte

VG- Vesícula Germinativa

PIV- Produção in vitro

PIVE- Produção in vitro de embriões

PZM- Porcine zygote medium

RNAm- RNA mensageiro

ROS- Espécies Reativas de Oxigênio

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO GERAL............................................................................................................................12

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................................................................14

2.1 Seleção oocitária com Brilliant Cresyl Blue (BCB)......................................................................14

2.2 Maturação in vitro de oócitos suínos.................................................................................................15

2.3 Maturação Citoplasmática......................................................................................................................16

2.3.1 Grânulos Corticais .................................................................................................................................17

2.3.2 Mitocôndrias...............................................................................................................................................18

3. HIPÓTESES.....................................................................................................................................................20

4. OBJETIVOS.....................................................................................................................................................21

5. ARTIGO 1

Brilliant Cresyl Blue staining negatively affects mitochondrial functions in porcine oocytes....................................................................................................................................................................22

5.1 Summary..........................................................................................................................................................24

5.2 Introduction......................................................................................................................................................25

5.3 Materials and methods..............................................................................................................................26

5.4 Statistical Analysis.......................................................................................................................................30

5.5 Results..............................................................................................................................................................31

5.6 Discussion........................................................................................................................................................32

5.7 Conclusion.......................................................................................................................................................34

5.8 References......................................................................................................................................................34

5.9 Figures......................................................................................................................................................38

6. MANUSCRITO 2

Efeito do meio para a seleção de oócitos suínos através do Brilliant Cresyl Blue na Maturação in vitro, Produção Embrionária e Genotoxicidade......................................43

6.1 Resumo................................................................................................. ...........................................................45

6.2 Abstract............................................................................................................................................................46

6.3 Introdução........................................................................................................................................................47

6.4 Materiais e Métodos....................................................................................................................................48

6.5 Análise Estatística........................................................................................................................................51

6.6 Resultados.......................................................................................................................................................51

6.7 Discussão.........................................................................................................................................................52

6.8 Conclusões.....................................................................................................................................................54

11

6.9 Referências....................................................................................................................................................54

6.10 Figuras...........................................................................................................................................................58

7. CONCLUSÕES...............................................................................................................................................62

8. REFERÊNCIAS..............................................................................................................................................63

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1. INTRODUÇÃO GERAL

Existe um grande interesse na PIV em suínos com a finalidade de investigação

biomédica, devido à similaridade fisiológica com a espécie humana (Abeydeera,

2002). Contudo, os resultados obtidos nesta espécie ainda são considerados

insatisfatórios, quando comparados com resultados in vivo ou com demais espécies,

como bovinos e camundongos (Kikuchi et al., 1999) em decorrência da MIV

citoplasmática incompleta. Durante a MIV na espécie suína, é sabido existir falhas

na migração e conteúdo dos grânulos corticais, acarretando em altas taxas de

fertilização polispérmica (Dang-Nguyen et al., 2011). Como resultado, esta

ineficiência também limita outras biotécnicas que necessitam de blastocistos de

qualidade, como a transgenia, produção de células e órgãos para xenotransplantes

(Dang-Nguyen et al., 2011).

Desta forma, um dos pré-requisitos para o sucesso da PIV é a qualidade

oocitária. Porém, a maior parte das falhas durante a PIV suína é decorrente da

seleção de oócitos de baixa qualidade, os quais não apresentam todas as

características morfológicas, bioquímicas, celulares e metabólicas para

completarem seu desenvolvimento (Naruse et al., 2006). Atualmente são utilizados

para os procedimentos in vitro, oócitos provenientes de fêmeas pré-púberes, devido

ao baixo custo e abundância destas fêmeas em abatedouros. Contudo, estes

oócitos são considerados mais heterogêneos e apresentam competência de

desenvolvimento reduzida (Pawlak et al., 2011).

Desta forma, metodologias que possibilitem acesso à determinação da

viabilidade, sem causar danos ao oócito, são alternativas para selecionar os

gametas mais competentes e melhorar a eficiência dos protocolos de PIV

(Goovaerts et al., 2010). Dentre as metodologias de seleção oocitária, o corante

Brilliant Cresyl Blue (BCB) é um método não invasivo que permite acessar a

viabilidade celular através da atividade metabólica do oócito. Porém, este método

apresenta-se atualmente bastante controverso. Existem relatos de bons resultados

utilizando oócitos selecionados através do BCB (Roca et al., 1998; Wongsrikeao et

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al., 2006) entretanto, existe a possibilidade de efeito prejudicial ao oócito, causado

ou pelo BCB (Pawlak et al., 2011) ou devido ao tempo, meio e condições da

metodologia utilizada para esta seleção (Goovaerts et al., 2010). Desta forma, o

BCB e sua atuação na MIV de oócitos suínos, possível toxicidade, assim como, o

desenvolvimento de melhorias neste teste foram o tema deste estudo.

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2. REVISÃO BIBIOGRÁFICA

2.1 Seleção oocitária com Brilliant Cresyl Blue (BCB)

O BCB é um corante vital que atua na seleção de oócitos através da avaliação

da atividade intracelular da enzima Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Esta

enzima da via pentose-fosfato apresenta importante papel de fornecimento de

energia para as células, através da liberação de NADPH, sendo produzida em altas

quantidades pelo oócito, enquanto este está em sua fase de crescimento (Manglia &

Epstein, 1975). Da mesma forma, a atividade da G6PDH decresce enquanto o

oócito finaliza esta fase (Ericsson et al., 1993). O teste BCB consiste na avaliação

da capacidade da G6PDH em degradar o BCB (Alm et al., 2005). Os oócitos que

completaram o crescimento e apresentam maior potencial de competência mantém

a cor azul (BCB+), pois a atividade da G6PDH é baixa, sendo incapazes de

degradar o corante. Os oócitos que conseguem degradar o corante (BCB-)

apresentam alta atividade da G6PDH (Rodríguez-González et al., 2002).

O BCB é considerado um teste simples e eficaz para a seleção oocitária em

várias espécies, como suínos (Roca et al., 1998; Wongsrikeao et al., 2006), bovinos

(Alm et al.,2005; Opiela et al., 2010), bubalinos (Manjunatha et al., 2007), ovinos

(Karami-Shabankareh et al., 2012) e equinos (Mohammadi-Sangcheshmeh et al.,

2011). Entretanto, mesmo existindo evidências de que os oócitos classificados

através do BCB sejam mais competentes, a utilização deste corante ainda é

controversa, pois há estudos que não encontraram diferença entre oócitos corados,

que seriam mais viáveis e oócitos não expostos ao corante, o que não justificaria a

pré-seleção (Opiela et al., 2008; Ishizaki et al., 2009; Pereira et al., 2013). Além

disso, as vantagens do uso do BCB também são contraditórias quanto a um

possível efeito deletério (Goovaerts et al., 2010; Vandaele, 2008), pois altas taxas

de alterações cromossômicas foram observadas em oócitos BCB provenientes de

fêmeas pré-púberes (Pawlak et al., 2011).

A manutenção dos oócitos durante o processo de coloração, normalmente

realizado entre 60-90 minutos, antes do início da MIV (Goovaerts et al., 2010), é

usualmente feita com meio mDPBS (Pujol et al., 2004; Wongsrikeao et al., 2006;

Opiela et al., 2008; Ishizaki et al., 2009; Pawlak et al., 2011). Porém, o meio D-PBS

15

apresenta baixa complexidade e isto poderia influenciar a competência oocitária

durante o tempo de coloração. Neste contexto, o uso de um meio mais complexo,

em termos de nutrientes, poderia influenciar positivamente a manutenção da

viabilidade oocitária durante o teste BCB. Entretanto, não existem informações

referentes ao efeito de meios alternativos que possam ser empregados na

manutenção dos oócitos durante o processo de coloração.

Em contrapartida, a exposição dos oócitos suínos ao BCB já foi correlacionada

com alterações nos níveis de RNAm e proteínas, responsáveis pelo sucesso da

fertilização (Kempisty et al., 2011). Como também, o BCB pode ter sido o

responsável por alterações cromossomais em oócitos suínos expostos a esse

corante (Pawlak et al., 2011). Da mesma forma, existem relatos de pesquisas onde

oócitos BCB+ não apresentaram resultados superiores à oócitos que não foram

submetidos ao corante (Ishizaki et al., 2009; Mohammadi-Sangcheshmeh et al.,

2011). Estas informações sugerem que o BCB pode apresentar algum nível de

toxicidade aos oócitos, reduzindo sua capacidade de desenvolvimento.

2.2 MIV de oócitos suínos

A competência de desenvolvimento ou qualidade oocitária é adquirida

progressivamente, enquanto o oócito cresce e matura. Esta é uma etapa de suma

importância, pois influencia o desenvolvimento embrionário, a manutenção da

prenhez e o desenvolvimento fetal (Krisher et al., 2007).

Quando aspirados a partir de ovários colhidos em abatedouro para a MIV, os

oócitos suínos se encontram em diferentes estágios de organização nuclear. Nos

folículos antrais, os oócitos inicialmente encontram-se no estágio de vesícula

germinativa (VG) e assim que a meiose é retomada, avançam para o estágio de

metáfase II (MII) em 32-44 h, completando o processo chamado de maturação

nuclear (Wu et al, 2002). Uma série de eventos, concomitantes a meiose, devem

ocorrer no citoplasma. Coletivamente, estes eventos são chamados de maturação

citoplasmática e são independentes da maturação nuclear (Krisher et al., 2007).

Em suínos, em torno de 70-90 % dos oócitos completam a maturação nuclear in

vitro ao final da MIV. Apesar destas altas taxas, o sucesso da extrusão do primeiro

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corpúsculo polar não garante que o oócito apresentará o número normal de

cromossomos (Dang-Nguyen et al., 2011). Além disso, os oócitos suínos

apresentam reduzida habilidade de desenvolvimento in vitro, possivelmente devido

à inadequada maturação citoplasmática (Abeydeera 2001; Krisher, 2004). Os

gametas nos quais a maturação nuclear ocorre em tempo normal, geralmente

apresentam assincronia entre a maturação nuclear e citoplasmática, podendo não

ser fecundados ou não ter desenvolvimento embrionário adequado (Izadyar, 1997).

Esta assincronia, explica a alta incidência de polispermia e as taxas insuficientes de

desenvolvimento até o estágio de blastocisto, quando comparados com oócitos

maturados in vivo, assim como ocorre com outras espécies domésticas in vitro

(Dang-Nguyen et al., 2011).

Um fator que têm melhorado a MIV dos oócitos suínos é a redução do

estresse oxidativo durante o processo in vitro, causado pela intensa liberação de

ROS, através do uso de antioxidantes (Dang-Nguyen et al., 2011). Desta forma, os

meios de PIV suína estão sendo aprimorados, em termos de composição, para que

suportem da melhor forma o desenvolvimento do oócito suíno in vitro.

2.3 Maturação Citoplasmática

Durante a maturação citoplasmática ocorrem alterações no número, no tamanho

e/ou na posição das organelas celulares, em decorrência de uma reestruturação

intracelular. Em oócitos imaturos, as mitocôndrias e o complexo de Golgi estão

localizados perifericamente. Durante a maturação, as mitocôndrias migram para a

região perinuclear, próxima à placa metafásica. Já, o complexo de Golgi se

reorganiza centralmente, diminuindo seu desenvolvimento, com agrupamento com o

retículo endoplasmático liso (Abeydeera et al., 2002). Os grânulos corticais (GC)

migram da região central para a região cortical (Yoshida et al., 1993).

No citoplasma, durante a MIV, ocorre acúmulo de RNAm e proteínas, substratos,

nutrientes, reorganização do citoesqueleto e organelas e alterações no metabolismo

celular (Krisher et al., 2007). Estas alterações são importantes para que ocorra a

ativação, a formação de pró-núcleos e a sustentação do desenvolvimento

embrionário pré-inplantação (Ptak et al., 1999).

Dentre os substratos, a síntese de glutationa (GSH) intracelular é um evento

17

importante que ocorre durante a maturação. Como a GSH confere proteção celular

contra o estresse oxidativo, através de sua medição é possível obter um indicativo

da maturação citoplasmática (Maedomari et al., 2007). A concentração intracelular

de GSH em oócitos suínos maturados in vivo (36,26 pmol/oócito) é inferior à

observada em oócitos maturados in vitro (7.98 pmol/oócito) (Luberda, 2005).

Entretanto, um acréscimo nos níveis de GSH foi observado em oócitos suínos

maturados in vitro, quando antioxidantes, como a cisteína ou a cistina, são

adicionados ao meio de MIV na presença de células do cumulus oophurus, pois

estas produzem a GSH, e a transferem para o oócito, através das junções gap

(Maedomari et al., 2007).

2.3.1 Grânulos corticais

Os grânulos corticais (GC) são vesículas secretórias que contem enzimas

hidrolíticas, proteinases e peroxidades, específicas dos gametas femininos, que são

derivadas do complexo de Golgi e formadas enquanto o oócito se encontra em fase

de crescimento (Liu et al., 2011). Estas vesículas se direcionam do interior para a

região cortical do oócito, durante a maturação. Uma vez relocados, os GC ficam

próximos da membrana plasmática. A redistribuição dos GC é um dos passos para

a reação cortical, um processo exocitótico cálcio dependente (Tsai et al., 2011).

No momento da fusão do espermatozoide com a membrana plasmática do

oócito, ocorre a exocitose do conteúdo dos GC no espaço perivitelino,

caracterizando o evento chamado de reação cortical (Dunbar et al., 1994). A reação

cortical apresenta extrema importância para a fecundação monospérmica, por

promover o bloqueio da zona pelúcida, impedindo a penetração de mais de um

espermatozoide, evitando a polispermia (Coy et al., 2008).

Porém, nos sistemas de MIV em suínos, a exocitose dos GC é incompleta e/ou

atrasada. Este fato é resultado da liberação de GC com conteúdo imaturo,

principalmente devido ao uso de oócitos procedentes de fêmeas pré-púberes

(Funahashi, 2003). Assim, a maturação citoplasmática insuficiente e a polispermia

nos oócitos suínos maturados in vitro são fatores associados com a baixa eficácia

da PIV (Dang-Nguyen et al., 2011).

18

2.3.2 Mitocôndrias

As mitocôndrias são as organelas mais abundantes no oócito e no embrião em

desenvolvimento, sendo responsáveis pela produção de energia em forma de ATP,

sinalização do cálcio e apoptose (Iwata et al., 2011). A função mitocondrial pode ser

predita com base no conteúdo de ATP e também através do potencial de membrana

mitocodrial (Iwata et al., 2011).

A produção de ATP ocorre via fosforilação oxidativa, através do transporte de

elétrons na membrana interna mitocondrial (Ramalho-Santos & Amaral, 2013). O

número de mitocôndrias pode ser predito com base no DNAmt, pois cada

mitocôndria apresenta apenas 1 cópia do genoma (Chiaratti et al., 2010). Durante a

oogênese, o número de mitocôndrias aumenta largamente, sendo que o número de

cópias do DNAmt aumenta de 100, nos oócitos dos folículos primordiais, para

300.000-400.000, nos oócitos maturos (Jansen & de Boer, 1998).

No período de crescimento do oócito, as mitocôndrias se agrupam em torno da

VG e, durante a maturação, migram para a região próxima a placa metafásica,

devido ao alto requerimento energético necessário durante a MIV (Spikings et al.,

2007). Durante a MIV, os níveis de ATP aumentam consideravelmente e o oócito

apresenta uma enorme quantidade de DNAmt. Entretanto, não ocorre replicação

deste material genético durante os estágios iniciais da clivagem e do

desenvolvimento embrionário pré-implantação (Spikings et al., 2007). Como

resultado, há um decréscimo progressivo do conteúdo de DNAmt, o que sugere que

o número de cópias do DNAmt precisa ser amplificado em níveis suficientes até o

momento da fecundação (El Shoubagy et al., 2006). Portanto, o número de cópias

do DNAmt seria um indicador de competência oocitária (Wang & Sun, 2007). Os

oócitos BCB+ apresentam mais cópias de DNAmt e tendem a serem fecundados

mais facilmente que os BCB-, nos quais, a replicação do DNAmt se encontra

atrasada (Spikings et al., 2007).

A disfunção mitocondrial causada pelo estresse oxidativo também tem sido

bastante estudada. Quando ocorre estresse oxidativo, há aumento nas ROS,

reduzindo o conteúdo de ATP e o potencial de membrana mitocondrial, o que

prejudica a MIV e o desenvolvimento embrionário (Zhang et al., 2006). Por ser um

indicador de danos funcionais e da qualidade oocitária, as mitocôndrias vêm sendo

19

largamente estudadas na reprodução assistida.

20

3. HIPÓTESES

Hipotetizou-se nesta pesquisa:

1. Que o BCB pode gerar toxicidade ao oócito imaturo, afetando o

desenvolvimento embrionário posterior.

2. Que um meio com maior complexidade de componentes pode manter o

oócito suíno em condições mais apropriadas durante a seleção oocitária

através do BCB.

21

4. OBJETIVOS

Com base no exposto acima, o presente trabalho teve como objetivos:

1. Averiguar se o BCB é responsável por toxicidade em oócitos suínos imaturos.

2. O desenvolvimento de um meio mais elaborado que substitua o D-PBS, para

a seleção de oócitos através do corante de viabilidade BCB.

22

5. ARTIGO 1

Brilliant Cresyl Blue staining negatively affects mitochondrial functions in

porcine oocytes

(Artigo publicado na revista Zygote, 2013)

23

Brilliant Cresyl Blue staining negatively affects mitochondrial functions in porcine

oocytes

E.C.S. Santos1)*, D Sato2)*, Lucia Jr. T1), H Iwata2)※

1) Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Campus

Capão do Leão s/n, 96010-900, Pelotas-RS, Brazil.

2) Tokyo University of Agriculture, Funako 1737 Atsugi City, 243-0037 Japan.

*Both author equally contributed to this study

※ Corresponding author

24

Summary

The aim of the present study was to examine the effects of Brilliant Cresyl Blue (BCB)

staining on mitochondrial functions in porcine oocytes. Cumulus-oocytes complexes (COCs)

collected from slaughterhouse-derived porcine ovaries were cultured with (13 µM) or without

(0 µM, control) BCB for 60min. Mitochondrial functions in oocytes were examined

immediately after staining or after in vitro maturation. BCB stained oocytes produced

reactive oxygen species (ROS) at higher level than control oocytes immediately after staining

(2.2 fold, P < 0.001) and after maturation (1.7 fold, P < 0.001). The ATP content and

mitochondrial membrane potential (MMP) in oocytes were similar for the two groups

immediately after staining. However, ATP and relative MMP levels were significantly (P <

0.05) lower in BCB-treated oocytes than in control (2.18 vs. 2.83pM, and 0.82 vs. 1.0,

respectively). There was no difference in mitochondrial DNA copy number between the two

groups after maturation. The ATP content in early developmental stage embryos (3 days after

parthenogenetic activation) was lower in BCB-staining group than that in the control group

but the difference was not significant. In conclusion, BCB staining of oocytes at the immature

stage compromises mitochondrial functions throughout oocyte maturation, but the function

restores during early embryo development.

Key words: BCB staining, Mitochondria, Oocyte, Pig

25

Introduction

Glucose metabolism changes as oocytes grow in follicle, and the activity of glucose-6-

phospatate dehydrogenase (G6PDH) decreased as oocyte attain to their maximum size. The

activity of G6PDH in oocytes can be visualized by staining with Brilliant Cresyl Blue (BCB),

and this simple method has been used in cows (Alm et al., 2005; Janowski et al., 2012;

Castaneda et al., 2013; Silva et al., 2013), in ovine (Mohammadi-Sangcheshmeh et al., 2011;

Wang et al., 2012), and in pigs (Ishizaki et al., 2009) to select for oocytes that have greater

developmental competence. In addition, oocytes determined as competent by BCB staining

have a higher ATP (Catála et al., 2012) level and mitochondrial content (Catála et al., 2011)

compared to oocytes deemed incompetent. However, some studies have reported that BCB

staining itself can exert adverse effects on oocytes. Exposure of porcine oocytes to a BCB

solution changed the levels of mRNA and proteins that are responsible for successful

fertilization (Kempisty et al., 2011) and induced chromosomal aberrations (Pawlak et al.,

2011). In addition, although BCB positive oocytes have higher ability to develop to the

blastocyst-stage embryos than BCB-negative oocytes, this ratio for BCB-positive oocytes

was similar to that for oocytes that had not been subjected to BCB staining (Wongsrikeao et

al., 2006). Moreover, other studies observed no significant differences in developmental

competence between BCB-positive and control oocytes (Ishizaki et al., 2009; Mohammadi-

Sangcheshmeh et al., 2011). These results raise the possibility that BCB staining is toxic to

oocyte. BCB is reduced to a colorless state by NADPH in oocytes. Thus, the reductive ability

of oocytes, which is essential for scavenging potentially harmful free radicals, may be

diminished by BCB staining.

It is well known that reactive oxygen species (ROS) can cause mitochondrial damage in

oocytes (Zhang et al., 2011; Ge et al., 2012). No report to date has examined the effect of

26

BCB staining on mitochondrial function in oocytes. To address this question, the effects of

BCB staining on porcine oocyte development and mitochondrial function were examined.

The ROS levels, ATP content, mitochondrial membrane potential (MMP), and mitochondrial

DNA (mtDNA) copy number were determined in oocytes immediately following BCB

treatment and after a maturation period and compared with values obtained from untreated

control oocytes. In addition we compared the ATP content in early developmental stage

embryos derived from oocytes stained with BCB with embryos derived from oocytes not

subjected to BCB staining.

Materials and methods

Chemicals and media

All chemicals were purchased from Nacalai Tesque (Kyoto, Japan) unless otherwise

indicated. The medium used for in vitro maturation (IVM) was North Carolina State

University 37 (NCSU37) solution (Petters and Wells 1993) supplemented with L-cysteine

(0.6 mM) and follicular fluid (10% v/v). The medium used for oocyte washing and ROS and

membrane potential measurement was NCSU37 without follicular fluid but containing 0.1%

BSA. Media used for parthenogetic activation, and IVC were based on PZM4 (Yoshioka et

al, 2002).

Oocyte collection and maturation

Ovaries of pre-pubertal gilts (LWD-pig, six months of age) were collected at a local

slaughterhouse and transported within 1h to the laboratory at 37°C in phosphate-buffered

saline (PBS) that contained 10 IU/mL penicillin G and 0.1 g/mL streptomycin sulfate.

Cumulus cells and oocyte complexes (COCs) were collected from follicles (3 - 6mm in

27

diameter) on the surface of ovaries using a 10mL syringe connected to 18G needle. For the

first 20 h of the maturation period, the oocytes were cultured in IVM medium containing 1

mM dibutyryl cAMP (dbcAMP; Sigma Chemical Co., St. Louis, USA), 10 IU/mL equine

chorionic gonadotropin (eCG, ASKA Pharma Co. Ltd., Tokyo, Japan), and 10 IU/mL human

chorionic gonadotropin (hCG, Fuji Pharma Co. Ltd., Tokyo, Japan). The oocytes were then

transferred to a maturation medium covered by paraffin oil (10 oocytes/100µl drop, NUNC

A･ S, Roskilde, Denmark) that lacked both dbcAMP and the hormones, and cultured for 24 h

at 38.5ºC in an atmosphere of 5% CO2 and 95% air.

Brilliant Cresyl Blue staining and chromatin configuration

COCs were cultured in an amino acids and glucose-free IVM medium containing 1 mM of

pyruvic acid, 0.1% BSA, and 13 µM BCB (B5388, Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) for

1 h. The oocytes were washed before use in subsequent experiments. The first experiment

was conducted to validate whether our BCB staining methods separate more developed

oocytes. Based on coloration from BCB staining, oocytes were sorted into two groups: BCB-

positive, having a strong blue color; and BCB-negative, having faint or no color. The oocytes

were denuded, fixed in 4% paraformaldehyde and permeabilized in PBS containing triton X-

100 for 30min. The oocytes were mounted with an antifade reagent containing DAPI (Pro-

long gold antifade reagent with DAPI; Invitrogen, OR, USA) on glass slides. The chromatin

configuration of the oocytes was then examined under microscope (Olympus, Tokyo, Japan).

As previously described, chromatin condensation is correlated with oocyte growth, and

highly competent oocytes have a more condensed chromatin configuration (Sun et al., 2004).

Oocytes were thus assigned to one of three categories according to the previous descriptions

of chromatin configuration, with slight modifications. Category І consisted of oocytes having

28

germinal vesicles, with the condensed chromatin forming a ring or horseshoe around the

nucleolus. Category II oocytes had a few chromatin clusters at the nuclear membrane.

Category III oocytes had non-condensed chromatin distributed throughout the nucleoplasm.

Thirty oocytes were categolised using BCB staining and repeated using oocytes from

differential ovaries series.

Measurement of ROS levels

Levels of ROS in oocytes immediately after BCB staining or after in vitro maturation were

measured using ROS Detection Reagents (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA,

USA) according to manufacturer’s instructions. In this assay, dihydrocalcein, AM permeates

the oocyte cell membrane and is oxidized to emit green fluorescence. Fluorescence was

observed under a fluorescent digital microscope (Keyence, BZ-8000, Tokyo, Japan), and the

fluorescence intensity of each pixel was transformed to obtain a quantitative measure using

Image-J software (NIH, Bethesda, MD, USA). Experiments were conducted 2 times using

20-25 oocytes derived from differential ovaries series. And fluorescence intensities of total

40–50 oocytes per group were used for comparison.

Measurement of ATP content in oocytes and early developmental stage embryos.

The effect of BCB staining on ATP content in individual oocytes was examined

immediately after staining, after in vitro maturation and 3 days after activation. ATP content

was measured as the luminescence generated in an ATP-dependent luciferin–luciferase

bioluminescence assay (ATP assay kit; Toyo Ink, Tokyo, Japan) as previously described

(Iwata et al., 2011). For each sample, individual oocytes were added to 50-μL distilled water.

The luminescence was measured immediately using a luminometer (Gene Light 55;

29

Microtech, Chiba, Japan). The experiment was performed at least 2 times with 30 oocytes or

embryos in each group for each experiment, and ATP content was compared between the two

oocyte groups.

Oocyte activation

The oocytes were activated in the culture medium containing ionomycin (10µg/ml) and then

incubated for 6h in culture medium containing cytochalasin B (10µg/ml) and cycloheximide

(10µg/ml). After the incubation, oocytes were washed and transferred into culture drop (10

oocytes/50µl) and incubated for 3 days. In vitro culture were performed at 38.5 °C in

atmosphere of 5% CO2 and 5% O2 and 90% N2.

Measurement of MMP

MMP was measured immediately following BCB staining and after in vitro

maturation. Oocytes were cultured for 30 min in NCSU37 medium containing 0.5 µM

MitoTracker Orange (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) a fluorescent

indicator of mitochondrial activity. After staining, oocytes were washed and mounted on a

slide, and fluorescence intensity was measured using a fluorescent digital microscope

(Keyence, BZ-8000, Tokyo, Japan). The measurement was converted to pixel counts using

ImageJ software (NIH, Bethesda, U.S.A.). Experiments were performed in duplicate using 50

oocytes in each group for each experiment, and total fluorescence intensity was compared

between the two oocyte groups.

Measurement of mtDNA copy number

Preliminary observations suggested that the mtDNA copy number varied considerably

among oocytes and donor gilts. However, the mean mtDNA copy number determined for a

group of 10 oocytes was similar to the value obtained for 10 cohort oocytes collected from

30

the same donor (r = 0.746, P < 0.01), as similar trend has been observed in cows (Iwata et al,

2011). Therefore, 20 oocytes were collected from a single donor and divided into two groups,

with one group of 10 oocytes cultured without BCB and the other with 13 µg/mL BCB for 60

min. After in vitro maturation, mtDNA copy number was compared between BCB-stained

and control oocytes (not subjected to BCB staining). In the comparison, total of 15 gilts were

used. DNA extraction and PCR amplification were conducted according to previously

described methods (Iwata et al., 2011). To obtain the mtDNA copy number, mtDNA was

amplified by real-time PCR using a Rotor-Gene 6500 real-time rotary analyzer (Corbett

Research, Sydney, Australia) with the primer set 5ʹ-CGAGAAAGCACTTTCCAAGG -3ʹ and

5ʹ- CTAATTCGGGTGTTGGTGCT -3ʹ and MESA Blue qPCR MasterMix Plus for SYBR

Assay (Eurogentec, Liège, Belgium). The primers were designed using Primer3Plus

(http://sourceforge.net/projects/primer3/) and a porcine mtDNA sequence (ACCESSION

AF304202; from base 8744 to 8914, 151bp). The PCR was performed with initial

denaturation at 95ºC for 5 min, followed by 40 cycles of 95ºC, 58ºC and 72ºC for 20 s at each

temperature. A standard curve was generated for each run using 10-fold serial dilutions

representing copies of the external standard, which was the PCR product of the corresponding

gene cloned into a vector using the Zero Blunt TOPO PCR cloning kit (Invitrogen, Carlsbad,

USA). Data from the two trials in which the amplification efficiency was < 1.9 were

discarded.

Statistical Analysis

The distribution of chromatin configuration and cleavage ratio of embryos was

analyzed by chi square test, and comparison of mean difference between BCB-treated

oocytes and un-treated oocytes (not subjected to BCB staining) were conducted using

student’s t-test. Pearson’s correlation was calculated using IBM SPSS ver. 21 (Statistical

31

Package for the Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL). P value less than 0.05 was

considered significantly difference.

Results

BCB positive oocytes had advanced chromatin configuration

A higher fraction of BCB-positive oocytes was assigned to Category I as compared to that of

BCB-negative oocytes (Table 1). Based on the results, we concluded current BCB staining

properly separated oocytes.

Mitochondrial function in oocytes is altered by BCB staining

Immediately after BCB staining and after in vitro maturation (44 h after BCB

staining), levels of ROS were higher for BCB-stained oocytes than for untreated controls

(Figure 1-A, B). The proportion of mitochondria with active membrane potentials was also

affected by BCB staining, such that the relative MMP in in vitro-matured BCB-stained

oocytes was low by 18% compared with that of control matured oocytes (Figure 2-B),

although there was no difference between the two groups immediately after BCB treatment

(Figure 2-A). Similarly, there was no difference in ATP content between BCB-treated and

control oocytes immediately after staining (1.52 vs. 1.62 pM, Figure 3-A), whereas ATP

content in in vitro-matured BCB-treated oocytes was significantly lower than that in control

oocytes (2.18 pM vs. 2.83 pM, P > 0.05; Figure 3-B). When the oocytes were activated and

cultured for 3 days, there was no difference between the cleaved ratio (>=2cell stage) between

the BCB treated groups and control group (embryos derived from oocytes not subjected to

BCB staining). ATP content in early developmental stage embryos was still lower for BCB

treated group than that for control group but the difference was not significant (P = 0.24,

.Table 2).

32

MtDNA copy number in BCB stained-oocytes

A comparison of mtDNA copy number of BCB-stained and untreated cohort oocytes is

shown in Figure 4-A.The mtDNA copy number was highly variable among gilt donors,

ranging from 82,383 to 299,817 copies. When the mean mtDNA copy number of total

oocytes was compared between BCB-stained and untreated oocytes, the difference was not

statistically significant (161,787 vs. 145,368, P > 0.05; Figure 4-B). There was a strong

correlation between mtDNA copy numbers of BCB-treated and untreated cohort oocytes

derived from the same donor (r = 0.74, P < 0.001, Figure 4-C). However, when the ratio of

mtDNA copy number of BCB-stained oocytes to mtDNA copy number of control oocytes

was calculated, the mean ratio ± SEM was 1.18 ± 0.07, which was significantly greater than

1.0, indicating that BCB staining increased the mtDNA copy number.

Discussion

This study is the first detailed investigation of the effects of BCB staining on

mitochondrial function in oocytes. The results demonstrate that mitochondrial functions in

oocytes are affected by BCB treatment and the effect continues during oocyte maturation but

the effect diminished until early developmental stage embryos.

BCB staining has been used to select for oocytes with high developmental

competence based on the activity of G6PDH (Mohammadi-Sangcheshmeh et al., 2011;

Mirshamsi et al., 2012). However, it has been suggested that BCB staining is ineffective for

equine oocyte selection (Pereira et al., 2013) and that it may adversely affect the intrinsic

character of porcine oocytes by altering the levels of proteins responsible for fertilization

(Kempisty et al., 2011). BCB is oxidized in oocytes, producing a strong blue color;

decoloration depends on NADPH produced via the pentose phosphate pathway. The present

33

study showed for the first time that oocytes cultured with BCB generated high levels of ROS,

immediately after staining and even after 44 h of culture, indicating that BCB staining

negatively affects the redox state in oocytes and that this effect is persistent. Mitochondria are

responsible for the regulation of redox homeostasis (Kang et al., 2012); it was therefore

important to determine whether BCB staining affects mitochondrial function in oocytes.

It was observed in this study that following a period of in vitro maturation, the ATP

content in oocytes increased with respect to the initial level at the germinal vesicle stage,

supporting previous findings in bovines (Stojkovic et al., 2001). Interestingly, MMP and the

ATP content were lower in in vitro-matured oocytes stained with BCB than in untreated

oocytes. MMP increases with oocyte maturation and is thus higher in in vitro-matured

oocytes, reflecting a greater degree of competence (Fujii et al., 2009). A high MMP is also

required for proper cortical granule exocytosis (Van et al., 2007). ATP is a determining factor

for successful fertilization of bovine oocytes, and oocytes cultured in an optimal maturation

medium contained higher levels of ATP than those cultured in a suboptimal medium;

furthermore, disruption of the mitochondrial electron transfer by rotenone reduced the ATP

content and positive fertilization outcomes (Somfai et al., 2012). Therefore, the lower MMP

and ATP levels observed in the present experiments as a result of BCB treatment are

indicative of compromised mitochondrial function, which could ultimately affect following

developmental ability of the oocytes.

In contrast, there was a strong correlation between mean mtDNA copy numbers of

BCB-treated and control oocytes, indicating that oocytes character resemble within individual

donor even after BCB staining. Interestingly, the ratio of mtDNA copy number in BCB-

stained oocytes to the copy number of controls was significantly greater than 1.0. In light of

the evidence that MMP and the ATP level were decreased by BCB treatment while mtDNA

34

copy number increased, it can be inferred that BCB staining reduces the overall quality of

mitochondria and the impaired mitochondrial quality stimulates de novo synthesis of

mitochondria. Mitochondrial homeostasis involves a balance between synthesis and

degradation (Weber et al., 2010). Together with it is suggested that in oocytes subjected to

BCB treatment, mitochondrial damage or a low ATP content may enhance mitochondrial

biogenesis, resulting in the accumulation of low-quality mitochondria. In addition, the fact

that early-stage embryos derived from BCB-stained oocytes had still low ATP content

compared with embryos derived from control oocytes but the difference was not significant

suggesting that the damaged mitochondria were partly restored during early embryonic

development.

In conclusion, BCB staining can have potentially damaging effects on oocytes as a

result of the increased production of ROS, a lowering of the MMP, and compromised ATP

production; however, further studies beyond the early developmental stages are required in

order to determine whether these effects can ultimately undermine embryonic development.

Acknowledgement

This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25450400 and CNPq-Brazil.

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38

Figures

1 2 3

Positive 40 20 (50.0)a 13 (32.5) 7 (17.5)a

Negative 22 5 (22.7)b 4 (18.2) 13 (59.1)b

Table1. Chromatin configuration of oocytes categorized based on the BCB staining.

Chromatin Configuration (%)

a-b, P<0.05. Oocytes were divided into 3 categories based on chromatin configurations. About 30 oocytes were

subjected to BCB staining and the experiment was repeated 2 times.

BCB No. of oocytes

Groups No. of oocytesNo.of cleaved

embryos

ATP content in

embryo (pM)

Control 128 66 1.33±0.16

BCB 157 65 1.14±0.12

Total 285 131

Table 2. ATP content in early developmental embryos derived from oocytes stained

with BCB.

39

40

41

42

43

6. MANUSCRITO 2

Efeito do meio para a seleção de oócitos suínos através do Brilliant Cresyl

Blue na Maturação in vitro, Produção Embrionária e Genotoxicidade

(Nas normas da revista Zygote)

44

Efeito do meio para a seleção de oócitos suínos através do Brilliant Cresyl Blue na

Maturação in vitro, Produção Embrionária e Genotoxicidade

Santos, E.C.S.1; Pradieé, J.2; Mirapalheta, E.M.2; Mion, B.2; Pereira, M.M.4; Lazari, J.C.4;

Mondadori, R.G.3; Vieira, A.D. 2; Pegoraro, L.M.C.4; Lucia,T. Jr.*1,2

1Centro de Desenvolvimento Tecnológico, 2Faculdade de Veterinária, 3 Instituto de Biologia,

Universidade Federal de Pelotas (UFPel) Pelotas

4Embrapa Clima Temperado, Pelotas, RS, Brasil.

*Autor para correspondência: Faculdade de Veterinária, Campus Capão do Leão, Universidade Federal de

Pelotas, CEP 96010-900, Pelotas, RS, Brasil, Fone: +55 53 3275 7644, E-mail: tluciajr@gmail.com

45

Resumo

A PIV de embriões suínos ainda apresenta resultados pouco satisfatórios, quando comparada

com outras espécies domésticas, o que pode ser atribuído à seleção de oócitos de baixa

qualidade. A coloração com Brilliant Cresyl Blue (BCB) permite a avaliação da atividade

intracelular da enzima G6PDH, presente em altas concentrações nos oócitos em crescimento,

nos quais o BCB é degradado com mais facilidade do que nos oócitos com crescimento

finalizado. Assim, os oócitos mais viáveis permanecem corados em azul. Entretanto, o único

meio usado para a seleção de oócitos com BCB é o D-PBS. Esta pesquisa objetivou avaliar

um novo meio, chamado de ReproPEL, para a seleção de oócitos suínos com BCB. Oócitos

obtidos de ovários de fêmeas suínas pré-púberes abatidas em um frigorífico foram corados

com BCB (13 µM) durante 60 min, nos meios D-PBS e ReProPEL, posteriormente separados

em corados (+) e sem coloração (-), compondo 6 grupos: DPBS+; DPBS-; ReproPEL+;

ReproPEL-; DPBSc; e ReproPELc (os dois últimos sendo grupos controle, sem contato com

o corante). Os oócitos foram maturados in vitro em NCSU-23, durante 48 h e avaliados

quanto a MIV nuclear, densidade dos grânulos corticais (GC), ativação partenogenética e

teste cometa. Na MIV nuclear, as maiores taxas de MII (P < 0,05) foram obtidas no DPBS+

(63,1%), ReproPELc (55,1%) e ReproPEL+ (50,2%). Quanto à densidade dos GC, os grupos

com menor área (P < 0,05), evidenciando melhor migração, foram ReproPELc, D-PBS+, D-

PBS- e ReproPEL+. A ativação partenogenética demonstrou que o meio ReproPEL possui

boa capacidade de manutenção oocitária, possibilitando taxas aceitáveis de desenvolvimento

até o estágio de blastocisto: ReproPEL+ (13,0%); e ReproPELc (12,7%). Conclui-se que o

meio ReProPEL pode ser usado para a manutenção de oócitos suínos, porém não é o mais

indicado para a seleção de oócitos através do BCB.

46

Abstract

The results of IVP of swine embryos are still unsatisfactory, when compared to other

domestic species, which may be due to the selection of oocytes of poor quality. Staining with

Brilliant Cresyl Blue (BCB) allows the evaluation of the intracellular activity of the G6PDH,

an enzyme present in high concentrations in growing oocytes, in which BCB is degraded

more intensively than in grown oocytes. Thus, oocytes with greater viability are stained in

blue. However, the D-PBS is the only medium used for oocyte selection through BCB. The

objective of this study was to test a new medium called ReproPEL for selection of oocytes

using BCB. Oocyes obtained from ovaries of prepubertal gilts slaughtered in an abattoir were

stained with 13 µM BCB during 60 min in the D-PBS and ReProPEL media, subsequently

classified in stained (+) or unstained (-), composing 6 groups: DPBS+; DPBS-; ReproPEL+;

ReproPEL-; DPBSc; and ReproPELc (the last two considered as controls, with no contact

with BCB). Oocytes were matured in vitro in NCSU-23 during 48 h and evaluated for nuclear

IVM, density of cortical granules (CG), parthenogenetic activation and comet assay. The

greater rates of nuclear IVM (P < 0.05) were obtained for DPBS+ (63.1%), ReproPELc

(55.1%) and ReproPEL+ (50.2%). The groups with smaller area of CG (P < 0.05), showing

better migration, were ReproPELc, D-PBS+, D-PBS- and ReproPEL+. The parthenogenetic

activation indicated that the ReproPEL medium presented satisfactory capacity of oocyte

maintenance, resulting in acceptable rates of development to the blastocyst stage: 13.0% for

ReproPEL+; and (12.7%) for ReproPELc. In conclusion, the ReproPEL medium can be used

for maintenance of swine oocytes, but not for oocyte selection through BCB.

47

Introdução

Em suínos, as tecnologias de reprodução assistida não têm acompanhado o

desenvolvimento observado em outras espécies de animais domésticos (Du et al., 2008). A

qualidade oocitária é fundamental para a realização bem sucedida da PIV (Pawlak et al.,

2011; Lee et al., 2013). Porém, ainda que produtos nascidos a partir de embriões suínos

fecundados in vitro já tenham sido obtidos (Wongsrikeao et al., 2006) suas taxas

insatisfatórias de sucesso (2-36%) tem sido atribuídas à baixa qualidade oocitária e à grande

variação no percentual de blastocistos (Pawlak et al., 2012). Esta baixa eficiência na espécie

suína também está relacionada com eventos da maturação citoplasmática, tais como: falha na

migração e conteúdo imaturo dos grânulos corticais, o que resulta em altas taxas de

polispermia (Funahashi, 2003; Dang-Nguyen et al., 2011); baixos níveis de glutationa in vitro

7,98 (pmol/oócito) em comparação com os níveis observados in vivo 36,26 (pmol/oócito)

(Brad et al., 2003); e assincronia com a maturação nuclear (Funahashi, 2003; Dang-Nguyen

et al., 2011). Portanto, ainda são necessárias melhorias no processo de seleção e nas

condições dos meios de manipulação e de MIV, ajustadas ao metabolismo do oócitos suínos

(Krisher et al., 2007; Kikuchi et al., 2002).

Metodologias que permitam a seleção dos oócitos mais competentes, bem como a

exposição dessas estruturas a meios mais adequados, são alternativas para aprimorar os

índices de PIV em suínos. Dentre os métodos não invasivos disponíveis para seleção

oocitária, o corante Brilliant Cresyl Blue (BCB) tem sido usado para indicar a competência

de oócitos (Roca et al., 1998; Alm et al. 2005; Wongsrikeao et al., 2006). Este corante de

viabilidade é degradado através da enzima G6PDH desidrogenase, que apresenta atividade

reduzida em oócitos que já completaram seu crescimento, porém tem alta atividade em

oócitos que estão em fase de crescimento (Roca et al., 1998; Wongsrikeao et al., 2006). Desta

forma, oócitos com maior competência permanecerão corados pelo BCB, sendo classificados

como BCB+, e os oócitos com menor competência não serão mantido corados, por serem

capazes de metabolizar o corante. Para seleção de oócitos com BCB, o D-PBS tem sido

utilizado como meio para incubação, por até 90 min em concentrações de 13 à 26 µM (Romar

et al., 1998), pois o BCB torna-se tóxico acima de 52 µM (Rodriguez-Gonzalez et al., 2002).

O período de incubação com BCB pode comprometer o desenvolvimento embrionário

posterior (Goovaerts et al., 2010; Vandaele, 2008). Como existe a possibilidade deste

comprometimento ser decorrente da capacidade de manutenção do meio, é necessário

48

determinar a efetividade do teste de BCB usando um meio com maior complexidade de

nutrientes.

Diversos estudos foram conduzidos visando à formulação de meios com composição

semelhante a dos fluídos presentes no oviduto no e útero das fêmeas. Um dos primeiros

meios desenvolvidos foi o fluído sintético de oviduto (SOF), desenvolvido para PIV em

bovinos (Takahashi & First 1992; Holm et al., 1994). Para a PIV em suínos, o meio NCSU

(Petters & Wells, 1993) serviu como base para o desenvolvimento do meio PZM (Porcine

zygote medium), elaborado com base na composição dos fluídos de oviduto de fêmeas suínas

(Yoshioka et al., 2002). Entretanto, a composição destes meios ainda não simula

completamente os fluídos naturais. Ainda que vários compostos presentes nestes meios, tais

como frutose (Wongsrikeao et al., 2006), glicina (Hong & Lee, 2007), citrato e mio-ynositol

adotados no meio SOFaaci (Holm et al., 1999), favoreçam o desenvolvimento oocitário in

vitro, ainda é necessário averiguar se os compostos presentes nos meios SOFaaci e PZM

podem ser utilizados na composição de um novo meio, elaborado para manter a viabilidade

oocitária durante a realização do teste com BCB.

Baseado neste contexto, este estudo objetivou comparar dois meios, um mais simples (D-

PBS) e um mais elaborado (ReproPEL) durante a seleção de oócitos suínos com o corante

BCB, avaliando as taxas de maturação nuclear, citoplasmática, desenvolvimento embrionário

e genotoxicidade.

Materiais e Métodos

Seleção oocitária e avaliação da maturação nuclear

Ovários de fêmeas suínas pré-púberes foram coletados em frigorífico local e

transportados em NaCl 0,9 % acrescida de gentamicina (50 µg/mL), em temperatura de 30-

35 °C. No laboratório, os complexos cumullus oócito (CCOs) foram recuperados a partir de

folículos com 3-6 mm de diâmetro, através de aspiração com auxílio de bomba de vácuo

(pressão de 14 mmHg). Somente os oócitos com citoplasma homogêneo e com células do

cumulus oophurus compactas foram selecionados para MIV. Após a classificação

morfológica, os CCOs foram colocados em dois meios (Tabela 1) ReproPel e D-PBS. Os

CCOs permaneceram durante 60 min, em placa Nunc 4 poços, em estufa com atmosfera de

5% CO2 e temperatura de 39 °C, em 2 gotas de 400 µL de cada meio, uma contendo 13 µM

de BCB e a outra somente meio. Após este período, os CCOs foram classificados sob

49

estereomicroscópio, sem luz incidente, como: corados (BCB+); ou não corados (BCB-).

Sendo separados em 6 grupos: 2 considerados como controles (sem acréscimo do corante):

PBSc e ReproPELc; e 4 com acréscimo de BCB (dependentes do status de coloração): PBS+,

PBS- e ReproPEL+ e ReproPEL-.

Os CCOs foram submetidos a MIV por 48 h, em meio NCSU-23 suplementado com:

10% de líquido folicular suíno (PFF); piruvato (0,727 mM); hipotaurina (5 mM); cisteína (0,6

mM); EGF (10 ng/ml); glutamina (1,0 mM); e β-mercaptoetanol (25 µM). Somente nas

primeiras 24 h, os meios foram acrescidos de 10 UI de hCG, 10 UI de eCG e 1 mM de

dAMP-c. A taxa de maturação nuclear foi determinada nos diferentes grupos através de

microscopia de epifluorescência, utilizando 30 µg/mL de Hoechst (Sigma® H33342),

segundo Uhm et al. (2007). Os CCOs em metáfase II (MII) foram considerados maturos e os

CCOs em vesícula germinativa (VG), quebra de vesícula (QVG) e em metáfase I (MI) foram

considerados imaturos.

Densidade dos grânulos corticais

Os CCOs foram selecionados e maturados conforme descrito anteriormente. Foram

utilizados 4 grupos para seleção com BCB: 1) D-PBS/BCB; 2) ReproPEL/BCB; 3) D-PBS;

4) ReproPEL, sendo os dois últimos considerados como controles. Após a MIV, a densidade

de migração dos grânulos corticais (GC) foi avaliada utilizando-se a aglutinina Lens culinaris

conjugada à isotiocianato de fluoresceína, FITC-LCA (Pereira et al., 2011). Os CCOs foram

desnudados por pipetagem sucessivas em meio com hialuronidase 0,1%. A zona pelúcida foi

removida com o uso de protease 0,1% em meio TCM 199. Os procedimentos seguintes

seguiram a metodologia descrita por Marques et al. (2011). As imagens foram obtidas através

de microscópio confocal Olympus FluoViewTM 1000, equipado com laser krypton-argon para

excitação da fluoresceína (GC) e IP (DNA). O software Image J® foi utilizado para análise

da área no plano equatorial. Para cada oócito, foram realizadas duas marcações, da área total

e da área com GC, sendo calculada a porcentagem de área ocupada pelos GC através de

metodologia descrita por Romar et al. (2012).

Ativação por partenogênese

Após a MIV, a ativação partenogenética foi conduzida nos grupos submetidos aos

mesmos tratamentos do experimento anterior. O dia da ativação foi considerado como o dia

zero (D0). Para isso, as células do cumulus oophurus foram removidas através de pipetagem

50

em meio contendo Hepes suplementado com 0,1% de hialuronidase. Os oócitos foram

ativados utilizando ionomicina (20 µM/mL) e 6-DMAP (2 mM/mL) (Rho et al., 1998). A

exposição em ionomicina ocorreu por 5 minutos em TCM-199 suplementado com 2 mg/mL

de BSA, e em 6-DMAP por 3 h, em temperatura controlada de 39 ºC. Finalizada a ativação,

os oócitos foram colocados em meio de cultivo PZM-3 (Yoshioka et al., 2002) em placa

Nunc 4 poços, na proporção de 40 estruturas para 400µL de meio. O meio para o

desenvolvimento embrionário foi acrescido de piruvato (0,2mM), glutamina (1mM),

hipotaurina (5mM) e BSA (3mg/mL). No quarto dia, acrescentou-se 10% de soro fetal bovino

inativado. O cultivo foi realizado dentro de bag com mistura contendo 5% de CO2, 5% de O2

e 90% de N2, mantido dentro de estufa de CO2, na temperatura de 39 °C. Os embriões foram

avaliados quanto à clivagem no D2 e quanto ao desenvolvimento até o estágio de blastocistos

no D7.

Genotoxicidade

A fragmentação do DNA foi avaliada após a MIV de CCOs submetidos aos mesmos

tratamentos descritos, sendo acrescentado um tratamento controle no qual não houve

exposição aos meios testados, sendo os CCOs somente lavados em líquido folicular (PFF)

durante a seleção morfológica. Esta análise foi realizada através do ensaio cometa. Para isso,

os oócitos foram desnudados em meio TCM 199 contendo Hepes e 0,1% de hialuronidase,

não sendo removida a zona pelúcida. Foi utilizado para o teste o protocolo de Santos et al.

(2009). Em cada repetição, 15- 20 oócitos desnudados foram colocados em 10 µL de PBS e

adicionados em 180 µL de agarose baixo ponto de fusão, aquecida a 50˚C. A agarose foi

distribuída em lâminas que foram dispostas em solução de lise (NaCl (2,5M), EDTA (100

mM), tris HCl (8mM), DMSO (10%) e Triton-X (1%), durante 24h. Após esse período, foi

realizada a eletroforese em sala escura, em cuba horizontal e resfriada. Foram utilizados 25 V

e 300 Amp durante 20 min. As lâminas foram fixadas em: ácido tricloroacético (0,15g/mL);

sulfato de zinco heptahidratado (0,05g/mL) e Glicerol (0,05 mL). Para a coloração, as

lâminas foram mantidas primeiramente em solução de carbonato de sódio 66% (0,05 g/mL) e

posteriormente, em solução contendo nitrato de amônio (0,001g/mL), Nitrato de Prata (0,001

g/mL), Ácido Tungstosílico (0,0025 g/mL) e Formaldeído PA (1,5 µL/mL). Finalizado, as

amostras foram mantidas em solução de ácido acético (0,01 mL/L) e secas para realização da

leitura em microscópio óptico. O nível de dano foi avaliado de 0 à 5, sendo 0 o menor nível e

51

5 o maior. A análise foi realizada através do nível de degradação da fita de DNA e formação

do arraste, conforme a figura 1.

Análise estatística

As taxas de coloração, de maturação nuclear, de densidade de grânulos corticais,

fragmentação de DNA, clivagem e desenvolvimento dos oócitos até o estágio de blastocistos

foram comparadas através do teste de qui-quadrado, usando o software Statistix®.

Resultados

O meio ReproPEL não demonstrou habilidade para seleção de oócitos competentes

através do BCB. A proporção de oócitos que mantiveram a coloração azul (BCB+) foi

superior (P<0,05) neste meio que no D-PBS. Esta taxa de coloração foi muito elevada

(86,2%), evidenciando que oócitos expostos ao BCB no meio ReproPEL não metabolizaram

o corante (Tabela 2).

Não ocorreu diferença entre meios testados na taxa de MIV nuclear. As taxas de

maturação nuclear mais elevadas (P<0,05) foram obtidas nos grupos D-PBS BCB+,

ReproPEL controle, ReproPEL BCB+ e D-PBS BCB- (Figura 2). A taxa observada para o

grupo D-PBS BCB- não diferiu (P>0,05) das taxas observadas para os grupos que

apresentaram desempenho inferior (D-PBS controle e ReproPEL BCB-).

No meio ReproPEL controle foi observada melhor migração dos GC. A maior

densidade dos grânulos corticais ocorreu nos oócitos dos grupos ReproPEL BCB- e D-PBS

controle (P<0,05). Os oócitos com menor área ocupada por GC, foram os do grupo

ReproPEL controle (Figura 3). Porém, não foram observadas outras diferenças quanto à

densidade dos grânulos corticais (P >0,05).

O meio ReproPEL foi eficiente para a produção embrionária. As maiores taxas de

desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto foram observadas para os oócitos

dos grupos ReproPEL BCB+ e ReproPEL controle (P < 0,05), enquanto que os oócitos dos

grupos BCB- apresentaram as menores taxas de desenvolvimento embrionário (P < 0,05),

independentemente do meio utilizado (Tabela 3).

O meio D-PBS e lavagem em líquido folicular (PFF) apresentaram menor taxa de

danos no DNA. O percentual de oócitos com DNA íntegro (dano = 0) foi elevado em todos

os grupos testados (Figura 4), porém os oócitos dos grupos D-PBS+, D-PBS controle e PFF

apresentaram as menores taxas de danos no DNA (P<0,05).

52

Discussão

Este é o primeiro trabalho que investiga a atuação de um meio mais elaborado para a

seleção de oócitos através do BCB. A diluição do BCB em meios mais complexos pode ser

uma ferramenta para a manutenção da viabilidade oocitária durante o tempo de exposição ao

corante. Oócitos suínos apresentam uma grande variação de qualidade e não apresentam

uniformidade de recursos intrínsecos que regulam a maturação, devido à utilização de fêmeas

pré-púberes como doadoras (Pawlak et al., 2011). Desta forma o uso do BCB tem sido

recomendado para a seleção de oócitos mais uniformes e mais competentes, conforme

relatado em bovinos (Alm et al., 2005), bubalinos (Manjunatha et al., 2007), equinos

(Mohammadi-Sangcheshmeh et al., 2011), ovinos (Karami-Shabankareh e Mirshamsi, 2012)

e suínos (Wongsrikeao et al., 2006). O BCB também permitiria maior uniformidade na

seleção de embriões, aumentando a eficiência na PIV em bovinos (Mirshamsi et al., 2013) e

em ovinos (Mirshamsi & Karami Shabankareh, 2012).

Em suínos, o uso do BCB foi relacionado com o aumento nas taxas de MIV nuclear e de

fecundação monospérmica, bem como, com melhoria no número de células nos blastocistos

após a FIV (Wongsrikeao et al., 2006). Entretanto, no presente estudo, a maturação nuclear e

citoplasmática foi semelhante entre oócitos selecionados (BCB+) e não selecionados pelo

BCB (controle), quando usado o meio ReproPEL. Também, a proporção de oócitos que se

mantiveram corados após 1h em BCB foi muito elevada no meio ReproPEL, comprovando

que oócitos submetidos ao BCB neste meio não foram capazes de metabolizar o corante.

Desta forma, a presença de coloração (BCB+) com o meio ReproPEL, não pode ser

equiparada com competência oocitária. Portanto, apesar de ser eficiente para a manutenção de

oócitos suínos, o meio ReProPEL não é o mais indicado como meio para a seleção com BCB.

Em geral, ambos os meios testados apresentaram alta densidade de GC, possivelmente

devido à ineficiência na maturação citoplasmática. Todavia, os oócitos do grupo controle

apresentaram menor área com GC, no meio ReproPEL. A redistribuição dos GC é

considerada um importante critério para a avaliação da MIV citoplasmática (Abeydeera et al.

2001; Krisher et al. 2007). Porém, ainda que altas taxas de MII (70-90%) tenham sido

alcançadas em suínos (Dang-Nguyen et al., 2011), a MIV citoplasmática ainda apresenta

resultados inconsistentes. Os resultados do presente estudo confirmam a ausência de

sincronia entre a MIV nuclear e a citoplasmática, conforme relatado por Funahashi (2003).

No entanto, a competência de um oócito é definida por: sua habilidade de finalizar a meiose;

53

de clivar após a fecundação; de desenvolver-se até o estágio de blastocisto; e de induzir a

prenhez, levando-a a termo (Krisher et al., 2004). No meio ReproPEL as melhores taxas de

desenvolvimento até blastocisto ocorreram, nos oócitos dos grupos BCB+ e controle,

demonstrando que o meio ReproPEL possibilitou melhor desenvolvimento embrionário que o

D-PBS. Entretanto, os resultados semelhantes entre oócitos BCB+ e os não expostos ao BCB,

indicam que a utilização do BCB seria questionável. Uma vez que diferenças entre oócitos

BCB+ e oócitos controle, no meio D-PBS foram observadas apenas quanto à migração dos

GC e a MIV nuclear, a seleção de oócitos através do BCB não se justifica. Da mesma forma,

Pawlak et al. (2014) descreveram a existência de similaridade na expressão gênica entre

oócitos BCB+ e não expostos ao BCB, confirmando que a seleção com BCB não é

fundamental para o sistema de MIV em suínos.

O presente estudo foi o primeiro a relacionar a exposição de oócitos suínos ao BCB

com danos de fragmentação no seu DNA, realizando o teste cometa sem a retirada da zona

pelúcida. Quando a fita do DNA oocitário é lesada, os fragmentos desnaturados migram para

fora do núcleo celular durante a eletroforese (Berthelot-Ricou et al., 2011). Os resultados

deste estudo indicaram que mais oócitos expostos ao BCB apresentaram DNA íntegro no

meio D-PBS, que oócitos expostos ao BCB e oócitos controle no meio ReproPEL. Entretanto,

a frequência total de danos, sem exposição ao BCB, foi alta em ambos os meios. Os oócitos

do grupo PFF, que não foram submetidos ao tempo adicional de incubação antes da MIV,

também apresentaram muitos danos. Devido a isso, não é possível afirmar se os danos

observados no DNA dos oócitos foram consequência da exposição ao BCB, do tempo

adicional de 60 min, ou do sistema de MIV. Também é possível que estes danos tenham sido

devido ao estresse oxidativo, que pode causar quebras na fita simples e alterações

irreversíveis na fita dupla do DNA (Takahashi et al., 1999). Como a replicação do DNA é

muito ativa, tanto na MIV, como no início do desenvolvimento embrionário, quebras neste

processo podem induzir a danos, mutações, expressão gênica anormal e supressão do

desenvolvimento posterior do embrião (Kitagawa et al., 2004). Os resultados deste teste

sugerem que a integridade do DNA foi superior no meio D-PBS, porém sem diferença entre

oócitos BCB+ e controle, o que também foi observado no meio ReproPEL. Portanto, não foi

possível concluir se a exposição ao BCB apresentou toxicidade para oócitos suínos.

54

Conclusões

O meio ReproPEL manteve os COC’s em boas condições para o desenvolvimento

embrionário e pode ser considerado como uma alternativa para a manutenção de oócitos

suínos. Porém, não é o meio mais indicado para o teste BCB. Como também, a seleção

mediante o BCB não demonstrou ser necessária através desta pesquisa. Como também, novos

estudos são primordiais para confirmação da genotoxicidade do BCB em oócitos suínos.

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58

Lista de Figuras

Tabela 1. Composição dos meios utilizados para incubação dos COCs com o corante BCB

para seleção.

Componentes ReproPEL (mM) D-PBS (g/mL)

NaCl 100 0,008

KCl 10 0,0002

Frutose 0,5 -

Mio Inositol 2,77 -

NaHCO3 5 -

Hepes sais de sódio 25 -

Glicina 10 -

Tri sódio citrato 0,34 -

KH2PO4 0,35 0,0002

MgSO4 0,4 -

CaCl2 2H2O 1,71 0,0001

Vermelho fenol 4 µM -

Gentamicina 0,00005 g/mL 0,00005

Lactato de sódio 5,35 -

Ácido Pirúvico 0,2 0,000036

EDTA 0,01 -

Na2HPO4 - 0,00115

Glicose - 0,001

MgCl2 6H2O - 0,0001

Tabela 2. Taxa de coloração de oócitos suínos após exposição ao BCB nos meios D-PBS e

ReproPEL.

Meio Não corados (%) Corados (%) N

D-PBS 96 (30,4) 220 (69,6)b 316

ReproPEL 46 (13,8) 288 (86,2)a 334

Total 142 (21,8) 508(78,2) 650 * Letras diferentes representam diferença estatística (P < 0,05). .

59

Fig 1. Classificação do índice de dano, através do teste cometa, baseado na migração de fragmentos de DNA (Santos et al., 2009).

Figura 2. Maturação nuclear (MII) de oócitos suínos maturados in vitro e corados com BCB em diferentes meios.

a,bLetras diferentes representam diferença estatística (P<0,05).

PBS+, n = 111; PBS-, n = 31; PBSc, n = 42; ,ReproPEL+, n = 119; ReproPEL- n = 22; e ReproPELc, n = 59.

60

Fig 2. Densidade dos grânulos corticais (CG) em oócitos suínos maturados in vitro e corados com BCB em diferentes meios. a,b

Letras diferentes representam diferença estatística (P<0,05).

n = 20 oócitos por grupo.

Tabela 3. Clivagem e desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto (D7) após

ativação partenogenética de oócitos suínos corados com BCB em diferentes meios.

Clivagem Blastocistos

Meio/coloração D2 (%) D7 (%)

n

PBS + 197 (58,6) ab 23 (6,8)b

336

PBS - 0 e 0 (0)c

161

PBS c 139 (45,1) c 17 (5,5)b

308

ReproPEL+ 162 (55,3)ab 38 (13,0)a

293

ReproPEL - 21 (23,3)d 1 (1,1)c

90

ReproPEL c 193 (52,0) bc 47 (12,7)a

371

Total 712 126

1621 * Letras diferentes representam diferença estatística em cada coluna (P<0,05).

* PBS+, ReproPEL+: BCB+; PBS-, ReproPEL-: BCB-; PBSc, ReproPELc: controles.

61

Fig 3. Diferentes níveis de fragmentação no DNA de oócitos suínos pós coloração com BCB em diferentes meios e maturados in vitro. a,b,c

Letras diferentes no mesmo meio demonstram diferença estatística (P<0,05).

Neste teste, os controles negativos não foram utilizados, com 5 repetições.

PBS+, ReproPEL+: BCB+; PBSc, ReproPELc: controles, PFF: controle somente em líquido folicular suíno.

62

7. CONCLUSÕES

Através deste trabalho conclui-se que o meio ReProPEL não é indicado para o

teste de seleção oocitária através do BCB. Porém, este meio demonstrou ser

eficiente na manutenção de oócitos suínos.

O BCB foi responsável por alterações na funcionalidade mitocondrial em oócitos

suínos imaturos. Em vista disso, novos estudos são necessários a fim de se

averiguar de que forma estes danos podem influenciar o desenvolvimento

embrionário posterior.

63

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